PT670493E - Ensaio para a determinacao de proteina numa amostra biologica - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "ENSAIO PARA A DETERMINAÇÃO DE PROTEÍNA NUMA AMOSTRA BIOLÓGICA”

Antecedentes do Invento

Campo do Invento O presente invento está relacionado de um modo geral com a detecção de proteína e, mais particularmente, com uma nova composição e método para a determinação de proteína numa amostra biológica utilizando uma fenolsulfoneftaleína particular como indicador de erro de proteínas, tampão e um poliéter alifático-policarbonato presente numa quantidade de 0,1 a dez por cento por peso.

Descrição da Técnica Anterior A determinação da presença de proteína numa amostra biológica é da maior importância no diagnóstico de vários estados patológicos que afectam o rim, sistema circulatório e sistema nervoso central. Assim, é frequentemente necessário medir quantitativamente e/ou qualitativamente a proteína (albumina) na urina. Isto é especialmente importante no diagnóstico de diabetes e doença renal. A proteína predominante nas determinações de diabetes é a albumina; assim, o sistema modelo para testes de proteína na urina é a albumina. São do conhecimento geral os testes para determinação da presença -2- de albumina na urina. O método mais económico e conveniente para a determinação de albumina envolve o humedecimento de uma tira de papel teste com um indicador de erro de protéina com uma pequena quantidade de urina. Se a albumina estiver presente na amostra de urina, a tira do teste indicará isto simplesmente mudando de cor. A cor observada normalmente varia dependendo da concentração de albumina na amostra.

As tiras de testes contendo indicadores de proteína de fenolsulfoneftaleína para a determinação de proteína estão descritos em EP 517 050 e em EP 517 054.

Se bem que as tiras teste do tipo acima referido sejam veículos convenientes e rápidos para a determinação de proteína no ponto de aplicação, um dos problemas que ocorre é o chamado efeito de gravidade específica. Tipicamente, os testes para a proteína da urina usam um corante indicador de pH que apresenta uma mudança no pKa quando complexado com proteína (o "erro da proteína" dos indicadores de pH). Este método não proporciona separação suficiente entre urina negativa e a que contem concentrações vestigiais de proteína (aproximadamente 15 microgramas por decilitro) e também dá leituras de falsos positivos na urina com gravidade específica elevada. Encontrou-se que a adição de certos compostos de policarbonato ao indicador de erro da proteína baixa a reactividade inicial do papel reagente e baixa a tendência para as amostras de urina com gravidade específica alta darem uma leitura positiva da proteína.

Um outro problema que ocorre com a produção de tais sistemas é que o material absorvente, geralmente papel de filtro, não possui reactividade consistente (i.e. uniforme) com os reagentes usados no sistema. Os lotes de papel de filtro muitas vezes interactuam com os reagentes necessários para a detenninação de proteína, num nível superior ao da reacção do material da matriz veículo com composições de reagentes para a determinação de outros analitos.

As dificuldades de ajustamento das formulações para obter reactividade uniforme entre a composição de reagentes e o material da matriz veículo empregue, tem sido um problema constante nesta área e de importância significativa para a indústria. Inicialmente pensava-se que o acerto do pH da composição dos reagentes ultrapassaria o problema da variabilidade na reactividade da composição de reagente e do material da matriz veículo. No entanto, os acertos do pH não foram eficazes para todos os lotes de material da matriz veículo. O resultado pretendido foi conseguir uma composição de reagentes que resultasse numa cor negativa mais clara e numa cor positiva mais escura. Encontrou-se que o Triton X-100, um tensioactivo de polietileno, tem um impacto na reactividade mas produz uma cor mais clara nos extremos negativo e positivo da gama de cor.

Estudaram-se outros meios para acertar a reactividade. Por exemplo, todos os componentes da composição de reagentes foram mudados mas estas variações não foram eficazes na produção da cor negativa mais clara pretendida e numa cor positiva mais escura. Introduziu-se também álcool polivinílico na composição de reagentes e encontrou-se que é ineficaz no controlo das características de reactividade dos reagentes com diferentes lotes de matriz veículo.

Assim, mesmo com controlo de qualidade adequado e tentando implementar restrições eficazes de despiste e de inventário, os problemas de reactividade entre diferentes lotes de material da matriz veículo não foi controlado eficazmente. 4. (Μη

Para ultrapassar ο problema da reactividade, referido atrás, na determinação da proteína, formulou-se e preparou-se uma composição de reagentes única de forma a que a variabilidade na reactividade entre a composição de reagentes e a matriz veículo fosse substancialmente eliminada. Ainda, a redução da variabilidade do pH da urina nos resultados dos ensaios, é um outro benefício observado na composição de reagentes.

