PT79884B - Process for the preparation of cell culture microcarriers used for cultivating fixing dependent cells - Google Patents

Process for the preparation of cell culture microcarriers used for cultivating fixing dependent cells Download PDF

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    • C08B37/0021—Dextran, i.e. (alpha-1,4)-D-glucan; Derivatives thereof, e.g. Sephadex, i.e. crosslinked dextran
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Description

Descrição d· objecto do invento que
PFEIFER & LANGEN, alemã, industrial, co* sede em Linnicher Strasse 48, 5000 Colónia 41, Republica Federal da Alemanha, pretende obter em Portugal, para: “PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE MI. CROPORTADORES DE CULTURAS DE CÊLULAS, UTILIZADOS NA CULTURA DE CÉLULAS DEPENDENTES DE FIXAÇÃO”·
MOD. 71 — 3.000 EX. — 03-84
0 objecto do presente invento consiste nu* processo para a preparação de culturas de células co* par. ticipações químicas co* carga positiva de polisacaridos reticulados e grupos básicos que lhe estão ligados, processo esse utilizado na cultura de células dependentes de fixação numa cultura «icroportadora·
As bases de fixação e multiplicação de células hunanas e animais em culturas celulares têm sido desenvolvidas, sistematicamente, durante os últimos 20 anos. Presentemente estão estabelecidos com rigor em muitos laboratórios, processos para a cultura de células para a produção de substâncias de inoculação, anticorpos, enzimas e hormonas·
Células primarias e células diploides precisam duma base fixa com uma carga superficial marcada, pa. ra o seu crescimento· Estas células são designadas como células dependentes de fixaçac, porque so pedem crescer se puderem estar ancoradas num suporte·
0 suporte utilizado originalmente, foi
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sebretude vidre, em" forma de discee Petri, frasces de cultura e frase·» de cultura cilindrices sabre a superfície des aparelhes, porém, se se pede formar uma menecamada das células, de forma que fica limitada a superfície que esta à disposição per aparelhe· Per isse, a escala industrial, para essas cultu. ras de multiplicaçãe de células têm de ser lavades, esteriliza des milhares de frasces de cultura, cheies cem meie nutrien te, ineculades cem células e recelhida a celheita depeis de terminada a multiplicação das células· Mas cerne tedas estas fases têm de ser realizadas em condições esteréis, teraam-se dispendiosas e meresas'·
Cem a intreduçãe da multiplicaçãe da cultura de células sebre micrepertaderes per A.L· ven Wezel, Nature 216 (1967) pag· 64, fei desenvolvida uma tecnelegia aperfeiçeada, que pede eliminar es problemas apresentados acima· Cem esta técnica sae suspensos micrepertaderes num meie nutriente, cem um tamanho médio nes limites de 100 a 300 pm. Desde que es micrepertaderes apresentem uma carga superficial apropriada, as células dependentes de ancoragea fixam-se aes micrepertaderes e crescem sebre estes· 2 a 5 f/l (pese em seco) de micrepertaderes peêm ã disposição em meie nutriente uma superfície de 0,76 a 1,9 m2/l de volume de cultura· Pele contrarie, es frascos de cultura maiores oferecem apenas uma superfície de apreximadamente 0,16 m2. Per isso, 1 1 de cultura cem micrepertaderes esta em cendiçees de substituir 5 a 12 frascos cilíndricos, grandes· Mas es micrepertaderes nãe atingiram, até agora, a importância na escala industrial que em principie se havia esperado, porque es micrepertaderes apresentades até ã presente data ainda têm uma série de inconvenientes·
256.034
File W/Lo - 1230 ISniSlinl
MOD. 71 — 3,000 EX. — 03-84
A. L. van Wezel utilizou originalmente pérolas de Dextran, insolúveis que sã· substituídas com grupos de dietilaminoetilo e que são comercializadas como DEAE-Sephadex A-50 (Pharmacia AB, Suécia). Mas, no seu emprego mostram-se efeitos citotoxicos e de absorção do meio nutriente que se demonstram numa extinção inicial de células bem como num crescimento insatisfatório de células; vidé C.-B. Horng, W. Melimaus (Biotechnology and Bioengineering Vol. 17 (1975) pág. 743-732). Entretanto, foram desenvolvidos vários aperfeiçoamentos para microportadores que estão em condições de eliminar alguns dos inconvenientes originais'. Assim, na DEi.OS 29 09 340 está descrito um processo para · pré-tratamento de microportadores de culturas de células, no qual as pérolas oão impregnadas com soro de vitela, fetal, e aquecidas durante aproximadamente 10 min. no soro de 75 a 90°C.
