PT845007E - Composicao farmaceuica contendo inibidores de interferao-gama - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA CONTENDO INIBIDORES DE INTERFERÃO-GAMA" A presente invenção refere-se a composições farmacêuticas para promoção de cicatrização de feridas ou lesões fibróticas, em particular para a promoção de cicatrização de feridas ou lesões fibróticas com cicatrização deficiente reduzida ou para a promoção da cicatrização de feridas crónicas.

Por "feridas ou lesões fibróticas" entende-se qualquer condição da qual possa resultar a formação de tecido cicatrizante deficiente. Em particular, isto inclui a cicatrização de feridas da pele, a reparação de lesões de tendões, a cicatrização de lesões provocadas por esmagamento, a cicatrização de lesões do sistema nervoso central (SNC), condições das quais pode resultar a formação de tecido cicatrizante deficiente no SNC, formação de tecido cicatrizante deficiente resultante de derrames, e adesão de tecido, por exemplo, como resultado de acidentes ou cirurgia (pode aplicar-se por exemplo à cicatrização de tendões e aos estrangulamentos e adesões abdominais). Exemplos de lesões fibróticas incluem fibrose pulmonar, glomerulonefrite, cirrose do fígado, vítreo-retinopatia proliferativa.

Em particular, existe uma ausência de composições para promover a cicatrização de feridas ou lesões fibróticas com cicatrização deficiente reduzida. A formação do tecido cicatrizante deficiente, embora proporcione resistência mecânica à ferida cicatrizada, pode tomar-se feio e pode prejudicar a função do tecido. 4 * -2-

4 * -2- X ,Ο f

Este é particularinente ο caso de feridas das quais resulta a formação de tecido cicatrizante deficiente no SNC, que inibindo a reconexão das terminações nervosas lesionadas ou o seu recrescimento, pode afectar significativamente a sua função.

Existe também uma falta de composições para utilizar no tratamento de feridas crónicas, como por exemplo as úlceras venosas, úlceras de diabéticos e escaras (úlceras de decúbito) especialmente nos doentes idosos e confinados a cadeiras de rodas. Tais composições podem ser extremamente úteis em doentes cuja cicatrização de feridas é lenta, ou naqueles em que o processo ainda não se iniciou. Tais composições podem ser utilizadas para "despoletar" a cicatrização de feridas e podem por isso ser utilizadas em combinação com composições (e.g. as do PCT/GB93/00586) que promovem a cicatrização de feridas ou de lesões fibróticas com cicatrização deficiente reduzida. Assim, não só uma ferida crónica podem ser cicatrizada, como pode ser cicatrizada com reduzida cicatrização deficiente.

De acordo com a presente invenção é proporcionado um inibidor de IFN-γ (Interferão-γ) para utilizar na cicatrização de feridas ou lesões fibróticas com reduzida cicatrização deficiente. IFN-γ (Interferão do tipo II ou Imune ) é produzido primariamente por linfócitos T sob estimulação mitogénica ou antigénica (Trinchieri et al., 1985, Immunology Today, 6:131).IFN-y (quer murino quer humano) exerce os seus efeitos através da ligação específica e saturada a uma única classe de receptores de elevada afinidade, que se encontram numa variedade de células incluindo fibroblastos, células endoteliais, e monócitos/ macrófagos. IFN-γ Tem sido largamente estudado (ver, por exemplo, Kovacs, -3-

