PT680972E - Peptidos derivados de trifluorometilcetonas processo para a sua preparacao e as composicoes farmaceuticas que os contem - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO

“PÉPTIDOS DERIVADOS DE TREFLUOROMETILCETONAS, PROCESSO PARA A SUA PREPARAÇÃO E AS COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS QUE OS CONTÊM” A presente invenção diz respeito a novos péptidos derivados de trifluorometilcetonas, ao processo para a sua preparação e às composições farmacêuticas que os contêm.

Estes novos derivados peptídicos possuem propriedades inibidoras da elastase leucocitária humana. Além disso, estes compostos possuem propriedades anti-oxi dantes. A elastina é uma proteína fibrosa elástica do tecido conjuntivo das vértebras. Ela encontra-se presente nas paredes vasculares, na pele, nos pulmões, nas cartilagens, nos ligamentos e noutros tecidos. As elastases são enzimas susceptíveis de solubilizar a elastina fibrosa. A elastase leucocitária humana é uma serina protease, a qual se encontra sob forma activa nos grânulos azurófilos do neutrófilo polimorfonuclear. Trata-se de uma glicoproteína com 25 a 30 kDa formada por 218 ácidos aminados. A elastase leucocitária humana (ELH) solubiliza a elastina fibrosa, mas cinde igualmente outras proteínas da matriz extra-celular (colagéneos, fibronectina, proteoglicanos, etc.), hidrolisa e inactiva um certo número de proteínas plasmáticas (factor da coagulação, imunoglobulina, complemento, etc.). A actividade elastolítica é controlada e regulada por ínibidores naturais (alfa 1 - 2

J antitripsina, alfa 2 - macroglobulina, inibidor brônquico) sensíveis aos oxidantes.

Descreveram-se na literatura inibidores da elastase leucocitária humana, reversíveis ou irreversíveis, para o tratamento de situações fisiopatológicas em que o seu papel foi evocado (D. A. TRAINOR, TIPS, 8, 303 - 307, 1987).

Estes estados patológicos podem ser o enfísema pulmonar, a artrite reumatóide, as doenças degenerativas do tecido conjuntivo como a aterosclerose (J. G. BIETH, “Elastases : Catalytic and Biological Properties” em “Regulation of matrix accumulation” - R. P. MECHAM - Academic Press, NY, 217 - 320, 1986), o síndroma da angústia respiratória aguda do adulto (P.M. SUTER e colab., Am. Ver. Respir. Dis., 145, 1016 - 1022, 1992), a fibrose cística (K. C. MEYER et colab., Am. Ver. Respir. Dis., 144, 580 - 585, 1991), a bronquite crónica (J. A. NADEL, Respiration, 58 (supl. 1, 3-5), 1991), as glomerulobefrites (E. SANDERS e colab., Renal, physiol., 3, 355 - 359, 1980), a psoríase (J. SCHALKWIJK e colab., Br. J. Dermatology, 122, 631 - 644, 1990), as lesões tecidulares que sobrevêm no decurso dos processos de isquémia-reperfusao (F. A. NICOLINI e colab., Am. HEART J., 122 - 1245, 1991 e C.R.B. WELBOURN e colab., Am. J. Physiol. 260, 1852 - 1856, 1991). Ela poderia igualmente desempenhar um papel nos fenómenos de migração celular normal ou patológica-invasão tumoral (J.G. BIETH citado anteriormente).

Recentemente, descreveram-se péptidos derivados de trifluorometilcetonas como inibidores de ELH. E o caso mais particularmente dos compostos descritos nas patentes de invençâbEP 189 305 e EP 369 391 ou EP585 155. A presente invenção diz mais especifícamente respeito aos compostos de 3 fórmula geral (I): 3

Z - (CHj)d - CONH - SO.

:0-A-CO-NH-CH-COCF, R, na qual: o símbolo Ri representa um grupo alquilo (Ci-C6) de cadeia linear ou ramificada ou cicloalquilo (C3-C7), o símbolo R.2 representa um grupo alquilo (Ct-C6) de cadeia linear ou ramificada ou cicloalquilo (C3-C7), o símbolo R3 representa um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo (CrC6) de cadeia linear ou ramificada, o símbolo R4 representa um átomo de halogéneo ou um grupo alquilo (Q-Có) de cadeia linear ou ramificada ou alcoxi (Ci-C6) de cadeia linear o ramificada, o símbolo R5 representa um grupo alquilo (CrC6) de cadeia linear ou ramificada, os símbolos X e Y, diferentes, representam, cada um, um grupo CO ou S02, o símbolo n representa o número 1, 2 ou 3, o símbolo p representa o número 1, o símbolo Z representa um átomo de enxofre ou de oxigénio, o símbolo A representa um qualquer dos grupos seguintes : • - N - CH - na qual:

