PT758905E

PT758905E - Composicoes farmaceuticas compreendendo hirudina

Info

Publication number: PT758905E
Application number: PT95905223T
Authority: PT
Inventors: Tudor Arvinte
Original assignee: Ucp Gen Pharma Ag; Novartis Ag
Priority date: 1994-01-26
Filing date: 1995-01-25
Publication date: 2001-11-30
Also published as: HU214823B; FI962979A; DE69521315T2; NO963113D0; ATE201996T1; MX9603010A; IL112388A0; EP0758905B1; EP0758905A1; HUT74879A; JP2001026548A; WO1995020399A1; NO963113L; AU1391595A; NZ278433A; DE69521315D1; JP3260760B2; FI962979A0; ES2159621T3; US6436901B1

Description

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-1 - DESCRIÇÃO "COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS COMPREENDENDO HIRUDINA" O presente invento refere-se a composições contendo hirudina e em particular a formulações em pó estáveis. A hirudina, um anticoagulante de ocorrência natural em sanguessugas (Hirudo medicinalis), não é uma única espécie polipeptídica mas uma classe de polipéptidos que actuam igualmente consistindo em pelo menos quatro representantes designados variante 1 de hirudina (HV1), variante 2 de hirudina (HV2) (cf. Pedido de Patente Europeia N° 158564), variante 3 de hirudina (PA) [cf. Pedido PCT N° 86/03493] e "des-(Val)2-hirudina" (cf. Pedido de Patente Europeia N° 158986). As variantes diferem umas das outras na estrutura em vários aminoácidos (especialmente, a sequência N-terminal de HV1 é Val-Val-Tyr, a de HV2 e de HV3 é Ile-Thr-Tyr e a de "des-(Val)2-hirudina" é Thr-Tyr) mas têm em comum uma acumulação de aminoácidos hidrófobos no terminal N e de aminoácidos polares no terminal C, um resíduo de tirosina (Tyr63) presente como sulfato-monoéster, três pontes dissulfídicas e a actividade anticoagulante.

Nos últimos anos foram clonados e expressos em hospedeiros microbianos ADNcs e genes sintéticos que codificam para variantes de hirudina. Embora os produtos de expressão não tenham o grupo sulfato-monoéster em Tyr63- e foram por isso designados "des-sulfatohirudinas" - vieram a exibir aproximadamente a mesma actividade biológica que as hirudinas naturais sulfatadas. A variante des-sulfatohirudina HV1 foi expressa em Escherichia coli

(Pedidos de Patente Europeia Nos 158564 e 168342) e em Saccharomyces cerevisiae (Pedidos de Patente Europeia Nos 168342, 200655, 225633, 252854 e 341215). De forma semelhante, a des-sulfatohirudina HV2 foi expressa em Escherichia coli (Pedido de Patente Europeia N° 158564) e em Saccharomyces cerevisiae (Pedido de Patente Europeia N° 200655, Pedido PCT N° 86/01224) e a des-(Val)2-des-sulfatohirudina foi expressa em Escherichia coli (Pedido de Patente Europeia N° 158986).

De acordo com o presente invento, pretende-se que o termo "hirudina" englobe hirudina, des-sulfatohirudina, uma variante de hirudina ou uma variante de des-sulfatohirudina ou um mutante destas, respectivamente, descritos na literatura e em particular um composto de des-sulfatohirudina ou um mutante deste obtenível a partir de uma estirpe de microorganismo transformado contendo ADN que codifique para uma des-sulfatohirudina ou um mutante desta. Tais des-sulfatohirudinas são, por exemplo, a variante de des-sulfatohirudina HV1, HV1 modificada (a, b), HV2, HV2 modificada (a, b, c), HV3, variantes de HV3 e des-(Val)2-des-sulfatohirudina.

As des-sulfatohirudinas preferidas são as que possuem a fórmula (SEQIDNo: 1)

Val Vai Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gin Asn Leu Cys Leu Cys 15 10 15

Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly Gin Gly Asn Xaa Cys Ile Leu Gly Ser 20 25 30

