KR100348657B1 - B형간염바이러스감염의치료를위한1,5-디데옥시-1,5-이미노-d-글루시톨의n-알킬유도체의사용 - Google Patents

Abstract

1, 5-디데옥시-1, 5-이미노-D-글루시톨의 N-알킬유도체 (여기서 알킬기는 3 내지 6개의 탄소원자를 함유함)를 감염된 숙주에 투여하는 것을 포함하는 B형 간염 바이러스(HBV) 감염의 치료방법이 개시된다.

Description

B형 간염 바이러스 감염의 치료를 위한 1,5-디데옥시-1,5-이미노-D-글루시톨의 N-알킬유도체의 사용

제1도는 HBV(B형 간염 바이러스) 외피(envelope)단백질의 유전지도를 도시한다. 최상부 라인은 HB 유전자의 선형지도를 보여주며, 프리 S1(PreS1), 프리 S2(PreS2) 및 S 도메인이 나타난다. 이 지도 아래의 숫자는 아미노산수로 표시된 도메인의 경계를 가리킨다. 그 숫자는 다른 HBV 변종마다 변화한다. 오른쪽 종렬의 백분율 값은 각 HB에 대한 비-, 모노- 및 디-글리코실화 단백질의 비율을 보여준다. 값은 Gerlich 및 Bruss, Molecular Bioloqy of Hepatitis B Virus, A. McLachlan 발행, CRC 인쇄, pp. 109-144 (1992)과 Hepatitis B Vaccines in Clinical Practice, R. W. Ellis, Marcel Dekker, Inc. 발행, pp. 41-82 (1992)로 부터 얻음.

제2도는 두 부분으로 나뉘어 제2A도 및 제2B도가 배지중의 HBV DNA와 N-부틸데옥시노지리마이신(NBDNJ)로 처리된 배양세포의 자동방사선사진을 도시한다. HepG 2.2.15 세포를 배지를 한번 갈아주며 지시농도의 NBDNJ의 존재하에 6일 동안 성장시켰다. 6일 후에 (배양의 7일째), 세포 및 배지를 수집했다. HBV 프로브에 대한 멤브레인의 혼성화에 의해 검출된 바이러스 DNA의 자동방사선사진을 보여준다.

제2A도: NBDNJ 없는 배지에서 유지된 2.2.15 세포의 배지로부터 회수된 DNA의 서던 블롯(Southern blot)의 자동방사선사진 (레인 1 및 2); 과 다음 NBDNJ 농도들: 200μg/mℓ (레인 3); 500μg/mℓ (레인 4); 및 1000μg/mℓ (레인 5)에서의 자동방사선사진.

제2B도: NBDNJ 없이 그리고 다음 NBDNJ 농도들의 존재하에 유지된 세포로부터 EcoRI으로 완전분해된 총 세포내 DNA의 서던 블롯의 자동방사선사진(레인 1)과 자동방사선사진:

레인 2 : 200μg/mℓ;

레인 3 : 500μg/mℓ;

레인 4 : 1000μg/mℓ;

레인 5 : 처리안된 2.2.15 세포로 부터 제조된 비리온으로 부터 분리된 EcoRI 분해 DNA.

레인 6 : 혼성화 콘트롤로서의 플라스미드 DNA.

화살표는 릴랙스된 원형 HBV 게놈(A) 및 선형화된 3.2kb 게놈(B)에 대한 예상 이동성을 가리킨다.

제3도는 4개 부분으로 나뉘어 제3A도, 제3B도, 제3C도 및 제3D도가 HBV로 감염되고 NBDNJ로 처리된 HepG2 세포의 세포 및 배지중 HBV DNA의 겔 전기영동 및 막대그래프를 도시한다.

제3A도 및 제3C도: MHB에 대한 모노클로날 항체에 의해 면역침전된 비리온으로 부터의DNA를 중합효소 연쇄반응(PCR)에 의해 증폭하고, 아가로스겔 전기영동에 의해 분해했다.

레인 1 : 분자량 마커;

레인 2 : 블랭크;

레인 3 : NBDNJ를 받지않은 세포로 부터의 배지;

레인 4 및 5 : 200μg/mℓ NBDNJ를 받은 세포로 부터의 배지;

레인 6 및 7 : 500μg/mℓ NBDNJ;

레인 8 및 9 : 700μg/mℓ NBDNJ;

레인 10 및 11 : 1000μg/mℓ NBDNJ.

이들 밴드는 농도측정법(densitometry)에 의해 영상화되었고, 피크 아래의 면적은 각 NBDNJ 농도의 두 개의 샘플의 평균을 좌표화한 제3C도에 보여진다.

제3B도 및 제3D도 : HBV로 제3A도에서 감염되고 NBDNJ로 처리된 배양물의 세포내 구획으로 부터의 DNA를 PCR로 증폭했다. 레인들은 다음 샘플들로부터의 증폭된 DNA를 함유한다:

레인 1 및 2 : NBDNJ 없음;

레인 3 및 4 ; 200μg/mℓ NBDNJ;

레인 5 및 6 : 500μg/mℓ NBDNJ;

레인 7및 8 : 700μg/mℓ NBDNJ;

레인 9 및 10 : 1000μg/mℓ NBDNJ.

제3D도: 제3B도의 겔의 농도측정 트레이싱의 평균 피크 아래 면적의 막대그래프.

제4도는 6개 부분으로 나뉘어 제4A도, 제4B도, 제4C도, 제4D도, 제4E도 및제4F도가 분획화되지 않은 배양배지 및 부분 정제된 비리온 제제중에 존재하는 HBV 항원을 도시한다. 동일한 부피의 지시샘플을 효소-연결 면역흡착분석법(ELISA)을 사용하여 HBV 외피항원에 대해 시험했다. 3일 배양물로부터의 분획화되지 않은 배지(제4A도, 제4B도 및 제4C도) 또는 부분 정제된 바이러스(제4D도, 제4E도 및 제4F도)의 샘플을 HBV SHB("S)(제4A도 및 제4D도), LHB"프리 S1"(제4B도 및 제4E도) 또는 MHB "프리 S2"(제4C도 및 제4F도) 에피토프에 대해 시험했다. 배양물을 밀리몰 단위로 표현된 지시농도의 NBDNJ에서 유지시키고 X축을 따라 나타냈다.

