PT739205E - Utilizacao de derivados de 1,5-didesoxi-1,5-imino-d-glucitol para o tratamento de infeccoes com o virus da hepatite b - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "UTILIZAÇÃO DE DERIVADOS DE l,5-DIDESOXI-l,5-IMINO-D-GLUCITOL PARA O TRATAMENTO DE INFECÇÕES COM O VÍRUS DA HEPATITE B"

Antecedentes do Invento

Este invento refere-se à utilização de derivados N-alquilo de 1,5-didesoxi-l,5-imino-D-glucitol para preparação de um medicamento para inibição da replicação e secreção do vírus da hepatite B em células infectadas com o referido vírus, e para utilização num método de inibição do vírus da hepatite B. O Vírus da Hepatite B (HBV) é um agente causador de doença hepática aguda e crónica [Ayoola et al., Buli. World Health Organ. 66, 443-455 (1988)]. Embora esteja disponível uma vacinação eficaz (duas vacinas de HBV presentemente disponíveis são Recombivax HB da Merck e Engerix-B da SmithKline Beecham), existem ainda mais de 300 milhões de pessoas no mundo cronicamente infectadas com o vírus [Eder et al., em Progress in Liver Diseases, eds. Popper e Schaffner (Grane & Stratton, Orlando, FL), vol. 8, págs. 367-394 (1986)]. Para eles, a vacina não tem qualquer valor terapêutico. De acordo com o Dr. Richard Duma, director executivo da National Foundation for Infectious

Diseases, ocorrem anualmente em estimativa 300000 casos de infecção com HIV \ só nos Estados Unidos [Med. World News 34(8), 20-21 (1993)]. Entre 25 e 40% dos que estão cronicamente infectados com HIV desenvolvem doença hepática grave. É por isso importante encontrar terapias anti-HBV eficazes. O interferão alfa foi utilizado para tratamento de infecção com HBV com resultados prometedores em alguns doentes [Hoofhagle e Jones, -2-

Seminars in Liver Disease 9. 231-233 (1989); e Perrillo, Seminars in Liver Disease 9, 240-248 (1989)]. O único tratamento para infecção crónica com HBV presentemente aprovado pela FDA dos E.U.A. é o interferão recombinante alfa-2b (Intron A, Schering-Plough). Os testes clínicos sobre a utilização do análogo nucleosídico, fialuridina, para tratamento da hepatite B crónica foram recentemente suspensos devido a paragem hepática relacionada com a droga em seis de 20 doentes. Consequentemente, existe uma grande necessidade de um tratamento com drogas seguro para a hepatite B.

Relatos recentes sugerem que a polimerase de ADN codificada pelo vírus, a qual funciona como uma transcriptase reversa, é um alvo atractivo [Doong et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88, 8495-8499 (1991); Lee et al., Antimicrob. Agent Chem. 33. 336-339 (1989); Price et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86. 8541-8544 (1989); e Venkateswaran et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84, 274-278 (1987)].

Outros processos mediados por vírus não têm estado dirigidos para intervenção anti-virai. A terapia anti-virai eficaz para HBV envolve provavelmente múltiplas estratégias, incluindo agentes que influenciam o sistema imunitário do hospedeiro bem como os que interferem com diferentes passos no ciclo de vida do vírus. É por isso de interesse explorar a possibilidade de outros passos não mediados pela polimerase no ciclo de vida do vírus serem vulneráveis a intervenção.

Sabe-se que o l,5-didesoxi-l,5-imino-D-glucitol (o qual também é conhecido como 1-desoxinojirimicina ou DNJ) e seus derivados N-alquilo são inibidores das enzimas de processamento de oligossacáridos N-ligados, glicosidase α I e II. Saunier et al., J. Biol. Chem. 257, 14155-14161 (1982); Elbein, Ann. Rev, Biochem. 56, 497-534 (1987). Tal como os análogos da glicose também estes têm potencial para inibir glicosiltransferases. Newbrun et al, Arch. Oral Biol. 28, 516-536 (1983); Wang et al, Tetrahedron Lett. 34. 403-406 (1993). A sua actividade inibidora contra as glicosidases levou ao desenvolvimento destes compostos como agentes anti-hiperglicémicos e agentes antivirais. Ver, p. ex., Ped. Int. PCT WO 87/03903 e Patentes U.S.: 4065562; 4182767; 4533668; 4639436; 4849430; 4957926; 5011829; e 5030638.

Os estudos sobre o efeito de agentes inibidores no vírus da hepatite B (HBV) têm sido até aqui escassos devido à falta de sistemas de cultura células permissivas para fíns de ensaio. Ou seja, a incapacidade até aqui para reproduzir e infectar produtivamente culturas de tecido com o vírus tem sido uma grave limitação à descoberta de agentes anti-HBV úteis.

Num estudo, foi relatado que N-metil-desoxinojirimicina inibe a formação de vírus da hepatite de ratinho (MHV) pelo qual o aparecimento de E2 na superfície celular é atrasado. Ver Repp et al., J. Biol. Chem. 280. 15873-15879 (1985); Datema et al, Pharmac. Ther. 33. 221-286, na 260 (1987). No entanto, MHV não está relacionado com o vírus da hepatite B (HBV). Por um lado, HBV é um membro da família dos Hepadnavírus e é um pequeno patogénio virai em humanos. O tamanho de HBV é aproximadamente 42 nM com um tamanho de genoma de ADN de 3,5 kb.