o símbolo A, representa com os átomos de azoto e de carbono aos quais se encontra ligado um anel 2-azabiciclo[2.2.2]octano, 2-aza- -biciclo[2.2.1]heptano, per-hidroindol, per-hidroisoindol, indolina, isoindolina, per-hidroquinoleína, per-hidroisoquinoleína, 1,2,3,4-tetra--hidroisoquinoleína, 1,2,3,4-tetra-hidroquinoleína, ciclopenta[b]-pirolidina, 1,3-tiazolidma ou pirrolidina, • ou, -N-CH-, i i Ré R7 na qual: o símbolo Ré representa um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo (Ci-Cé) de cadeia linear ou ramificada, um grupo cicloalquilo (Cí-Ce) ou um grupo mdan-2-ilo, o símbolo R7 representa um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo (CpCé) de cadeia linear ou ramificada, compostos de fórmula geral (I) que compreendem os hidratos da função cetona COCF3 correspondentes, os seus enantiómeros, diastereoisómeros e epímeros assim como os seus sais de adição com uma base aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.

Entre as bases aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico, pode-se citar a título não limitativo o hidróxido de sódio, o hidróxido de potássio, a terbutilamina, a dietilamina, a etilenodiamina, etc... A invenção estende-se igualmente ao processo de preparação dos compostos de fórmula geral (I), caracterizado pelo facto de se utilizar, como composto inicial, um álcool de fórmula geral (II), de que se separaram eventualmente os isómeros por uma técnica clássica de separação : 5

OH / H2N-CH-CH (II) r2 CFj na qual o símbolo R2 tem os significados definidos antes na fórmula geral (I), que se faz reagir . a ou com um aminoácido protegido de fórmula geral (III), de que se separaram eventualmente os isómeros de acordo com uma técnica clássica de separação, por uma técnica clássica de acoplamento peptídico tal como a descrita por W. KONIG e R. GEIGER (Ber., 103, 788, 1970):

Boc - A - C02H (III) na qual o símbolo A tem os significados definidos antes na fórmula geral (I) e o símbolo Boc representa um grupo terc -butoxicarbonilo, para se obter um composto de fórmula geral (IV) :

OH /

Boc - A - CO - NH - CH - CH (IV) I \ R2 cf3 na qual os símbolos A, R2 e Boc têm os significados definidos antes, composto de fórmula geral (IV) : * ou que se desprotege por hidrólise ácida para se obter o composto de fórmula geral (V) :

OH / (V)

H - A - CO - NH - CH - CH l \ R2 cf3 6 na qual os símbolos A e R2 têm os significados definidos antes, com o qual se faz reagir um aminoácido protegido de fórmula geral (VI), de que se separaram eventualmente os isómeros segundo uma técnica clássica de separação, na presença de um agente de acoplamento clássico da síntese peptídica:

Boc - NH - CH - C02H (VI)

I

Ri na qual o símbolo Boc representa um radical butoxicarbonilo e o símbolo Ri tem os significados definidos antes na fórmula geral (I), para se obter um composto de fórmula geral (VII) :

OH /

Boc-NH-CH-CO-A-CO-NH-CH-CH (VII) I 1 \ R, R2 CF3 na qual os símbolos Boc, Rt, A e R2 têm os significados definidos antes, que se submete a uma oxidação para se obter um composto de fórmula geral (VIII), de que se separam eventualmente os isómeros segundo uma técnica clássica de separação,

Boc - NH - CH - CO - A - CO - NH - CH - COCF3 (VIII)

I I R. R2 na qual os símbolos Boc, R(, A e R2 têm os significados definidos antes, * ou que se submete a uma oxidação para se obter um composto de fórmula geral (X): 7

Boc-A-CO-NH-CH-COCF3 (X)

I R2 na qual os símbolos Boc, A e R2 têm os significados definidos antes, que se desprotege em meio ácido para se obter um composto de fórmula geral (XI): H - A - CO - NH - CH - COCF3 (XI)

I r2 na qual os símbolos AeR2 têm os significados definidos antes, que se faz reagir com um aminoácido protegido de fórmula geral (VI) tal como definido anteriormente, para se obter um composto de fórmula geral (VIII) definido anteriormente, b ou com um dipeptido protegido de fórmula geral (XII), obtido mediante acoplamento clássico de dois aminoácidos sob forma racémica ou de enantiómeros puros,

Boc-NH-CH-CO- A-C02H (XII) l R. na qual os símbolos Boc, Ri e A têm os significados definidos antes, para se obter um composto de fórmula geral (VII) definida anteriormente, que se submete a uma oxidação e conduz ao composto de fórmula geral (VIII) definido anteriormente, composto de fórmula geral (VIII) que se desprotege em meio ácido, para se obter um composto de fórmula geral (IX), de que se separam eventualmente os isómeros segundo uma técnica clássica de separação, (IX) H2N-CH-CO-A-CO-NH-CH-COCF3

