PT661291E - Sintese de oligorribonucleotidos em fase solida - Google Patents

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DESCRIÇÃO "SÍNTESE DE OLIGORRIBONUCLEÓTIDOS EM FASE SÓLIDA" A policondensação quimica de mononucleótidos é um importante método para a preparação de ácido desoxirribo-nucleicos (ADN) ou de ácido ribonucleico (ARN).

Um problema básico na síntese química de ADN ou de ARN é a selecção de grupos protectores apropriados dos grupos amina e hidroxilo das bases nucleotídicas e dos resíduos de açúcar. Estes grupos protectores devem por um lado ser estáveis sob as condições da reacção de policondensação, isto é, durante a reacção, e por outro lado devem ser suficientemente lábeis a fim de poderem ser separados novamente no fim da reacção sem que ocorra a cisão das ligações fosfodiéster formadas [H. G. Khorana; Pure Appl. Chem. 17 (1968) 349]. É especialmente problemática a síntese química de ARN, uma vez que o resíduo de açúcar ribose possui dois grupos hidroxilo que têm de ser ambos protegidos. Os grupos protectores do grupo hidroxilo em 5' deve ser mais tarde separado antes de cada fase da policondensação, isto é, sem cisão do grupo protector de hidroxilo em 2' . 0 grupo protector do grupo hidroxilo em 2' pelo contrário deve ser separado apenas no fim da síntese do ARN e portanto sob condições que não provoquem qualquer cisão ou isomerização da ligação fosfodiéster [C.B. Reese, Nucleic Acids and Molecular Biology, Vol. 3, F. Eckstein & D. M. Lilley eds., Springer-Verlag Berlim-Heidelberga 1989, pág. 164-181]. A síntese eficaz de oligorribonucleótidos sobre materiais de suporte sólidos está por conseguinte ainda muito afastada na sua eficácia do bom funcionamento do método da fosfoamidite para a formação de cadeias de oligodesoxirribonucleótidos. É apresentada uma revisão no trabalho de C.B. Reese, Nucleic 1 Ι]

Acids and Molecular Biology, Vol. 3, F. Eckstein & D. M. Lilley eds., Springer-Verlaq Berlim-Heidelberga 1989, pág. 164-181], S. L. Beaucage, R. P. Iyer [Tetrahedron 48 (1982) 2223-2311], E. Ohtsuka, S. Iwai [em Synthesis and Application of DNA and RNA, S. A. Narang, Ed., Academic Press, Londres 1987, pág. 115--136] e 0. Sakatsuma et al. [Tetrahedron 47 (1991) 8717-8728].

Na prática, utilizam-se principalmente 5'-0-dimetoxi-tritil-2'-0-terc.-butildimetilsilil-ribo-3'-0-(β-ciano-etil, N-di-isopropil)fosfoamidites protegidas por acilo nas agliconas, descritas no trabalho de N. Usman et al. [J. Am.

Chem. Soc. 109 (1987) 7845], K.K. Ogilvie et al. [Proc. Natl.

Acad. Sei. USA 85 (1988) 5764], Estes compostos estão disponíveis no comércio. As sínteses de oligorribonucleótidos efectuadas com estes compostos não são, no entanto, de modo algum satisfatórias, de tal modo que se torna necessário procurar novas soluções [Μ. H. et al.: J. Org. Chem. 56 (1991) 4608, D. Gasparutto et al.: Nucleosides & Nucleotides 9 (1990) 1087, T. Wu et al.: J. Org. Chem. 55 (1990) 4717].

Toda uma série de outras combinações de grupos protectores para as funções hidroxilo em 2' e em 5' do resíduo de açúcar ribose, que são referidas na literatura acima citada, não produz igualmente os resultados pretendidos.

Para além do grupo protector 2'-O-terc.-butildimetil-sililo, utilizam-se como grupos protectores para a posição 2’determinados grupos acetal. Investigações sistemáticas de Reese, resumidas por exemplo em Beaucage, Tetrahedron 48 (1992) 223, mostraram em resumo que é possível combinar grupos acetal como o resíduo 1-(2-clorofenil)-4-metoxipiperidinilo-4 (Cpmp) ou 1-(2-fluorofenil)-4-metoxipiperidinilo-4 (Fpmp) no grupo 2’--OH com o resíduo 5'-O-dimetoxitritilo e o resíduo 5'-pixilo (9-(9-fenil)xantenil-éter), uma vez que estas últimas funções são facilmente removíveis por completo por meio de ácidos fracos, principalmente antes que o acetal seja atacado. Também estas 5'-O-dimetoxitritil-2'-O-Fpmp-3'-0-(β-ciano-etil, N-di- 2

-isopropil)fosfoamidites estão disponíveis no comércio.

Uma das maiores vantagens dos grupos protectores acetálicos frente ao grupos protectores de sililo é que podem ser introduzidos selectivamente sem reacções secundárias na posição 2' . Uma outra vantagem é o acoplamento eficaz dos acetais que cobre o grupo protector 2' com um maior preenchimento do espaço. Deste modo, por exemplo, o acoplamento de monómeros de ribonucleótidos protegidos com 2'-0-tetra--hidropiranilo (2'-0-Thp) é mais eficaz do que com o grupo protector 2'-0TBDMS, que é mais exigente estericamente. O trabalho de 0. Sakatsume et al. [Tetrahedron 47 (1991) 8717-8728] com a introdução do grupo protector 2'-0-1-(2-cloro-etoxi)etilo (Cee) mostra no entanto que é recomendável uma adequação mais exacta dos grupos protectores acetálicos com o resíduo 5'-O-dimetoxitritilo e o resíduo 5'-pixilo.

Surpreendentemente conseguiu-se descobrir grupos protectores para o grupo hidroxilo em 2’ que são superiores aos até agora descritos com referência à síntese de ARN. Para esta conclusão são critérios fundamentalmente a preparação simples e selectiva dos componentes monómeros e a eficácia da acoplagem dos monómeros. Os grupos protectores apresentar uma estabilidade algo superior em comparação por exemplo com o grupo Ctmp frente a ácido dicloroacético a 1,5 %, o qual é utilizado para a remoção da protecção do grupo 5'-OH durante o ciclo de acoplagem, e por outro lado deve ser ainda suficientemente lábil em relação aos ácidos, a fim de que no fim da síntese possa ser ainda removível rapidamente.

As sínteses de oligonucleótidos com estas fosfitamidites de oligorribonucleótidos protegidos em 2' por acetal de novo tipo decorrem com muito bons resultados. 0 facto de que na utilização de grupos protectores β-elimináveis, estes poderem ser separados mesmo em suportes sólidos garante uma purificação e um isolamento simples do oligorribonucleótido protegido em 2' 3

t por acetal. Estes compostos podem também ser entendidos como uma forma estável do oligorribonucleótido que, ao contrário dos oligorribonucleótidos não protegidos, podem ser conservados sem inconvenientes durante períodos prolongados e em seguida ser transformados num momento ulterior quando necessário por meio de tratamento com ácido no oligómero livre.

Os oligonucleótidos que contêm uma ou mais unidades de ribonucleótidos sob a sua forma protegida, especialmente aqueles que possuem estas unidades na extremidade 3' e/ou 5', apresentam um comportamento de resistência muito melhorada frente às nucleases, sendo as propriedades de hibridação apenas muito ligeiramente modificadas. Estes oligonucleótidos são por conseguinte apropriados para serem utilizados como oligonucleótidos anti-sentido ou ribozimas [A. Peyman, E. Uhlmann, Chem. Rev. 90 (1990) 543] . E objecto processo para a

da presente invenção, por conseguinte, preparação de um composto da fórmula I um 4

em que n é um número de 1 a 150, de preferência de 1 a 50, de modo especialmente preferido de 8 a 30, de modo muito especialmente preferido de 8 a 20; L significa oxi, sulfanodiilo ou imina, de preferência oxi; BB independentemente entre si é 5

e E representa OH ou NH2 e Y representa hidrogénio, alquilo-Ci-C4, flúor, cloro, bromo ou alcenilo-C2-C6, alcinilo-C2-C5, de preferência 6 t hidrogénio, CH3 ou 1-propinilo, de modo especialmente preferido hidrogénio; ou BB pode significar, para além das bases nucleosidicas naturais, também outras bases nucleosidicas modificadas, como 5-(hidroximetil)uridina, 5-amino-uridina, pseudo--uridina, di-hidro-uridina, lnosina, 8-aza-7-desaza--adenosina, tubercidina, nebularina, xantosina, 2-amino-adenosina, etenoadenosina, 7-desazaguanosina, 04-metil-timidina, N6-metiladenosina, 06-metilguanosina ou nucleósidos de piridopirimidina; W significa, independentemente entre si, oxigénio ou enxofre, de preferência oxigénio; T representa, independentemente entre si, hidrogénio, -0CH3, -0-CH2CH3, -0-CH2-CH=CH2 ou OH, sendo OH pelo menos uma vez; Y' representa oxi, sulfanodiilo, imina, (CH2)k ou N(CH2)k, em que k significa um número inteiro de 1 a 18, de preferência de 1 a 6, sendo Y' de preferência oxi; U representa hidroxilo, mercapto, SeH, alcoxilo-Ci-C18, alquilo-Ci-Cie, arilo-C6-C2o/ aril-C6-Ci4-alquilo-Ci-C8, NHR17, NR17R18 ou um resíduo da fórmula (OCH2CH2) cO (CH2) c-CH2R20, sendo U de preferência hidroxilo, mercapto, alcoxilo-C:-C6, alquilo-Ci-C6/ NHR17 ou NR17R18, de modo especialmente preferido hidroxilo ou alquilo-Ci-C6; em que R17 significa alquilo-Ci-Ci8, arilo-C6-C2o, arÍl-C6-C14~ -alquilo-Ci-Cg, - (CH2)d- [NH (CH2-)d]d'-NRiaRi8; de preferência alquilo-Ci-C8 ou metoxietilo, de modo especialmente preferido alquilo-Ci-C4 ou metoxietilo, em que 7 r d significa um número inteiro de 2 a 6 e d' significa um número inteiro de 0 a 6, e R18 representa alquilo-Ci-Ci8, arilo-C6-C2cn aril-C6-Ci4- -alquilo-Cx-Cs ou, no caso de NR17R18, em conjunto com R17 e com o átomo de azoto a que se encontram ligados significa um anel heterociclico pentagonal ou hexagonal, que adicionalmente pode contar um outro heteroátomo da série 0, S e N, como por exemplo o anel morfolinilo e o anel imidazolidinilo; R19 independentemente entre si significa hidrogénio ou alquilo-Ci-Cõ ou alcoxil-Ci-C4-alquilo-Ci-C6; c significa um número inteiro de 1 a 100, de preferência de 3 a 20 e de modo especialmente preferido de 3 a 8; c' significa um número inteiro de 0 a 18, de preferência de 0 a 15; R20 significa hidrogénio ou um grupo funcional como hidroxilo, amina, NHR17, COOH, CONH2, COOR21 ou flúor, cloro ou bromo, em que R21 é alquilo-Ci-C4, de preferência metilo;

C1 e C2 são iguais ou diferentes e representam hidrogénio, alquilo-Ci-Cie, alcenilo-C2-Ci8, alcinilo-C2-Ci8, alquil--Ci-Ci8-carbonilo, alcenil-C2-Ci8-carbonilo, alcinil-C2-Ci8--carbonilo, arilo-C6-C2o/ aril-C6-Ci4-alquilo-Ci-C8 ou um resíduo da fórmula II

(II) 8

U ll em que W possui o significado anteriormente definido; Q e Q' independentemente um do outro representam hidroxilo, mercapto, SeH, alcoxilo-Ci-C22 ou -0-(CH2)b--nr15r16, com b igual a 1 a 6 e R15 e R16 independentemente vim do outro significam hidrogénio, alquilo-Ci-Cie, de preferência alquilo-Ci-Cg, arilo-C6-C2cv aril-C6-Ci4-alquilo-“Ci~C8, aril-Ce-Cií-alcoxilo-Ci-Ce, em que arilo significa também heteroarilo e arilo possui eventualmente 1, 2 a 3 substituintes iguais ou diferentes da série carboxilo, amina, nitro, alquil-Ci-C4-amina, alcoxilo-Ci~C6, hidroxilo, flúor, cloro, bromo e ciano, ou significa alquil-Cú-Cie-mercapto, NHR17, NR17R18, em que R17 e R18 possuem os significados anteriormente definidos, ou em conjunto com o átomo de azoto a que se encontram ligados formam um anel triangular a hexagonal, ou Q ou Q' significa de preferência hidroxilo, mercapto, OCH2CH3, O-Í-C3H7, 0-n-C3H-7, 0~n-Ci8H37, 0-(CH2)3— - (3-piridilo), 0- (CH2) 2- (4-nitrofenilo), farsenilo, fitilo, vitamina A, vitamina E, testosterona, colesterol, CH3, 0-(CH2)4- - (9-acridina); ou

Q e Q' representam um resíduo da fórmula III 9 (III)

em que g e g' são iguais a 0 ou 1, h é igual a 0 a 10, G significa alquileno-C2-Ci2, em especial alquileno-C2-C4, aril-C6-Ci4-dialquileno-Ci-C8, arileno-C6-Ci8, eventualmente substituído uma a três vezes por flúor, cloro, bromo, amina, hidroxilo, alquilo-Ci-Ci8, alcoxilo-Ci-Cie, alcoxi-Ci-Cie-carbonilo, arilo-Cs-Ci4, aril-C6~Ci4--alquilo-Ci-Cis ou aril-C6-Ci4-alcoxilo-Ci-Ca, um grupo da fórmula (CH2CH2N' ) íCH2CH2 ou (CH2N' )íCH2, em que i é um número inteiro de 1 a 11, de preferência de 1 a 5 e Ν' representa oxi, sulfanodi-ilo, imina ou metileno e W, U e Y' possuem os significados anteriormente definidos; ou Q e Q' significam um grupo que favorece a assimilação intracelular ou que serve de marcação de uma sonda de ADN ou que inicia a reticulação ou a cisão de análogos de oligonucleótidos durante a hibridação destes aos ácidos nucleicos alvo, podendo também na fórmula I a sequência de ácidos nucleicos ser interrompida uma ou várias vezes por adaptadores da 10 fórmula III e podendo formar conjugados segundo processos conhecidos também por meio de bases nucleicas ou por meio da espinha dorsal de diésteres fosfóricos ou diésteres fosfotíónicos; C1 e C2 significam em especial hidrogénio e um resíduo da fórmula II com W = oxi e Q = y' = hidroxilo; caracterizado por

a) se proteger um composto da fórmula IV

(IV) em que B representa

11 r —a,11 '

em que 12 L·, .1.. ^ R3 significa em cada caso independentemente um grupo da fórmula v^r\ ou

V -CH, -CH; Γ\ -NO, R4 representa hidrogénio ou 2-(p-nitrofenil}etilo; R5 significa °>-< ' °>-o ou

no2 R6 significa OH, NH2,

13 L·

ou Y representa hidrogénio , alquilo-Ci- "C4, flúor, cloro, bromo ou alcenilo-C2-C6, alcinilo-C2- -c6, de preferência hidrogénio, CH3 ou 1 -propinilo, de modo especialmente preferido hidrogénio; ou pode, para além das bases nucleosídicas naturais, também representar outras bases nucleosidicas modificadas, cujos grupos amina ou hidroxilo estão protegidos por grupos protectores apropriados, como o grupo para-nitro-feniletiloxicarbonilo, o grupo benzoílo e o grupo para--(t-butil)benzoílo para os grupos hidroxilo e os grupos benzoilo, para-(t-butil)benzoilo, para-nitrofeniletiloxi-carbonilo, isobutirilo, para-(terc-butil)fenilacetilo para os grupos amina, em que os nucleósidos com bases modificadas (BB) mencionados em seguida estão disponíveis no comércio e a introdução dos vários grupos protectores pode ser efectuada por exemplo de acordo com C. Lehmann et al., Nucl. Acids Res. 17 (1989) 2379; C. B. Reese "The Chemical Synthesis of Oligo and Polyribonucleosides" em Nucleic Acids and Molecular Biology, vol. 3, F. Eckstein & D. M. Lilley eds., Springer-Verlag Berlim - Heidelberga 1989, p. 164-181; E. Sonveaux, Bioorganic Chemistry 14 (1986) 274; A. Peyman, E. Uhlmann, Chem. Rev. 90 (1990) 543; S. L. Beaucage, R. P. Iyer, Tetrahedron 49 (1993) 1925, 2223, 6123; 5-(hidroximetil)uridina, 5-amino--uridina, pseudo-uridina, di-hidro-uridina, inosina, 8-aza-7-desaza-adenosina, tubercidina, nebularina, xantosina, 2-aminoadenosina, eteno-adenosina, 7-desaza- 14

V L-C, ^ -guanosina, 04-metiltimidina, N6-metiladenosina, 06-metil-guanosina ou piridopirimidino-nucleósidos, nas posições 3' e 5' de acordo com processos conhecidos, de preferência por reacção com 1,3-dicloro-l,1,3,3-tetraisopropil-dissiloxano de acordo com processos conhecidos [p. ex. por analogia com Markiewicz, J. Chem. Res., synop. 1979, 24,-

Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 7 (1980) 115], por exemplo em piridina a 0 °C, com obtenção dos compostos protegidos 3',5'-0--(tetraisopropildosiloxano-1, 3-diilo); b) em seguida fazer reagir o composto protegido com o éter vinilico da fórmula V,

em que r significa 1 ou 2 e X representa arilo-C6-Ci2, em que arilo pode possuir um ou mais substituintes, de preferência um a três, de modo especialmente preferido um a dois substituintes seleccionados de hidroxilo, mercapto, nitro, flúor, cloro, bromo, alquilo-Ci-C6, alcoxilo-Ci-C6, alquil-Ci-C6-mercapto, alcenilo-C2-C6, alcinilo-C3-C6/ C(0)0H, C(0)NH2, C(0)0- -alquilo-Ci-Cie, C (0) 0-arilo-C6-Ci2, C (O)-alquilo-Ci~Ci8, C (0) -arilo-C6-Ci2, 0—C(0)NH2, 0—C (0) 0—alquilo-Ci—Ci8, 0-C (0) 0-arilo-C6-Ci2, 0-C (0)-alquilo-Ci-Ci8, 0-C (0) -arilo--C6-Ci2, O-C (O) - [C.H2] Γ-X1 ou O-CÍOO-tCH^l.-X1, sendo X1 = arilo-C6-Ci2, que pode eventualmente conter um a três substituintes seleccionados de amina, hidroxilo, nitro, alquilo-Ci-C6, alcoxilo-Ci-Ce, alcoxi-Ci-C6-carbonilo, flúor, cloro ou bromo; 15 quando r=l, X representa ainda fenilo ou alcoxil-Ci-Cí-fenilo; quando r=2, X representa ainda CN, S-fenilo, SOz-fenilo, N-ftalimida ou NO2; quando r=l, X representa de preferência arilo-C6~Ci2^ em que ariio pode conter um a dois substitulntes, de preferência um substituinte, seleccionados de flúor, cloro, bromo, alquilo-Ci-Ci ou alcoxilo-Ci-C4 e pode eventualmente contar um substituinte seleccionado de 0-C (0) - [CH2] r-X1 ou 0-C (0) 0-[CH2] r-X1, sendo X1 = arilo-C6-Ci2, que pode conter um a três substituintes seleccionados de alquilo-Ci-C4, alcoxilo-Ci-Cí, flúor, cloro ou bromo; quando r=2, X representa de preferência 4-nitrofenilo; quando r=l, X representa de modo especialmente preferido 2,5--dicloro-4-pivaloiloxifenilo, 3-cloro-4-[2-(4-nitrofenil]-etoxicarboniloxi] -fenilo, 2-cloro-4-[2-(4-nitrofenil)- etoxicarboniloxi]-fenilo, 3-fluoro-4-[2-(4-nitrofenil)- etoxicarboniloxi]-fenilo, de modo especialmente preferido 3-fluoro-4-[2-(4-nitrofenil)etoxicarboniloxi]-fenilo; de modo análogo a processos conhecidos [p. ex. 0. Sakatsume et al.; Tetrahedron, 47 (1991) 8717-8728 e a literatura ai citada], isto é por exemplo o composto protegido em 3' e 5' é feito reagir num solvente orgânico apropriado, p. ex. tolueno com 1 a 20, de modo especialmente preferido com 1 a 5 equivalentes do éter vinilico da fórmula V, eventualmente após adição de um catalisador, de preferência um ácido, e efectuar o processamento final, eventualmente após neutralização, igualmente de acordo com processos conhecidos como por exemplo extracção, cristalização e cromatografia; c) cindir novamente os grupos protectores em 5' e em 3' , igualmente por analogia com processos conhecidos, em que no caso dos compostos protegidos com O-tetraisopropildissiloxano-1,3-diilo 16

em 3' e em 5' a cisão dos grupos protectores é efectuada por exemplo com HNEt3+;

d) introduzir o grupo protector em 5' com R2 = dimetoxitritilo, monometoxitritilo, pixilo ou tritilo, de preferência dimetoxitritilo, de acordo com processos conhecidos [p. ex. M.J. Gait, Oligonucleotide Synthesis - a practical approach, IRL Press, 1984], por exemplo o grupo dimetoxitritilo por reacção com cloreto de dimetoxitritilo em piridina, obtendo-se deste modo um composto da fórmula VI

R1 representa -[CH2]r-Xf sendo; r = 1 ou 2 e X representa arilo-C6-Ci2, em que arilo pode conter um ou mais substituintes, de preferência um a três, de modo especialmente preferido um a dois substituintes seleccionados de hidroxilo, mercapto, nitro, flúor, cloro, bromo, alquilo-Ci-C6, alcoxilo-Ci~C6, alquil-Ci-C6-mercapto, alcenilo-C2-Cs, alcinilo-C3-C6, C(0)0H, C(0)JMH2, C(0)o- -alquilo-Ci-Ci8í C (0) 0-arilo-C6-Ci2, C (0) -alquilo-Ci-Ci8, C (0) -arÍlo-C6-Ci2, 0-C(0)NH2, 0-C (0) O-alquilo-Ci-Cis, 0-C (0)0-arilo-C6-Ci2, 0-C (0)-alquilo-Ci-C18/ 0-C(0)-arilo- —Cc—Ci?# 0-C (0) - [CH2] r-X1 ou 0-C (0) 0- [CH2] r-X1, sendo X1 = 17 arilo-C6-Ci2, que pode eventualmente conter um a três substituintes scleccionados de amina, hidroxilo, nitro, alquilo-Ci-Cg, alcoxilo-Ci-C6/ alcoxi-Ci-C6-carbonilo, flúor, cloro ou bromo; quando r=l, X representa ainda fenilo ou alcoxil-Ci-C4-fenilo; quando r=2, X representa ainda CN, S-fenilo, SC>2-fenilo, N-ftalimida ou NO2; quando r=l, X representa de preferência arilo-C6-Ci2, em que arilo pode conter um a dois substituintes, de preferência um substituinte, seleccionados de flúor, cloro, bromo, alquilo-Ci-C4 ou alcoxilo-Ci-C4 e pode eventualmente contar um substituinte seleccionado de 0-C (O) - [CH2] r-X1 ou 0-C (0) O- [CH2] r-X1, sendo X1 = arilo-C6-Ci2, que pode eventualmente conter um a três substituintes seleccionados de alquilo-Ci-C4, alcoxilo-Ci~C4, flúor, cloro ou bromo; quando r=2, X representa de preferência 4-nitrofenilo; quando r=l, X representa de modo especialmente preferido 2,5--dicloro-4-pivaloiloxifenilo, 3-cloro-4-[2-(4-nitrofenil]-etoxicarboniloxi]-fenilo, 2-cloro-4-[2-(4-nitrofenil)- etoxicarboniloxi]-fenilo, 3-fluoro-4-[2-(4-nitrofenil) -etoxicarboniloxi]-fenilo, de modo especialmente preferido 3-fluoro-4-[2-(4-nitrofenil)etoxicarboniloxi]-fenilo; R2 representa dimetoxitritilo, monometoxitritilo, pixilo ou tritilo, de preferência dimetoxitritilo; e B possui o significado anteriunuente definido;

e) fazer reagir o composto da fórmula VI com um composto da fórmula VII 18

* r7r8 n-P

(VII)