Por outro lado, MHV é um membro da família dos Coronavírus e é um vírus grande contendo ARN que não é patogénico para humanos, embora sejam comuns patogénios de coronavírus humanos que causam infecções do tracto respiratório superior. O tamanho de MHV é cerca de 100-150 nM (sendo um pouco pleiotrópico), com um tamanho de genoma de ARN de aproximadamente 30 kb. Existem muito poucas semelhanças entre HBV e MHV. Informação adicional dos antecedentes e uma descrição completa dos -4-

Coronavírus (incluindo MHV) podem ser obtidas por referência a K. Holmes, em Virology, 2a edição, ed. por B. Fields, págs. 841-856, Raven Press, New York, NY, 1990. A incapacidade para prever os resultados de um vírus para o outro é evidente a partir dos relatos recentes de dois grupos científicos diferentes de que a secreção do vírus da hepatite delta (HDV) não era dependente da glicosilação de sAg de HBV. W. Hui-Lin et al., Abstr. 115 e C. Gureau et al., Abstr. 117, em Resumos dos Artigos Apresentados na Reunião de 1994, "Molecular Biology of Hepatitis B Viruses," Outubro 3-6, 1994, Instituto Pasteur, Paris, França. HDV não especifica a sua própria proteína do envelope. Este infecta as mesmas células que HBV e utiliza o antigénio S de HBV (proteína do envelope de HBV) para fazer a partícula infecciosa e madura de HDV. Para distinção, a secreção de HBV é dependente de glicosilação e adição de glicanos. Ou seja, embora HBV e HDV sejam compostos pelas mesmas proteínas do envelope, a secreção de HDV é independente de glicosilação enquanto que HBV é muito sensível a glicosilação. O efeito do inibidor de glicosilação, tunicamicina, em sistemas de cultura celular de vírus da hepatite B foi descrito por Pizer et al, J. Virol. 34. 134-153 (1980); Datema et al., supra na 270. No entanto, a tunicamicina impede indesejada e completamente a adição de oligossacáridos N-ligados a polipéptido sintetizado de novo. Ou seja, o tratamento com tunicamicina resulta em inibição completa de glicosilação N-ligada de proteínas e é muito tóxico para as células. Para além disso, o tratamento com tunicamicina de células infectadas com HBV não resultou numa redução significativa da secreção de HBV.

Breve Descrição do Invento

De acordo com a utilização do presente invento é proporcionado um medicamento para inibição do vírus da hepatite B (HBV) em células infectadas com o referido vírus. O método compreende a utilização de um derivado N-alquilo de l,5-didesoxi-l,5-imino-D-glucitol no qual o referido grupo alquilo contém de 3 a 6 átomos de carbono numa quantidade eficaz para preparar um medicamento para o tratamento das referidas células para inibir a replicação e secreção de viriões de HBV. O grupo N-alquilo é de preferência butilo.

Num exemplo preferido ilustrativo do invento, mostra-se que N-butil-l,5-didesoxi-l,5-imino-D-glucitol (NB-DNJ) suprime a secreção de partículas de HBV e causa retenção intracelular do ADN de HBV em ambas as células HepG 2.2.15 estavelmente transfectadas e células HepG2 infectadas com HBV.

As células HepG2 são células de hepatoma humano bem conhecidas, largamente distribuídas e prontamente disponíveis. O estabelecimento e características da linha celular HepG2 estão descritos na Patente U.S. 4393133. Amostras desta linha celular estão também disponíveis em American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, sob o número de acesso ATCC HB 8065 e em European Collection of Animal Cell Cultures, Porton Down, UK. Estas células foram utilizadas como uma fonte de várias proteínas, p. ex., inibidor do factor tecidular (TFI), também conhecido como inibidor da coagulação associada a lipoproteínas (LACI), por Broze e Miletich, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84. 1886-1890 (1987) e nas Patentes U.S. 4996852, 5106833 e 5212091.

As células HepG 2.2.15 são derivadas das células HepG2 e são -6-

preparadas tal como descrito por Sells et al, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84, 1005-1009 (1987). A supressão da secreção de partículas de HBV através da utilização do invento foi muito inesperada uma vez que foi anteriormente relatado que o tratamento com tunicamicina de células produtoras de HBV resultava numa secreção de partículas de HBV normal. Ver Grippon et al, Mol. Biol. HBV. San Diego, CA, Resumo página 67 (1992). Foi verificado pelos presentes inventores que a secreção de viriões de HBV mas não de partículas sub-virais é inibida pelo presente invento. O aumento de ADN de HBV intracelular resultante do tratamento pelo método do invento foi também inesperado.

Como as proteínas do envelope de HBV contêm apenas um ou dois glicanos N-ligados por molécula, a capacidade para inibir a secreção de tais proteínas modestamente (por peso) glicosiladas e seus produtos viriões pelos derivados N-alquilo de DNJ foi uma surpresa quando comparado com o seu menor efeito sobre a secreção de HIV o qual contém proteínas de envelope altamente glicosiladas. Foi também inesperado verificar que viriões e partículas de HBV que contêm grandes proteínas de terminal cocarboxi, LHBs (GHBs), e MHBs médias foram mais sensíveis a DNJ N-butilo que partículas ricas em SHBs (PHBs) pequenas.

