KR20200022753A - 시클로피록스(Ciclopirox)의 HBV 코어조립 저해 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 시클로피록스(ciclopirox) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는, 항-HBV(Hepatitis B Virus) 조성물; 시클로피록스 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는, HBV 바이러스 유발 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물; 상기 약학 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, HBV 바이러스 유발 질환의 치료 방법; 및 시클로피록스 또는 이의 생리학적으로 허용가능한 염을 포함하는, HBV 바이러스 유발 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물 등에 관한 것이다.
본 발명은 시클로피록스의 HBV 저해능을 신규하게 규명함으로써, 기존 사용되는 약물들의 단독 요법으로는 cccDNA의 제거를 할 수 없다는 문제점을 극복하였을 뿐만 아니라, 바이러스의 생활사 중 코어조립을 막아 HBV를 효과적으로 제거할 수 있는 치료제를 제공할 수 있다. 나아가, 이를 통해 사회적으로 만성 B형 간염, 간경변증 및 간세포암종과 같은 질병의 발생을 감소시킬 수 있다.

Description

시클로피록스(Ciclopirox)의 HBV 코어조립 저해 용도 {Use of ciclopirox to inhibit HBV core assembly}

본 발명은 시클로피록스의 새로운 약물 효과에 대해 규명한 것으로, 구체적으로 시클로피록스(ciclopirox) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는, 항-HBV(Hepatitis B Virus) 조성물; 시클로피록스 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는, HBV 바이러스 유발 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물; 상기 약학 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, HBV 바이러스 유발 질환의 치료 방법; 및 시클로피록스 또는 이의 생리학적으로 허용가능한 염을 포함하는, HBV 바이러스 유발 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물 등에 관한 것이다.

B형 간염 바이러스(Hepatitis B Virus, HBV) 감염은 전세계적으로 발생 빈도가 높을 뿐만 아니라 6-10% 정도는 간경화나 간세포암과 같은 만성 간질환으로 진행될 가능성이 높기 때문에 매우 중요한 보건 문제이다. 국내 간세포암 발생률은 인구 10만명당 22.2명(남자 36.0명, 여자 10.2명)이며, 간세포함으로 인한 사망률은 인구 10만명당 15.4명(남자 25.8명, 여자 6.6명)이다(질병관리본부).

이러한 질병을 유발하는 HBV를 억제하기 위한 초기 인터페론(Interferon, IFN) 치료에서는, 면역 반응을 증가시켜 세포독성 T 림포구를 활성화하여 HBV를 치료하였다. 짧은 유병기간이거나 높은 혈청 아미노전이효소치, 낮은 B형 간염바이러스 DNA를 갖는 경우 높은 반응률을 보였다. 또한, 공유결합으로 닫힌 원형 DNA(covalently closed circular DNA, cccDNA)의 전사 억제를 통해 HBV 복제를 억제할 수 있으며, NK 세포 활성화를 조절할 수 있는 장점이 있다. 그러나, 발열, 오한, 전신무력감, 우울증, 울혈성 심부전, 호중구감소증 등의 심각한 부작용이 발생하는 문제가 있다.

인터페론의 단점을 보완하는 AIDS 치료제로 개발된 라미부딘 (lamivudine, 3-TC)이 HBV 치료에 효과적인 것으로 밝혀졌다. 그러나 라미부딘은 만성 B형 간염의 치료에 효과적인 약제임에도, 장기간 사용할 경우 라미부딘 내성 HBV가 출현하는 문제가 있다.

최근 10여 년 간 B형 간염의 치료에 있어 높은 항바이러스 (highly-potent) 효과를 보이며 내성이 희박하게 발생하는 엔테카비어(entecavir, ETV)나 테노포비어(tenofovir, TDF)가 사용되고 있다. 이러한 바이러스의 역전사 과정을 차단하는 경구용 항바이러스 약제는 적은 부작용과 함께 향상된 치료 성적을 보였다. 하지만, 이들 약제는 뉴클레오티드 유사체(nucleotide analogues)로서 바이러스의 복제 과정을 억제하나, 바이러스를 완전히 제거할 수 없고 핵 내에 cccDNA를 제거하지 못하기 때문에, 이를 이용한 장기적인 치료가 불가능하다. 따라서 HBV를 완전히 제거할 수 있는 새로운 치료제가 필요한 상황이다.

한편, HBV는 Double-stranded DNA 바이러스이며, 감염시 RNA 중합효소가 DNA 주형으로부터 중합효소, 피막 단백질, Coat 단백질, HBx 단백질을 생성한다. 한 세포의 감염에 의해 200~300개의 새로운 B형 간염바이러스가 게놈에 의해 생성되며, 이를 바탕으로 다량의 바이러스가 생성 및 방출 된다. HBx는 대표적인 병원성 단백질로 알려져 있으며, 직접 DNA에 결합하지는 않지만 전사활성화인자(transactivator)의 역할뿐 아니라 면역반응과 연관된 단백질과의 상호작용 및 세포 내 다양한 신호전달에 대한 영향을 주는 것으로 알려져 있다.