Levine, Wong, Wang e Thilly experimen. taram com microportadores de espessura de carga diferente e chegaram á conclusão de que pérolas de Dextran-DEÃE com um diá metro de 150 um e com uma espessura de carga de 2 meq/g da matriz de Dextran, seca, são óptimas para a ancoragem de células e para o seu desenvolvimento; vidé D«W· Levine et al em Somatic Cell Genetrics Voí. 3 (1977), pág. 149 - 155, (OS-PS 4 189 534 bem como DE-OS 27 49 989).
Microportadores que em vez de 5,4 meq/ g, sá apresentam 1,5 a 2,0 meq/g de espessura de carga, foram entretanto comercializados pela Firma Pharmacia AB com a designação de *Cytodex-l" bem como pela Firma Flow Loboratories com a designação "Superbeads. A publicação "Microcarrier cell cultura, Principlés + methods" Edição 1981, que pode ser adqui,
56.034
l>
rida através da Firma Pharmacia AB, Uppsala, Suécia, dá um relance sebre as características e possibilidades de use destes produtos bem cem· uma introdução no desenvolvimento da tecnologia des micreportadores'·
Mas, infelizmente, também se demonstrou que estes micreportadores aperfeiçoados com uma capacidade de carga nitidamente reduzida continuam a apresentar na prática efeitos citotoxicos sobretudo em células sensíveis.
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A EP-OS 66 726 parte do principio que estas características citetoxicas dos micreportadores à base de Dextran-DEAE devem estar na estrutura quimica dos micrepertadores em si. Assim, é conhecido que os microportadores-DEAE além do substituinte-DEAE, com azoto ligado terciáriamente, contêm também grupos com azoto ligado quaternariamente que, na síntese dos micreportadores, formam uma nova reacção, que não pode ser completamente evitada, com mais cloroetil-dietil-amina· Pelos chamados grupos "TAndem” nesta, supoe-se que aetuam alquilando e são toxicas; vidé L.Ahrgren al al em "Polymeric Amines and Ammonium SAlts” E.J. Goethals, Pergamom Press, pág. 293 - 294. Da mesma forma, na publicação da firma Pharmacia AE "Microcarrier cell cultur”, pág. 27 chama-se a atenção para o facto de que com os processos de fabricação conhecidos para βε micreportadores de Dextran-DEAE são formados até 35# de grupos Tandem. No produto Cytodex-1 o teor dos grupos Tandem seria re« duzido para aproximadamente 15#·
Para serem cempletamente eliminados estes supostos efeitos citotoxicos, estão descritos na EP-OS 66 726, micreportadores que contêm apenas grupos amino quater-456’. 03 4
File W/Lo - 1230
nários· Esses microportadores estão comercializados pela Pharmacia AB, Suécia, sob a designação nCytodex-2”· Apresentam uma capacidade de carga de 0,5 a 0,8 meq/g.
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Apesar desta capacidade de carga já bastante reduzida, estse microportadores na prática continuam a apresentar ainda efeitos desvantajosos que são atribuídos a uma absorção de componentes ou partículas do meio nutriente pelo portador· Per isso, na DE-OS 30 33 885 encontram.se descritos microportadores isentos de carga que estão revestidos com polipeptídeos como colagem ou gelatina· Mas sobre estes microportadores so se podem ancorar células que contenham elementos estruturais sobre a sua superfície, que apresentem uma afinidade de união suficiente para a camada de polipeptidoos sobre o microportador.