비교하면 2.28mM은 대략 500μg/mℓ의 HBDNJ와 동일하다. Y축은 플레이트 판독기에 의해 읽힌 중재 OD 단위의 ELISA 반응의 비색신호를 나타낸다.

제5도는 세부분으로 나뉘어 제5A도, 제5B도 및 제5C도가 NBDNJ 처리된 것과 처리안된 배양물의 배지중 LHB 및 MHB의 웨스턴 블롯(Western blot) 분석을 도시한다. 배양배지의 폴리에틸렌글리콜(PEG) 침전물(제5A도) 또는 처리안된 것 (제5B도)과 NBDNJ 처리된 배지(제5C도)로 부터의 부분 정제된 비리온, HB 필라멘트 (filament) 및 구(sphere)를 SDS-PAGE (13.5% 아크릴아미드)에 의해 분해하고, 임모빌린 페이퍼에 옮기고, 프리 S1 및 프리 S2 특이적 모노클로날 항체와 인큐베이션했다.

- 레인은 제5도의 각 부분의 상부에 표시된다. 사람 혈청으로부터 정제된 1.0μg의 HBV유전자형 D를 콘트롤로 사용한다.

- 킬로달톤(kd) 단위의 분자량 마커(mW)는 제5도의 각 부분의 우측에 표시된다.

- 좌측의 화살표는 LHB (S1) 및 MHB (S2) 폴리펩티드를 나타낸다.

발명의 배경

본 발명은 B형 간염 바이러스를 저해하는 신규의 방법에 관한 것이며, 더 구체적으로는 상기 바이러스로 감염된 세포에서 B형 간염 바이러스의 복제 및 분비를 저해하기 위한 1, 5-디데옥시-1, 5-이미노-D-글루시톨의 N-알킬 유도체의 사용에 관한 것이다.

B형 간염 바이러스(HBV)는 급성 및 만성 간질환의 병원체이다 (Ayoola et al., Bull. World Health Organ. 66, 443-455 (1988)). 비록 효과적인 백신법을 구할 수 있지만 (현재 구할 수 있는 두가지 HBV 백신은 Merck의 Recombivax HB 및 SmithKline Beecham의 Engerix-B이다), 아직도 세계적으로 3억 이상의 바이러스 만성 감염 인구가 있다 (Eder et al., Progress in Liver Diseases, eds. Popper 및 Schaffner (Grune & Stratton, Orlando, FL), vol. 8, pp. 367-394 (1986)), 그들에게 백신은 치료가치를 가지지 못한다. 전염병 국가재단의 전무이사인 Richard Duma 박사에 따르면, 미국에만도 매년 약 300,000건의 HBV 간염이 발생한다고 한다 (Med. World News 34 (8), 20-21 (1993)). HBV로 만성 감염된 사람중 25 내지 40%는 심각한 간질환으로 발달한다. 따라서 효과적인 항-HBV 요법을 개발하는 것은 중요하다.

알파 인터페론은 HBV 감염의 치료법으로 사용되어 약간의 환자들에게 유망한 결과를 가져왔다(Hoofnagle 및 Jones, Seminars in Liver Disease 9, 231-233(1989); 및 Perrillo, Seminars in Liver Disease 9, 240-248 (1989). 최근 미국 FDA에 의해 승인된 단하나의 만성 HBV 감염 치료법은 재조합 인터페론 알파-2b(인트론 A, Schering-Plough)이다.

만성 B형 간염의 치료를 위한 뉴클레오시드 유사체, 피알우리딘 (fialuridine)의 사용에 대한 임상시험은 20명의 환자중 6명에서의 약품-관련 간기능 부전 때문에 최근 보류되었다. 결과적으로 B형 간염의 안전한 약품 치료법이 매우 절실하다.

최근 보고서는 역전사효소로 기능하는 바이러스 암호화된 DNA 중합효소가 매력적인 표적이라는 것을 제시한다 (Doong et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 8495-8499 (1991); Lee et al., Antimicrob. Agent Chem. 33, 336-339 (1989); Price et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 8541-8544 (1989), 및 Venkateswaran et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 274-278 (1987).

다른 바이러스-매개 공정은 항-바이러스 간섭에 대한 표적이 되지 못했다. HBV에 대한 효과적인 항바이러스 요법은 숙주면역계에 영향을 주는 약물 뿐만아니라 바이러스 생활환의 서로 다른 단계들을 방해하는 것들을 포함하여 다중 전략을 내포하기 쉽다. 따라서 바이러스 생활환중 다른 비-중합효소 매개 단계들이 간섭을 받을 수 있다는 가능성을 개발하는 것은 흥미롭다.

1, 5-디데옥시-1, 5-이미노-D-글루시톨 (또한 1-데옥시노지리마이신 또는 DNJ라고도 알려짐) 및 그것의 N-알킬 유도체는 N-연결 올리고당 프로세싱 효소인 α -글루코시다제 I 및 II의 공지된 저해인자이다. Saunier et al., J. Biol.Chem. 257, 14155-14161(1982); Elbein, Ann. Rev. Biochem. 56, 497-534 (1987). 글루코스 유사체로서 그것들은 또한 글루코실 트랜스퍼라제를 저해할 수 있는 잠재능을 가진다. Newbrun et al., Arch. Oral Biol. 28, 516-536 (1983); Wang et al., Tetrahedron Lett. 34, 403-406(1993). 그것들의 글루코시다제에 대한 저해활성은 이들 화합물이 과혈당방지제 및 항바이러스제로서 개발되도록 이끌었다. 예를들어 PCT 국제출원 WO 87/03903 및 미국 특허 : 4,065,562; 4,182,767; 4,533,668; 4,639,436; 4,849,430; 4,957,926; 5,011,829; 및 5,030,638 참조.