Asp Gly Glu Xaa Asn Gin Cys Val Thr Gly Glu Gly Thr Pro Xaa Pro 35 40 45

Gin Ser Xaa Asn Asp Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Glu Xaa 50 55 60 (I) -3-

na qual a) Xaa em 27,36 e 47 são cada um Lys, Xaa em 51 é His e Xaa em 62 é o resíduo peptídico Glu-Tyr-Leu-Gln (HV1), ou b) Xaa em 27 é Ile ou Glu e Xaa em 36, 47, 51 e 62 são tal como definidos em a) (HV1 modificado a), ou c) Xaa em 36 é Ile ou Glu e Xaa em 27, 47, 51 e 62 são tal como definidos em a) (HV1 modificado a), ou d) Xaa em 47 é Ile ou Glu e Xaa em 27, 36, 51 e 62 são tal como definidos em a) (HV1 modificado a), ou e) Xaa em 51 é Leu ou Asp e Xaa em 27, 36, 47 e 62 são tal como definidos em a) (HV1 modificado a), ou f) Xaa em 62 é seleccionado a partir do grupo que consiste em Glu-Tyr, Glu-Tyr-Leu, Glu-Asp-Leu-Gln, Glu-Glu-Leu-Gln, Glu-Tyr-Lys-Arg, Glu-Asp-Lys-Arg, Glu-Lys-Leu-Gln, Ser-Phe-Arg-Tyr, Trp-Glu-Leu-Arg, Glu-Tyr-Leu-Gln-Pro e Glu-Tyr-Leu-Gln-Arg e Xaa em 27, 36, 47 e 51 são tal como definido em a) (HV1 modificado b). ou possuindo a fórmula (SEQID No: 2) -4-

Leu Thr Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gin Asn Leu Cys Leu Cys 1 5 10 15 Glu Gly Ser Asn Vai Cys Gly Gin Gly Asn Lys Cys Ile Leu Gly Ser 20 25 30 Asp Gly Glu Lys Asn Gin Cys Vai Thr Gly Glu Gly Thr Pro Lys Pro 35 40 45 Gin Ser His Asn Asp Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Glu Glu Tyr Leu 50 55 60 Gin 65 (II) ou possuindo a fórmula (SEQID No: 3)

Ile Thr Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gin Asn Leu Cys Leu Cys 1 5 10 15 Glu Gly Ser Asn Vai Cys Gly Lys Gly Asn Lys Cys Ile Leu Gly Ser 20 25 30 Asn Gly Lys Gly Asn Gin Cys Vai Thr Gly Glu Gly Thr Pro Xaa Pro 35 40 45 Glu Ser His Asn Asn Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Glu Glu Xaa Leu 50 55 60 Gin 65 (III) na qual a) Xaa em 47 é Asn e Xaa em 63 é Tyr (HV2), ou -5- ,Ο ί r<\t í®**ifb i ^ b) Xaa em 47 é Lys, Arg ou His e Xaa em 63 é Tyr (HV2 modificado a), ou c) Xaa em 63 é Glu ou Asp e Xaa em 47 é Asn (HV2 modificado b), ou possuindo a fórmula (SEQID No: 4)

Vai Vai Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gin Asn Leu Cys Leu Cys 1 5 10 15 Glu Gly Ser Asn Vai Cys Gly Lys Gly Asn Lys Cys Ile Leu Gly Ser 20 25 30 Asn Gly Lys Gly Asn Gin Cys Vai Thr Gly Glu Gly Thr Pro Asn Pro 35 40 45 Glu Ser His Asn Asn Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Glu Glu Tyr Leu 50 55 60

Gin 65 (IV) ou possuindo a fórmula (SEQ ID No: 5)

Ile Thr Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gin Asn Leu Cys Leu Cys 1 5 10 15 Glu Gly Ser Asn Vai Cys Gly Lys Gly Asn Lys Cys Ile Leu Gly Ser 20 25 30 Gin Gly Lys Asp Asn Gin Cys Vai Thr Gly Glu Gly Thr Pro Lys Pro 35 40 45 Gin Ser His Asn Gin Gly Asp Phe Glu Pro Ile Pro Glu Asp Ala Tyr 50 55 60

Asp Glu 65 (V) -6-

M

HV3 e variantes da referida HV3 que se caracterizam por um encurtamento da estrutura primária em 1 ou 2 aminoácidos no terminal N ou em 18,10,9,6,4 ou 2 aminoácidos no terminal C.

Os compostos des-sulfatohirudina particularmente preferidos são os de fórmula I em que os grupos Xaa são tal como definidos em a) ou o composto de fórmula III em que Xaa em 47 é Lys e Xaa em 63 é Tyr. A hirudina mais preferida é a des-sulfatohirudina HV1 possuindo a fórmula I em que Xaa em 27, 36 e 47 são cada um Lys, Xaa em 51 é His e Xaa em 62 é o resíduo peptídico Glu-Tyr-Leu-Gln.

As hirudinas utilizadas no presente invento podem ser preparadas sinteticamente, p. ex., quimicamente ou de preferência através de técnicas recombinantes, ou através de isolamento a partir de sanguessugas.