Outra das vantagens na utilização dos derivados N-alquilo de DNJ definidos é a sua relativa não toxicidade. Por exemplo, sabe-se que o derivado N-butilo é não tóxico (TD50 > 5 mM) à sua concentração eficaz para inibição da replicação de HIV (EC5o = 43 μΜ). Ver, p. ex., Bryant et al., Resumos da 10a Conferência Internacional sobre SIDA, Berlim, Junho 7-11, 1993. Mostra-se -7- também aqui que 90% das células HepG 2.2.15 infectadas com HBV e tratadas com 1000 pg/ml do derivado N-butilo de DNJ eram tão viáveis quanto os controlos não tratados.

Tendo em conta os resultados aqui demonstrados, pensa-se que outros compostos que inibem o transporte de viriões de HBV ou passos na via de adição de glicosilação serão úteis na inibição da morfogénese de HBV em cultura de tecidos e hospedeiros mamíferos.

Descrição Detalhada do Invento

Enquanto que o fascículo conclui com reivindicações que apontam particularmente e reivindicam distintamente a matéria objecto vista como formando o invento, pensa-se que o invento será melhor compreendido a partir da seguinte descrição detalhada ilustrativa em conjunto com as figuras acompanhantes nas quais: A FIG. 1 mostra o mapa genético das proteínas do envelope de HBV. A linha de cima mostra um mapa linear dos genes de HBs, com os domínios preSl, preS2 e S indicados. Os números por baixo deste mapa indicam as extremidades dos domínios, expressos como o número de aminoácidos. Os números variam para diferentes estirpes de HBV. Os valores percentuais na coluna da direita mostram a fracção de proteínas não, mono e diglicosiladas para cada HBs. Os valores são de Gerlich e Bruss, em Molecular Biology of Hepatitis B Virus, ed. A. McLachlan, CRC Press, págs. 109-144 (1992) e em Hepatitis B Vaccines in Clinicai Practice, ed. R. W. Ellis, Mareei Dekker, Inc., págs. 41-82 (1992). A FIG. 2 em duas partes, FIGS. 2A e 2B, mostra autorradiogramas -8- de ADN de HBV nos meios e células de culturas tratadas com N-butildesoxinojirimicina (NBDNJ). Células HepG 2.2.15 foram postas a crescer durante 6 dias na presença da concentração indicada de NBDNJ com uma mudança de meio. Após o sexto dia (sétimo dia em cultura), foram recolhidos células e meio. São mostrados autorradiogramas do ADN virai detectado por hibridação de membranas com sondas de HBV. FIG. 2A: autorradiograma de um "Southern blot" de ADN recuperado do meio de células 2.2.15 mantidas em meio sem NBDNJ (pistas 1 e 2); e nas seguintes concentrações de NBDNJ: 200 pg/ml (pista 3); 500 pg/ml (pista 4); e 1000 pg/ml (pista 5). FIG. 2B: autorradiograma de um "Southern blot" de ADN total intracelular, totalmente digerido com EcoRI, de células mantidas na ausência de NBDNJ (pista 1) e na presença das seguintes concentrações de NBDNJ: pista 2: 200 μg/ml; pista 3: 500 pg/ml; pista 4: 1000 pg/ml.

Pista 5: ADN digerido com EcoRI isolado de viriões preparados a partir de células 2.2.15 não tratadas.

Pista 6: ADN plasmídico como controlo de hibridação. Setas: indicam a mobilidade esperada para genomas de HBV circulares relaxados (A) e genomas linearizados de 3,2 kb (B). A FIG. 3 em quatro partes, FIGS. 3A, 3B, 3C e 3D, mostra electroforese em gel e histogramas de ADN de HBV nas células e meio de células HepG2 infectadas com HBV e tratadas com NBDNJ. FIG. 3A e FIG. 3C: ADN de viriões, imunoprecipitados com anticorpo monoclonal para MHBs, foi amplificado por reacção em cadeia da polimerase (PCR) e resolvido por electroforese em gel de agarose.

Pista 1: marcadores de peso molecular;

Pista 2: Branco;

Pista 3: Meio de células que não receberam NBDNJ;

Pistas 4 e 5: meio de células que receberam 200 pg/ml de NBDNJ;

Pistas 6 e 7: 500 pg/ml de NBDNJ;

Pistas 8 e 9: 700 μg/ml de NBDNJ, 10 e 11: 1000 μg/ml de NBDNJ.

Estas bandas foram visualizadas por densitometria e as áreas sob os picos são mostradas na Fig. 3C na qual a média das duas amostras de cada concentração de NBDNJ foi representada graficamente. FIG. 3B e FIG. 3D: ADN do compartimento intracelular das culturas infectadas na Fig. 3A com HBV e tratadas com NBDNJ foram amplificados por PCR, As pistas contêm ADN amplificado a partir das seguintes amostras:

Pistas 1 e 2: Sem NBDNJ;

Pistas 3 e 4: 200 pg/ml de NBDNJ; Pistas 5 e 6: 500 pg/ml de NBDNJ; Pistas 7 e 8: 700 pg/ml de NBDNJ; Pistas 9 e 10: 1000 pg/ml de NBDNJ. - 10-