Sumário do Invento O presente invento proporciona uma tira de teste analítico para a detecção de proteína numa amostra biológica compreendendo uma matriz veículo absorvente, impregnada com uma fenolsulfoneftaleína, indicador de erro de proteína, seleccionada do grupo 3,4,5,6-tetrabromofenolsulfoneftaleína (TBPSP), 3',3"-dinitro-3,4,5,6-tetrabromofenolsulfoneftaleína (DNT) e 3',3"-dibromo-3,4,5,6-tetrabromofenolsulfoneftaleína (DBTB), um tampão adicionado para ajustar o pH entre 1,5 e 4,5 e um poliéter-policarbonato presente numa quantidade igual a 0,1 a 10% por peso.

De acordo com o invento, usa-se um processo de impregnação de duplo banho do veículo absorvente com a composição de reagentes em que o tampão e, facultativamente, um corante de fundo como seja FD&C Amarelo #5 e FD&C #3, são primeiro impregnados no veículo absorvente com uma solução aquosa e a fenolsulfoneftaleína indicador de erro de proteína e os compostos poliéter alifático-policarbonato são impregnados num segundo banho usando um solvente não aquoso, como seja uma solução de álcool.

Um outro aspecto do presente invento é dirigido a um método para a detecção de proteína numa amostra biológica em que a tira de teste analítico é -5- molhada na amostra biológica. A tira teste molhada compreende um veículo absorvente impregnado com a composição de reagentes descrita atrás. A tira teste é observada para detectar qualquer alteração de cor indicadora da presença e quantidade de proteína na amostra biológica.

Descrição dos Modelos de Realização Preferidos

I

De acordo com o invento, descobriu-se que as tiras teste para a determinação de proteína em fluidos biológicos podem ser preparadas sem quaisquer problemas de reactividade significativos, entre a matriz veículo e a composição de reagentes, para vários lotes de matriz veículo. Ainda, encontrou-se que a influência da variabilidade da urina nos limites de detecção, tanto para a detecção visual como para a detecção instrumental é reduzida pela composição de reagentes do presente invento. O presente invento é conseguido através da impregnação de uma matriz veículo absorvente com a composição de reagentes. A matriz veículo absorvente é preferencialmente papel de filtro. Um papel de filtro preferido é o de grau 204 adquirido à Ahlstrom Filtration Inc., o qual contem uma mistura de madeira e pasta de celulose. Este papel de filtro difere de lote para lote. Anteriormente, restrições de despiste e inventário foram ineficazes para garantir um desempenho óptimo do reagente.

Outros materiais úteis como veículo absorvente incluem feltro, tiras de cerâmica porosa e fibras de vidro entrelaçadas (descritas na Patente U.S. No. 3,846,247). São igualmente sugeridos, como veículos absorventes adequados para tiras teste, materiais tais como madeira, tecido, materiais esponjosos e substâncias argilosas (como descrito na Patente U.S. No. 3,552,928). Encontrou-se, no entanto, que o papel de filtro é especialmente adequado apesar das variações que existem de lote para lote. 6-U^ A matriz veículo absorvente é impregnada com uma composição de reagentes conforme indicado atrás. Encontrou-se que um processo de impregnação de duplo banho usando um primeiro banho aquoso e um segundo banho com solução de solvente não aquoso, proporciona resultados óptimos. A tira absorvente contem um tampão para justar o pH entre cerca de 1,5 e 4,5. Preferencialmente, o sistema é ajustado a um pH de cerca de 3,5 e mais preferencialmente cerca de 3,7. No entanto, a natureza do sistema tampão não é crítica. Pode ser empregue qualquer material tamponante conhecido. Entre os tampões preferidos encontram-se o ácido cítrico e o citrato de sódio.

Se o tampão for mais de 9,3 g/dl (gramas por decilitro) o escorrimento dos reagentes pode ser um problema e se o tampão for inferior a 7,1 g/dl o poder tamponante pode não ser suficiente. Uma quantidade de tampão equivalente a cerca de 8,7 g/dl é óptima.

Para além do material tamponante, facultativamente, podem ser adicionados corante vermelho ou amarelo durante o primeiro banho. Pode ser usado qualquer corante vermelho adequado para composições de reagentes. No entanto, um material preferido é o corante vermelho FD&C #3. Um corante amarelo preferido é o amarelo FD&C #5. O corante mascara a coloração da urina nos níveis de cor negativos. Outros corantes, tensioactivos e similares podem ser também adicionados ao primeiro banho como componentes facultativos adicionais.

