PT87185B

PT87185B - Processo para a sintese de peptidamidas pelo metodo da reaccao em fase solida com utilizacao de grupos de ancoragem labeis em meio acido

Info

Publication number: PT87185B
Application number: PT87185A
Authority: PT
Inventors: Werner Stueber; Jochen Knolle; Gerhard Breipohl
Original assignee: Hoechst Ag
Priority date: 1987-04-08
Filing date: 1988-04-07
Publication date: 1992-07-31
Also published as: JPS63267748A; US4922015A; AU1437188A; JP2725780B2; AU605848B2; DK189388A; IL86004A0; DK189388D0; KR970005473B1; IE881035L; AU629049B2; ATE63108T1; GR3002283T3; IL86004A; AU6368690A; CA1337839C; PH27398A; ES2022508B3; IE60856B1; KR880012638A

Description

A presente invenção refere-se a novos distanciadores e ao seu processo de preparaçao, assim como à síntese de peptidamidas por meio do método de reacçao em fase sólida, com utilização destes grupos de ancoragem lábeis em meio ácido.

Para a preparaçao de peptidamidas por meio da síntese por reacção em fase sólida, utilizam-se em geral resinas de benzidrilamina ou de metil-benzidrilamina como, por exemplo, é descrito por J. P. Tam e col., Tetrahedron Letters, 22, 2851 (1981). Um outro método consiste na amonólise de ésteres de benzilo de peptidos ligados a um veiculo (C. Ressler e oaL. , J. Am. Chem. Soc., 76, 3107 (1951)).

fm’.

Ambos estes métodos se forte necessário para a eliminação do distanciador (ácido fluorídrico líquido ou ácido trifluormetano-sulfónico) originarem reacçoes secundárias ou a eliminação incompleta.

A presente invenção tem como objectivo proporcionar um novo distanciador que possibilita uma separação mais suave e melhor das peptidamidas da resina de suporte.

De acordo com a presente invenção, este objectivo é atingido mediante a utilização de compostos de fórmula geral I

R² R³

na R¹	qual significa alquilo em G^-Cg ou arilo em eventualmen-
te	substituído;
R²	significa hidrogénio ou um radical de aminoácido que es-
tá	protegido com um grupo de protecçao da amina eliminável
em	meio ligeiramente ácido ou básico;
R³	significa hidrogénio ou alquilo em C^-C^ ;

genio,

em que radical é alcóxi em C^-C ou alquilo em C^-C^, os radicais podem ser iguais

-O-(CH_) -COOH; e z n n significa um numero inteiro de 1 até la geral I, número inteiro em

-COOH, ₄ ou -0-(CH_o) diferentes,

2'η mas um

Sao preferidos os compostos significa metilo e ou 3.

de fórmu_D1 que R

1, n representa o

Sao igualmente preferidos os compos2 tos desta fórmula geral I em que R significa um radical de aminoácido, que está protegido com um grupo de protecçao de uretana - em especial, Fmoc (fluorenilmetóxi-carbonilo)- e

R significa hidrogénio.

, 1 9

Os símbolos Y a Y significam ainda, especialmente, metilo ou metóxi, em que no entanto um destes símbolos significa -0-(CH2)_n-COOH e, pelo menos, quatro destes símbolos significam hidrogénio.

De preferência, Y^, Y³, Y^, Y⁷ ou Y⁸significam o radical -o-(CH„) -COOH.

n

Os radicais alquilo e alcóxi podem ser de cadeia linear ou ramificada.

radical arilo em C^-C^^ é por exemplo, fenilo, naftilo, bifenililo ou fluorenilo; de preferência, é fenilo,

R^z significa o radical de um aminoácido, de preferência, de um ^-aminoácido que, caso seja quiral, pode existir sob a forma de D ou L. Preferem-se os radicais .. dos aminoácidos que existem na Natureza, os seus enantiómeros, homólogos, derivados e metabólitos simples (veja-se,

por exemplo, Wunsch e col., Houben-Weyl 15/1 e 2, Stuttgart, Thieme 1974). De entre estes interessam por exemplo: Aad, Abu, TAbu, ABz, 2Abz, fAca, Ach, Acp, Addp, Ahb, Aib, (3Aib, Ala, pAla, AAla, Alg, All, Ama, Amt, Ape, Apm, Apr, Arg, Asn, Asp, Asu, Aze, Azi, Bai, Bph, Can, Cit, Cys, Cyta,

Daad, Dab, Dadd, Dap, Dapm, Da Glu, Gly, Guv, hCys, His, hSer Iva, Kyn, Lant, Lcn, Leu, Lsg, Min, nArg, Nle, Nva, Oly, Orn, Pro, APro, Pse, Pye, Pyr, Py Sem, Ser, Thi, β Thi, Thr, Thy Tyr, Vai, assim como os radica ácidos anantioméricos.