B형 간염 바이러스(HBV)에 대한 저해제의 효과에 대한 연구는 분석용 허용세포 배양시스템의 결여로 인해 지금까지 드물었다. 즉, 지금까지 조직배양을 재생하고 바이러스에 의해 생산적으로 감염시킬 수 없는 것이 유용한 항-HBV제의 개발에 심각한 한계가 되어왔다.

한 연구에서, N-메틸 데옥시노지리마이신은 마우스 간염 바이러스(MHV)의 형성을 저해함으로써 세포표면상의 E2의 출현을 지연시킨다고 보고되었다. Repp et al., J. Biol. Chem. 280, 15873-15879 (1985); Datema et al., Pharmac. Ther. 33, 221-286. 260(1987) 참조. 그러나 MHV는 B형 간염 바이러스(HBV)와 동족이 아니다. 한편 HBV는 헤파드나바이러스과(family)의 일원이며, 사람에서의 작은 바이러스 병원체이다. HBV 크기는 약 42nM이고, DNA 게놈 크기는 3.5kb이다.

한편 MHV는 코로나바이러스과 일원이고, 일반적으로 상부 호흡기 감염을 유발하는 사람 코로나바이러스 병원체와 달리 사람에 비병원성인 큰 RNA-함유 바이러스이다. MHV크기는 약 100-150nM (약간 다면작용성이다)이고, RNA 게놈 크기는 약30kb이다. HBV과 MHV 사이에는 매우 적은 유사성이 있다. 코로나바이러스(MHV 포함)에 대한 더 이상의 배경정보와 완전한 설명은 K. Holmes, Virology, 2판, B. Fields 발행, pp. 841-856, Raven Press, New York, NY, 1990을 참조하여 얻을 수 있다.

간염 델타 바이러스(HDV) 분비는 HBV sAg 글리코실화에 의존하지 않는다는 두 개의 다른 과학그룹에 의한 최근 보고서로부터 한 바이러스로부터 다른 바이러스까지 결과를 예상하는 것이 불가능하다는 것이 명백하다. W. Hui-Lin et al., 요약서 115, 및 C. Gureau et al., 요약서 117, 1994 미팅에서 제출된 논문의 요약서, "Molecular Biology of Hepatitis B Viruses", 1994 10. 3-6, Institut Pasteur, Paris, France.

HDV는 자신의 외피 단백질을 특이화하지 않는다. 그것은 HBV와 동일한 세포를 감염하고, HBV S 항원(HBV 외피단백질)을 사용하여 감염성 성숙 HDV 입자를 만든다. 구별방법으로 UBV 분비는 글리코실화 및 글리칸 트리밍에 의존성이다. 즉 비록 HBV 및 HDV는 동일한 외피단백질로 이루어졌지만, HDV 분비는 글리코실화 독립성인데 반해 HBV는 글리코실화에 매우 민감하다.

B형 간염 바이러스 세포배양 시스템에 대한 글리코실화 저해인자, 투니카마이신의 효과는 Pizer et al., J. Virol. 34, 134-153 (1980); Datema et al., 상동 270에 기술되어 있다. 그러나 투니카마이신은 새로 합성된 폴리펩티드에 대한 N-연결 올리고당의 첨가를 바람직하지 않게 완전히 방지한다. 즉 투니카마이신의 처리는 단백질의 V-연결 글리코실화의 완전한 저해를 초래하여 세포에 매우 독성이다.더우기 HBV 감염세포의 투니카마이신 처리는 HBV 분비의 상당한 감소를 초래하지 않는다.

발명의 개요

본 발명에 따르면 B형 간염 바이러스(HBV)로 감염된 세포에서 상기 바이러스를 저해하는 방법을 제공한다. 이 방법은 HBV 비리온의 복제 및 분비를 저해하기에 효과적인 양으로 1, 5-디데옥시-1, 5-이미노-D-글루시톨의 N-알킬유도체(여기서 알킬기는 3 내지 6 탄소원자를 함유함)로 상기 세포를 처리하는 것을 포함한다. N-알킬기는 바람직하게는 부틸이다.

본 발명의 바람직한 실시예에서, N-부틸-1, 5-디데옥시-1, 5-이미노-D-글루시톨(NB-DNJ)은 안정적으로 형질감염된 HepG 2.2.15 세포 및 HBV 감염된 HepG2 세포 둘다에서 HBV 입자의 분비를 억제하고 HBV DNA의 세포내 보류를 초래한다고 밝혀졌다.

HepG2 세포는 공지되고 널리 분포되고 쉽게 구할 수 있는 사람 간종양 세포이다. HepG2 세포주의 확립 및 특성은 미국특허 4,393,133에 기술된다. 이 세포주의 샘플은 또한 American Type Culture Collection, Rockville, Maryland로부터 수탁번호 ATCC HB 8065하에, 그리고 European Collection of Animal Cell Cultures, Porton Down, UK로부터 구할 수 있다. 이들 세포는 다양한 단백질들, 예컨대 Broze 및 Miletich, Proc. Natl. Acad. Sci, USA 84, 1886-1890 (1987)와 미국특허 4,996,852, 5,106,833 및 5,212,091에 리포단백질 연합 응집저해인자(LACI)로도 알려진 조직인자 저해인자(TFI)의 원천으로 사용되었다.

HepG 2.2.15 세포는 HepG2 세포의 유도체이고, Sells et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 84, 1005-1009 (1987)에 기재된 대로 제조되었다.