De um modo geral, pode ser usado o corante em excesso de aproximadamente 40 g/100 litros e menos de 60 g/100 litros. Para o azul de tetrabromofenol (TBPB) é óptimo 5g/100 litros. -7-

Num segundo banho usa-se uma solução de um solvente não aquoso, preferencialmente etanol, para reduzir a evaporação. O indicador de erro de proteína fenolsulfoneftaleína poli-halogenado a ser empregue como composto indicador é uma tetrabromofenolsulfoneftaleína seleccionada do grupo 3,4,5,6-tetrabromofenolsulfoneftaleína (TBPSP); 3',3"-dinitro-3,4,5,6-tetrabromofenol-sulfoneftaieína (DNTB); 3',3"-dibromo-3,4,5,6-tetrabromofenolsulfoneftaleína (DBTB). : O outro ingrediente essencial da segunda composição de reagentes de banho é um material poliéter alifático-policarbonato. Os materiais preferidos são preparados usando difenilcarbonato e um composto hidroxilo difimcional (álcool) ou misturas de compostos hidroxilo difuncionais. A identificação dos policarbonatos, os seus pesos moleculares e os alcoóis usados na sua preparação estão apresentados na tabela que se segue: TABELA 1 N° de Identificação Composto álcool Razão Peso Molecular KOK 9209 tetraetilenoglicol/ 1 1795 hexanediol-1,6 1 KOK 10000 tetraetilenoglicol/ 1 4187 hexanediol-1,6 1 KOK 10000 trietilenoglicol - 1972 KOK 10002 trietilenoglicol/ tetraetilenoglicol 1 1972 KOK10071 poliéter L-950 (polipropileno-glicol PM cerca de 420 g/mole) - 1594 O último material da Tabela 1 é particularmente preferido. Este copolímero de óxido de polipropileno e carbonato, preparado através da conden- .Lu, ^ sação, catalisada por butóxido de titânio (IV), do material Polyether L950® (Bayer AG) com difenilcarbonato tem a estrutura

O material de partida Polyether L950 é um polipropilenoglicol difuncional com um peso molecular médio de cerca de 420, preparado através da polimerização de óxido de propileno na presença de 1,2-propanediol. Uma cadeia de polímero cresce a partir de cada um dos resíduos diol, resultando num poliéter linear com cada um dos extremos terminando num grupo hidroxilo secundário (i.e., um grupo hidroxilo funcionalidade de dois). O material poliéter- policarbonato resulta da ligação de resíduos poliéter com ligações carbonato nas seguintes proporções:

atm (g) atmrinoD

Poliéter L 950 4248 10,22

Difenilcarbonato 1581 7,39

Ti(OC4H9)4 0,6 0,0018

Observou-se que é importante limitar a quantidade de material poliéter alifático-policarbonato a 10% por peso ou menos para redução do efeito da gravidade específica. Relativamente à redução dos efeitos do papel de filtro observou-se ser desejável limitar a quantidade de material poliéter alifátio policarbonato para dois por cento por peso ou menos.

Os exemplos que se seguem estão apresentados para descrever realizações preferidas e utilidade do presente invento e não pretendem limitar o presente invento a menos que de outro modo seja estabelecido nas reivindicações apensas. -9- -9-

{/L/wj EXEMPLO 1 A. Preparação de papel reagente para proteínas, contendo policarbonatos, e reagentes testemunha sem polímero.

Estes reagentes para proteína não tamponados foram usados com soluções teste tamponadas para fins de identificação de polímeros úteis.

Solução de banho: Azul de tetrabromofenol, TBPB, 0,3 mM e 0,1% ou 1,0% (p/v) de policarbonato em THF. (Os reagentes testemunha foram preparados com soluções de banho idênticas que não continham um polímero).

Os banhos foram usados para impregnar papel Whatman CCP-500 usando uma velocidade de imersão de 4 pés/min e temperaturas de secagem de 60°C. O papel reagente foi processado em blocos de tiras reagente de 0,2 x 0,2 polegadas. B. Medição da reactividade dos reagentes 1. Amostras. Os reagentes foram mergulhados em tampão citrato de potássio 0,20M a pH 3,5 ou 4,0, e contendo ou não 20 mg/dl de Albumina Sérica Bovina (HSA).