U

em que Z' representa OR ou alquilo-Ci-Cie, alcoxilo-Ci-Ci8, arilo--C6-C2o ou aril-C6-Ci4-alquilo-Ci-C8, de preferência OR9, alquilo-Ci-C6, alcoxilo-Cx-Ce, arilo-C6~C2o ou aril-C6-Ci4--alquilo-Ci-Ce, e de modo especialmente preferido OR9; R7 e R8 são iguais ou diferentes e significam alquilo-Ci-C8, de preferência isopropilo, ou cicloalquilo-C5-Ci2, de preferência até Cs, benzilo ou fenilo ou, em conjunto com o átomo de azoto a que se encontram ligados, um anel heterociclico saturado ou insaturado, com eventualmente outros heteroátomos, como p. ex. morfolina, e substituintes como ésteres de 0(C)0-alquilo-Ci-C4; e R9 representa um grupo da fórmula

ou um grupo benzilo, o qual não possui substituintes ou possui um a quatro substituintes no anel, de preferência não possui substituintes, em que o ou os substituinte (s) é (são) independentemente entre si flúor, cloro, bromo ou um grupo (grupos) alquilo-Ci-C4, nitro, metoxilo ou carboxilo; 19

Z representa cloro ou bromo ou um resíduo da fórmula NR7R8, em que R7 e R8 possuem os significados anteriormente definidos;

na presença de uma base, de preferência piridina ou uma mistura de tetra-hidrofurano (THF), dioxano, diclorometano (DCM), clorofórmio e/ou acetonitrilo com uma trialquil-Ci-C4-amina, de preferência trimetilamina, trietilamina ou diisopropiletil--amina, ou, quando Z é um resíduo da fórmula NR7R8, então na presença de um composto da fórmula [HNR12R13R14] (+)A<_), em que R12, R13 e R14 podem ser iguais ou diferentes e significam um grupo alquilo-Ci-C4 e A = flúor, cloro ou bromo, em especial cloro, ou tetrazolo, obtendo-se um composto da fórmula VIII

o .B (VIII)

em que R1, R2, R7, R8, Z' e B possuem os significados anteriormente definidos;

f) fazer-se reagir o composto VI obtido segundo d) por meio de processos conhecidos com 1 a 10 equivalentes, de preferência com 1 a 2 equivalentes, de um adaptador, como anidrido succínico, num solvente orgânico apropriado, por exemplo cloreto de metileno, eventualmente após adição de um catalisador, por exemplo 4-dimetilaminopiridina, obtendo-se um composto da fórmula IX 20 1 1

(IX) em que R1, R2 e B possuem os significados anteriormente definidos, e em seguida processar de acordo com processos conhecidos, como por exemplo extracção, cristalização ou cromatografia, em que o residuo de ácido succinico na posição 3' serve de adaptador para estes na síntese dos polímeros de suporte utilizados e em alternativa aos adaptadores de ácido succinico podendo ser utilizados também outros adaptadores, p. ex. descritos em Sonveaux [Bioorg. chem. 14 (1986) 274];

g) acoplar o composto da fórmula X

em que R2 e B possuem os significados anteriormente definidos; V representa hidrogénio, O-alquilo-Ci-Cie, O-alcenilo-Ci-Cie, O-alcinilo-Ci-CiB ou -O-CH (CH3) -0R1, em que R1 possui o significado anteriormente definido, representa de preferência hidrogénio, OCH3, 0-CH2CH3, 0-CH2-CH=CH2 ou O-CH (CH3) -OR1, em que R1 possui o significado anteriormente definido, de acordo com processos conhecidos, ao suporte sólido, como 21

aminopropril-CPG (CPG = Controlled Pore Glass - vidro de poros controlado3) , por exemplo por reacção com DCC e p-nitrofenol num solvente orgânico apropriado [p. ex. M.J. Gait, Oligonucleotide Synthesis - a practical approach, IRL Press, 1084] ; h) cindir o grupo protector em 5' de acordo com processos conhecidos, por exemplo por tratamento com ácido dicloroacético a 1 a 4 % em cloreto de metileno ou clorofórmio;

i) fazer reagir o composto obtido com um composto da fórmula XI

Z' (XI) em que R2, R7, R8, V, Z' e B possuem os significados anterior-mente definidos e j) oxidar o composto obtido de acordo com processos conhecidos, por exemplo por reacção com iodo na presença de piridina, lutidina ou colidina aquosa, eventualmente também em presença de outros solventes orgânicos como por exemplo tetra--hidrofurano, ou por exemplo por reacção com dissulfureto de Ν,Ν,Ν',N'-tetraetiltiuramo em acetonitrilo, ou por exemplo por reacção com iodo na presença de uma alquilamina ou uma arilamina, sendo as diferentes fases do processo de oxidação conhecidos dos especialistas que servem para a preparação de oligonucleótidos modificados, resumidas por exemplo em Beaucage e Iyer [Tetrahedron 4 9 (1983) 6123] bem como em Uhlmann e

Peyman (Chcm. Rev. 90 (1990) 543], e a oxidação efectuada de 22 preferência por reacção cora iodo na presença de piridina, lutidina ou colidina aquosa, eventualmente também em presença de outros solventes orgânicos como tetra-hidrofurano; k) repetir as fases de reacção h a j até ao comprimento de cadeia pretendido;

l) retirar o oligonucleótido do suporte por meio de processos conhecidos, como por exemplo por HN3 a uma temperatura de 50 a 60 °C, e cindir os grupos protectores no fosfato e bases nucleotídicas igualmente de acordo com processos conhecidos, obtendo-se o composto da fórmula XII

(XII) em que n, L, BB, W, V, Y', U, C1 e C2 possuem os significados anteriormente definidos; 23

m) incubar o composto da fórmula XII em meio ácido, de preferência a um pH de 1 a 3, dc modo especialmente preferido a um pH de 1,5 a 2,5 e de modo muito especialmente preferido a um pH de 1,8 a 2,2, com uma solução de ácido p-toluenos-sulfónico a 1 a 30 %, de preferência a 2 a 6 % num solvente orgânico apropriado, por exemplo em cloreto de metileno / metanol durante 0,5 a 10 h, de preferência 1 a 3 noras, de modo especialmente preferido 3 h, em seguida neutralizar por exemplo com NH3 / metanol e após a remoção do solvente por evaporação e depois de purificar, por exemplo por precipitação a partir de etanol, cromatografia em gel, electroforese em gel ou HPLC obter o composto da fórmula I [cfr. também E. Sonveaux, Bioorg. Chem. 14 (1986) 274].

Por exemplo, para grupos que favorecem a assimilação intracelular, existem diferentes resíduos lipofilicos, como -O- (CH2)x-CH3, em que x significa um número inteiro de 6 a 18, -O- (CH2) n-CH=CH- (CH2) m-CH3, em que nem significam independentemente um do outro um número inteiro de 6 a 12, -0- (CH2CH20) 4- (CHZ) 9-CH3, -0-(CH2CH20)8-(CH2)i3-CH3 e -0- (CH2CH20) 7- (CH2) 15-CH3, mas também resíduos esteróides como colesterilo e conjugados, que aproveitam os sistemas de transporte naturais como ácidos eólicos, ácido fólico, 2-(N-alquil, N-alcoxil)-aminoantraquinona e conjugados da manose e peptídeos dos receptores correspondentes que conduzem a endocitose dos oligonucleótidos mediada por receptores como EGF (Epidermal Growth Factor - factor de crescimento epidérmico), bradiquinina e PDGF (Platelet Derived Growth Factor - factor de crescimento derivado de plaquetas). Sob a designação de grupos marcadores entendem-se grupos fluorescentes por exemplo de derivados de dansil (=N-dimetil-l--aminonaftil-5-sulfonilo), de fluoresceína ou de cumarina ou grupos quimioluminescentes por exemplo de derivados da acridina bem como o sistema de dígoxigenina detectável por meio de ELISA, os grupos de biotina detectáveis por meio do sistema biotina / avidina ou ainda braços de adaptadores com grupos funcionais que permitem uma derivatização subsequente com 24

L-C, )=^*· grupos relatores adjacentes, por exemplo um adaptador de amino-alquilo que é transformado numa conda quimioluminescente r.om um éster activo de acridínio. São grupos marcadores típicos análogos çh3

cr

N—(CH2)—N— Η H Éster de acridínio

Derivado de fluoresceína x = 2-18, de preferência 4 R = H ou alquilo-Cj-04 (= "fluoresceína" para x = 4 e R = CH3) 25

Conjugado de digoxigenina

Os análogos de oligonucleótidos que se ligam, intercalam e/ou cindem ou causam reticulação de ácidos nucleicos incluem os conjugados de acridina, psoraleno, fenantrolina, nafto-quinona, daunomicina ou cloroetilaminoarilo. São resíduos de intercalação e reticulação típicos os seguintes: 26 J v

Derivado de acridina x = 2 - 12, de preferência 4

—S-(CH2)-NH

Cl x = 2 - 12, de preferência 4

27

O OH O

Cl—ch2ch2 \ /h3c

N

(CH2)—0— x

1 - 18, X = alquilo, halogénio, N02, CN, -c-R

O 28 1>, y

Cl—CH2CH2 // 'λ y*-Jr \

Cl—CH2CH2 -C-R II 0 x = 1 - 18, X = alquilo, halogénio, N02, CN, É ainda objecto da presente invenção o composto da fórmula

VI

(VI) em que R1 representa -[CH2]r-X, sendo; r = 1 ou 2 e X representa arilo-C6-Ci2, em que arilo pode conter um ou mais substituintes, de preferência um a três, de modo especialmente preferido um a dois substituintes seleccionados de hidroxilo, mercapto, nitro, flúor, cloro, bromo, alquilo-Ci-C6, alcoxilo-Ci-Cô, alquil-Ci-Ce-mercapto, alcenilo-C2-Ce., alcinilo-C3-C6, C(0)0H, C(0)NH2, C(0)0- -al quilo-Ci-Cia, C (0) 0-arilo-C6“Ci2, C (0) -alquilo-Ci-Ci8, C (0)-arilo-C6_Ci2, 0-C(0)NH2, 0-C (0) O-alquilo-Ci-Cia, 0-C (O) 0-arilo-C6-Ci2, 0-C (O) -alquilo-Ci-Cis, 0-C (0) -arilo--C6-C12, 0-C(0)-[CH2]r-X1 ou O-CÍOJO-fCHzj^X1, sendo X1 = arilo-C6~Ci2, que pode eventualmente conter um a três SUbStituluLes seleccionados de amina, hidroxilo, nitro, 29

alquilo-Ci-Ce/ alcoxilo-Ci-Cs, alcoxi-Ci~C6-carbonilo, flúor, cloro ou bromo; quando r=l, X representa ainda fenilo ou alcoxil-Ci-C4-fenilo; quando r=2, X representa ainda CN, S-fenilo, S02-fenilo, N-ftalimida ou N02; quando r=l, X representa de preferência arilo-Ce-Ci2, em que arilo pode conter um a três substituintes, de preferência um a dois substituintes, seleccionados de flúor, cloro, bromo, alquilo-Ci-C4, alcoxilo-Ci-C4, O-C (O) - [CH2] r-X1 ou 0-C (0) 0-[CHaJr-X1/ sendo X1 = arilo-C6-Ci2, que pode eventualmente conter um a três substituintes seleccionados de alquilo-Ci-C4, alcoxilo-Ci-C4, flúor, cloro ou bromo; quando r=2, X representa de preferência 4-nitrofenilo; quando r=l, X representa de modo especialmente preferido 2,5--dicloro-4-pivaloiloxifenilo, 3-cloro-4-[2-(4-nitrofenil]-etoxicarboniloxi]-fenilo, 2-cloro-4-[2-(4-nitrofenil)- etoxicarboniloxi]-fenilo, 3-fluoro-4-[2-(4-nitrofenil)- etoxicarboniloxi]-fenilo, de modo especialmente preferido 3-fluoro-4-[2-(4-nitrofenil)etoxicarboniloxi]-fenilo; R2 representa dimetoxitritilo, monometoxitritilo, pixilo ou tritilo, de preferência dimetoxitritilo; e B representa 30 Γ L· f

em que R3 significa em cada caso independentemente uns dos outros um 31 grupo da fórmula

VO· VO ou

no2 representa hidrogénio ou 2-(p-nitrofenil)etilo;

significa /

CH \ ou

V -CH, -CH- no2

representa hidrogénio, alquilo-Ci-C4, ou alcenilo-Cs-Ce, alcinilo-C9-CK, flúor de cloro, bromo preferência

U li hidrogénio, CH3 ou 1-propinilo, de modo especialmente preferido hidrogénio; ou B pode, para além das bases nucleosídicas naturais, também representar outras bases nucleosídicas modificadas, cujos grupos amina ou hidroxilo estão protegidos por grupos protectores apropriados, como o grupo para-nitro- feniletiloxicarbonilo, o grupo benzoílo e o grupo para--(t-butil)benzoílo para os grupos hidroxilo e os grupos benzoílo, para-(t-butil)benzoílo, para-nitrofeniletiloxi-carbonilo, isobutirilo, para-(terc-butil)fenilacetilo para os grupos amina. B representa em todos os compostos de preferência

Nos compostos da fórmula VI o açúcar pode apresentar para além da configuração β natural também a configuração a, sendo de preferência compostos com a configuração β do açúcar.

Para além do referido anteriormente, a presente invenção refere-se a compostos da fórmula VIII 33 (VIII),o

RrR8 N-P' 2'

1 em que R1 representa -[CH2]r-X^ sendo; r = 1 ou 2 e X representa arilo-C6-Ci2, em que arilo pode conter um ou mais substituintes, de preferência um a três, de modo especialmente preferido um a dois substituintes seleccionados de hidroxilo, mercapto, nitro, flúor, cloro, bromo, alquilo-Ci-Cs, alcoxilo-Ci-Cs, alquil-Ci-Ce-mercapto, alcenilo-C2-C6, alcinilo-C3-C6, C(0)0H, C(0)NH2, C(0)0- -alquilo-Ci-Cis, C (0) 0-arilo-C6~Ci2, C (O) -alquilo-Ci-Cig, C (0)-arilo-Cg-Ciz, 0-C(0)NH2, 0-C (0) 0-alquilo-Ci-Ci8, 0-C (0) 0-arilo-C6-Ci2, 0-C (0) -alquilo-Ci-Ci8, 0-C(0)-arilo--C6~Ci2, O-CtOj-tCHzJr-X1 ou 0-C(O)0-[CH2Jr-X1, sendo X1 = arilo-C6-Ci2, que pode eventualmente conter um a três substituintes seleccionados de amina, hidroxilo, nitro, alquilo-Ci-Ce, alcoxilo-Ci-C6, alcoxi-Ci-Cg-carbonilo, flúor, cloro ou bromo; quando r=l, X representa ainda fenilo ou alcoxil-Ci-C4-fenilo; quando r=2, X representa ainda CN, S-fenilo, S02-fenilo, N-ftalimida ou N02; quando r=l, X representa de preferência arilo-C6-Ci2, em que arilo pode conter um a três substituintes, de preferência um a dois substituintes, seleccionados de flúor, cloro, bromo, alquilo-Ci-C4 ou alcoxilo-Ci~C4, 0-C (0) - [CH2] γ'Χ1 ou 0-C(0)0-[CH2]r-X1, sendo X1 = arilo-C6-Ci2, que pode eventualmente conter um a três substituintes seleccionados de alquilo-Ci-C4, alcoxilo-Ci-CU, flúor, cloro ou bromo; quando r=2, X representa de preferência 4-nitrofenilo; quando r=l, X representa de modo especialmente preferido 2,5--dicloro-4-pivaloiloxifenilo, 3-cloro-4-[2-(4-nitrofenil] -etoxicarboniloxi]-fenilo, 2-cloro-4-[2-(4-nitrofenil)- etoxicarboniloxi]-fenilo, 3-fluoro-4-[2-(4-nitrofenil)-etoxicarboniloxi]-fenilo, de modo especialmente preferido 3-fluoro-4-[2-(4-nitrofenil)etoxicarboniloxi]-fenilo; R2 representa dimetoxitritilo, monometoxitritilo, pixilo ou tritilo, de preferência dimetoxitritilo; Z' representa OR9 ou alquilo-Ci-Cie, alcoxilo-Ci-Ci8, arilo- -C6-C2o ou aril-C6-Cio-alquilo-Ci-C8, de preferência OR9, alquilo-Ci-Cg, alcoxilo-Ci-C6, arilo-C6-C2o ou aril-C6-Ci4--alquilo-Ci-Ce, e de modo especialmente preferido OR9; R7 e R8 são iguais ou diferentes e significam alquilo-Ci-Ce, de preferência isopropilo, ou cicloalquilo-C5-Ci2, de preferência até C8, benzilo ou fenilo ou, em conjunto com o átomo de azoto a que se encontram ligados, um anel heterocíclico saturado ou insaturado, com eventualmente outros heteroátomos, como p. ex. morfolina, e podem conter substituintes como ésteres de 0(C)0-alquilo-Ci-C4; e R9 representa um grupo da fórmula 35 ch2- -CH·,· / % no2

CH2—CH2-C=N

ch3 ou um grupo benzilo, o qual não possui substituintes ou possui um a quatro substituintes no anel, de preferência não possui substituintes, em que o ou os substituinte (s) é (são) independentemente entre si flúor, cloro, bromo ou um grupo (grupos) alquilo-Ci-C4, nitro, metoxilo ou carboxilo; B representa

36

em que R3 significa em cada caso independentemente um grupo da fórmula

V \ % ou

CH2 no2 R4 representa hidrogénio ou 2-(p-nitrofenil)etilo; R5 significa 37 t u

Y representa hidrogénio, alquilo-Ci-C4, flúor, cloro, bromo ou alcenilo-C2-C6, alcinilo-C2-C6, de preferência hidrogénio, CH3 ou 1-propinilo, de modo especialmente preferido hidrogénio; ou B pode, para além das bases nucleosidicas naturais, também representar outras bases nucleosidicas modificadas, cujos grupos amina ou hidroxilo estão protegidos por grupos protectores apropriados, como o grupo para-nitro-feniletiloxicarbonilo, o grupo benzoilo e o grupo para--(t-butil)benzoílo para os grupos hidroxilo e os grupos benzoilo, para-(t-butil)benzoílo, para-nitrofeniletiloxi-carbonilo, isobutirilo, para-(terc-butil)fenilacetilo para os grupos amina. 38 Γ

É igualmente objecto da presente invenção um composto da fórmula XII

W=P—u

W=P—u

(XII) c2 em que n significa um número de 1 a 150, de preferência de 4 a 50, de modo especialmente preferido de 8 a 30, de modo muito especialmente preferido de 8 a 20; L significa oxi, sulfanodiilo ou imina, de preferência oxi; BB independentemente entre si, é 39

e E representa OH ou NH2 e Y representa hidrogénio, alquilo-Ci-C4, flúor, cloro, bromo ou al nenilo-C2-Ce ou alcinilo-C2-C6, de preferência 40 Γ U, hidrogénio, CH3 ou 1-propinilo, de modo especialmente preferido hidrogónio; ou BB pode significar, para além das bases nucleosídicas naturais, também outras bases nucleosídicas modificadas, como 5-(hidroximetil)uridina, 5-amino-uridina, pseudo--uridina, di-hidro-uridina, inosina, 8-aza-7-desaza--adenosina, tubercidina, nebularina, xantosina, 2-amino-adenosina, etenoadenosina, 7-desazaguanosina, 04-metil-timidina, N6-metiladenosina, 06-metilguanosina ou nucleósidos de piridopirimidina; W significa, independentemente entre si, oxigénio ou enxofre, de preferência oxigénio; V representa hidrogénio, -O-alquilo-Ci-Cie, -O-alcenilo- -Ci-Cis, -O-alcinilo-Ci-Cie ou -O-CH (CH3) -0R1, em que R1 possui o significado anteriormente definido, no entanto representa pelo menos uma vez -O-CH (CH3) -ORi; representa de preferência hidrogénio, -OCH3/ -0-CH2CH3, -0-CH2, CH=CH2 ou -O-CH (CH3)-OR1, pelo menos uma vez no entanto -0-CH(CH3)-0Ri; Y' representa oxi, sulfanodiilo, imina, (CH2)k ou N(CH2)k, em que k significa um número inteiro de 1 a 18, de preferência de 1 a 6, sendo Y' de preferência oxi; U representa hidroxilo, mercapto, SeH, alcoxilo-Ci-Cis, alquilo-Ci-Cie, arilo-C6-C2o, aril-Ce-Cií-alquilo-Ci-Ce, NHR17, NR17R18 ou um resíduo da fórmula (OCH2CH2) c0 (CH2) c-CH2R20, sendo U de preferência hidroxilo, mercapto, alcoxilo-Ci-C6, alquilo-Ci-C6, NHR1' ou NR17R10, de modo especialmente preferido hidroxilo ou alquilo-Ci-C6; em que R17 significa alquilo-Ci-Cie, arilo-C6-C2o/ aril-C6-C14- -alqui lo-Ci-Ca, - (CH?) d- [NH (CH2_) d] d' ~NR19R19; de 41

preferência alquilo-Ci-C8 ou metoxietilo, de modo especialmente proferido alquilo-Ci-C4 ou metoxietilo, em que d significa um número inteiro de 2 a 6 e d' significa um número inteiro de 0 a 6, e

representa alquilo-Ci-Cis, arilo-C6-C20, aril-C6-Ci4--alquilo-Ci-Cs ou, no caso de NR17R18 em conjunto com R17 e com o átomo de azoto a que se encontram ligados formar um anel heterocíclico pentagonal ou hexagonal, que adicionalmente pode contar um outro heteroátomo da série O, S e N, como por exemplo o anel morfolinilo e o anel imidazolidinilo; R19 independentemente entre si significa hidrogénio ou alquilo-Ci-Ce ou alcoxil-Ci-C4-alquilo-Ci-C6; c significa um número inteiro de 1 a 100, de preferência de 3 a 20 e de modo especialmente preferido de 3 a 8;

significa um número inteiro de 0 a 18, de preferência de 0 a 15;

Rzo significa hidrogénio ou um grupo funcional como hidroxilo, amina, NHR17, COOH, C0NH2, COOR21 ou flúor, cloro ou bromo, em que R21 é alquilo-Ci-C4, de preferência metilo;

