KR101578602B1

KR101578602B1 - B형 간염 바이러스 캡시드 어셈블리 억제능을 갖는 화합물을 포함하는 hbv 감염으로 인한 간질환 예방 또는 치료용 약학 조성물

Info

Publication number: KR101578602B1
Application number: KR1020140042227A
Authority: KR
Inventors: 정구흥; 조민형
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2014-04-09
Filing date: 2014-04-09
Publication date: 2015-12-18
Also published as: KR20150117317A

Abstract

본원은 HBV의 캡시드 어셈블리를 효과적으로 억제 또는 차단하여 HBV로 인한 다양한 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있는 약학 조성물을 개시한다. 본원에 따른 약학 조성물은 단독으로 또는 기존의 항바이러스제와 병용요법으로 HBV 바이러스로 인한 다양한 간질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

B형 간염 바이러스 캡시드 어셈블리 억제능을 갖는 화합물을 포함하는 HBV 감염으로 인한 간질환 예방 또는 치료용 약학 조성물 {Pharmaceutical composition comprising compound having inhibitory activity against capsid assembly of Hepatitis B Virus for treating or preventing liver disease due to HBV infection}

본원은 B형 간염바이러스로 인한 질환 치료제 분야이다.

B형 간염 바이러스 (Hepatitis B Virus, HBV)는 간세포를 감염하여 만성 간염을 일으키는 바이러스로, 전 세계적으로 약 3억 5천만명이 HBV에 감염 된 것으로 추정되며, 이 중 5 내지 10 %는 평생 만성 B형 간염으로 고생하는데, 만성간염은 간경변, 간부전을 거쳐, 간세포암 (Hepatocellular Carcinoma, HCC)으로 발전된다(Ahn et al., 2005. J. Hepatol 42(2): 188-94; Montalto, G. et al. 2002. Ann NY Acad Sci 963: 13-20).

특히 간세포암은 우리나라에서 4번째로 발병률이 높은 암이나 (국가암정보센터, 2003년-2005년 분석자료) 간암 특이적 치료법은 답보상태이다. 간암의 주 치료법은 간절제술, 간동맥 화학색전술, 항암 화학요법, 방사선치료, 및 간이식술 등을 들 수 있으나, 효과적인 치료를 위해서는 질환의 원인인 바이러스의 증식을 억제하는 것이 급선무로 이를 기본으로 하는 치료 방법의 개발이 필요하다.

특히 바이러스의 형성과 생존에 있어 캡시드는 필수적이기 때문에 이러한 캡시드의 형성을 차단 또는 억제할 수 있는 물질은 강력한 항 바이러스제로 기능할 수 있으나, 이러한 치료제는 아직까지 존재하지 않는다.

Stray 등은 헤테로아릴디하이드로피리미딘 (HAP) 구체적으로 methyl 4-(2-chloro-4-fluorophenyl)-6-methyl-2-(pyridin-2-yl)-1,4-dihydropyrimidine-5-carboxylate (HAP-1)을 이용한 캡시드 어셈블리 억제제를 개시한다 (Proc Natl Acad Sci U S A. 2005; 102(23): 8138-8143).

미국 특허 제6,544,520호는 HBV 바이러스 억제제에 관한 것으로 코어 항원에 결합하여 HBV의 어셈블리를 억제하는 특정 서열을 갖는 펩타이드를 개시한다.

또한 뉴클레오사이드 유사체와 같은 항바이러스제가 시도되기도 하였으나, 큰 부작용으로 인해 사용되지 못하고 있다.

HBV의 증식의 억제에 초점을 맞춘 안정하고 효과적인 치료제의 개발이 요구된다.

본원은 캡시드 어셈블리 과정을 표적으로 하는 HBV 증식 억제제를 제공하고자 한다.

한 양태에서 본원은 하기 화학식 1의 화합물 는 그 염을 유효성분으로 포함하는 HBV 감염으로 인한 간질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다:

<화학식 1>

상기 화학식 1에서,

A 는 C 또는 N 이고;

R₁및 R₂ 는 각각 수소 또는 할로겐이고,

R₃및 R₄ 는 각각 수소, C₁-C₆의 직쇄 또는 분쇄상 알킬기, -C(=O)R_a, -S(=O)₂R_a 이고, 상기 R_a는 C1-C6의 직쇄 또는 분쇄상 알킬기, 치환 또는 비치환된 아릴기, 치환 또는 비치환된 헤테로 아릴기이다.

본원에 따른 일 구현예에서 상기 화학식 1의 화합물은 하기 화학식 2 또는 화학식 3으로 표시된다:

<화학식 2>

<화학식 3>

상기 화학식 2 또는 3에서,

R'₁, R'₂ , R'₄ 및 R'₅ 는 각각 수소 또는 할로겐이고,

R'₃ 및 R'₆ 는 각각 수소, C₁-C₆의 직쇄 또는 분쇄상 알킬기, -C(=O)R_a, -S(=O)₂R_a 이고, 상기 Ra 는 C₁-C₆의 직쇄 또는 분쇄상 알킬기, 치환 또는 비치환된 아릴기, 치환 또는 비치환된 헤테로 아릴기다.

본원에 따른 일 구현예에서, 상기 화학식 1의 화합물은 후술하는 화학식 4 내지 화학식 16 중 어느 하나의 화합물이며, 특히 상기 화학식 1의 화합물은 화학식 5 (BCM-599), 화학식 6 (BCM-600), 화학식 8 (BCM-602), 화학식 10 (BCM-604) 화학식 12 (BCM-606) 또는 화학식 14 (BCM-608)이다.

본원에 따른 화합물은 HBV 감염으로 인한 간질환 예방 또는 치료용으로 유용하며, 예를 들면 간염, 지방간, 간부전, 간경변, 또는 간암의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다. 본 이론으로 한정하는 것은 아니지만, 본원에 따른 화합물은 HBV 캡시드 어셈블리의 억제 또는 차단에 의해 이러한 효과를 발휘한다.

다른 양태에서 본원은 본원의 화합물 또는 그 염을 포함하는, 캡시드 어셈블리 차단 또는 억제용 약학 조성물을 제공한다. 본원의 약학 조성물은 HBV 감염으로 인한 간염, 지방간, 간부전, 간경변, 또는 간암을 포함하는 간질환의 치료 또는 예방에 효과가 있다.