0 presente invento visa desenvolver microportadores para culturas de células cem participações químicas cem carga positiva de polisacaridos reticulados e gn pos básicos que lhe estão associados, os quais não apresentem os inconvenientes acima indicados'· 0 invento propõe-se, principalmente, a tarefa de desenvoler microportadores que podem ser utilizados também em escala industrial para a criação de células sensíveis e não apresentem, consequentemente, na prática, qualquer toxicidade·
Esta tarefa foi resolvida, inesperadamente, pelo facto dos grupos básicos com carga positiva apresentarem a formula (i)
-5-
56'. 034
File W/Le - 1230
II
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<Z-? .)n
(I)
na qual Z é «aa cadeia de hidrocarbonetos, facultativamente substituída por, pele menos, 2 átomos de carbono, e R^ são iguais ou diferentes e representam grupes alquilo, arilo ou aralquilo e n é pelo menos Γ.
Os microportadores para culturas de células com esses grupos básicos com carga positiva tem.se de. monstrade, surpreendentemente, come não tóxicos, embora os pe. ritos da profissão partissem do princípio que justamente esses grupos eram particularaente tóxicos e por isso não bavia a pos. sibilidade de existirem ou então só em pequeno numero nos mi. croportadores de culturas de células'· Suspreendentemente, es. tes grupos básicos com carga positiva existem em numero bastante grande, de maneira que não se torna necessário limitar a quantidade dos meq/g de polisacaridos humedecidos, anidrose Uma das razões para estas propriedades, surpreendenteaente boas, dos microportadores para culturas de células, conforme c presente invento, parece residir, não na densidade de carga, mas no valor-pKs dos grupos básicos com carga positiva. Enquar to os grupos básicos de Sephadex-DEAE se situam e» 9,2, os valeres pKs dos microportadores conforme o invento situam.se nc âmbito de 5 a 8'· Num microportador preferido, de acordo com o invento e fácil de fabricar, Z representa um grupo etileno e R e R um grupo etilo e n é igual a 1, sendo o valor-pKs de
1 Λ
6,2’. Este microportador práticaaente é só substituído por grupos . "Tandem"·
-656*034
File w/Lo - 1230
I»
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Além de case nais simples, mencionado, de grupos - "Tandem”, conforme o invento, podem ser usados taafbém os grupos, nos quais Z apresente 3, 4 ou mais átomos de carbono e nos quais R* e Rg representem além do grupo etilo também grupos metilo, grupos propilo, grupos isepropilo e grupos butilo· Como os valores-.pKs continuam a ficar nos limites de, aproximadamente 5 a 8, R1 e R2» também podem ser grupos arilo, tais como, grupos fenilo e toluól bem como grupos aralquilo, tais como principalmente grupos benzilo>;. Visto os valores-pKs ficarem no âmbito de 5 a 8, n também pode ser maior dc que 1, de forma que podem ser usados igualmente grupes básicoc de 3 ou 4 grupos aminc/·
Come contra-iões negativos para es á. tomos de azoto com carga positiva, podem ser empregues em prirL. cípio todos os aniões orgânicos ou inorgânicos 'fisiolegicameni te toleráveis· Particularmente apropriados são os iões de cio. reto, fosfato, aulfato e acetato*·
Os valores-pKs dos substituintes básicos dos polisacaridos reticulados podem ser averiguados de 'foif-. ma simples por titulação^ As curvas de titulação apresentam o ponto de viragem conhecido no valor-pKs·
A preparação de novos microportadores de culturas de células de acordo cem o presente invento efectua-se pela reacção, em si mesmo, conhecida dos polisacaridoc reticulados com substâncias da Formula II
R.
(II)
1.