-10- (/MJ C. Resultados e discussão 1. Dados. TABELA 2: Resultados de pH 3,5 K/S a 630 nm aos 20 i s (desvio padrão) Polímero Sem HSA HSA 20 mg/dl Declive % de redução do branco (1) % de redução do declive (2) Nenhum 0,088 (0,005) 0,375 (0,020) 0,0144 - - KOK 9209 (0,1% p/v) 0,068 (0,007) 0,271 (0,008) 0,0102 56 29 KOK 10000 (0,1% p/v) 0,079 (0,020) 0,283 (0,008) 0,0102 25 29 KOK 10000 (1,0% p/v) 0,069 (0,002) 0,229 (0,007) 0,0080 53 44 KOKIOOOl (0,1% p/v) 0,077 (0,003) 0,322 (0,018) 0,0123 31 15 KOK 10002 (0,1% p/v) 0,071 (0,006) 0,327 (0,008) 0,0128 47 11 (1) O K/S do papel testemunha branco é de aproximadamente 0,052; assim a % de redução no branco-[{(K/S do branco:sem polímero-0,052) - (K/S do branco:com polímero-0,052)}] / (K/S do brancoisempolímero -0,052)] x 100 (2) % de Redução no declive = [(declive:sem polímero-declive com polímero) / (declive: sem, polímero)] x 100

Resultados semelhantes foram obtidos a pH 4,0. - 11 - (/Λη 2. , Discussão. Na solução tampão a pH 3,5 e 4,0, alguns policarbonatos reduzem o branco mais do que reduzem o declive. Postulou-se a partir desta experiência que a adição de policarbonatos ao reagente para proteína completo (contendo um tampão e TBPS) baixaria a cor inicial (branco) e possivelmente a incidência de falsos positivos. EXEMPLO 2 A. TBPB- Formulação de reagente para proteína 10% KOK 10 071 1. Solução de estoque de tampão. Dissolver 14,57 gramas (g) de ácido cítrico, 10;93 g de citrato de sódio e 7,2 mg de amarelo FD&C #5 em 154 ml de água destilada; pH 3,46. 2. Primeiro banho, (a) 17,94 g de solução de estoque de tampão; (b) 5,0 g de etanol e (c) 2,47 g de água destilada. 3. Segundo banho, (a) 7,5 mg de TPBP; (b) 2,5 g de KOK 10 071 e (c) q.s. para 25 ml com THF. B. A formulação do controlo foi preparada com o mesmo primeiro banho e com um segundo banho não contendo polímero.

Os banhos permitiram a impregnação de papel E & D 237C usando uma velocidade de imersão de 4 pés por minuto (pés/min) e secagem a temperaturas de 80°C para o primeiro banho e 60°C para o segundo banho. - 12- C. Medição da reactividade dos reagentes. 1. Amostras. As amostras usadas para testar foram (1) um conjunto de urinas negativas com SG média e HSA adicionada ao conjunto de urinas com SG média para obter uma concentraçãode 15 mg/dl e (2) três amostras de urina com SG elevada clinicamente negativas1 (SG = A, 1,028; B 1,027; e C, 1,027). As reactividades destas amostras foram medidas num instrumento CLINITEK® 200 (três medições por amostra). 2. Os dados estão apresentados abaixo como K/S para cada uma das amostras. Ainda, a contribuição por cada uma das amostras de urina com SG elevada está apresentada como [(K/SSg eievada-K/Sbranco)] x 100. Esta contribuição é a percentagem da reactividade de 15 mg/dl de HSA causada pela urina com SG elevada. TABELA 3

Efeito de 10% KOK 10,071 no desempenho do reagente para proteína K/S a 630 nm (desvio padrão)

Urina SG média Urina SG elevada Contribuição de urina SG elevada

HSA

Reasente Sem HSA 15 me/ml A B C A B C Sem polímero 0,165 (0,016) 0,29 (0,013) 0,258 (0,012) 0,238 (0,017) 0,240 (0,019) 74 58 60 10%KOK 10071 0,073 (0,005) 0,137 (0,002) 0,088 (0,013) 0,092 (0,004) 0,086 (0,011) 23 30 20 1 Clinicamente negativo é definido como negativo pelo teste Sulfosal e contendo HSA <2 mg/dl e proteína total < 10 mg/dl. O objectivo é obter uma resposta para urina clinicamente negativa que seja uma pequena porção da resposta dada por 15 mg/dl de HSA. η(Μη

Tanto a cor inicial como a reactividade a HSA são reduzidas por 10% KOK 10071. No entanto, as contribuições da urina negativa com SG elevada são também reduzidas consideravelmente. No entanto, a presença de 10% do polímero KOK 10071 parece reduzir a possibilidade das amostras de urina com SG elevada darem resultados positivos falsos.