Fig. 3D: Histograma da área sob os picos médios do traçado densitométrico do gel da Fig. 3B. A FIG. 4 em seis partes, FIGS. 4A, 4B, 4C, 4D, 4E e 4F, mostra antigénios de HBV presentes no meio de cultura não fraccionado e em preparações de viriões parcialmente purificadas. Foram testados volumes iguais das amostras indicadas para antigénios do envelope de HBV utilizando o método do ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA). Foram testadas amostras de meio não fraccionado (FIGS. 4A, 4B e 4C) ou de vírus parcialmente purificado (FIGS. 4D, 4E e 4F) de culturas com 3 dias para SHBs de HBV ("S) (FIGS. 4A e 4D), LHBs: epitopos "PreSl" (FIGS. 4B e 4E) ou "PreS2" de MHBs (FIGS. 4C e 4F). As culturas foram mantidas nas concentrações indicadas de NBDNJ, expressas em unidades milimolares e mostradas ao longo do eixo dos xx.

Para comparação, 2,28 mM equivale aproximadamente a 500 pg/ml de NBDNJ. O eixo dos yy mostra o sinal colorimétrico da reacção de ELISA, em unidades de OD (DO) arbitrárias, lido pelo leitor de placas. A FIG. 5 em três partes, FIGS. 5A, 5B e 5C, mostra análise por "Western blot" de LHBs e MHBs no meio de culturas tratadas e não tratadas com NBDNJ. Precipitados de polietilenoglicol (PEG) do meio de cultura (FIG. 5A) ou de viriões parcialmente purificados, filamentos de HBs e esferas de culturas não tratadas (FIG. 5B) e tratadas com NBDNJ (FIG. 5C) foram resolvidos por SDS-PAGE (poliacrilamida a 13,5%), transferidos para papel de imobilina e incubados com anticorpo monoclonal específico para PreSl e PreS2.

As pistas são como indicado no topo de cada parte da FIG. 5. É utilizado como controlo 1,0 pg de HBV genótipo D, purificado a partir de soro humano. -11 -

Os marcadores de peso molecular (pm) em quilodaltons (kd) são mostrados no lado direito de cada parte da FIG. 5.

As setas da esquerda mostram os polipéptidos de LHBs (Sl)eMHBs (S2). O envelope de HBV contém três proteínas de terminal co-carboxi (HBs), denominadas proteína grande (LHBs), média (MHBs) e pequena (SHBs) (ver Figura 1). Estas proteínas resultam da iniciação alternada da tradução de um único enquadramento de leitura aberto (ORF) [Ganem, em Hepadnaviruses, eds. Mason e Seeger (Springer-Verlag), págs. 61-84 (1991)]. Todas as três proteínas HBs ocorrem com oligossacáridos N-ligados de tipo complexo no aminoácido 146 do domínio S [ver Figura 1 e Gerlich e Bruss, em Molecular Biology of Hepatitis B Virus. ed. A. McLachlan, CRC Press, págs. 109-144 (1992) e em Hepatitis B Vaccines in Clinicai Practice. ed. R. W. Ellis, Mareei Dekker, Inc., págs. 41-82 (1992)]. MHBs (mas nunca LHBs) ocorrem também com oligossacáridos de tipo híbrido no domínio preS2. Durante a infecção natural com HBV, o fígado produz um grande excesso de proteínas HBs as quais são segregadas como partículas sub-virais filamentosas ou esféricas de 20 nM de diâmetro [Ganem, em Hepadnaviruses, págs. 61-84 (1991); e Gerlich e Bruss, em Molecular Biology of Hepatitis B Virus e em Hepatitis B Vaccines in Clinicai Practice. supra]. As esferas de HBs são muito abundantes e contêm cinco a dez vezes menos LHBs que os filamentos de HBs e partículas de HBV. As MHBs são um componente menor de entre todos os três tipos de partículas [Gerlich e Bruss, em Molecular - 12-

Biology of Hepatitis B Vírus e em Hepatitis B Yaccines in Clinicai Practice, supra]. A morfogénese de HBV é complexa. Acredita-se que as partículas do núcleo virai pré-reunidas se ligam aos lados citosólicos das proteínas do envelope virai (da superfície), as quais se inseriram na membrana do retículo endoplasmático (RE) (ER) [Gerlich e Bruss, em Molecular Bioloev of Hepatitis B Virus e em Hepatitis B Yaccines in Clinicai Practice, supra].

Após terem adquirido o envelope, os viriões gemulam para o lúmen do RE, donde são transportados através do complexo de Golgi para o fluído extracelular. As glicoproteínas imaturas contêm três resíduos de glicose terminais nos oligossacáridos N-ligados.

Pensa-se que a remoção dos resíduos de glicose terminais tenha um papel importante na migração das glicoproteínas imaturas do RE para o Golgi [Datema e Romero, Pharmacol. Thera. 33, 221-286 (1987)]. O açúcar imino, NBDNJ, é um potente inibidor da glicosidase α I, uma enzima celular que remove resíduos de glicose terminais de oligossacáridos nascentes, e foi verificado que suprimia a formação do Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV) in vitro [Karpas et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85, 9229-9233 (1988); Patente U.S. 4849430; e Walker et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84. 8120-8124 (1987)]. Uma vez que a secreção de HBV requer LHBs e SHBs, ambas as quais possuem oligossacáridos N-ligados, foi testado o efeito de NBDNJ sobre a síntese virai.