Rl R-2 na qual os símbolos Ri, A e R2 têm os significados definidos antes, que se faz reagir com um ácido de fórmula geral (XIII), segundo uma técnica clássica de acoplamento peptídico,

na qual os símbolos R5, Z, n, p, R4, R3, X e Y têm os significados definidos antes na fórmula geral (I), para se obter um composto de fórmula geral (I), composto de fórmula geral (I), que se purifica segundo uma técnica clássica de purificação, de que se separam, se assim se desejar, os isómeros segundo uma técnica clássica de separação, e depois, se necessário, que se transforma em sal de adição com uma base aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.

Os compostos de fórmula geral (1) possuem propriedades farmacológicas muito interessantes, em particular inibidoras da elastase leucocitária humana. A este título, eles podem ser utilizados com vantagem num certo número de indicações terapêuticas como o enfisema pulmonar, a bronquite crónica, o síndroma de angústia respiratória aguda do adulto, a fibrose cística, a artrite reumatóide, a glomerunefiite, as inflamações, os síndromas de isquémica-reperfusão, os fenómenos de invasão e de difusão das células malignas, as doenças degenerativas do tecido conjuntivo, o

envelhecimento cutâneo. A actividade inibidora da elastase leucocitária humana foi demonstrada em ensaios in vitro e in vivo. Os compostos apresentaram actividades inibidoras superiores aos produtos de referência tal como a clorometilcetona ou a dicloroisocumarina.

Os substituintes dos compostos de fórmula geral (I) permitiram adicionar à actividade inibidora de elastase leucocitária humana, propriedades de tipo anti-oxidante. A presente invenção tem igualmente por objecto as composições farmacêuticas que contêm como princípio activo pelo menos um composto de fórmula geral (I) ou um dos seus sais de adição com uma base aceitável sob o ponto de vista farmacológico sozinho ou em associação com um ou mais excipiente sou veículos inertes, não tóxicos.

Entre as composições farmacêuticas segundo a invenção, pode-se citar mais particularmente as que são convenientes para administração por via oral, parentérica, nasal, os comprimidos simples ou dragei ficados, os comprimidos sublinguais, as gélulas, as pastilhas, os supositórios, os cremes, as pomadas, os geles dérmicos, os aerossóis, as ampolas bebíveis e injectáveis, etc. A posologia útil varia consoante a idade e o peso do paciente, a natureza e a gravidade da afecção, assim como a via de administração.

Esta podem ser oral, nasal, rectal ou parentérica. De uma maneira geral, a posologia unitária encontra-se compreendida entre 10 pg e 300 mg para um tratamento em 1 ou 3 tomas por 24 horas.

Uma via preferida de administração dos derivados da invenção é a via aerossol sob a forma de pó ou de aerossol líquido.

Os exemplos seguintes ilustram a invenção e não a limitam de modo algum.

Os produtos iniciais utilizados são produtos conhecidos ou preparados de acordo com modos operatórios conhecidos.

As abreviaturas utilizadas nos exemplos são as seguintes :

Boc em vez de terc.-butoxicarbonilo.

Vai em vez de valilo,

Phi em vez de per-hidroindol-2-carbonilo.

Bz em vez de benzilo,

Valinol-CF3 em vez de :

.OH -nh-ch-ch; \

,CH CF,

H3C kCH, w

Preparação A : Acido 4~[4-cloro-3-(4-hidroxi-3,5-diterc.-butilfeniltioacetilamino-sulfonil)-benzoãaminosulfonil]-benzóico Estádio A : Acido 4-hidroxi-3,5-diterc-butilfeniltioacético

Agitam-se durante 7 horas à temperatura de 70°C 144 mmoles de 4-hidroxi-3,5-diterc.-butiltiofenol, 128 mmoles de carbonato de potássio e 144 mmoles de bromoacetato de terc.-butilo em 280 ml de acetonitrilo, sob atmosfera de azoto, e depois durante 12 horas à temperatura ambiente. Após evaporação do solvente, retoma-se o resíduo com água e extrai-se com éter etílico. Lava-se a fase 11 orgânica com uma solução saturada de cloreto de sódio, seca-se e evapora-se. Purifica-se o resíduo mediante cromatografia sobre coluna de sílica utilizando como eluente uma mistura de clorometano/ciclo-hexano (40/60). Dilui-se o óleo isolado em 150 ml de cloreto de metileno e adicionam-se a esta mistura 30 ml de ácido trifluoroacético. Após 18 horas à temperatura ambiente evapora-se o solvente e obtém-se o produto pretendido após precipitação em pentano.

Ponto de fusão : 130°C.