De acordo com o presente invento o termo "mutante" refere-se a proteínas (muteínas) que exibem actividade anti-trombótica as quais diferem da hirudina ou des-sulfatohirudina nativa numa ou múltiplas mutações (cf. Pedidos de Patente Europeia N° 352227 e N° 352228). O ADN que codifica para os referidos mutantes que pode ser preparado através de métodos conhecidos na arte p. ex. mutagénese dirigida ao local, é clonado e expresso em hospedeiros microbianos tais como Escherichia coli e Saccharomyces cerevisiae.

Os compostos de hirudina utilizados no invento podem estar na forma livre mas também na forma de sais destes. Uma vez que contêm um grupo amino livre em vários resíduos de aminoácidos, os compostos podem estar na forma de sais de adição ácida. Os sais de adição ácida adequados são em -7-

particular sais fannacologicamente aceitáveis com ácidos convencionais terapeuticamente aceitáveis. Ácidos inorgânicos representativos são ácidos hidrohálicos (tais como ácido clorídrico) e também ácido sulfurico, ácido fosfórico e ácido pirofosfórico. Ácidos orgânicos representativos são em particular ácidos arenossulfónicos (tais como ácido benzenossulfónico ou p-toluenossulfónico) ou ácidos alcanossulfónicos inferiores (tais como ácido metanossulfónico), bem como ácidos carboxílicos tais como ácido acético, ácido láctico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido málico, ácido tartárico, ácido ascórbico e ácido cítrico. Como, no entanto, o composto utilizado no invento contém também grupos carboxilo livres em vários resíduos de aminoácidos, grupos carboxilo estes que conferem um carácter acídico a todo o péptido, estes podem também estar na forma de sais com bases inorgânicas ou orgânicas, p. ex. sais de sódio, potássio, cálcio ou magnésio, ou também sais de amónio derivados de amónia ou de uma base orgânica contendo azoto farmacologicamente aceitável. No entanto, uma vez que estes contêm ao mesmo tempo grupos carboxilo livres e grupos amino livres, podem também estar na forma de sais internos. São preferidos os sais farmacologicamente aceitáveis.

Um problema no desenvolvimento de uma forma de dosagem contendo hirudina é a sua fraca estabilidade em soluções aquosas e na forma de pó. A fraca estabilidade pode ser observada quando a hirudina é analisada através de métodos cromatográficos, tais como HPLC de fase reversa (RP-HPLC). Método de RP-HPLC: É utilizada uma coluna LiChroCART 125-4 (Merck LiChrospher 100 RP-18 5 pm). O solvente A é acetato de amónio a 0,5% em acetonitrilo/água (10:90), (v/v); o solvente B é acetato de amónio a 0,5% em acetonitrilo/água (25:75). A eluição é efectuada a 45°C utilizando uma taxa de fluxo de 0,5 ml/min. A eluição binária é um gradiente linear que começa no tempo zero com solvente B a 23% e atingindo 46% de solvente B após 24 minutos. Após 2 min. a 70% de solvente B a coluna é equilibrada durante 7 min. a 23% de solvente B. É mostrado na Fig. 1 um cromatograma típico de hirudina recombinante HV1 (CGP 39393) em água utilizando o método de RP-HPLC (1 mg/ml de hirudina).

Na Fig. 1 a área relativa do pico principal é de 95,15%. O armazenamento de hirudina em água à temperatura ambiente resulta num aumento de sub-produtos com o tempo. Isto mostra-se através de uma diminuição na área do pico principal e um aumento na área dos picos pequenos. As mudanças que ocorrem podem ser aceleradas utilizando experiências limite de temperatura i.e. armazenando a temperaturas elevadas.

Verificámos agora que o fosfato de potássio pode ser utilizado para aumentar a estabilidade da hirudina.

De acordo com isto o presente invento proporciona uma composição farmacêutica liofilizada compreendendo hirudina, fosfato de potássio e um açúcar. A composição do invento pode ser produzida formando uma solução aquosa dos ingredientes e depois liofilizando-a de um modo convencional. O fosfato de potássio é de preferência hidrogenofosfato dipotássico. -9-

«-Α

Este pode ser utilizado, na solução antes da liofílização, a uma molaridade de 0,1 a 0,5, de preferência de 0,1 a 0,3. Açúcares adequados incluem manitol, trealose, sacarose, sorbitol, frutose, glicose, maltose, lactose e dextrano. Os açúcares preferidos são o manitol e a trealose. A quantidade de açúcar na solução antes da liofílização pode ser tal de forma a produzir uma concentração de 5 a 50% (p/v) e de preferência de 5 a 20% (p/v). A solução antes da liofílização é de preferência isotónica. O pH da solução antes da liofílização pode ser de 4 a 10, de preferência de 6 a 9, sendo ainda preferível de 6,5 a 8.