시클로피록스는 hydroxypyridinone 항진균제로 알려져 지루성피부염(seborrhoeic dermatitis) 치료제로 연구되고 있으나, 이의 HBV 치료 효과에 대해서는 전혀 알려진 바가 없다.

이러한 배경하에서, 본 발명자들은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 예의 노력한 결과, 시클로피록스의 HBV 저해능을 신규하게 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은, 시클로피록스(ciclopirox) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는, 항-HBV(Hepatitis B Virus) 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은, 시클로피록스 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는, HBV 바이러스 유발 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은, 상기 약학 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, HBV 바이러스 유발 질환의 치료 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은, 시클로피록스 또는 이의 생리학적으로 허용가능한 염을 포함하는, HBV 바이러스 유발 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공하는 것이다.

이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는 시클로피록스(ciclopirox) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는, 항-HBV(Hepatitis B Virus) 조성물을 제공한다.

상기 시클로피록스는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물로, 항진균제로 알려져 지루성피부염(seborrhoeic dermatitis) 치료제로 연구되고 있으나, 이의 HBV 치료 효과에 대해서는 전혀 알려진 바가 없다.

[화학식 1]

본 발명에서는 시클로피록스가 HBV 생활사 과정 중 코어조립 과정을 특이적으로 저해하는 것을 신규하게 확인하였다. 구체적으로, 본 발명자들은 기존에 사용 중인 엔테카비르, 테노포비어 등의 약물이 HBV 바이러스의 cccDNA를 제거하지 못하는 단점을 해결하고자 노력한 결과, 시클로피록스가 cccDNA를 효과적으로 제거하고 HBV 코어조립을 저해할 수 있음을 새롭게 확인하였다.

구체적으로, 정제된 HBV 코어단백질의 조립환경에서 시클로피록스가 코어단백질의 조립을 저해함을 확인하였고, 코어나 HBV DNA전체를 과발현하는 세포 내에서도 시클로피록스가 이의 조립을 저해함을 확인하였다. 또한 수크로즈 농도구배에 따라 정제된 코어단백질을 형태에 따라 분리하였을 때, 시클로피록스에 의해 조립된 코어가 감소하고 이형체 형태의 코어가 증가한 것을 확인하였다(도 2).

더욱 구체적으로, 시클로피록스와 결합하는 HBV 코어단백질의 구조를 분석한 결과, 시클로피록스가 코어단백질과 결합하고 있음을 확인하였고, 특히 티로신 118 자리가 결합에 중요함을 입증하였다(도 3). 또한, 이로부터 시클로피록스가 직접적으로 HBV 코어 단백질에 결합하여 코어 조립을 저해하는 것임을 확인하였다.

본 발명의 시클로피록스는 HBV 가 발현되고 있는 세포주과 임의적으로 HBV를 발현시킨 세포주에서, 약물을 처리하는 농도 구배에 따라 세포생존에 영향 없이 HBV를 감소시키는 것을 보여준다(도 5). 또한, HBV가 발현되는 세포주에 시클로피록스 처리시 약물 농도구배에 따라 밖으로 배출되는 DNA뿐만 아니라 내부에 있는 DNA도 감소시킴을 확인하였다(도 6).

상기 시클로피록스는 HBV 코어단백질의 조립을 저해할 수 있으며, 보다 구체적으로 코어조립단계에 필수적인 티로신 잔기(티로신 118)와, 트립토판 잔기(트립토판 102)에 결합함으로써 코어조립을 저해하는 것일 수 있다.

본 발명에서 사용된 "항-HBV"이란, HBV 바이러스에 의한 세포변성 효과를 특이적으로 저해함으로써, HBV 바이러스의 증식을 특이적으로 억제하는 작용을 의미한다.

본 발명에서 HBV (hepatitis B virus), 즉 B형간염바이러스는 B형 간염(hepatitis B)을 일으키는 DNA 바이러스로, HBs로 불리기도 한다. B형 간염 바이러스는 중심주 core에 DNA, DNA polymerase, HBc 항원, HBe 항원을 포함한다.

상기 항-HBV 조성물은 엔테카비어(entecavir), 테노포비어(tenofovir) 또는 이들의 조합을 추가로 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 시클로피록스는 엔테카비어 또는 테노포비어와 처리시 단독 처리에 비한 상승 효과를 나타내었으며, 시클로피록스 약물 농도구배에 따라 밖으로 배출되는 DNA뿐만 아니라 내부에 있는 DNA도 감소시킴을 확인하였다(도 7).

본 발명의 다른 하나의 양태는, 시클로피록스 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는, HBV 바이러스 유발 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 하나의 양태는, 상기 약학 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, HBV 바이러스 유발 질환의 치료 방법을 제공한다.

상기 시클로피록스, 약학적으로 허용가능한 염, HBV 바이러스에 대해서는 상기 설명한 바와 같다.