HBV-생산 세포의 투니카마이신 처리가 정상적 HBV 입자 분비를 초래한다는 것이 이전에 보고되었기 때문에, 본 발명의 방법에 의한 HBV 입자의 분비의 억제는 예측하기 힘들다.

Grippon et al., Mol. Biol. HBV, San Diego, CA, 요약서 페이지 67 (1992) 참조. 서브바이러스 입자가 아닌 HBV 비리온의 분비가 투니카마이신에 의해 저해된다는 것이 본 발명자에 의해 밝혀졌다.

또한 본 발명의 방법에 의한 처리로부터 유발되는 세포내 HBV DNA의 증가도 예측할 수 없다.

HBV 외피 단백질은 분자당 오직 한개 또는 두개의 N-연결 글리칸을 함유하기 때문에, DNJ의 N-알킬유도체에 의해 적당히 (중량에 의해) 글리코실화된 단백질과 그것들의 비리온산물의 분비를 저해하는 능력은 많이 글리코실화된 외피 단백질을 함유하는 HIV의 분비에 대한 그것들의 더 작은 효과와 대비할 때 놀라운 것이었다. 또한 큰 코카르복시-말단 단백질, LHB 및 중간 MHB를 함유하는 HBV 비리온 및 입자가 작은 SHB 증식입자 보다 N-부틸 DNJ에 더 민감하다고 기대되지 않는다.

DNJ의 N-알킬유도체의 사용에서 또다른 이점은 그것들이 비교적 비독성이라는 것이다. 예를들어 N-부틸유도체는 HIV 복제의 저해에 효과적인 농도(EC₅₀= 43μM)에서 비독성(TD₅₀, 5mM)이라고 알려진다. 예컨대 Bryant et al., 제10회 AIDS국제회의의 요약서, Berlin, June 7-11, 1993 참조. 또한 HBV로 감염되고 1000μg/mℓ의 DNJ의 N-부틸유도체로 처리된 HepG 2.2.15 세포중 90%가 처리안된 콘트롤 만큼 생존성이었다는 것이 여기에 보여진다.

여기에 증명된 결과의 관점에서, HBV 비리온의 수송 또는 글리코실화 트리밍 경로의 단계를 저해하는 다른 화합물은 조직배양 및 포유동물 숙주에서 HBV 형태발성을 저해하기에 유용할 것이라고 믿어진다.

[발명의 상세한 설명]

본 명세서는 본 발명을 구성한다고 간주되는 표제물을 구체적으로 선택하고 구별하여 주장하는 특허청구의 범위로 결론을 내리지만, 본 발명은 첨부도면과 관련하여 다음 예시적인 상세한 설명으로부터 더잘 이해될 수 있다고 믿어진다.

HBV 외피는 세개의 코-카르복시-말단 단백질(HB)을 함유하며, 큰(LHB), 중간 (MHB) 및 작은(SHB) 단백질로 칭하여 진다 (제1도 참조), 이들 단백질은 단일 개방 해독틀(ORF)의 교대(alternate) 번역개시로 부터 초래된다 (Ganem, Hepadnaviruses, Mason 및 Seeger (Springer-Verlag)발행, pp. 61-84 (1991)). 세가지 HB 단백질 모두는 S 도메인의 아미노산 146에 복합형 N-연결 올리고당으로 발생한다 (제1도와 Gerlich 및 Bruss, Molecular Biology of Hepatitis B. Virus, A. McLachlan 발행, CRC 인쇄, pp. 109-144(1992), 및 Hepatitis B. Vaccines in Clinical Practice, R. W. Ellis, Marcel Dekker, Inc. 발행, pp. 41-82 (1992) 참조).

MHB (LHB는 아님)는 또한 프리 S2 도메인내의 혼성형 올리고당으로 발생한다. HBV에 의한 자연 감염도중, 간은 매우 과량의 HB 단백질을 생산하고 이를 20nM 직경의 사상 또는 구상 서브-바이러스 입자로서 분비한다 (Ganem, Hepadnaviruses, pp. 61-84 (1991); 과 Gerlich 및 Bruss, Molecular Biology of Hepatitis B. Virus, 및 Hepatitis B. Vaccines in Clinical Practice, 상동). HB 구가 매우 풍부하며, HB 필라멘트 및 HBV입자 보다 5 내지 10배 더 적은 LHB를 함유한다. MHB는 세가지 타입의 입자 모두의 부성분이다 (Gerlich 및 Bruss, Molecular Biology of Hepatitis B. Virus, 및 Hepatitis B. Vaccines in Clinical Practice, 상동).

HBV의 형태발생은 복잡하다. 전조립된 바이러스 코어 입자는 바이러스 외피(표면) 단백질의 세포질 측에 부착하여 소포체(ER) 막내로 삽입한다고 믿어진다 (Gerlich 및 Bruss, Molecular Biology of Hepatitis B. Virus, 및 Hepatitis B. Vaccines in Clinical Practice 상동).

외피를 획득한 후, 비리온은 ER의 루멘으로 발아하고, 거기로부터 골지체를 통해 세포외 유체내로 수송된다. 미성숙 당단백질은 N-연결 올리고당상에 세개의 말단 글루코스 잔기를 함유한다.

말단 글루코스 잔기의 제거는 ER로부터 골지까지의 미성숙 당단백질의 이동에 중요한 역할을 한다고 생각된다 (Datema 및 Romero, Pharmacol. Thera. 33, 221-286 (1987)). 이미노당, NBDNJ는 α-글루코시다제 I의 잠재 저해인자이며, 이 세포효소는 초기 올리고당으로 부터 말단 글루코스잔기를 제거하고, 생체외에서 세포독성 사람 면역결핍 바이러스(HIV)의 형성을 억제한다고 밝혀졌다 (Karpas et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 9229-9233(1988); 미국특허 4,849,430; 및Walker. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 8120-8124 (1987)). HBV 분비는 둘다 N-연결 올리고당을 가진 LHB 및 SHB를 필요로 하기 때문에, 바이러스 합성에 대한 NBDNJ의 효과를 시험했다.

