JP2001026548A

JP2001026548A - ヒルジンを含んでなる医薬組成物

Info

Publication number: JP2001026548A
Application number: JP2000191094A
Authority: JP
Inventors: Tudor Arvinte; アービント，チュダー
Original assignee: UCP Gen Pharma AG; Novartis AG
Current assignee: UCP Gen Pharma AG; Novartis AG
Priority date: 1994-01-26
Filing date: 2000-06-21
Publication date: 2001-01-30
Also published as: GR3036574T3; FI962979A0; FI962979A; HU9602037D0; AU1391595A; JP3260760B2; PT758905E; DK0758905T3; NO963113D0; ES2159621T3; CA2181907A1; NZ278433A; EP0758905B1; US6436901B1; DE69521315D1; NO963113L; HUT74879A; JPH09508377A; ATE201996T1; ZA95577B

Abstract

(57)【要約】【課題】安定なヒルジン組成物の提供。【解決手段】本発明は、ヒルジン、リン酸カリウムお
よび糖を含んでなる凍結乾燥医薬組成物を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ヒルジン含有の組
成物に関し、特に安定な粉末製剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】ヒルジン、ヒル (Hirudo medicinalis)
において天然に産生する抗凝固剤は、単一のポリペプチ
ド種ではなく、ヒルジン変異体１（HV１）、ヒルジン変
異体２（注、ヨーロッパ特許出願第158564号) 、ヒルジ
ン変異体３（PA) 〔注、 PCT出願第86／03493 号〕およ
び“デス−(Val)₂−ヒルジン"(注、ヨーロッパ特許出願
第158986号）と命名された少なくとも４つの代表例から
成る、同等に作用するポリペプチドのクラスである。

【０００３】変異体は、アミノ酸の数により互いに構造
が異なる（特に、HV１のＮ末端配列は Val-Val-Tyrであ
り、HV２およびHV３のそれは Ile-Thr-Tyrでありそして
"des−(Val)₂−ヒルジン”のそれは Thr-Thr-Thrであ
る）が、しかしＮ末端に疎水性アミノ酸およびＣ末端に
極性アミノ酸の蓄積、スルファトモノエステルとして存
在するチロシン残基(Tyr⁶³) 、３つのジスルフィドブリ
ッジおよび一般に抗凝血作用を有する。

【０００４】過去２年にわたって、ヒルジン変異体をク
ローニングするcDNAおよび合成遺伝子がクローン化され
そして微生物宿主中で発現された。発現生産物は、 Tyr
⁶³でスルファトモノエステル基を欠いている（そして従
って“デスルファトヒルジン(desulphatohirudins)”と
命名された）けれども、それらは天然のスルファトヒル
ジンとほゞ同じ生物学的活性を示すことが判明した。デ
スルファトヒルジン変異体HV１は、エシェリキア・コリ
中で発現され（ヨーロッパ特許出願第158564号および第
168342号）そしてサッカロミセスセレビジエ（Saccha
romyces cerevisiae）中で発現され（ヨーロッパ特許出
願第200655号、 PCT出願第86／01224 号）そしてデス−
(Val)₂−デスルファトヒルジンは、エシェリキア・コリ
中で発現された（ヨーロッパ特許出願第158986号）。

【０００５】本発明によれば、語句「ヒルジン」は、そ
れぞれ文献で示されるヒルジン、デスルファトヒルジ
ン、ヒルジン変異体又はデスルファトヒルジン変異体又
はその突然変異体を包含することを意図しそして特にデ
スルファトヒルジン化合物又はデスルファトヒルジン又
はその突然変異体をコードする DNAを含有する形質転換
微生物菌株から得ることのできるその突然変異体を包含
することを意図する。そのようなデスルファトヒルジン
は、例えばデスルファトヒルジン変異体HV１，HV１修飾
（ａ，ｂ）、HV２修飾（ａ，ｂ，ｃ）、HV３、HV３の変
異体およびデス(Val)₂−デスルファトヒルジンである。