-756l.O34
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na qual Z é una cadeia de hidrocarbonetos, eventualmente substituída, de pelo aenos 2 átomos de carbono, R* e são iguait •u diferentes e representam grupos alquile, arilo eu aralqui. lo e Y é um grupo reactivo^, Cemo grupos reactivos podem ser considerados, principalmente, cloreto, brometo e ainda também grupos de ácido sulfonico, etc·, que estejam em condições de realizar uma alquilação.0 do polisacarido reticulado'·
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De acorde com o invento a reacção efectua-se, em presença de bases fortes em, pelo menos, 2 fases e, pelo menos, cem excesso 2.vezes molecular da substancia II. Neste caso, de preferencia a suspensão alcalina, aquosa de poe
lisacarido reticulado é deitada em toluol quente e reagida con a substância II com agitação’· A seguir, os grupos básicos, con carga positiva de preferência são neutralizados por aniões fisiológicamente toleráveis1·
Os polisacaridos reticulados preferidos que podem ser considerados são es polidextranes reticulados conhecidos'. Da mesma forma, porém, podem ainda ser usados principalmente outros polisacaridos expandíveis e reticulados como portadores dos grupos básicos, positivos'·
Nos exemplos seguintes são explicados mais em pormenor, os processos para a fabricação dos novos mi. croportadores e a sua utilização·
EXEMPLO 1
Fabricação dos microportadores:
13 g de pérolas Dextran, humedecidas
-85^.034
File W/Lo -1230
(Polydex PL-50 ou Sephadex G 50) cem uma admissão de água de cerca de 5 g/g e com uma granulometria de 80 a 100 |im são expandidos durante a noite em água destilada'· Depois da aspiração da água excedente, as pérolas expandidas são misturadas cem 5,2 g duma solução de sodio lexivxada a 43 por cento em peso· A suspensão alcalina assim preparada de pequenas esferai; de dextran é deitada em 120 g de toluol pré-aquecxdo a 50°C» Cem agitação vigorosa, são adicionados a esta mistura de reac., ção, 8 ml de cloroetil-dxetxl-aiâiná· Passadas 3 horas de reac., ção, a 50°C são adicionados gota a gota mais 10 ml de cloroetildietilamina"♦
MOD. 7t — 3.000 EX. — 03-84
Passadas mais 3 horas de agitação a 50°C, a reacção está terminada· As pérolas de dextran reagido são separadas da mistura de reacção por meio de filtração· Através de lavagem várias vezes com álcool e água destilada ben come regulação do valor-pH com ácido clorídrico diluído para 5,0, es microportaderes sao purificados'· A expansão efectua-so a seguir por tratamento repetido das pérolas com soluções de lavagem com concentração alcoolica crescente'· As pérolas expandidas são secas durante a noite a 80°C«
Microportadores fabricados segundo es.. te método contêm aproximadamente 4, de azoto e uma capacida.. de de carga de 2,86 meq/g de microportadores ou 4,66 meq/g do dextran, seco, não tratado.
A capacidade de permutação dos microportadores assim fabricados é de 2,4 meq/g microportadores ou 3,91 meq/g de dextran, seco, húmido, não tratado'.
-956.034
File W/Lo - 1230
II
MOD. 71 — 3.000 EX. — 03-84
Para a determinação da capacidade de permutação são expandidos 1,0 g de micrepertadores secos em água destilada, transportados para uaa pequena coluna e lavados várias vezes coa 0,1 n de ácido clorídrico*. A eliminação dos iões de cloreto não ligados efectua-se por lavagem das pé rolas com ácido clorídrico 10”^n'.