본 발명에서 HBV 바이러스 유발 질환이란 HBV 감염으로 인해 생체 내에 발생할 수 있는 질환을 의미하며, 예시적으로 간염, 간경변증 및 간세포암종 또는 이들의 조합일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 약학 조성물은 엔테카비어, 테오포비어 또는 이들의 조합을 추가로 포함하는 것일 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 '예방'은, 본 발명의 조성물의 투여로 HBV 바이러스 감염 질환을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 또한, 본 발명에서 사용되는 용어 '치료'는, 상기 조성물의 투여로 HBV 바이러스 유발 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 사용된 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 개체에 본 발명의 약학적 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 '개체'란 HBV 바이러스 감염 질환이 이미 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 모든 동물을 의미하고, 본 발명의 조성물을 개체에게 투여함으로써, 상기 질환을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있다.

본 발명의 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서 사용된 용어 '약학적으로 유효한 양'은 의학적 치료에 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 바이러스 감염 질환의 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 상기 기재한 유효성분 이외에 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용할 수 있다. 상세하게는, 제형화할 경우 통상 사용하는 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제로는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 첨가하여 조제될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제를 포함한다. 비수성 용제 및 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 일반적으로 1일에 50 ㎎/kg, 바람직하게는 20~100 ㎎/kg의 양이 투여되도록 하며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정시간 간격으로 1일 수회, 바람직하게 1회 내지는 4회 분할 투여할 수 있으며, 이는 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

본 발명의 다른 하나의 양태는, 시클로피록스 또는 이의 생리학적으로 허용가능한 염을 포함하는, HBV 바이러스 유발 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

상기 시클로피록스, 염, HBV 바이러스에 대해서는 상기 설명한 바와 같다.

시클로피록스 또는 이의 생리학적으로 허용가능한 염을 HBV 바이러스 감염의 예방 또는 개선을 목적으로 건강기능식품 조성물에 첨가될 수 있다. 상기 성분을 건강기능식품 첨가물로 사용할 경우, 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, "개선"은 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미할 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어 "건강기능식품"이란 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환 등의 형태로 제조 및 가공한 식품을 말한다. 여기서 기능성이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 건강기능성 식품은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조 시에는 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어날 수 있다.

본 발명의 조성물을 건강기능식품에 포함하여 사용할 경우, 상기 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 건강기능식품 또는 건강기능식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합양은 사용 목적 (예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품의 제조 시에 본 발명의 조성물은 원료 조성물 중 1 ~ 10 중량%, 구체적으로 5 ~ 10 중량%의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하로도 사용될 수 있다.

상기 건강기능식품 조성물은 엔테카비어, 테오포비어 또는 이들의 조합을 추가로 포함하는 것일 수 있다.

본 발명은 안정성이 보장된 약물인 시클로피록스의 HBV 저해능을 신규하게 규명함으로써, 기존 사용되는 약물들의 단독 요법으로는 cccDNA의 제거를 할 수 없다는 문제점을 극복하였을 뿐만 아니라, 바이러스의 생활사 중 코어조립을 막아 HBV를 효과적으로 제거할 수 있는 치료제를 제공할 수 있다. 나아가, 이를 통해 사회적으로 만성 B형 간염, 간경변증 및 간세포암종과 같은 질병의 발생을 감소시킬 수 있다.