De forma a ilustrar mais o invento, foram efectuados os seguintes exemplos detalhados embora será compreendido que o invento não está limitado a estes exemplos específicos ou aos detalhes aí descritos.

EXEMPLOS MÉTODOS: Células e meios:

I

As células HepG2 foram adquiridas da European Collection of Animal Cell Cultures (Porton Down, UK). As células HepG2 2.15 [2.2.15, Sells e Chen, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84. 1005-1009 (1987)] foram obtidas do Dr. George Acs (Mt. Sinai Medicai College, New York, USA).

Todas as culturas de tecidos foram mantidas em CO2 a 5% em meio RPMI 1640 (GIBCO), suplementado com 10% de soro fetal de vitelo inactivado pelo calor (Techgen, London, UK), 50 unidades/ml de penicilina e estreptomicina, glutamina 1 mM (GIBCO). Para as células 2.2.15, 200 pg/ml. Foi adicionado ao meio antibiótico G418 (Genticin, GIBCO), tal como em Sells e Chen, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84. 1005-1009 (1987). A viabilidade das células foi medida por citometria de fluxo utilizando um citómetro FACscan, Becton Dickinson, Sunnyvale, CA, USA, após incubação com iodeto de propídio, tal como em Platt e Jacob, Eur. J. Biochem. 208. 187-193 (1992).

Infeccão das células HepG2:

Foi purificado HBV de soro humano ou do meio das células em cultura por sedimentação para entre 40 e 46% de sacarose (p/p) após ultracentrifugação, [Seifer et ai, Virol. 179. 300-311 (1990)]. Os viriões foram dializados em Tampão Fosfato de Potássio 0,02 M, pH 7,4, concentrados, tratados com protease V8 (de Staphylococcus aureus, Sigma Chemical Co.) de um dia para o outro a 37°C, centrifugados durante 8 horas através de uma almofada de sacarose a 20%/Tris 0,01 M, pH 7,4, NaCl 0,14 M, EDTA (TNE) 0,005 M. Os compactados foram ressuspensos em meio de crescimento e utilizados então para inocular as células HepG2.

Compostos iminoaçúcar: A síntese de NBDNJ é bem conhecida e é descrita por Fleet et al., FEBS Letters 237. 128-132 (1988). NBDNJ foi proporcionado por G. D. Searle/Monsanto Co. como composto SC-48334.

Deteccão de ADN virai:

Foi precipitado meio de aproximadamente 5 x 106 células com polietilenoglicol (PEG) 8000 (Sigma), após clarificação, tal como em Sells e Chen, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84, 1005-1009 (1987), ressuspenso em 0,5 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS) e sedimentado - 15- através de uma almofada de sacarose a 20% em PBS durante 5 horas a 50000 rpm num rotor Beckman TI00.3 (aprox. 75000 x g).

Foi preparado ADN a partir dos compactados tal como em Sells e Chen, Proc. Natl. Acad. Sei USA 84. 1005-1009 (1987). Para os "Southern blots" [Maniatis et al., Molecular cloning. a laboratorv manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982)], o ADN foi resolvido por electroforese através de agarose a 1,2%, transferido para papel de filtro H+ bond (Amersham) e hibridado com sonda de HBV radioactiva com 32P (Amersham) (feita pelo método da iniciação aleatória descrito no estojo do fabricante, (Amersham), utilizando pHBV como molde [Foster et al, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88. 2888-2892 (1991)]). O vírus descendente no meio das células HepG2 infectadas com HBV derivado de soro foi detectado precipitando o meio com anticorpo monoclonal para os epitopos PreS2. O ADN dos viriões imunoprecipitados foi amplificado por uma reacção em cadeia da polimerase (PCR) utilizando iniciadores dos nucleótidos 2815 e 190 no que diz respeito ao genoma virai (utilizando o local EcoRI como nucleótido 1). O ADN foi preparado a partir de lisados celulares por métodos padrão tal como descrito por [Maniatis et al, Molecular cloning. a laboratorv manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982)].

Detecção de proteínas de HBV pelo ensaio de Imunoabsorção Enzimática (ELISA):

Os anticorpos monoclonais aqui utilizados são bem conhecidos e são descritos por Heerman et ai, J. Virol. 52. 396-402 (1984), para o anticorpo contra PreSl (MA 18/7); Heerman et al., Intervirology 28: 14-21 (1987), para o anticorpo contra PreS2 (Q 19/10), ver também Gerlich e Bruss, Molecular Biology of Hepatitis B Virus. ed. A. McLachlan, CRC Press, 109-144 (1992) e em Hepatitis B Vaccines in Clinicai Practice. ed. R. W. Ellis, Mareei Dekker, Inc., págs. 41-82 (1992); e Heerman et ai, em Virai Hepatitis and Li ver Disease. ed. Zuckermann, A. R. Liss, 697-701 (1988), para o anticorpo contra S (C20-2).