Estádio B : Éster etílico do ácido 4-cloro-3-(4-hidroxi-3,5-diterc.-butilfeniltio-acetilamino-sulfonil) -benzóico A 98 mmoles do produto obtido no estádio anterior e 89 mmoles de 2-cloro-5-etoxicarbonilbenzenossulfonamida em 500 ml de tetra-hidrofurano, adicionam-se 17,9 mmoles de 2-dimetilaminopiridina e 93 mmoles de cloridrato de l-(3-dimetilammopropiI)-3-etiIcarbodiimida. Agita-se o conjunto durante 20 horas à temperatura ambiente. Após evaporação do solvente, retoma-se o resíduo com acetato de etilo. Lava-se a fase orgânica com uma solução de ácido cítrico a 10 % e depois com uma solução saturada de cloreto de sódio. Após secagem e evaporação obtém-se o produto pretendido mediante cristalização em éter isopropílico.

Ponto de fitsão : 144°C.

Estádio C: Ácido 4-cloro-3-(4-hidroxi-3,5-diterc.-butilfeniltioacetilamino-sulfoniI)--benzóico A 7,8 mmoles do composto obtido no estádio anterior dissolvidas em 300 ml de etanol adicionam-se, sob atmosfera de azoto, 155 mmoles de soda IN e 200 ml de água. Decorridas 48 horas de agitação, à temperatura ambiente, evapora-se o 12

etanol. Lava-se a fase aquosa residual com acetato de etilo e depois acidifica-se com ácido clorídrico. Extrai-se o óleo que decanta com acetato de etilo. Após lavagem da fase orgânica com uma solução saturada de cloreto de sódio, secagem e evaporação, retoma-se o resíduo com pentano e obtém-se o produto pretendido que cristaliza. Ponto de fusão : 217°C

Estádio D : Éster etílico do ácido 4-[4-cloro-3-(4-hidroxi-3,5-diterc.-butilfeniltio-acetilamino-sulfonil)-benzoílamino-sulfonil]-benzòico

Obtém-se o produto pretendido mediante reacção de 58 mmoles do composto obtido no estádio anterior com 58 mmoles de 4-etoxicarbomlbenzeno-sulfonamida de acordo com o processo descrito no estádio B. Purifica-se o produto pretendido mediante cromatografia sobre coluna de sílica utilizando como eluente uma mistura de diclorometano/metanol/amoniaco a 28 % (90/10/0,5).

Ponto de fiisão : > 260°C.

Estádio E : Ácido 4-[4-cloro-3-(4-hidroxi-3,5-diterc.-butilfeniltioacetilamino-sulfonil)-benzoãaminosulfonil]-benzóico Saponificam-se 37 mmoles do éster obtido no estádio anterior com 112 ml de soda IN em 250 ml de etanol e 150 ml de água segundo a técnica descrita no estádio C.

Exemplo I : 4-[4-Cloro-3-(4-hidroxi-3,5-diterc.-butilfeniltioacetilamino-sulfonil)--benzoílamino-sulfonilJ-benzoíl-(S) Val-(2S, 3aS, 7aS)Phi-(R,S)-Val- -cf3

Estádio A : Boc-(S)Val-(2S,3aS,7aS)Phi-OBz

Utilizando a técnica de acoplamento peptídico descrita por W. KONIG e 13 13

R. GEIGER (Chem. Ber., 103. 788, 1970), faz-se reagir 400 mmoles de Boc-(S)Val--OH e 400 mmoles de tosilato de (2S,3aS,7aS)Phi-OBz em 700 ml de dimetilformamida (DMF). Após filtração da diciclo-hexilureia formada e evaporação da DMF, dissolve-se o resíduo em acetato de etilo. Lava-se a fase orgânica com hidorgenossulfonato de sódio, com ácido cítrico a 10 % e com uma solução saturada de cloreto de sódio. Após evaporação do solvente retoma-se o resíduo com óxido de isopropilo. Filtra-se a solução e trata-se durante uma hora à temperatura ambiente com 5 g de Noir SOS. Obtém-se então o produto pretendido após filtração.

Estádio B: Boc-(S) Val-(2S,3aS,7aS)Phi-OH

Dissolve-se o composto obtido no estádio anterior em 500 ml de etanol e hidrogena-se durante 20 horas, à temperatura e pressão ambientes, na presença de 5 g de paládio sobre carvão a 5 %. Após filtração e evaporação, retoma-se o resíduo com pentano, filtra-se e obtém-se o produto pretendido.