도 1은 시클로피록스의 HBV 저해능을 규명하는 과정을 나타내는 도면으로, 도 1의 A는 약 1000개의 약물에서 HBV 저해능을 가진 약물을 스크리닝하기 위한 개략도; 도 1의 B는 첫 번째 스크리닝을 통해 선택된 19개의 약물의 HBV 저해능을 보여주는 그래프; 도 1의 C는 상기 19개의 약물의 HBV 전사물 발현양을 보여주는 그래프; 및 도 1의 D는 상기 19개의 약물의 코어 및 캡시드 단백질 발현 저해능을 보여주는 그래프이다. 결과값은 평균±표준편차로 나타내었고, 스튜던트 t 테스트를 통해 *는 p<0.05, **는 p<0.01의 신뢰값을 갖는다.
도 2는 시클로피록스의 코어 조립 저해능을 보여주는 도면으로, 도 2의 A는 시클로피록스의 코어조립 저해능을 보여주는 면역블롯팅 이미지; 도 2의 C와 D는 간세포주에서 코어단백질을 발현시키고 시클로피록스를 처리한 경우 시클로피록스의 코어조립 저해능을 나타낸다. 구체적으로, SDS Page를 통하여 환원된 코어 단백질의 양은 변화가 없으나, 조립된 코어단백질을 탐침하는 native 젤에서는 조립된 코어단백질이 크게 감소한 것을 나타낸다. 도 2의 B는 도 2의 A와 같은 방법으로 정제된 코어단백질을 이용해 수크로즈 농도구배로 코어조립이 감소함을 나타낸다.
구체적으로, 도2의 B는 코어조립 후 수크로즈 농도구배에 따른 코어 단백질의 위치가 달라지는 점을 이용하여 10%에서 50% 수크로즈 농도구배를 만들고, 조립반응과 더불어 약물 처리한 코어단백질을 초원심분리로 분리하였을 때 조립된 코어단백질이 감소와 더불어 조립되지 않은 이합체 형태의 단백질의 양이 크게 증가한 것을 나타낸다. 도 2의 C는 HBV의 코어 단백질을, 도 2의 D는 HBV의 전체 단백질을 발현시킨 경우 시클로피록스에 의한 코어조립 저해능을 나타낸다. 이 역시 개개의 코어단백질의 양은 변화가 없으나, 시클로피록스에 의해 조립된 코어가 크게 감소한 것을 나타낸다. 도 2의 E는 전자현미경 관찰 결과로, 조립된 코어 크기가 시클로피록스에 의해 커지고 원형이 파괴됨을 보여준다. 요컨대, 도 2는 시클로피록스가 HBV 코어단백질의 조합을 저해함으로써 HBV 저해능을 보임을 나타낸다.
도 3은 HBV 코어 단백질에 시클로피록스가 결합하는 위치에 대한 분석 결과를 나타낸다. 구체적으로, 도 3의 A는 비대칭 단위의 육각형의 전체적인 구조를 보여준다. 단백질의 2차 구조는 STRIDE를 사용하여 계산하였으며, 이는 시클로피록스가 공간 채우기 모델로 표시되어 코어단백질과 결합하는 것을 보여준다. 도 3의 B와 C는 시클로피록스과 HBV 코어 단백질이 결합하는 자리들을 나타내며, 특히 티로신(Y) 118 자리의 수소 결합이 중요함을 나타낸다. 도 3의 D는 Y118자리의 돌연변이를 통하여 실제로 시클로피록스에 의한 코어조립 저해가 감소됨을 나타낸다. 도 3의 E와 F는 사슬 B와 C의 시클로피록스 결합 위치와 비 존재 위치의 비교함을 나타낸다.
도 4는 HBV를 발현하는 세포주와, HBV를 과발현시킨 세포주에서 각각 밖으로 배출되는 HbsAg 단백질의 양을 정량한 결과를 나타낸 것이다. 구체적으로, 도 4의 A 및 B는 시클로피록스 처리시 밖으로 배출되는 HBsAg의 양의 변화에 대해 효소 결합 면역 침강 분석법을 나타낸다. 그 결과, 시클로피록스 농도구배에 따른 HBsAg는 유의미하게 변하지 않은 것을 확인하였다. 결과값은 평균±표준편차로 나타내었고, 스튜던트 t 테스트를 통해 *는 p<0.05, **는 p<0.01의 신뢰값을 갖는다.
도 5은 시클로피록스의 농도구배에 따른 HBV 저해능을 확인한 결과를 보여주는 도면으로, 각각 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2, 5, 10 mM 로 7개의 농도를 이용해서 확인하였다.
구체적으로, 도 5의 A 및 B는 HBV 저해능을 규명했던 스크리닝 방법과 동일하게, 6일 동안 시클로피록스를 처리한 후 HepG2.2.15와 HBV를 발현시킨 간세포에서 각각 농도구배별 HBV DNA 감소량을 확인한 결과를 나타낸다. 도 5의 C 및 D는 밖으로 배출되는 DNA가 아닌 세포 내에 있는 HBV DNA를 추출하여 시클로피록스 저해능을 확인한 결과를 나타낸다. 구체적으로, HepG2.2.15와 HBV 발현시킨 간세포를 각각 용해한 후 micrococcal nuclease를 이용하여 캡시드화된 RNA를 제거하고, 바이러스 DNA를 추출하여 그 발현양을 확인하였다. 그 결과, 시클로피록스의 농도구배에 따라 HBV DNA가 감소함을 확인하였다.
도 6은 HBV 감염시스템을 구축하여 HBV를 감염시킨 후 처리한 시클로피록스의 HBV 저해능을 나타낸다. 도 6의 A는 HBV 감염시스템에 대한 흐름을 나타낸다. 구체적으로, HBV가 감염되는데 필수적인 수용체(NTCP)를 발현하는 HepG2, Huh7 세포주에 6시간 동안 시클로피록스를 처리 후, HepG2.2.15의 상층액을 이용하여 바이러스 감염과 더불어 다시 시클로피록스를 처리한다. 16시간 후 바이러스를 세척하고, 14일 동안 매일 시클로피록스를 처리한 후 세포와 세포상층액을 모아 분석한다. 도 6의 B와 C는 HBV를 감염 가능하게 하는 NTCP 세포주의 NTCP 발현을 면역블롯 방법과 유세포 분석기를 이용하여 입증한 결과를 나타낸다. 도 6의 D 내지 F는 바이러스 감염 시스템에서 시클로피록스의 HBV 저해능을 나타낸다. 구체적으로, 도 6의 D는 두 세포주에서 밖으로 배출되는 HBV DNA가 시클로피록스 농도에 따라 유의미하게 감소되는 것을 나타낸다. 도 6의 E는 세포 내에 존재하는 rcDNA가 제거된 cccDNA를 추출하여 발현양을 확인한 결과, 두 세포주에서 시클로피록스의 농도에 따라 그 발현양이 유의미하게 감소시키는 것을 나타낸다. 도 6의 F는 세포 내에 존재하는 rcDNA 발현양을 확인한 결과, 두 세포주에서 시클로피록스의 농도에 따라 그 발현양이 유의미하게 감소시키는 것을 나타낸다.
도 7은 시클로피록스의 병용 치료의 가능성을 보여주는 것으로, 엔테카비어(ETV), 테노포비어(TDF)와 함께 처리된 시클로피록스가 HBV 저해능에 상승효과를 보이는 것을 나타낸다. 시클로피록스 농도 구배에 따라 처리한 후 ETV와 TDF를 1 mM을 병용 처리하였다.
구체적으로, 도 7의 A는 6일 동안 조건에 맞게 약물을 처리한후 밖으로 배출된 HBV DNA를 정량하였다. 그 결과, 로그범위 내로 시클로피록스를 단독처리 했을 때보다 ETV와 TDF를 병용 처리하였을 때 HBV DNA가 크게 감소한 것을 나타낸다. 도 7의 B는 같은 조건에서 세포 내에 존재하는 HBV DNA를 추출하여 정량한 결과를 나타내는 것으로, 로그범위 내로 시클로피록스를 단독처리 했을 때보다 ETV와 TDF를 병용 처리하였을 때 HBV DNA가 크게 감소한 것을 나타낸다. 도 7의 C는 밖으로 배출되는 HBsAg 단백질의 양을 측정한 결과로, 시클로피록스를 단독 처리했을 때나, ETV와 TDF를 병용 처리하였을 때에 HBsAg 저해능이 없음을 나타낸다.
도 8은 시클로피록스를 HBV를 발현하는 마우스에 주입했을 때 HBV 저해능을 나타낸다. 도 8의 A는 마우스에서 HBV를 발현하고 5일 동안 매일 시클로피록스, TDF 또는 시클로피록스와 TDF 병용 처리하는 과정을 나타낸다. 구체적으로, HBV를 발현하는 pAAV HBV 1.2x 플라스미드를 마우스 꼬리에 Hydrodynamic 주입법으로 삽입하여 마우스에서 HBV를 발현시키고, 5일 동안 매일 약물을 처리한다. 도 8의 B는 약물 처리 후 간세포에서 HBV 코어단백질과 표면 단백질의 발현양을 확인하였을 때, 시클로피록스에 의해 HBV 코어단백질의 양이 감소하고, TDF와 병용 처리하였을 때 더욱 효과적으로 감소한 것을 나타낸다. 도 8의 C는 약물 처리 후 채취한 혈액으로부터 혈액 속에 포함된 HBV DNA를 정량한 결과, 시클로피록스에 의하여 HBV DNA가 감소하고 TDF와 병용 처리하였을 때 더욱 효과적으로 감소한 것을 나타낸다. 도 8의 D는 약물처리 후 채취한 혈액으로부터 혈액 속에 포함된 HBsAg 단백질의 양을 정량한 결과를나타낸다.
도 9는 시클로피록스에 의한 세포생존을 확인하기 위한 MTS 결과를 나타낸다. 그 결과, HBV를 발현하는 세포주 HepG2.2.15와 HBV를 발현시킨 간세포주에서 시클로피록스 처리에 의한 세포생존에는 영향이 없음을 보여준다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실험예 1. 세포 배양 방법

