PT667859E

PT667859E - Marcacao de moleculas utilizando derivados de 2-hidrazinopiridina

Info

Publication number: PT667859E
Application number: PT93924157T
Authority: PT
Inventors: David Aaron Schwartz; Gary James Bridger; Michael Jeffrey Abrams; Sreenivasan Padmanabhan; Michael Evert Ultee
Original assignee: Anormed Inc
Priority date: 1992-11-05
Filing date: 1993-11-03
Publication date: 2001-02-28
Also published as: KR100295545B1; ES2150950T3; JPH08502744A; KR950704256A; FI952141A; ATE195730T1; NZ257376A; CA2148595A1; DK0667859T3; HUT72332A; AU676863B2; JP3542597B2; DE69329293T2; FI113044B; HU226459B1; CA2148595C; FI952141A0; AU5375594A; WO1994010149A1; GR3034883T3

Description

DESCRIÇÃO “Marcação de moléculas utilizando derivados de 2-hidrazinopiridiua” O presente invento refere-se a melhoramentos na marcação de moléculas e, mais especialmente, refere-se a novos derivados de hidrazina bifuncionais, que são capazes de ligar iões metálicos, em particular o tecnécio e o rénio, a moléculas com utilidade biológica.

Antecedentes do invento

Devido à sua elevada especificidade biológica, algumas macromoléculas (e.g. anticorpos monoclonais e fragmentos seus derivados) têm sido utilizadas para direccionar radioisótopos para locais específicos in vivo, para fins de imagiologia ou terapia. A utilização do isótopo meta-estável de tecnécio 09mTc na medicina nuclear de diagnóstico está bem estabelecida, e também se podem utilizar terapeuticamente os isótopos emissores beta de rénio, 1S6Re, l88Re e 189Re. Estão já descritos vários métodos para ligar o tecnécio a macromoléculas. Alguns destes métodos envolvem a redução de grupos dissulfureto na macromolécula (normalmente uma imunoglobulina) a tióis e a utilização subsequente destes grupos para ligar o Tc reduzido (e.g. McKenzie et aL, publicação de Patente Internacional WO 87/04164 e Bremmer et al., EP 0 271 806 A2). Os métodos de marcação directa deste tipo têm várias desvantagens potenciais. A redução das unidades dissulfureto pode conduzir à desnaturação das proteínas e à perda subsequente da especificidade biológica. Além disso, o método não pode ser utilizado para marcar macromoléculas que não possuam porções dissulfureto.

Altemativamente, o 99mTc pode ser ligado a macromoléculas através de quelatos bifuncionais, como o DTPA (D. Lanteigne e D. J. Hnatowich, Int. J. Appl. Radiat. Isot., 35, 617 (1984)), tiosemicarbazonas quelantes (Y. Arano et al., Int. J. Nucl. Med. Biol., 12, 425 (1985)) e ligandos de diamidoditiol (A. Fritzberg, ped. de Patente Europeia, EP 188 256 A2). Os problemas associados com estes métodos incluem uma ligação não específica significativa do tecnécio (ligação à proteína em locais diferentes do grupo quelante) e cinéticas lentas de marcação com Tc. A Requerente descreveu previamente, no pedido de Patente Europeia EP 0 384 769 A2, um novo método para modificar moléculas biológicas (e.g. anticorpos monoclonais, IgG humana policlonal e ovalbumina) e moléculas mais pequenas (e.g. péptidos) com porções 2-hidrazinopiridino que reagem com Tc reduzido, e.g. 99mTcv(gluco-heptonato), para produzir

84 540

ΕΡ 0 667 859 / PT radioconjugados imunorreactivos, estáveis. Já foi demonstrado que as moléculas biológicas (e.g. anticorpos monoclonais), modificadas para transportar radioisótopos ou moléculas de medicamento, são metabolizadas in vivo, e que os produtos resultantes são distribuídos ao longo do corpo. Na tentativa de controlar a biodistribuiçào dos produtos metabolizados, têm-se alterado as características químicas da porção modificada, por inclusão de funcionalidades hidrófilas ou cliváveis. Paik et al. (J. Nucl. Med., 30, 1693-1701 (1989) e Antibod. Immunoconjug. and Radiopharm., 3, 127-136 (1990)) demonstraram que a interposição de uma funcionalidade éster entre o anticorpo monoclonal e o radioisótopo ('"In) acelerava a eliminação sanguínea do isótopo e reduzia a sua absorção por órgãos normais, como músculo, rim, fígado e baço. Esta eliminação mais rápida a partir de órgãos normais aumentava a razão tumor/órgão normal em 2-3 vezes. De modo semelhante, foi observada uma eliminação aumentada em animais sem tumores, por Deshapande et al. (Nucl. Med. Biol, 16, 587-597 (1989)), Paik et al. (Nucl. Med. Biol., 16, 475-481 (1989)), Weber et al. (Bioconjugate Chem., 1, 431-437 (1990)) e Gustavson et al. (Patente US 5 112 953 (1992)) para anticorpos marcados com radioisótopos 111 In ou 99mTc, através de um agente quelante ligado por meio de uma função éster ou dissulfureto.

Constitui o objecto do presente invento proporcionar novas moléculas bifuncionais com grupos hidrazino e grupos reactivos espaçados por porções hidrófilas e/ou cliváveis, que podem ser utilizadas para ligar iões metálicos, como o 99mTc, a macromoléculas, de forma a alterar vantajosamente a biodistribuiçào das moléculas biológicas radiomarcadas.

Sumário do invento

De acordo com o invento, proporcionam-se novos compostos de hidrazina bifuncionais que possuem porções hidrófilas (e.g. ácidas) e/ou cliváveis (e.g. dissulfuretos e ésteres), bem como conjugados seus derivados. Resultados in vivo, que demonstram a localização em tumores de conjugados de compostos de acordo com o invento com o fragmento F(ab') do anticorpo monoclonal C46.3, marcados com 99mTc, são apresentados a seguir. Alguns destes compostos apresentam valores tumor/sangue significativamente melhores, comparados com o mesmo fragmento de anticorpo marcado pelo método directo (e.g. Bremmer et al.). O presente invento proporciona novos compostos de fórmula geral I,

84 540

ΕΡ 0 667 859 / PT ΕΝΝΗ"' .

J-T-Q-Z α.) em que E é um grupo alquilideno, ou representa H,, caso em que o composto está na forma de um sal de adição de ácido, J é seleccionado de -CO-NH-, -CO-O-, -CO-S- e ΝΉ-CO-, T é uma cadeia alquileno ou, quando J é -CO-NH, T é uma porção de resíduo de aminoácido, Q é um dissulfureto, éster ou tioéster, e Z é bromoacetato, maleimido, dissulfureto ou éster de N-hidroxi-succinimidilo.

Quando E é um grupo alquilideno, é de preferência um alquilideno inferior, linear ou ramificado, de até quatro átomos de carbono.

Como acima especificado, quando o composto de fórmula I está na forma de sal de adição de ácido, o ácido é, de forma adequada, um ácido halogenídrico, ácido nítrico, ácido trifluoroacético, ácido tetrafluorobórico ou ácido sulfúrico, mas podem utilizar-se outros ácidos, desde que isso não interfira com a utilização dos compostos.

Os compostos do invento podem ser sintetizados pelo perito em química orgânica. As moléculas podem ser construídas de muitos modos diferentes, a partir de materiais de partida geralmente conhecidos per se. De forma conveniente, utiliza-se um dos esquemas reaccionais apresentados nas figuras, os Esquemas 1 a 4, ou uma sua modificação óbvia. Deve ter-se em conta que com moléculas deste tipo, os materiais de partida e as condições reaccionais precisas podem variar, obtendo-se processos análogos, de que resultam produtos análogos que se incluem na fórmula I. Mais concretamente, os pormenores da síntese de compostos de fórmula I específicos são dados nos exemplos seguintes. O invento proporciona também novos compostos de fórmula geral (II), a seguir descrita:

(Π) em que E é como acima definido. Estes compostos poderão ter também utilidade como moléculas ligantes. O invento proporciona ainda compostos de fórmula geral Ia ^ |j-CO-NH-CI-íCOOH)-C(R)2—S— S-p fl-R* (Ia) ENNH^Sr ^ em que E é como acima definido, R é H ou CH, e R' é H ou NO,.

Compostos específicos do invento incluem os seguintes:

e os seus sais de adição de ácido.

5 84 540

ΕΡ 0 667 859 / PT e os seus sais de adição de ácido.

e os seus sais de adição de ácido.

e os seus sais de adição de ácido. f) NO* il

6 84 540 ΕΡ 0 667 859 / PT e os seus sais de adição de ácido.

e os seus sais de adição de ácido

e os seus sais de adição de ácido.

84 540

ΕΡ 0 667 859 / PT 7 e os seus sais de adição de ácido.

e os seus sais de adição de ácido.

e os seus sais de adição de ácido. 8 84 540

ΕΡ 0 667 859 / PT

e os seus sais de adição de ácido.

e os seus sais de adição de ácido. O invento proporciona ainda um conjugado formado por reacção de uma macromolécula com um composto de acordo com o invento. De forma adequada, a macromolécula é uma proteína como uma imunoglobulina, por exemplo um anticorpo monoclonal, ou um fragmento seu derivado. Isto pode ser realizado por um método análogo ao descrito por Abrams et al. em J. Nucl. Med., 31, 2022 (1990). Abrams et al. descrevem também um método para marcação radioactiva e, de modo análogo, os conjugados de acordo com o invento podem ser utilizados para produzir uma macromolécula marcada, inventiva e útil, que é um átomo de um metal, como o 99mTc ou um radioisótopo de Re, ligado a um conjugado de acordo com o invento.