Pela adição duma quantidade suficiente de solução de sulfato de sedio a 10/, os iões de cloreto ligados são expulsos e determinados como indicadores por titulação de eluato com solução de nitrato de prata 0,1 e cromaj to de potássio1·
Como resultado é então obtido meq Cl por grama de microportadores. A conversão para meq Cl” per gr« ma de pérolas de dextran não tratadas efectua-se segundo a seguinte formula:
capacidade de permutação/g - dextran humedecido, não tratado, seco =
t meq cl”/g microportadores
X · UUU JL
1.000 - 135 X /N X Í.000
100 X 14
A determinação da estrutura doe compostos de azoto assim ligados efectua-se por titulação de 1 g dos microportadores secos em 20 ml duma solução de cloreto de potássio 1 m depois da regulação do valor-pH de saída para 12 com ácido clorídrico 1,0. A curva de titulação mostra devido à ausência duma fase no limite-pH de 10 a 8,5» que já não estão existentes mais grupos maino terciários. 0 valor-pKs do composto amino anda entre 5 a 7.
in
56'. 034
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l>
MOD. 71 — 3.000 EX. — 03-84
EXEMPLO 2
Pela variação das quantidades de sódio lexiviade e cloroetilI
-dietil-aaina, usados, são fabricados os microportadores nfis· 434, 416, 432 e 4354
EXEMPLO 3
(cinética de crescimento de células-CMK (Ril de macaco Green)
5 mg/l de microportadores, fabricados segundo o Exemplo 1 ou 2 são incubados em pratos Petri bacteriológicos, 0,6 cm, 1 ho. ra a 37°C com 5 ml de meio MEM (Minimium Essential Médium) + 8# FBS (soro bovino fetal)·
O
Depois da adição de células-GMK, frescas, dissolvidas em tripsina/Versen, de forma a regular-se uma concentração de 2,6 X 10^ células/ml de meio, efectua-se de 15 em 15 minutos a recolha duma amostra*· Através da contagem das células não liga* das pode ser determinada a velocidade de crescimento1·
Em comparação com o material portador
de células conforme o invento, foi realizada ao mesmo tempo a
cinética de crescimento também com os microportadores a adqui* (R)
rir por compra no mercado sobre base de Dextran (Cytodex ) com uma espessura de carga de 2,0 meq/g de matriz Dextran,neu..
tra e com o permutador de aniões Sephadex A-50
(RX
Os resultados estão apresentados na Fig· 1 e mostram que os novos microportadores mesmo com capacidade de carga alta não são tóxicos, enquanto que com Sephatex A-50, os efeitos tóxicos, conhecidos apareciam logo passa4 dos cerca de 75 minuto^.
-1156.034
File W/L· - 1230
EXEMPLO 4
0 crescimento de células dependentes de ancoragem no Exemplo de células-GMK sobre os microportadores 416 e 421 com espessuras de carga diferentes*.
MOD. 71 — 3.000 EX. — Ο3-Θ4
Cada 0,3 g dos microportadores secos foram expandidos em 20 ml de PBS e a seguir esterilisados a 115°C durante 15 minutos a 15 psif.
0 PBS foi posto de parte e substituído por meio de cultura, quente. Como meio de cultura foi usado por exemplo MEM (Minimúm Essentxal Médium) com uma adição de 8» de soro bovino fetal (soro de vitela fetal ou soro de feto de vitela)*· A suspensão das pérolas foi transferida para um frasco de cultura, de preferência, com um frasco especial de fiação'· 0 volume foi cheio com o meio de cultura + 8% de FBS até 100 ml, gaseificado e temperado'· A inoculação foi efectua. da com um inoculo de células de células-GMK 1,3 X 10 («Rim de macaco Verde), que provinham da Passagem ns. 127 do Instituto de Virologia da Universidade de Colónia e estiveram 5 dias em frascos de plástico com meio de cultura*.