다른 양태에서 본원의 약학 조성물은 기존의 간질환 치료에 사용되는 HBV 폴리머라제 억제제와 조합으로 사용될 수 있으며, 본원 화합물 대 상기 HBV 폴리머라제 억제제의 비는 이로 제한하는 것은 아니나 약 1:1 내지 40:1 로 사용될 수 있다. 본원에 따른 일 구현예에서, 이러한 HBV 폴리머라제 억제제는 라미부딘(Lamivudin), 아데포비르 (Adefovir, ADV), 텔비부딘 (Telbivudine), 엔테카비르(Entecavir) 또는 테노포비르 (Tenofovir)를 포함할 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다. 본원에 따른 일 구현예에서 약학조성물은 화학식 5 (BCM-599), 화학식 6 (BCM-600), 화학식 8 (BCM-602), 화학식 10 (BCM-604), 화학식 12 (BCM-606) 또는 화학식 14 (BCM-608)의 화합물을 포함할 수 있다.

다른 양태에서 본원은 B형 간염 바이러스 유래의 6개의 코어 단백질 단량체로 이루어진 헥사머를 제공한다. 헥사머의 구조는 도 1을 참조할 수 있다. 헥사머는 HBV 캡시드와 상호작용하여 이의 어셈블리를 억제하는 물질의 스크리닝, 동정, 분리, 발굴 등에 유용하게 사용될 수 있다. 코어 단백질은 공지된 서열로 전장 또는 149개만이 사용될 수 있다. HBV 코어 단백질 서열은 공지된 것으로 예를 들면 전장 서열은 서열번호 1의 서열을 가지며, 149개의 서열은 상기 서열에서 1 내지 149개 잔기의 서열을 가진다. 본원에 따른 일 구현예에서 각 코어단백질 단량체 149개의 잔기를 가지며 서열번호 1의 서열을 기준으로 아미노산 잔기 21-35, 101-120, 및 136-140로 형성된 홈구조(groove)를 포함한다.

다른 양태에서 본원은 본원에 따른 헥사머를 이용한, 상기 헥사머에 형성된 홈구조와 후보 화합물간의 결합력을 측정하는 단계를 포함하는, HBV의 캡시드 어셈블리 억제제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.

본원에 따른 약학 조성물은 높은 친화도로 Cp의 홈 (groove) 구조에 결합을 통해 HBV의 캡시드 어셈블리를 효과적으로 억제 또는 차단하여, HBV로 인한 다양한 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 인실리코 모델링을 통해 수득된 cp149 이량체 (A) 및 육량체 (B)의 구조이다.
도 2는 cp149의 결합 포즈(pose)와 어셈블리 억제제 후보물질 간의 유사도를 나타내는 것으로, A는 cp149 이량체 수용체 상의 cp149 루프 구조 (Ser121-Pro135)에 대한 예측된 결합 포즈이고, B는 상기 수용체 상의 ARG127-THR128-PRO129 세 개 펩타이드에 대하여 예측된 결합 포즈이고, C는 BCM-599의 cp149 이량체 수용체에 대한 예측된 결합 포즈이고, D는 BCM-599와 cp149의 근접 아미노산 잔기사이의 상호작용을 나타내는 수용체-리간드 상호작용을 나타내는 모식도이다.
도 3은 예측 분자의 억제 효과를 인비트로 어셈블리 분석 및 아가로스 젤 분석을 통해 조사한 결과로, A, B에서 cp149는 최종농도 25μM의 13개의 각 분자로 처리되었으며, 0.9% (위 패널) 및 1.5% (아래 패널) SDS-PAGE로 분석하였으며, 시료의 순서는 다음과 같다; A: -, +, 599, 598, 600, 601, 602, 603, 604; B: -, +, 5999, 605, 606, 607, 608, 609, 610. C 내지 H는 [C] BCM-599, [D] BCM-600, [E] BCM-602, [F] BCM-604, [G] BCM-606, [H] BCM-608로 상기 각 물질을 1μM 내지 25μM의 농도로 처리 후 위와 같이 분석한 결과이다.
도 4는 인비트로에서 어셈블된 cp149의 슈크로스 농도구배 원심분리 결과를 나타낸다. A 내지 F는 슈크로스 농도구배에 분포된 단백질 분자를 나타내고, A는 음성 대조군, B는 양성 대조군이며, C는 BCM-599, D는 BCM-600, E는 BCM-602, F는 BCM-606 처리된 것이고, G는 단백질의 분로를 보다 명확하게 나타내기 위해 밴드 강도를 분석한 결과로, N은 음성 대조군이고, P는 양성 대조군이다.
도 5는 억제제 후보 물질은 HepG2.2.15 물질에 처리한 후 바이러스 타이터를 분석한 정량 PCR 결과 및 IC₅₀ 값을 나타낸다. 또한 억제제 후보물질과 라미부딘(Lamivudine)을 특정 비로 혼합한 후 위와 같은 실험을 수행하여 상대적 시너지 효과를 측정한 CI-인덱스 결과이다. A는 화합물 라미뷰딘 시너지 패턴을 나타내는 아이소볼믹 그래프로, 값은 각 화합물의 IC₅₀에 대하여 적정화(normalized)되었다. B는 BCM-599/라미뷰딘 조합의 CI 인덱스이고, C는 일정 농도 (=0.07μM)의 라미뷰딘에서 BCM-599의 첨가에 의한 바이러스 타이터의 변화를 나타내는 결과이다.
도 6은 비처리 cp149 및 억제제 후보화합물 처리된 cp149 캡시드에 대한 전자 현미경 사진이다 (배율: X80,000). 어셈블된 코어 입자를 2% 유라닐 아세테이틀 사용하여 네가티브 염색을 하였다. A는 비-어셈블된 cp149 사진이고, B는 반응 용액 (50 mM Hepes, 15mM NaCl, 및 10 mM CaCl2 in pH 7.5) 중의 완전히 어셈블된 cp149의 사진이고, C 내지 F는 BCM-599, BCM-600, BCM-602, 및 BCM-606의 각 억제제를 25μM로 처리한 후 어셈블된 cp149의 사진이다.
도 7은 인실리코 모델링을 통해 예측된 결합에너지와 인비트로/인비보 실험 결과에서 수득한 IC₅₀ 값을 비교한 결과이다. 이들 값을 로그 스케일로 변환하여 나타냈으며, A는 인비트로/인실리코 관련성이고, B는 인비보/인실리코 관련성을 나타낸다. 그 결과 RMSD (Root Mean Square Deviation)가 약 0.80으로 나타났으며 이는 본원에서 구축된 cp149 모델이 억제제 스크리닝에 있어 매우 효과적인 수단임을 나타내는 것이다.