Estádio C: Boc-(S) Val-(2S,3aS,7aS)Phi-(R,S)-Valinol-CF3

Acoplam-se 20 mmoles do composto obtido no estádio anterior e 20 mmoles de cloridrato de l,l,l-trifluoro-3-amino-4-metil-2-pentanol de acordo com a técnica de acoplamento peptídico descrita no estádio A. Retoma-se o resíduo final obtido após lavagem da fase acetato de etilo e evaporação com éter. Filtra-se uma primeira mistura de diastereoisómeros. Evapora-se o éter e obtém-se a segunda mistura de diastereoisómeros após purificação do resíduo mediante cromatografia sobre coluna de sílica utilizando como eluente uma mistura de diclorometano/acetato de etilo (90/10). Utilizam-se estas misturas de 14 diastereoisómeros tais quais no estádio seguinte.

Estádio D: Boc-(S) Val-(2S,3aS,7aS)PhÍ-(R,S)-CF3

Colocam-se 172 mmoles de cloreto de oxalilo em 50 ml de diclorometano, sob atmosfera de azoto. Arrefece-se o conjunto à temperatura de -55°C e adicionam-se a esta temperatura 35 ml de dimetilsulfóxido em 100 ml de diclorometano. Após 5 minutos de agitação e mantendo a temperatura, adicionam-se lentamente 73 mmoles do composto obtido no estádio anterior em 300 ml de diclorometano. Leva-se então a temperatura até -15°C e mantém-se o conjunto durante 10 minutos sob agitação. Após um novo arrefecimento a -55, -60°C, adicionam-se 75 ml de trietilamina em 100 ml de diclorometano. Após regresso à temperatura ambiente e adição de 300 ml de água, decanta-se a fase orgânica e depois lava-se com uma solução de ácido cítrico a 10 % até pH ácido e depois com uma solução de cloreto de sódio. Após secagem e evaporação purifica-se o resíduo mediante cromatografia sobre coluna de sílica utilizando como eluente uma mistura de diclorometano/etanol (97,5/2,5) obtendo-se o produto pretendido.

Estádio E: (S)-Val-(2S,3aS,7aS)Phi-(R,S)Val-CF3, cloridrato

Dissolve-se o produto obtido no estádio anterior em 350 ml de dioxano e mantém-se uma corrente gasosa de ácido clorídrico nesta solução durante 30 minutos à temperatura ambiente. Mantém-se a agitação durante 15 horas. Evapora-se o solvente e obtém-se o produto pretendido que se seca.

Estádio F : 4-[4-Cloro-3-(4-hidroxi-3,5-diterc. -butilfeniltioacetilamino-sulfonil)--benzoilamino-sulfonil]-benztííl-(S)Val-(2S, 3aS, 7uS)Phi-(R,S)-Val--CF3 15 15

Obtém-se o produto pretendido de acordo com o processo descrito em Tet. Lett., 1219, 1975 a partir do composto obtido no estádio anterior e de 30 mmoles do ácido descrito na preparação A agitadas em 350 ml de DMF. Decorridas 20 horas de agitação, à temperatura ambiente, evapora-se o solvente e retoma-se o resíduo com acetato de etilo e com uma solução a 10 % de ácido cítrico. Decanta-se a fase orgânica, lava-se com água até à neutralidade e evapora-se. Purifica-se o resíduo mediante cromatografía sobre coluna de sílica utilizando como eluente uma mistura de diclorometano/metanol/amoníaco a 28 % (85/15/0,5). Obtém-se assim o produto pretendido que se lava com uma solução de ácido cítrico a 10 % e depois com água até à neutralidade. Após secagem e evaporação retoma-se com pentano e filtra-se.

Microanálise elementar: C% H% N% S% Cl% Calculada 54,66 5,78 6,37 8,75 3,23 Encontrada 54,82 5,93 6,69 8,69 3,48

Exemplo 2 : 4-[4-Cloro-3-(4-hidroxi-3,5-diterc.-butilfeniltioacetilamino-sulfonil)--benzoílaminosulfonilJ-benzoíl-(S) Val-(2S,3aS, 7aS)Phi~ Val-CF3, isómero a

Exemplo 3 : 4-[4-Cloro-3-(4-hidroxi-3,5-diterc.-butilfeniltioacetilamino-sulfoniI)--benzoílaminosulfonilJ-benzoíl-(S) Val-(2S,3aS, 7aS)Phi- Val-CF3f isómero β

Separam-se os isómeros α e β do composto do exemplo l sob a forma de sal de sódio mediante cromatografía líquida sobre coluna de sílica Cl8 utilizando 16 16

como eluente uma mistura de acetonitrilo/hidrogenocarbonato de sódio (0,05M) segundo um gradiente que vai de 30 % a 100 % de acetonitrilo.

Exemplo 4 : [4-Cloro-3-(4-hidroxi-3,5-diterc.-butilfenil-tioacetilamino-sulfonil)-benzoíl-(S)Val-(2S,3aS,7aS)Phi-Val-CF3 [composto não reivindicado}

Obtém-se o produto pretendido de acordo com ,o processo descrito no exemplo 1 mas substituindo no estádio F o ácido descrito na preparação A pelo ácido descrito no estádio C da preparação A. Purifica-se mediante cromatografia sobre coluna de sílica utilizando como eluente uma mistura de diclorometano/metanol/amoníaco (90/10/1).