C1 e C2 são iguais ou diferentes e representam hidrogénio, alquilo-Ci-Cie, alcenilo-C2-Ci8, alcinilo-C2-Ci8, alquil--Ci-Ci8-carbonilo, alcenil-C2-Ci8-carbonilo, alcinil-C2~Ci8--carbonilo, arilo-C6-C2o, aril-C6-Ci4~alquilo-Ci-C8 ou um resíduo da fórmula II 42

u t (II) Q-P-Q'

II w em que W possui o significado anteriormente definido; Q e Q' independentemente um do outro representam hidroxilo, mercapto, SeH, alcoxilo-Ci~C22 ou -0-(CH2)b--NR15R16, com b igual a 1 a 6 e

e R16 independentemente um do outro significam hidrogénio, alquilo-Ci-Cis, de preferência alquilo--Ci-Cs, arilo-C6-C2o/ aril-C6-Ci4-alquilo-Ci-C8, aril--C6-Ci4-alcoxilo-Ci-C8, em que arilo significa também heteroarilo e arilo possui eventualmente 1, 2 a 3 substituintes iguais ou diferentes da série carboxilo, amina, nitro, alquil-Ci-C4-amina, alcoxilo--Ci~C6, hidroxilo, flúor, cloro, bromo e ciano, ou significa alquil-Ci-Ci8-mercapto, NHR1', NR17R18, em que R17 e R18 possuem os significados anteriormente definidos, ou em conjunto com o átomo de azoto a que se encontram ligados formam um anel triangular a hexagonal, ou Q ou Q' significa de preferência hidroxilo, mercapto, OCH2CH3, O-Í-C3H7, 0-n-C3H7, 0-n-Ci8H37, 0-(CH2)3- -(3-piridilo), 0- (CH2) 2-(4-nitrofenilo), farsenilo, fitilo, vitamina A, vitamina E, testosterona, colesterol, CH3, 0- (CH2) 4-(9-acridina); ou

Q e Q' representam um resíduo da fórmula III 43 -Y- wII -P- u Y- w u

-Y u

(III)

em que g e g' são iguais a 0 ou 1, h é igual a 0 a 10/ significa alquileno-C2-Ci2, em especial alquileno-Cz-C4, aril-Ce-C^-dialquileno-Ci-Ce, arileno-C6_Cie/ eventualmente substituído uma a três vezes Pdr flúor, cloro, bromo, amina, hidroxilo, alquilo-Ci-Ci8, alcoxilo-Ci-Ci8, alcoxi-Ci-Ci8_carbonilo, arilo-C6-Ci4, aril-C6-Ci4--alquilo-Ci-Cie ou aril-Ce-Cií-alcoxilo-Ci-Ce, um grupo da fórmula (CH2CH2N'' ) íCH2CH2 ou (CH2N' )íCH2, em que i é um número inteiro de 1 a 11, de preferência de 1 a 5 e Ν' representa oxi, sulfanodi-ilo, imina ou metileno e W, U e Y' possuem os significados anteriormente definidos; ou Q e Q' significam um grupo que favorece a assimilação intracelular ou que serve de marcação de uma sonda de ADN ou que inicia a reticulação ou a cisão de análogos de oligonucleótidos durante a hibridação destes aos ácidos nucleicos alvo, podendo também na 44 ^ I—^ ^ fórmula I da sequência de ácidos nucleicos ser interrompidos uma ou várias vezes por adaptadores da fórmula III e podendo formar conjugados segundo processos conhecidos também por meio de bases nucleicas ou por meio da espinha dorsal de diésteres fosfóricos ou diésteres fosfotiónicos;

Exemplos 1.1 2'-0-(1-Benziloxi)etil-N4-NPEOC-3',5'-tetraisopropil- dissiloxano-1,3-diil-citidina

Dissolvem-se 678 mg (1,0 mmol) de N4-NPEOC-citídína protegida em 3' e 5' em 10 ml de tolueno absoluto de cada vez e coevaporam-se duas vezes num evaporador rotativo. Em seguida toma-se a espuma em 30 ml de tolueno absoluto, adicionam-se 335 mg (2,5 mmol) de éter benzilvinilico e trata-se a solução incolor com 2,0 (20 mg = 0,11 mmol) de uma solução mãe de p-Ts0H*H20 em THF abs. (1,0 g/ 100 ml). Após se deixar sob agitação de um dia para o outro à temperatura ambiente (controlo por CCF) dilui-se a solução reaccional límpida com AE até 200 ml e extrai-se por agitação por duas vezes com 100 ml de solução sat. de NaHCCb e 100 ml de solução sat. de NaCl.

Reextraem-se as fases aquosas com 100 ml de AE, secam-se as fases orgânicas reunidas sobre Na2S04, filtra-se e evapora-se em evaporador rotativo. A purificação final é efectuada por cromatografia em coluna através de gel de sílica.

As fracções do produto são evaporadas em evaporador rotativo e coevapora-se várias vezes com MeOH / CH2CI2. Obtêm-se deste modo 690 mg (0,84 mmol) de uma espuma incolor, que é constituída por ambos diastereómeros (PI + P2). Esta quantidade corresponde a um rendimento de 84 % do teórico. 45 1.2 2' -0- (1-Benzíloxi) etil-N4-NPEOC-citidina

Retomam-se 520 mg (0,64 mmol) de 2'-O-(1-benziloxi) etil--N4-NPEOC-3',5' -tetraisopropildissiloxano-1,3-diil-citidina (Exemplo 1.1) em 32 ml de uma solução 0,2 N de NH4F (6,4 mmol) e agita-se de um dia para o outro a temperatura ambiente. Concentra-se a solução num evaporador rotativo quase à secura, retoma-se a suspensão resultante com 5 ml de CH2CI2 e trata-se brevemente com ultrassons, antes de carregar o produto bruto na coluna. A coluna é cheia com 20 g de gel de silica e equilibrada com tolueno.

Gradientes de eluição (tolueno / AE / MeOH em ml) : 100/0/0, 50/50/2,5, 50/50/5 (PI + P2);

FracçÕes cada 20 ml;

As fracções do produto são evaporadas em evaporador rotativo e coevaporadas várias vezes com MeOH / CH2C12. Obtêm-se deste modo 320 mg (0,56 mmol) de uma espuma incolor, que é constituída por ambos diastereómeros (PI + P2). Esta quantidade corresponde a um rendimento de 88 % do teórico. 1.3 2' -0- (1-Benziloxi) etil-5' -DMTR-N4-NPEOC-citidina

Coevaporam-se 980 mg (1,72 mmol) de 2'-O-(1-benziloxi)-etil-N4-NPEOC-citidina (Exemplo 1.2) previamente seca duas vezes com 20 ml de cada vez de tolueno abs. num evaporador rotativo, em seguida retoma-se em 10 ml de piridina abs., dilui-se com 50 ml de tolueno abs. e por fim trata-se com 700 mg de DMTR-C1 (2,07 mmol). Deixa-se a solução reaccional sob agitação de um dia para o outro à temperatura ambiente e faz-se parar a reacção por adição de 1 ml de MeOH.

Após 5 minutos, evapora-se a solução sob vácuo num evaporador rotativo até obtenção de um óleo, retoma-se com 200 ml de AE e extrai-se duas vezes com 100 ml de solução sat. de NaHC03 e 100 ml de solução sat. de NaCl. Rccxtrai-se a fase 46 ^ l ·" ^ aquosa com 150 ml de AE, secam-se as fases orgânicas reunidas com Νβ23θ4, filtra-sc c concentra-se até obtenção de nm óleo. A purificação final é efectuada por cromatografia em coluna através de gel de sílica.

As fracções do produto são evaporadas em evaporador rotativo e coevaporadas várias vezes com MeOH / CH2CI2. Obtêiu-se deste modo 1,45 g (1,661 mmol) de uma espuma incolor cromatograficamente pura, que é constituída por ambos diastereómeros (PI + P2) . Esta quantidade corresponde a um rendimento de 97 % do teórico. 2. Ν,Ν-diisopropilamida de N4-NPEOC-5'-O-DMTR-2'-0- -(1-benziloxi)-etil-citidina-3' -0-fosfato de β-ciano--etilo

Num balão de 50 ml carregam-se 450 mg (0,5 mmol) de 2'-0--(1-benziloxi)etil-5'-DMTR-N4-NPEOC-citidina (Exemplo 1.3) e coevapora-se duas vezes com 20 ml de cada vez de tolueno abs.. Em seguida adicionam-se 7,5 ml (1,25 mmol) de uma solução mãe de reagente de fosfitilação (cloreto de Ν,Ν-diisopropilamida de fosfato de β-cianoetilo) (0,15 mol/1 CH2C12 abs.) e concentra-se de novo até obter um óleo. Em seguida dilui-se com 10 ml de acetonitrilo absoluto e agita-se a solução reaccional após adição de 23 mg de tetrazolo (0,33 mmol) à temperatura ambiente durante 6 h. Faz-se parar a reacção vertendo sobre 150 ml de uma solução (1/1) de NaHC03 / AE. Separam-se as fases numa ampola de decantação, agita-se mais uma vez com 50 ml de AE e lava-se as fases orgânicas reunidas com 50 ml de solução sat. de NaCl. Após secagem sobre Na2S04 e filtração, concentra-se até obtenção de um óleo em evaporador rotativo. A purificação final é efectuada por cromatografia. Para esse fim, enche-se uma coluna de 2 cm de diâmetro com 20 g de gel de sílica e condiciona-se com tolueno.

Gradientes de. eluição (tolueno / AE em ml): 100/0, 200/70; 47

Fracções cada 10 ml;

As fracções do produto são evaporadas em evaporador rotativo e misturadas com 10 ml cada de CH2CI2 / MeOH. Seca-se à temperatura ambiente sob alto vácuo. Obtêm-se deste modo 459 mg (0,426 mmol) de uma espuma incolor. Esta quantidade corresponde a um rendimento de 85 % do teórico. 3. 2' -O- (1-Benziloxi) etil-5' -DMTR-N4-NPEOC-3' -O-succinil- -citidina

Num balão de 50 ml carregam-se 330 mg (0,37 mmol) de 2'-0-- (1-benziloxi) etil-5'-DMTR-N4-NPEOC-citidina (Exemplo 1-3), juntam-se 50 mg (0,490 mmol) de anidrido succinico e 60 mg de 4-DMAP e retoma-se com 10 ml de cloreto de metileno absoluto. A solução resultante é agitada durante 14 h à temperatura ambiente. Faz-se parar a reacção por agitação com 50 ml de tampão de fosfato (pH 6,0), após o que a solução reaccional é diluida com 100 ml de AE. Repete-se o procedimento mais uma vez, extrai-se a fase orgânica com tampão, seca-se sobre Na2S04 e concentra-se até obtenção de um óleo em evaporador rotativo. A purificação final é efectuada por cromatografia através de uma coluna de 2 cm de diâmetro com 15 g de gel de silica e equilibrada com tolueno.

Gradientes de eluição em ml (tolueno / AE) : 100/0, 200/50, 150/50 (P) e 100/100 (P);

Fracções cada 10 ml;

As fracções do produto são evaporadas em evaporador rotativo, retomadas com CH2C12 e filtradas através de uma pipeta de Pasteur cheia com algodão. O filtrado foi novamente concentrado, misturado com MeOH e CH2C12 e seco sob alto vácuo. Obtêm-se deste modo 357 mg (0,361 mmol) de uma espuma incolor. Esta quantidade corresponde a um rendimento de 98 % do teórico. 48 f L·, 4.1 2' -0- (1-Benziloxi) etil-N6-NPEOC-3' , 5' -tetraisopropil- dissiloxano-1,3-diil-adenosina

Dissolvem-se 1,40 g (2,0 mmol) de N6-NPEOC-adenosina protegida em 3' e 5' com tetraisopropildissiloxano em 10 ml de tolueno absoluto de cada vez e coevaporam-se duas vezes num evaporador rotativo. Em seguida toma-se a espuma em 30 ml de tolueno absoluto, adicionam-se 375 mg (2,8 mmol) de éter benzilvinílico e trata-se a solução incolor com 2,0 (20 mg = 0,11 mmol) de uma solução mãe de p-TsOH’H20 em THF abs. (1,0 g/ 100 ml) . Após se deixar sob agitação de um dia para o outro à temperatura ambiente (controlo por CCF), dilui-se a solução reaccional limpida com AE até 200 ml e extrai-se por agitação por duas vezes com 100 ml de solução sat. de NaHC03 e 100 ml de solução sat. de NaCl. Reextraem-se as fases aquosas com 100 ml de AE, filtram-se as fases orgânicas reunidas através de Na2S04 e concentra-se em evaporador rotativo. A purificação final é efectuada por cromatografia através de uma coluna de 3 cm de diâmetro que foi carregada com 40 g de gel de sílica e equilibrada com tolueno.

Gradientes de eluição (tolueno / AE em mol): 200/0, 160/40, 140/60, 100/100, 100/200 (PI + P2);

Fracções cada 20 ml;

As fracções do produto são evaporadas em evaporador rotativo e coevaporadas várias vezes com MeOH / CH2CI2. Como produto secundário obtêm-se deste modo 720 mg (0,74 mmol = 37 % do teórico) de uma espuma incolor constituída por ambos os diastereómeros (Pl + P2) do produto dissubstituído. 0 produto pretendido foi isolado com um rendimento de 57 % do teórico (980 mg = 1,13 mmol) sob a forma de uma espuma incolor. O rendimento total corresponde a 94 % do teórico. 49 j~ 1--Zj 4.2 2'-0-(1-Benziloxi)etil-N6-NPEOC-adenosina

Retomam-se 2,08 g (2,40 mmol) de 2'-O-(1-benziloxi)etil--N®-NPEOC-3',5’-tetraisopropildissiloxano-1,3-diil-adenosina (Exemplo 4.1) em 120 ml de uma solução 0,2 N de NH4F (24 mmol) e agita-se de um dia para o outro à temperatura ambiente. Concentra-se a solução num evaporador rotativo quase à secura, retoma-se a suspensão resultante com 20 ml de CH2C12 e trata-se brevemente com ultrassons, antes de carregar o produto bruto na coluna. A coluna é cheia com 80 g de gel de sílica e condicionada com tolueno.

Gradientes de eluição (tolueno / AE / MeOH em ml) : 200/0/0, 200/200/0, 200/200/20 (PI + P2);

Fracções cada 30 ml;

As fracções do produto são evaporadas em evaporador rotativo e coevaporadas várias vezes com MeOH / CH2CI2. Obtêm-se deste modo 1,38 g (2,321 mmol) de uma espuma incolor, que é constituída por ambos diastereómeros (PI + P2). Esta quantidade corresponde a um rendimento de 97 % do teórico. 4.3 2'-O-(1-Benziloxi)etil-5'-DMTR-N6-NPEOC-adenosina

Coevaporam-se 1,120 g (1,84 mmol) de 2' -O-(1-benziloxi)-etil-N6-NPEOC-adenosina (Exemplo 4.2) previamente seca duas vezes com 20 ml de cada vez de tolueno abs. num evaporador rotativo, em seguida retoma-se em 20 ml de piridina abs., dilui-se com 50 ml de tolueno abs. e por fim trata-se com 770 mg de DMTR-C1 (2,27 mmol). Deixa-se a solução reaccional sob agitação de um dia para o outro à temperatura ambiente e faz-se parar a reacção por adição de 1 ml de MeOH. Após 5 minutos, evapora-se a solução sob vácuo num evaporador rotativo até obtenção de um óleo, retoma-se com 200 ml de AE e extrai-se duas vezes com 100 ml dc solução sat. de NaHCOj e 100 ml de 50 L·, solução sat. de NaCl. Reextrai-se a fase aquosa com 150 ml de AE, secam-se as fases orgânicas reunidas com Na?SOd, filtra-se e concentra-se até obtenção de um óleo. A purificação final é efectuada por cromatografia através de uma coluna com 5 cm de diâmetro cheia com 80 g de gel de sílica e equilibrada com tolueno.

Gradientes de eluição (tolueno / AE / MeOH em ml) : 200/0, 200/200, 200/200/10, 200/200/20, 200/200/40;

Fracções cada 30 ml;

As fracções do produto são evaporadas em evaporador rotativo e coevaporadas várias vezes com MeOH / CH2C12. Obtêm-se deste modo 1,52 g (1,69 mmol) de uma espuma incolor cromatograficamente pura, que é constituída por ambos diastereómeros (PI + P2). Esta quantidade corresponde a um rendimento de 90 % do teórico. 5. Ν,Ν-Diisopropilamida de 2'-0-(l-benziloxi)etil-5'-O- -DMTR-N6-NPEOC-adenosina-3'-O-fosfato de β-ciano-etilo

Num balão de 50 ml carregam-se 450 mg (0,5 mmol) de 2'-0--(l-benziloxi)etil-5'-DMTR-Ns-NPEOC-adenosina (Exemplo 4.3) e coevapora-se duas vezes com 20 ml de cada vez de tolueno abs. . Em seguida adicionam-se 7,5 ml (1,1 mmol) de uma solução mãe de reagente de fosfitilação (0,15 mol/1 CH2C12 abs.) e concentra-se de novo até obter um óleo. Em seguida dilui-se com 10 ml de acetonitrilo absoluto e agita-se a solução reaccional após adição de 24 mg de tetrazolo (0,38 mmol) à temperatura ambiente durante 6 h. Faz-se parar a reacção vertendo sobre 150 ml de uma solução (1/1) de NaHC03 / AE. Separam-se as fases numa ampola de decantação, agita-se mais uma vez com 50 ml de AE e lava-se as fases orgânicas reunidas com 50 ml de solução sat. de NaCl. Após secagem sobre Na2SC>4 e filtração, concentra-se até obtenção de um óleo em evaporador rotativo. A purificação final é efectuada por cromatografia. Para este fim, carrega-se uma coluna de 2 cm de diâmetro com 20 g de gel de sílica e 51

equilibra-se com tolueno.

Gradientes de eluição (tolueno / AE em mol): 100/0, 200/70; Fracções cada 10 ml;

As fracções do produto são evaporadas em evaporador rotativo e misturadas com 10 ml cada de CH2C12 / MeOH. Seca-se à temperatura ambiente sob alto vácuo. Obtêm-se deste modo 390 mg (0,340 mmol) de uma espuma incolor. Esta quantidade corresponde a um rendimento de 68 % do teórico. 6. N6-NPEOC-5'-DMTR-3'-succinoíl-2'-O-(1-benziloxi)etil- -adenosina

Num balão de 50 ml carregam-se 330 mg de 2'-0-- (1-benziloxi) etil-5' -DMTR-N6-NPEOC-adenosina (Exemplo 4.3), 50 mg (0,490 mmol) de anidrido succinico e 60 mg de 4-DMAP e retoma-se com 10 ml de cloreto de metileno abs.. A solução resultante é agitada à temperatura ambiente durante 14 h. Faz--se parar a reacção por agitação com 50 ml de tampão de fosfato (pH 6,0), após o que a solução reaccional é diluída com 100 ml de AE. Repete-se o procedimento mais uma vez, extrai-se a fase orgânica com tampão, seca-se sobre Na2S04, filtra-se e concentra-se no evaporador rotativo até obtenção de um óleo. A purificação final é efectuada por cromatografia através de uma coluna de 2 cm de diâmetro carregada com 15 g de gel de sílica e equilibrada com tolueno.

Gradientes de eluição em ml (tolueno / AE): 100/0, 100/50 (PI + P2) ;

Fracções cada 10 ml;

As fracções do produto são evaporadas em evaporador rotativo, retomadas com CH2CI2 e filtradas através de uma pipeta de Pasteur cheia com algodão. 0 filtrado é de novo concentrado, agitado com MeOH e CH2C12 e seco sob alto vácuo. Obtêm-se deste 52

u, ^ modo 290 mg (0,29 xnmol) de uma espuma incolor. Esta quantidade corresponde a um rendimento de 79 % do teórico. 7.1 2' -O- (1-Benziloxi) etil-Nz-NPE0C-06-NPE-3', 5' -tetraiso-propildissiloxano-l,3-diil-guanosina

Dissolvem-se 3,07 g (3,54 nunol) de N?-NPEOC-ofi-NPE--guanosina protegida em 3' e 5' com tetraisopropildissiloxano em 20 ml de tolueno absoluto de cada vez e coevaporam-se duas vezes num evaporador rotativo. Em seguida toma-se a espuma em 80 ml de tolueno absoluto, adicionam-se 525 mg (3,91 mmol) de éter benzilvinilico e trata-se a solução incolor com 5,0 (50 mg = 0,27 mmol) de uma solução mãe de p-Ts0H*H20 em THF abs. (1,0 g/ 100 ml). Após se deixar sob agitação de um dia para o outro à temperatura ambiente (controlo por CCF), dilui-se a solução reaccional límpida com AE até 300 ml e extrai-se por agitação por duas vezes com 150 ml de solução sat. de NaHC03 e 150 ml de solução sat. de NaCl. Reextraem-se as fases aquosas com 200 ml de AE, secam-se as fases orgânicas reunidas sobre Na2S04, filtra-se e concentra-se em evaporador rotativo. A purificação final é efectuada por cromatografia através de uma coluna de 3 cm de diâmetro que foi carregada com 90 g de gel de sílica e equilibrada com tolueno.

Gradientes de eluição (tolueno / AE em ml) : 200/0, 250/50, 250/100 (PI + P2);

Fracções cada 30 ml;

As fracções do produto são evaporadas em evaporador rotativo e coevaporadas várias vezes com MeOH / CH2C12. Obtêm-se deste modo 3,13 g (3,22 mmol) de uma espuma incolor constituída por ambos os diastereómeros (PI + P2) . Esta quantidade corresponde a 91 % do teórico. 7.2 2'-0- (1-Benziloxi) etil-N2-NPE0C-06-NPE-guanosina

Retomara 3ê 2,94 g (3,02 mmol) dc N2-NPEOC-Oe-NPE-2' -O- 53 ρ ^ ^—S· -(1-benziloxi)etil-3',5'-tetraisopropildissiloxano-1,3-diil--yuanosina (Exemplo 7.1) cm 150 ml de uma solução 0,2 N de NHaF (30 mmol) e agita-se de um dia para o outro à temperatura ambiente. Concentra-se a solução num evaporador rotativo quase à secura, retoma-se a suspensão resultante com 20 ml de CH2CI2 e trata-se brevemente com ultrassons, antes de carregar o produto bruto na coluna. A coluna é cheia com 80 g de gel de sílica e equilibrada com tolueno.