Tal como será descrito em maior pormenor em seguida, os testes com conjugados de fragmentos de anticorpo marcado com 99mTc mostram uma melhoria, relativamente aos

84 540

ΕΡ 0 667 859 / PT 9 fragmentos marcados que não utilizam uma molécula ligante de acordo com o invento, ou relativamente a fragmentos marcados que utilizam moléculas ligantes diferentes, numa ou mais das características da razão entre a radioactividade detectada no tumor e a detectada no sangue, no tumor em relação a órgãos ou na eliminação a partir do sangue. Deste modo, o invento proporciona ainda a utilização de macromoléculas marcadas de acordo com o invento para imagiologia e/ou terapia, de acordo com princípios bem conhecidos. O invento será agora descrito nos Exemplos seguintes, que pretendem ser ilustrativos e não Iimitantes.

Experimental

Os espectros de Ή RMN foram registados num espectrómetro Bruker AM 300 de 300 MHz. Todos os espectros de 'H RMN foram registados em DMSO-d6, salvo indicação em contrário. A análise de espectro de massa por bombardeamento atómico rápido foi realizada num espectrómetro de massa de campo elevado ZAB 2-SE VG Analítico, operando a

Bacc=8 kV.

Os nomes dos compostos descritos entre parêntesis [ ] nos vários Exemplos estão conforme a nomenclatura do Chemical Abstracts Service Registry Index. O ácido 6-hidrazinonicotínico, o ácido 6-(BOC-hidrazino)nicotínico e o 6-(BOC-hidrazino)nicotinato de succinimidilo foram preparados de acordo com Abrams et ai, J. Nacl. Med, 31, 2022 (1990).

As estruturas dos compostos individuais preparados nos Exemplos seguintes são apresentadas nas figuras anexas, nas quais os números dos compostos correspondem aos números dos Exemplos.

Exemplo 1 Ácido 6-(BOC-hidrazino)nicotinamido-v-t-butil-(LVglutâmico

Adicionou-se 6-(BOC-hidrazino)nicotinato de succinimidilo (300 mg, 1,0 eq.) numa porção a uma solução, sob agitação vigorosa, de ácido y-t-butil-(L)-glutâmico (173 g) numa mistura de dioxano (5 ml) e solução de bicarbonato de sódio aquoso (5 ml). A mistura foi

84 540

EP 0 667 859 / PT 10 agitada durante 3 horas e em seguida vertida em água (50 ml). O pH foi ajustado para pH14 com NaOH 10N, em seguida para pH7 com HC1 concentrado, e extractou-se uma vez com acetato de etilo (40 ml). O pH da fase aquosa foi então baixado para pH4 com HC1 concentrado, saturado com cloreto de sódio e extractado com acetato de etilo (3x4 ml). As fases orgânicas combinadas foram secas (MgS04) e evaporadas sob pressão reduzida, originando o produto como um pó branco (360 mg, 96%). Éster N-hidroxi-succinimidílico de ácido 6-(BOC-hidrazinolnicotinamido-Y-t-butil- ('L)-glutâmico

Adicionou-se, a 0°C, DCC (170 mg) a uma solução agitada de ácido 6-(BOC-hidrazino)nicotinamido-y-t-butil-(L)-glutâmico (360 g) e N-hidroxi-succinimida (96 g) em THF (10 ml), sob árgon. A mistura foi agitada a 0°C durante 2 horas, em seguida à temperatura ambiente durante a noite, após o que precipitou um sólido branco. O sólido foi removido por filtração e o filtrado foi evaporado sob pressão reduzida para originar o produto na forma de uma espuma branca (quant.). Síntese de 1

Cloridrato de éster N-hidroxi-succinimidílico de ácido 6-(BOC- hidrazinolnicotinamido-fLVglutâmico

Adicionou-se uma solução saturada de cloreto de hidrogénio em dioxano (2 ml) a uma solução, sob agitação, de éster N-hidroxi-succinimidílico do ácido 6-(BOC-hidrazino)nicotinamido-y-t-butil-(L)-glutâmico (150 mg) em dioxano (2 ml). Após uma hora, tinha-se formado um precipitado a partir da solução homogénea, continuou-se a agitação por mais 3 horas e em seguida removeu-se o sólido por filtração, lavou-se com éter e secou-se para originar o produto na forma de um sólido cristalino branco/amarelo. 'H RMN (DMSO-d6) δ 2,10-2,29 (m, 2H), 2,39 (t, 2H, J=6,9 Hz), 2,81 (s, 4H), 4,88 (m, 1H), 6,93 (d, 1H, J=8,8 Hz), 8,18 (d, 1H, J=8,8 Hz), 8,63 (m, 2H), 9,04 (d, 1H, J=7,6 Hz, D,0 permutável), 9,95 (s largo, 2H, D,0 permutável); espectro de massa (FAB); m/e (intensidade relativa); 380(60, M+l), 283(100), 201(35), 185(42), 136(40).

Exemplo 2 Éster t-butílico de ácido 6-(BOC-hidrazino)nicotinamido-y-t-butil-(L)-glutamil-v- benzil-(X)-glutâmico

Arrefeceu-se uma solução de ácido 6-(BOC-hidrazino)nicotinamido-y-t-butil-(L)

I 84 540

EP 0 667 859 / PT 11 glutâmico (200 mg), cloridrato de éster t-butílico do ácido y-benzil-(L)-glutâmico (151 mg, 1.0 eq.) e N-hidroxi-succinimida (53 mg, 1,0 eq.) em DMF (10 ml) a 0°C, com agitação sob árgon. Adicionou-se a esta solução trietilamina (32 ml, 1,1 eq.) seguido de DCC (94 mg,

j I

1.0 eq.), numa porção, e agitou-se a mistura a 0°C durante 3 horas, em seguida à temperatura ambiente durante 4 dias, altura em que precipitou um sólido branco. A solução foi diluída com acetato de etilo (50 ml), arrefecida e o sólido removido por filtração. O filtrado foi evaporado até à secura sob pressão reduzida e o resíduo oleoso foi repartido entre acetato de etilo (50 ml) e solução aquosa saturada de bicarbonato de sódio (30 ml), separou-se a camada orgânica, lavou-se exaustivamente com salmoura, secou-se (MgS04) e evaporou-se até à secura sob pressão reduzida, obtendo-se um sólido espumoso branco (90%). Éster t-butílico de ácido ó-fBOC-hidrazinolnicotinamido-v-t-butil-dl-glutamiHLV glutâmico

Adicionou-se éster t-butílico do ácido 6-(BOC-hidrazino)nicotinamido-y-t-butil-(L)-glutamil-y-benzil-(L)-glutâmico (300 mg) a uma suspensão de paládio em carbono activado (Aldrich, 10%) em acetato de etilo (5 ml) e a mistura foi agitada rapidamente sob uma atmosfera de hidrogénio durante 6 a 8 horas (até a reacção estar completa por TLC). A mistura foi filtrada e evaporada até à secura sob pressão reduzida, para originar uma espuma branca. Esta foi utilizada directamente no passo seguinte sem posterior purificação. Éster t-butílico de ácido ó-ÍBOC-hidrazinolnicotinamido-Y-t-butil-ÍLl-glutarnil-y-N- hidroxi-succinimidil-(L)-glutâmico

Dissolveu-se o produto acima obtido (100 mg) em acetato de etilo (10 ml) com N-hidroxi-succinimida (18,4 mg, 1,0 eq.) e arrefeceu-se a 0°C, com agitação, sob árgon. Adicionou-se DCC (33 mg, 1,0 eq.) numa porção a esta solução e agitou-se a mistura durante a noite à temperatura ambiente, altura em que precipitou um sólido branco. O sólido foi removido por filtração e o filtrado foi evaporado até à secura sob pressão reduzida, para originar o produto na forma de uma espuma branca. Síntese de 2

Cloridrato de ácido ó-hidrazino-nicotinamido-lLl-glutamil-y-N-hidroxisuccinimidil- ΠΑ- glutâmico

Adicionou-se uma solução saturada de cloreto de hidrogénio em dioxano (1 ml) a uma solução, com agitação, de éster t-butílico de ácido 6-(BOC-hidrazino)nicotinamido-y-t-

84 540

ΕΡ 0 667 859 / PT 12 butil-(L)-ghitamil-y-N-hidroxi-succinimidil-(L)-glutâmico (20 mg) em dioxano (1 ml). Após uma hora tinha-se formado um precipitado na solução homogénea, continuou-se a agitação por mais 24 horas e em seguida evaporou-se a mistura até à secura sob pressão reduzida. O sólido branco/amarelo que permaneceu foi lavado com éter (3 x) por decantação e em seguida evaporado e seco. Ή RMN (DMS0-d6/D:0) δ 1,80-2,20 (m, 4H), 2,31 (m, 2H), 2,76 (m, 2H), 2,80 (s, 4H), 4,24 (m, 1H), 4,42 (m, 1H), 6,90 (d. 1H, J=8,8 Hz), 8,17 (dd, 1H, J=8,8, 2,4 Hz), 8,71 (s, 1H); espectro de massa (FAB); m/e intensidade relativa; 509(18, M+l).

Exemplo 3 6-('2-propenil-hidrazono')nicotinamido-3-propanol

Adicionou-se uma solução de 3-aminopropanol (3,0 ml, 37,9 mmol) em DMF (20 ml), gota a gota, a uma solução de 6-(2-propenil-hidrazono)nicotinato de succinimidilo (10 g, 34,4 mmol) em DMF (80 ml) e a mistura foi agitada durante 16 horas à temperatura ambiente e em seguida concentrada sob pressão reduzida. O resíduo, um óleo amarelo pálido, foi dissolvido em acetato de etilo (50 mi) e lavado com uma quantidade mínima de água, seco (Na^SOJ e concentrado sob pressão reduzida a um sólido amarelo pálido, que foi recristalizado a partir de acetato de etilo, para originar o produto desejado na forma de um sólido branco (5,6 g, 65%).