u, Djan, Dpa, Dtc, Fel, Gin,

Hyl, Hyp, 3Hyp, Ile, Ise,

Lys, (SLys, ALys, Met, Mim, Pan, Pec, Pen, Phe, Phg, Pic, , Pza, Qin, Ros, Sar, Sec,

Tia, Tle, Tly, Trp, Trta, s dos correspondentes D-aminor; Nas cadeias laterais dos mencionados radicaos de aminoácidos podem existir grupos funcionais protegidois. Os grupos de protecçao apropriados são descritos em Hubbuch, Kontakte (Merck), 1979, N^s 3, págs. 14 - 23 e em Bullesbach, Kontakte (merck), 1980, N² 1, pág. 23 - 35.

Os grupos de protecçao lábeis em ácidos fracos ou lábeis em bases sao especialmente os grupos de protecçao de uretano, como, por exemplo, Fmoc, Ddz, Bpoc, Msc, Peoc, Pse, e Tse, de preferência, Fmoc (veja-se por exemplo, Hubbuch, Kontakte (merck) 1979, N² 3, pág 14-23.).

A presente invenção refere-se também a um processo para a preparaçao dos compostos de fórmula )I) caracterizado pelo facto de

a) se fazer reagir um composto de fórmula (II) na

R¹ te

qual significa alquilo em C^-Cg substituído;

ou arilo em C z- — C _Ί . o 14 eventualmenY¹, Y², Y³, Y⁴, Y⁵, Y⁶, Y⁷, Y⁸ e Y⁹ significam hidrogénio, alquilo em C^-C^, alcoxi em C^-C^ ou -O-CCI^^-COOH em que os radicais podem ser iguais ou diferentes, mas um radical é -O-(CH₂)_n-COOH; e n significa um número inteiro de 1 até 6;

com um composto de fórmula (III)

R² R \/

N

I

H na qual

R^z significa hidrogénio ou um radical de aminoácido que é protegido com um grupo de protecçao de amino eliminável em meio ácido fraco ou em meio básico, e

«*

R significa hidrogénio ou alquilo em C|-C^; ou

b) se fazer reagir um composto de fórmula (IV)

com hidroxilamina, de maneira a obter-se um composto de fórmula (V)

(V) na qual r1, Y¹, Y², Y³, Y⁴, Y⁵, Y⁶, Y⁷, Y⁸ e Y⁹ são como de definiu acima,

- 6 seguida, reduzir-se a de preferência (S. Gaehde, G.

em com zinco

Matsueda,

451 (1981)) e,

oxima de maneira a obter-se a amina no seio eventualmente, se de acido acético glacial

Peptide Protein transformar num seu derivado

A reacção dum composto de fórmula (II) com um composto de fórmula (II) realiza-se, de preferência, no seio de um dissolvente prótico polar, por exemplo, ácido acético, a uma temperatura compreendida entre 0°C e o ponto de ebulição da mistura reaccional.

Os compostos de fórmula (II) sao novos.

Obtêm-se compostos de fórmula (II), por exemplo, por redução de derivados de benzofenona de fórmula (IV)

(IV) na qual

R¹, Y¹,

Y²,

Y³, γ4 acima, com agentes para o grupo ceto, _v5 _v6 _v7 _v8 _v9

Y , Y , Y , Y e Y sao como redutores apropriados, isto por exemplo, boro-hidreto de sódio.

se definiu e, selectivos

Os derivados de benzofenona de fórmula (IV) obtêm-se

a) por reacção de benzofenonas de fórmula (IV) na qual r! é como se definiu acima e y\ Y^ , Υ³, Y^ Y³, Y³, Y⁷,Y³ e

Y significam hidrogénio, alquilo em C^-C^, alcoxi em C^-C^ e um dos símbolos Y^ a Y^ significa hidroxilo, com ácidos gordos U) -halogenados de fórmula (VI)

Hal-(CH_O) -COOH n

(VI) na qual

Hal significa halogéneo e n é como se definiu acima, ou os seus ésteres, realiezando-se, em seguida, no caso dos grupos éster, uma saponificaçao alcalina do agrupamento éster, por exemplo, com lixívia de hidróxido de sódio (M. Prashad e col., Indian J. Chem. 178, 496 - 498 (1979)),

b) por exemplo, fórmula (VII) por reacçao de cloretos de ácido benzóico de

(VII) com ácidos \)J-fenóxi-alcanóicos de fórmula (VIII)

R¹, Υ¹, Υ², Υ⁴, Υ⁵, Υ⁶, Υ⁷, Υ⁸, Υ⁹ e η são como se definiu em a) e R⁴ significa alquilo em Cj-Cg, de preferência, metilo ou etilo, com utilização de um catalizador de Lewis como, por exemplo, tricloreto de alumínio ou tetracloreto de titânio (Organikum 13^a Edição, página 354 (1974)); ou

c) por reacção do correspondente cloreto do ácido benzóico de fórmula (VII) com fenóis correspondentemente substituídos de fórmula (IX) de modo a obterem-se os correspondentes ésteres de fenilo de fórmula (X)

(X)

subsequente deslocação de Fries com ácidos de Lewis como, por exemplo, tetracloreto de carbono (R. Martin e col., Monatsh. Chemie 110. 1057 - 1066 (1979) e posterior reacção com ácidos gordos -halogenados de fórmula (VI) em que Hal e n são como se definiu acima.