Gradientes de eluição (tolueno / AE / MeOH em ml) : 200/0/0, 200/200/0, 200/200/20 (PI + P2) ;

Fracções cada 30 ml; O produto cristaliza por concentração, é separado por filtração através de um funil de Buchner e lavado com 50 ml de MeOH. A partir de duas fracções obtêm-se no total 2,10 g (2,764 mmol) de um sólido amorfo que é constituído por ambos os diastereómeros. Esta quantidade corresponde a um rendimento de 92 % do teórico. 7.3 2'-O- (1-Benziloxi) etil-5'-DMTR-N2-NPE0C-06-NPE-guanosina

Coevaporam-se 1,590 g (2,093 mmol) de 2'-O-(1-benziloxi)-etil-N2-NPEOC- 06-NPE-guanosina (Exemplo 7.2) previamente seca duas vezes com 30 ml de cada vez de tolueno abs. num evaporador rotativo, em seguida retoma-se em 30 ml de piridina abs., dilui-se com 80 ml de tolueno abs. e por fim trata-se com 850 mg de DMTR-C1 (2,51 mmol). Deixa-se a solução reaccional sob agitação de um dia para o outro à temperatura ambiente e faz-se parar a reacção por adição de 1 ml de MeOH. Após 5 minutos, evapora-se a solução sob vácuo num evaporador rotativo até obtenção de um óleo, retoma-se com 200 ml de AE e extrai-se duas vezes com 100 ml de solução sat. de NaHCCb e 100 ml de solução sat. de NaCl. Reextrai-se a fase aquosa com 150 ml de AE, secam-se as fases orgânicas reunidas com Na2S04, filtra-se e concentra-se até obtenção de um óleo. A purificação final é efectuada por cromatografia alravés de gel de 3ilica. 54 ϋ I__ ΐ

As fracções do produto são evaporadas em evaporador rotativo e coevaporadas várias vezes com MeOH / CH2CI2. Obtêm—se deste modo 2,190 g (2,06 mmol) de uma espuma incolor cromatograficamente pura, que é constituída por ambos diastereómeros (PI + P2) . Esta quantidade corresponde a um rendimento de 99 % do teórico. 8. N, N-Diisopropilamida de N2-NPE0C-06-NPE-0-DMTR- -2' - (1-benziloxi) etil-guanosina-3' -0-fosfato de β-ciano-etilo

Num balão de 50 ml carregam-se 530 mg (0,5 mmol) de 2'-0-- (1-benziloxi) etil-5'-DMTR-N2-NPEOC-06-NPE-guanosina (Exemplo 7.3) e coevapora-se duas vezes com 20 ml de cada vez de tolueno abs.. Em seguida adicionam-se 7,25 ml de uma solução mãe de reagente de fosfitilação (0,15 mol/1 CH2CI2 abs.) e concentra-se de novo até obter um óleo. Em seguida dilui-se com 10 ml de acetonitrilo e agita-se a solução reaccional após adição de 28 mg de tetrazolo (0,38 mmol). Faz-se parar a reacção vertendo sobre 150 ml de uma solução (1/1) de NaHCCh / AE. Separam-se as fases numa ampola de decantação, agita-se mais uma vez com 50 ml de AE e lava-se as fases orgânicas reunidas com 50 ml de solução sat. de NaCl. Após secagem sobre Na2S04 e filtração, concentra-se até obtenção de um óleo em evaporador rotativo. A purificação final é efectuada por cromatografia. Para este fim, carrega-se uma coluna de 2 cm de diâmetro com 20 g de gel de sílica e condiciona-se com tolueno.

Gradientes de eluição (tolueno / AE em ml): 100/0, 200/70; Fracções cada 10 ml;

As fracções do produto são evaporadas em evaporador rotativo e misturadas com 10 ml cada de 0Η2012 / MeOH. Seca-se à temperatura ambiente sob alto vácuo. Obtêm-se deste modo 510 mg (0,404 mmol) de uma espuma incolor. Esta quantidade corresponde a um rendimento de 81 % do teórico. 55 9. 9.

U ^ 2' -0- (1-Benziloxi) etil-5' -DMTR-N2-NPE0C-06-NPE-3' -0--succinoíl-guanosina

Num balão de 50 ml carregam-se 390 mg (0,367 mmol) de 2' -0- (1-benziloxi) etil-5'-DMTR-N2-NPEOC-06-NPE-guanosina (Exemplo 7.3), 58 mg (0,490 mmol) de anidrido succinico e 72 mg de 4-DMAP (0,589 mmol) e retoma-se com 10 ml de cloreto de metileno absoluto. A solução resultante é agitada à temperatura ambiente de um dia para o outro. Faz-se parar a reacção por agitação com 50 ml de tampão de fosfato (pH 6,0), após o que a solução reaccional é diluída com 100 ml de AE. Repete-se o procedimento mais uma vez, extrai-se a fase orgânica com tampão, seca-se sobre Na2S04, filtra-se e concentra-se no evaporador rotativo até obtenção de um óleo. A purificação final é efectuada por cromatografia através de uma coluna de 2 cm de diâmetro carregada com 15 g de gel de sílica e equilibrada com tolueno.

Gradientes de eluição em ml (tolueno / AE) : 100/0, 200/50, 150/50 (P) e 100/100 (P);

Fracções cada 10 ml;

As fracções do produto são evaporadas em evaporador rotativo, retomadas com CH2CI2 e filtradas através de uma pipeta de Pasteur cheia com algodão. O filtrado é de novo concentrado, agitado com MeOH e CH2CI2 e seco sob alto vácuo. Obtêm-se deste modo 250 mg (0,22 mmol) de uma espuma incolor. Esta quantidade corresponde a um rendimento de 61 % do teórico. 10.1 2'-0-(1-Benziloxi)etil-3',5'-tetraisopropildissiloxano- -1,3-diil-uridina

Dissolvem-se 4,86 g (10,9 mmol) de uridina protegida em 3' e 5' em 30 ml de tolueno absoluto de cada vez e coevaporam-se duas vezes num evaporador rotativo. Em seguida toma-se a espuma em 80 ml de tolueno abs., adicionam-se 3,36 g (25,0 mmol) de éter benzilvinilico e trata-se a solução incolor com 19,2 (192 56 mg = 1,0 mmol) de uma solução mãe de p-Ts0H*H20 em THF abs. (1,0 g/ 100 ml). Após se deixar sob agitação de um dia para o outro à temperatura ambiente (controlo por CCF), dilui-se a solução reaccional límpida com AE até 300 ml e extrai-se por agitação por duas vezes com 100 ml de solução sat. de NaHC03 e 100 ml de solução sat. de NaCl. Reextraem-se as fases aquosas com 100 ml de AE, secam-se as fases orgânicas reunidas sobre Na2S0,a, filtra-se e concentra-se em evaporador rotativo. A purificação final é efectuada por cromatografia através de uma coluna de 4 cm de diâmetro que foi carregada com 75 g de gel de sílica e equilibrada com tolueno.

Gradientes de eluição (tolueno / AE em ml) : 200/0, 250/50, 150/100 (PI + P2);

Fracções cada 50 ml;

As fracções do produto são evaporadas em evaporador rotativo e coevaporadas várias vezes com MeOH / CH2CI2. Obtêm-se deste modo 5,64 g (9,10 mmol) de uma espuma incolor constituída por ambos os diastereómeros (Pl + P2) . Esta quantidade corresponde a 91 % do teórico. 10.2 2'-0-(1-Benziloxi)etil-uridina

Retomam-se 3,10 g (5,00 mmol) de 2'-0-(1-benziloxi)etil--3',5'-tetraisopropildíssíloxano-1,3-dií1-uridina (Exemplo 10.1) em 250 ml de uma solução 0,2 N de NH4F (50 mmol) e agita--se de um dia para o outro à temperatura ambiente. Concentra-se a solução num evaporador rotativo quase à secura, retoma-se a suspensão resultante com 50 ml de CH2C12 e trata-se brevemente com ultrassons, antes de carregar o produto bruto na coluna (d = 5 cm) . A coluna é cheia com 100 g de gel de sílica e equilibrada com tolueno.

Gradientes de eluição (tolueno / AE / MeOH em ml): 300/0/0, 250/150/0, 150/150/15, 150/150/30 (Pl + P2);

Fracções cada 50 ml;

As fracções do produto são evaporadas em evaporador rotativo e coevaporadas várias vezes com MeOH / CH2CI2. Obtêm-se deste modo 1,86 g (4,80 mmol) de uma espuma incolor constituída por ambos os diastereómeros (PI + P2) . Esta quantidade corresponde a 96 % do teórico. 10.3 2'-O-(1-Benziloxi)etil-5'-DMTR-uridina

Coevaporam-se 780 mg (2,06 mmol) de 2'-O-(1-benziloxi)-etil-uridina (Exemplo 10.2) previamente seca duas vezes com 10 ml de cada vez de tolueno abs. num evaporador rotativo, em seguida retoma-se em 10 ml de piridina abs. e por fim trata-se com 780 mg (2,26 mmol) de DMTR-C1. Deixa-se a solução reaccional sob agitação de um dia para o outro à temperatura ambiente e faz-se parar a reacção por adição de 1 ml de MeOH. Após 5 minutos, evapora-se a solução sob vácuo num evaporador rotativo até obtenção de um óleo, retoma-se com 150 ml de AE e extrai-se duas vezes com 50 ml de solução sat. de NaHC03 e 50 ml de solução sat. de NaCl. Reextrai-se a fase aquosa com 50 ml de AE, secam-se as fases orgânicas reunidas com Na2S04, filtra--se e concentra-se até obtenção de um óleo. A purificação final é efectuada por cromatografia através de uma coluna de 3 cm de diâmetro cheia com 30 g de gel de sílica e equilibrada com tolueno.

Gradientes de eluição (tolueno / AE / MeOH em ml) : 200/0, 100/100, 100/100/5, 100/100/100;

Fracções cada 30 ml;

As fracções do produto são evaporadas em evaporador rotativo e coevaporadas várias vezes com MeOH / CH2CI2. Obtêm-se deste modo 1,29 g (1,9 mmol) de uma espuma incolor cromatograficamente pura, que é constituída por ambos diastereómeros (PI + P2). Esta quantidade corresponde a um rendimento de 92 % do teórico. 58

Lr

V t 11. 2' -O-(1-Benziloxi)etil-5'-0-DMTR-N4-NPE0C-uridina-3'-0--(N,N-diioopropil-2-cianoetil)-fosfi tami da

Num balão de 50 ml carrega-se 1,00 g (1,47 mmol) de 2'-0-- (1-benziloxi)etil-5'-DMTR-uridina (Exemplo 10.3) e coevapora--se duas vezes com 20 ml de cada vez de tolueno absoluto. Em seguida adicionam-se 20,0 ml (3 mmol) de uma solução mãe de reagente de fosfitilação (0,15 mol/1 CH2CI2 abs.) e concentra-se de novo até obter um óleo. Em seguida dilui-se com 20 ml de acetonitrilo e agita-se a solução reaccional após adição de 100 mg de tetrazolo (1,49 mmol). Faz-se parar a reacção vertendo sobre 250 ml de uma solução (1/1) de NaHC03 / AE. Separam-se as fases numa ampola de decantação, agita-se mais uma vez com 70 ml de AE e lava-se as fases orgânicas reunidas com 70 ml de solução sat. de NaCl. Após secagem sobre Na2S04 e filtração, concentra-se até obtenção de um óleo em evaporador rotativo. A purificação final é efectuada por cromatografia. Para este fim, carrega-se uma coluna de 2 cm de diâmetro com 15 g de gel de silica e condiciona-se com tolueno.

Gradientes de eluição (tolueno / AE em ml): 100/0, 100/100; Fracções cada 10 ml;

As fracções do produto são evaporadas em evaporador rotativo e misturadas com 10 ml cada de CH2C1Z / MeOH. Seca-se à temperatura ambiente sob alto vácuo. Obtêm-se deste modo 1,23 g (1,40 mmol) de uma espuma incolor. Esta quantidade corresponde a um rendimento de 95 % do teórico. 12. 2' -O-(1-Benziloxi)etil-5'-DMTR-3'-O-succinoíl-uridina

Num balão de 50 ml carregam-se 250 mg (0,368 mmol) de 2' -O-(1-benziloxi)etil-5'-DMTR-uridina (Exemplo 10.3), 50 mg (0, 490 mmol) de anidrido succínico e 60 mg de 4-DMAP e retoma--se com 10 ml de cloreto de metileno absoluto. A solução resultante é agitada à temperatura ambiente de um dia para o outro. Faz-se parar a reacção por agitação com 50 ml de tampão 59 (p U ^^ de fosfato (ρΗ 6,0), após ο que a solução reaccional é diluída com 100 ml dc AE. Repete-se o procedimento ma is uma vez, extrai-se a fase orgânica com tampão, seca-se sobre Na2SCh, filtra-se e concentra-se no evaporador rotativo até obtenção de um óleo. A purificação final é efectuada por cromatografia através de uma coluna de 2 cm de diâmetro carregada com 15 g de gel de sílica e equilibrada com tolueno.

Gradientes de eluição em ml (tolueno / AE): 100/0, 200/50, 150/50 (P) e 100/100 ,(P) ;

Fracções cada 10 ml;

As fracções do produto são evaporadas em evaporador rotativo, retomadas com CH2CI2 e filtradas através de uma pipeta de Pasteur cheia com algodão. 0 filtrado é de novo concentrado, agitado com MeOH e CH2CI2 e seco sob alto vácuo. Obtêm-se deste modo 265 mg (0,340 mmol) de uma espuma incolor. Esta quantidade corresponde a um rendimento de 93 % do teórico. 13.1 2'-0-[1-(4-Nitrofeniletoxi)etil]-3',5'-O-(1,1,3,3- -tetraisopropildissiloxano-1,3-diil)-uridina

Dissolvem-se 2,0 g (4,10 mmol) de 3',5'-0-(1,1,3, 3-tetra-isopropildissiloxano-1,3-diil)-uridina em 40 ml de dicloro-metano absoluto, trata-se com 3,07 mg (1,63 μπιοί) de p-TsOH·H20, 1,18 g (6,15 mmol) de éter 2-(4-nitrofenil)etil- vinílico e agita-se durante 30 minutos à temperatura ambiente. Após terminar a reacção, dilui-se com diclorometano e lava-se 3 x com 90 ml de cada vez de solução de hidrogenocarbonato de sódio saturada. Reextraem-se as fases aquosas com diclorometano, reúnem-se as fases orgânicas, seca-se sobre sulfato de sódio, separa-se por filtração e concentra-se em evaporador rotativo. O resíduo é carregado para purificação numa coluna de gel de sílica (3,5 x 21,5 cm) e é cromatografado com tolueno >(300 ml), tolueno / acetato de etilo 12:1 (480 ml), 11:1 (210 ml), 10:1 (220 ml), 9:1 (200 ml), 8:1 (180 ml), 7:1 (160 ml), 6:1 (140 ml), 5:1 (240 ml) e 4:1 (200 ml). ApÓ3 utilização dc 60 1500 ml de eluente, obtém-se o primeiro produto de reacção. Tidas a3 fracções que contêm produto são reunidas e concentradas em evaporador rotativo. Recristaliza-se o resíduo sólido restante a partir de 2 ml de tolueno / acetato de etilo 1:1, separam-se os cristais por filtração em filtro de vácuo, lavam-se com uma pequena quantidade de tolueno / acetato de etilo 1:1 e secam-se a 40 °c sob alto vácuo. ObLêm-se 2,3 g (3,38 mmol, 82 %) do composto sob a forma de cristais de cor amarela clara.

Ponto de fusão: 145 °C CCF (gel de sílica): Rf = 0,47 + 0,55

Análise: C31H49N3O10SÍ2 (679,92) N 6,18 6, 09 calc. C 54, 76 H 7,26 determ. 54,60 7,26 UV (metanol): λ^χ [mu] (lg ε) : 265 (4,28) 1H-RMN (250 MHz CDCI3, TMS, ppm) : N02 (NPEE)); m-H para. 9,24 (m, 1H, H-N(3)); 8,12+8,09 (2d, o-H para 7,94-7,88 (m, 1H, H-C(6)); 7,43+7,36 (2d, 2H, NO2/NPEE)); 5,73-5, 64 (m, 2H, H-C(l'), H-C(5)); 5,02-4,91 (m, 1H, CH(NPEE)); 4,26-3,60 (m, 7H, H-C(2'), a-CH2 (NPEE), H-C (3'), H-C(3'), H-C(4'), CH2(5')); 3,03-2,92 (m, 2H, β-Οί2 (NPEE)); 1,39+1,33 (2d, 3H, CH3(NPEE)); 1,07-0,90 (m, 28H, isopropilo) 13.2 2'-0-[1-(4-Nitrofeniletoxi)etil]-uridina

Dissolvem-se 2,0 mg (2,95 mmol) de 2'-0-[1-(4-nitro-feniletoxi)ctil]-3',5'-O-(1,1,3,3-tetraisopropi1dissiloxano--1,3-diil)-uridina em 8,0 ml de tetra-hidrofurano absoluto, trata-se com 2,22 g (7,06 mmol) de fluoreto de tetrabutilamónio • 3 H20, agita-se durante 25 minutos à temperatura ambiente e concentra-se em evaporador rotativo. Purifica-se o resíduo carregando-o numa coluna de gel de sílica (3,5 x 18,0 cm), 61 <1

ΐ cromatografando com diclorometano (250 ml), diclorometano / metanol 100:1 (250 ml), 98: 1 (500 ml), 96:1 (300 ml), 94:1 (300 ml), 90:1 (250 ml), 85:1 (500 ml), 80:1 (400 ml) e obtém-se após 1400 ml de utilização do eluente a primeira fracção do produto. Reúnem-se as fracções que contêm o produto e concentram-se em evaporador rotativo. Recristaliza-se o resíduo sólido a partir de 15 ml de acetato de etilo, separa-se o resíduo sólido em filtro de vácuo, seca-se este a 40 °C sob alto vácuo e isolam-se 1,13 g (2,59 mmol, 88 %) de cristais amarelos claros do composto.

Ponto de fusão: 162 ° C / metanol CCF (gel de sílica): Rf = 0, 42 + 0, 46 diclorometano 9:1

Análise: C19H23N3O9 (437, 40) N 9, 60 9, 20 calc. C 52,17 H 5,30 determ. 51,71 5,47 UV (metanol): A^áx [nm] (lg ε) : 265 (4,23) 1H-RMN (250 MHz, d5-DMSO, ppm) : 11,36 (s, 1H, H-N (6) ) ; 8,12 (d, 2H, o-H para N02(NPEE)); 7, 92-7,88 (m, 1H, H-C(6)); 7,47 (d, 2H, m-H para N02 (NPEE) ) ; 5, 89-5, 84 (m, 1 H, H-C(l')); 5, 655,62 (m, 1H, H-ctõ) ) ; 5,19-5,17 (m, 2H, HO-C(5')), HO-C(3')); 4,83-4,79 (m, 1 H, CH(NPEE)); 4,16-3,50 (m, 7H, H-C(2')), H-C(3'), H-C(4'), a-CHz(NPEE), CH2(5')); 2,90-2,80 (m, 2H, B-CH2 (NPEE) ) ; 1,22-1,1,13 (m, 3H, CH3(NPEE) 13.3 2'-O-[1-(4-Nitrofeniletoxi)etil]-uridina 3,0 g (6,16 mmol) de 3',5'-O-(1,1,3,3-tetraisopropildis-siloxano-1,3-diilo)-uridina são dissolvidos em 60 ml de diclorometano absoluto, arrefece-se num banho de gelo / cloreto de sódio a 0 °C, mistura-se com 4,6 mg (24,18 μκιοί) de p-Ts0H*H20, 1,78 g (9,24 mmol) de éter 4-nitrofeniletil-vinílico, agita-se em banho de gelo durante 2 a 3 horas e em 62

seguida neutraliza-se com solução 0,5 N de metanolato de sódio / metanol e concentra-se em cvaporador rotativo. Toma-se o resíduo em diclorometano, lava-se 3 x com 90 ml de cada vez de solução de hidrogenocarbonato de sódio saturada, extraem-se as fases aquosas com diclorometano, reúnem-se todas as fases orgânicas, secam-se sobre sulfato de sódio, filtram-se e concentram-se em evaporador rotativo. O resíduo é dissolvido em 13,0 μΐ de tetra-hidrofurano absoluto, é misturado com 4,08 g (0,013 mol) de fluoreto de tetrabutilamónio · 3 H20, agita-se à temperatura ambiente durante 1 hora e H e em seguida concentra-se em evaporador rotativo. O resíduo que fica é levado a purificar por cromatografia relâmpago em ácido silícico (3,0 x 19,0), é eluído com diclorometano (250 ml), diclorometano / metanol 100:1 (250 ml), 95:1 (285 ml), 90:1 (450 ml), 80:1 (480 ml) e obtém—se após 1200 ml de eluente a primeira fracção do produto. Todas as fracções com produto são reunidas e concentradas em evaporador rotativo e o resíduo sólido que fica é recristalizado com 15 ml de acetato de etilo. Separam-se os cristais por filtração em filtro de vácuo e secam-se a 40 °C sob alto vácuo. Do produto desejado isolam-se 2,47 g (5,66 mol, 92 %) sob a forma de cristais ligeiramente amarelados.

Ponto de fusão: 162 °C CCF (gel de sílica): Rf = 0,42 + 0,46 (diclorometano / metanol 9:1)

Análise: C19H23N3O9 (437, 40) calc. determ. C 52,17 51,71 H 5, 30 5,47 N 9, 60 9,20 UV (metanol): λ„ώΧ [nm] (lg ε) : 265 (4,23) 1H—RMN (250 MHz, dc-DMSO, ppm) : 63 11,36 (s, 1H, H-N(6)); 8,12 (d, 2H, o-H a N02(NPEE)); 7,92-7,88 (hl, 1H, H-C (6) ) ; 7,47 (d, 2H, m-H a NOz(NPEE)); 5, 89-5, 84 (m, 1H, H-C(1’)) ; 5,65-5, 62 (m, 1H, H-C(5)); 5,19-5,17 (m, 2H, H0-C (5')), HO-C(3') ) ; 4,83-4,79 (m, 1H, CH(NPEE)); 4,16-3,50 (m, 7H, H-C(2')) , H-C(3'), H-C(4'), a-CH2(NPEE), CH2 (5')); 2,90-2,80 (m, 2H, 9-CH2 (NPEE) ) ; 1,22-1,1,13 (m, 3H, CH3(NPEE) 13.4 5' -O-(4,4'-Dimetoxitrifenilmetil)-2'-O-[1(4-nitro- feniletoxi)etil]-uridina 0,5 g (1,4 ramol) de 2'-O-[1-(4-nitrofeniletoxi)etil]--uridina são coevaporados por 3 x com 15 mol de piridina absoluta de cada vez, o resíduo é em seguida dissolvido em 60 ml de piridina absoluta, é misturado com 0,46 g (0,37 mmol) de cloreto de 4,4'-dimetoxitrifenilmetil e é agitado à temperatura ambiente durante 4 horas. Em seguida dilui-se a mistura com 10 ml de metanol, agita-se durante mais 30 minutos à temperatura ambiente, concentra-se O depósito em evaporador rotativo até metade do volume, toma-se com diclorometano e lava-se por 2 x com 80 ml de água de cada vez. As fases aquosas são reextraídas com diclorometano, as fases orgânicas reunidas são secas sobre sulfato de sódio, separadas por filtração e concentradas em evaporador rotativo e o resíduo é por várias vezes coevaporado com tolueno. Para a purificação aplica-se o produto em bruto numa coluna de gel de sílica (4,0 x 25,0 cm), cromatografa-se com tolueno (100 ml), tolueno / acetato de etilo 2:1 (450 ml), 1:1 (600 ml) e obtém-se após 550 ml de eluente a primeira fracção do produto, sendo em seguida todas retidas, reunidas e concentradas em evaporador rotativo. Dissolve-se o resíduo em 4 ml de diclorometano, adiciona-se gota a gota 500 ml de éter de petróleo, separa-se por filtração em filtro de vácuo o precipitado obtido e seca-se a 40 °C sob alto vácuo, sobre aparas de parafina. Obtêm-se 0,67 g (0,91 mmol, 80 %) do composto sob a forma de um sólido amorfo, incolor.