HegG2, HepG2.2.15, Huh7, NTCP 과발현 HepG2, Huh7 세포는 10% FBS(Fetal Bovine Serum)을 포함하는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)과 1% 항생제를 첨가한 37℃의 배지에서 배양하였다.

실험예 2. 플라스미드의 제조 방법

pUC19에 HBV1.2×adr 아형 ORF(Open Reading Frame) 제조하였고, pCDNA3에 Myc 표지-CP149 ORF(Open Reading Frame) 제조하였다. 마우스 hydrodynamic 주입을 위한 pAAV에 HBV1.2×adr 아형 ORF(Open Reading Frame)를 제조하였다.

실험예 3. 밖으로 배출된 바이러스 정량 방법

세포에 시클로피록스(ciclopirox), 엔테카비어(entecavir) 및/또는 테노포비어(tenofovir) 등의 약물을 처리한 후 세포의 상층액을 모았다. 상기 상층액 30ul에 같은 용량으로 1X PBS를 더해주었고, 6ul의 1N NaOH를 첨가한 후 37℃에서 1시간 반응 후 6ul Tris-HCl/HCl를 추가하였다. 그 후 98℃에서 5분간 열처리하여 단백질을 변성시켰다. 이를 원심분리하여 변성된 단백질을 제거하고, 상층액에 존재하는 바이러스를 실시간 PCR를 통하여 정량하였다.

실험예 4. 내부에 존재하는 바이러스 정량 방법

세포에 시클로피록스, 엔테카비어 및/또는 테노포비어 등의 약물을 처리한 후 세포를 1X PBS를 이용해 세척하였다. 그 후 세포를 용해시킨 후 뉴클레아제(nuclease)를 처리한 뒤 세포에서 HBV DNA를 추출하였다. 이는, 제조업자(Invivogen)의 설명서에 따라 DNA을 추출하였다.