Os compostos de fórmula (VIII) preparam-se por reacçao dos cortrespondentes fenóis de fórmula (IX)

(IX) com os correspondentes ésteres de ácidos U/ -halogéneo-alcanóicos, por exemplo, com hidreto de sódio de dimetil-formamida (DMF) ou carbonato de potássio em acetona.

Procedendo de maneira análoga, podem também preparar-se os correspondentes compostos de fórmula geral I das fórmulas VII, VIII, IX e X.

A invenção refere-se ainda à utilizaçao dum composto de fórmula I, em que R nao significa hidrogénio, na síntese realizada por reacçao em fase sólida de compostos de fórmula (XI)

P-R²-NH-R³ (XI) na qual

P significa um radical de péptido proveniente de (γ-amino- 2

-ácidos, em que q p+1, R significa um radical de aminoácido que é protegido com um grupo de protecçao de amino eliminável em meio ácido fraco ou em meio básico e R^J é como se definiu acima, bem assim como a um processo para a preparaçao dum peptido de fórmula (XI) em que

3 P, R e R sao como se definiu acima, por meio de uma síntese por reacçao em fase solida, que se caracterizad pelo facto de junto de uma resina se acoplar um composto de fórmula (I) com os reagentes de acoplamento usuais utilizados na química dos péptidos, por intermédio do agrupamento -0-(CH„) -COOH, se eliminar o grupo de protec2 n ção do aminoácido R , se acoplar sucessivamente nas fases q-p por grupos de protecçao do grupo amino lábeis em ácidos fracos ou lábeis em bases de o(-aminoácidos temporariamente protegidos, eventualmente sob a forma dos seus derivados activados e, depois de terminar a construção do peptido de fórmula (XI), se libertar da resina por tratamento com um ácido mediamente fraco, em que simultaneamente ou por processos apropriados se eliminam em seguida os grupos de protecção da cadeia lateral temporariamente inseridos.

Se, para se evitarem reacções secundárias ou no caso de ser necessário para a síntese de péptidos especiais, os grupos funcionais presentes na cadeia lateral dos aminoácidos podem ser adicionalmente protegidos por grupos de protecçao apropriados (veja-se por exemplo, T.W. Greene, Protective Groups in Organic Synthesis”, Nova Iorque, John Wiley and Sons, 1981) em que a primeira linha se inserem Arg(Tos), Arg(Mts), Arg(Mtr), Asp(OBzl), Asp(Obut); Cys(4-MeBzl), Cys(Acm), Cys(SBut), Glu(OBzl), Glu(Obut), His(Tos), His(Fmoc), His(Dnp), His(Trt), Lys(Cl-2), Lys(Boc), Met(O), Ser(Bzl), Ser(But), Thr(Bzl), Thr(But).

r

de suporte podem obter-se comercialmente ou preparar-se como, por exemplo, as resinas de álcool alcoxi-benzílico, as resinas de aminometilo ou as resinas de benzidrilamino. Preferem-se as resinas de benzidrilamino (BHA) ou de metil-benzidrilamino (MBHA). 0 cargamento determina-se por análise de aminoácidos e/ou por análise elementar.

Como reagentes de acoplaçao para o (I) e os outros derivados de aminoácidos composto de fórmula podem empregar-se todos os reagentes de activaçao possíveis empregados na síntese dos peptidos, veja-se, por exemplo, Houben-Weyl, Methoden der Organischen Chemie, Volume 15/2, mas especialmente as carbo-di-imidas como, por exemplo, N,N’-diciclo-hexil-carbodiimida, N,N’-di-isopropil-carbodiimida ou N-etil-N'-(3-dimetilamino-propil)-carbodiimida. 0 acoplamento pode realizar-se directamente por adiçao de derivado de aminoácido com o reagente de activaçao e, almente, exemplo, 4-dimetilamino-piridina, (HOBt) (W. Konig, R. Geiger, Chem. Ber., ou 3-hidroxi-4-oxo-3,4-di-hidro-benzotriazina Konig, R. Geiger, Chem.

mas também se pode realizar separadamente via do derivado de aminoácido sob a forma trico ou de éster de HOBt ou de activada pode ser adicionada no priado para a resina eventucom uma adiçao que evita a racemizaçao, como, por 1-hidróxi-benzotriazol

708 (1970)) (HOObt)

Ber. 103, 2054 (1970)) para a a activaçao de anidrido

HOObt e a solução da seio de um dissolvente aprode peptido susceptível de acoplamento.