Ponto de fusão: 136 °C 64

u CCF (gel de sílica): Rf = 0,44 (diclorometano / metanol 15:1)

Análise: C40H41N3O11 (739,78) calc. C 64, 94 H 5,58 N 5,68 determ. 65,31 6,09 5,10 UV (metanol): λ^χ [nm] (lg ε) : 204 (4,78); 233 (4, 33); 266 (4,22) 1H-RMN (250 MHz, d6-DMS0, ppm) : 11,4 (s, 1H, NH) ; 8,11 (d, 2H, o-H a NOz(NPEE)); 7,74 + 7,71 (2d, 1H, H-C (6) ) ; 7,48 (d, m-H a NOz(NPEE); 7, 38-7, 22 (m, 9H, O-H a OCH3, H(fenilo)); 6,88 (d, 4H, m-H a OCH3) ; 5,85+5,81 (2d, 1H, H-C(1')); 5,32-5,21 (m, 2H, H-C(5), HO-C(3')>; 4,91-4,87 (m, 1H), CH(NPEE)); 4,24-4,12 (m, 2H, H-C(2'), H-C(3')); 3,96 (m, 1H, H-C (4 ' )) ; 3,72-3, 58 (m, 8H, OCH3, <x-CH2 (NPEE) ) ; 3,32-3,19 (m, 2H, CH2(5')); 2,89 (t, 2H, (β-ΟΗ2 (NPEE) ) ; 1,26-1,18 (m, 3H, CH3(NPEE)) 14. 5'-O-(4,4'-Dimetoxitrifenilmetil)-2'-0[1(4-nitro- feniletoxi)etil]-uridina-3' -O-(N,N-diisopropil-2--cianoetil)-fosfitamida

Sob atmosfera de gás inerte são dissolvidos 0,5 g (0,67 mmol) de 5'-O-(4,4'-dimetoxitrifenilmetil)-2'-0[1(4-nitro-feniletoxi)etil]-uridina em 10 ml de diclorometano absoluto, isento de ácido, mistura-se com 23,6 mg (0,33 mmol) de 1H--tetrazolo, 0,407 g (1,35 mmol) de bis(diisopropilamino)-(2--cianoetoxi)fosfano e agita-se sob atmosfera de azoto de um dia para o outro à temperatura ambiente. Em seguida dilui-se a mistura reaccional com diclorometano, agita-se por 2 x com 30 ml de solução de cloreto de sódio / hidrogenocarbonato de sódio de cada vez, extraem-se as fases aquosas com diclorometano, reúnem-se todas as fases orgânicas que são em seguida secas sobre sulfato de sódio, separadas por filtração e concentradas em evaporador rotativo. 65 Γ Ο produto em bruto é aplicado sobre uma coluna de gel de sílica (3,3 x 14,0 cm), 6 eluido com tolueno + 0,5 % de EtsN (50 ml), tolueno / acetato de etilo 2:1 + 0,5 % de Et3N (300 ml), 1:1 + 0,5 % de Et3N (100 ml) e depois de 200 ml de eluente obtém-se a primeira fracção do produto. As várias fracções do produto são reunidas e concentradas em evaporador rotativo. O óleo resultante é coevaporado por várias vezes com dicloru-metano até à formação de espuma. Após secagem sob alto vácuo obtêm-se 314,0 mg (0,33 mol, 50 %) sob a forma de uma espuma de cor amarela. CCF (gel de sílica): Rf = 0,46 + 0,55 (tolueno / metanol 1:1)

Análise: C49H50N5O12 (940,0) 62,61 N 7,45 6,29 7,49

calc. C 62,61 H determ. 62,42 UV (metanol): λπ,άχ [nm] (lg ε) : 202 (4, 89); 234 (4,32); 265 (4,22) 1H-RMN (250 MHz, ds-DMSO, ppm) : 9,39 (s, 1H, NH) ; 8,1 (d, 2H, o-H a N02(NPEE)); 8,09-7,93 (m, 1H, H-C (6) ) ; 7,40-7,20 (m, 11H, m-H a OCH3, H(fenilo), m-H a N02 (NPEE)); 6,08-5,99 (m, 1H, H-C(l')); 5,29-5,25 (m, 1H, H-C(5)); 5,21-4,98 (m, 1H, CH(NPEE); 4,58-4,38 (m, 2H, H-C(2'), H-C(3')); 4,27-4,20 (m, 1H, H-C(4·)); 4,09-3,44 (m, 14H, 0C-CH2 (NPEE) , P-O-CH2, OCH3, CH2 (5') , N-CH) ; 2,98-2,90 (m, 2H, (3-CH2 (NPEE) ) ; 2,64+2,43 (2t, 2H, CH2-CN)); 1,40-1,14 (m, 15H, CH3(NPEE), C(CH3) 2) 31P-RMN (161,70MHz, CDC13, H3P04, ppm): 151,24; 150,85; 150,75; 150,14 66 15

5'-Ο-(4,4'-Dimetoxitrifenilmetil)-2'-0-[1-(4-nitro-feniletoxi)etil]-uridina-3'-O-(N,N-diisopropil-[2- (4— nitrofenil)etil)-fosfitamida 0,15 g (0,202 mmol) de 5'-O-(4,4'-dimetoxitrifenilmetil)--2'-O-[1-(4-nitrofeniletoxi)etil]-uridina e 9,6 mg (0,137 mmol) de ΙΗ-tetrazolo são introduzidos num balão cheio de azoto, são dissolvidos em 4 ml de diclorometano isento de ácido, absoluto, são misturados com 0,21 g (0,547 mmol) de bis- (diisopropilamino)-2-(4-nitrofeniletoxi)fosfano e são agitados de um dia para o outro à temperatura ambiente sob atmosfera de azoto. Em seguida concentra-se em evaporador rotativo e submete-se o produto em bruto a purificação numa coluna de gel de sílica (3,0 x 10,0 cm). Executa-se a cromatografia com tolueno (250 ml), tolueno / acetato de etilo 3:1 (200 ml), 2:1 (600 ml) e obtém-se, após aplicação de 500 ml de eluente, a primeira fracção do produto. As várias fracções que contêm o produto são reunidas e concentradas em evaporador rotativo. O residuo é coevaporado por várias vezes, com diclorometano, até à formação de espuma. Após secagem sob alto vácuo obtêm-se 0,125mg (0,12 mol, 60 %) do produto desejado sob a forma de uma espuma incolor. CCF (gel de sílica): Rf = 0,52 (tolueno / acetato de etilo 1:1) Análise: C54H62N5Oi4P (1036, 09) calc. determ. C 62,60 62, 55 H 6,03 N 6,75 6,15 6,48 UV (metanol): Xmáx [nm] (lg ε) : 202 (5,0); 235 (4,39); 267 (4,43) 1H-RMN (250 MHz, CDC13, TMS, ppm) : 8,72 (s, 1H, NH) ; 8,12-7,98 (m, 5H, H-C(6), o-H a N02 (NPEE e NPE)); 7,41-7,21 (m, 13H, H(fenilo), m-H a N02 (NPEE e NPE), m-H a 0CH3); 6,81 (d, 4H, o-H a 0CH3) ; 6,15-6,0 (m, 1H, H-C(lr)); 67 5,27-5,18 (m, 1H, H-C(5)); 5,01-4,89 (m, 1H, CH(NPEE)); 4,57-4,03 (m, 3H, H-C(2’), H-C(3’)/ H-C(4'))/ 4,0-3,21 (m, 14H, a-CH2(NPEE), 0CH3, PO-CH2, CH2(5'), N-CH) ;3,01-2,85 (m, 4H, CH2-N02), P~CH2(NPEE) ) ; 1,30-0,99 (m, 15H, CH3(NPEE), C(CH3)2) 31P-RMN (161,70 MHz, CDC13, H3P04, ppm) : 150,04; 149,83; 149,39; 149,28 16.1 N4- [2-(4-nitrofenil)etoxicarbonil]-2'-O-[1-(4-nitro- feniletoxi)etil-3',5'-O-(1,1,3,3-tetraisopropil-dissiloxano-1,3-diil)-citidina 0,5 g (0,73 mmol) de N4-[2-(4-nitrofenil)etoxicarbonil]--3',5'-O-(1,1,3, 3-tetraisopropildissiloxano-l,3-diil)-citidina são dissolvidos em 8 ml de diclorometano absoluto, são misturados com 0,58 mg (3,05 μιηοΐ) de p-Ts0H*H20 e são arrefecidos em banho de gelo a 0°C. Em seguida adicionam-se 0,211 g (1,095 mmol) de éter 4-nitrofenilvinílico e agita-se a solução de reacção primeiro em banho frio e em seguida deixa-se aquecer lentamente até à temperatura ambiente. Passadas 5 horas neutraliza-se a mistura reaccional com uma solução de metanolato de sódio 1,0 N / metanol e concentra-se em evaporador rotativo.

Submete-se o produto em bruto a purificação numa coluna de gel de sílica (3,0 x 18,0 cm), elui-se com tolueno (400 ml), tolueno / acetato de etilo 5:1 (240 ml), 4:1 (500 ml), 3:1 (840 ml), 2:1 (500 ml) e obtém-se, após aplicação de 130 ml de eluente, a primeira fracção do produto. As várias fracções que contêm o produto são purificadas e concentradas em evaporador rotativo e o óleo resultante é coevaporado por várias vezes com diclorometano. Após secagem da espuma incolor a 40 °C sob alto vácuo, obtêm—se 0,53 g (0,607 mmol, 83 %) do produto desejado. CCF (gel de sílica): Rf = 0,27 + 0,44 (tolueno / acetato de etilo 1:1)

Análise: C40H57N5O13SÍ2, (872,09) N 8, 03 7, 83 H 6,5» 6, 65 calc. C 55,09 determ. 54,93 UV (metanol): Xmáxtnm] (lg ε) : 211 (4,53); 247 (4,33); 276 (4,36) 1H-RMN (250 MHz, d6~DMSO, ppm): 10,88 (s, 1H, NH) ; 8,16-8,02 (m, 5H, H-C(6), o-H a NO2 (NPEE e NPEOC) , 7,61-7,48 (m, 4H, m-H a N02 (NPEE e NPEOC) ) ; 6,97 (d, 1H, H-C(5)); 5,67+5,69 (2s, 1H, H-C(l')); 5,05-4,92 (m, Ih, CH(NPEE)); 4,37-4,33 (m, 2H, a-CH2 (NPEOC)); 4,22-3,58 (m, 7H, H-C(2'), H-C (3'), H-C(4'); a-CH2(NPEE), CH2(5')); 3, 09-2, 90 (M, 4H, P-CH2 (NPEOC) , β-ΟΗ2 (NPEE) ) ; 1,34+1,26 (2d, 3H, CH3(NPEE)); 1,03-0, 77 (m, 28H, isopropilo) . 16.2 N4-[2-(4-Nitrofenil)etoxicarbonil]-2'-O-[1-(4-nitro- feniletoxi)etil-3',5'-0-(1,1,3,3-tetraisopropil-dissiloxano-1,3-diil)-citidina 1,0 g (1,47 mmol) de 2'-O-[1-(4-nitrofeniletoxi)etil--3',5'-O-(1,1,3,3-tetraisopropildissiloxano-l,3-diil)-citidina (do Exemplo 19) são dissolvidos em 20 ml de dimetilformamida absoluta, são misturados com 0,59 g (1,91 mmol) de cloreto de l-metil-3-p-nitrofeniletoxicarbonilimidazolo e são agitados durante 3 horas à temperatura ambiente. Em seguida concentra-se a dimetilformamida em evaporador rotativo sob alto vácuo, recolhe-se o resíduo em diclorometano, agita-se 2 x com 50 ml de água de cada vez e 1 x com 50 ml de solução de hidrogeno-carbonato de sódio. As várias fases aquosas são reextraídas com diclorometano e as fases orgânicas reunidas são secas sobre sulfato de sódio, separadas por filtração e concentradas em evaporador rotativo. O resíduo é submetido a purificação numa coluna de gel de sílica (2,0 x 18,0 cm), é cromatografado com tolueno (150 ml), 69 t L· tolueno / acetato de etilo 4:1 (650 ml), 2:1 (150 ml), 1:1 (100 ml) e obtém-se, após aplicação de 500 ml de eluente, a primeira fracção do produto. Todas as fracções que contêm o produto são reunidas, concentradas em evaporador rotativo, o óleo remanescente é coevaporado por várias vezes com diclorometano e seca-se em seguida a espuma incolor resultante a 40 °C, sob alto vácuo. Pode-se isolar 1,23 g (1,41 mmol, 95 %) do composto. CCF (gel de sílica) : Rf = 0,27 + 0, 44 (tolueno / acetato de etilo 1:1) C40H57N5O13SÍ2 (872,09) UV (metanol): ^[nm] (lg ε) : 211 (4,53); 247 (4, 33); 276 (4,36) 1H-RMN (250 MHz, CDC13, TMS, ppm) : 10,88 (s, 1H, NH) ; 8,16-8,02 (m, 5H, H-C(6), o-H a N02 (NPEE e NPEOC) 7,61-7,48 (m, 4H, m-H a N02 (NPEE e NPEOC) ) ; 6,97 (d, 1H, H-C(5)); 5,67+5,69 (2s, 1H, H-C(l')); 5,05-4,92 (m, lh, CH(NPEE)); 4,37-4, 33 (m, 2H a-CH2 (NPEOC)); 4,22-3,58 (m, 7H, H-C(2’), H-C(3'), H-C(4'); a-CH2(NPEE), CH2(5')); 3,09-2,90 (M, 4H, β-CHz (NPEOC) , p-CH2 (NPEE) ) ; 1,34+1,26 <2d, 3H, CH3(NPEE)); 1,03-0,77 (m, 28H, isopropilo). 16.3 N4-[2-(4-Nitrofenil)etoxicarbonil]-2’-0-[1-(4-nitro- feniletoxi)etil]citidina 2,0 g (2,95 mmol) de N4-[2-(4-nitrofenil)etoxicarbonil]--3',5'-O-(1,1,3,3-tetraisopropildissiloxano-l,3-diil)-citidina são dissolvidos em 30 ml de diclorometano absoluto, são misturados com 2,36 mg (12,4 μπιοί) de ácido 4-toluenosulfónico x H20 e são arrefecidos em banho de gelo a 0 °C. A esta mistura adicionam-se 0,85 g (4,42 mmol) de éter 4-nitrofeniletílico, agita-se primeiro a mistura reaccional em banho frio e em seguida deixa-se regressar lentamenLe à temperatura ambiente. 70 ril L·

t

Passadas 9 horas, a mistura é neutralizada com uma solução de metanolato de sódio 1,0 N / metanol e concentrada em evaporador rotativo. 0 óleo remanescente é dissolvido em 7,0 ml de tetra--hidrofurano absoluto, misturado com 1,95 g (6,19 mmol) de fluoreto de tetrabutilamónio x 3 H20 0,5 ml de acetato de etilo, agita-se durante 4 horas à temperatura ambiente e em seguida concentra-se em evaporador rotativo. O resíduo é submetido a purificação numa coluna de gel de sílica (3,5 x 15,0 cm), é cromatografada com diclorometano (400 ml), diclorometano / metanol 90:1 (270 ml), 50:1 (250 ml), 30:1 (500 ml) tendo-se podido obter, após aplicação de 1100 ml de eluente, as primeiras fracções do produto. As várias fracções que contêm o produto são reunidas e concentradas em evaporador rotativo. 0 resíduo é dissolvido em diclorometano, adiciona-se 150 ml de éter dietílico gota a gota, separa-se por filtração em filtro de vácuo o precipitado formado e seca-se a 40 °C sob alto vácuo. Obtêm-se 1,25 g (1,98 mmol, 68 %) do produto desejado, sob a forma de um sólido amorfo incolor. CCF (gel de sílica): Rf = 0,38 + 0,48 (diclorometano / metanol 95:5)

Análise: C28H31N5O12 (629,58) calc. C 53,41 H 4,96 N 11,12 determ. 53,46 5,13 10,89 UV (metanol): λ^ηιη] (lg 6): 212 (4,49); 2,47 (4,32); 275 (4,34) 1H-RMN (250 MHz, ds-DMSO, ppm) : 10,79 (S, 1H, NH) ; 8,41-8,35 (iu, 1H, H~C(6)); 8,15-8,05 (m, 4H, o-H a N02 (NPEOC e NPE) ) ; 7, 60-7,42 (m, 4H, mH a N02 (NPEOC e NPEE)); 6, 95 (d, 1H, H-C (5) ) ; 5,87-5,79 (2d, 1H, H-C (1 ')); 5,24-5,07 (m, 2H, HO-C ( 5' HOC(3 *)); 4, 96+4,90 (2q, 1H, CH(NPEE)); 4,75 (t, 2H, a- -CH2 (NPEOC)) ; 4,103,67 (m, 7H, 71 Γ U K- t H-C (2' ) , H-C(3') , H-C(4’), CH2(5'), a-CH2 (NPEE)); 3,07 (t, 2H, (3-CH2 (NPEOC) ) ; 1,25+1,19 (2d, 3H, CH3(NPEE) 16.4 N4- [2- (4-Nitrofenil)etoxicarbonil]-21-O-[1-(4-nitro feniletoxi) etil] -citidina 2,78 g (3,18 mmol) de N4-[2-(4-nitro£enil)etoxicarbonil]--2'-O-[1-(4-nitrofeniletoxi)etil]-3', 5'-0-(1,1,3,3—tetraiso-propildissiloxano-1,3-diil)-citidina são dissolvidos em 8,0 ml de tetra-hidrofurano absoluto, misturados com 2,51 g (7,97 mmol) de fluoreto de tetrabutilamónio x 3 H20, 0,6 ml de ácido acético glacial, agita-se a solução reaccional durante 4 horas à temperatura ambiente e em seguida concentra-se em evaporador rotativo. O óleo resultante é submetido a purificação numa coluna de gel de sílica (3,0 x 15,0 cm), onde é eluído com diclorometano (300 ml), diclorometano / metanol 95:1 (380 ml), 90:1 (360 ml), 80:1 (240 ml), 70:1 (330 ml), 60:1 (900 ml), 55:1 (660 ml) e após aplicação de 1300 ml de eluente obtém-se a primeira fracção contendo o produto. Reúnem-se as várias fracções que contêm o produto, concentram-se em evaporador rotativo, o resíduo resultante é coevaporado por várias vezes até à formação de espuma. Após secagem da espuma incolor a 40 °C sob alto vácuo, obtêm-se 1,95 g (3,09 mmol, 97 %) do produto desejado. CCF (gel de sílica): Rf = 0,38 + 0,48 (diclorometano/metanol 95:5) C28H31N5O12 (629,58)

Os dados espectroscópicos são idênticos aos do Exemplo 16.3. 16.5 N4-[2-(4-Nitrofenil)etoxicarbonil]-21-O-[1-(4-nitro feniletoxi) etil]-citidina 0,5 g (1,14 mmol) de 2'-O-[1-(4-nitrofeniletoxi)etil]- 72 -citidina e 0,46 g (1,49 mmol) de cloreto de l-metíl-3-ρ—nitro-feniletoxicarbonilimidazólio são dissolvidos em 10 ml de dimetilformamida absoluta e são agitados durante 3 horas à temperatura ambiente. A dimetilformamida é em seguida separada por concentração em evaporador rotativo sob alto vácuo, o residuo é recolhido em diclorometano, lavado por 2 x com 30 ml de água de cada vez e 1 vez com 30 ml de solução de hidrogeno-carbonato de sódio. Todas as fases aquosas são reextraidas com diclorometano, as fases orgânicas reunidas são secas sobre sulfato de sódio, filtradas e concentradas em evaporador rotativo. A purificação é realizada numa coluna de gel de sílica (3,0 x 17,0 cm), com eluição por diclorometano (200 ml), diclorometano / metanol 98:1 (100 ml), 96:1 (95 ml), 94:1 (190 ml), 92:1 (90 ml), 90:1 (360 ml), 85:1 (340 ml), 80:1 (160 ml), 76:1 (75 ml), 70:1 (70 ml), 60:1 (60 ml), 50:1 (100 ml), 40.1 (80 ml), 30:1 (180 ml), 25:1 (250 ml) e obtém-se, após aplicação de 1200 ml de eluente, a primeira fracção do produto. As várias fracções que contêm o produto são reunidas e concentradas em evaporador rotativo, o resíduo obtido é coevaporado com diclorometano por várias vezes até à formação de espuma. Após secagem da espuma incolor a 40 °C, sob alto vácuo, obtêm-se 0,52 g (0,82 mmol, 73 %) do composto. CCF (gel de sílica): Rf = 0,25 + 0,33 (diclorometano/metanol 95:5) C28H31N5012 (629, 58)

Os dados espectroscópicos são idênticos aos do Exemplo 16.3. 16.6 5'-0-(4,4'-Dimetoxitrifenilmetil)-N4-[2-(4-nitrofenil)- etoxicarbonil]-2'-0-[1-(4-nitrofeniletoxi)etil]--citidina 1,95 g (3,09 mmol) de N4-[2-(4-nitrofenil)etoxicarbonil]--2 1-o-[ 1-(4-nitrofeniletoxi)etil]-citidina são coevaporados 3 x - u com 10 ml de piridina absoluta de cada vez, o resíduo é dissolvido em 60 ml de piridina absoluta, misturado com 1, 36 g (4,02 mmol) de cloreto de 4,4'-dimetoxitrifenilmetilo e a solução reaccional é agitada à temperatura ambiente de um dia para o outro. Em seguida adicionam-se 10 ml de metanol, agita--se durante mais 30 minutos à temperatura ambiente, concentra--se em evaporador rotativo e o resíduo é coevaporado por várias vezes com tolueno. O produto em bruto é submetido a purificação numa coluna de gel de sílica (3,0 x 12,0 cm), eluído com tolueno (400 ml, tolueno / acetato de etilo (3:1, (400 ml), 2:1 (1200 ml) e obtém-se, após aplicação de 850 ml de eluente, a primeira fracção do produto. As várias fracções que contêm o produto são reunidas e concentradas em evaporador rotativo. O resíduo é dissolvido em 2 ml de diclorometano, adicionam-se gota a gota 250 ml de éter dietílico, separa-se por filtração em filtro de vácuo o precipitado formado e seca-se a 40 °C sob alto vácuo. Obtêm-se 2,61 g (2,80 mmol, 91 %) do composto sob a forma de um sólido incolor, amorfo. CCF (gel de sílica): Rf = 0,48 (tolueno / acetato de etilo / -metanol 5:4:1 )

Análise: Cí^iNsO^xí^O (949, 97) calc. C 61,95 H 5,19 N 7,37 determ. 61,42 5,35 7,09 UV (metanol): λπώχ[ηιη] (lg ε) : 211 (4,72); 236 (4,55); 274 (4,40) ^-RMN (250 MHz, d6-DMSO, ppm) : 10,71 (s, 1H, NH); 8,28-8,22 (m, 1H, H-C(6)); 8,16-8,06 (m, 4H, O-H a N02(NPE0C e NPEE)); 7, 60-7,22 (ju, 13H, m-Η a N02 (NPEOC e NPEE) , H(fenilo), m-H a OCH3) ) ; 6,90-6,87 (m, 4H a OCH3) ; 6,78-6,71 (m, 1H, H-C(5)); 5,75+5,74 (2s, 1H, H-C(l’))' 5'41 +5,19 (2d, 1H, HO-C(3’)); 5,09 +4,95 (2q, 1 H, CH(NPEE)) ! 4'34 (t, 2H, a-CH2 (NPEOC)); 4,28-3, 63 (m, 13H, H-C (2 *) , H-C(3'), 74 ff '4