Microanálise elementar: C% H% N% S% Cl% Calculada 56,41 6,39 6,12 7,00 3,87 Encontrada 56,58 6,81 6,07 6,80 3,96

Estudo farmacológico dos derivados da invenção Exemplo 5 : Actividade inibidora da elastase leucocitária humana in vitro

Determina-se a potência dos compostos da invenção pelo nível de inibição da acção da elastase leucocitária humana sobre um substrato peptídico de baixo peso molecular de acordo com a técnica descrita por B.M. ASHE e colab., (J. Biol. Chem., 256, 11603 - 11606, 1981). Mede-se esta actividade seguindo a cinética de hidrólise do substrato que leva à libertação de paranitroanilina que absorve para um comprimento de onda de 410 nm.

Reagente :

Enzima : Elastase de saliva leucocitária humana (Elastin Products Co.) solubilizada a 1000 Ul/ml de água destilada e congelada em alíquotas de 50 μΐ a -20°C.

Substrato : metoxisuccinil-L-alanil-L-alanil-prolil-valina-paranitroanilida (Sigma Chimie).

Tampão : Tris 0,1; NaCl 0,5M; pH = 7,8.

Material :

Espectrofotómetro termostatizado a 37°C equipado com um passador de cuba.

Cuba de 1 ml de poliestireno.

Banho-maria a seco regulado a 37°C.

Modo operatório :

Em uma cuba introduz-se . - 970 μΐ de tampão 10 μΐ do produto a ensaiar ou do solvente (concentrado x 100) 10 μΐ de elastase leucocitária de saliva humana diluída a 1/10° - Agitação e incubação durante 15 minutos à temperatura de 37°C A reacção é iniciada pela adição de 10 μΐ de substrato.

Introduz-se a cuba no espectrofotómetro, regista-se a densidade óptica em função do tempo a 410 nm a 37°C. Mede-se a velocidade inicial para cada concentração de produto (ou testemunha solvente) estudada. Calculam-se percentagens de inibição em relação à testemunha solvente .

Percentagem de inibição = 100 x [(velocidade testemunha - velocidade do produto ensaiado) / velocidade testemunha]. 18

Calculam-se as concentrações inibidoras 50 (CI50) a partir das percentagens de inibição por regressão linear simples. Os resultados obtidos neste ensaio são para o composto do exemplo 1 CI50 = 26 nM, para o composto do exemplo 4 : CI50 = 46 nM.

Exemplo 6 : Actividade inibidora in vivo : modelo de edema agudo hemorrágico no criceto. A instilação traqueal no criceto de uma preparação purificada de elastase leucocitária de saliva humana leva a uma hemorragia aguda que pode ser quantificada pela medida da concentração de hemoglobina na lavagem bronco-alveolar 18 horas após a instilação de elastase.

Efectua-se o estudo em cncetos machos com 120 a 140 g (Syrian Golden, n = 10 por lote). Anestesiam-se os animais com pentobarbital para a dose de 40 mg/kg por via intraperitoneal.

Anestesiam-se os cricetos e expõe-se a traqueia cirurgicamente. Administram-se os produtos a ensaiar por meio de uma agulha directamente na traqueia num volume de 0,1 ml para a dose de 15 nM. Administra-se a elastase leucocitária de saliva humana 18 horas após a administração do produto por via intratraqueal, para a dose de 50 unidades por animal, sob um volume de 0,2 ml.

Sacrifícam-se os animais por meio de uma dose letal de pentobarbital, 3 horas após a instilação da elastase e efectua-se uma lavagem bronco-alveolar com soro fisiológico. Quantifica-se o grau de hemorragia pelo método colorimétrico que permite o doseamento da concentração de hemoglobina (ensaio de Boeringer - combinação hemoglobina). 19

Os resultados são expressos em percentagem de inibição da hemorragia. O composto da presente invenção constitui um inibidor efectivo da elastase leucocitária humana que previne ou diminui a hemorragia induzida pela instilação intraqueal de elastase leucocitária humana. Os resultados obtidos neste ensaio para o composto do exemplo 1 demonstram uma duração de acçâo assinalável com uma inibição de 53 % para o tempo de 18 horas após administração intratraqueal e para o composto do exemplo 4, uma inibição de 23 % nas mesmas condições.