103, (W.

resina presiméespecie acoplamento ou a activaçao do composto de fórmula (I) e do derivado de aminoácido com um dos reagentes de activaçao acima mencionados pode realizar-se no seio de dimetil-formamida ou de cloreto de metileno ou duma mistura destes dois dissolventes. 0 derivado de aminoácido activado pode ser empreghado correntemente num excesso compreendido entre 1,5 e 4 vezes. No caso de se realizar um

acoplamento incompleto, repete-se a reacçao de acoplamento sem previamente realizar o necessário desbloqueamento do grupo (X-amino da resina de péptido do aminoácido que se encontra mais próximo.

A realizaçao sequencial da reacçao de acoplamento pode efectuar-se por meio da reacçao de ninidrina, como, por exemplo, é descrito por E. Kaiser e col., Anal. Biochem. 34, 595 (1970). A síntese pode também automatizar-se, por exemplo, com o sintetizador de péptidos do Mod. 430A da firma Applied Biosystems, caso em que se podem utilizar nao só os programas de síntese previstos pelo fabricante do aparelho, mas também os preparados pelo próprio utilizador. Estes últimos estão empregados especialmente no caso da utilização dos derivados de aminoácidos protegidos com o grupo Fmoc.

A eliminação da peptidamida da resina realiza-se por tratamento com as ácidos mediamente fortes correntemente utilizados na química dos péptidos (por exemplo, ácido trifluoracético), em que como captadores de catiões se podem utilizar substâncias como fenol, cresol, tiocresol, anisol, tioanisol, etanoditiol, sulfurato de dimetilo, sulfureto de etil-metilo ou semelhantes usualmente usados na síntese em fase sólida ou sozinhos ou numa mistura de dois ou mais destes reagentes auxiliares. 0 ácido trifluoroacético pode ser utilizado também depois de diluído com um dissolvente apropriado, por exemplo, cloreto de metileno.

Durante a separação do distanciador da resina, realiza-se simultaneamente a eliminação dos grupos de protecçao da cadeia lateral.

A purificação dos péptidos brutos assim obtidos efectua-se por meio de cromatografia em Sephadex (R), resinas permutadoras de ioes ou HPLC..

Os seguintes exemplos servem para esclarecimento da presente invenção sem que o respectivo âmbito seja limitado.

EXEMPLO 1

4-(4’-Metoxi-benzoil)-fenoxi-acetato de metilo

Dissolvem-se 64 g de cloreto de alumínio (isento de água) em 160 ml de 1,2-dicloroetano e adicionam-se 71,6 gramas de cloreto de 4-metoxi-benzoílo. Adicionam-se gorta a gota 57,6 ml de fenoxi-acetato de metilo, lentamente, sob agitaçao e aquece-se a mistura reaccional durante quatro horas a 50°C. Adiciona-se gota a gota a mistura reaccional a água com gelo, separando-se um óleo. Separa-se a fase aquosa, agita-se o resíduo por três vezes com água e cristaliza-se com metanol. Filtra-se o precipitado para o separar e recristaliza-se em acetato de etilo.

Rendimento: 54,9 gramas (53% da teoria); ponto de fusão: 146°C (148°C, acetato de etilo).

EXEMPLO 2

Ácido 4-(4'-metoxi-benzoil)-fenoxi-acÓtico de éster de metilo (Exemplo 1) em 120 ml de 1,2-dlmetoxietano/água (4:1, em volume:volume) e mistura-se com 15 ml de NaOH 2N. Agitao pH

Dissolvem-se 9,0 gramas

-se a mistura reaccional durante a 3 com HC1 3N. Evapora-se igual vácuo, separa-se por filtraçao em alto se com agua e seca-se três horas e regula-se o dissolvente orgânico produto que precipita, vacuo.

em lavaRendimento: 8,4 gramas (98% da -182°C.

teoria); ponto de fusão;

18114

EXEMPLO 3

(4-Carboxi-metoxifenil)-4’-metoxi-fenil-carbinol

Dissolvem-se 11,4 gramas de ácido 4-(4*-metoxi-benzoil)-fenoxi-acético em 600 ml de metanol a 80% (a refluxo) e adicionam-se 4,4 ml de N-metil-morfolina. No decurso de duas horas, adicionam-se em várias porçoes 6 gramas de boro-hidreto de sódio e prossegue-se a reacçao durante três horas, sob condições de aquecimento a refluxo. Arrefece-se a mistura reaccional até à temperatura ambiente e acidula-se a pH 2,5 com HC1 3N. Elimina-se o metanol por destilação, extrai-se a fase aquosa com acetato de etilo, lava-se com solução de cloreto de sódio e seca-se sobre sulfato de sódio. Depois de se eliminar por destilação o acetato de etilo, obtém-se um pó branco amorfo. 0 produto é imediatamente empregado na reacção seguinte.