3,07 (t, 2H, (p- 1,28+1,?? (2d, 3H, H-C (4 ') , a-CH2 (NPEE), OCH3, CH2(5')); -CH2 (NPEOC) ) ; 2,92 (m, 2H, β-0Η2(ΝΡΕΕ) CH3 (NPEE)) 17. 5' -O-(4,4'-Dimetoxitrifenilmetil)-N4-[2-(4-nitrofenil)- etoxicarbonil]-2'-O-[1-(4-nitrofeniletoxi)etil]--citidina-3'-O-(N,N-diisopropil-2-cianoetii)--fosfitamida 0,4 g (0,43 mmol) de 5'-O- (4,4'-dimetoxitrifenilmetil)-N4--[2-(4-nitrofenil)etoxicarbonil]-2'-O-[1-(4-nitrofeniletoxi)-etil]-citidina e 18,0 mg (0,25 mmol) de ΙΗ-tetrazolo são carregados num balão inundado com azoto em estado gasoso e dissolvem-se os reagentes em 8 ml de acetonitrilo absoluto (análise do resíduo). Em seguida adicionam-se 0,31 g (1,03 mol) de bis(diisopropilamino)(2-cianoetoxi)fosfano e agita-se de um dia para o outro sob atmosfera de azoto à temperatura ambiente. Em seguida dilui-se a solução de reacção com acetato de etilo, agita-se 3 x com 40 ml de solução de cloreto de sódio / hidrogenocarbonato de sódio, recuperam-se por extracção as fases aquosas com acetato de etilo, reúnem-se as várias fases orgânicas que são em seguida secas sobre sulfato de sódio, separadas por filtração e concentradas em evaporador rotativo. O resíduo oleoso é submetido a purificação numa coluna de gel de sílica (2,5 x 20,0 cm), é eluido com tolueno (100 ml), tolueno / acetato de etilo 3:1 (200 ml), 2:1 (750 ml), 1:1 (200 ml) e obtém-se, após aplicação de 450 ml de eluente, a primeira fracção do produto. Todas as fracções que contêm o produto são reunidas, concentradas em evaporador rotativo, o resíduo é coevaporado por várias vezes com acetato de etilo até à formação de espuma e em seguida é seco sob alto vácuo. Obtêm-se 0,42 g (0,37 mmol, 86 %) do composto sob a forma de uma espuma incolor. CCF (gel de sílica): Rf = 0,73 +0,76 (tolueno / acetato de etilo / metanol 5:4:1) 75

Análise: C58H66N7O15P (1132,18) calc. determ. C 61,53 60, 88 H 5,87 6,24 N 8,65 8,50 UV (metanol): A^áx [nm] (lg ε) : 203 (4,91); (214 (4,66)]; 235 (4,48; 275 (4,33) ^-RMN (250 MHz, CDCI3 TMS, ppm) : 8,58-8,49 (m, 1H, H-C(6)); 8,20-8,06 (m, 5H-0-H a N02 (NPEE e NPEOC) , NH) ; 7,42-7,21 (m, 13H, m-H a N02 (NPEE e NPEOC) , H(fenilo), m-H a OCH3) ; 6,87-6,58 (m, 5H, o-H a OCH3, H-C(5)); 6,10-5,91 (m, 1H-H-C(1')); 5,29-5,12 (m, 1H, CH(NPEE)); 4,49-4,39 (m, 2H, a-CH2 (NPEOC) ) ; 4,32-4,10 (m, 3H, H-C (2'), H-C(3 *), H-C(4')); 4,0-3,78 (m, 8H, a-CH2(NPEE), OCH3); 3,70-3,40 (m, 8H, P-0-CH2, CH2(5’), N-CH, β-Οί2 (NPEOC) ) ; 3,18-2,90 (m, 4H., CH2-CN, β-ΟΪ2 (NPEE) ) ; 1,33-0,92 (m, 15H, CH3(NPEE), C(CH3) 2) 31P-RMN (161,70 MHz, CDCI3 H3PO4, ppm): 151,63; 150,34; 150,22; 149,54 18. 5' -O-(4,4'-Dimetoxitrifenilmetil)-N4-(2-(4-nitrofenil)- etoxicarbonil]-21-O-[1-(4-nitrofeniletoxi)etil]--citidina-3'-O-(N,N-diisopropil-[2-(4-nitrofenil)etil)--fosfitamida

Pesam-se 0,4 g (0,43 mmol) de 5'-0-(4,4'-dimetoxitrifenilmetil) -N4- [2 - (4-nitrofenil)etoxicarbonil]-2'-0-[1- (4--nitrofeniletoxi)etil]-cítidína e 20,31 mg (0,29 mmol) de 1H--tetrazolo num balão inundado com azoto em estado gasoso, dissolvem-se em 9 ml de acetonitrilo absoluto (análise do residuo) , adicionam-se 0,46 g (1,5 mol) de bis (diiso-propilamino)-2-(4-nitrofeniletoxi)fosfano e agita-se de um dia para o outro, sob atmosfera de azoto, à temperatura ambiente. Em seguida dilui-se a solução de reacção com acetato de etilo, agita-se 3 x com 40 ml de solução de cloreto de sódio / 76 - u hidrogenocarbonato de sódio, recuperam-se por extracção as fases aquosas com acetato de etilo, reúnem-se as várias fases orgânicas que são em seguida secas sobre sulfato de sódio, separadas por filtração e concentradas em evaporador rotativo. 0 resíduo oleoso é submetido a purificação numa coluna de gel de sílica (2,5 x 20,0 cm), é eluido com tolueno (100 ml), tolueno / acetato de etilo 3:1 (200 ml), 2:1 (750 ml), 1:1 (200 ml) e obtém-se, após aplicação de 450 ml de eluente, a primeira fracção do produto. Todas as fracções que contêm o produto são reunidas, concentradas em evaporador rotativo, o resíduo é coevaporado por várias vezes com acetato de etilo até à formação de espuma e em seguida é seco sob alto vácuo. Obtêm-se 0,42 g (0,37 mmol, 86 %) do composto sob a forma de uma espuma incolor. CCF (gel de sílica): Rf = 0, 19 + 0, 32 + 0,38 (tolueno / acetato de etilo / metanol 5:4:1)

Análise: C63H7oN7012P (1228,27) calc. C 61,60 H 5,74 N 7,98 determ. 61,31 5,93 7,75 UV (metanol): λ^χ [nm] (lg ε) : 204 (5,0); [211 (4,85)]; 236 (4,57); 274 (4,57) 1H-RMN (250 MHz, CDC13, TMS, ppm): 8,52-8,41 (m, 1H, H-C(6}); 8,20-7, 97 (m, 7H, o-H a N02 (NPEOC, NPEE e NPE) , NH) ; 7,43-7,19 (m, 1 5H, m-H a N02 (NPEOC, NPEE e NPE) , H(fenilo), m-H a OCH3) ; 6,84-6,55 (m, 5H, o-H a OCH3, H-C(5)); 6,02-5,90 (m, 1H, HC(1')); 5,21-5,12 (m, 1H, CH(NPEE)); 4,44-4,42 (m, 2H, a-CH2 (NPEOC)); 4,25-4,13 (m, 3H, H-C (2 ' ) / H-C (3' ) , H-C(4*)); 3,92-3,61 (m, 10H, PO CH2, a-CH2 (NPEE), 0CH3) ; 3,51-3,39 (m, 4H, CH2(5'), N-CH); 3,15-2,81 (m, 6H, β-0Η2 (NPEE)); 1,34-1,02 (m, 15H, CH3(NPEE), C(CH3)2) 31P-RMN (161,70 MHz, CDC13, H3P04, PPM): 77 \ t 150,28; 149,21; 148,97; 148,35 19.1 2' -Ο-[1-(4-Nitrofeniletoxi)etil]-3', 5' -O-(1,1,3,3- -tetraisopropildissiloxano-1, 3-diil)-citidina 2,0 g (3,79 mmol) de N4-acetil-3',5'-0-(1,1,3,3-tetraiso-propildissiloxano-1,3-díil)-citidina são dissolvidos em 40 ml de diclorometano absoluto, misturados com 0,31 g (1,64 mmol) de p-Ts0H-H20, 1,09 g (5,68 mmol) de éter 4-nitrofenilvinílico, agitados à temperatura ambiente durante 2 H horas e em seguida neutralizam-se com solução de metanolato de sódio 9,5 N / metanol e concentram-se em evaporador rotativo. Toma-se o resíduo em diclorometano, agita-se 3 x com 70 ml de solução saturada de hidrogenocarbonato de sódio, extraiem-se todas as fases aquosas com diclorometano e reúnem-se em seguida todas as fases orgânicas, que são então secas sobre sulfato de sódio, separadas por filtração e concentradas em evaporador rotativo. Para proceder à purificação coloca-se o produto em bruto numa coluna de gel de sílica (3,5 x 21,0). A eluição é feita com tolueno (200 ml), tolueno / acetato de etilo 1:1 (200 ml), 1:2 (600 ml), 1:3 (600 ml), 1:4 (250 ml), 1:5 (480 ml), 1:8 (180 ml) e obtém-se a primeira fracção que contém o produto após aplicação de 1500 ml de eluente. Reúnem-se várias fracções do produto e concentram-se em evaporador rotativo. O óleo remanescente é coevaporado por várias vezes com diclorometano e a espuma incolor resultante é em seguida seca a 40 °C, sob alto vácuo. Do composto podem-se obter 1,64 g (2,41 mmol, 64 %). CCF (gel de sílica) : Rf = 0,51 (tolueno / acetato de etilo / -metanol) 5:4:1 )

Análise: C31H50N4O9SÍ2 (678, 93) calc. C 54,84 H 7,42 N 8,25 determ. 54,76 7,35 8,05 UV (metanol): [nm] (lg ε) : 271 (4, 27) 78 f 1H-RMN (250 MHz, dg-DMSO, ppm) : 8,19-6,08 (m, 2H, o-H a N02(NPEE)); 7,71-7,57 (m, 1H, H-C(6))/ 7,54-7,48 (m, 2H m-H a N02(NPEE)); 7,22 (s, 2H, NH2) ; 5,06 + 5,04 (2 q, 1 H, CH(NPEE)); 4,19-3,60 (m, 7H, H-C(2'), H-C(3*), a-CH2(NPEE), H-C(4'), CH2(5')); 2,93-2,9 (m, 2H, (β-ΟΗ2 (NPEE)); 1,32+1,25 (2d, 3H, CH3(NPEE)); 1,02-0,78 (m, 28 H, isopropílo) 19.2 2'-O-(1-(4-Nitrofeniletoxi)etil]-citidina

Dissolvem-se 2,0 g (3,79 mmol) de N4-acetil-3',5'-O-- (1,1,3,3-tetraisopropildissiloxano-l,3-diil)-citidina em 40 ml de diclorometano, mistura-se a solução de reacção com 0,31 g (1,64 mmol) de p-TsOH-H20 1, 09 g (5,68 mmol) de éter 4-nitro-feniletilvinilico, agita-se a mistura durante 2 H horas à temperatura ambiente, neutraliza-se com solução de metanolato de sódio 0,5 N / metanol e em seguida concentra-se em evaporador rotativo. O residuo é recolhido em diclorometano e agitado por 3 x com 70 ml de solução de hidrogenocarbonato de sódio de cada vez. Todas as fases aquosas são extraidas com diclorometano, reúnem-se várias fases orgânicas, secam-se sobre sulfato de sódio, filtram-se e concentram-se em evaporador rotativo. O resíduo remanescente é retomado em 3,0 ml de tetra--hidrofurano absoluto, misturado com 2,87 g (9,09 mmol) de fluoreto de tetrabutilamónio x 3 H20, agita-se à temperatura ambiente durante 20 minutos e em seguida concentra-se em evaporador rotativo. A fim de purificar, carrega-se o óleo obtido numa coluna de gel de sílica (3,7 x 17,0 cm), elui-se com diclorometano (200 ml), diclorometano / metanol 90:1 (270 ml), 80:1 (160 ml), 70:1 (140 ml), 50:1 (100 ml), 40:1 (80 ml), 20:1 (150 ml), 10:1 (440 ml), 9:1 (100 ml) e após aplicação de 1000 ml de eluente obtém-se a primeira fracção com produto. As várias fracções com produto são purificadas, concentradas em evaporador rotativo e o resíduo é recristalizado a partir de 100 ml de diclorometano. O sólido precipitado é filtrado em filtro de vácuo e em seguida é seco a 40 °C sob alto vácuo. 79 Γ

U

Obtêm-se 1,03 g (2,36 mmol, 62 %) de um produto incolor, cristalino que apesar da recristalização contém ainda impurezas de fluoreto de tetrabutilamónio.

Ponto de fusão: 145 °C CCF (gel de sílica) Rf= 0,34+0,4 (clorofórmio / metanol 1:1) UV (metanol): Xmáx(nm] (lg ε) : 271 (4,16) 1H-RMN (250 MHz, d6-DMSO, ppm) : 8,10 (2d, 2H, o-H a N02(NPEE)), 7,88+7,85 (2d, 1H, H-C(6)); 7,49 (2d, 2H, m-H a N02 (NPEE) ) , 7,28+7,20 (2s, 2H, NH2) ; 5,89+5,82 (2d, 1H, H-C(l')); 5,72+5,70 (2d, 1H, H-C(5)); 5,20-4,99 (m, 2H, HO-C(5·)/ HO-C(3')); 4,35 (m, 1H, CH(NPEE)); 4,08-3,48 (m, 7H, H-C(2'), H-C(3’), H-C(4'), CH2(5')/ a-CH2 (NPEE)) ; 2,95-2, 78 (m, 2H, p-CHz(NPEE); 1,18+1,14 (2d, 3H, CH3(NPEE)); 19.3 N4-Acetil-2'-O-(1-(4-nitrofeniletoxi)etil J-citidina 3,3 g (6,25 mmol) N4-acetil-3',5'-0-(1,1, 3, 3-tetradiiso-propildissiloxano-1,3-diil-citidina são dissolvidos em 60 ml de diclorometano absoluto, arrefecidos em banho de gelo / cloreto de sódio a 0 °C, são misturados com 0,51 g (2,70 mmol) de p--TSOH-H2O, 1,80 g (9,37 mmol) de éter 4-nitrofeniletilvinílico, são agitados durante 2 horas em banho frio e em seguida são agitados numa ampola de decantação por 3 x com 70 ml de solução de hidrogenocarbonato de sódio de cada vez. As fases aquosas são extraídas com diclorometano, reúnem-se as várias fases orgânicas, secam-se sobre sulfato de sódio, filtram-se e concentram-se em evaporador rotativo. 0 resíduo é dissolvido em 14,0 ml de tetra-hidrofurano absoluto, é misturado com 4,3 g (13,63 mmol) de fluoreto de tetrabutilamónio x 3 ll20, é agitado durante 30 minutos à temperatura ambiente e em seguida concentra-se em evaporador rotativo.

Para purificar, carrega-se o óleo remanescente numa coluna 80 t de gel de sílica (4,0 x 13,0 cm), cromatografa-se com dicloro- me Lana (600 ml), diclorometano / metanol 95 : 1 (570 ml) . 90:1 (810 ml), 85:1 (570 ml) . 80:1 (480 ml) , 70:1 (560 ml), 60:1 (480 ml), 55:1 ( ;280 ml), 50:1 (500 ml) , 45:1 (640 ml) , 40:1 (980 ml) e após aplicação de 4000 ml de eluente obtém-se a primeira fracção do produto. As várias fracções do produto são reunidas e concentradas em evaporador rotativo. Dissolve-se o resíduo em 3 ml de diclorometano, adicionam-se gota a gota 300 ml de éter dietílico, separa-se por filtração em filtro de vácuo o precipitados formado e seca-se a 40°C sob alto vácuo. Obtêm-se 2,62 g (5,47 mmol, 88 %) do produto, sob a forma de um sólido incolor, amorfo.

Ponto de fusão: 157°C CCF (gel de sílica) Rf = 0,56 +0,63 (diclorometano / metanol 9:1)

Análise: C2iH26N409 (478, 46) calc. C 52,71 H 5,47 N 11,70 determ. 52,70 5,59 11,09 UV (metanol): Kk* [nm] (lg ε) : 212 (4,35); 250 (4,26); 279 (4,08) lH-RMN (250 MHz, d6-DMSO, ppm) : 10,89 (s, 1H, NH); 8,41 (t, 1H, H-C(6)); 8,12-8,02 (m, 2H, o-H a NO2 (NPEE) ) ; 7,47 (t, 2H, m-H a N02(NPEE)); 7,16 (d, 1H, H-C(5)); 5,88+5,79 (2d, 1H, H-C(l')); 5,18 (m, HO-C(5')); 5,08 (m, 1H, HO-C(3')); 4,99+4,91 (2q, 1H, CH(NPEE)); 4,10-3,57 (m, 7H, H-C(2'), H-C(3'), H-C(4')/ CH2(5*), a-CH2 (NPEE) ) ; 2,92-2,83 (m, 2H, p~CH2 (NPEE)); 2,08 (s, 3H, CH3 (acetilo) ) ; 1,25+1,20 (2d, 3H, CH3 (NPEE)); 81 19.4 N4-Acetil-5'-Ο-(4,4’-dimetoxitrifenilmetil)-2'-0- [ 1- (4--nitrofeniletoxi)etil]-citidina

Coevapora-se 1,0 g (2,09 mmol) de N4-acetil-2’-O-[1-(4-nitrofeniletoxi) etil]-citidina por 3 x com 10 ml de piridina absoluta de cada vez, o resíduo é retomado em 40 ml de piridina absoluta, é misturada com 0,77 g (2,3 mmol), cloreto de 4,4'--dimetoxitrifenilmetilo e é agitado à temperatura ambiente de um dia para o outro. A mistura reaccional é em seguida diluída com 10 ml de metanol, agitada durante mais 30 minutos à temperatura ambiente, concentrada até à metade, retomada com diclorometano e agitada por duas vezes com 50 ml de água de cada vez. As fases aquosas são extraídas com diclorometano, reúnem-se todas as fases orgânicas, secam-se sobre sulfato de sódio, filtram-se, concentram-se em evaporador rotativo e o resíduo é por várias vezes coevaporado com tolueno. O óleo remanescente é purificado numa coluna de gel de sílica (3,2 x 23,0 cm), cromatografado com diclorometano (100 ml), 100:1 (200 ml), 98:1 (200 ml), 95:1 (480 ml), 90:1 (270 ml), 85:1 (250 ml), 80:1 (240 ml), 70:1 (140 ml) e após aplicação de 1200 ml de eluente obtém-se a primeira fracção do produto. As várias fracções do produto são reunidas e concentradas em evaporador rotativo. 0 produto é dissolvido em 2 ml de diclorometano, adicionam-se gota a gota 250 ml de éter dietílico, o precipitado formado é separado por filtração em filtro de vácuo e seco a 40 °C sob alto vácuo. Obtêm-se 1,29 g (1,65 mmol, 80 %) do composto sob a forma de um sólido incolor amorfo.

Ponto de fusão: 160°C CCF (gel de sílica) Rf = 0,48 (diclorometano / metanol 15:1)

Análise: C42H44N4O11 (780,83) calc. determ. C 64,60 64,85 H 5,67 6, 00 N 7, 17 6, Θ7 82 p U, ^ UV (metanol) Kà* [nm] (lg ε) : 204 (4,84); 236 (4,48); 274 (4,17), [296 (4,06)] 1H-RMN (250 MHz, d6-DMS0, ppm) : 10,90 (s, 1 H, NH); 8,34-8,24 (m, 1 H, H-C(6)); 8,09'(d, 2H-o-H a N02(NPEE)); 7,52-7,23 (m, 11H, m-H a N02(NPEE)); H(fenilo), m-H a OCH3) ; 6,98-6,95 (m, 1H, H-C{5)); 6,90-6, 87 (m- 4H, o-H a OCH3) ; 5,88+5,76 (2s, 1H, H-C(l')); 5,25-5.15 (m, 1H, HO-C(3')); 5,08+4,95 (2q, 1H, CH(NPEE)); 4,273,97 (m, 3H, H-C(2'), H-C(3'), H-C(4*)); 3,89-3,68 (m, 10 H, CH2(5'), a-CH2(NPEE), OCH3); 2,92 (m, 2H, β-Οί2 (NPEE) ) ; 2,08 (s, 3H, CH3 (acetilo) ) ; 1,29-1,22 (m, 3H, CH3(NPEE)) 20.1 N6-[2-(4-Nitrofenil)etoxicarbonil]-2'-O-[1-(4-nitro- feniletoxi)etil]3',5'-O-(1,1,3,3-tetraisopropil-dissiloxano-1,3-diil)-adenosina 0,5 g (0,711 mmol) de N6-[2-(4-nitrofenil)etoxicarbonil]-3',5'-O-(1,1, 3, 3-tetraisopropildissiloxano-l,3-diil) adenosina são dissolvidos em 9 ml de diclorometano absoluto, misturados com 9,56 mg (2,94 mol) de p-Ts0H*H2O e arrefecidos em banho de gelo a 0 °C. Em seguida adicionam-se 0,20 g (1,06 mmol) de éter 4-nitrofeniletilvinílico, agita-se a solução de reacção primeiro em banho de gelo, em seguida deixa-se aquecer até à temperatura ambiente e agita-se de um dia para o outro. Agita-se por 3 x com 50 ml de solução saturada de hidrogeno-carbonato de sódio de cada vez. As fases aquosas são extraídas com diclorometano, reúnem-se as várias fases orgânicas, secam--se sobre sulfato de sódio, filtram-se e concentram-se em evaporador rotativo.

Para purificar, aplica-se o produto em bruto numa coluna de gel de sílica (3,5 x 14,0 cm), cromatografa-se com tolueno (500 ml), tolueno / acetato de etilo 5:1 (300 ml), 4:1 (500 ml), 3:1 (800 ml), 2:1 (500 ml), após 1400 ml de eluente obtém--se a primeira fracção do produto, que em seguida é recolhida e concentrada em evaporador rotativo. O resíduo é coevaporado por 83

U várias vezes com diclorometano, até à formação de espuma. Obtêm-se, após secagem da espuma incolor a 40 °C sob alto vácuo, 0,412 g (0,46 mmol, 65 %) do produto desejado. CCF (gel de sílica) Rf = 0,39 (tolueno / acetato de etilo 1:1)

Análise: C4iH57N7012Si2 (896, 1 2) calc. C 54, 95 H 6,41 N 10,94 determ. 54,71 6,48 10,62 UV (metanol): Vá* [nm] (lg ε) : 203 (4,93); 267 (4,58); [276 (4,51)] 1H-RMN (250 MHz, d6-DMS0, ppm) : 8,69+8.61 (2s, 1H, H-C(8)); 8,30+8,22 (2s, 1H, H-C(2)); 8,21 (S, 1H, NH);8,15 (d, 2H, o-H a N02(NPE0C)); 8,05+7,99 (2d, 2H, o-H a N02(NPEE)); 7, 43-7, 29 (m, 4H, m-H a N02 (NPEOC e NPEE) ) ; 6,02+6,0 (2s, 1H, H-C(l')); 5,06+5,01 (2q, 1H, CH(NPEE)); 4,57-3,68 (m, 9H, H-C(2'), a-CH2 (NPEOC) , H-C (3'), a-CH2(NPEE), H- C(4'), CH2(5*)); 3,13 (t, 2H, β-ΟΗ2 (NPEOC) ) ; 2,98-2,90 (m, 2H, β-Οί2 (NPEE) ) ; 1,45 + 1 ,38 (2d, 3H, CH3(NPEE)); 1, 07-0, 84 (m, 28H, isopropilo) 20.2 N6-(2-(4-Nitrofenil)etoxicarbonil]-2'-O-((1-(4-nitro- feniletoxi)etil]adenosina 0,3 g (0,334 mmol) de N6-(2-(4-nitrofenil)etoxicarbonil]--3',5'-O-(1,1,3,3-tetraisopropildissiloxano-l,3-diil)-2'-O-(1--p-nitrofeniletoxi)etil]adenosina são dissolvidos em 1,0 ml de tetra-hidrofurano absoluto, são misturados com 0,26 g (0,836 mmol) de fluoreto de tetrabutilamónio x 3 H20 e 0,09 ml (1,67 mmol) de ácido acético glacial, sao ayiLados à temperatura ambiente durante 4 horas e em seguida são concentrados em evaporador rotativo.