Exemplo 7: Estudo da peroxidação lipídica A/ Praticou-se o estudo sobre microsomas hepáticos na presença de Fe3 + (100 μΜ) e ascorbato (100 μΜ). Realizou-se a dosagem do malondialdeído (MDA) pelo método do ácido tiobarbitúrico (espectrofotometria λ = 532 nm) segundo a técnica descrita por N. PAYA e colab. (Biochem. Pharmacol., vol. 44, n° 2, p. 205-214, 1992). O produto do exemplo 1 possui uma actividade inibidora 50 % (CI50) de IO"6 M sobre a peroxidação lipídica no sistema estudado. B/ Estudou-se a acção dos derivados da presente invenção sobre a modificação oxidativa das LDL induzida pelo sulfato de cobre.

Incubam-se as LDL humanas 24 horas na presença de sulfato de cobre 10'5M e na ausência ou na presença dos compostos estudados (10'9 M a ÍO^M). após a incubação, avalia-se a peroxidação das LDL por electroforese sobre gel de agar e pela formação de malondialdeído (MDA) (Patharsrathy S et al., J. Clin. Invest. 77, 641 -644, 1986).

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Avalia-se a actividade dos produtos pelo cálculo das concentrações que reduzem de 50 % (CI50) a produção de MDA em relação às experiências testemunhas.

Os compostos dos exemplos 1 e 4 apresentam uma CI50 de 3.10'7 M sobre a peroxidação das LDL humanas induzida pelo sulfato de cobre.

Exemplo 8: Composição farmacêutica Fórmula de preparação para 1000 comprimidos doseados a 10 mg

Composto do exemplo 1................................................................................... 10 g Hídroxipropilcelulose.......................................................................................100 g

Amido de trigo................................................................................................ 10 g

Lactose............................................................................................................100 g

Estearato de magnésio.................................................................................... 3 g

Talco................................................................................................................ 3 g

Lisboa, 13 de Março de 2000

Claims (9)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Compostos de fórmula geral (I) :

na qual: o símbolo Ri representa um grupo alquilo (Ci-C6) de cadeia linear ou ramificada ou cicloalquilo (C3-C7), o símbolo R2 representa um grupo alquilo (CrC6) de cadeia linear ou ramificada ou cicloalquilo (C3-C7), o símbolo R3 representa um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo (Ci-C6) de cadeia linear ou ramificada, o símbolo R4 representa um átomo de halogéneo ou um grupo alquilo (CrQ) de cadeia linear ou ramificada ou alcoxi (C]-C6) de cadeia linear o ramificada, o símbolo R5 representa um grupo alquilo (Ci-C6) de cadeia linear ou ramificada, os símbolos X e Y, diferentes, representam, cada um, um grupo CO ou S02, o símbolo n representa o número 1, 2 ou 3, o símbolo p representa o número 1, o símbolo Z representa um átomo de enxofre ou de oxigénio, o símbolo A representa um qualquer dos grupos seguintes :

• - N - CH - na qual : 2 o símbolo Α[ representa com os átomos de azoto e de carbono aos quais se encontra ligado um anel 2-azabicicIo[2.2.2]octano, 2-aza--biciclo[2.2.1]heptano, per-hidroindol, per-hidroisoindol, indolina, isoindolina, per-hidroquinoleína, per-hidroisoquinoleína, 1,2,3,4-tetra--hidroisoquinoleína, 1,2,3,4-tetra-hidroquinoleína, ciclopenta[b]-pirolidina, 1,3-tiazolidina ou pirrolidina, • ou, - N - CH -, R<> Rt na qual o símbolo Ré representa um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo (CrC6) de cadeia linear ou ramificada, um grupo cicloalquilo (C3-C6) ou um grupo indan-2-ilo, o símbolo R7 representa um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo (C)-C6) de cadeia linear ou ramificada, compostos de fórmula geral (I) que compreendem os hidratos da função cetona COCF3 correspondentes, os seus enantiómeros, diastereoisómeros e epímeros assim como os seus sais de adição com uma base aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.

2. Compostos de fórmula geral (I) de acordo com a reivindicação 1 tais que o símbolo A representa o grupo de fórmula geral - N - CH - tal como definido na reivindicação 1

3. Compostos de fórmula geral (I) de acordo com a reivindicação 1 tais 3 que o símbolo A representa um anel per-hidroindol.

4. Compostos de fórmula geral (I) de acordo com a reivindicação l tais que o símbolo n representa o número 1.

5. Compostos de fórmula geral (I) de acordo com a reivindicação 1 tais que o símbolo Z representa um átomo de enxofre.

6. Composto de fórmula geral (I) de acordo com a reivindicação 1 que é o 4-[4-cloro-3-(4-hidroxi-3,5-diterc-butilfeniltioacetilaminosulfonil)-benzoílamino-sulfonil]-benzoíl-(S)Val-(2S,3aS,7aS)Phi-(R,S)Val-CF3.