Cloreto de N-hidroxi-succinimidilo e de alutarilo

Benkovic, Lemer WO 88 09380; segue-se um processo num só vaso, alternativo;

Adicionou-se N-hidroxi-succinimida (5,0 g) numa porção a uma solução de anidrido de ácido glutárico (4,95 g) em diclorometano (30 ml) e a mistura foi agitada durante 2,5 horas à temperatura ambiente, até a reacção estar completa (verificado por Ή RMN). Adicionou-se cloreto de oxalilo a esta mistura, gota a gota, através de uma cânula (3,0 eq., solução 2M em diclorometano, Aldrich, 65 ml) altura em que ocorreu uma forte efervescência. A mistura foi agitada durante a noite e em seguida evaporada até à secura sob pressão reduzida. Adicionou-se mais diclorometano e a mistura foi evaporada mais uma vez. Este procedimento foi repetido várias vezes, até o resíduo obtido por evaporação começar a cristalizar. O sólido foi lavado com éter três vezes por decantação e seco, originando o produto na forma de um sólido branco.

84 540

ΕΡ 0 667 859 / PT 13 Síntese de 3

Adicionou-se trietilamina (123 ul, 1.1 eq.), seguida de cloreto de N-hidroxi-succinimidilglutarilo (200 mg, 0,8 mmol) numa porção, a uma solução de 6-(2-propenil-hidrazono)nicotinamido-3-propanol (200 mg, 0,8 mmol) em THF (15 ml) sob árgon a 0°C, e a mistura foi deixada aquecer até à temperatura ambiente, com agitação, durante a noite. Por evaporação sob pressão reduzida obteve-se um óleo que foi redissolvido em acetato de etilo e arrefecido num banho de gelo, originando um precipitado cristalino branco de cloridrato de trietilamina, que foi removido por filtração. O filtrado foi concentrado e purificado por cromatografia em coluna e uma coluna curta de sílica gel, utilizando isopropanol a 5% em acetato de etilo como eluente. Obteve-se o produto desejado na forma de um pó sólido branco (80 mg, 22%). Ή RMN (CDC13) δ 1,15 (t, 3H, J=7,5 Hz), 1,96 (penteto, 2H, J=6,2 Hz), 2,08 (penteto, 2H, J=7,l Hz), 2,31-2,40 (dq, 2H, J=7,5, 5,1 Hz), 2,51 (t, 2H, 7,1 Hz), 2,73 (t, 2H, J=7,l Hz), 2,84 (s, 4H), 3,50 (q, 2H, J=6,4 Hz), 4,24 (t, 2H, J=6,l Hz), 6,54 (t largo, 1H, D,0 permutável), 7,19-7,26 (m, 2H), 7,97-8,01 (dd, 1H, J=8,8, 2,4 Hz), 8,50 (dd, 1H, J=2,4, 0,7 Hz); espectro de massa (FAB); m/e (intensidade relativa); 462(100, M+l), 432(10), 233(42).

Exemplo 4 3-hidroxipropil-r6-(2-propenil-hidrazono)1nicotinato

Adicionou-se 3-bromo-l-propanol (2,58 g, 18,6 mmol) a uma mistura de ácido 6-(2-propenil-hidrazono)nicotínico (3,08 g, 15,5 mmol) e carbonato de potássio (5,4 g, 39 mmol) em DMF (20 ml). A mistura reaccional foi agitada sob árgon a 70°C durante 16 horas. A solução foi arrefecida e concentrada até à secura sob pressão reduzida. O resíduo foi dissolvido em acetato de etilo (100 ml) e extractado com água (2x50 ml). A fase orgânica foi seca (Na^SOJ e evaporada sob pressão reduzida para originar um sólido avermelhado. Utilizou-se a cromatografia em coluna (sílica gel; cloreto de metileno/metanol (95/5)) para isolar o produto na forma de um sólido branco (2,3 g, 60%). Síntese de 4 Téster propílico de ácido 6-propilideno-hidrazino-3-r(bromoacetil)oxi1-3- piridinocarboxílicol

Adicionou-se brometo de bromoacetilo (112 mg, 0,60 mmol) gota a gota a 0-5°C a uma solução, sob agitação, de 3-hidroxipropil-[6-(2-propenil-hidrazono)]nicotinato (150 mg,

84 540

ΕΡ 0 667 859 / PT 14 0,6 mmol) e carbonato de sódio anidro (127 mg, 1,20 mmol) em cloreto de metileno seco (20 ml), sob árgon. A mistura reaccional foi agitada a 0-5°C durante 1 hora, em seguida à temperatura ambiente durante 1 hora. O sólido foi removido por filtração e o filtrado após diluição com cloreto de metileno (50 ml) foi extractado com água (25 ml). A fase orgânica foi seca (Na^SOJ e evaporada sob pressão reduzida, originando o produto bruto na forma de um sólido gomoso. Utilizou-se TLC preparativa (placa de sílica gel de 1000 pm, acetato de etilo/hexano (2/1)) para isolar o produto na forma de um sólido branco (120 mg, 54%). 'H RMN (CDC13) δ 1,16 (t, 3H, J=7,5 Hz), 2,15 (m, 2H, J=6,3 Hz), 2,36 (m, 2H, J—7,6 Hz), 3,84 (s, 2H), 4,34 (t, 2H, J=6,2 Hz), 4,41 (t, 2H, J=6,3 Hz), 7,31 (d, 1H, J= 10,4 Hz), 7,33 (t, 1H), 8,18 (dd, IH, J=2,2, 9,1 Hz), 8,66 (d, J=2,2 Hz); espectro de massa (FAB); m/e (intensidade relativa); 374(100, M+l), 372(100, M+l), 294(25), 176(52), 121(46).

Exemplo 5

Cloridrato de S-(2-tiopiridil)-(L)-cisteína

Este dissulfureto foi sintetizado pelo método de P.C.S. Chong e R.S. Hodges, J. Biol. Chem., (1981), 256, 5064. 6-(BOC-hidrazino)nicotinamido-lS-(2-tiopiridini-('L)-cisteína

Uma solução de 6-(BOC-hidrazino)-piridina-5-carboxilato de succinimidilo (500 mg, 1,42 mmol) em dioxano (5 ml) foi adicionada a uma solução de cloridrato de S-(2-tiopiridil)-(L)-cisteína (369 mg, 1,37 mmol) e uma solução aquosa saturada de bicarbonato de sódio (5 ml) e água (3 ml). A mistura reaccional foi agitada à temperatura ambiente durante 2,5 horas. Adicionou-se água (25 ml) à mistura reaccional e a solução aquosa foi lavada com acetato de etilo, para remover o éster não reagido. A fase aquosa foi saturada com cloreto de sódio e acidificada a pH3,7. A solução aquosa foi extractada com acetato de etilo (2 x 25 ml). Os extractos orgânicos combinados foram secos sobre sulfato de magnésio, filtrados e concentrados para originar 611 mg de um sólido branco pegajoso. Adicionou-se éter ao recipiente e os sólidos foram raspados dos lados e isolados por filtração, para originar o produto desejado na forma de um sólido branco (550 mg, 82%). Síntese de 5

Cloridrato de 6-hidrazino-nicotinamido-S-(2-tiopiridilV('L')-cisteína

Preparou-se uma solução de cloreto de hidrogénio (gás) em dioxano seco, fazendo

84 540 ΕΡ 0 667 859 / PT 15

borbulhar cloreto de hidrogénio em dioxano seco a uma taxa moderada, durante 5 minutos. Foi adicionada 6-(BOC-hidrazino)nicotinamido-[S-(2-tiopiridil)]-(L)-cisteína (50 mg) à solução de cloreto de hidrogénio/dioxano (5 ml). A mistura reaccional foi agitada à temperatura ambiente durante 2 horas e formou-se um precipitado branco. Removeu-se o solvente sob pressão reduzida e secou-se em seguida sob vácuo elevado, para originar 35 mg de um sólido amorfo branco. Ή RMN δ 3,30 (m, 2H), 4,65 (m, IH), 6,93 (d, 1H, J=8,6 Hz), 7,25 (m, 1H), 7,75 (m, 1H), 8,15 (d, 1H, .1=8,6 Hz), 8,45 (d, 1H), 8,70 (s, 1H), 9,05 (d, 1H); espectro de massa (FAB); m/e; 366, 351, 257, 223, 202, 179.

Exemplo 6

Cloridrato de S-(2-tio-5-nitropiridilV(X)-cisteína

Adicionou-se dissulfureto de 4-nitropiridina (1,98 g, 6,34 mmol) a DMF (10 ml) e aqueceu-se a mistura para facilitar a dissolução. Arrefeceu-se a solução à temperatura ambiente e adicionou-se uma solução de cloridrato de (L)-cisteína (0,5 g, 3,17 mmol) em DMF (6 ml). A mistura reaccional ficou amarelo claro e foi agitada à temperatura ambiente, durante 16 horas. Formou-se uma quantidade pequena de precipitado, que foi removida por filtração. O filtrado foi concentrado para originar um óleo espesso amarelo-acastanhado que por tratamento com diclorometano originou um precipitado amarelo. O precipitado foi isolado por filtração. Dissolveram-se os sólidos em metanol com aquecimento ligeiro e filtrou-se para remover os sólidos insolúveis brancos. O filtrado foi tratado com éter para induzir a precipitação. Isolou-se o sólido amarelo por filtração, para originar 240 mg do produto desejado. Isolou-se o sólido amarelo por filtração para originar 240 mg do produto desejado. Precipitaram mais 120 mg de produto a partir do filtrado de diclorometano original; rendimento total de 360 mg (39%). 6-fBOC-hidrazinolnicotinamido-S-f2-tio-5-nitropiridilV('LVcisteína

Dissolveu-se cloridrato de S-(2-tio-5-nitropiridil)-(L)-cisteína (220 mg, 0,70 mmol) em bicarbonato de sódio saturado, aquoso (5 ml) e adicionou-se uma solução de 6-(BOC-hidrazino)nicotinato de succinimidilo (246 g, 0,70 mmol) em dioxano (5 ml) e a mistura reaccional foi agitada à temperatura ambiente durante 3 horas. Adicionou-se água (25 ml) e lavou-se a solução aquosa com acetato de etilo, para remover o éster não reagido. Acidificou-se a fase aquosa a pH3,3 com HC1 IN e em seguida com cloreto de sódio. Extractou-se a solução aquosa ácida com acetato de etilo (2x35 ml). Secaram-se os extractos orgânicos combinados sobre sulfato de magnésio, filtrou-se e concentrou-se para originar