E.J., 1991, Immunology Today 12(1):17-23 - que afirma que o IFN-γ reduz a proliferação de fibroblastos e a produção de tecido conjuntivo, i.e. inibe a formação de tecido cicatrizante deficiente). Estudos anteriores sobre o efeito de IFN-γ em locais de feridas, demonstraram (Pitei, B. et al., 1994, Plastic and Reconstructive Surgery, 93: 1224-1235) que em estudos sobre o efeito da injecção intralesional do IFN-γ em cicatrizes hipertróficas (um espessamento anormal do músculo) a maior parte dos doentes (6/7) mostraram alívio dos sintomas, e todos os doentes apresentaram uma redução do tamanho das lesões durante o tratamento, embora não houvesse alterações no teor do colagénio total. Duncan et al (1985, J.Exp. Med.,162: 516-527) e Amento et al (1985, J. Clin. Invest.,76: 836-848)) demonstraram que o IFN-γ inibe a síntese do colagénio dos tipos I e III e da fíbronectina por fibroblastos dérmicos e sinoviais e colagénio do tipo II pelos condrócitos numa forma dependente da dose. Murray et al( 1985, J.Immunol.A 34:1619-1622) mostraram também que IFN-γ está envolvido na activação de macrófagos in vivo. Tamai et al (1995, J. Invest. Dermatol.,104: 384-390) demonstraram que IFN-γ está envolvido na regulação das metaloproteases (MMP) e nos inibidores de tecidos de metaloproteases (TIMP) na cultura de células in vitro.

Parece que IFN-γ é uma molécula multipotente, com muitas acções dependendo das condições do meio ao qual é adicionada. Várias equipas descreveram existir uma diminuição na síntese de colagénio in vitro quando se adiciona IFN-γ às culturas, e Granstein et al (1989, J. Invest. Dermatol., 93: 18-27) demonstraram haver uma inibição da deposição de colagénio e portanto cicatrização deficiente reduzida, em feridas tratadas com IFN-γ. Destes resultados, crê-se que o tratamento de locais (de feridas ou lesões fibróticas) com IFN-γ resultaria numa cicatrização com cicatriz deficiente reduzida.

As experiências realizadas, muito surpreendentemente, mostraram que (ver abaixo a secção "Experimental") a inibição do IFN-y promove efectivamente a cicatrização com cicatriz deficiente reduzida, apesar dos ensinamentos do estado da técnica. O inibidor pode, por exemplo, ser um anticorpo neutralizante. Pode ser um anticorpo monoclonal, um anticorpo policlonal, anticoipo ou derivado de um fago, um anticorpo produzido por engenharia genética (por exemplo o diacorpo) ou um anticorpo derivado de um ratinho transgénico.

Altemativamente, o inibidor pode ser qualquer um que inibe IFN-γ de interactuar com o seu receptor (i.e. antagoniza a activação do receptor do IFN-γ) ou que inibe a activação do receptor. Pode por exemplo ser uma molécula que imita a sequência da ligação do receptor do IFN-γ e que se liga ao receptor mas não o activa, assim inibindo competitivamente a ligação do IFN-γ ao receptor e inibindo a activação do receptor. O inibidor pode ser utilizado em conjunto com um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável. O inibidor pode ser utilizado em conjunto com uma composição para promover a cicatrização de feridas ou lesões fibróticas com cicatrização deficiente reduzida. 0 inibidor pode ser utilizado em conjunto com uma composição para cicatrizar feridas crónicas.

De acordo com a presente invenção, é também um método para a promoção da cicatrização de feridas ou lesões fibróticas com cicatrização deficiente reduzida, incluindo a inibição do IFN-γ. -5- /--¾ | j*'l .' J i ! C- ^if&BS*******·*^***· \ —" -/ /<v. í '< ’ A inibição pode ser conseguida por administração a um local de um inibidor do IFN-γ. Por "local" entende-se a ferida ou a lesão fibrótica. O inibidor pode ser um inibidor de acordo com a presente invenção.

Podem ser inibidas entre 300 a cerca de 30000 UI de IFN-γ. O IFN-γ pode ser inibido imediatamente antes da formação de ferida/início (por "início" entende-se o início da doença fibrótica). Pode ser inibido imediatamente depois da ferida/início, embora possa ser inibido mais adiante, por exemplo dentro de 3 a 7 dias da ferida/ início. O método pode ser utilizado em conjunto com um método para promover a cicatrização de feridas ou lesões fibróticas com cicatrização deficiente reduzida. O método pode ser utilizado em conjunto com o método para promover a cicatrização das feridas crónicas. A invenção pode ser mais evidente a partir dos exemplos seguintes, que mostram a título de exemplo apenas, formas de inibição do IFN-γ e promoção de cicatrização com cicatrização deficiente reduzida e a promoção de cicatrização de feridas crónicas.