7. Processo para a preparação dos compostos de fórmula geral (I) de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se utilizar, como composto inicial, um álcool de fórmula geral (II), de que se separaram eventualmente os isómeros por uma técnica clássica de separação : OH / H2N-CH-CH (II) I \ R2 cf3 na qual o símbolo R2 tem os significados definidos antes na fórmula geral (I), que se faz reagir : a ou com um aminoácido protegido de fórmula geral (III), de que se separaram eventualmente os isómeros de acordo com uma técnica clássica de separação, por uma técnica clássica de acoplamento peptídico : Boc - A - C02H (III) na qual o símbolo A tem os significados definidos antes na fórmula geral (I) e o símbolo Boc representa um grupo terc.-butoxicarbonilo, para se obter um composto de fórmula geral (IV) : OH / Boc - A - CO - NH - CH - CH I \ R2 cf3 (IV) na qual os símbolos A, R2 e Boc têm os significados definidos antes, composto de fórmula geral (IV): * ou que se desprotege por hidrólise ácida para se obter o composto de fórmula geral (V) : OH / H - A - CO - NH - CH - CH (V) R2 cf3 na qual os símbolos A e R2 têm os significados definidos antes, com o qual se faz reagir um aminoácido protegido de fórmula geral (VI), de que se separaram eventualmente os isómeros segundo uma técnica clássica de separação, na presença de um agente de acoplamento clássico da síntese peptídica: (VI) Boc - NH - CH - C02H R na qual o símbolo Boc representa um radical butoxicarbonilo e o símbolo Rt tem os significados definidos antes na fórmula geral (I), para se obter um composto de fórmula geral (VII) : 5 OH / Boc-NH-CH-CO-A-CO-NH-CH-CH (VII) I I \ Ri R2 CF3 na qual os símbolos Boc, Ri, A e R2 têm os significados definidos antes, que se submete a uma oxidação para se obter um composto de fórmula geral (VIII), de que se separam eventualmente os isómeros segundo uma técnica clássica de separação, Boc-NH-CH-CO-A-CO-NH-CH-COCFj (VIII) I 1 R. R2 na qual os símbolos Boc, R1; A e R2 têm os significados definidos antes, * ou que se submete a uma oxidação para se obter um composto de fórmula geral (X): Boc - A - CO - NH - CH - COCF3 (X) I R2 na qual os símbolos Boc, A e R2 têm os significados definidos antes, que se desprotege em meio ácido para se obter um composto de fórmula geral (XI): H-A-CO-NH-CH-COCF3 (XI) I r2 na qual os símbolos A e R2 têm os significados definidos antes, que se faz reagir com um aminoácido protegido de fórmula geral (VI) tal como definido anteriormente, para se obter um composto de fórmula geral (VIII) definido anteriormente, b ou com um dipeptido protegido de fórmula geral (XII), obtido mediante acoplamento clássico de dois aminoácidos sob forma racémica ou de enantiómeros puros, Boc-NH-CH-CO-A-C02H (ΧΠ) I Ri na qual os símbolos Boc, Ri e A têm os significados definidos antes, para se obter um composto de fórmula geral (VII) definido anteriormente, que se submete a uma oxidação e conduz ao composto de fórmula geral (VIII) definido anteriormente, composto de formula geral (VIII) que se desprotege em meio ácido, para se obter um composto de fórmula geral (IX), de que se separam eventualmente os isómeros segundo uma técnica clássica de separação, H2N-CH-CO-A-CO-NH-CH-COCF3 (IX) I I Ri R2 na qual os símbolos Ri, A e R2 têm os significados definidos antes, que se faz reagir com um ácido de fórmula geral (XIII), segundo uma técnica clássica de acoplamento peptídico,

na qual os símbolos R5, Z, n, p, R*, R3, X e Y têm os significados definidos antes na fórmula geral (I), 7 para se obter um composto de fórmula geral (I), composto de fórmula geral (I), que se purifica segundo uma técnica clássica de purificação, de que se separam, se assim se desejar, os isómeros segundo uma técnica clássica de separação, e depois, se necessário, que se transforma em sal de adição com uma base aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.

8. Composições farmacêuticas que contêm como princípio activo pelo menos um composto de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 6, sozinho ou em associação com um ou mais excipientes ou veículos inertes, não tóxicos, aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico.

9. Composições farmacêuticas de acordo com a reivindicação 8 que contêm pelo menos um princípio activo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 6 utilizado como inibidor da elastase leucocitária humana a título de tratamento principal ou complementar das doenças degenerativas do tecido conjuntivo como o enfísema pulmonar, as perturbações inflamatórias como a artrite reumatóide, patologias pulmonares do tipo do síndroma da angústia respiratória aguda, da fibrose cística, da bronquite crónica, das lesões tecidulares induzidas pelo síndroma de isquémia-reperfusão e para o tratamento tópico sobre a pele a fim de inibir a elastólise.

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