84 540

ΕΡ 0 667 859 / PT 16 145 mg de um sólido amarelo, que foi suspenso em éster e isolado por filtração para originar 35 mg do produto desejado. O filtrado foi concentrado e tratado com éter/hexanos para originar mais 95 mg do produto desejado; rendimento total de 125 mg (35%). Síntese de 6

Cloridrato de 6-(hidrazino-nicotinamido-S-f2-tio-5-nitroDÍridil)-(L~)-cisteína

Preparou-se uma solução de cloreto de hidrogénio (gás) em dioxano seco, fazendo borbulhar cloreto de hidrogénio em dioxano seco a uma taxa moderada, durante 5 minutos. Adicionou-se 6 (BOC-hidrazino)nicotinamido-S-(2-tio-5-nitro-piridil)-(L)-cisteína (50 mg) a uma solução de cloreto de hidrogénio/dioxano (5 ml). A mistura reaccional foi agitada à temperatura ambiente durante 2 horas e formou-se um precipitado branco. Removeu-se o solvente sob pressão reduzida e secou-se subsequentemente sob vácuo elevado para originar 25 mg de um sólido amorfo branco. Ή RMN δ 3,30 (m, 2H), 4,66 (m, 1H), 6,92 (d, 1H, J=9,0 Hz), 8,01 (d, 1H, J=9,0 Hz)), 8,12 (d, 1H, J=8,9 Hz), 8,48 (dd, 1H, J=8,9, 2,7 Hz), 8,64 (s, 1H), 9,03 (d, 1H, J=8,3 Hz), 9,2 (s largo, 1H); espectro de massa (FAB); m/e; 411, 391, 363, 335, 307, 293, 277, 257,201, 185, 171, 157.

Exemplo 7 Síntese de 7

Preparado a partir de (L)-penicilamina utilizando procedimentos experimentais semelhantes aos descritos nos Exemplos 5 e 6. ‘H RMN (DMSO-d6) δ 1,41 (s, 3H), 1,43 (s, 3H), 4,75 (m, 1H), 6,92(d, 1H, J=9,l Hz), 7,20 (m, 1H), 7,79 (m, 2H), 8,14 (dd, 1H, J=9,8, 2,3 Hz), 8,39 (d, 1H, J=4,0 Hz), 8,54 (s, 1H), espectro de massa (FAB); m/e (intensidade relativa); 394(100, M+l).

Exemplo 8 6-(BOC-hidrazinolnicotinamido-3-propanol

Adicionou-se uma solução de 3-amino-l-propanol (90 mg, 1,2 eq.) em DMF (2 ml) a uma solução, com agitação, de 6(BOC-hidrazino)nicotinato de succinimidilo (350 mg) em DMF (4 ml), arrefecida a 0-5°C. A mistura foi agitada a 0-5°C durante 1 hora e em seguida à temperatura ambiente durante 16 horas. A mistura reaccional foi concentrada até à secura para originar um resíduo sólido branco. O resíduo foi dissolvido em acetato de etilo (100 ml) e extraído com água (2x25 ml). A fase orgânica foi seca (Na^SOJ e evaporada sob pressão

84 540 ΕΡ 0 667 859 / PT 17

reduzida para originar o produto na forma de um pó branco (330 mg, 90%).

Adicionou-se brometo de bromoacetilo (200 mg, 1,1 eq.), gota a gota a 0-5°C a uma solução, com agitação, de 6-(BOC-hidrazino)nicotinamido-3-propanol (296 mg, 1 eq.) e carbonato de sódio anidro (212 mg, 2 eq.) em cloreto de metileno seco (15 ml), sob árgon. A mistura foi agitada a 0-5°C durante 1/2 hora e em seguida à temperatura ambiente durante 2 horas. O sólido foi removido por filtração e o filtrado, após diluição com cloreto de metileno (50 ml), foi extractado com água (25 ml). A fase orgânica foi seca (Na^SOJ e evaporada sob pressão reduzida, originando o produto bruto na forma de um sólido amarelo pálido. O produto bruto foi purificado por cromatografia em coluna em sílica gel, utilizando cloreto de metileno/metanol (90/10) como eluente, originando o produto bromoacetilado puro na forma de um sólido branco (267 mg, 62%). Síntese de 8

Tmonobromidrato de éster oronílico de ácido 3-rr(6-hidrazino-3-DÍridiniDcarbonill- aminolbromoacéticol

Preparou-se uma solução de brometo de hidrogénio em acetato de etilo, fazendo passar brometo de hidrogénio anidro (gás) através de acetato de etilo (10 ml), a uma taxa moderada, durante 5 minutos.

Dissolveu-se o bromoacetato acima (90 mg) em acetato de etilo (1 ml) e adicionou-se HBr/acetato de etilo (2 ml) e a mistura reaccional foi agitada à temperatura ambiente. Após 5 minutos, a solução ficou turva e formou-se um precipitado. A agitação foi continuada durante 21/2 horas. A mistura turva foi filtrada, lavada com éter (3x10 ml) e seca sob pressão reduzida para originar um sólido branco (65 mg, 71%). Ή RMN (DMSO-d6) δ 1,95 (t, 2H, J=6,2 Hz), 3,35 (t, 2H, J=6,2 Hz), 4,15 (s, 2H), 4,20 (t, 2H, J=6,2 Hz), 6,95 (d, 1H, J=8,8 Hz), 8,15 (dd, 1H, J=2,4, 8,8 Hz), 8,65 (d, 1H, J=2,4 Hz), espectro de massa (FAB); m/e (intensidade relativa); 333(33, M+l), 331(33, M+l), 136(100).

Exemplo 9 B-hidroxinropil-ó-iBOC-hidrazinolnicotinato

Adicionou-se 3-bromo-l-propanol (2,0 g, 14,39 mmol) a uma mistura de ácido 6-(BOC-hidrazino)nicotínico (3,0 g, 11,86 mmol) e carbonato de potássio (2,2 g, 15,9 mmol) em DMF (20 ml). A mistura reaccional foi agitada sob árgon a 70°C durante 16 horas. A 84 540

ΕΡ 0 667 859 / PT

I

18 solução foi arrefecida e concentrada até à secura sob pressão reduzida. O resíduo castanho foi dissolvido em acetato de etilo (100 ml) e extractado com água (2x50 ml). A fase orgânica foi seca (Na,SOJ e evaporada sob pressão reduzida para originar um óleo amarelo pálido. Utilizou-se a cromatografia em coluna (sílica gel, acetato de etilo/hexano (3/1)) para isolar o produto na forma de um sólido branco (2,28 g, 60%).

Adicionou-se brometo de bromoacetilo (290 μΐ, 3,6 mmol), gota a gota a 0-5°C a uma solução agitada do éster-álcool anterior (935 mg, 3,0 mmol) e carbonato de sódio anidro (636 mg, 6,0 mmol) em cloreto de metileno seco (25 ml), sob árgon. A mistura reaccional foi agitada a 0-5°C durante 30 minutos, em seguida à temperatura ambiente durante 1 hora. O sólido foi removido por filtração e o filtrado, após diluição com cloreto de metileno (50 ml) foi extractado com água (25 ml). A fase orgânica foi seca (Na:S04) e evaporada sob pressão reduzida, originando o produto bruto na forma de um sólido pegajoso, amarelo acastanhado. Utilizou-se cromatografia em coluna (sílica gel, acetato de etilo/hexano (2/1)) para isolar o produto bruto na forma de um sólido branco (0,36 g, 28%). Síntese de 9

Preparou-se uma solução de brometo de hidrogénio em dioxano fazendo passar brometo de hidrogénio anidro (gás) em dioxano (10 ml) a uma taxa moderada, durante 5 minutos. O bromoacetato acima (75 mg) foi dissolvido em dioxano (2 ml) e adicionou-se HBr/dioxano (2 ml) e a mistura reaccional foi agitada à temperatura ambiente durante 2 minutos. Filtrou-se a mistura turva, lavou-se com éter (3x10 ml) e secou-se sob pressão reduzida, para originar um sólido branco (40 mg, 56%). Ή RMN (D,0) δ 2,18 (t, 2H, J=6,0 Hz), 4,01 (s, 2H), 4,39 (t, 2H, J=6,0 Hz), 4,44 (t, 2H, J=6,0 Hz), 6,89 (d, 1H, J=9,0 Hz), 8,13 (dd, 1H, J=2,0, 9,2 Hz), 8,62 (d, 1H, J=2,0 Hz), espectro de massa (FAB); m/e (intensidade relativa) 334(100, M+l), 332(100, M+l), 212(76), 194(38), 154(48), 136(45).

Exemplo 10 3-hidroxipropiir(6-BOC-hidrazino)nicotinamidol-y-t-butil-(L)-glutamato

Adicionou-se 3-bromopropanol (227 μ1, 1,1 eq.) a uma solução, com agitação, de ácido 6-(BOC-hidrazino)nicotinamido-Y-t-butil-(L)-glutâmico (1,0 g, 2,29 mmol) e carbonato de potássio (348 mg, 1,1 eq.) em DMF (5 ml) e aqueceu-se a mistura a 55-60°C durante a noite. A solução foi evaporada até à secura sob pressão reduzida e o resíduo foi repartido entre acetato de etilo e bicarbonato de sódio aquoso saturado. A fase orgânica foi

84 540

ΕΡ 0 667 859 / PT 19 separada e lavada exaustivamente com água, seca (Na;S04) e evaporada sob pressão reduzida, dando origem a um sólido branco espumoso. O produto desejado foi purificado por cromatografia em coluna em sílica gel, utilizando 90% de acetato de etilo em hexano como eluente, originando um sólido branco (900 mg, 78%).