Se desejado pode ser adicionado um tampão citrato à solução antes da liofílização p. ex. adicionando ácido cítrico. A molaridade do citrato pode ser de 0,1 a 0,5, de preferência de 0,1 a 0,3. A concentração de hirudina na solução antes da liofílização pode ser de 0,1 a 500 mg/ml, de preferência de 20 a 250 mg/ml. O produto liofílizado é estável durante longos períodos de tempo sem a necessidade de armazenamento refrigerado. Adicionalmente, após o produto ter sido novamente dissolvido em água, a solução resultante é também estável durante longos períodos embora a estabilidade em solução não seja tão boa como a estabilidade do pó liofílizado.

As soluções feitas através de nova dissolução do produto liofílizado podem ser utilizadas na produção de ampolas padrão, seringas de câmara dupla pré-cheias ou sistemas de multi-administração. As soluções podem como é claro -10-

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ser também utilizadas imediatamente para administração. O invento é ilustrado através dos seguintes Exemplos.

Exemplo 1 São produzidas soluções aquosas de des-sulfatohirudina recombinante HV1 (CGP 39393 de Ciba-Geigy) dissolvendo-a em (a) água; (b) 70 partes por volume de uma solução de trealose a 5% e 30 partes por volume de uma mistura de ácido cítrico/K2HP04, 150 mM a pH 7,4; (c) 30 partes por volume de uma solução de manitol a 5% e 70 partes por volume de uma mistura de ácido cítrico/K2HP04, 150 mM a pH 7,4; e (d) 30 partes por volume de uma solução de manitol a 5% e 70 partes por peso de K2HPO4, 150 mM a pH 7,4. Em cada caso a concentração de hirudina é de 30 mg/ml.

As soluções são liofilizadas e armazenadas a 46°C. Em tempos diferentes, as amostras são dissolvidas em água para 1 mg/ml de hirudina e o pico principal é medido através de RP-HPLC. Os resultados obtidos são dados na Tabela 1 abaixo.

Tabela 1

Sistema % da área do pico principal após 11 dias 42 dias 103 dias 132 dias 162 dias (a) 85,1 80,4 71,9 65,5 61,0 (b) 92,6 93,2 90,8 86,9 89,7 (c) 93,9 90,8 85,0 83,1 83,6 (d) 92,4 90,5 85,5 83,5 84,0 -11 -

Pode ser observado que a estabilidade se mantém a um nível elevado mesmo quando armazenadas durante longos períodos a 46°C.

Exemplo 2 São feitas soluções aquosas de des-sulfatohirudina recombinante HV1 (CGP 39393 de Ciba-Geigy) dissolvendo-a em diferentes misturas de açúcar/citrato/fosfato tal como se segue. Em cada caso são misturadas 30 partes por volume de açúcar com 70 partes por volume de citrato/fosfato. man 5%: CKP - K2HPO4 100 mM (1,74%); ácido cítrico 7 mM (0,134%); manitol 82 mM (1,5%); hirudina 4 mM (0,3%). sac 10%: CKP - K2HP04 100 mM (1,74%); ácido cítrico 7 mM (0,134%); sacarose 87,6 mM (3%); hirudina 4 mM (0,3%). tre 10%: CKP - K2HP04 100 mM (1,74%); ácido cítrico 7 mM (0,134%); trealose 87,6 mM (3%); hirudina 4 mM (0,3%).

As soluções são liofilizadas e armazenadas a temperaturas diferentes. Após um determinado tempo de armazenamento é dissolvida novamente uma amostra em água para lmg/ml de hirudina e o pico principal é medido por RP-HPLC. Os resultados obtidos são dados na Tabela 2 abaixo.

Tabela 2

Sistema % da área do pico principal após 8 dias 55 dias 55 dias 132 dias 79°C 59°C 46°C 26°C Água 34,0 59,6 75,9 89,6 man 1,5%: CKP 67,0 82,2 91,0 94,6 sac 3%: CKP 76,1 86,8 91,5 94,4 tre 3%: CKP 80,2 87,0 91,3 94,3 A estabilidade melhorada pode ser observada quando o pó é armazenado a várias temperaturas. A 26°C que é provavelmente ligeiramente acima das condições ambientes normais não existe degradação perceptível após 132 dias. -13- -13-