Rendimento:

9,3 gramas (83% da teoria)

EXEMPLO 4

2-Metil-fenoxi-acetato de metilo

Dissolvem-se 108 gramas de 2-metil-fenol em 500 mL de acetona isenta de água e adicionam-se 165,8 gramas de carbonato de potássio pulverizado, à suspensão sob agitaçao adicionam-se 113 ml de bromo-acetato de metilo e continua-se a agitar à temperatura ambiente sob exclusão de humidade. Depois de a reacçao terminar, separa-se o sal por filtração sob sucção, lava-se em seguida com acetona e concentra-se o filtrado até à secura, Retoma-se com acetato de etilo, lava-se com água, seca-se a fase orgânica sobre sulfato de magnésio e concentra-se até à secura.

Rendimento: 180 gramas dum líquido oleoso, que se faz reagir directamente em seguida.

r

EXEMPLO 5

4-(4'-Metoxi-benzoil)-2-metil-fenoxi-acetato de metilo

Dissolvem-se 146,6 gramas de tricloreto de alumínio isento de agua em 500 ml de 1,2-dicloro-etano. Ã temperatura de 0°C, adicionam-se gota a gota, sucessi!

i vamente, 187 gramas de cloreto de 4-metoxi-benzoílo e 180 g de 2-metil-fenoxi-acetato de metilo. Para se completar a reacçao, aquece-se a 50°C. Despeja-se a mistura reaccional em gelo e regula-se a pH igual a 2 com HC1 2N. Separa-se por filtraçao sob sucção o produto que precipita e lava-se com água e com um pequeno volume de éter. Dissolve-se a quente o precipitado em acetato de etilo com a adiçao de um pequeno volume de carvao activado, filtra-se e cristaliza-se a -10°C. Separa-se o produto por filtraçao sob sucção, lava-se com éter e seca-se em alto vácuo.

Rendimento: 172,8 gramas (55% da teoria).

Ponto de fusão: 92-95°C.

EXEMPLO 6

4-(4’-Metoxi-benzoil)-2-metil-fenoxi-acetato de metilo

Em 200 ml de DMF isenta de água, dissolvem-se 50 gramas de 4-hidroxi-3-metil-4^f-metoxi-benzofenona (R. Martin e col., Monatsh Chemie 110, 1057 - 1066 (1979)) e, sob uma atmosfera de N₂» mistura-se cuidadosamente com 9 gramas de uma dispersão a 55% de hidreto de sódio em óleo mineral. Em seguida, adicionam-se gota a gota, sob agitaçao, 19,5 ml de bromo-acetato de metilo e deixa-se repousar durante a noite à temperatura ambiente. Separa-se por filtração sob sucção o sal que precipita e encontra-se o filtrado em vácuo até ã secura. Retoma-se o resíduo em acetato de etilo e lava-se com solução de hidrogeno-carbonato de sódio e com

água. Seca-se a fase orgânica sobre sulfato de magnésio e elimina-se o dissolvente por vaporizaçao. Tritura-se o resíduo com éter, separa-se por filtraçao sob sucção e seca-se. Rendimento: 38,9 gramas (60% da teoria)

Ponto de Fusão: 96-98°C.

EXEMPLO 7

4-(4’-Metoxi-benzoil)-fenoxi-acetato de metilo

Dissolvem-se 29,1 gramas de 4-hidroxi-4¹-metoxi-benzofenona (R. Martin e col., Monatsh. Chemis 110, 1057 - 1066 (1979)) em 400 ml de acetona isenta de água. Em seguida, sob agitação, adicionam-se 19,3 gramas de I^CO^ finamente pulverizado e 16 ml de bromo-acetato de metilo e agita-se à temperatura ambiente. Depois de decorridos dois dias, a reacçao está terminada. Separa-se por filtraçao sob sucção o sal precipitado da mistura das substâncias e concentra-se o filtrado até à secura. Despejam-se os dois resíduos em agua e regula-se a pH 3 com HC1 2N. Separa-se por filtraçao sob sucção, lava-se com água e seca-se em exsicador sob alto vácuo.

Rendimento: 35,7 gramas (98% da teoria) Ponto de Fusão: 143 - 145°c

EXEMPLO 8

Ácido 4-(4'-metoxi-benzoil)-2-metil-fenoxi-acético

Agitam-se à temperatura ambiente 35,8 gramas de 4-(4’-metoxi-benzoil)-2-metil-fenoxi-acetato de metilo com uma mistura de 240 ml de dioxano e 240 ml de NaOH 0,5 N. Depois de a reacçao ter terminado, elimina-se por destilação o dissolvente orgânico, regula-se a fase aquosa a pH 3 com HC1 2N e extrai-se com acetato de etilo. Lava-se com água, seca-se sobre sulfato de magnésio e concentra-se até a secura. Obtêm-se cristais amarelos claro.