Um outro exemplo comparou reagente para proteína contendo TBPB com e sem 4% de KOK 10071. EXEMPLO 3 A. Formulação de reagente para proteína TBPB - KOK (quantidades para preparar banhos de 100 ml) 1. O primeiro banho (citrato de sódio 0,45 M - pH 3,70, Amarei FD&C 0,03mM; solução aquosoa). (a) 50 ml de citrato de sódio 0,9M, pH - 3,70; (b) 3,0 ml de amarelo FD&C #5; e (c) 47 ml de água destilada. 2. Segundo banho (TBPB 0,30 mM, 4% (p/v) de KOK 1007; em THF). (a) 30 ml de TBPB 1 mM em THF; (b) 40 ml 10% KOK 10071 em THF; e (c) 30 ml de THF. A formulação testemunha foi preparada com o mesmo primeiro banho e com um segundo banho que não continha polímero. Os banhos foram impregnados em papel E&D 237C como no Exemplo II. u.ÍMy B. Medição da reactividade dos reagentes 1. Amostras. As amostras em urina com SG média foi-lhes adicionada HSA conforme descrito atrás. Uma urina com SG elevada clinicamente negativa (A; SG = 1,030; pH = 5,6) e um conjunto de urinas com SG elevada alcalinas (B; SG=1,024; pH = 8,7) foram usados para testar possíveis leituras de falsos positivos. A urina com SG elevada "B" foi usada como um exemplo do "pior caso" para testar os limites do efeito do polímero KOK. Seis medições repetidas de cada amostra foram feitas em instrumentos CLINITEK® 200+ e os dados estão apresentados abaixo: TABELA 4

Efeito de 4% KOK 10.071 no desempenho do reagente para proteína K/S a 630 nm (desvio padrão com 90% de confiança)

Urina SG média Urina SG elevada Contribuição de urina SG elevada Reagente Sem HSA HSA 15 mg/ml A B A B Sem polímero 0,268 (0,012) 0,458 (0,023) 0,379 (0,011) 0,430 (0,023) 58 85 4%KOK 10071 0,110 (0,002) 0,241 (0,007) 0,145 (0,004) 0,177 (0,004) 26 51

Tal como no segundo exemplo, a cor inicial e a reactividade com HSA foram reduzidas pelo policarbonato KOK 10071. Também, de modo semelhante, as contribuições das amostras negativas com SG elevada são reduzidas relativamente ao reagente sem policarbonato. Isto confirma que o - 15-

de as amostras de urina com SG elevada policarbonato reduz a possibilidade darem resultados falsos positivos. EXEMPLO 4

Uma solução aquosa (10 litros), ajustada a um pH final de 3,7, tendo 417 g de citrato de sódio, 455 g de ácido cítrico, 0,29 g de amarelo FD&C #5 e 0,5 g de vermelho FD&C #3 e 24 g de PVA foi usada para impregnar papel de filtro 204C.

Após o primeiro banho ter secado (a temperaturas de 80-100°C) o papel de filtro foi impregnado com uma segunda solução. A segunda solução (10 litros) foi uma solução de 5 g de tetrabromofenolsulfoneftaleína em etanol, 50 g de ácido cítrico e 150 g de copolímero de óxido de propileno carbonato preparado pela condensação de polieter L 950® (Bayer AG) com difenilcarbonato, catalisada por butóxido de titânio IV. O material resultante foi então seco a temperaturas entre 35 e 105°C. EXEMPLO 5

Os lotes de papel que diferem apenas em lotes de pasta causam grandes diferenças de reactividade quando usados com regente para proteínas sem KOK (Tabela 5). As diferenças na ligação do corante e proteína à fibra do papel foi proposta como a causa das diferenças entre lotes. Ainda, foi proposto que o aumento da ligação da proteína ao papel diminuiria o fundo do ensaio e que o aumento da ligação da proteína ao papel diminuiria a resposta à proteína do ensaio. A Tabela 5 baseia-se na utilização de uma fórmula central semelhante à do Exemplo 4 sem KOK. -16- Ι/ΐΑη TABELA 5 CLINITEK-10 CLINITEK-200 Média Média Média Média