Dissolveu-se o composto acima (200 mg, 0,40 mmol) e carbonato de sódio anidro (84 mg, 2,0 eq.) em diclorometano (10 ml) e arrefeceu-se a 0°C sob árgon. Adicionou-se brometo de bromoacetilo (40 μΐ, 1,2 eq.) gota a gota, e deixou-se a mistura aquecer até à temperatura ambiente durante a noite. Adicionou-se acetato de etilo (20 ml) e lavou-se a solução com bicarbonato de sódio aquoso saturado, secou-se (Na,S04) e evaporou-se sob pressão reduzida. Purificou-se o produto desejado por cromatografia em coluna, em sílica gel, utilizando acetato de etilo a 80% em hexano como eluente, obtendo-se um óleo incolor (40 mg, 16%). Síntese de 10

Dissolveu-se o bromoacetato acima descrito (40 mg, 0,06 mmol) em dioxano anidro e arrefeceu-se num banho de gelo. Passou-se o brometo de hidrogénio (gás) por uma solução durante aproximadamente 1 minuto (ou até à saturação). Deixou-se a solução em repouso a 0°C durante 3 minutos e em seguida adicionou-se éter para precipitar o produto. Deixou-se assentar o sólido branco no fundo do frasco e removeu-se a solução de brometo de hidrogénio sobrenadante com uma pipeta Pasteur. Lavou-se em seguida o sólido por decantação com éter, dez vezes, e os vestígios remanescentes de éter foram removidos por evaporação sob pressão reduzida e secagem irt vácuo durante a noite. O produto era um sólido branco (25 mg, 77%). Ή RMN (D20) δ 2,07 (penteto, 2H, J=6,2 Hz), 2,09-2,31 (m, 2H), 2,38 (t, 2H, J=6,9 Hz), 4,02 (s, 2H), 4,25 (t, 2H, J=6,l Hz), 4,31 (t, 2H, J=5,9 Hz), 4,53 (m, 1H), 6,96 (d, 1H, J=9,3 Hz), 8,06-8,09 (dd, 1H, J=9,3, 2,1 Hz), 8,41 (d, 1H, J=2,0 Hz); espectro de massa (FAB); m/e (intensidade relativa); 463(100, M+l), 461(100, M+l), 383(22), 339(10), 237(10).

Exemplo 11 2-carboxietil-2-piridildissulfureto foi preparado pelo processo de acordo com Carlesson et ai, Biochem. J., (1978), 173, 723-737.

84 540

ΕΡ 0 667 859 / PT 20 Síntese de 11

Adicionou-se diciclo-hexil-carbodiimida (157 mg, 1,0 eq.) a uma solução agitada de 6-(2-propenil-hidrazono)nicotinamido-3-propanol (190 mg, 0,8 mmol) e 2-carboxietil-2-piridildisulfureto (163 mg, 1,0 eq.) em THF (10 ml) a 0°C e agitou-se a mistura a 0-5°C, durante 72 horas, altura em que precipitou um sólido branco. O sólido branco foi removido por filtração e o filtrado foi evaporado sob pressão reduzida. Dissolveu-se o resíduo em acetato de etilo e arrefeceu-se, o que originou novo precipitado de diciclo-hexilureia (“DCU”). Este processo foi repetido mais uma vez até toda a ureia ter sido removida. O produto desejado foi purificado por cromatografia em coluna em sílica gel utilizando metanol a 5% em diclorometano, como eluente. A recristalização em acetato de etilo/éter originou um sólido branco (85 mg, 25%). Ή RMN (CDC13) δ 1,15 (t, 3H, J=7,5 Hz), 1,95 (penteto, 2H, J=6,0 Hz), 2,36 (dq, 2H, J=5,0, 7,6 Hz), 2,80 (t, 2H, J=7,0 Hz), 3,07 (t, 2H, J=7,0 Hz), 3,50 (m, 2H), 4,04 (t, 2H, .1=7,0 Hz), 6,51 (tripleto largo, 1H, D20 permutável), 7,07-7,12 (m, 1H), 7,17-7,21 (m, 2H), 7,60-7,72 (m, 2H), 7,95-7,99 (dd, 1H, J=8,8, 2,4 Hz), 8,22 (s largo, 1H, D20 permutável), 8,42-8,45 (m, 1H), 8,55 (d, 1H, J=2,4 Hz); espectro de massa (FAB); m/e (intensidade relativa); 448(100, M+l), 176(45).

Exemplo 12 6-(BOC hidrazino)nicotinamido-2-etanotiol

Adicionou-se cloridrato de 2-aminoetanotiol (0,65 g, 5,7) a uma solução agitada de 6-(BOC-hidrazino)nicotinato de succinimidilo (2,0 g, 5,7 mmol) e trietilamina (0,8 ml, 5,7 mmol) em DMF (20 ml). A mistura reaccional foi agitada à temperatura ambiente durante 16 horas. Concentrou-se a solução até à secura sob pressão reduzida. Dissolveu-se o resíduo em acetato de etilo (100 ml) e extraiu-se com água (50 ml). Secou-se a fase orgânica (Na^SOJ e evaporou-se sob pressão reduzida originado o produto na forma de um pó branco (1,19 g, 6,7%).

Adicionou-se brometo de bromoacetilo (1,2 eq.), gota a gota a 0-5°C, a uma solução agitada de 6-(BOC-hidrazino)nicotinamido-2-etanotiol (200 mg) e carbonato de sódio anidro (2 eq.) em cloreto de metileno seco (20 ml), sob árgon. A mistura reaccional foi agitada a 0-5°C durante 30 minutos e em seguida à temperatura ambiente durante 1 hora. Os sólidos foram removidos por filtração e o filtrado, após diluição com cloreto de metileno (50 ml) foi extractado com água (25 ml). A fase orgânica foi seca (Na,S04) e evaporada sob pressão reduzida, originando 0 produto bruto na forma de um sólido castanho claro. Utilizou-se a

84 540

ΕΡ 0 667 859 / PT 21 cromatografia em coluna (sílica gel, acetato de etilo/hexano (2/1)) para isolar o produto puro na forma de um sólido amarelo pálido (110 mg, 41%). Síntese de 12

Fmonobromidrato de etiltioéster de ácido 2-IT(6-hidrazino-3- pirídiniDcarbonillaminol-bromoacéticol

Preparou-se uma solução de brometo de hidrogénio em acetato de etilo fazendo passar brometo de hidrogénio anidro em acetato de etilo (10 ml) a uma taxa moderada, durante 5 minutos. O derivado BOC-hidrazinopiridina acima descrito (22 mg) foi dissolvido em acetato de etilo (1 ml) e adicionou-se HBr/acetato de etilo (2 ml) e a mistura reaccional foi agitada à temperatura ambiente durante 1 hora. A mistura reaccional turva foi filtrada para originar 12 mg de um sólido branco (57%). Ή RMN (DMSO-d6) δ 3,15 (t, 2H), 3,45 (m, 2H), 4,45 (s, 2H), 6,95 (d, 1H), 8,15 (d, 1H), 8,65 (s, 1H); espectro de massa (FAB); m/e (intensidade relativa); 335(42, M+l), 333(42, M+l), 185(100).

Exemplo 13

Cloridrato de dissulfureto de S-f2-piridilVS’-(2-amino)etilo

Adicionou-se, gota a gota, cloridrato de 2-aminoetanotiol (2,3 g, 0,02 mmol) em metanol (25 ml) a uma solução agitada de Aldritiol (8,8 g, 0,04 mol) e ácido acético glacial (1,6 ml) em metanol (40 ml). Agitou-se a solução amarelo claro à temperatura ambiente, durante 16 horas. Concentrou-se a solução até à secura sob pressão reduzida. O resíduo foi agitado com cloreto de metileno (100 ml) e filtrado, para originar o produto na forma de um pó branco (3,6 g, 80%). 6-(2-propenil-hidrazona)-N-('2,-piridilditioetil)nicotinamida (Composto de Fórmula II)

Adicionou-se cloridrato de 2-piridilditioaminoetano (444 mg, 2 mmol) a uma solução de 6(2-propenil-hidrazono)nicotinato de succinimidilo (590 mg, 2,0 mmol) e trietilamina (0,6 ml) em DMF (20 ml). A mistura reaccional foi agitada à temperatura ambiente durante 16 horas. A solução foi concentrada até à secura sob pressão reduzida. Dissolveu-se o resíduo em acetato de etilo (100 ml) e extractou-se com água (2x50 ml). Secou-se a fase orgânica (NajSOJ e evaporou-se sob pressão reduzida para originar o produto na forma de um pó branco (650 mg, 90%).

84 540

ΕΡ 0 667 859 / PT 22 Ή RMN (DMSO-dft) δ 1,02 (t, 3H), 2,25 (q, 2H), 3,05 (t, 2H), 3,55 (m, 2H), 7,05 (d, 1H), 7,25 (m, 1H), 7,45 (t, 1H), 7,85 (m, 2H), 7,95 (d, IH), 7,55 (m, 3H).

Adicionou-se, gota a gota, ácido mercaptoetanóico (106 mg, 1,0 mmol) em DMF (2 ml) a uma solução do dissulfiireto acima (361 mg, 1,00 mmol) e ácido acético glacial (20 μΐ) em DMF (10 ml). A mistura reaccional foi agitada à temperatura ambiente durante 16 horas. Concentrou-se a solução até à secura sob pressão reduzida. O resíduo foi triturado com cloreto de metileno (10 ml) e filtrado, para originar o produto na forma de um pó branco (208 mg, 58%). Síntese de 13

Adicionou-se DCC (63 mg, 0,31 mmol) a 0°C a uma solução agitada do ácido acima descrito (108 mg, 0,30 mmol) e N-hidroxi-succinimida (35 mg, 0,30 mmol) em DMF (5 ml). A mistura foi agitada a 4°C durante 16 horas. O sólido branco (DCU) foi removido por filtração e o filtrado foi concentrado até à secura sob pressão reduzida. Triturou-se o resíduo com acetato de etilo (25 ml) e filtrou-se. Concentrou-se o filtrado sob pressão reduzida originando 13 na forma de um pó branco (70 mg, 51%). Ή RMN (CDC13) δ 1,15 (t, 3H, J=7,5 Hz), 2,35 (m, 2H, J=7,5 Hz), 2,91 (s, 4H), 2,94 (t, 2H, J=6,7 Hz), 3,03 (m, 2H), 3,11 (m, 2H), 3,75 (q, 2H, J=6,4 Hz), 7,17 (d, IH, J=7,9 Hz), 7,21 (t, IH, J=4,7 Hz), 7,98 (dd, IH, J=2,4, 8,8 Hz), 8,53 (d, IH); espectro de massa (FAB); m/e (intensidade relativa); 454(100, M+l), 253(32), 225(82), 176(61), 121(46).