As amostras foram incubadas em poços de microtítulo (de um dia para o outro a 4°C) revestidos com anticorpos monoclonais específicos para os epitopos de LHBs, MHBs ou SHBs e bloqueadas com BSA a 1% em PBS. Após incubação com amostras de vírus durante 1 hora (37°C), as placas foram lavadas 4 vezes com PBS/0,1% de detergente não iónico Tween 20. O antigénio ligado foi detectado por incubação com anticorpo de cabra anti-HBs conjugado com peroxidase (Behring) seguido por revelação em ortofenilenodiamina (0,33 mg/ml de solução PBS-peróxido). As densidades ópticas foram lidas num leitor de placas Behring. Foram conduzidos testes em vírus purificado e meio total numa - 17-

série de diluições da amostra para assegurar uma quantificação correcta. "Western Blots”:

As amostras foram dissolvidas em tampão de carregamento, resolvidas por electroforese através de géis de SDS-poliacrilamida a 13,5% (SDS-PAGE) e transferidas para membranas de PVDF (Millipore) e bloqueadas com leite em pó a 5%, tal como em Gultekin e Heerman, Analvtical Biochem. 172. 320-329 (1989). Após incubação com anticorpo primário de um dia para o outro à temperatura ambiente em 1% de albumina de soro bovino (BSA) em TNE e com anticorpo secundário (soro de cabra anti-IgG de ratinho conjugado com peroxidase) durante 1 hora em TNE à temperatura ambiente, as membranas foram reveladas em PBS-peróxido-diaminobenzidina (Sigma), tal como descrito nas instruções do fabricante.

RESULTADOS NBDNJ reduz a quantidade de ADN de HBV associado a viriões libertado no meio por células 2.2.15:

As células 2.2.15 são derivadas da linha HepG2 e segregam cronicamente HBV infecciosos bem como partículas sub-virais (partículas e esferas de HBs) para o meio de cultura [Heerman et ai, J. Virol. 52. 396-402 (1984); e Sells et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84. 1005-1009 (1987)].

Para determinar o efeito de NBDNJ sobre a produção e secreção de HBV, foram mantidas células 2.2.15 em meio contendo uma série de concentrações de NBDNJ durante seis dias, com uma mudança de meio no terceiro dia. Após seis dias no composto, o ADN foi isolado do vírus (tal como acima descrito em "Métodos"). O ADN virai foi detectado por hibridação de "Southern blots" com sondas de ADN de HBV marcadas radioactivamente, tal como mostrado na Figura 2A.

Foi detectado ADN específico do vírus, migrando com a mobilidade esperada de ADN circular relaxado e genómico linear [Sells et al., J. Virol. 62, 2836-2844 (1988)] nas amostras derivadas de meio de cultura não tratado (pistas 1 e 2). Existe uma diminuição dependente da dose do ADN específico do vírus obtido dos meios de células tratadas com NBDNJ (pistas 3, 4 e 5). A autorradiografia mostrada na Figura 2A foi quantificada por densitometria. A densitometria revelou que 500 μg/ml (2,28 mM) e 1000 pg/ml de NBDNJ resultou em diminuições de 90 e 99%, respectivamente. A diminuição não foi devida a toxicidade de NBDNJ, uma vez que 90% das células mantidas em 1000 pg/ml de NBDNJ durante seis dias eram tão viáveis quanto os controlos não tratados, tal como determinado por análise de FACs de células coradas com iodeto de propídio e incorporação de ^S-metionina nas proteínas. Células 2.2.15 tratadas com NBDNJ contêm níveis elevados de ADN de HBV intracelular. A diminuição mediada por NBDNJ do ADN de HBV associado a viriões no meio pode ter sido devida a uma diminuição da síntese de ADN virai. Altemativamente, esta pode ter sido devida a um acontecimento pós-sintético tal - 19- SEBSEZÍ®^ como "montagem", transporte ou saída de viriões da célula. Para distinguir entre estas possibilidades, foi comparada a quantidade de ADN intracelular específico de HBV em células 2.2.15 não tratadas e tratadas com NBDNJ.

Foi preparado ADN celular total a partir de células tratadas e não tratadas e completamente digerido com EcoRI para linearizar os genomas virais. Quantidades de microgramas quase iguais dos produtos da digestão (tal como determinadas por coloração com brometo de etídio e hibridação com uma sonda específica para as células) foram resolvidas por electroforese, sujeitas a "Southern blot" e hibridadas com a sonda específica para HBV (Figura 2B). São detectados genomas de HBV de comprimento unitário que migram como bandas de 3,2 kb em ADN derivado de células 2.2.15 não tratadas (pista 1) e de viriões isolados do meio de cultura de controlo (pista 5).

As pistas 2, 3 e 4 contêm ADN derivado de células tratadas com 200, 500 e 1000 pg/ml de NBDNJ, respectivamente. Existe um claro aumento dependente da dose na quantidade de ADN de HBV presente em células tratadas com NBDNJ, em comparação com células não tratadas. A densitometria deste autorradiograma sugere que as células tratadas com 200, 500 e 1000 pg/ml de NBDNJ exibem um aumento de 1,7, 3,0, 5,1 vezes, respectivamente, na abundância de cópias de HBV, quando ajustada a variação de carregamento, utilizando hibridação para um gene de MHC de classe III celular, Gl, como controlo de carregamento. Células HepG2 infectadas com HBV e tratadas com NBDNJ libertam menos vírus descendentes.