실험예 5. HBsAg 단백질의 분석 방법

분비된 HBV의 HBsAg 단백질은 효소 결합 면역 침강 분석법을 이용하여 분석하였다. 구체적으로, HBsAg 특이 ELISA를 이용하였다. 각각의 약물을 처리한 세포에서 상층액을 모아 키트(Hepatitis B surface antigen ab ELISA kit)를 이용하여 분석하였고, 이는 제조업자(abnova)의 설명서에 따라 분석하였다.

실험예 6. HBV 캡시드 단백질의 검출 방법

HBV 캡시드 단백질은 아가로스 젤 전기영동을 이용하여 검출하였다. 구체적으로, 분리된 Cp149 이량체 단백질을 코어조립 반응버퍼 150mM NaCl, 15mM HEPES와 함께 약물을 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 후 아가로즈 젤을 이용하여 단백질을 분리하였고, 래빗 폴리클로날 항-HBV 코어 항체(Rabbit polyclonal antiHBV core antibody)를 이용하여 면역블롯을 수행하였다. 또한, 세포에서 발현되는 코어를 분리하기 위하여, 1% NP-40로 세포를 용해하였고 초원심분리(55000rpm)를 20℃에서 8시간 동안 진행한 후, 바닥에 가라앉은 조립된 코어를 아가로즈 젤을 이용하여 분리한 뒤 래빗 폴리클로날 항-HBV 코어 항체를 이용하여 면역 블롯을 수행하였다.

실시예 1. 시클로피록스(ciclopirox)의 HBV 저해 활성 확인

HBV에 대하여 저해 활성을 갖는 약물을 스크리닝하기 위하여, 안정성이 보장된 FDA 승인된 약물 라이브러리를 이용하였다.

구체적으로, HBV를 생산하는 HepG2.2.15 세포주에 약 1000개의 약물을 3일동안 1 mM로 매일 처리한 후 밖으로 배출되는 HBV DNA 양을 측정함으로써 첫번째 스크리닝을 하고, 여기서 선택된 19개의 약물을 6일 동안 처리한 후 전술한 바와 같은 방법으로 HBV DNA를 측정하는 두번째 스크리닝을 통해 13개의 약물을 선택하였다. 이때, 양성대조군으로 HBV 약물로 사용되는 엔테카비어를 이용하였다.

그 결과, 도 1의 A 및 B에서 볼 수 있듯이, 엔테카비어보다 효과적으로 HBV DNA의 배출을 저해하는 19개의 약물을 선발하였고, 그 중 13개의 약물(#1, #3, #4, #5, #6, #7, #10, #11, #12, #13, #16, #17, #18, #19)이 6일의 긴 기간 동안 지속적으로 효과를 보임을 확인하였다.

또한, 도 1의 C에서 볼 수 있듯이, 상기 19개의 약물 중에서도 4개의 약물(#6, #12, #16, #19)이 HBV의 전사체 발현을 감소시킴을 확인하였다.

한편, 도 1의 D에서 볼 수 있듯이, 상기 19개의 약물 중에서 특히 1개의 약물(#7)이 코어 단백질 발현에는 영향을 미치지 않지만 캡시드 단백질의 발현을 현저히 억제함을 확인하였고, 이는 시클로피록스임을 확인하였다.

상기 결과를 통해, 시클로피록스는 HBV 생활사 과정 중, RNA 단계에서 일어나는 HBV의 전사체에는 영향을 미치지 않아 코어 단백질 발현에는 영향을 미치지 않지만, 그 이후 과정인 캡시드 단백질의 조립을 저해함으로써 최종적으로 배출되는 바이러스 DNA를 감소시켜 항-HBV 효과를 나타내는 약물로 사용될 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 2. 시클로피록스의 HBV 저해 활성 메커니즘 규명

상기 실시예 1을 통해 시클로피록스는 HBV 저해 활성을 가짐을 확인한바, 이의 저해 메커니즘을 규명하고자 하였다. 즉, 코어 단백질 발현에는 영향을 미치지 않으나, 캡시드 단백질의 발현을 현저히 억제함을 확인하였는바, 시클로피록스는 코어 조립을 저해하는 것으로 해석하였고, 이를 검증하고자 하였다.

구체적으로, 정제된 코어단백질149(CP149) 이형체, 코어 단백질 과발현 세포주, HBV의 전체 단백질 과발현 세포주 등에 시클로피록스를 처리한 후 코어의 조립 반응을 분석하였다. 그 결과, 도 2의 A 내지 C에서 볼 수 있듯이, 시클로피록스의 농도가 증가할수록 정제된 코어단백질149(CP149) 이형체의 조립이 저해되며, 각 세포주에서도 농도 구배에 따라 코어 조립이 저해됨을 확인하였다.

또한, 실제로 코어조립이 저해되고 이형체로 남아있는지 여부를 확인하기 위하여 상기 CP149를 조립반응 조건에서 조립한 후, 초원심분리를 통해 수크로즈 농도별로 반응물을 분리하였다. 그 결과, 도 2의 D에서 볼 수 있듯이, 시클로피록스를 처리하지 않았을 때는 이형체 CP149가 감소하고(분획번호 1-3), 코어조립된 CP149가 증가하는 경향을 나타내었으나(분획번호 5-8), 시클로피록스를 처리하는 경우에는 이형체 CP149가 증가하고 코어조립된 CP149가 감소하는 반대의 경향을 나타냄을 확인하였다.