본원에서는 화학식 1의 아미드계 물질들이 높은 친화도로 코어 단백질 이량체의 다른 이량체와의 상호작용부위에 결합을 통해, 캡시드 형성을 억제함으로서 바이러스 생성을 억제할 수 있다는 발견에 근거한 것이다. 본원에서는 HBV 캡시드를 구성하는 코어 단백질 (core protein, cp) 의 X-선 회절분석 데이터를 바탕으로 이량체/육량체 구조의 모델을 구축한 후 라이브러리 스크리닝을 통해 물질을 발굴한 후, 이러한 물질이 캡시드 어셈블리를 억제할 수 있음을 실험적으로 검증하였다.

이에 한 양태에서 본원은 하기 화학식 I의 화합물 또는 그 염을 유효성분으로 포함하는 HBV 감염으로 인한 간질환 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

상기 화학식 1에서,

A 는 C 또는 N 이고;

R₁및 R₂ 는 각각 수소 또는 할로겐이고,

R₃및 R₄ 는 각각 수소, C₁-C₆의 직쇄 또는 분쇄상 알킬기, -C(=O)R_a, -S(=O)₂R_a 이고, 상기 R_a는 C₁-C₆의 직쇄 또는 분쇄상 알킬기, 치환 또는 비치환된 아릴기, 치환 또는 비치환된 헤테로 아릴기이다.

본원에 따른 화학식에서 사용되는 아릴기, 헤테로아릴기가 갖는“치환된”에서의 “치환”은 할로겐 원자, 할로겐 원자로 치환된 C₁-C₂₀의 알킬기(예: CCF₃,CHCF₂,CH₂F,CCl₃등), 히드록시기, 니트로기, 시아노기, 아미노기, 아미디노기, 히드라진, 히드라존, 카르복실기나 그의 염, 술폰산기나 그의 염, 인산이나 그의 염, 또는 C₁-C₂₀의 알킬기, C₂-C₂₀의 알케닐기, C₂-C₂₀의 알키닐기, C₁-C₂₀의 헤테로알킬기, C₆-C₂₀의 아릴기, C₆-C₂₀의 아릴알킬기, C₆-C₂₀의 헤테로아릴기, 또는 C₆-C₂₀의 헤테로아릴알킬기로 치환된 것을 의미한다.

상기 화학식 1에서 사용되는 C₁-C₆의 알킬기의 구체적인 예로는 메틸, 에틸, 프로필, 이소부틸, sec-부틸, ter-부틸, neo-부틸, iso-아밀, 헥실 등을 들 수 있다.

상기 화학식 1에서 사용되는 아릴기는 단독 또는 조합하여 사용되어, 하나 이상의 고리를 포함하는 방향족 시스템인 것을 의미하며, 예를 들어 페닐, 나프틸, 테트라히드로나프틸 등을 들 수 있다. 또한 상기 아릴기 중 하나 이상의 수소 원자는 상술한 “치환”에서 정의한 바와 같은 치환기로 치환가능하다.

화학식 1에서 사용되는 헤테로아릴기는 N, O, P 또는 S 중에서 선택된 하나 이상의 헤테로원자를 포함하고, 나머지 고리원자가 탄소인 유기 화합물인 것을 의미하며, 예를 들어 피리딜 등을 들 수 있다. 또한 상기 헤테로아릴기 중 하나 이상의 수소 원자는 상술한 “치환”에서 정의한 바와 같은 치환기로 치환가능하다.

본원에서 할로겐은 F, Cl, Br, 또는 I 중 하나이다.

본원에 따른 한 구현예에서 상기 화학식 1의 화합물은 하기 화학식 2 또는 3으로 표시된다.

상기 화학식 2 또는 3에서,

R'₁, R'₂ , R'₄및 R'₅ 는 각각 수소 또는 할로겐이고,

R'₃ 및 R'₆ 는 각각 수소, C₁-C₆의 직쇄 또는 분쇄상 알킬기, -C(=O)R_a, -S(=O)₂R_a 이고, 상기 Ra 는 C₁-C₆의 직쇄 또는 분쇄상 알킬기, 치환 또는 비치환된 아릴기, 치환 또는 비치환된 헤테로 아릴기를 포함한다. 화학식 2 또는 3에서 알킬기, 치환 또는 비치환된 아릴기, 및 치환 또는 비치환된 헤테로 아릴기의 정의는 앞서 언급한 바와 같다.

화학식 1의 화합물의 예로는 다음과 화학식 4 내지 16으로 표시되는 화합물을 들 수 있다.

.

본원에 따른 화합물은 HBV 증식의 최전방에서 중요한 역할을 하는 캡시드 어셈블리를 억제 또는 차단할 수 있다. HBV는 유전체가 부분적으로 이중가닥인 3.2 kb의 원형 DNA 바이러스로, 유전체에는 4개의 겹친 해독틀이 존재하며, 이로부터 표면단백질 (HBs), 코어단백질 (HBc, Cp), 중합효소 (HBV pol), 및 X 단백질 (HBx)이 발현된다 (Seeger C, et al., Microbiol. Mol. Biol. Rev., 2000;64: 51-68). 코어단백질은 HBV pol, 프리게놈 RNA (pgRNA) 및 타 다른 단백질의 패키징에 관여하며, HBV 라이프사이클에서 중요한 역활을 하는 것으로 알려져 있다 (ibid.). 바이러스의 생성에는 코어단백질과 바이러스 게놈 및 타 단백질의 어셈블리가 필요하기 때문에, 코어단백질의 어셈블리는 HBV 복제에 있어 중요한 단계이다.