Para purificar, carrega-se o resíduo numa coluna de gel de 84 rf- Lc —-λ. 4 ' sílica (3,0 x 12,0 cm), cromatografa-se com diclorometano (400 ml), diclorometano / metanol 95:1 (670 ml). 90:1 (360 ml), 85:1 (340 ml). 80:1 (240 ml), 75:1 (750 ml), 70:1 (700 ml), 65:1 (650 ml), 60:1 (610 ml) e após aplicação de 2200 ml de eluente obtém-se a primeira fraeção do produto. As várias fraeções do produto são reunidas e concentradas em evaporador rotativo e o resíduo é coevaporado por várias vezes com diclorometano aLé à formação de espuma. Após secagem da espuma incolor a 40 °C sob alto vácuo é possível isolar 0,201 g (0,307 mmol, 92 %) do composto. 0,5 + 0,57 (diclorometano / metanol CCF (gel de sílica) Rf 95:5)

Análise: C29H31N7O11 x 1/2 H20 (662,61) calc. C 52,56 H 4,86 N 14,79 determ. 52,41 4,98 14,52 UV (metanol): XmájJnm] (lg ε) : 212 (4,55); 267 (4, 54); (273 (4,40)] 1H-RMN (250 MHz, dg-DMSO, ppm) : 10, 65+10, 63 (2s, 1H, NH) ; 8,72 + 8,69 (2s, 1H, H-C(8)); 8,61 + 8,59 (2s, 1H, H-C (2) ) ; 8,13 (d, 2H, o-H a N02 (NPEOC)); 8,03 (d, 2H, o-H a NO2 (NPEE) ) ; 7,61 (d, 2H, m-H a N02 (NPEOC) ) ; 7, 24 + 7,23 (2d, 2H, m-H a NOz(NPEE)); 6,11 +6,08 (2s, 1H, H- C (1' ) ) ; 5,24 (m, 2H, HO-C(5'), HO-C(3')); 4,81-4,74 (m, 2H, CH(NPEE), H-C(2’)); 4,38 (t, 2H, a-CH2 (NPEOC)); 4,38-4, 26 (m, 1H, H-C(3')); 3,99 (m, 1H, H-C(4')); 3,72-3,42 (m, 4H, CHZ(5'), <X-CH2 (NPEE) ) ; -3,10 (t, 2H, β-ΟΗ2 (NPEOC) ) ; 2, 63-2, 49 (m, 2H, β- -CH2(NPE)); 1,18+1,10 (2d, 3H, CH3(NPEE)) 20.3 N5-[2-(4-Nitrofenil)etoxicarbonil]-2'-O-((1- (4-nitro- feniletoxi)etil]adenosina 0,5 g (0,711 mmol) de Ns-2- (4-nitrofenil)etoxicarbonil]- 85 t -3',5'-Ο- (1,1,3,3-tetraisopropildissiloxano-l, 3-diil)-adenosina são dissolvidos em 9 ml de diclorometano absoluto, misturados com 0,56 mg (2,94 mol) de p-Ts0H*H20 e arrefecidos em banho de gelo a 0 °C. A esta solução adicionam-se 0,20 g (1,06 mmol) de éter 4-nitrofeniletilvinílico, agita-se primeiro em banho de gelo, deixa-se a mistura reaccional aquecer lentamente até à temperatura ambiente e agita-se depois de um dia para o outro. Agita-se por 3 x com 50 ml de solução saturada de hidrogeno-carbonato de sódio de cada vez, extraem-se todas as fases aquosas com diclorometano, as fases orgânicas reunidas são secas sobre sulfato de sódio e concentradas em evaporador rotativo. 0 resíduo é dissolvido em 1,8 ml de tetra-hidrofurano absoluto, é misturado com 0,56 g (1,778 mmol) de fluoreto de tetrabutilamónio · 3 H20 e 0,2 ml (3,55 mmol) de ácido acético glacial, é agitado durante 4 horas à temperatura ambiente e em seguida concentra-se em evaporador rotativo.

Para purificação aplica-se o óleo resultante numa coluna de gel de sílica (3,0 x 10,9 cm), elui-se com diclorometano (500 ml), diclorometano / metanol 95:1 (485 ml), 80:1 (410 ml), 70:1 (710 ml), 65:1 (650 ml), após aplicação de 1450 ml de eluente, obtém-se a primeira fracção que contém o produto, reúnem-se todas as fracções do produto seguintes e concentra-se em evaporador rotativo. 0 resíduo é coevaporado por várias vezes com diclorometano até à formação de espuma e em seguida seca-se a 40 °C sob alto vácuo. Obtêm-se 0,31 g (0,474 mmol, 67 %) do produto desejado sob a forma de uma espuma incolor. CCF (gel de sílica) Rf= 0,5+0,57 (diclorometano / metanol 95:5) C29H3iN7On x 1/2 H20 (662, 61)

Os dados espectroscópicos são idênticos aos do Exemplo 20.2. 86 20.4 5' -Ο- (4,4' -Dimetoxitrifenilmetil) -Νδ- (2- (4-nitrofenil) - etoxicarbonil]-2'-Ο-[1—(4-nitrofeniletoxi)et i1]--adenosina 0,5 g (0,76 mmol) de N6-(2-(4-nitrofenil)etoxicarbonil]--2'-O-[1-(4-nitrofeniletoxi)etil]-adenosina são coevaporados por 3 x com 10 ml de piridina absoluta de cada vez, o resíduo é dissolvido em 30 ml de piridina absoluta, misturado com 0,36 g (1,07 mmol) de cloreto de dimetoxitrifenilmetilo e é agitado à temperatura ambiente de um dia para o outro. Em seguida é diluído com acetato de etilo e agitado por três vezes com 30 ml de solução saturada de hidrogenocarbonato de sódio de cada vez. As fases aquosas são extraídas com acetato de etilo, reunem-se todas as fases orgânicas, secam-se sobre sulfato de sódio, filtram-se, concentram-se em evaporador rotativo e o resíduo é por várias vezes coevaporado com tolueno. O produto em bruto é purificado numa coluna de gel de sílica (3,0 x 16,0 cm), eluido com tolueno (200 ml), tolueno / acetato de etilo 3:1 (400 ml), 2:1 (300 ml), 1:1 (400 ml), 1:2 (600 ml) e após 1100 ml de eluente obtém-se a primeira fracção do produto. As várias fracções do produto são reunidas e concentradas em evaporador rotativo. Dissolve-se o resíduo resultante em 3 ml de acetato de etilo, adicionam-se gota a gota 75 ml de n-hexano, separa-se por filtração em filtro de vácuo o precipitados formado e seca-se a 40 °C sob alto vácuo sobre aparas de parafina. Obtêm-se 0,7 g (0,73 mmol, 96 %) do produto, sob a forma de um sólido incolor amorfo. CCF (gel de sílica) Rf = 0,44 (tolueno / acetato de etilo / metanol 5:4:1)

Análise: C50H49N7O13 (955, 98) calc. determ C 62,82 62,28 H 5,16 5,26 N 10,25 10,23 UV (metanol) : λ^: [nm] (lg s) : 202 (5, 01); 23G (4,42); 267 87 (4,59); [275 (4,52)] XH-RMN (250 MHz, d6-DMSO, ppm) : 10,55 (s, 1H, NH); 8,55-8,49 (m, 2H, H-C(8), H-C(2)); 8,13 (d, 2H, o-H a N02 (NPEOC) ) ; 8,03-7,97 (m, 2H, o-H a N02(NPEE); 7,60 (d, 2H, m-H a N02 (NPEOC)); 7,37-7,20 (m, 11H, m-H a N02(NPEE), H(fenilo), m-H a 0CH3) ; 6, 48-6,78 (m, 4H, o-H a OCH3) ; 6,13-6,11 (m, 1H, H-C(l')); 5,28-5,26 (m, 1H, H0-C(3')); 4,94-4,87 (m, 1H, CH(NPEE)); 4,85-4,78 (m, 1H, HC(2')); 4,41-4,36 (m, 3H, a~ -CH2 (NPEOC), H-C(3')); 4,12-4,10 (m, 1H, H-C(4')); 3,70 (s, 6H, OCH3) ; 3,62-3,39 (m, 2H, CH2(5')); 3,10 (t, 2H, B~CH2 (NPEOC) ) ; 2,64-2,52 (m, 2H, B-CH2 (NPEE) ); 1,20+1,13 (2d, 3H, CH3(NPEE)) 21. 5'-O- (4, 4 '-Dimetoxitrifenilmetil) -N6- (2- (4-nitrofenil) - etoxicarbonil]-2'-O-[1-(4-nitrofeniletoxi)etil]— adenosina-3'-O-(N,N-diisopropil-2-cianoetil)--fosfitamida 0,4 g (0,46 mmol) de 5'0-(4,4'-dimetoxitrifenilmetil)-N5-- [2- (4-nitrofenil)etoxicarbonil]-2'-O-[1-(4-nitrofeniletoxi)-etil]-adenosina são introduzidos, juntamente com 21,8 mg (0,31 mmol) de ΙΗ-tetrazolo, num balão com azoto gasoso, são dissolvidos com 8 ml de acetonitrilo absoluto (análise do resíduo) e em seguida são misturados com 0,37 g (1,24 mmol) de bis(diisopropilamino)-(2-cianoetoxi)fosfano. A solução de reacção é agitada de um dia para o outro à temperatura ambiente sob atmosfera de gás inerte, é diluída com acetato de etilo e lavada por 3 x com 40 ml de solução de cloreto de sódio / hidrogenocarbonato de sódio. Todas as fases aquosas são extraídas com acetato de etilo e as fases orgânicas reunidas são secas sobre sulfato de sódio, filtradas e concentradas em evaporador rotativo. O produto em bruto é purificado numa coluna de gel de sílica (2,5 x 18,0 cm), cromatografado com tolueno / acetato de etilo 3:1 (400 ml), 2:1 (600 ml), após aplicação de 550 ml de eluente obtém-se a primeira fracçâo do produto, as quais são em 88

I \S ' seguida todas reunidas e concentradas em evaporador rotativo. Após coevaporação do resíduo com acetato dc ctilo e subsequente secagem da espuma incolor sob alto vácuo, obtêm-se 0,45 g (0,39 mmol, 85 %) do composto. CCF (gel de sílica): Rf = 0,14 + 0,23 (tolueno / acetato de etilo 1:1)

Análise: CsgHeeNgOiíP (1156,20) cale. C 61,29 H 5,75 N 10,90 determ. 60,61 6,01 10,76 UV (metanol): ^[nm] (lg ε) : 204 (4, 98); 236 (4,47); 266 (4,56); [276 (4,48)] ^-RMN (250 MHz, d6-DMS0, ppm) : 8,66-8,63 (m, 1H, H-C(8)); 8,21-7,98 (m, 6H, H-C(2), o-H a N02(NPE0C e NPEE) , NH) ; 7,46-7,11 (m, 13H, m-H a N02 (NPEE e NPEOC), H-fenil, m-H a 0CH3) ) ; 6, 83-6, 76 (m, 4H, o-H a OCH3) ) ; 6,21-6,11 (m, 1H, H-C (1')); 5, 23-5, 08 (m, 1H, H-C(2')); 4,98--4,73 (m, 1H, CH(NPEE)); 4,61-4,50 (m, 3H, a-CH2 (NPEOC) , H- —C(3')); 4,41-4,28 (m, 1H, H-C(4 *)); 3,93-3,16 (m, 8H, 0CH3, a--CH2 (NPEE)); 3, 76-3, 42 (m, 4H, P-0-CH2, CH2(5')); 3,45-3,27 (m, 2H, n-CH) ; 3,16 (t, 2H, 5-CH2 (NPEOC) ) ; 2,72-2,57 (m, 4H, 5-CH2- -CN) , CH2-CN) ; 1,35-1,15 (m, 15H, CH3(NPEE), C(CH3)2) 31P-RMN (161,70MHz, CDCl3, H3P04, ppm): 151,56; 150,98; 150,79; 150,53 22. 5'-0-(4,4'-Dimetoxitrifenilmetil)-N6-(2-(4-nitrofenil)- etoxicarbonil]2'-O-[1-(4-nitrofeniletoxi)etil]— adenosina-3'-O-(N,N-diisopropil-[2-(4-nitrofenil) etil)--fosfitamida 0,4 g (0,41 mmol) de 5'-O-(4,4'-dimetoxitrifenilmetil) -N6-- [2- (4-nitrofenil)etoxicarboni1]-O-[1-(4-nitrofeniletoxi) - 89 etil]-adenosina são introduzidos, juntamente com 19,78 mg (0,282 mmol) de ΙΗ-tetrazolo, num balão com azoto gasoso, são dissolvidos com 9 ml de acetonitrilo absoluto (análise do resíduo) e em seguida são misturados com 0,45 g (1,13 mmol) de bis(diisopropilamino)-2-(4-nitrofeniletoxi)fosfano. A solução de reacção é agitada de um dia para o outro à temperatura ambiente, sob atmosfera de gás inerte, é diluída com acetato de etilo e lavada por 3 x com 40 ml de solução de cloreto de sódio / hidrogenocarbonato de sódio de cada vez. Todas as fases aquosas são extraídas com acetato de etilo e as fases orgânicas reunidas são secas sobre sulfato de sódio, filtradas e concentradas em evaporador rotativo. O produto em bruto é purificado numa coluna de gel de sílica (82,5 x 18,0 cm), eluído com tolueno (100 ml), tolueno / aetato de etilo 5:1 (300 ml), 4:1 (300 ml), 3:1 (400 ml), 2:1 (300 ml) e após 700 ml de eluente obtém-se a primeira fracção do produto. As várias fracções contendo o produto são reunidas, o resíduo obtido é coevaporado por várias vezes com acetato de etilo e a espuma incolor resultante é seca sob alto vácuo. Podem-se isolar 0,431 (0,33 mmol, 80 %) do composto desejado. CCF (gel de sílica): Rf = 0,26 + 0, 30 (tolueno / acetato de etilo 1:1)

Análise: C64H70N9O16P (1252,29) calc. C 61,38 H 5,68 N 10,06 determ. 60,81 5,82 9,54 UV (metanol): λ^χ [nm] (lg ε) : 207 (5,23); [214 (5,09)]; 269 (4,70) 1H-RMN (250 MHz, CDCI3, TMS, ppm) : 8,66-8,60 (m, 1H, H-C(8)); 8,19-7,96 (m, (H, H-C(2), o-H a NOz (NPEOC, NPE e NPEE), NH); 7, 44-7,07 (m, 15H, m-H a N02 (NPEE e NPEOC) , H(fenilo), m-H a OCH3) ; 6,76+6,75 (2d, 4H, o-H a 0CH3) ; 6,25-6,08 (m, 1H, H-C(!'))/ 5,21-4,68 (m, 2H, H-C(2'), iF u y v CH(NPEE)); 4,54-4,42 (m, 3H, H-C(3'), <x-CH2 (NPEOC) ) ; 4,38-4,28 (m, 1H, H-C (4 ' ) ) ; 4,0-3,70 (m, 8H, a-CH2(NPEE), 0CH3) ; 3,60-3,40 (m, 4H, P-0-CH2 (5') ) ; 3,35-3,22 (m, 2H, N-CH) ; 3,14 (t, 2H, CH2 (NPEOC); 3, 05-2, 52 (m, 4H, B-CH2(NPEE), 5-CH2(NPE); 1,29-0,97 (m, 15H, CH3(NPEE), C(CH3)2) 31P-RMN (161,70 MIIz, CDCI3, H3PO4, ppm) : 150,58; 149,89; 149,32; 149,25 23.1 N6-Benzoíl-2'-O-(1-(4-nitrofeniletoxi]-3',51-O- -(1,1,3,3-tetraisopropildissiloxano-l, 3-diil)-adenosina 1,0 g (1,63 mmol) de N6-benzoil-3', 5’-Ο-(1,1,3,3-tetraisopropildissiloxano-l, 3-diil)-adenosina são dissolvidos em 16 ml de diclorometano absoluto, são misturados com 32,6 mg (0,17 mmol) de p-Ts0H*H20 0,46 g (2,4 mmol) de éter 4-nitrofeniletil-vinílico, são agitados durante 1 ½ horas à temperatura ambiente, são neutralizados com solução de metanolato de sódio 0,5 N / metanol e são concentrados em evaporador rotativo. 0 resíduo é recolhido em diclorometano e extraído por 3 x com 50 ml de solução de hidrogenocarbonato de sódio de cada vez. As várias fases aquosas são extraídas com diclorometano, as fases orgânicas reunidas são secas sobre sulfato de sódio, filtradas e concentradas em evaporador rotativo. 0 produto em bruto é purificado numa coluna de gel de sílica (83,5 x 16,0 cm), onde é cromatografada com tolueno (200 ml) tolueno / acetato de etilo 4:1 (400 ml), 3:1 (600 ml), 2:1 (500 ml) e, após aplicação de 500 ml de eluente obtém-se a primeira fracção do produto. As várias fracções que contêm o produto são reunidas, concentradas em evaporador rotativo e o resíduo é coevaporado por várias vezes com diclorometano até à formação de espuma. Após secagem da espuma levemente amarelada, a 40 °C, sob alto vácuo, obtêm-se 1,0 g (1,24 mmol, 76 %) do composto. CCF (gel de sílica): Rf = 0,40 (tolueno / acetato de etilo 1:1) 91 Γ

Análise: C39H54N609SÍ2 (807,07) N 10,41 10,26 calc. C 58,04 H 6,74 determ. 58,05 6,78 UV (metanol): λ,^χ [nm] (lg ε) : 276 (4,41) 1H-RMN (250 MHz, CDC13, TMS, ppm) : 9.01 (s, 1H, NH); 8,71 +8,63 (2s, 1H, H-C(8)); 8,27+8,20 (2s, 1H, H-C(2) ) ; 8,10-7,94 (m, 4H, o-H a N02(NPEE), o-H(benzoílo); 7,57-7,07 (m, 5H, m-H a N02(NPEE), m- e p-H(benzoilo) ) ; 6,01- -5,99 (2s, 1H, H-C(1 *)); 5,06-4,97 (m, 1H, CH(NPEE)); 4,60-4,49 (m, 1H, H-C(2')); 4,40-4,32 (m, 1H, H-C(3')); 4,233,64 (m, 5H, H-C (4 *) / CH2(5’), a-CH2 (NPEE) ) ; 2,97-2,86 (m, 2H, B-CH2 (NPEE) ) ; 1,41 +1,34 (2d, 3H, CH3(NPEE)); 1,02-0,88 (m, 28H, isopropilo) 23.2 N6-Benzoil-2'-O-(1-(4-nitrofeniletoxi)etil)-adenosina 2,0 g (3,25 mmol) de N6-benzoíl-3',5'-0-(l,l,3,3—tetraiso-propildissiloxano-1,3-diil)-adenosina são dissolvidos em diclorometano absoluto, são misturados com 5,6 mg (29,4 μηαοί) de p-Ts0H*H20 e são arrefecidos em banho de gelo a 0 °C. A esta solução adicionam-se 2,0 g (10,6 mmol) de éter 4-nitro-feniletilvinilico, agita-se em seguida em banho de gelo, deixa--se a mistura reaccional regressar lentamente à temperatura ambiente, neutraliza-se a mistura reaccional passada 1 horas com solução de metanolato de sódio 0,5 N / metanol e concentra--se em evaporador rotativo. O resíduo é retomado com diclorometano e é agitado por 3 x com 60 ml de solução saturada de hidrogenocarbonato de sódio. Todas as fases aquosas são extraídas com diclorometano, as fases orgânicas reunidas são secas sobre sulfato de sódio e concentradas em evaporador rotativo. O resíduo é dissolvido eiu 8,0 ml de tetra-hidrofurano absoluto, misturado com 2,46 g (7,82 mmol) de fluoreto de tetrabutilamónio · 3 H20, agitado durante 30 minutos à temperatura ambiente e em seguida é centrfugado. 92 A purificação é realizada carregando o óleo resultante numa coluna de gel de silica (83,0 x 17,0 r.m) e eluindo cora diclorometano (200 ml), diclorometano / metanol 50:1 (200 ml), 45:1 (370 ml), 40:1 (140 ml), 35:1 (180 ml). Após aplicação de 550 ml de eluente obtém-se a primeira fracção que contém o produto, reunem-se todas as fracções do produto subsequentes e concentra-se em evaporador rotativo, o resíduo é dissolvido em 2 ml de diclorometano, adicionam-se gota a gota 250 ml de éter dietilico, o precipitado incolor formado é separado por filtração em filtro de vácuo e seco em seguida a 40 °C sob alto vácuo. Obtêm-se 1,26 g (2,23 mmol, 68 %) do produto desejado sob a forma de um sólido amorfo incolor.

Ponto de fusão: 170 °C CCF (gel de silica): Rf = 0,54 + 0,60 (diclorometano / metanol 9:1 )

Análise: C27H28N6O0 (653, 61) calc. C 57,44 H 4,99 N 14,88 determ. 57,06 5,26 14,62 UV (metanol): λπ,4χ[ηια] (lg ε) : 277 (4,44); 1H-RMM (250 MHz, d6-DMSO, ppm) : 11,23 (s, 1H, NH); 8,75+8,74 (2s, 1H, H-C(8)); 8,72+8,71 (2s, 1H, H-C(2)); 8,08-8,01 (m, 4H, o-H a N02(NPEE), o-H(benzoilo)); 7,64-7,51 (m, 3H, m- e p-H(benzoilo)); 7,31-7,28 (2d, 2H, m-H a N02(NPEE), 6,15 (d, 1H, H-C(l')); 6,15 (d, 1H, H-C(l')); 5,37- -5,13 (m, 2H, HO-C(5'), H0-C(3')); 4,934,72 (m, 2H, CH(NPEE), H-C (2')); 4,35-4,17 (m, 1H, H-(3')); 4,0 (m, 1H, H-C(4')); 3, 79-3, 40 (m, 4H, CH2(5'), u-CH2 (NPEE) ) ; 2, 68-2,60 (m, 2H, β- -CH2 (NPEE) ) ; 1,18 + 1,134 (2d, 3H, CH3(NPEE)) 93 ί__ 23.3 N6-Benzoíl-5'-Ο-(4,4'-dimetoxitrifenilmetil)-2'-0-(1- -4'-nitrofenilctoxi)etil-adenosina 0,9 g (1,59 mmol) de N6-benzoíl-2'-0-[1-(4-nitro-feniletoxi) etil]-adenosina são coevaporados por 3 x com 10 ml de piridina absoluta de cada vez, o resíduo é dissolvido em 40 ml de piridina absoluta, misturado com 0,59 g (1,75 mmol) de cloreto de 4,4'-dimetoxitrifenilmetilo e agita-se a solução de reacção à temperatura ambiente de um dia para o outro. Em seguida adicionam-se 10 ml de metanol, agita-se durante mais 30 minutos à temperatura ambiente, concentra-se até metade do volume, retoma-se com diclorometano e agita-se por 2 x com 50 ml de água de cada vez. A fase aquosa é extraída com diclorometano, todas as fases orgânicas são reunidas, secas sobre sulfato de sódio, filtradas, concentradas em evaporador rotativo e o resíduo é coevaporado por várias vezes com tolueno. A purificação é realizada carregando o óleo resultante numa coluna de gel de sílica (3,2 x 17,0 cm), eluindo com tolueno (100 ml) e tolueno / acetato de etilo 2:1 (600 ml), 1:1 (300 ml), 1:2 (900 ml), 1:3 (400 ml). Após aplicação de 1100 ml de eluente obtém-se a primeira fracção que contém o produto, todas as fracções são reunidas e concentradas em evaporador rotativo. 0 resíduo é dissolvido em 2 ml de diclorometano, adicionam-se gota a gota 200 ml de éter dietílico, o precipitado é separado por filtração em filtro de vácuo e seco em seguida a 40 °C sob alto vácuo. Obtêm-se 1,1 g (1,27 mmol, 80 %) do produto desejado sob a forma de um sólido amorfo, incolor.