【０００６】好ましいデスルファトヒルジンは、次の式
（配列番号：１）

【化１】

【０００７】（ここでａ）27, 36そして47の Xaaは各々 Lysであり、51の Xaa
は Hisでありそして62のXaaはペプチド残基 Glu-Tyr-Le
u-Glnである（HV１）、又はｂ) 27の Xaaは、 Ile又は Gluでありそして36, 47, 51
および62の Xaaはａ）で定義されたものである（HV１修
飾ａ）、又はｃ）36の Xaaは Ile又は Gluでありそして27, 47, 51お
よび62の Xaaはａ）で定義されたものである（HV１修飾
ａ）、又はｄ）47の Xaaは Ile又は Gluでありそして27, 36, 51お
よび62の Xaaはａ）で定義されたものである（HV１修飾
ａ）、又はｅ）51の Xaaは Leu又は Aspでありそして27, 36, 47お
よび62の Xaaはａ）で定義されたものである（HV１修飾
ａ）、又はｆ）62の Xaaは、Glu-Tyr, Glu-Tyr-Leu, Glu-Asp-Leu-
Gln, Glu-Glu-Leu-Gln,Glu-Tyr-Lys-Arg, Glu-Asp-Lys-
Arg, Glu-Lys-Leu-Gln, Ser-Phe-Arg-Tyr, Trp-Glu-Leu
-Arg, Glu-Tyr-Leu-Gln-Proおよび Glu-Tyr-Leu-Gln-Ar
gから成る群から選ばれそして27, 36, 47および51の Xa
aはａ）で定義されたものである（HV１修飾ｂ))を有す
るものであるか、又は次の式（配列番号：２）

【０００８】

【化２】

【０００９】を有するものであるか、又は次式（配列番
号：３）

【化３】

【００１０】（ここで、ａ）は47の Xaaは Asnでありそして63の Xaaは Tyrであ
り（HV２）、又はｂ) 47の XaaはLys, Arg又は Hisでありそして63の Xaa
は Tyrであり（HV２修飾ａ）、又はｃ）63の Xaaは Glu又は Aspでありそして47の Xaaは A
snである（HV２修飾ｂ))を有するものであるか、又は次
の式（配列番号：４）

【００１１】

【化４】

【００１２】を有するものであるか、又は次の式（配列
番号：５）

【化５】

【００１３】を有するものである。HV３および該HV３の
変異体は、Ｎ末端で１又は２個のアミノ酸又はＣ末端で
18, 10, ９，６，４又は２個のアミノ酸だけ一次構造を
短かくすることによって特徴づけられる。特に好ましい
デスルファトヒルジン化合物は、式Ｉ（式中、 Xaa基は
ａ）のもとで定義されたものである）の化合物であるか
又は式III （式中、47の Xaaは Lysでありそして63の X
aaは Tyrである）の化合物である。最も好ましいヒルジ
ンは、式Ｉ（式中、27, 36および47の Xaaは各々 Lysで
あり、51の Xaaは Hisでありそして62の Xaaはペプチド
残基である) を有するデスルファトヒルジンHV１であ
る。

【００１４】本発明で用いられるヒルジンは、合成的
に、例えば化学的に製造できるか又は組換え技術によ
り、又はヒルから単離することにより製造できる。本発
明によれば、語句“突然変異体”は、簡単な又は多重の
変異により天然のヒルジン又はデスルファトヒルジンと
は異なる抗凝血作用を示すタンパク質（ムテイン(mutei
n)) を意味する（注、ヨーロッパ特許出願第352227号お
よび第352228号）。当業者に公知の方法、例えば部位特
異的変異誘発により生産される該突然変異体をコードす
る DNAをクローン化し次いでエシェリキア・コリ（Esch
erichia coli）およびサッカロミセスセレビジエ（Sa
ccharomyces cerevisiae）の如き微生物宿主中で発現す
る。