코어 단백질은 코어 어셈블리에 필요한 N-말단 부위와 바이러스 복제를 조절하는 C 말단으로 이루어진 두 개의 영역을 갖는 183-185개 아미노산으로 구성되어있다 (ibid.). 코어단백질은 바이러스의 캡시드를 형성하며, 과정에서 코어단백질은 이량체를 형성하고, 이어 이량체간의 상호작용에 의해 궁극적으로 180개 또는 240개의 코어단백질이 캡시드를 형성하게 된다. 캡시드는 패키지된 바이러스와 숙주 인자 (host factor)의 보호에 필수적인 역활을 한다. 따라서 캡시드의 형성을 억제 방해할 경우, HBV 증식으로 인한 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

따라서 본원에 따른 화학식 1의 화합물은 캡시드 이량체 및/또는 육량체와의 결합을 통한 캡시드 어셈블리를 효과적으로 억제하여 바이러스 증식을 억제하여, 바이러스로 인한 다양한 간질환의 치료 또는 예방에 효과적으로 사용될 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "간질환" 이란, 간 기능에 장해가 있는 증상을 가리킨다. 예를 들어, 바이러스성 간염(특히, HBV에 의해 매개된 간염), 지방간, 간부전, 간경화 및 간세포암을 들 수 있다. 병명이 확실치 않은 경우라도, GOT, GPT, γ-GTP 등의 간 기능의 지표에 이상이 관찰되는 증상도 간질환에 포함되며, 특히 HBV 감염으로 인한 것이다.

특히 간세포암은 간에서 발생하는 원발성 간암을 의미하며, 다른 부위에서 생겨서 간으로 전이된 암은 간세포암은 포함되지 않는다. 간세포암은 전체 간암의 90％ 이상을 차지하며, 환자의 40 내지 80％는 재발하는데, 대부분 다시 간에 재발하지만, 폐와 림프절, 복강을 둘러싸고 있는 안쪽 벽과 종격동에서 나타날 수도 있으며, 이러한 암도 본원에 포함된다.

본원에서 사용된 용어 "치료" , “완화” 또는 “개선” 이란 본원에 따른 조성물의 투여로 HBV 감염으로 인한 질환의 증세를 호전시키거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다. 본원이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면, 대한의학협회 등에서 제시된 자료를 참조하여 질환의 정확한 기준을 알고, 개선, 향상 및 치료된 정도를 판단할 수 있을 것이다.

본 명세서에서 사용된 용어 "예방" 은 본원에 따른 조성물의 투여로 HBV 감염으로 인한 질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 본원의 추출물은 감염 초기 또는 증상이 나타나기 전에 투여할 경우 이러한 질환을 예방할 수 있다는 것은 당업자에게 자명할 것이다.

이에 다른 양태에서 본원은 또한 화학식 I의 화합물을 포함하는 HBV 캡시드 어셈블리 억제 또는 차단용 조성물에 관한 것이다.

또다른 양태에서 본원은 화학식 I의 화합물을 포함하는 HBV 캡시드 어셈블리 억제 또는 차단을 통한 간질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 간질환에 대하여는 앞서 설명한 바와 같다.

본원 조성물은 상기 언급한 유효성분 이외에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 또는 유효성분의 용해성 및/또는 흡수성을 유지/증가시키는 화합물을 추가로 함유할 수 있다. 또한 본원의 조성물은 간질환의 치료 또는 예방을 위하여 단독으로, 또는 수술, 기타 약물치료 및 생물학적반응조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

예를 들면 공지된 항바이러스제, 예를 들면 DNA 폴리머라제에 작용하여 증식을 억제하는 하나 이상의 약제와 함께 사용되어 상승작용을 유도할 수 있다. 한 구현예에서는 예를 들면 라미부딘(Lamivudin), 아데포비르 (Adefovir, ADV), 텔비부딘 (Telbivudine), 엔테카비르(Entecavir) 또는 테노포비르 (Tenofovir) 중 하나 이상과 함께 사용될 수 있으며, 이와의 병용 요법 즉 칵테일 요법으로 바이러스 증식을 더욱 효과적으로 억제할 수 있어, 관련 질환의 치료에 매우 유용하다. 각 성분의 비는 치료 목적 및 구체적 성분을 고려하여 절절한 비를 선택할 수 있으며, 이로 제한하는 것은 아니다 화학식 I의 화합물 대 HBV DNA 폴리머라제 억제제, 특히 라미부딘의 비는 약 1:1 내지 40:1이나 이로 제한하는 것은 아니다.

본원의 조성물은 상기 언급한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있으며, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다. 더 나아가 당해 기술분야의 적정한 방법으로 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제형화할 수 있다.

본원 조성물의 투여방법은 특별히 이에 제한되는 것은 아니며, 공지된 억제제의 투여방법을 적용할 수 있으며, 목적하는 방법에 따라 비경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여의 경우 피부에 붙이는 패치형, 코/호흡기를 통해 투여할 수 있으며, 신속한 치료효과를 얻기 위해서는 정맥내 주사에 의한 투여가 바람직하다. 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 매우 다양하다. 전형적인 약물의 경우 투약단위체는, 예를 들어 약 0.01 mg 내지 100 mg를 포함하나 상기 범위의 이하 및 이상의 범위를 배제하는 것은 아니다. 일일 투여량은 약 1μg 내지 10g 일 수 있으며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다.

다른 양태에서 본원은 B형 간염 바이러스 유래의 6개의 코어 단백질 단량체로 이루어진 헥사머에 관한 것이다.

헥사머를 구성하는 코어 단백질은 전장 또는 N 말단부터 149개 아미노산 잔기를 가질 수 있다. 전장은 183 개 내지 185개 아미노산 잔기를 가질 수 있다. 코어단백질 서열은 공지된 것으로 이로 제한하는 것은 아니나, 예를 들면 하기와 같은 서열번호 1의 서열을 가진다:

:MDIDPYKEFGASVELLSFLPSDFFPSVRDLLDTASALYRDALESPEHCTPNHTALRQAILCWGELMTLASWVGNNLEDPAARDLVVNYVNTNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVVRRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQSPASQC.