Rendimento: 30,2 gramas (83% da teoria). Ponto de Fusão: 149 - 151°C.

EXEMPLO 9 (4-Carboxi-metoxi-3-metil-fenil)-4'-metoxi-fenil-carbinol

Dissolvem-se 22,5 graams de ácido 4-(4’-metoxi-benzoil)-2-metil-fenoxi-acético numa mistura constituída por 100 ml de dioxano e 200 ml de água sob adição de NaOH IN. a solução sob agitaçao, adicionam-se em várias porçoes 2,8 gramas de boro-hidreto de sódio e deixa-se repousar durante a noite. Em seguida, elimina-se o dioxano por vaporização, regula-se a fase aquosa a pH 3 com HC1 2N e extrai-se com acetato de etilo. Seca-se a fase orgânica sobre sulfato de magnpesio e concentra-se até à secura. Obtém-se uma espuma incolor que se tritura com n-hexano, de maneira a obter-se um pó amorfo, e em seguida, separa-se por filtraçao sob sucção. 0 produto é empregado directamente na reacçao seguinte .

Rendimento: 19,2 gramas (84% da teoria).

EXEMPLO 10

2,6-Dimetil-fenoxi-acetato de metilo

Dissolvem-se 65 g de 2,6-dimetil-fenol em 200 ml de DMF isenta de água e, sob atmosfera de I^, adicionam-se em várias porçoes 23,2 gramas de uma suspensão a 55% de hidreto de sódio em óleo mineral. Depois, sob agitaçao, adicionam-se gota a gota 50,4 ml de bromo-acetato de metilo e deixa-se repousar a mistura durante a noite. Separa-se por filtração sob sucção o sal formado e concentra-se o filtrado até à secura. Retoma-se o resíduo em acetato de etilo e extrai-se com água. Seca-se a fase orgânica sobre sulfato de sódio e concentra-se até á secura. Obtém-se um líquido

oleoso que se emprega directamente na reacçao seguinte. Rendimento: 95,8 gramas (92% da teoria).

EXEMPLO 11

2,6-Dimetil-4-(4'-metoxi-benzoil)-fenoxi-acetato de metilo

A síntese realiza-se procedendo de maneira análoga a que se descreveu no Exemplo 5, com 19,4 g de 2,6-dimetil-fenoxi-acetato de metilo.

Rendimento: 17,4 gramas (53% da teoria).

EXEMPLO 12 (4-Carboxi-metoxi-3,5-dimetil-fenil)-4’-metoxi-fenil-carbinol

Ã temperatura ambiente, agitam-se 16,4 gramas de 2,6-dimetil-4-(4’-metoxi-benzoil)-fenoxi-acetato de metilo numa mistura de 100 ml de NaOH 0,5 e 100 ml de dioxano. Depois de terminada a saponificaçao do éster de de boro-hidreto de sódio e metilo, adicionam-se 1,89 gramas deixa-se reagir durante a noite, filtraçao sob sucção uma pequena lúvel, concentra-se o filtrado ate a fase aquosa assim obtida com HC1 IN. de etilo, lava-se a fase orgânica co fato de magnésio e concentra-se até à secura, amorfo que se utiliza directamente para a reacçao seguinte. Rendimento: 11,3 gramas (71% da teoria).

Em seguida, quantidade de material insosepara-se por secura e acidula-se a seca-se sobre sulObtém-se um pó

Maneira de Proceder Geral para a Preparaçao da (4-carboxi-metoxi-fenil-4'-metoxi-fenil)-metilamida do No(-Fmoc-aminoácido, assim como da (4-carboxi-metoxi-3-metil-fenil-4'-metoxi-fenil)-metilamida do N -Fmoc-amino-ácido e da (4-carboxi-metoxi-3,5-dimetil~fenil-4'-metoxi-fenil)-metilamida do N o(-Fmoc-aminoácido

Dissolvem-se 10 mmoles de amida de N & -Fmoc-aminoácido e 10 mmoles do correspondente carbinol na quantidade necessária de ácido acético glacial isento de água e adicionam-se cinco a dez gotas de ácido sulfúrico concentrado. Adicionam-se ainda 2 gramas de peneiro molecular e deixa-se repousar durante a noite. Em seguida, separa-se por filtraçao sob sucção o peneiro molecular e dilui-se o filtrado com a quantidade de água necessária para que o produto precipite parcialmente. Extrai-se a fase aquosa com acetato de etilo e sacode-se a fase orgânica com água. Recristaliza-se a substância que se obtém depois de secagem sobre sulfato de magnésio e evaporaçao até à secura.