【００１５】本発明で用いられるヒルジン化合物は、遊
離形をとり得るがしかしそれらの塩の形であってもよ
い。該化合物は幾つかのアミノ酸残基中に遊離アミノ基
を含有しているので、化合物は酸付加塩の形をとること
ができる。適当な酸付加塩は、通常の治療的に許容し得
る酸と特に薬理学的に許容し得る塩である。代表的無機
酸はハロゲン化水素酸（例えば塩素）、および硫酸、リ
ン酸およびポリリン酸である。代表的有機酸はアレーン
スルホン酸（例えばベンゼンスルホン酸又はｐ−トルエ
ンスルホン酸）、又は低級アルカンスルホン酸（例え
ば、メタンスルホン酸）、並びにカルボン酸例えば酢
酸、乳酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リンゴ酸、酒
石酸、アスコルビン酸およびクエン酸である。

【００１６】しかし、本発明で用いられる化合物は幾つ
かのアミノ酸残基中に遊離カルボキシル基（このカルボ
キシル基はペプチド全体に酸性特性を付与する）を含有
しているので、それらは無機もしくは有機塩基との塩、
例えばナトリウム、カリウム、カルシウム又はマグネシ
ウム塩、又はアンモニア又は薬理的に許容し得る有機窒
素含有塩基から誘導されるアンモニウム塩の形をとり得
る。しかし、それらは遊離カルボキシル基と遊離アミノ
基を同時に含有するので、それらはまた分子内塩の形を
とり得る。薬理的に許容し得る塩は好ましい。ヒルジン
を含有する剤形を開発する際の１つの問題は、水性溶液
および粉末形においてその溶解性が劣っていることであ
る。劣った溶解性は、ヒルジンをクロマトグラフィー法
例えば逆相HPLC(RP-HPLC)により分析するとき見られ得
る。

【００１７】RP-HPLC法：LiChroCART 125-4カラムを用
いる（Merck LiChrospher 100 RP-18５μｍ）。溶剤Ａ
はアセトニトリル／水（10：90）、（ｖ：ｖ）中 0.5％
酢酸アンモニウムであり；溶剤Ｂはアセトニトリル／水
（25：75）中 0.5％酢酸アンモニウムである。溶出は
0.5ml／分の流速を用い45℃で行なわれる。二つの溶出
は、23％溶剤Ｂを用い零時から出発しそして24分後46％
溶剤に達する線状グラジエントである。２分後70％溶剤
Ｂで、カラムは23％溶剤Ｂで７分間平衡化される。

【００１８】RP-HPLC(１mg／mlヒルジン）を用い水中で
の組換えヒルジンHV１ (CGP39393)の典型的クロマトグ
ラムを図１に示す。図１において主ピークの相対的ピー
クは 95.15％である。室温で水中でヒルジンを保存する
と、時間と共に生成物が増加する。このことはそれ自身
主ピークの領域の減少および複数の小ピークの領域の増
加により示される。生起する変化は、温度ストレス実験
を用いることにより、すなわち高温での保存により加促
できる。

【００１９】今や、本発明者等はリン酸カリウムがヒル
ジンの安定性を増加するために使用できることを見出し
た。従って、本発明は、ヒルジン、リン酸カリウムおよ
び糖を含んでなる凍結乾燥医薬組成物を提供する。本発
明の組成物は、成分の水性溶液を形成し次いでそれを常
法で凍結乾燥することにより製造できる。リン酸カリウ
ムは好ましくはリン酸水素二カリウムである。それは、
凍結乾燥前、溶液中、 0.1〜0.5 のモル濃度、好ましく
は 0.1〜0.3 のモル濃度で使用できる。

【００２０】適当な糖には、マニトール、トレハロー
ス、スクロース、ソルビトール、フルクトース、グルコ
ース、マルトース、ラクトースおよびデキストランが含
まれる。好ましい糖は、マニトールおよびトレハロース
である。凍結乾燥前の溶液中の糖の量は、５〜50％（ｗ
／ｖ）、好ましくは５〜20％（ｗ／ｖ）の温度をもたら
すそのような量であってよい。凍結乾燥前の溶液は、好
ましくは等張である。

【００２１】凍結乾燥前の溶液のpHは、４〜10、好まし
くは６〜９、そして最も好ましくは6.5〜８であってよ
い。所望により、シトラート緩衝剤を、例えばクエン酸
を添加することにより、凍結乾燥前の溶液に添加でき
る。シトラートのモル濃度は、 0.1〜0.5 、好ましくは
0.1〜0.3 である。凍結乾燥前の溶液中のヒルジンの濃
度は、 0.5〜500 mg／ml、好ましくは20〜25mg／mlであ
る。