Exemplo 14

Adicionou-se DCC (472 mg, 2,3 mmol) a 0°C a uma solução agitada de ácido 6-(BOC-hidrazino)nicotinamido-t-butil-(L)-glutâmico (lg, 2,3 mmol), trietilamina (0,32 ml, 2,3 mmol) e S-(2-piridil)-S’-(2-aminoetil)dissulfureto (507 mg, 2,3 mmol) em DMF (10 ml). A mistura foi agitada a 4°C durante 16 horas. Filtrou-se o precipitado sólido (DCU) e a solução foi concentrada até à secura, sob pressão reduzida. Dissolveu-se o resíduo em acetato de etilo (100 ml) e extractou-se com bicarbonato de sódio saturado (50 ml), salmoura (50 ml) e água (50 ml). A fase orgânica foi seca (NajSO,,) e evaporada sob pressão reduzida para originar o produto na forma de um sólido branco (1,28 g, 92%).

Adicionou-se, gota a gota, ácido 3-mercaptopropiónico (106 mg, 1,0 mmol) em etanol (10 ml) a uma solução do BOC-hidrazinopiridil-glutamildissulfureto acima descrito (606 mg, 1,0 mmol) e ácido acético glacial (100 μΐ) em etanol (25 ml). A mistura reaccional

84 540

ΕΡ 0 667 859 / PT 23 foi agitada à temperatura ambiente durante 16 horas. A solução foi concentrada até à secura sob pressão reduzida para originar um sólido amarelo. Utilizou-se a cromatografia em coluna (sílica gel, cloreto de metileno/metanol (3/2) e ácido acético (4% do eluato)) para isolar o produto na forma de um sólido branco (302 mg, 50%).

Adicionou-se DCC (58,4 mg, 0,28 mmol) a 0°C, a uma solução agitada de ácido de BOC-hidrazinopiridinodissulfureto (170 mg, 0,28 mmol) e N-hidroxi-succinimida (33 mg, 0,29 mmol) em DMF (5 ml). A mistura reaccional foi agitada a 4°C durante 16 horas. O sólido branco (DCU) foi removido por filtração e o filtrado concentrado até à secura sob pressão reduzida. O resíduo foi triturado com acetato de etilo (25 ml) e filtrado. O filtrado foi concentrado sob pressão reduzida, para originar o produto na forma de um pó branco (75 mg, 38%). Síntese de 14

Preparou-se uma solução de brometo de hidrogénio em acetato de etilo, fazendo passar brometo de hidrogénio anidro (gás) em acetato de etilo (10 ml) a uma taxa moderada, durante 5 minutos. Dissolveu-se 6-BOC-hidrazinoglutamildissulfureto (30 mg) em acetato de etilo (1 ml), adicionou-se HBr/acetato de etilo (1 ml) e agitou-se a mistura reaccional à temperatura ambiente, durante 20 minutos. Filtrou-se a lama e secou-se, para originar um sólido branco (21 mg, 78%). 'H RMN (CD3OD) δ 2,15 (m, 2H), 2,45 (t, 2H), 2,83 (s, 4H), 2,88 (m, 2H), 3,05 (m, 4H), 3,45 (m, 2H), 4,45 (m, 1H), 6,95 (d, 1H), 8,25 (d, 1H), 8,45 (s, 1H); espectro de massa (FAB); m/e (intensidade relativa); 543(22, M+l), 322(49), 269(100), 207(85). A fim de possibilitar a comparação em testes biológicos prepararam-se os seguintes compostos: 6-(BOC-hidrazinol-3-(N-bromoacetil)aminopiridina

Adicionou-se cloreto de bromoacetilo (1,1 g, 6,4 mmol), gota a gota a 0-5°C a uma solução agitada de 3-amino-6-(BOC-hidrazino)piridina (1,2 g, 5,4 mmol) e carbonato de sódio anidro (682 mg, 6,4 mmol) em acetonitrilo seco (25 ml) sob árgon. A mistura foi agitada a 0-5°C durante 1/2 hora e em seguida à temperatura ambiente durante 3 horas. A mistura reaccional foi concentrada sob pressão reduzida e o resíduo foi repartido entre água (50 ml) e acetato de etilo (150 ml). A fase orgânica foi separada, seca (Na^OJ e

84 540

ΕΡ 0 667 859 / PT 24 concentrada sob pressão para 25-30 ml. O sólido branco (1,0 g, 54,3%) que precipitou foi removido por filtração e seco. Ή RMN (DMSO-d6) δ 1,39 (s, 9H); 3,99 (s, 2H), 6,45 (d, 1H, J=8,8 HZ), 7,65 (dd, 1H, J=2,4, 8,8 Hz), 8,15 (d, 1H, J=2,4 Hz). Análise: Calculado para C,2HI7N,Br03: C-41,75; H-4,96; N-16,23; Br-23,15. Encontrado: C-41,87; H-5,00; N-16,27; Br-23,27.

Bromidrato de 3-(N-bromoacetil)amino-6-hidrazinopiridina (Composto 15)

Preparou-se uma solução de brometo de hidrogénio em dioxano, fazendo borbulhar brometo de hidrogénio anidro (gás) através de dioxano (10 ml), a uma taxa moderada, durante 5 minutos. Dissolveu-se 6-(BOC-hidrazino)-3-(N-bromoacetil)-aminopiridina (60 mg) em dioxano (2 ml) e adicionou-se HBr/dioxano (2 ml) e agitou-se a mistura reaccional à temperatura ambiente durante 30 minutos, altura em que se formou um precipitado. A mistura reaccional foi agitada à temperatura ambiente durante um total de 4 horas, em seguida foi filtrada, lavada com éter (3x25 ml) e seca sob pressão reduzida para originar um sólido branco (50 mg, 87,7%). Ή RMN (D,0) δ 4,08 (s, 2H), 7,02 (d, 1H, J=8,8 Hz), 7,85 (dd, 1H; J=2,4, 8,8 Hz), 8,25 (d, 1H, J=2,4 Hz).

Seguindo os procedimentos de síntese descritos no pedido de Patente Europeia EP 0 384 769 A2, utilizou-se 3-amino-6-(BOC-hidrazino)-piridina para preparar cloridrato de 3-maleimido-6-hidrazinopiridina (Composto 16).

Prepararam-se novos compostos de acordo com a invenção:

Exemplo 17 3-(Benziloxiacetilamidol-l-propanol

Adicionou-se uma solução de cloreto de benziloxiacetilo (19,5 g, 106,0 mmol) em dioxano (36 ml), gota a gota a 0-5°C durante 4 horas, a uma solução agitada de 3-amino-l-propanol (3,0 g, 68,83 mmol), bicarbonato de sódio (14,5 g, 172,6 mmol), água (100 ml) e dioxano (52 ml). A mistura foi extractada com acetato de etilo (3x200 ml) e as fases orgânicas combinadas foram lavadas com salmoura, secas (MgSOJ e evaporadas sob pressão reduzida, obtendo-se o produto na forma de um óleo transparente (11,1 g, 72%).

84 540 ΕΡ Ο 667 859 / ΡΤ 25 3-(benziloxiacetamido)-l-propil-(6-BOC-hidrazino)nicotinato

Adicionou-se uma solução de DCC (4,48 g, 21,71 mmol) em DMF (10 ml), gota a gota a 0°C a uma solução, sob agitação, de ácido 6-(BOC-hidrazino)nicotínico (5,0 g, 19,74 mmol), DMF (25 ml), 3-benziloxiacetamido-l-propanol (4,4 g, 19,74 mmol) e 4-(dimetilamino)piridina (2,48 g, 19,74 mmol) e a mistura foi agitada durante 16 horas. Diluiu-se a solução com acetato de etilo (250 ml), arrefeceu-se e removeu-se o sólido por filtração. Evaporou-se o filtrado até à secura sob pressão reduzida e repartiu-se o resíduo oleoso entre acetato de etilo (200 ml) e solução saturada de bicarbonato de sódio (30 ml). Separou-se a camada orgânica, secou-se (MgSOJ e evaporou-se sob pressão reduzida. O produto foi purificado por cromatografia em coluna (sílica gefacetato de etilo) para originar um sólido branco (5,1 g, 56%). 3-hidroxiacetilamido-1 -p.ropil-6-(BOC-hidrazino)nicotinato

Adicionou-se 3-(benziloxiacetilamido)-l-propil-(6-BOC-hidrazino)nicotinato (1,6 g, 3,48 mmol) em formato de amónio (1,1 g, 17,44 mmol) a uma suspensão de paládio em carbono activado (Aldrich a 10%, 1,0 g) em metanol (16 ml). A mistura foi agitada rapidamente sob árgon, durante 16 horas. A suspensão foi filtrada através de celite e evaporada sob pressão reduzida, para originar uma espuma branca (1,0 g, 78%). 3-metanossulfoniloxiacetilamido-l-propil-(6-BOC-hidrazino)nicotinato