LISTAGEM DAS SEQUÊNCIAS INFORMAÇÃO GERAL REQUERENTE: (A) NOME: Ciba-Geigy AG (B) RUA: Klybeckstrasse 141 (C) CIDADE: Basle (E) PAÍS: Suíça (F) CÓDIGO POSTAL: 4002 (G) TELEFONE: 061 969 1111 (H) TELEFAX: 061 969 7976 (I) TELEX: 962991 (ii) TÍTULO DO INVENTO: Composições Farmacêuticas (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 5 (iv) FORMATO LEGÍVEL EM COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: Disquete

(B) COMPUTADOR: compatível com IBM PC

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SUPORTE LÓGICO: Chemtext Versão 1.50 SEQIDNO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 63-66 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iv) ANTI-SENTIDO: NÃO

Vai Vai Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gin Asn Leu Cys Leu Cys 1 5 10 15 Glu Gly Ser Asn Vai Cys Gly Gin Gly Asn Xaa Cys Ile Leu Gly Ser 20 25 30 Asp Gly Glu Xaa Afen Gin Cys Vai Thr Gly Glu Gly Thr Pro Xaa Pro 35 40 45 Gin Ser Xaa Asn Asp Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Glu Xaa 50 55 60 SEQ ID NO: 2 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 65 aminoácidos (A) TIPO: aminoácido (B) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(iii) HIPOTÉTICA:NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO

Leu Thr Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gin Asn Leu Cys Leu Cys 1 5 10 15 Glu Gly Ser Asn Vai Cys Gly Gin Gly Asn Lys Cys Ile Leu Gly Ser 20 25 30 Asp Gly Glu Lys Asn Gin Cys Vai Thr Gly Glu Gly Thr Pro Lys Pro 35 40 45 Gin Ser His Asn Asp Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Glu Glu Tyr Leu 50 55 60

Gin 65 - 15-

SEQ ID NO: 3 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 65 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO

Ile Thr Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gin Asn Leu Cys Leu Cys 1 5 10 15 Glu Gly Ser Asn Vai Cys Gly Lys Gly Asn Lys Cys Ile Leu Gly Ser 20 25 30 Asn Gly Lys Gly Asn Gin Cys Vai Thr Gly Glu Gly Thr Pro Xaa Pro 35 40 45 Glu Ser His Asn Asn Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Glu Glu Xaa Leu 50 55 60

Gin 65 SEQ ID NO: 4 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 65 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína -16-

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO

Gin 65 SEQ ID NO: 5 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 66 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iv) ΑΝΤΙ -SENTIDO: NÃO Ile Thr Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gin Asn Leu Cys Leu Cys 1 5 10 15 Glu Gly Ser Asn Vai Cys Gly Lys Gly Asn Lys Cys Ile Leu Gly Ser 20 25 30 Gin Gly Lys Asp Asn Gin Cys Vai Thr Gly Glu Gly Thr Pro Lys Pro 35 40 45 Gin Ser His Asn Gin Gly Asp Phe Glu Pro Ile Pro Glu Asp Ala Tyr 50 55 60 Asp Glu 65 Lisboa, 22 de Agosto de 2001

ALBERTO CANELAS Agente Oficial da Propriedade industrial RUA VICTOR CORDON, 14 1200 LISBOA

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Composição farmacêutica liofilizada compreendendo hirudina, fosfato de potássio e um açúcar.
2. Composição tal como reivindicada na reivindicação 1 em que o fosfato de potássio é hidrogenofosfato dipotássico.
3. Composição tal como reivindicado na reivindicação 1 ou 2 em que o açúcar é manitol, trealose, sacarose, sorbitol, frutose, glicose, maltose, lactose ou dextrano.
4. Composição tal como reivindicada em qualquer uma das reivindicações anteriores em que a hirudina é uma variante des-sulfatohirudina ou um mutante desta.
5. Composição tal como reivindicada em qualquer das reivindicações anteriores em que a hirudina é representada por SEQ ID No: 1.
6. Composição tal como reivindicada em qualquer uma das reivindicações anteriores a qual também contém um citrato.
7. Composição tal como reivindicada em qualquer uma das reivindicações anteriores a qual é obtida dissolvendo os ingredientes em água e depois liofílizando a solução.
8. Composição tal como reivindicada na reivindicação 7 na qual o pH da solução antes da liofilização é de 4 a 10. -2-
9. Composição tal como reivindicada em qualquer uma das reivindicações 7 a 9 em que a concentração de hirudina na solução antes da liofilização é de 0,1 a 500 mg/ml.
10. Composição tal como reivindicada em qualquer uma das reivindicações 7 a 11 em que a solução antes da liofilização é isotónica. Lisboa, 22 de Agosto de 2001

ALBERTO CANELAS Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 14 1200 LISBOA