코어 단백질은 코어 어셈블리에 필요한 N-말단 부위와 바이러스 복제를 조절 하는 C 말단으로 이루어진 두 개의 영역을 갖는 183 내지 185개 아미노산으로 구성되어 있다. 코어단백질은 바이러스의 캡시드를 형성하며, 과정에서 코어단백질은 이량체를 형성하고, 이어 이량체간의 상호작용에 의해 궁극적으로 180개 또는 240개의 코어단백질이 캡시드를 형성하게 된다. 캡시드는 패키지된 바이러스와 숙주 인자 (host factor)의 보호에 필수적인 역활을 한다. 따라서 캡시드의 형성을 억제 방해할 경우, HBV 증식으로 인한 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다. 본원에서는 캡시드 형성을 억제하는 물질을 발굴함에 있어서, 180 개 또는 240개의 코어단백질로 이루어진 캡시드가 아닌, 6개 코어단백질로 구성된 헥사머가 캡시드 억제제 발굴에 유용하게 사용될 수 있음을 발견하였다.

본원에 따른 헥사머는 코어 단백질 이량체를 단위체로 하여, 이량체가 3개 결합한 육랑체로 단량체 당 1개의 홈 (groove)이 형성되며, 헥사머에는 총 6개의 홈이 형성된다. 이 중 6개 중 3개는 헥사머의 형성에 참여하고, 외부의 3개의 홈이 스크리닝에 사용된다. 상기 외부 3개의 홈은 하기 서열번호 1의 서열번호를 기준으로 아미노산 잔기 21-35, 101-120, 및 136-140로 형성된다. 상기와 같은 홈 구조를 형성하는 한 상기 서열에 일부 변이가 발생한 것도 포함되며, 홈을 형성하는 잔기의 구체적 위치도 이에 따라 변동이 있을 수 있다.

다른 양태에서 본원은 또한 본원에 따른 헥사머를 이용한 상기 HBV의 캡시드 어셈블리 억제제를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 헥사머에 형성된 홈구조와 후보 화합물간의 결합력을 측정하는 단계; 및 결합을 억제하지 않는 대조군 화합물과 비교하여, 억제능이 있는 화합물을 후보 화합물로 선별하는 단계를 포함한다. 본원에 따른 헥사머를 이용한 구체적 예로는 이로 제한하는 것은 아니나, 본원에 따른 실시예에 기재된 것을 참조할 수 있다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

본 발명은 달리 언급이 없는 한 세포생물학, 세포배양, 분자생물학, 유전자 형질전환 기술, 미생물학, DNA 재조합기술에 관한 당업자의 기술수준 내인 통상의 기술을 사용하여 실시될 수 있다. 또한 일반적인 기술에 관한 보다 자세한 설명은 Molecular Biotechnology: (Bernard et al., ASM press 1994); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed. (Sambrook et al., Harbor Laboratory Press 2001); Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed. (Ausubel et al. eds., John Wiley &Sons 1999); DNA Cloning, Volumes I and II (Glover ed., 1985)을 참고할 수 있다.

실시예

실시예 1 실험 물질 및 방법

본 실시예에서 사용된 물질 및 실험 방법은 다음과 같다.

1-1. 실험에 사용한 물질

항 Anti-HBcAb (Polyclonal Rabbit, 1:4000)은 Dako (Glostrup, Denmark)에서 수득하였다. Horseradish-conjugated 항-rabbit Ab (1:40,000) 및 마우스 단클론 항-FLAG Ab (5 μg/ml)는 Sigma (St. Louis, MO, United States) 유래이다. BL21 (DE3) + pLysS E. coli 및 pET28b 벡터는 Novagen (Madison, WI, United States) 유래이다. Isopropyl-h-d-1-thiogalactoside (IPTG)는 Duchefa Biochemie (Haarkem, Netherlands) 유래이다. Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)은 Welgene (Daegu, Republic of Korea) 유래이다. 소태아 혈청은 Invitrogen (Carlsbad, CA, United States) 유래이다. 실시간 정량 PCR용 PCR SYBR-Green 반응혼합물은 Qiagen (Hilden, Germany) 유래이다. 화합물 라이브러리는 B&C Company (Seoul, Korea)에서 제공받았다.

1-2. 바이러스 및 세포

HepG2.2.15 세포는 10% 소태아 혈청을 포함하는 DMEM 배지를 사용하여 37℃ 5% CO₂에서 조건에서 배양하였다.

1-3. 캡시드 단백질 구조 모델링

이량체/헥사머 Cp149-HBcAg에 대하여 X-선 회절 분석을 통해 결정을 규명하였다(3.5 Å). cp149 및 cp183 각각에 대한 단량체 및 이량체 구조에 대한 인실리코 모델을 구축하였다. 이들 단백질의 구조는 종전 X-선 회절 분석 결과를 이용하였다 (Packianathan C et al., J. Virol. 2009;84(3): 1607-1615; Wynne SA, et al., Mol Cell. 1999;3(6): 771-780). 결정격자 중의 물분자는 빼내고, 사라진 잔기 및 원자를 추가하여 전장 모델을 구축하였다. 단백질 구조 시물레이션은 AMBER 및 CHARMM 힘의 장(Forece Field) 세트를 근거로 수행하였다. 각 원자의 부분 전하는 Momany-Rone 방법 (CHARMm FF)으로 적용하였다. 에너지 수준은 Adopted Basis-set Newton-Raphson (ABNR) 알고리즘으로 최소화하였다. 수득한 구조는 molecular volume integration (GBMV) 방법에 의한 Generalized Born model을 사용하여 1,000,000 사이클 동안 37℃에서 평형화되었고, 용매내 및 단백질 내부의 유전상수는 각각 80 및 4이었다(Smith JR, et al., Bioorg Med Chem 2012;20:1354-1363). 이를 근거로 인실리코에서 캡시드 어셈블리 억제제 후보 물질을 탐색하였으며, 구체적으로 이량체 모델을 이용하여 후보분자와 자유 이량체 간의 상호작용을 시물레이션하고, 헥사머 모델을 이용하여 HbcAg 분자 상호작용의 차이점을 관찰하여 보다 정교한 스크리닝과정을 수행하였다.