As células 2.2.15 são um sistema útil para estudar produção de HBV num ambiente estavelmente transfectado. No entanto, a síntese pré- genómica de HBV nestas células, pode ocorrer a partir de moldes de ADN virai integrado e não de moldes de ADN virai circular covalentemente fechado, tal como se pensa que ocorra durante a infecção natural [Sells et al, J. Virol. 62. 2836-2844 (1988)]. Para além disso, estas células produzem partículas do núcleo nuas bem como vários produtos de ADN sub-genómicos os quais são libertados para o meio [Sells et al, supra\.

Por isso, foram infectadas células HepG2 com HBV modificado com proteases. No dia seguinte, o meio de cultura foi substituído por meio de controlo ou meio contendo várias concentrações de NBDNJ. Cinco dias após a infecção, os viriões descendentes foram imunoprecipitados com anticorpo monoclonal específico para a porção central do domínio PreS2. Sequências de ADN específicas de HBV foram amplificadas por PCR utilizando iniciadores específicos para HBV. Os produtos da reacção foram resolvidos por electroforese em gel de agarose e recolhidas imagens após coloração com brometo de etídio (Figura 3A). Os produtos de 519 pares de bases (seta, Figura 3A) foram quantificados por análise de densitometria e o gráfico é mostrado na Figura 3C. Embora a PCR possa subestimar as diferenças entre as concentrações iniciais de ADN nas amostras, é evidente que o meio de células infectadas com vírus processados com proteases e pós-tratadas com 700 pg/ml (3,2 mM) de NBDNJ contém menos uma ordem de grandeza de ADN virai que o das amostras não tratadas. Estes resultados mostram que a diminuição mediada por NBDNJ em ADN libertado para os meios não é própria do sistema de células 2.2.15 tranfectadas. Células HepG2 infectadas com HBV e tratadas com NBDNJ contêm quantidades aumentadas de ADN de HBV intracelular.

Como o meio de cultura das células HepG2 infectadas com HBV tratadas com NBDNJ era semelhante ao das células 2.2.15, no que diz respeito à quantidade reduzida de ADN associado a viriões, era interessante saber se existia um aumento concomitante no ADN virai nas células tratadas. Foi preparado ADN celular total a partir de amostras que correspondem às apresentadas nas Figuras 3A e C. O ADN intracelular específico de HBV foi amplificado utilizando PCR. Os produtos da reacção foram resolvidos por electroforese em gel de agarose e o gel corado com brometo de etídio (Fig. 3B) foi analisado por densitometria (Fig. 3D). De forma clara, as células HepG2 infectadas com HBV e pós-tratadas com NBDNJ acumulam maiores quantidades de ADN virai que as células não tratadas. O meio de cultura de células 2.2.15 tratadas e não tratadas com NBDNJ contém quantidades semelhantes de antigénio do envelope de HBV.

As células 2.2.15 segregam viriões bem como partículas sub-virais [Sells et al., J. Virol, 62. 2836-2844 (1988)]. A redução mediada por NBDNJ de ADN associado a viriões no meio de cultura podia ser um reflexo de uma diminuição generalizada na secreção de todas as partículas contendo HBs. Altemativamente, pode ter havido uma diminuição selectiva da partícula de virião rara com uma relativa economia da(s) outra(s) forma(s), a(s) qual(is) está(ão) em largo excesso.

Para distinguir entre estas possibilidades, foi determinada a quantidade e natureza dos antigénios do envelope no meio de cultura por ELISA e análise de "Western". A análise de ELISA de antigénios de SHBs, MHBs e LHBs presentes em meio de cultura clarificado é mostrada nas Figuras 4A, B e C. Os resultados mostram que não existe qualquer efeito significativo sobre a quantidade total de antigénios de SHBs (S) e LHBs (PreSl) no meio. Existe uma modesta diminuição dependente da dose na quantidade total de antigénio de -22- 6 essas**8® MHBs (PreS2) no meio. Esta diminuição é de aproximadamente 2,5 vezes à mais alta concentração de NBDNJ (4,5 mM ou aproximadamente 1000 pg/ml). Estes resultados foram confirmados por análise de "Western blot". A Figura 5 mostra "Western blots" de meio de culturas de controlo e das tratadas com 1000 pg/ml. Aqui é mostrado que os meios de culturas tratadas com NBDNJ (Figura 5A, pista 3) e não tratadas (Figura 5A, pista 2) contêm quantidades semelhantes de antigénios de MHBs (S2) e LHBs (Sl).

Por este motivo, NBDNJ não causa uma redução generalizada na quantidade de antigénios de SHBs e LHBs no meio de cultura. Existe, no entanto, uma diminuição de duas vezes na quantidade de antigénio de MHBs no meio de células 2.2.15 tratadas com 1000 pg/ml de NBDNJ, tal como determinado por ELISA. O meio de cultura de células 2.2.15 tratadas com NBDNJ contém quantidades reduzidas de antigénios do envelope de HBV que sedimentam como viriões intactos.

Para determinar a quantidade de HBs presente em viriões intactos, foi fraccionado meio das culturas indicadas através de gradientes de sacarose por ultracentrifugação. Os viriões segregados derivados de culturas tratadas e não tratadas e que sedimentam para 40-46% de sacarose, foram concentrados e testados quanto às proteínas HBs por ELISA. As Figuras 4D, 4E e 4F mostram os resultados. Todas as formas de HBs foram facilmente detectáveis em amostras contendo viriões preparados a partir do meio de células 2.2.15 não tratadas.