Grau Lote Neg. Pos. Neg. Pos. 237 7775 672 525 695 479 menos fundo 237 8079 745 549 824 511 237 8137 753 560 839 529 237 14014 706 551 743 510 237 8977 743 586 800 572 237 9241 740 595 787 555 237 . 9041 — — 761 570 204 331 749 555 838 525 204 225 772 578 866 545 mais fundo 204 342 760 562 850 523 204 14011 755 575 818 548 204 14013 759 584 823 555 204 306 740 563 805 537 204 238 767 595 841 564 204 9115 — — 839 572 A reactividade do reagente é expressa como números codificados para dois instrumentos Miles separados, o CLINITEK-10 e o CLINITEK-200. Os números codificados são baseados na % de reflectância na absorvância máxima dos corantes entre 610 e 660 nm. Números codificados mais baixos indicam maior reactividade e mais cor de fundo. O pH do reagente é 3,46 para estas determinações. O papel de filtro graus 237 e 204 são produtos da Alhstrom Filtration de Mt. Holly Springs, Pennsylvania. A tira de teste analítico preparada de acordo com o Exemplo 4 foi molhada em urina e a alteração de cor resultante foi observada e registada como uma indicação da proteína na amostra biológica de urina.

Uma grande redução do efeito do lote de papel de filtro foi conseguida com o reagente Proteína 4 "Pro 4" (baseado no Exemplo 4) como se pode ver na Tabela 6. Esta redução aumentou a manufacturabilidade e tomou o -17- resultado do reagente mais consistente. Pensa-se que o polímero reduza a variação causada pelo papel ao destruir a ligação do corante às fibras de celulose. Como resultado, a reactividade do reagente para proteína pode ser mantida consistentemente como um alvo. TABELA 6 Fórmula Negativo Reactividade 30 mg/dl Pro4 883 570 863 570 904 586 Observou-se que mesmo quando os diferentes lotes de papel de filtro foram empregues a reactividade entre a acomposição de reagentes e o papel de filtro não foi um factor na determinação da proteína. Ainda, as tiras teste mostraram uma redução da variabilidade relativamente às diferentes amostras de urina para os limites de detecção visual e instrumental. Isto é contrário a outras formulações utilizadas para a determinação da proteína em que os limites de detecção para urina com gravidade específica média e alta muitas vezes variam para as leituras visuais e instrumentais.

Lisboa, 27 de Outubro de 2000

Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 14 1200 LISBOA

Claims (4)

1. - 1 -

   REIVINDICAÇÕES 1. Um método para a detecção de proteína numa amostra biológica, método esse que se caracteriza pelos passos de: a) molhar uma tira de teste analítico com uma amostra biológica, a tira teste incluindo um veículo absorvente impregnado numa primeiro banho aquoso com tampão adicionado para ajustar o pH entre 1,5 e 4,5 e depois impregnado o referido veículo adsorvente com uma solução de solvente não aquoso consistindo numa tetrabromofenolsulfoneftaleína se-leccionada do grupo 3,4,5,6-tetrabromofenolsulfoneftaleína (TBPSP); 3',3"-dinitro-3,4,5,6-tetrabromofenolsulfoneftaleína (DNTB); 3',3"-di-bromo-3,4,5,6-tetrabromofenolsulfoneftaleína (DBTB) e 0,1 a 10% por peso de um polieterpolicarbonato alifático e; (b) observação e registo de qualquer alteração de cor da tira teste, em que uma alteração da cor é indicadora de proteína na amostra biológica.
2. { 2. O método da reivindicação 1, em que o polieterpolicarbonato alifático está presente entre 0,1 e 2% por peso e tem a estrutura:

   em que m é cerca de 3 e n é cerca de 6.
3. 3. Um dispositivo teste para a determinação de proteína numa -2- w amostra biológica consistindo numa matriz veículo impregnada com tetrábromo-fenolsulfoneftaleína seleccionada do grupo 3,4,5,6-tetrabromofenolsulfoneftaleí-na (TBPSP); 3',3"-dinitro-3,4,5,6-tetrabromofenolsulfoneftaleína (DNTB); 3',3"-dibromo-3,4,5,6-tetrabromofenolsulfoneftaleína (DBTB) e 0,1 a 10% por peso de um polietérpolicarbonato alifático.
4. 4. O dispositivo teste da reivindicação 3, em que o polieter-policarbonato alifático está presente entre 0,1 e 2% por peso e tem a estrutura:

   em que m é cerca de 3 e n é cerca de 6. Lisboa, 27 de Outubro de 2000

   Agente Oficial da Propríedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 14 1200 USBÒA