Parte Experimental Método: 84 ratinhos, machos, CDI, de 12 a 15 semanas de idade (Charles River) foram anestesiados utilizando partes iguais de halotano, oxigénio e óxido nitroso. Fizeram-se incisões de 2 x lcm com espessamento íotal (através da panícula carnosa) a 3 cm da base do crânio e lcm de cada um dos lados da linha média dorsal.

Foram usadas soluções de ensaio anti-IFN-γ, IFN-γ e PBS. Anti-IFN-γ incluiu anticorpos monoclonais contra IFN-γ murino ( MuIFN-γ; = IgG'2a de ratazana). Foram obtidos anticorpos como fluido ascético de ratinhos nus e sem timo, inoculados com clone do hibridoma F3 (J. ImmunoL, 1987, 138: 4178) e purificados por cromatografia de afinidade, em anti-mAB de cadeia Kappa de ratazana. O potencial de neutralização do anticorpo foi 1/1000000 contra 30 U/mL de MuIFN-γ contendo 1,25 ng/mL de endotoxina. IFN-γ era MuIFN-γ recombinante, derivado de células de ovários de "hamster" Chinês (CHO), purificado por cromatografia de afinidade em anti-IFN-γ mAB. A concentração inicial do IFN-γ era de 300000 ID/ml (endotoxina: 73 pg/mL).

Os animais foram separados em grupos como se segue:

Grupo A: Animais tratados com uma única injecção intraperitonal (IP) de 100 pL de anticorpos anti-IFN-γ puro antes da formação da ferida.

Grupo B: Animais tratados com uma única injecção intradérmica (ID) de 50 pL ou 25 pL de anticorpos antiIFN-γ (diluído com PBS) antes da formação da ferida.

Grupo C: Animais tratados com uma única injecção ID de IFN-γ (15000 ou 7500 UI) antes da formação da ferida.

Grupo D: Animais tratados com injecções de IFN-γ (15000 ou 7500 UI) ao dia 0 antes da ferida e 3 e 7 dias após a formação da ferida. /-Λ -7-

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Grupo Ε: Animais tratados com uma única injecção IP de controlo de PBS (soro fisiológico tamponado com fosfato ) ao dia 0 antes da formação da ferida (controlo).

Grupo F: Animais tratados com uma única injecção ID de PBS de controlo ao dia 0 antes da formação da ferida

Grupo G: Animais tratados com uma injecção ID de PBS ao dia 0 antes da ferida e 3 e 7 dias após formação da ferida.

Os animais foram sacrificados com uma sobredosagem de clorofórmio aos 7, 14, 70 e 120 dias após a ferida. As feridas foram extiipadas e dissecadas para histologia e imunocitoquímica de rotina . Cortaram-se secções de cera com 7 μηι e corou-se de Hemotoxilina e Eosina para avaliar a invasão e re-epitelialização das células e para a avaliar através do ensaio Masson's Trichome a deposição e orientação do colagénio.

Resultados

Anticorpos anti-IFN-γ: Não se observou diferença, em qualquer altura, entre as feridas de controlo e as feridas tratadas, nos animais tratados com uma única injecção IP.

Com uma única injecção ID de anti-IFN-γ não houve diferenças comparadas com os controles de 7 e 14 dias. Contudo, nos de 70 e 120 dias, foram observadas diferenças acentuadas na orientação das fibras do colagénio nas feridas tratadas. -8-

0 tratamento Anti-IFN-γ é anti-cicatrização deficiente, promovendo a qualidade da arquitectura dénnica, apesar das observações da técnica anterior. Enquanto as fibras ainda eram pequenas e compactadas, imediatamente por baixo da epiderme, elas encontravam-se aleatoriamente orientadas, enquanto que no meio e na profundidade da derme, estavam menos compactadas e orientadas como que numa tecelagem em cesto. As cicatrizes das feridas de controlo apresentavam as fibras de colagénio, compactadas paralelamente por toda a área da ferida. IFN-y

Aos primeiros dias (7 e 14 dias) todas as feridas tratadas (em ambos os regimes de injecções) demonstraram inflamação aumentada e angiogénese numa forma dependente da dose, i.e. doses baixas, embora pior que as feridas de controlo, mas não tão má como as feridas que foram tratadas com doses mais altas de IFN-y.