Procedendo de acordo com a maneira de proceder geral acima referida, preparam-se os seguintes compostos:

EXEMPLO 13 (4-Carboxi-metoxi-fenil-4’-metilamida de N ^-Fmoc-glicina

Rendimento: 65%.

Ponto de Fusão: 136 - 138°C.

EXEMPLO 14 (4-Carboxi-metoxi-fenil-4’-metoxi-fenil)-metilamida de N °( -Fmoc-alanina

Rendimento: 65%.

Ponto de Fusão: 159 - 162°C.

EXEMPLO 15 (4-Carboxi-metoxi-3-metil-fenil-4'-metoxi-fenil)-metilamida de N q( -Fmoxc-glicina

Rendimento: 60%.

Ponto de Fusão: 135 - 140°C

EXEMPLO 16 (4-Carboxi-metoxi-3-metil-fenil-4'-metoxi-fenil)-metilamida de N %-Fmoc-valina

Rendimento: 81%.

Ponto de Fusão: 172 - 175°C.

EXEMPLO 17 (4-Carboxi-metoxi-3,5-dimetil-fenil-4’-metoxi-fenil)-metilamida de N o(-Fmoc-glicina

Rendimento: 70%.

Ponto de Fusão: 122 - 126°C.

EXEMPLO 18

Síntese de oxitocina

H-Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NHL _________________________________I ² com utilização do composto de ancoragem descrito no Exemplo 13

A síntese realizou-se num sintetizador de péptidos fornecido pela firma Fa. Labotec.

De 1,5 gramas de resina de Boc-Val (carregamento 0,76 mmole/grama), em primeiro lugar elimina-se o grupo de protecçao, com ácido trifluoroacêtico no seio de cloreto de metileno. Depois de se lavar com diclorometano e etil-di-isopropilamina e de novo com diclorometano, seca-se

de de a resina. Em seguida, adicionam-se 2,1 mmoles do composto ancoragem preparado de acordo com o Exemplo 13 juntamente com 3,15 mmoles de HOBt dissolvido em 20 ml de DMF isenta água sobre a resina e adicionam-se 2,3 mmoles de di-isopropil-carboxi-imida. Sob lenta mistura, deixa-se reagir a tem peratura ambiente durante a noite. Verifica-se que a reacça está completa por meio da reacção de ninidrina (ensaio de Em seguida, separa-se por filtraçao sob sucção a lava-se

Kaiser).

resina, com DMF e, em seguida, constrói-se o péptido sobre a resina, realizando ciclicamente as seguintes operações :

- Eliminação do grupo de protecçao Fmoc com 20% de piperidina em DMF.

- Lavagem da resina com DMF.

- Acoplamento do Fmoc-aminoacido sob activaçao in situ como éster de HOBt com utilização de como reagente de activaçao (2,1 di-isopropil-carbodi-imida mmoles de aminoácido, 3,15 mmoles de HOBt,

2,3 mmoles de di-isopropil-carbo-di-imida).

- Lavagem da resina com DMF.

(ensaio de Kaiser),

Se o acoplamento estiver incompleto repete-se a operaçao de acoplamento.

Como grupos de protecçao da cadeia lateral, utiliza-se butilo terciário para a tirosina e butiltio para a cisteína.

Depois de a síntese terminar, separa-se em primeiro lugar ainda o grupo de protecçao Fmoc e, em seguida, lava-se a resina sucessivamente com DMF, diclorometano, isopropanol, diclorometano e éter terc.-butil-metílico e seca-se em alto vácuo. Obtêm-se 2,4 gramas de resina de peptido.

A separaçao realiza-se à temperatura ambiente com uma mistura de ácido trifluoroacético/tioanisol/ /etanoditiol (80/15/5). Depois de duas horas, separa-se por filtração sob sucção em éter terc.-butil-metílico, separa-se por centrifugação o peptido bruto que precipita e lava-se por três vezes com éter terc.-butil-metílico. A separaçao do grupo de protecçao terc.-butiltio realiza-se com tributil-fosfina em trifluoretanol/água a pfí 7,3. Cicliza-se o 5-H peptido com iodo em ácido acético a 60% e purifica-se por (R) cromatografia em Sephadex ^J LH 20 em metanol.

Rendimento em oxitocina: 33%, idêntico a uma amostra de comparaçao autêntica.