Adicionou-se, gota a gota, uma solução de cloreto de metanossulfonilo (0,23 ml, 2,98 mmol) em diclorometano (5 ml) a 0°C a uma solução agitada de 3-(hidroxiacetilamido)-l-propil-(6-BOC-hidrazino)nicotinato (1,0 g, 2,17 mmol) e trietilamina (0,41 ml, 2,98 mmol) em diclorometano (20 ml), e a mistura reaccional foi agitada a 0°C durante mais 2 horas e em seguida evaporada sob pressão reduzida. Dissolveu-se o resíduo em acetato de etilo, lavou-se com água, secou-se (MgS04) e evaporou-se sob pressão reduzida, para originar uma espuma branca (1,2 g, 98%). 3-(brornoacetilamido)-l-propil-(6-BOC-hidrazino)nicotinato

Adicionou-se uma solução de brometo de lítio (1,7 g, 26,9 mmol) em acetona (30 ml), gota a gota, a uma solução agitada de 3-(metanossulfoniloxiacetilamido)-l-propil-(6-BOC-hidrazino)nicotinato (1,2 g, 2,68 mmol) em acetona (20 ml), e a mistura reaccional foi aquecida ao refluxo durante 1,5 horas. Deixou-se arrefecer até à temperatura ambiente e em

84 540

ΕΡ 0 667 859 / PT seguida evaporou-se a mistura sob pressão reduzida e o resíduo foi dissolvido em acetato de etilo (100 ml) e lavado com água (3x100 ml). Separou-se a camada orgânica, secou-se (MgS04), evaporou-se sob pressão reduzida e o produto foi purificado por cromatografía em coluna (sílica geliacetato de etilo) para originar uma espuma branca (0,8 g, 69%). Ή RMN (CDC13) δ 1,47 (s, 9H), 2,00 (penteto, 2H, J=6,2 Hz), 3,43 (q, 2H, J=6,3 Hz), 3,89 (s, 2H), 4,39 (t, 2H, J=5,9 Hz), 6,73 (d, 1H, J=8,8 Hz), 8,15 (dd, 1H, J=2,2 Hz, 8,7 Hz), 8,82 (d, H, J=2,2 Hz).

Monobromidrato de 3-(bromoacetilamido)-l-propil-(r6-hidrazino)nicotinato

Adicionou-se brometo de hidrogénio (Aldrich, solução a 30% em peso em ácido acético, 1 ml) a uma solução agitada de 3-(bromoacetilamido)-l-propil-(6-BOC-hidrazino)nicotinato (50 mg) e ácido acético (1 ml), sob árgon. A mistura reaccional foi agitada durante 3 minutos e adicionou-se éter (20 ml) imediatamente, para precipitar o produto. Após agitação durante 1 minuto, removeu-se o éter por decantação. O produto foi repetidamente lavado com éter (6-10 vezes) e removeram-se os vestígios finais por evaporação, sob pressão reduzida, para originar um sólido branco (18 mg, 37%). Ή RMN (DMSO-dfi) δ 1,86 (penteto, 2H, J=6,5 Hz), 3,22 (q, 2H, J=6,5 Hz), 3,83 (s, 2H), 4,25 (t, 2H, J=6,2 Hz), 6,91 (d, 1H, J=8,8 Hz), 8,14 (dd, 1H, J=2,2 Hz), 8,8 Hz), 8,40 (t largo, 1H, D20 permutável), 8,69 (d, 1H, J=8,8 Hz), espectro de massa (FAB); m/e (intensidade relativa); 333(100, M+l), 331(100, M+l), 253(15), 194(43), 178(20).

Exemplo 18

Utilizando o processo descrito no Exemplo 1, o ácido a-t-butil-(L)-glutâmico originou o ácido 6-BOC-hidrazino)nicotinamida-a-t-butil-(L)-glutâmico. Utilizando o processo do Exemplo 10, o ácido 6-BOC-hidrazinonicotinamida-a-t-butil-(L)-glutâmico foi convertido na molécula ligante de ácido glutâmico, derivada de γ-bromoacetato.

Procedimento final de desproteccão

Adicionou-se brometo de hidrogénio (Aldrich, solução a 30% em peso em ácido acético, 1,0 ml) a uma solução agitada de bromoacetato (100 mg, 0,162 mmol) em ácido acético (2 ml). A mistura reaccional foi agitada durante 3 minutos e adicionou-se imediatamente éter dietílico (20 ml) para precipitar o produto. Deixou-se o sólido branco assentar no fundo do frasco e removeu-se a solução sobrenadante de brometo de hidrogénio, com uma pipeta Pasteur. Este processo foi repetido dez vezes com éter e os vestígios

84 540

ΕΡ 0 667 859 / PT 27 remanescentes de éter foram removidos por evaporação sob pressão reduzida e secagem in vacuo durante a noite. O produto era um sólido branco (50 mg, 57%). Ή RMN (MeOH-d4) δ 2,00 (penteto, 2H, J=6,3 Hz), 2,09-2,33 (m, 2H), 2,52 (t, 2H, J=7,3 Hz), 3,95 (s, 2H), 4,15 (t, 2H, J=5,l Hz), 4,22 (t, 2H, J=6,2 Hz), 4,63 (m, 1H), 6,97 (d, 1H, J=8,6 Hz), 8,21 (dd, 1H, J=2,l, 9,2 Hz), 8,47 (d, 1H, J=2,l Hz); espectro de massa (FAB); m/e (intensidade relativa); 463(100, M+l), 461(100, M+l), 379(10), 339(10), 269(15).

Processo de marcação radioactiva

Ligaram-se os compostos de acordo com o invento a grupos sulfidrilo do fragmento F(ab') do anticorpo monoclonal C46,3, utilizando métodos convencionais (veja-se Chemical Modification of Proteins, Means and Feeney, Holden-Day Inc 1971). A ausência de grupos SH livres após modificação foi confirmada pelo teste de Grassetti e Murray (Arch. Biochem. Biophys., 119, 41-49 (1967)). O número de hidrazinas livres por fragmento F(ab’) foi determinado por meio de um teste de formação de hidrazona, descrito por Abrams et al. (J. Nucl. Med., 31, 2022 (1990)). A proteína modificada foi então marcada radioactivamente, utilizando um processo semelhante ao descrito por Abrams et al. (J. Nucl. Med., 31, 2022 (1990)) e utilizando para comparação, uma ligação directa de 99mTc ao fragmento, utilizando o método de Bremmer e utilizando duas moléculas ligantes de hidrazino, 15 e 16.

Estudos de biodistribuicão em ratinhos

Cresceram-se tumores em ratinhos atímicos “nús” de 3-4 meses de idade, por injecção subcutânea no flanco traseiro, de 10h células de carcinoma de colon LS174T.

Injectaram-se fragmentos marcados com ""'Tc em ratinhos, através da cavidade retro-orbital. Os ratinhos receberam 5-50 pg de proteína e 150-800 pCi de 99mTc, num volume de cerca de 300 μΐ de solução salina tamponada com fosfato. A quantidade injectada por ratinho foi quantificada, quer pela perda de peso e radioactividade de cada seringa, quer pela radioactividade absorvida pelo ratinho. A dissecção foi realizada a 4 e a 22 horas. Os órgãos foram pesados numa balança analítica e a sua radioactividade foi determinada num contador gama. Determinou-se a biodistribuição nos órgãos a partir desta medição, utilizando métodos convencionais,

84 540

ΕΡ 0 667 859 / PT assumindo que o volume sanguíneo do ratinho era de 8%. Recolheram-se alíquotas adicionais (15 μΐ) de sangue a 0,5 e 2 horas, para estudos farmacocinéticos. Todos os valores de contagem gama foram corrigidos quanto ao decaimento radioactivo, contando as alíquotas retidas da dose injectada, ao mesmo tempo que os órgãos. Os dados finais são expressos como a média de cinco (5) ratinhos por grupo, (+/-) desvio padrão, na Tabela seguinte.

Analisando os resultados apresentados nas Tabelas 1 e 2, é evidente que os ligantes que continham uma função éster clivável (compostos 8, 9, 10 e 17) conseguiram um melhor direccionamento para o tumor, comparados com a marcação directa e marcação através de ligantes não cliváveis (compostos 15 e 16). As razões tumor/sangue eram significativamente maiores, devido a uma combinação de retenção no tumor e libertação pelo sangue mais rápida, como pode ser observado pela % de dose injectada/grama de tecido (Tabela 2). Os ligantes baseados em dissulfureto (compostos 5 e 7) originaram conjugados com uma eliminação pelo sangue rápida. TABELA 1

Razões órgão/sangue na altura da dissecção para ratinhos com tumores, aos quais foi fornecido FAB' C46.3 marcado com 99nTpc por mej0 je ligantes vs. meios directos

Ligante 5-Fab' MSR = 3,1 Ligante 7-Fab' MSR = 0,75 Ligante 8-Fab' MSR = 1,5 Ligante 9-Fab' MSR = 2,7 Orgão 4 horas 22 horas 4 horas 22 horas 4 horas 22 horas 4 horas 22 horas Sangue (1,00) (1,00) (1,00) (1.00) (1,00) (1,00) (1,00) (1,00) Pulmão 0,59±0,09 1,37±0,40 0,50=0,08 0,90±0,21 1.01=0.27 1,60±0,49 0,70±0,04 I,ll±0,10 Baço 0,31 ±0,04 1,28±0,44 0,34±0,04 0.92=0,20 0,42=0,15 1,61=0,19 0,31 ±0,05 1,16±0,14 Fígado 0.63±0,06 2,50±0,78 0,60±0,08 1,28=0,31 0,69±0,2i 2,42±0,57 0,59±0,05 1,86±0,34 Rím 54,6±6,3 282=58 13,5 ±2,3 61,4=14,5 116±23 316±63 55.9±6,7 121±13 Tumor 1,58±0,38 4,41 = 1,34 1,14=0,52 2,77±0,72 3,01 ±0,46 12,8±1,4 2,03±0,69 10,9±2,2 Músculo 0,33±0,18 0,80±0,43 0,20±0,11 0,36=0,08 0,20±0,05 0,24±0,05 0,14±0,02 0,18±0,02