Aos 70 e 120 dias , as feridas tratadas aos dias 0, 3 e 7 após ferida, com dose elevada de IFN-γ mostraram fibrose acentuada (i.e. cicatrização deficiente). Observou-se, macroscopicamente, que as feridas estavam levantadas e que microscopicamente o colagénio estava densamente compactado em grandes bandas enroladas dentro dos limites da ferida. Estas feridas tratadas, mostraram ainda inflamação residual na base da ferida quando comparadas com as feridas de controlo. Novamente, esta cicatriz deficiente apresentava-se numa forma dependente da dose, i.e. quanto maior era a dose de IFN-y maior era a cicatrização deficiente. -9-

Discussao

Trabalhos anteriores demonstraram que a administração de IFN-γ a feridas inibe a síntese do colagénio, sugerindo que pode ser utilizado como agente anti-cicatrização deficiente. Outros autores demonstraram que o tratamento de quelóides ou cicatrizes hipertróficas com IFN-γ reduz o tamanho da cicatriz.

Contrariamente a estas observações, estas experiências mostraram , muito surpreendentemente, que o tratamento precoce das feridas com IFN-γ causa fibrose com cicatrizes levantadas que estão cheias de colagénio, enquanto que o tratamento das feridas por incisão com anticorpos para IFN-γ promove a cicatrização com fibras de colagénio em "tecelagem de cesto" assemelhando-se a uma derme normal (i.e. é reduzida a cicatrização deficiente).

Lisboa, 7 de Dezembro de 2001

ALBERTO CANELAS Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 14 1200 LISBOA

Claims (10)

1. - 1- <ν- L *>3*· rr REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de um inibidor de IFN-γ no fabrico de um medicamento para promover a cicatrização de feridas ou lesões fibróticas com redução da cicatrização deficiente.
2. 2. Utilização de um inibidor de IFN-γ de acordo com a reivindicação 1, em que o inibidor compreende um anticorpo neutralizante.
3. 3. Utilização de um inibidor de IFN-γ de acordo com as revindicações 1 ou 2, em que o inibidor pode ser seleccionado do grupo que consiste em anticorpo monoclonal, anticorpo derivado de um fago, anticorpo produzido por engenharia genética, anticorpo policlonal e um anticorpo derivado de um ratinho transgénico.
4. 4. Utilização de um inibidor de IFN-γ de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3, em que o inibidor previne a interacção do IFN-γ com o seu receptor.
5. 5. Utilização de um inibidor de IFN-γ de acordo com qualquer das reivindicações anteriores para utilizar em conjunto com um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamemte aceitável.
6. 6. Utilização de um inibidor de IFN-γ de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, para utilização em conjunto com uma composição para promover a cicatrização de feridas e lesões fibróticas com cicatrização deficiente reduzida. -2-
7. 7. Utilização de um inibidor de IFN-γ de acordo com qualquer das reivindicações anteriores para utilização em conjunto com uma composição para promover cicatrização de feridas crónicas.
8. 8. Utilização de acordo com qualquer das revindicaçôes 1 a 7, incluindo a administração de um inibidor de IFN-γ ao local da ferida ou fibrose
9. 9. Utilização de acordo com qualquer das revindicaçôes 1 a 8, incluindo a inibição de cerca de 300 a 30000 UI de IFN-γ.
10. 10. Utilização de acordo com qualquer das revindicaçôes 1 a 9 em que o IFN-γ é inibido quer imediatamente antes da formação da ferida/início, quer imediatamente após formação da ferida/início. Lisboa, 7 de Dezembro de 2001

    ALBERTO CANELAS Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 14 1200 LISBOA