본 발명을 더욱 예시하기 위해 다음 상세한 실시예를 수행했으나, 본 발명은 이들 특정 실시예 또는 여기의 상세한 설명에 한정되지 않는다고 이해될 것이다.

실시예

방법:

세포 및 배지:

HepG2 세포는 European Collection of Animal Cell Cultures (Porton Down, UK)로 부터 구입했다. HepG2 2.15 (2.2.15, Sells 및 Chen, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 1005-1009 (1987)) 세포는 George Acs 박사(Mt. Sinai Medical College, New York, USA)로 부터 얻었다.

모든 조직 배양물은 10% 열 불활성화된 태아 소혈청(Techgen, London, U.K.), 50유니트/mℓ의 페니실린 및 스트렙토마이신, 1mM 글루타민(GIBCO)으로 보충된 RPMI 1640 (GIBCO) 배지에서 5% CO₂에 유지시켰다. 2.2.15 세포에 대해서는 Sells 및 Chen, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 1005-1009 (1987)에서와 같이 배지에 200μgs/mℓ 항생제 G418(Genticin, GIBCO)을 첨가했다.

세포 생존성은 Platt 및 Jacob, Eur. J. Biochem. 208, 187-193 (1992)에서와 같이 요오드화 프로피듐과 인큐베이션한 후 FACscan 세포측정기, BectonDickinson, Sunnyvale, CA, USA를 사용하여 유동 세포측정법에 의해 측정했다.

HepG2 세포의 감염:

초원심분리후에 40 내지 46% 수크로스(w/w)로 침전시켜 사람 혈청으로부터 또는 배양세포의 배지로부터 HBV를 정제했다 (Seifer et al., Virol. 179, 300-311 (1990). 비리온을 0.02M 인산칼륨 버퍼, pH 7.4에 투석하고, 농축하고, 37℃에서 하룻밤 동안 V8 프로테아제(Staphylococcus aureus, Sigma Chemical Co. 로부터)로 처리하고, 20% 수크로스/0.01M Tris, pH 7.4, 0.14M NaCl, 0.005M EDTA (TNE) 쿠션을 통해 8시간 동안 원심분리했다. 펠렛을 성장배지에서 재현탁한 다음, 이를 사용하여 HepG2 세포를 접종했다.

이미노당 화합물

NBDNJ의 합성은 공지되고, Fleet et al., FEBS Letters 237, 128-132 (1988)에 기재 되어 있다. NBDNJ는 화합물 SC-48334로서 G.D. Searle/Monsanto Co. 에 의해 제공되었다.

바이러스 DNA의 검출

Sells 및 Chen, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 1005-1009 (1987)에서와 같이 약 5x10⁶세포로 부터의 배지를 정화후에 폴리에틸렌글리콜(PEG) 8000 (Sigma)으로 침전시키고, 0.5 mℓ 인산 버퍼된 염수(PBS)에서 재현탁하고, Beckman T100.3 로터에서 50,000rpm으로 (약 75,000xg) 5시간 동안 PBS중 20%수크로스의 쿠션을 통해 침전시켰다.

DNA를 Sells 및 Chen, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 1005-1009 (1987)에서와 같이 펠렛으로부터 제조했다. 서던 블롯을 위해 (Maniatis et al., Molecular cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982)), DNA를 1.2% 아가로스를 통한 전기영동으로 분해하고, H⁺결합(Amersham) 여과지로 옮기고, 방사성³²F (Amersham HBV 프로브(pHBV를 주형으로 사용하여 키트 제조자(Amersham)에 의해 기술된 랜덤 프라이밍법에 의해 만듬)와 혼성화시켰다(Foster et al., Proc. Netl. Acad. Sci. USA 88, 2888-2892 (1991)) .

혈청 유래 HBV로 감염된 HepG2 세포의 배지중 자손 바이러스는 모노클로날 항체를 갖는 배지를 프리 S2 에피토프로 침전시킴으로써 검출했다. 면역침전된 비리온으로부터의 DNA는 바이러스 게놈에 대한 뉴클레오티드 2815 및 190으로 부터의 프라이머(뉴클레오티드 1으로서 EcoRI 부위를 사용)를 사용한 중합효소 연쇄반응 (PCR)에 의해 증폭했다.

Maniatis et al., Molecular cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982)에 기재된 표준방법에 의해 DNA를 세포 용해물로 부터 제조했다.

효소연결 면역흡착 분석법(ELISA)에 의한 HBV 단백질의 검출

여기서 사용된 모노클로날 항체는 공지되고, 프리 S1에 대한 항체(MA 18/7)는 Heerman et al., J. Virol. 52, 396-402 (1984)에; 프리 S2에 대한 항체(Q19/10)는 Heerman et al., Intervirology 28, 14-21 (1987)에, 또한 Gerlich 및 Bruss, Molecular Biology of Hepatitis B. Virus, A. McLachlan 발행, CRC 인쇄, 109-144 (1992) 및 Hepatitis B. Vaccines in Clinical Practice, R. W. Ellis, Marcel Dekker, Inc. 발행. pp. 41-82 (1992) 참조: 그리고 S에 대한 항체(C20-2)는 Heerman et al., Viral Hepatitis and Liver Disease, Zuckermann, A.R.Liss 발행, 697-701 (1988)에 기술되어 있다.

샘플을 LHB, MHB 또는 SHB 에피토프에 특이적인 모노클로날 항체로 피복된 미세적정 웰에서 배양하고 (4℃에서 하룻밤), PBS중 1%, BSA로 봉쇄했다. 1시간 (37℃) 동안 바이러스 샘플을 넣고 배양한 후, 플레이트를 PBS/0.1% Tween 20 비이온성 세제로 4회 세척했다.