Após uma fase de ancoragem, estática, inicial, foi regulada uma velocidade de agitação de 30 UpM. A mudança de meio era efectuada de 48 em 48 horas1*· 0 crescimento das células foi vigiado ao longo dum período de 170 horas separando as células dos portadores por meio de tripsina e contando segundo um Processo de Sanfortet al, modificado (J. Natí. Câncer Inst'· II, 737 (1951). Para comparação foi determinado ao mesmo tempo o crescimento nos microportadores Gytodex-1 conhecidosí, 0 resultado depreende-se da Fig. 2 e mostra
56.034
File W/Lo - 1230
que e crescimento é bom sobre os novos microportadores mesmo com uma capacidade de carga elevada·
MOD. 71 — 3.000 EX. — 03-84
Substância A B C D
434 1,0 0,66 0,71 0,73 0,79
416 b8 1,14 1,29 1,38 1,56
432 3,8 2,33 2,71 3,68 4,27
421 4,0 2, 4 2,86 3,91 4,66
435 4,8 3,'O 3,43 5,59 6,39
Senhadex A-50 4,2 2,7 3,0 4,54 5,04
Cytodex-A 1,8 1,2 1,29 1,45 1,56
A : capacidade de permutação por g de mxcroportador
6 J capacidade de carga por g de aicroportador
C : capacidade de permutação por g de Dextran reticulado não tratado, anidro
D : capacidade de carga por g de Dextran humedecido, não tratado, anidra·
I»
0 depósito do primeiro pedido para o invento acima descrito foi efectuado na República Federal da Alemanha, em 28 de Janeiro de 1984 sob ο Νδ. P 34 02 927. 3'·
-

Claims (6)

  1. REIVINDICAÇÕES.
    Ifi'· - Processo para a preparação de microportadores de cultura de células com participações quimicas com carga positiva de polisacaridos reticulados e grupos básicos que lhes estão associados por reacção do polisacarido reticulado com substâncias da fórmula (II)
    -1356.034
    File W/Le - 1230
    Y - Z -N
    (II)
    MOD. 71 — 3.000 EX. — 03-84
    na qual Z é uma cadeia de hidrocarbonetos facultativamente substituídos de pelo menos 2 átomos de carbono, R* e Rg são iguais ou diferentes e representam grupos alquilo, arilo ou aralquilo e Y é um grupo reactivo caracterizado pelo facto de a reacção ser efectuada em presença de bases fortes em pelo menos duas fases e pelo menos com o excesso 2-vezes molecular da substancia II·
    0
  2. 2£. . Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a suspensão alcalina, aquosa de pelisacaridos reticulados ser deitada em toluol quente e feita reagir sob agitação com a substância II*
  3. 3®'« - Processo de acordo com uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo facto de os grupos básicos, com carga positiva serem a seguir neutralizados por aniões fisiologicamente toleráveis'·
  4. 4®. - Processo de acordo com a reivindicação 1, para a preparação de microportadores de culturas de células com participações químicas com carga positiva de polisacaridos reticulados e grupos básicos que lhesestão asso ciados, caracterizado pelo facto de os grupos básicos com car ga positiva apresentarem a formula I
    Γ© r©
    - 0 _ (Z_N_) _Z - N - H
    ι η ι
    (I)
    -14564034
    File W/Lo - 1230
    na qual Z é uma cadeia de hidrocarbonetos facultativamente substituídos de pelo menos 2 átomos de carbono, R* e R^ são iguais ou diferentes e representam grupos alquilo, arilo ou aralquilo e n é pelo menos 1'·
    MOD. 71 — 3.000 EX. — 03-84
  5. 5®. - Processo de acorde com a reivindicação 4, caracterizado pelo facto de Z ser um grupo etileno
    R e R_ representarem grupos etilo e n ser igual a 1‘·
    1 &
  6. 6®· - Processo de acordo com a reivindicação 4 ou 5, caracterizado pelo facto de os grupos básicos
    com carga positiva serem neutralizados por aniões fisiológi.
    «
    camente toleráveis?·
    l»
    -15-
    H ter ο por Ca.d ore 6
    Sopmjonuasap ap y
    Cirietica. <je Jesenoduimento
    ccCuLo-S -RMV 3q/1 de Microbortadores em (ή£Μ + 8“/o FQ$
    (.6 tf K) J
    o—o Cytodex
    1,5 meq CT/g •x 4,1 meq Cl"/g
    te
    X-—J
    0 25 50 75 100
    200
    Jemj3o £
    FIG.2
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