나아가, 도 4의 A 및 B에서 볼 수 있듯이, HBV를 발현하는 세포주와 HBV를 과발현시킨 세포주 모두에서, 발현되어 배출되는 HBsAg 단백질 양에는 영향이 없음을 확인하였다.

상기 결과를 통해, 시클로피록스는 HBV의 코어 단백질 발현에는 영향을 미치지 않으면서 코어 조립만을 저해하며, 현재 상기 코어 조립 단계의 저해는 현재 바이러스 저해제의 타겟으로 이용되고 있는바, 시클로피록스는 항-HBV 효과를 나타내는 약물로서 사용될 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 3. 시클로피록스의 HBV 코어 단백질 결합 자리 규명

상기 실시예 2를 통해, 시클로피록스가 HBV 코어조립을 저해함으로써 생체 외 HBV 증식 억제 효과를 나타냄을 확인한바, HBV 코어단백질에서의 시클로피록스 결합 위치를 확인하였다. 구체적으로, 이를 확인하기 위하여 코어단백질의 크리스탈을 생성하였고, 시클로피록스와의 구조 분석을 진행하였다.

그 결과, 도 3에서 볼 수 있듯이, 헥사머 형태의 조립된 HBV 코어 단백질에의 시클로피록스의 결합 자리를 확인하였으며, 특히 티로신 118 자리가 약물과 코어 단백질간의 수소결합에 중요함을 돌연변이를 통하여 확인하였다(도 3의 D). 상기 결과를 통해, 시클로피록스가 직접적으로 HBV 코어 단백질에 결합하여 코어 조립을 저해함으로써 HBV 저해능을 가짐을 입증하였다.

실시예 4. 시클로피록스의 HBV 증식 억제 효과 확인

상기 실시예 1 및 3를 통해, 시클로피록스는 HBV의 코어 조립을 저해함을 확인하였는바, HBV의 증식도 실제로 억제할 수 있는지 확인하고자 하였다.

먼저, 도 5의 A 내지 D에서 볼 수 있듯이, HBV를 발현하는 세포주와 HBV를 과발현시킨 세포주 모두에서, 시클로피록스의 농도가 증가함에 따라 밖으로 배출되거나 세포 안에 남아있는 HBV DNA의 양이 감소됨을 확인하였다.

나아가, HBV에 감염된 간암세포주 NTCP-HepG2, NTCP-Huh7에 시클로피록스 를 처리하여 HBV 증식 정도를 분석하였다. 간암세포주에 시클로피록스를 6시간 미리 처리한 후 다시 시클로피록스와 함께 HBV를 16시간 동안 배양하였다. 그 후, 14일 동안 배양한 후 세포를 분석하였다. 이와 같은 실험의 개략도는 도 6의 A에 나타내었다. 도 B와 C에서 간암세포주 NTCP-HepG2, NTCP-Huh7에서 발현하는 NTCP 단백질을 면역블롯과 유세포분석기를 통하여 입증하였다.

그 결과, 도 6의 D내지 F에서 볼 수 있듯이, 시클로피록스 처리 시 농도구배에 따라 밖으로 배출되는 HBV DNA가 감소하고, 세포 내부에 존재하는 HBV cccDNA와 rcDNA가 감소함을 확인하였다(도 6).

상기 결과를 통해, 시클로피록스는 HBV 증식을 효과적으로 억제할 수 있으며, HBV DNA 뿐만 아니라, 현재 사용되는 약물의 가장 큰 문제점인 cccDNA의 감소 측면에서도 효과를 보임을 알 수 있었다. 따라서, 시클로피록스가 앞으로의 HBV 치료를 위한 HBV 저해제로서의 사용될 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 5. 시클로피록스의 엔테카비어 및/또는 테노포비어와의 시너지 효과 확인

상기 실시예 1 내지 4를 통해, 시클로피록스는 HBV의 코어 조립을 저해하여 이의 증식을 저해할 수 있음을 확인하였는바, 기존의 항-HBV 약물인 엔테카비어(ETV) 또는 테노포비어(TDF)와 병용시 시너지 효과를 나타내는지 확인하고자 하였다.

한편, 엔테카비어(ETV)와 테노포비어(TDF)는 HBV를 저해하는 약물로 현재 사용되고 있으나, HBV의 cccDNA를 제거하지 못하는 단점을 가지고 있었다. 이를 보완하기 위하여 상황에 따라 인터페론 계열 약물과 병용되어 사용되고 있다. 따라서, 시클로피록스도 종래의 약물인 엔테카비어 또는 테노포비어와 병용되어 사용될 경우 효과를 나타낼 수 있는지 확인하기 위하여, 이들의 시너지 효과를 확인하였다.