Por outro lado, não existiam virtualmente nenhumas proteínas HBs detectáveis em amostras preparadas a partir do meio de células tratadas com 2,25 e 4,5 mM (aproximadamente 500 e 1000 pg/ml, respectivamente, para -23 - comparação) de NBDNJ. Isto sugere uma quantidade reduzida de vírus intacto no meio destas amostras.

Os resultados de ELISA foram confirmados por análise de "Western blot" de fracções do gradiente de sacarose contendo o vírus intacto, filamentos ou esferas (Figuras 5B, de culturas não tratadas, e 5C, de culturas tratadas com NBDNJ). Volumes iguais de fracções do gradiente de sacarose foram resolvidos por electroforese em gel SDS, transferidos para membranas, incubados com anticorpo específico para epitopos de MHBs (PreS2). HBV parcialmente purificado derivado de soro humano é apresentado nas pistas 5 (Figuras 5B e 5C) como controlo.

As fracções distais às fracções que contêm o virião (próximo do fundo do gradiente) foram resolvidas na pista 1 para mostrar a especificidade do anticorpo. As pistas 2, 3 e 4 (Figura 5B e Figura 5C) contêm as fracções contendo o vírus intacto, filamentos e esferas de HBs (respectivamente), tal como definido por sedimentação em sacarose e presença (para viriões) e ausência (para partículas sub-virais) de ADN virai. Existe uma diminuição na quantidade de todas as proteínas HBs em viriões, filamentos e esferas preparados a partir do meio de culturas tratadas com NBDNJ (comparar pistas 2, 3 e 4 nas Figuras 5B e 5C). A diminuição em MHBs (epitopo PreS2) é particularmente intensa. As imagens mostradas nas Figuras 5B e 5C foram quantificadas por densitometria. A análise por densitometria revelou que a diminuição de LHBs em amostras de viriões tratados com NBDNJ, em comparação a amostras não tratadas, foi de aproximadamente 4 vezes. A diminuição em MHBs, nas mesmas pistas (Figura 5C, pista 2 comparada com a Figura 5B, pista 2) foi de 12 vezes. Note-se que o gradiente utilizado para separar as várias formas de proteína HBs resulta em fracções "ricas" em diferentes formas. Ou seja, as fracções que contêm -24- os viriões contêm também provavelmente filamentos e esferas. Isto pode causar uma subestimação do efeito de NBDNJ sobre a libertação de viriões, relativamente a esferas e filamentos, tal como julgado por análise imunológica.

Contudo, os resultados da análise de "Western blot" são consistentes com os de ELISA, no que diz respeito ao meio de culturas tratadas com NBDNJ conter quantidades semelhantes de antigénios de HBs totais mas material antigénico grandemente reduzido em fracções de viriões.

Os compostos inibidores aqui descritos podem também ser utilizados para administração a doentes infectados com HBV através de meios convencionais, de preferência em formulações com diluentes ou transportadores farmaceuticamente aceitáveis. Estes compostos podem ser utilizados na forma amina livre ou na sua forma salina. Derivados de sais farmaceuticamente aceitáveis são ilustrados, por exemplo, pelo sal de HC1.

Estes compostos inibidores podem também ser utilizados na forma de pró-drogas tais como os derivados 6-fosforilados descritos nas Patentes U.S. 5043273 e 5103008, e os derivados O-acilados tais como descritos, p. ex., nas Patentes U.S. 5003072; 5144037; e 5221746. Um tal derivado preferido é 1,5-(butilimino)-1,5-didesoxi-D-glucitol, tetrabutirato. A quantidade do composto activo a ser administrada deve ser uma quantidade eficaz, ou seja, uma quantidade que seja clinicamente benéfica mas não apresente efeitos tóxicos os quais se sobreponham às vantagens que acompanham a sua utilização. Seria esperado que a dosagem diária para um humano adulto variasse normalmente entre cerca de um a 1000 miligramas do composto activo. A via preferida de administração é oralmente na forma de cápsulas, comprimidos, xaropes, elixires e semelhantes, embora também possa -25- ser utilizada a administração parenteral. Formulações adequadas do composto activo em diluentes e transportadores farmaceuticamente aceitáveis na forma de dosagem terapêutica podem ser preparadas por referência a textos gerais no campo tais como, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences. Ed. Arthur Osol, 16a ed., 1980, Mack Publishing Co., Easton, PA., U.S.A.

Lisboa, 26 de Janeiro de 2000

JORGE CRUZ

Agente Oficial da Proprisdsde Industrial RUA VICTOR CORDON, 14

1200 LISBOA

Claims (3)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de um derivado N-alquilo de l,5-didesoxi-l,5-imino-D-glucitol na qual o referido grupo alquilo contém de 3 a 6 átomos de carbono numa quantidade eficaz para preparar um medicamento para o tratamento de infecções com o vírus da hepatite B num hospedeiro humano infectado para inibir a replicação e secreção de viriões do vírus da hepatite B.
2. 2. Utilização da Reivindicação 1 na qual o grupo alquilo é butilo.
3. 3. Utilização da Reivindicação 1 na qual a quantidade inibidora eficaz é de cerca de um a cerca de 1000 mg. Lisboa, 26 de Janeiro de 2000

   Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 14 1200 LISBOA