1-4. 분자 다이나믹 시물레이션 및 다킹 시물레이션

본 실시예에서 코어 단백질 아미노산 잔기 21-35, 101-120, 및 136-140로 둘러쌓인, 억제제와 같은 화합물 분자의 가능한 결합 부위로 작용할 수 있는 홈(groove) 구조를 규명하였다. 이 홈의 원래 기능은 이량체-이량체 상호작용 부위로서, 다른 이량체의 루프구조인 잔기 126-135에 결합한다. 이량체 모델에서 각 폴리펩타이드 사슬 당 2 개의 자유 홈이 있다. 육량체 모델에서 3 개의 내부 홈 구조는 루프 구조가 차지하여, 3개의 바깥 홈만을 라이브러리 스크리닝 및 수용체-리간드 상호작용 시물레이션에 사용할 수 있다. 본 실시예에서는 이와 같은 3개의 독립적 기전으로, CDOCKER, LibDock, 및 LigandFit 알고리즘 (Discivery Studio 3.1, accelrys, USA)을 사용하여 상기 홈에 맞춤으로 결합할 수 있는 분자를 규명하였다. 독킹 시물레이션을 사용하여 스크리닝을 수행한 후, 에너지 레벨 최소화 및 1,000,000 사이클 동안 37℃ 조건에서 평형화를 통해 상술한 바와 같이 가장 우수한 결합 포즈를 조사하였다.

1-5. 인비트로 어셈블리 분석 및 슈크로스 농도구배 전기영동

Cp149는 종전에 기술된 바와 같이 준비하였다 (Kang HY, et al., Biochem. J. 2006;398: 311-317). Cp149 어셈블리를 위해, 일정 농도의 후보 화합물과 Cp149 (최종 농도 60μM) 를 어셈블리 반응 완충액 (50 mM HEPES (pH 7.5), 15mM NaCl, 10mM CaCl₂)에서 혼합한 후 37℃에서 1시간 동안 정치하였다. 이어, 각 시료의 어셈블된 입자를 분리하여 0.9% 비변성 아가로스 젤에서 전기영동을 수행한 후 종전에 기술된 바와 같이 면역블롯을 수행되었다 (ibid). 슈크로스 농도구배 원심분리 및 뒤 이은 면역블롯도 종전에 기술된 바와 같이 면역블롯을 수행되었다 (ibid).

1-6. 실시간 PCR 을 이용한 HBV DNA 정량

24웰 플레이트 각 웰을 가득채운(confluent)한 HepG2.2.15 세포를 도면에 기재된 바와 같은 일정 농도의 후보 화합물로 처리하였다. 24시간 후에, 배지를 수집한 후 방출된 비리온을 수확한 후 페놀로 추출하고, 에탄올로 침전하였다. 타이터를 정량 PCR로 종전에 기술된 바와 같이 측정하였다 (Shim HY, et al., Virology, 2011;410: 161-169). 요약하면 추출한 DNA를 HotStartTaq 폴리머라제를 포함하는 PCR SYBR Greeen 반응 혼합물 (Qiagen)에 추가한 후, 프라이머로 F-5′-GTGTCTGCGGCGTTTTATCA-3′, 및 R-5′-GACAAACGGGCAACATACCTT-3′를 사용하여 분석하였다. 상기 프라이머는 HBV 유전체의 379 내지 476 nt 부위를 증폭하여 98 bp의 산물이 생성된다. 반응조건은 다음과 같다: 95 °C에서 15 min, 이어 94 °C에서 15 s, 55 °C에서 30 s 및 72 °C에서 30 s 반응을 45주기. 배지에 포함된 HBV 농도는 pHBV 1.2 ×를 연속희석 (5.28× 10⁶ copies per milliliter (cpm), 5.28× 10⁵ cpm, 5.28× 10⁴ cpm, 5.28× 10³cpm, 5.28× 10² cpm)하여 표준 곡선을 작성하여 사용하였다.

1-7. IC ₅₀ 의 계산

각 화합물의 50% 억제효과를 나타내는 농도인 IC₅₀을 결정하기 위해, 상술한 바와 같이 정량 PCR을 수행하였다. 단, 각 억제제는 100% DMSO로 희석하여 0.25 내지 50μM 농도로 사용하였다. 각 웰의 최종 DMSO 농도는 1% 이었다. 바이러스 유전체 타이터 수치를 % 억제로 전환하였다. 결과는 용량 대비 반응의 함수를 나타내는 시그모이드 커브로 작성하였으며, 이로부터 IC₅₀을 계산하였다. 세포독성은 종전에 기술된 바와 같이 각 처리 24시간 후에 중성 적색 염료의 업테이크로 측정되었다 (Korba BE, et al., Antiviral Res, 1992;19: 55-70).

1-8. 라미뷰딘과 인비보 조합 분석

라미뷰딘과 어셈블리는 억제하는 후보 화합물이 조합으로 사용된 경우 시너지여부를 조사하기 위하여 이들 분자를 도면에 기재된 바와 같은 다양한 농도로 24웰 플레이트의 HepG2.2.15 세포에 처리하였다. 24시간 후에 배지를 수집하여 종전에 기술된 바와 같이 바이러스 타이터를 측정하였다 (Shim HY, et al., Virology, 2011;410: 161-169). CI 지수는 종전과 같이 결정되었다 (Chou T. et al., Pharmacological Review, 2006;58(3): 621-681).

1-9. 전자현미경

네가티브 염색을 위해, 어셈블된 코어 입자를 포함하는 10ul의 시료를 카본 코팅된 그리드에 적용한 후 1분간 정치하였다. 이어 그리드를 물로 세척한 후 2% 유라닐 아세테이트로 1분간 염색하였다. 사용된 전자 현미경은 80 kV에서 작동하는 LIBRA 120 (Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)으로, 전자현미경 분석은 National Instrumentation Center for Environmental Management (대한민국)에 의뢰하여 수행하였다.

실시예 2 코어 단백질 구조를 근거한 라이브러리 스크리닝 및 발굴된 캡시드 어셈블리 억제제

도 1에 기재된 바와 같이 이량체 및 육량체에 대한 구조 모델을 구축하였다. 이 중 이량체 모델을 이용하여 라이브러리의 화합물과 자유 이량체 간의 상호작용을 시물레이션하였고, 육량체 모델은 화합물-단백질 간 상호작용에 있어 차이점을 관찰하고, 스크리닝 방법의 효율 개선에 사용하였다.