구체적으로, 간암세포주에 시클로피록스 단독; 시클로피록스 및 엔타카비어; 또는 시클로피록스 및 테노포비어를 상기 실시예 3에 따른 방법으로 처리한 후 HBV의 증식능을 확인하였다. 그 결과, 도 7의 A 및 B에서 볼 수 있듯이, 시클로피록스와 엔테카비어 또는 테노포비어를 동시에 처리하는 경우에는, 시클로피록스 단독을 처리하는 것보다 세포 밖으로 배출되는 HBV DNA 및 세포 내부에 남아있는 HBV DNA의 양을 현저하게 감소됨을 확인하였다. 반면, HBsAg 단백질 양은 별다른 변화가 없음을 확인하였다(도 6의 C).

상기 결과를 통해, 시클로피록스 단독으로도 HBV 증식을 효과적으로 억제할 수 있으나, 엔테카비어 또는 테노포비어와 병용하여 사용하는 경우에는 더 우수한 항-HBV 효과를 나타낼 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 6. 생체 내 시클로피록스의 HBV 증식 억제 효과 확인

상기 실시예 1 내지 5를 통해, 시클로피록스가 우수한 HBV 증식 억제 효과를 나타냄을 확인한바, 생체 내에서도 동일한 효과를 나타내는지 확인하고자 하였다.

구체적으로, 마우스에 HBV를 발현하는 플라스미드를 꼬리에 하이드로다이나믹(Hydrodynamic) 방법을 이용하여 주입함으로써 생체 내에서 HBV를 생성하도록 하였다. 이후, 5일 동안 매일 시클로피록스 단독, 테노포비어 단독, 또는 시클로피록스 및 테노포비어 병용을 처리한 후 마우스 혈청에 존재하는 HBV의 증식 정도를 확인하였다. 이와 같은 실험의 개략도는 도 8의 A에 나타내었다.

그 결과, 도 8의 B에서 볼 수 있듯이, 간세포에서 HBV 코어단백질이 감소한 것을 확인하였다. 또한, 도 8의 C로부터 시클로피록스 단독은 마우스 생체 내 존재하는 HBV DNA의 양을 현저하게 감소시키며, 처리 5일째에는 HBV DNA가 거의 존재하지 않음을 확인하였다. 특히, 시클로피록스와 테노포비어를 동시에 처리하는 경우에도 HBV DNA 저해 억제 효능이 우수하며, 시클로피록스 단독 처리보다 근소하게 우수한 효과를 나타냄을 확인하였다. 반면, HBsAg 단백질 양은 별다른 변화가 없음을 확인하였다(도 8의 D).

상기 결과를 통해, 시클로피록스는 생체 내 존재하는 HBV 증식을 효과적으로 억제할 수 있으므로, 항-HBV 효과를 나타내는 약물로 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 7. 시클로피록스의 세포 독성 확인

상기 실시예 1 내지 6를 통해, 시클로피록스가 생체 내외에서 우수한 HBV 증식 억제 효과를 나타냄을 확인한바, 실제로 HBV 저해 약물로서 개발이 가능한지 확인하고자 이의 세포 독성을 분석하였다.

그 결과, 도 9에서 볼 수 있듯이, HBV를 발현하는 세포주 및 HBV를 과발현하는 세포주 모두에서 시클로피록스에 의한 세포 생존율 감소는 영향은 나타나지 않음을 확인하였다. 또한, 가장 높은 농도인 10 uM에서도 세포의 생존이 유지됨을 확인하였다.

상기 결과를 통해, 시클로피록스는 세포의 생존에는 영향을 미치지 않으므로 인체에 안전하게 사용될 수 있으며, 항-HBV 효과를 나타내는 약물로서 매우 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (10)

1. 시클로피록스(ciclopirox) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는, 항-HBV(Hepatitis B Virus) 조성물.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 시클로피록스는 하기 화학식 1로 표시되는 것인, 항-HBV 조성물.
   [화학식 1]
   

   
3. 제1항에 있어서, 상기 시클로피록스는 HBV 코어단백질의 조립을 저해하는 것인, 항-HBV 조성물.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 항-HBV 조성물은 엔테카비어(entecavir), 테노포비어(tenofovir) 또는 이들의 조합을 추가로 포함하는 것인, 항-HBV 조성물.
   
5. 시클로피록스 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는, HBV 바이러스 유발 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
   
6. 제5항에 있어서, 상기 HBV 바이러스 유발 질환은 간염, 간경변증 및 간세포암종 또는 이들의 조합인 것인, 약학 조성물.
   
7. 제5항에 있어서, 상기 약학 조성물은 엔테카비어, 테오포비어 또는 이들의 조합을 추가로 포함하는 것인, 약학 조성물.
   
8. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항의 약학 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, HBV 바이러스 유발 질환의 치료 방법.
   
9. 시클로피록스 또는 이의 생리학적으로 허용가능한 염을 포함하는, HBV 바이러스 유발 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
   
10. 제9항에 있어서, 상기 건강기능식품 조성물은 엔테카비어, 테오포비어 또는 이들의 조합을 추가로 포함하는 것인, 건강기능식품 조성물.

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