Claims

Processo para a síntese de peptidamidas pelo método da reacçao em fase sólida, de fórmula I

CH (D na qual r! significa alquilo em C^-Cg te substituído,
2 ,

R significa hidrogénio ou um radical de aminoacido, que e protegido com um grupo de protecçao do grupo amino eliminável em meio ácido fraco ou em meio básico,

R significa hidrogénio ou alquilo em C^-C^, γΐ, Y³, γ³, Υ⁴, Υ⁵, Υ⁶, Υ⁷, Υ³ e Υ^ significam hidrogénio, alquilo em C^-C^, alcoxi em C^-C^ ou -O-ÍC^^-COOH em que os radicais podem ser iguais ou diferentes, mas um radical é -0-(CH_o) -COOH e

2 n n significa um número inteiro de 1 até 6, caracterizado pelo facto de

a) se fazer reagir um composto da fórmula II * 4 na

R¹ _γ3 (II) qual significa alquilo em C^-Cg substituído,

2 _v3 _γ5, γό, _γ7, _y8 θ _γ9 _signi£icam hidrogénio, ou arilo em Ch-C, . eventualmen6 14 te

Y¹, Y^, Y^J, Y^, Y alquilo em C^-C^, alcoxi em C^-C^ ou -0-(CH2)_n~C00H, em que os radicais podem ser iguais ou diferentes, um radical mas é -O-(CH„) -COOH, e z n n significa um número inteiro de 1 até 6, com um composto da fórmula III

2 * * na qual R^z significa hidrogénio ou um radical de aminoácido que é protegido com um grupo de protecçao do grupo amino eliminável em meio ácido fraco ou básico, e

R^J significa hidrogénio ou alquilo em C^-C^, ou

b) se fazer reagir um composto da formula IV * 1 (IV) com hidroxilamina de maneira a obter-se um composto da fórmula V (V) na qual

R¹, Y¹, Y², Y³, niu em a), em seguida, amina e eventualmente se transformar nos seus derivados

Ϊ⁴, , y⁶, ϊ reduzir-se

Y⁸ e Y⁹ a óxima com obtenção serem como se def i de

- 2^g Processo para a preparaçao dum composto da fórmula I, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de, nesta fórmula, significar metilo e n ser um dos números inteiros 1, 2 ou 3.
3^a

Processo para a signigrupo preparação dum composto da fórmula I de acordo com uma ou as duas reivindicações , 2

1 e 2, caracterizado pelo facto de, nesta formula, R ficar um radical de aminoácido que é protegido com um de protecçao de uretana e R significa hidrogénio.

-
4^a

Processo para a preparaçao dum compos to da fórmula I de acordo com uma ou várias reivindicações

1 9 3

1 a 3, caracterizado pelo facto de, os radicais Y , Y , Y , γ\ Y³, γ6, Y⁷, Y⁸ e Y^ significam metilo ou metoxi, em que no entanto um destes radicais significa -O-(CH2)_n-COOH e pelo menos 4 destes radicais significam hidrogénio.
5^a

Processo para a preparaçao dum composto da fórmula I, de acordo com uma ou várias reivindicações 1 a 4, cais Y¹, Y³, Y⁵, Y⁷ ou caracterizado pelo facto de, nesta fórmula, os radi1 significam radical -0-(CH_o) -COOH. z n
6^a

Processo para preparaçao dum peptídeo da fórmula XI (XI) de peptido de #-aminoácidos em que e

1, na qual

P significa um radical q % p+1 ,

R^z significa um radical de aminoácido

3 '

R e como se definiu na reivindicação por síntese em fase sólida, caracterizado pelo facto de se acoplar um composto da fórmula I de acordo com uma ou mais ~ 2 das reivindicações 1 a 5 em que R nao significa hidrogénio *2 a uma resina, se eliminar o grupo de protecçao R do aminoa27 eido , se acoplarem em fase sucessivas q - p -aminoácidos temporariamente protegidos por grupos de protecçao de amino lábeis em meio básico ou lábeis por ácidos fracos eventualmente sob a forma dos seus derivados activados e depois de terminar a construção, se libertar o peptido da fórmula XI com um ácido mediamente forte de resina, eliminando-se simultaneamente ou mediante métodos apropriados subsequentes, se eliminar de novo os grupos de protecçao das cadeias laterais introduzidos temporariamente.

- 7^â Processo para a preparaçao dum composto da fórmula II

_Y8 Y⁹ Υ¹ γ² λ --— ( ΟΗ \ | / ^Ε1·^0_\γ 1 / CH —4 λ'¹ (II) Υ⁷ Υθ γ

na qual r! significa alquilo em C^-Cg ou arilo em Cg-C^^ eventualmente substituído, Y¹, Y², Y³, Y⁴, Y⁵, Y⁶, Y⁷, Y⁸ e Y⁹ significam hidrogénio, alquilo em C^-C^, alcóxi em C^-C^ ou -0-(CH2)_n~C00H em que os radicais podem ser iguais ou diferentes mas um radical é -0-(CH_o) -COOU e

2 n n significa um número inteiro de 1 a 6, caracterizado pelo facto de se reduzir um derivado de benzofenona da fórmula IV

- 28 % | (IV) na qual

R¹, Y¹, Y², Y³, Y⁴, Y⁵, Y⁶, Y⁷, Y⁸ e Y⁹ são como se definiu acima.