【００２２】凍結乾燥生成物は、冷凍保存に対する必要
性はなく、長期間安定である。加えて、生成物を水に再
溶解した後、生成溶液はまた長期間安定であるがしかし
溶液中の安定性は凍結乾燥粉末の安定性程良好でない。
凍結乾燥生成物を再溶解することによって製造される溶
液は、標準アンプル、予備充てん二重チャンバ注射器、
又はマルチ投与システムの製造に用いることができる。
溶液は、勿論、投与に対し直ちに使用できる。本発明を
次の実施例により説明する。

【００２３】例１．組換えデスルファトヒルジンHV１
（チバガイギーからのCGP39393) の水性溶液は、それを
（ａ）水；（ｂ）５％トレハロース溶液の70容量部およ
びクエン酸／K₂HPO₄混合物の30容量部、pH 7.4で 150m
M；（ｃ）５％マニトール溶液の30容量部およびクエン
酸／K₂HPO₄混合物70部、pH 7.4で 150mM；および（ｄ）
５％マニトール溶液の30容量部およびK₂HPO₄の70重量
部、pH 7.4で 150mM中に溶解することにより製造され
る。各々の場合、ヒルジンの濃度は30mg／mlである。

【００２４】溶液を凍結乾燥しそして46℃で保存する。
異なる時間、サンプルを水に溶解し１mg／mlヒルジンと
し次いで主ピークを RP-HPLCにより測定する。得られた
結果を下記の表１に示す。

【表１】安定性は、46℃で拡大された期間保存されたときでさえ
高いレベルで維持されていることがわかる。

【００２５】例２．組換えデスルファトヒルジンHV１
（チバ−ガイギーからのCGP39393) の水性溶液を、次の
如くそれを種々の糖／シトラート／ホスフェート混合物
に溶解することにより製造する。各々の場合、30容量部
の糖を、70容量部のシトラート／ホスフェートと混合す
る。 man ５％：CKP −100mM K₂HPO₄ (1.74％) ; ７mMクエン
酸(0.134％) ; 82mMマニトール(1.5％) ；４mMヒルジン
(0.3％). suc 10％：CKP −100mM K₂HPO₄ (1.74％) ; ７mMクエン
酸(0.134％) ; 87.6mMスクロース（３％) ；４mMヒルジ
ン(0.3％). tre 10％：CKP −100mM K₂HPO₄ (1.74％) ; ７mMクエン
酸(0.134％) ; 87.6mMトレハロース（３％) ；４mMヒル
ジン(0.3％). 溶液を凍結乾燥しそして種々の温度で保存する。一定の
保存時間後、サンプルを水に溶解し１mg／mlヒルジンと
し次いで主ピークを RP-HPLCにより測定する。

【００２６】

【表２】

【００２７】粉末を種々の温度で保存するとき改善され
た安定性が認められる。通常の周囲条件よりも恐らくは
わずかにより高い26℃で、 132日後に顕著な分解は認め
られない。