본 실시예에서 사용한 라이브러리는 1128개의 약물유사 분자로 구성되며, 이 중 이량체 또는 육량체의 홈 구조에 맞아 떨어질 수 있는 구조를 갖는 화합물을 발굴하여, 결합 친화도 및 안정성을 조사하였다. 그 결과 표 1에 나타난 바와 같이 총 13개의 화합물을 선별하였다. 이 들은 두 종류의 분자 패밀리 즉 이들은 유사한 골격 구조 및 잔기 구조를 갖는 2-아미노-N-(2,6-디클로로피리딘-3-일)아세트아미드 계 및 N-(2,4-디클로로페닐)-2-(메틸아미노)아세트아미드 계에 속하며 이들은 모두 전반적 구조적 유사성을 가진다. 특히 이 중 BCM-599 및 BCM-606이 이량체 및 육량체 모델 모두에서 우수한 결합 에너지 및 결합 안정성을 나타냈다. 이량체 모델에서 2개의 홈 간의 친화도 차이는 무시할 만한 것이었으나, 육량체 및 이량체 모델의 홈 간의 친화도 차이는 유의성이 있었다. 이러한 차이는 이량체 및 육량체 간의 구조(conformation) 적 차이로 인한 것으로 판단된다. 그 이유는 육량체의 홈이 이량체의 경우와 비교하여 보다 넓고 느슨해졌기(relaxed) 때문이다. 발굴된 분자의 결합 포즈는 홈의 중앙에 결합하는 ARG127-THR128-PRO129 트리펩타이드의 포즈와 매우 유사하였다 (도 2). 최종적으로 상기 두 개의 분자를 포함하는 13개의 분자를 라이브러리부터 선별하였다.

[표 1]

실시예 3 발굴된 캡시드 어셈블리 억제제의 캡시드 타이터 감소효과

실시예 2에서 발굴된 13개의 분자 중 6개가 캡시드 어셈블리를 강하게 감소시키는 것으로 나타났다 (도 3 참조). 이 중 BCM-606 및 BCM-599가 가장 강력한 것으로 나타났으며, 모든 이량체의 어셈블리는 차단하였다. 다른 4개의 분자 즉 BCM-600, BCM-602, BCM-604, 및 BCM-608도 형성된 캡시드 농도를 상당히 감소시키는 것으로 나타났다. 이후 실험에서 6개의 화합물을 사용하였다.

6개 화합물에 대한 EC₅₀을 1-50μM 농도구배에서 어셈블리 분석을 이용하여 측정한 결과는 다음 표 2와 같다. 특히 4개 분자 BCM-600, BCM-602, BCM-604, 및 BCM-608에 대한 EC₅₀은 20μM을 넘었다.

[표 2]

상기 표 2에 사용된 약어는 다음과 같다: NA: IC₅₀ 값이 범위를 벋어나 표준편차 해당사항 없음. ND: 저용해도로 인해 IC₅₀, IC₉₀, 및 표준편차 검출되지 않음. Stdev(50): IC₅₀에 대한 표준편차

실시예 5 슈크로스 농도구배 전기영동 분석을 통한 캡시드 어셈블리 억제 과정 규명

BCM-599, BCM-600, BCM-602 및 BCM-606 화합물을 이용하여 슈크로스 농도구배 원심분리를 통한 억제 효과를 추가로 분석하였다. 결과는 도 4에 기재되어 있다. 이에 나타난 바와 같이, 10-50%의 슈크로스 농도구배를 이용한 결과, 침강계수의 차이로 인해 어셈블되지 않은 캡시드는 분획 1-4에서 검출되었으며, 완전히 어셈블된 캡시드는 분획 7-8에서 검출되었다. BCM-599 및 BCM-606 화합물의 경우 어셈블되지 않은 대조군과 유사한 분포 양상을 나타냈다. 즉 자유 이량체는 분획 1-4에서 검출되었으며, 다른 분획에서는 무시할 만큼의 신호가 검출되었다. 이는 BCM-599 및 BCM-606 화합물이 강력한 캡시드 어셈블리 억제제임을 나타내는 것이며, 이러한 양상은 cp149 이량체가 자유상태로 있는 경우에만 관찰되었다. BCM-600 또는 BCM-602의 경우도 캡시드는 비어셈블된 분획에서 상당히 많은 양이 검출되었다.

실시예 6 캡시드 억제제 화합물의 HepG2.2.15 세포에서의 비리온 타이터 (titer) 감소 효과

본원에서 발굴된 13개의 억제제를 HepG2.2.15 세포에 처리하여 세포질 환경에서의 억제 효과를 측정하였다. 결과는 표 2에 기재되어 있다. 표 2에 기재된 바와 같이 13개 중 3개의 화합물이 IC₅₀ 수치가 10μM 이하로 항 바이러스 활성을 나타냈다. 반면 각 화합물의 억제 강도는 인비트로 어셈블리에서 관찰될 결과와 상당히 상이하였다. 5개의 화합물은 50μM 아래의 억제 강도를 나타냈다.

가장 강한 억제 효과는 BCM-599에서 나타났다 (표 2 참조). 인비트로 어셈블리와 비교하여, BCM-599의 IC₅₀ 수치는 10배 이상 감소하였다. 나아가, BCM-600의 경우도 IC₅₀ 수치가 5배 이상 감소하였다. 하지만, BCM-606 의 경우 IC₅₀ 수치는 약간 증가하였으며, BCM-600 수치를 상회하였다. 이러한 결과는 세포배양 조건에서는 BCM-606이 효과적으로 기능하지 않음을 나타낸다.

실시예 7 캡시드 억제제 화합물 및 라미부딘의 조합에 의한 시너지 효과

억제제 후보 화합물을 라미부딘과 함께 사용하여 시너지 효과를 측정하였다. 결과는 도 5에 기재되어 잇다. 인비보에서 낮은 IC₅₀ 수치를 갖는 6개의 화합물을 선정하여 라미부딘과의 IC₅₀ 수치 및 조합 지수를 계산하였다 (표 3 참조). 라미부딘과 각각의 각 화합물의 인비보 IC₅₀ 수치를 기초로 25:75, 50:50; 75:25 비를 구성하여 모든 비에 대해 부가적 효과는 50% 억제가 되도록 하였다. 50:50의 경우 CI = 0.563의 값을 나타냈으며 그 외의 25:75, 75:25 비율에서도 CI = 0.65 수준을 나타냈다. 아래 표 3 에서 모든 조합은 화합물 양: 라미부딘의 양으로 표시하였으며, CI (combination 지수)는 Calcusyn 소프트웨어 (BIOSOFT, UK)를 사용하였다. 지수는 실험에 사용된 화합물 간의 상호작용에 대한 정량적 분석이다.