결합된 항원은 퍼옥시다제 콘쥬게이트된 염소 항-HB 항체(Behring)와 배양한 후 오르쏘페닐렌디아민(0.33mg/mℓ PBS-퍼옥시드 용액)에서 발생시킴으로써 검출했다. 광학밀도를 Behring 플레이트 판독기에서 읽었다. 정제된 바이러스 및 총 배지에 대한 시험을 일련의 샘플 농도에 걸쳐 수행하여 적당한 정량화를 보장했다.

웨스턴 블롯:

샘플을 로딩버퍼에 용해시키고, 13.5% SDS 폴리아크릴아미드겔(SDS-PAGE)을 통한 전기영동에 의해 분해하고, PVDF (밀리포어) 멤브레인으로 옮기고, 5% 분말우유로 봉쇄했다(Gultekin 및 Heerman, Analytical Biochem. 172, 320-329 (1989)). TNE중 1% 소혈청 알부민(BSA)에서 실온에서 하룻밤동안 1차 항체와 배양하고, 실온에서 TNE에서 1시간동안 2차 항체(퍼옥시다제 콘쥬게이트된 염소 항-마우스 IgG 혈청)와 배양한 후, 멤브레인을 퍼옥시드-디아미노벤지딘(Sigma) PBS에서 발생시켰다 (제조자의 지시서에 기술된 대로).

결과

NBDNJ는 2.2.15 세포에 의해 배지로 해리된 비리온연합 HBV DNA의 양을 감소시킨다:

2.2.15 세포는 HepG2주로부터 유래되고 배양배지내로 감염성 HBV 뿐만아니라 서브-바이러스입자(HB 입자 및 구)를 만성적으로 분비한다(Heerman et al., J. Virol. 52, 396-402(1984), 및 Sells et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 1005-1009 (1987)).

HBV의 생산 및 분비에 대한 NBDNJ의 효과를 결정하기 위해, 2.2.15 세포를 6일 동안 3일째 한번의 배지교환으로 일정범위의 NBDNJ 농도를 함유하는 배지에서 유지시켰다. 화합물에서의 6일 후에, DNA를 바이러스로부터 분리했다 (상기 "방법"에 기술된대로). 제2A도에 도시된대로 방사성 표지된 HBV DNA 프로브에 대한 서던블롯의 혼성화에 의해 바이러스 DNA를 검출했다.

릴랙스된 원형 및 선형 게놈길이 DNA의 예상 이동성(Sells et al., J. Virol. 62, 2836-2844 (1988))으로 이동하는 바이러스-특이적 DNA를 처리안된 배양배지로부터 유래된 샘플(레인 1 및 2)에서 검출했다. NBDNJ로 처리된 세포의 배지로부터 얻은 바이러스 특이적 DNA에는 (레인 3, 4 및 5) 명백한 투여량-의존성 감소가 있었다. 제2A도에 도시된 자동방사선사진은 농도측정계에 의해 정량되었다. 농도측정은 500μg/mℓ(2.28mM) 및 1000μg/mℓ의 NBDNJ는 각각 90 및 99%의 감소를 초래한다는 것을 밝혀냈다.

요오드화 프로피듐 염색된 세포의 FAC 분석과 단백질내로의^[35]-S 메티오닌 통합에 의해 결정할 때 6일 동안 1000μgs/mℓ NBDNJ로 유지된 세포의 90%가 처리안된 콘트롤 만큼 생존성이므로, 감소는 NBDNJ의 독성 때문이 아니다.

NBDNJ로 처리된 2.2.15 세포는 고레벨의 세포내 HBV DNA를 함유한다.

배지내 비리온 연합 HBV DNA의 NBDNJ-매개 감소는 바이러스 DNA 합성의 감소때문일 수 있다. 그렇지 않으면 비리온 조합, 세포로 부터의 수송 또는 방출과 같은 합성후 사건 때문일 수 있다. 이들 가능성 사이를 구별하기 위해, 처리안된것과 VBDNJ 처리된 2.2.15 세포에서 세포내 HBV 특이적 DNA의 양을 비교했다.

총 세포 DNA를 처리된 것과 처리안된 세포로부터 제조하고, EcoRI으로 완전 분해하여 바이러스 게놈을 선형화 했다. 거의 동일한 미크로그램 양의 분해산물(에티듐브로마이드 염색과 세포 특이적 프로브에의 혼성화에 의해 결정)을 전기영동에 의해 분해하고, 서던 블로팅하고, HBV 특이적 프로브로 혼성화 했다 (제2B도). 3.2kb 밴드와 같이 이동하는 단위길이 HBV 게놈을 처리안된 2.2.15 세포로부터 유래된 DNA (레인 1)와 콘트롤 배양배지로 부터 분리된 비리온(레인 5)에서 검출했다.

레인 2. 3 및 4는 각각 200, 500 및 1000μg/mℓ NBDNJ로 처리된 세포로부터 유래된 DNA를 함유한다. 처리안된 세포와 비교하여 NBDNJ 처리된 세포에 존재하는 HBV DNA 양의 명백한 투여량-의존성의 증가가 있다. 이 자동방사선사진의 농도측정은 로딩 콘트롤로서 세포 MHC 클래스 III 유전자, G1에의 혼성화를 사용하여 로딩편차를 조정했을 때, 200, 500 및 1000μgs/mℓ의 NBDNJ로 처리된 세포가 각각 HBV 사본 양의 1.7, 3.0, 5.1배 증가를 나타낸다는 것을 보여준다.

HBV로 감염되고 NBDNJ로 처리된 HepG2 세포는 자손 바이러스를 덜 방출한다.