84 540

ΕΡ 0 667 859 / PT 29

Ligante 10-Fab' MSR = 4,5 Ligante 12-Fab' MSR = 0,87 Ligante 17-Fab' MSR = 3,0 Orgão 4 horas 22 horas 4 horas 22 horas 4 horas 22 horas Sangue (1,00) (1.00) (1.00) (1.00) (1,00) (1,00) Pulmão 0,75±0,33 1,47=0,11 0,59=0,07 0.90=0,25 0,77=0,13 1,82±0,45 Baço 0,37±0,16 1,88=0,44 0.38=0,08 1,09±0.36 0,55=0,07 3,14±0,89 Fígado 0,77±0,21 4,20=1.01 0.74=0,18 1.91=0,56 0,76=0,04 5,03±2,51 Rim 54,6=4,9 254=30 23,5±5,3 128±33 107=7 598±200 Tumor 1,98=0,43 15.6±6,1 1,55=0,86 3,97=2,02 2,12=0,81 12,8=2,3 Músculo 0,16=0,03 0,35=0,05 0,38=0,18 0,68=0,18 0,73=0,39 2,42±1,15 *Ligante 15-Fab' MSR = 0,62 *Ligante 16-Fab' MSR = 0,95 *Fab' marcado directamente Orgão 4 horas 22 horas 4 horas 22 horas 4 horas 22 horas Sangue não realizado (1,00) não realizado (1.00) (1,00) (1,00) Pulmão 0,55±0,21 1,12=0,30 0,70±0.11 0,85±0,09 Baço 0,42±0,08 1,54=0,38 0,37±0,05 0,71±0,10 Fígado 0,65±0,06 2,71±0,56 0,73±0,05 1,53±0,28 Rim 41,5±15,2 155=46 69,2±14,1 114±14 Tumor 2,00±0.59 5,09±1,06 2,39±0,55 4,02=1,13 Músculo 0,24=0,14 0.95±0,41 0,17±0,04 0,20=0,20

Notas: 1. Todos os resultados são médias de 5 ratinhos ± desvio padrão. 2. MSR = Razão de substituição molar, número de hidrazinas incorporadas por fragmento Fab'. 3. *Resultados de conjugados de ligantes não cliváveis e marcação directa para comparação. 4. >95% do 9,mTc foi ligado por Fab', tal como determinado por técnicas convencionais de cromatografia em camada fina utilizadas em medicina nuclear. TABELA 2 % de dose iniectada por grama de tecido na altura da dissecção, para ratinhos que possuem tumores, aos quais foi fornecido Fab'C46.3 marcado com 99mjc por meio de ligantes vs. meios directos

Ligante 5-Fab' MSR = 3,1 Ligante 7-Fab' MSR = 0,75 Ligante 8-Fab' MSR = 1,5 Ligante 9-Fab' MSR = 2,7 Orgão 4 horas 22 horas 4 horas 22 horas 4 horas 22 horas 4 horas 22 horas Sangue 1,29±0,13 0,23±0,09 3,11±0,73 0,85±0,10 1,95±0,21 0,29±0,02 2,18±0,02 0,35±0,03 Pulmão 0,76±0,11 0,30±0,06 1,50±0,17 0,75±0,12 1,93±0,38 0,47±0,16 1,53±0,08 0,39±0,06 Baço 0,40±0,02 0,28±0,09 1,05±0,28 0,76±0,07 0,80±0,19 0,47±0,06 0,66±0,12 0,40±0,07 Fígado 0,81 ±0,10 0,54±0,07 1,83±0,27 1,06=0,13 1,32±0,24 0,70±0.16 1,28±0,07 0,63±0,08 Rim 70,1 ±6,6 62,3±l 1,3 40,6±4,0 51,0==6,2 223=27 91,2±20,0 121 ± 12 41,8±6,7 Tumor 1,99±0,71 0,96±0,16 3,43±1,57 2,30=0,48 5,87±1,03 3,72±0,58 4,45±1,71 3,74±0,65 Músculo 0,44±0,29 0,18±0,13 0,58±0,23 0,30±0,03 0,39±0,04 0,07±0,02 0,31 ±0,06 0,06±0,01 30 84 540

ΕΡ 0 667 859 / PT

Ligante 10-Fab' MSR = 4,5 Ligante 12-Fab’ MSR = 0,87 Ligante 17-Fab' MSR = 3,0 Orgão 4 horas 22 horas 4 horas 22 horas 4 horas 22 horas Sangue 2,63±0,26 0.35±0.06 1,92=0.42 0,59=0,11 1,55±0,15 0,24±0,09 Pulmão 2.10±0,89 0,5l±0,l2 1,11=0.20 0.51=0,07 1,18=0,19 0,40±0,03 Baço l,03±0,35 0,64±0.l2 0,71=0,11 0,62=0.13 0,86=0,14 0,69±0,10 Fígado 2,l4±0,46 l,43±0.20 1.37±0.15 1.09±0,17 1,18±0,17 1,05±0,36 Rim 154=15 87,6=1 l,5 43,4=4.6 72,9± 10,0 167±23 127il4 Tumor 5,38±0,83 5,l8±l,60 2,83±1.41 2,19=0,62 3,29±1,23 2,88=0,57 Músculo 0,44±0,08 0,l2±0,0l 0.74±0.37 0,39=0,05 1,17±0,69 0,56=0,27 *Ligante 15-Fab' MSR = 0,62 *Ligante 16-Fab' MSR = 0.95 *Fab' marcado directamente Orgão 4 horas não realizado 22 horas 4 horas j 22 horas 4 horas 22 horas Sangue 2.69=0,29 não realizado 1 0,72=0.12 1,65±0,10 0,35=0,04 Pulmão 1,48=0,57 i 0,79=0.19 1,15±0,18 0,30=0,03 Baço 1,12=0,10 j 1,10=0,28 0,62±0,08 0,25±0,04 Fígado 1,72=0,17 1,91=0,31 1,21±0,10 0,53=0,10 Rim 104=20 1 117=23 114±23 40,1±5,8 Tumor 5.25=1,00 j 3,62=0,72 3,97±1,04 1,41=0,41 Músculo 0.62=0,28 0.72=0.40 0,28±0,06 0,07=0,01

Notas: 1. Todos os resultados são médias de 5 ratinhos ± desvio padrão. 2. MSR = Razão de substituição molar, número de hidrazinas incorporadas por fragmento Fab'. 3. *Resultados de conjugados de ligantes não cliváveis e marcação directa, para comparação. 4. >95% de 99mTc foi ligado por Fab', tal como determinado por técnicas convencionais de cromatografia em camada fina, utilizadas em medicina nuclear.

Lisboa,

*ÍZ fiOV. 200J

Por AnorMED Inc. - O AGENTE OFICIAL -

OifclQíQV ©

ESG.® AOTtóia IOÂO DA CUNHA FERRE1RÂ Ag. Of. Pr. Ind.

Boo dos Flores, 74 - 4.®

LISBQA

Claims

84 540 ΕΡ 0 667 859 / PT 1/8

REIVINDICAÇÕES 1. Composto de fórmula geral (I)

J—T -0-2 em que E é um grupo alquilideno ou representa H,, caso em que o composto está na forma de sal de adição ácida, J é seleccionado de entre -CO-NH, -CO-O-, -CO-S- e -NH-CO-, T é uma cadeia de alquileno ou se J é -CO-NH-, T é o resíduo de uma porção de aminoácido, Q é dissulfureto, éster ou tioéster e Z é um bromoacetato, maleimido, dissulfureto ou éster de N-hidroxi-succinimidilo
2. Composto de acordo com a reivindicação 1, em que na fórmula (I), quando E é um grupo alquilideno, é um alquilideno de cadeia linear ou ramificada de até 4 átomos de carbono.
3. Composto de fórmula geral (Ia)

84 540 ΕΡ 0 667 859 / PT 2/8 em que E é definido como na reivindicação 1, R é H ou CH3 e R’ é H ou N02.
4. Composto de fórmula CCOH

84 540 ΕΡ 0 667 859 / PT 3/8 e os seus sais de adição de ácido.
7. Composto de fórmula

84 540 ΕΡ 0 667 859 / PT 4/8 e os seus sais de adição de ácido.
10. Composto de acordo com a reivindicação 3, de fórmula:

e os seus sais de adição de ácido.
11. Composto de fórmula:

e os seus sais de adição de ácido.
12. Composto de fórmula:

e os seus sais de adição de ácido. 84 540 ΕΡ 0 667 859 / PT 5/8
13. Composto de fórmula:

COOH

3r e os seus sais de adição de ácido.
14. Composto de acordo com a reivindicação 1, de fórmula:

'N

e os seus sais de adição de ácido.
15. Composto de fórmula: O

e os seus sais de adição de ácido. 84 540 ΕΡ 0 667 859 / PT 6/8
16. Composto de acordo com a reivindicação 1, de fórmula:

e os seus sais de adição de ácido
17. Composto de fórmula:

e os seus sais de adição de ácido.
18. Composto de fórmula:

e os seus sais de adição de ácido. 84 540 ΕΡ 0 667 859/PT 7/8
19. Composto de fórmula:

e os seus sais de adição de ácido.
20. Composto de fórmula:

e os seus sais de adição de ácido.
21. Conjugado formado pela reacção de uma macromolécula com um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores.
22. Conjugado de acordo com a reivindicação 21, em que a macromolécula compreende uma imunoglobulina ou um fragmento seu derivado.
23. Macromolécula marcada compreendendo um átomo metálico ligado a um conjugado de acordo com a reivindicação 21 ou 22.
24. Macromolécula marcada de acordo com a reivindicação 23, em que o metal é seleccionado entre os radioisótopos de Tc e Re. 84 540 ΕΡ 0 667 859 / PT 8/8
25. Composto de fórmula geral (II): ENNE CCNH-ÍCH^-S-S w !!

N (H) em que E é como definido na reivindicação 1. Lisboa, '? ® a® Por AnorMED Inc. - O AGENTE OFICIAL -