[표 3]

실험 결과 모든 조합에서 시너지 효과를 나타내는 것으로 나타났다. 라미부딘 및 BCM-599를 함께 사용한 결과 CI 값이 0.7 미만으로, 이는 조합 사용으로 인한 상당한 시너지 효과를 의미한다. 시너지 효과는 하기 문헌 (Chou T. Theoretical Basis, Experimental Design, and Computerized Simulation of Synergism and Antagonism in Drug Combination Studies. Pharmacological Review, 2006;58(3): 621-681)에 기재된 기준에 의해 판단된 것으로, 0.7 이하의 값이 일반적 시너지가 있는 것으로 정의한다.

이어 최적 비율을 확인하기 위하여, 라미부딘 및 BCM-599를 다양한 농도 조합으로 사용하였다. 가장 낮은 CI 지수 (CI = 0.55) 는 12:1의 조합비에서 관찰되었다. 또한 라미부딘의 양을 고정하고 BCM-599의 양을 변화시키면서 시험한 결과 (표 4 참조), 라미부딘 0.07μM의 IC₅₀에서, 1x 및 2x 배로 라미부딘을 추가에 의해 바이러스 타이터가 각각 27% 및 40% 감소하였다. 이러한 결과는 항 바이러스 효과를 증대시키기 위해 기존의 항바이러스제와 함께 본원 화합물이 유용하게 사용될 수 있음을 나타내는 것이다.

[표 4]

실시예 8 전자현미경 분석을 통한 억제 효과 규명

전자현미경 분석에서, 캡시드 입자는 원주가 30-35 nm의 원형의 속이 빈 입자로 검출된다. 네가티브 염색을 하면 캡시드는 중앙이 검은 밝은 고리모양을 나타내며, 특정 경우에는 중앙에 검은 부분이 없는 흰색입자로 검출되기도 한다. 이러한 현상은 유라닐 아세테이트에 대한 노출이 부족하여 생긴 결과로 분석된다. 비어셈블된 cp149 시료를 사용한 결과, 살아있는 입자는 검출되지 않았으며, 반-규칙적인 양상의 응집체가 검출되었으며, 완전히 어셈블된 경우에 이러한 양상은 검출되지 않았다.

억제제 화합물로 처리한 경우, 어셈블 및 비어셈블된 양상이 혼합되어 나타났다 (도 6 참조). 상대적은 적은 부분적으로 어셈블된 입자 및 높은 단백질 백그라운드가 관찰되었으며, 이는 완전히 어셈블된 시료에서는 나타나지 않았다. 이러한 결과는 어셈블리 반응과정에서 캡시드 입자로서 어셈블되었어야 할 이량체가 본 억제제 화합물로 인해 어셈블되지 못하고 남아 있었기 때문이다. 나아가, 화합물 중에서 상대적으로 강한 억제제인 BCM-599 및 606을 BCM-600 및 BCM-602과 비교한 경우, 후자에서 구모양의 입자가 보다 많이 관찰되었다. 이러한 결과는 억제제로서의 화합물간의 차이가 캡시드 어셈블리 완성에 영향을 미친다는 것을 나타낸다.

이상의 실험 결과에서 알 수 있는 바와 같이, 본원의 화학식 I의 화합물 및 이를 포함하는 약학 조성물은 캡시드 어셈블리의 억제를 통해 효과적으로 바이러스 증식을 억제하여 HBV 바이러스로 인한 다양한 간질환에 폭 넓게 사용될 수 있다.

상기와 같이 본원의 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고, 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본원의 기본 개념을 이용한 당업자에 의한 다양한 변형 또는 개량된 것 또한 본원의 권리범위에 속하는 것이다.

Claims

하기 화학식 1의 화합물 또는 그 염을 유효성분으로 포함하는 HBV 감염으로 인한 간암 예방 또는 치료용 약학 조성물:
<화학식 1>

,
상기 화학식 1에서,
A 는 C 또는 N 이고;
R₁및 R₂ 는 각각 수소 또는 할로겐이고,
R₃은 수소 또는 메틸기이고
R₄ 는 -C(=O)R_a, -S(=O)₂R_a 이고, 상기 R_a는 수소 또는 C₁-C₆의 직쇄 또는 분쇄상 알킬로 치환된 아민; 수소, C₁-C₆알콕시기 또는 할로겐으로 치환된 페닐기; 수소, C₁-C₆알콕시기 또는 할로겐으로 치환된 페닐아민; 수소, C₁-C₆알콕시기 또는 할로겐으로 치환된 피리딘기임.
삭제
제 1 항에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물은 하기 화학식 4 내지 16 중 어느 하나로 표시되는 것인, HBV 감염으로 인한 간암 예방 또는 치료용 약학 조성물:
<화학식 4>

;

<화학식 5>

;

<화학식 6>

;

<화학식 7>

;

<화학식 8>

;
<화학식 9>

;

<화학식 10>

;

<화학식 11>

;

<화학식 12>

;

<화학식 13>

;

<화학식 14>

;

<화학식 15>

; 또는

<화학식 16>

.
제 3 항에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물은 화학식 5 (BCM-599), 화학식 6 (BCM-600), 화학식 8 (BCM-602), 화학식 10 (BCM-604), 화학식 12 (BCM-606) 또는 화학식 14 (BCM-608)의 화합물인, HBV 감염으로 인한 간암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
삭제
제 1 항, 제 3 항 또는 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 간암 예방 또는 치료는 HBV 캡시드 어셈블리의 억제 또는 차단에 의한 것인, HBV 감염으로 인한 간암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 HBV 폴리머라제 억제제를 추가로 포함하는 것인, HBV 감염으로 인한 간암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제 7 항에 있어서, 상기 화합물 대 상기 HBV 폴리머라제 억제제의 비는 1:1 내지 40:1 인 것인, HBV 감염으로 인한 간암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제 7 항에 있어서, 상기 HBV 폴리머라제 억제제는 라미부딘(Lamivudin), 아데포비르 (Adefovir, ADV), 텔비부딘 (Telbivudine), 엔테카비르(Entecavir) 또는 테노포비르 (Tenofovir) 인, HBV 감염으로 인한 간암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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