2.2.15 세포는 안정하게 형질감염된 환경에서 HBV 생산을 연구하기에 유용한 시스템이다. 그러나 이들 세포에서의 HBV 프리게놈(pregenome) 합성은 공유결합으로 폐쇄된 원형 바이러스 DNA 주형이 아닌 통합된 바이러스 DNA주형으로부터 일어날 수 있으며, 자연 감염도중발생한다고 생각된다 (Sells et al., J. Virol. 62, 2836-2844 (1988)). 더우기 이들 세포는 배지로 방출된 다양한 서브게놈 바이러스 DNA 산물 뿐만아니라 나출(naked) 코어 입자도 생산한다 (Sells et al., 상동).

그러므로 HepG2 세포를 프로테아제-변형된 HBV로 감염시켰다. 다음날 배양배지를 콘트롤배지 또는 다양한 농도의 NBDNJ를 함유하는 배지로 교체했다. 감염한지 5일 후에 자손 비리온을 프리 S2 도메인의 중앙부분에 특이적인 모노클로날 항체로 면역침전시켰다. HBV 특이적 DNA 서열을 HBV 특이적 프라이머를 사용한 PCR에 의해 증폭시켰다. 반응생성물을 아가로스겔 전기영동에 의해 분해하고, 에티듐브로마이드 염색후에 영상화했다 (제3A도). 519염기쌍 생성물(화살표 제3A도)을 농도측정분석에 의해 정량하였고. 좌표는 제3C도에 보여진다. 비록 PCR이 샘플들에서의 초기 DNA 농도 사이의 차이를 과소평가할 수 있지만, 프로테아제 프로세싱된 바이러스로 감염된 후 700μg/mℓ(3.2mM) NBDNJ로 처리된 세포로 부터의 배지는 처리안된 샘플 보다 한자리수 덜 바이러스 DNA를 함유한다는 것이 명백하다. 이들 결과는 배지로방출된 HBV의 NBDNJ 매개된 감소가 2.2.15 형질감염된 세포 시스템에 특유한 것이 아님을 보여준다.

HBV로 감염되고 NBDNJ로 처리된 HepG2 세포는 증가된 양의 세포내 HBV DNA를 함유한다.

NBDNJ로 처리된 HBV 감염 HepG2 세포의 배양배지는 비리온 연합 DNA의 감소된 양에 관해 2.2.15 세포와 유사하기 때문에, 처리된 세포내의 바이러스 DNA의 동시 증가가 있는지 알아 보는 것은 흥미롭다. 총 세포 DNA를 제3A도 및 제3C도에 제시된 것에 해당하는 샘플로부터 제조했다. 세포내 HBV특이적 DNA를 PCR을 사용하여 증폭했다. 반응생성물을 아가로스겔 전기영동에 의해 분해하고 에티듐브로마이드로 겔을 염색한 후 (제 3B도), 농도측정법에 의해 분석했다 (제3D도). 분명히 HBV로 감염되고 NBDNJ로 후처리된 HepG2 세포는 처리안된 세포 보다 더 많은 양의 바이러스 DNA를 축적했다.

NBDNJ 처리된 것과 처리안된 2.2.15 세포의 배양배지는 유사한 양의 HBV 외피 항원을 함유한다.

2.2.15 세포는 서브-바이러스 입자 뿐만아니라 비리온도 분비한다 (Sells et al., J. Virol. 62. 2836-2844 (1988). 배양배지중 비리온-연합 DNA의 NBDNJ-매개된 감소는 모든 HB함유 입자 분비의 일반적 감소의 반영일 수 있다. 그렇지 않으면 방대한 초과량으로 존재하는 상대적으로 부족한 다른 형태(들)를 갖는 드문 비리온 입자의 선택적 감소일 수도 있다.

이들 가능성 사이를 구별하기 위해 배양배지중 외피항원의 양과 성질을ELISA 및 웨스턴분석 둘다에 의해 결정했다. 정화된 배양배지에 존재하는 SHB, MHB 및 LHB의 ELISA 분석은 제4A도, 제4B도 및 제4C도에 보여진다. 결과는 배지중 SHB(S) 및 LHB(프리 S1) 항원의 총량에 대한 중대한 영향은 없다는 것을 보여준다. 배지중 MHB (프리 S2) 항원의 총량의 약간의 투여량-의존성 감소가 있다. 이 감소는 최고 NBDNJ 농도(4.5mM 또는 약 1000μg/mℓ)에서 약 2.5배이다. 이들 결과는 웨스턴 블롯분석에 의해 확인되었다. 제5A도는 콘트롤 배양물과 1000μg/mℓ로 처리된 것으로 부터의 배지의 웨스턴 블롯을 보여준다. 여기에 NBDNJ 처리된 것(제5A도, 레인 3)과 처리안된 배양물(제5A도, 레인 2)로 부터의 배지는 유사한 양의 MHB (S2) 및 LHB (S1) 항원을 함유한다는 것이 보여진다.

따라서 NBDNJ는 배양배지중 SHB 및 LHB 항원의 양에 일반화된 감소를 초래하지 않는다. 그러나 ELISA에 의해 결정된 바와같이 1000μg/mℓ NBDNJ로 처리된 2.2.15 세포의 배지중 MHB항원의 양에 2배 감소가 있다.

NBDNJ-처리된 2.2.15 세포의 배양배지는 완전한 비리온으로 침전하는 감소된 양의 HBV 외피항원을 함유한다.

완전한 비리온에 존재하는 HB의 양을 결정하기 위해, 지시배양물로 부터의 배지를 초원심 분리에 의해 수크로스 구배를 통해 분별했다. 처리된 것과 처리안된 배양물로부터 유래된 분비된 비리온을 40-46% 수크로스에 침전시키고 농축하고 ELISA에 의해 HB 단백질에 대해 시험했다. 제4D도, 제4E도 및 제4F도는 결과를 보여준다. 또는 형태의 HB들이 처리안된 2.2.15 세포의 배지로 부터 제조된 비리온을 함유하는 샘플에서 쉽게 검출될 수 있었다.