【配列表】

一般情報：（ｉ）出願人：（Ａ）名称：チバ−ガイギー AG （Ｂ）街：クレーベックストラーセ 141 （Ｃ）市：バーゼル（Ｅ）国：スイス（Ｆ）郵便番号：4002 （Ｇ）電話：0619691111 （Ｈ）テレファックス：0619697976 （Ｉ）テレックス：962991 （ii）発明の名称：医薬組成物（iii ）配列の数：５（iv）コンピューター読みとり方式（Ａ）媒体のタイプ：フロッピー（登録商標）ディスク（Ｂ）コンピューター：IBM PCコンパチブル（Ｃ）作動システム：PC-DOS／MS-DOS （Ｄ）ソフトウェア：ケムテクトバージョン1.50 配列番号：１（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ：63−66個のアミノ酸（Ｂ）タイプ：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：タンパク質（iii ）ハイポセティカル：no （iv）アンチセンス：no Val Val Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gln Asn Leu Cys Leu Cys 1 5 10 15 Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly Gln Gly Asn Xaa Cys Ile Leu Gly Ser 20 25 30 Asp Gly Glu Xaa Asn Gln Cys Val Thr Gly Glu Gly Thr Pro Xaa Pro 35 40 45 Gln Ser Xaa Asn Asp Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Glu Xaa 50 55 60 配列番号：２（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ：65個のアミノ酸（Ｂ）タイプ：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：タンパク質（iii ）ハイポセティカル：no （iv）アンチセンス：no Leu Thr Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gln Asn Leu Cys Leu Cys 1 5 10 15 Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly Gln Gly Asn Lys Cys Ile Leu Gly Ser 20 25 30 Asp Gly Glu Lys Asn Gln Cys Val Thr Gly Glu Gly Thr Pro Lys Pro 35 40 45 Gln Ser His Asn Asp Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Glu Glu Tyr Leu 50 55 60 Gln 65 配列番号：３（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ：65個のアミノ酸（Ｂ）タイプ：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：タンパク質（iii ）ハイポセティカル：no （iv）アンチセンス：no Ile Thr Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gln Asn Leu Cys Leu Cys 1 5 10 15 Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly Lys Gly Asn Lys Cys Ile Leu Gly Ser 20 25 30 Asn Gly Lys Gly Asn Gln Cys Val Thr Gly Glu Gly Thr Pro Xaa Pro 35 40 45 Glu Ser His Asn Asn Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Glu Glu Xaa Leu 50 55 60 Gln 65 配列番号：４（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ：65個のアミノ酸（Ｂ）タイプ：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：タンパク質（iii ）ハイポセティカル：no （iv）アンチセンス：no Val Val Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gln Asn Leu Cys Leu Cys 1 5 10 15 Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly Lys Gly Asn Lys Cys Ile Leu Gly Ser 20 25 30 Asn Gly Lys Gly Asn Gln Cys Val Thr Gly Glu Gly Thr Pro Asn Pro 35 40 45 Glu Ser His Asn Asn Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Glu Glu Tyr Leu 50 55 60 Gln 65 配列番号：５（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ：66個のアミノ酸（Ｂ）タイプ：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：タンパク質（iii ）ハイポセティカル：no （iv）アンチセンス：no Ile Thr Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gln Asn Leu Cys Leu Cys 1 5 10 15 Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly Lys Gly Asn Lys Cys Ile Leu Gly Ser 20 25 30 Gln Gly Lys Asp Asn Gln Cys Val Thr Gly Glu Gly Thr Pro Lys Pro 35 40 45 Gln Ser His Asn Gln Gly Asp Phe Glu Pro Ile Pro Glu Asp Ala Tyr 50 55 60 Asp Glu 65

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、水中での、組換えヒルジンHV１のRP-H
PLC(１mg／mlヒルジン）における典型的なクロマトグラ
ムを示す。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ヒルジン、リン酸カリウムおよび糖を含
んでなる凍結乾燥医薬組成物。
【請求項２】リン酸カリウムが、燐酸水素二カリウム
である、請求の範囲第１項記載の組成物。
【請求項３】糖が、マンニトール、トレハロース、ス
クロース、ソルビトール、フルクトース、グルコース、
マルトース、ラクトース又はデキストランである、請求
の範囲第１又は２項記載の組成物。
【請求項４】ヒルジンが、デスルファトヒルジン(des
ulphatohirudin) 変異体又はその突然変異体である、請
求の範囲第１〜３項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】ヒルジンが、デスルファトヒルジンHV１
である、請求の範囲第１〜４項のいずれか１項に記載の
組成物。
【請求項６】前記成分を水に溶解し、次いでその溶液
を凍結乾燥することによって得られた、請求の範囲第１
〜５項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】凍結乾燥前の前記溶液のpHが４〜10であ
る、請求の範囲第６項記載の組成物。
【請求項８】凍結乾燥前の前記溶液中のヒルジンの濃
度が、 0.1〜500 mg／mlである、請求の範囲第６又は７
項に記載の組成物。
【請求項９】凍結乾燥前の前記溶液が等張性である、
請求の範囲第６〜８項のいずれか１項に記載の組成物。