한편 2.25 및 4.5mM (약 500 및 1000μg/mℓ 각각, 비교용) NBDNJ로 처리된 세포의 배지로 부터 제조된 샘플에서 사실상 검출가능한 HB 단백질이 없었다. 이는 이들 샘플의 배지중 완전한 바이러스의 감소된 양을 암시한다.

ELISA 결과는 완전한 바이러스, 필라멘트 또는 구를 함유하는 수크로스 구배로 부터의 분획을 웨스턴 블롯 분석하여 확인했다 (처리안된 배양물로부터의 제5B도와 NBDNJ 처리된 배양물로부터의 제5C도). 수크로스 구배의 분획들로 부터의 동일 부피를 SDS 겔 전기 영동에 의해 분해하고 멤브레인으로 옮기고, LHB (프리 S1)에 특이적인 항체와 인큐베이션하고 영상화한 다음, MHB (프리 S2) 에피토프에 특이적인 항체와 더 인큐베이션했다. 사람혈청으로부터 유래된 부분정제된 HBV는 콘트롤로서 레인 5 (제5B도 및 제5C도)에 제시된다.

비리온 함유 분획의 말단분획(구배의 바닥부근)은 레인 1에서 분해되어 항체의 특이성을 보였다. 레인 2, 3 및 4 (제5B도 및 제5C도)는 각각 완전한 바이러스, HB필라멘트 및 구함유 분획을 함유하며, 이는 수크로스에서 침전과 바이러스 DNA의 존재(비리온) 및 부재(서브-바이러스 입자)에 의해 정의된다. NBDNJ 처리된 배양물의 배지로부터 제조된 비리온, 필라멘트 및 구에 존재하는 모든 HB 단백질의 양에 감소가 있다 (제5B도 및 제5C도의 레인 2, 3 및 4 비교). MHB (프리 S2 에피토프)의 감소가 특히 심각하다. 제5B도 및 제5C도에 보여진 영상을 농도측정법에 의해 정량했다.

농도측정분석은 처리안된 샘플에 비해 NBDNJ 처리된 비리온 샘플중 LHB의 감소가 약 4배라는 것을 나타냈다. 동일한 레인(제5B도의 레인 2와 비교된 제5C도의레인 2)에서 MHB의 감소는 12배 이었다. 다양한 형태의 HB 단백질을 분리하기 위해 사용된 구배는 서로 다른 형태로 강화된 (enriched) 분획의 결과를 초래함을 알수 있다. 즉, 비리온 함유 분획은 또한 필라멘트 및 구를 함유하기 쉽다. 이것은 면역학적 분석법에 의해 판단할 때 구 및 필라멘트에 비해 비리온의 방출에 대한 NBDNJ의 효과를 과소평가하도록 만들 수 있다.

그럼에도 불구하고, NBDNJ 처리된 배양물로 부터의 배지는 유사한 양의 총 HB 항원을 함유하지만 비리온 분획에서 매우 감소된 항원성 물질을 함유한다는 점에서, 웨스턴 블롯 분석의 결과는 ELISA의 결과와 일치한다.

여기에 기술된 저해화합물은 또한 통상의 수단, 바람직하게는 약제학적으로 허용 가능한 희석제 및 담체와의 제제에 의해 HBV로 감염된 환자에 투여하기 위해 사용될 수 있다. 이들 화합물은 자유 아민형태 또는 그것들의 염 형태로 사용될 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 염 유도체는 예를들어 HCl 염에 의해 예시된다.

이들 저해화합물은 또한 미국특허 5,043,273 및 5,103,008에 기술된 6-포스포릴화 유도체와 미국특히 5,003,072; 5,144,037; 및 5,221,746에 기술된 O-아실화유도체와 같은 프로드 러그의 형태로 사용될 수 있다. 바람직한 그러한 유도체는 1, 5-(부틸이미노)-1, 5-디데옥시-D-글루시톨, 테트라부티레이트이다.

투여되는 활성화합물의 양은 효과적인 양, 즉 의학적으로 유익하나 그 사용에 수반 되는 이점을 무색케 하는 유해 효과를 나타내지 않는 양이어야 한다. 성인 일일 투여량은 보통 약 1 내지 1000밀리그램의 활성 화합물의 범위일 것이라는 것을 예측할 수 있다. 비록 비경구적 투여도 사용될 수 있지만, 바람직한 투여경로는캡슐, 정제, 시럽, 엘릭서등의 형태로 경구적 투여이다. 치료적 투여형태로서 약학적으로 허용가능한 희석제 및 담체에서의 활성 화합물의 적당한 조제는 예를들어 Remington's Pharmaceutical Sciences, Arthur Osol 발행, 16판, 1980, Mack Publishing Co., Easton, PA., U.S.A.와 같은 당업계의 일반적 교과서를 참조하여 제조할 수 있다.

본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 본 명세서를 읽은 후에 여러 가지 다른 실시예들이 당업계의 기술자에게 명백할 것이다. 모든 그러한 다른 실시예들은 첨부된 특허청구의 범위의 범주내에 포함될 수 있도록 의도된다.

Claims (3)

1. B형 간염 바이러스 비리온의 복제 및 분비를 저해하기에 효과적인 양으로 1,5-디데옥시-1,5-이미노-D-글루시톨의 N-알킬유도체 (여기서 상기 알킬기는 3 내지 6개의 탄소원자를 함유함)를 포함하는 B형 간염 바이러스 감염의 치료를 위한 약학조성물.
2. 제 1항에 있어서, 알킬기는 부틸인 것을 특징으로 하는 약학조성물.
3. 제 1항에 있어서, 효과적인 저해 양은 약 1 내지 1000 mg인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.