Ponto de fusão: 120°C CCF (gel de sílica): Rf = 0,63 (diclorometano / metanol 15:1)

Análise: C^eH^oNeOio (866, 93) caie. C 66,50 H 5,34 N 9,69 94 determ. 65, 82 5,21 9,77 UV (metanol): λ^χ [nm] (lg ε) : 203 (4,91); 233 (4,49); 276 (4,45) 1H-RMN (250 MHz, d6-DMSO, ppm) : 11,25 (s, 1H, NH); 8,65-8,61 (m, 2H, H-C(2)); 8,07-8,02 (m, 4H, o-H a N02(NPEE), o-H(benzoilo) ; 7,64-7,51 (m, 3H, m- e p- -H(benzoílo) ) ; 7,36-7,15 (m, 11H, m-H a OCH3, H(fenilo), m-H a N02(NPEE), 6,84-6,81 (m, 4H, o-h a 0CH3) ) ; 6,17-6,16 (m, 1H, H- -C (1') ) ; 5,35-5,33 (m, 1H, HO- -C(3')); 5,054,91 (m, 1H, CH(NPEE)); 4,87-4,83 (m, 1H, H-C i (2')); 4,48-4,31 (m, 1H, H- -C (3') ) ; 4,13 (m, 1H, H-C(4')); 3,70-3,48 (m, 10H, OCH3, CH2(5'), a-CH2 (NPEE)) ; 2, 70-2,61 (m, 2H, B-CH2(NPEE) ) ; 1,25 + 1,13 (2d, 3H, CH3(NPEE)) 24 . N6-Benzoíl-5'-O- (4,4'-dimetoxitrifenilmetil)-2'-O-[1--(4-nitrofeniletoxi)etil]-adenosina-3'-O-(N,N-diiso-propil-2-cianoetil)-fosfitamida

Num balão cheio de azoto gasoso pesam-se 1,0 g (1,5 nimol) de N®-benzoil-5'-0-(4,4'-dimetoxitrifenilmetil)-2'-O-[1— (4— -nitrofeniletoxi)etil-adenosina, 54,64 mg (0,78 mmol) de 1H--tetrazolo, dissolvem-se os reagentes em 20 ml de diclorometano isento de ácido, mistura-se com 0,83 g (3,11 mmol) de bis-(diisopropilamino)-(2-cianoetoxi)fosfano e agita-se a solução de reacção sob atmosfera de azoto gasoso de um dia para o outro. Dilui-se em seguida com diclorometano, agita-se por 3 x com 50 ml de solução de cloreto de sódio / hidrogenocarbonato de sódio, extraiem-se as fases aquosas com diclorometano, reunem-se as várias fases orgânicas, secam-se sobre sulfato de sódio, filtram-se e concentram-se em evaporador rotativo. A purificação é realizada carregando o produto em bruto numa coluna de gel de sílica (3,0 x 15,0 cm) e eluindo com tolueno (200 ml), tolueno / acetato de etilo 3:1 (400 ml), 2:1 (600 ml) . Após aplicação de 550 ml de eluente obtém-se a 95 ! r\

\f V primeira fracção que contém o produto, sendo as fracções seguintes reunidas e concentradas em evaporador rotativo. 0 resíduo resultante é coevaporado com diclorometano por várias vezes até à formação de espuma. Após secagem da espuma incolor sob alto vácuo isolam-se 1,07 g (1,0 mmol, 87 %) do produto desejado. CCF (gel de sílica): Rf = 0,54 +0, 66 (tolueno / acetato de etilo 1:3)

Análise: C57H63N8O11P (1067,15) calc. C 64,15 H 5,95 N 10,50 determ. 64,52 6,27 9, 96 UV (metanol): ^máx [nm] (lg ε) : 204 (4,93; 233 (4,52); 276 (4,46) XH-RMN (250 MHz, CDC13, TMS, ppm) : 9,10 (s, 1H, NH) : 8,70-8, 68 (m, 1H, H-C(8)); 8,28-8,21 (m, 1H, H-C (2)); 8, 047, 99 8m, 4H, o-H a N02 (NPEE), o-H(benzoílo); 7,62--7,16 (m, 14H, H(-fenilo), m- e p-H(benzoílo), m-H a N02(NPEE), m-H a O-CH3) ) ; 6, 83-6, 67 (m, 4H, o-H a 0-CH3) ) ; 6,23-6,1 1 (m, 1H, H-C(1')); 5,39-5,1 1 (m, 1H, H-C(2')); 4,98-4,72 (m, 1H, CH(NPE)); 4,3-4,53 (m, 1H, H-C(4')); 3,93-3,82 (m, 2H, a--CH2(NPEE)); 3, 77 + 3, 76 (2s, 6H, 0-CH3) ; 3,68-3,21 (m, 6H, P-O- -CH2, CH2 (5' ) , N-CH) ; 2,70-2, 62 (m, 4H, CH2-CN, J5-CH2 (NPEE) ) ; 1,38-1,02 (m, 15H, CH3(NPEE), C(CH3)2) 31P-RMN (161,70MHz, CDC13, H3PO4, ppm): 151,60; 151,05; 150,87; 150,54 25.1 N2-(2-(4-Nitrofenil)etoxicarbonil)-Oc-[2-(4-nitrofenil)- etil]-2'-O-[1-(4-nitrofeniletoxi)etil]-3',5'-O--(1,1,3,3-tetraisopropildissíloxano-l,3-diil)-guanosina 0,5 g (0,575 mmol) Nz-(2-(4-nitrofenil)etoxicarbonil]-06- 96

-[2-(4-nitrofenil)etil]-3',5'-0-(1,1,3,3-tetraisopropil-dissiloxano-1,3 diil)-guanosina são dissolvidos em 7 ml de diclorometano absoluto, misturados com 0,6 mg (7,1 μιαοί) de p-TsOH·H20 e arrefece-se a 0 °C em banho de gelo. Em seguida adicionam-se 0,22 g (1,15 mmol) de éter 4-nitrofeniletil-vinílico, agita-se primeiro em banho de gelo, passadas 2 horas deixa-se a solução de reacção aquecer lentamente e agita-se em seguida à temperatura ambiente de um dia para o outro. Dilui-se com diclorometano, agita-se por 3 x com 40 ml de solução saturada de hidrogenocarbonato de sódio de cada vez, extraiem--se as fases aquosas com diclorometano e reunem-se todas as fases orgânicas, secam-se sobre sulfato de sódio e concentram--se em evaporador rotativo. 0 resíduo oleoso é purificado numa coluna de gel de sílica (3,0 x 11,0 cm), cromatografado com tolueno (500 ml), tolueno / acetato de etilo 20:1 (630 ml), 15:1 (320 ml), 10:1 (440 ml), 5:1 (360 ml), 4:1 (350 ml) e após aplicação de 1900 ml de eluente obtém-se a primeira fracção do produto, reunem-se todas as fracções que contêm o produto e concentra-se em evaporador rotativo. Obtém-se uma espuma incolor por meio de várias coevaporações do resíduo oleoso com diclorometano. Após secagem da espuma a 40 °C sob alto vácuo, isolam-se 0,55 g (0,518 mmol, 90 %) do produto desejado. CCF (gel de sílica): Rf = 0,53 (tolueno / acetato de etilo 1:1)

Análise: C49H64N8O15SÍ2 (1061,27) N 10,55 9,83 calc. C 55,45 H 6,07 determ. 55,91 6,39 ^-RMN (250 MHz, d6-WSO, ppm) : 10,31 + 10,30 (2s, 1H, NH) ; 8,20-8,10 (m, 5H, H-C(8), o-H a N02(NPE e NPEOC)); 7,93+7,74 (2d, 2H, o-H a N02(NPEE), 7,64-7,56 (m, 4H, m-H a N02 (NPE e NPEOC); 7,37+7,23 (2d, 2H, m-H a NOz(NPEE), 5,91 +5,88 (2d, 1H, H-C(l')); 5,04+4,93 (2q, 1H, 97 Γ u CH(NPEE); 4,76-4,41 (m, 4H, a-CH2 (NPEOC), H-C(2·), H-C(3')); 4,34 (m, 2H, OC CII2 (NPE) ) ; 4,18-3,53 (m, 5H, H-C(4'), a- -CH2(NPEE), CH2(5')); 3,28 (t, 2H, fi-CH2 (NPEOC) ) ; 3,07 (m, 2H, fi-CH2(NPE)); 2, 82+2,72 (2t, 2H, B-CH2 (NPEE) ) ; 1,29+1,25 (2d, 3H, CH3(NPEE)); 0,99-0,83 (m, 28 H, isopropilo) 25.2 N2-(2-(4-Nitrofenil)etoxicarbonil)-Os-[2~(4-nitrofenll)- etil]-2'-O-[1-(4-nitrofeniletoxi)etil]-guanosina 0,4 g (0,46 itimol) de N2-(2-(4-nitrofenil)etoxicarbonil)--O6-[2-(4-nitrofenil)etil]-2'-O-[1-(4-nitrofeniletoxi)etil]--3', 5'-O-(1,1,3,3-tetraisopropildissiloxano-l,3-diil)-guanosina são dissolvidos em 2,0 ml de tetra-hidrofurano absoluto, são misturados com 0,35 g (1,10 mmol) de fluoreto de tetra-butilamónio · 3 H20, 0,12 ml (2,21 mmol) de ácido acético glacial, são agitados à temperatura ambiente durante 5 horas e em seguida são concentrados em evaporador rotativo. A purificação é realizada carregando o produto em bruto numa coluna de gel de sílica (2,5 x 14,0 cm) e eluindo com diclorometano (300 ml) e diclorometano / metanol 100:1 (400 ml), 80:1 (4000 ml), 70:1 (350 ml). Após aplicação de 800 ml de eluente obteve-se a primeira fracção que contém o produto, reuniram-se todas as fracções do produto e concentrou-se em evaporador rotativo. 0 resíduo obtido é coevaporado por várias vezes com diclorometano até à formação de espuma, seca-se a espuma incolor a 40 °C sob alto vácuo e isolam-se 0,288 g (0,351 mmol, 95 %) do composto. CCF (gel de sílica): Rf = 0,25+0,3 (diclorometano / metanol 95:5)

Análise: C37H38N8O14 (818,76) calc. C 54, 27 H 4, 67 N 13, 68 determ. 54,25 5,16 13,26 UV (metanol) : 7w,áx[nm] (lg 202 (4,60); 215 (4,GO); 268 b) : 98 Γ ϊ (4,60) 1H-RMN (250 MHz, dg-DMSO, ppm) : 10,53+10,34 (2s, 1H, NH); 8,48+8,43 (2s, 1H, H-C(8)); 8,15-8,10 (m, 4H, o-H a N02 (NPE and NPEOC) ) ; 8,0-7,92 (2d, 2H, o-H a N02(NPEE), 7, 627,57 (m, 4H, m-H a N02 (NPE e NPEOC) ) ; 7,23+7,19 (2d, 2H, m-H a N02(NPEE), 6, 0 + 5,97 (2d, 1H, H-C(l')); 5,23 + 5,18 (2d, 1H, H0-C{3')); 5,07-5,00 (m, 1H, HO-C(5')); 4,78-4,60 (m, 4H, a-CH2 (NPEOC) , H-C(2'), CH(NPEE)); 4,36 (t, 2H, a- -CH2 (NPE) ) ; 4,28-4,18 (m, 1H, H-C(4')); 3,72-3,49 (m, 4H, CH2 (5 ’ ) , Q-CH2 (NPEE) ) ; 3, 36-3,26 (m, 2H, li-CH2 (NPEOC) ) ; 3,09 (t, 2H, â-CHz (NPE) ) ; 2, 66-2, 52 (m, 2H, B-CH2 (NPEE) ) ; 1,17+1,11 (2d, 3H, CH3(NPEE)) 25.3 N2- [2- (4-Nitrofenil) etoxicarbonil) -O6- [2- (4-nitrofenil) - etil]-2'-O-[1-(4-nitrofeniletoxi)etil]-guanosina 2,0 g (2,3 mmol) de N2-(2-(4-nitrofenil)etoxicarbonil]-O6--[2-(4-nitrofenil)etil]-3', 5'-O-(1,1,3,3-tetraisopropildis-siloxano-1,3-diil)-guanosina são dissolvidos e 25 ml de diclorometano absoluto, misturados com 2,8 mg (14,22 μτηοΐ) de p-TsOH*H20 e arrefece-se a 0 °C em banho de gelo. A esta solução adicionam-se 0,99 g (4,6 mmol) de éter 4-nitrofenil-vinílico, agita-se primeiro em banho de gelo, passadas 2 horaas deixa—se regressar lentamente à temperatura ambiente e agita-se em seguida de um dia para o outro. A solução de reacção é diluída com diclorometano e lavada por 3 x com 50 ml de solução saturada de hidrogenocarbonato de sódio de cada vez. Todas as fases aquosas são extraídas com diclorometano, as fases orgânicas reunidas são secas sobre sulfato de sódio, filtradas e concentradas em evaporador rotativo. O óleo resultante é dissolvido em 6,0 ml de tetra-hidrofurano absoluto, misturado com 1,67 g (5,3 mmol) de fluoreto de tetrabutilamónio · 3 H20 e 0,6 ml (0,01 mmol) de ácido acético glacial, agita-se durante 5 horas à temperatura ambiente e em seguida concentra-se em evaporador rotativo. 99 r ~ L~l ^ Ο produto em bruto é purificado numa coluna de gel de Silica (3,0 x 13,0 cm) e é eluido com diclorometann (400 ml) diclorometano / metanol 100:1 (500 ml), 90:1 (360 ml), 80:1 (800 ml), 70:1 (350 ml) e após aplicação de 1100 ml de eluente obtém-se a primeira fracção do produto. Todas as fracções seguintes que contêm o produto são reunidas, concentradas em evaporador rotativo e o resíduo é coevaporado por várias vez.es com diclorometano até à formação de espuma. Após secagem da espuma incolor a 40 °C, sob alto vácuo, obtêm-se 1,75 g (1,664 mmol, 93 %) do produto desejado. CCF (gel de sílica): Rf = 0,25 + 0,3 (diclorometano / metanol 95:5) C37H38N8O14 (818,76)

Os dados espectroscópicos são idênticos aos do Exemplo 25.2. 25.4 5'-O-(4,4’-Dimetoxitrifenilmetil)-N2- [2-(4-nitrofenil)- etoxicarbonil]-O6-[2-(4-nitrofenil)etil]-2'-O-[1— (4 — -nitrofeniletoxi)etil]-guanosina 1,8 g (2,19 mmol) de N2-[2-(4-nitrofenil)etoxicarbonil]--O6-[2-(4-nitrofenil)etil]-2'-O-[1-(4-nitrofeniletoxi)etil]--guanosina são coevaporados por 3 x com 10 ml de piridina absoluta de cada vez, o resíduo é retomado em 35 ml dde piridina absoluta, misturada com 0,96 g (2,85 mmol) de cloreto de 4, 4' -dimetoxitrifenilmetilo e agita-se de um dia para o outro à temperatura ambiente. Em seguida dilui-se a mistura reaccional com acetato de etilo, lava-se por 3 x com 50 ml de solução saturada de hidogenocarbonato de sódio de cada vez, extraiem-se as fases aquosas com acetato de etilo, reunem-se várias fases orgânicas, secam-se sobre sulfato de sódio, filtram-se, concentram-se em evaporador rotativo e o resíduo é coevaporado por várias vezes com tolueno. 100 r i vi A purificação é realizada carregando o produto em bruto numa coluna de gel de sílica (3,0 x 14,0 cm) e eluindo com tolueno (200 ml) e tolueno / acetato de etilo 5:1 (300 ml), 4:1 (750 ml), 3:1 (800 ml), 2:1 (1200 ml). Após aplicação de 1300 ml de eluente obtém-se a primeira fracção do produto que é em seguida purificada e concentrada em evaporador rotativo. 0 resíduo é dissolvido em 5 ml de dicloruiuetano, adicionam-se gota a gota 200 ml de n-hexano, o precipitado formado é separado por filtração em filtro de vácuo e seco em seguida a 40 °C sob alto vácuo sobre aparas de parafina e isolam por fim 2,36 g (2,1 mmol, 96 %) do composto sob a forma de um sólido incolor, amorfo. CCF (gel de sílica): Rf = 0,6 (tolueno / acetato de etilo, metanol 5:4:1)

Análise: CeB^eNsOie (1121,13) calc. C 62,13 determ. 61,61

H 5,03 5, 03 N 9,99 10,18 UV (metanol): [nm] (lg ε): 201 (5,01); (214 (4,77)]; 236 (4,49); 268 (4,65) 1H-RMN (250 MHz, ds-DMS0, ppm) : 10,33 (2s, 1H, NH); 8,31 (s, 1H, H-C(8)); 8,1 5-8,11 (m, 4H, o--H a N02(NPE0C e NPE) ) ; 7, 98 + 7, 92 (2d, 2H a NOz(NPEE)); 7,64--7,55 (m, 4H, m-H a N02 (NPEOC e NPE)); 7,33-7,15 (m, 1H, m-H a N02(NPEE), H(fenilo), m-H a OCH3) ; 6, 80-6, 70 (m, 4H, o-H a 0CH3) ; 6,02 (m, 1H, H-C(l')); 5,20 (d, 1H, HO-C(3')); 4,84-4,70 (m, 4H, H-C (2' ) , CH(NPEE), a-CH2 (NPEOC) ) ; 4,84-4,30 (m, 3H, H--C (3'), a-CH2 (NPE) ) ; 4,01 (m, 1H, H-C(4')); 3, 688-t- -3,685+3, 000 + 3,673 (4s, 6H, OCH3) ; 3, 66-3,26 (m, 4H, CHZ (5' ) , a--CH2 (NPEE) ) ; 3,34-3,19 (m, 2H, fl-CH2 (NPEOC) ) ; 3,07 (t, 2H, (3--CH2(NPE) ); 2, 71-2, 50 (m, 2H, 5-CH2(NPEE)); 1,19 + 1,14 (2d, 3H, CH3 (NPEE) ) 101 (Γ“ U ι 26. 26 5'-Ο- (4, 4'-Dimetoxitrifenilmetil) -Ν2- [2- (4-nitro- fenil) etoxicarbonil] -O6- [2- (4-nitrofeni1 )et i1]-2' -0- [ 1--(4-nitrofeniletoxi)etil]-guanosina-3'-0-(N,N~diiso-propil-2-cianoetil)-fosfitamida

Num balão cheio com azoto gasoso colocam-se 0,4 g (0,35 mmol) de 51-0-(4,4 1-dimetoxitrifenilmetil)-N2-[2-(4—niti.u- fenil) etoxicarbonil] -O6- [2- (4-nitrofenil) etil] -2' -0- [ 1— C4— -nitrofeniletoxi)etil]-guanosina e 15,0 mg (0,21 mmol) de H-tetrazolo, dissolvem-se os reagentes em 8 ml de acetonitrilo absoluto (análise do resíduo), adicionam-se 0,25 g (0,85 mmol) de bis(diisopropilamino)(2-cianoetoxi)fosfano e agita-se a mistura reaccional sob atmosfera de gás inerte de um dia para o outro à temperatura ambiente. Em seguida dilui-se com acetato de etilo e lava-se por 3 x com 40 ml de solução de cloreto de sódio / hidrogenocarbonato de sódio de cada vez. As fases aquosas são extraídas com acetato de etilo, as várias fases orgânicas são secas sobre sulfato de sódio, filtradas e concentradas em evaporador rotativo.

Para proceder à purificação carrega-se o produto em bruto numa coluna de gel de silica (2,5 x 21,0 cm) e elui-se com tolueno (100 ml) e tolueno / acetato de etilo 4:1 (125 ml), 3:1 (400 ml), 2:1 (150 ml), 1:1 (100 ml), obtendo-se após aplicação de 350 ml de eluente a primeira fracção do produto, sendo em seguida todas reunidas e concentradas em evaporador rotativo. Após coevaporação do resíduo com acetato de etilo e secagem da espuma incolor sob alto vácuo, obtêm-se 0,34 g (0,25 mmol, 75 %) de guanosina-fosfitamida. CCF (gel de sílica): Rf = 0,43 + 0,52 (tolueno / acetato de etilo 1:1)

Analise: C67ÍÍ73NioOi7P (1321,35) calc. C 60, 90 H 5,56 N 10,60 determ. 60,85 5,74 10,18 102 Γ ^ —t UV (metanol): λmáχ[ran] (lg ε) : 203 (50,5); (214 (4,85)1; 236 (4,51); 2 60 (4, 63) 1H-RMN (250 ΜΗζ., CDCl3, TMS, ppm) : 8,14-7,96 (m, 7Η, H-C(8), o-H a N02 (NPE, NPEOC e NPEE)); 7,52--7,08 (m, 15H, m-H a N02(NPE, NPEOC and NPEE), m-H a OCH3, H (fenilo) ) ; 6, 75+6, 74 (2d, 4H, o-H a 0CH3) ) ; 6,13-5,98 ( (η, 1H, H-C (1')) ; 5,28-5, 08 (m, 1H, CH(NPEE)); 4,91-4,69 (m, 3H, H--C(2'), a-CH2 (NPEOC)); 4, 58-4, 43 (m, 1H, H-C (3 T)); 4,41-4,19 (m, 3H, H-C (4' ) , a-CH2 (NPEE) ) ; 4,08-3,53 (m, 2H, P-0-CH2) ; 3, 738 +3, 73 (2s, 6H, 0CH3) ; 3, 68-3, 46 (m, 4H, CHZ(5'), N-CH) ; 3,35-3,25 (m, 4H, a-CH2(NPE), 5-CH2 (NPEOC)); 3,08-2, 98 (m, 2H, 5-CH2 (NPE)) ; 2,75-2,58 (m, 4H, CH2-CN, S-CH2 (NPEE)); 1,34-0,96 (m, 15H, CH3(NPEE), C(CH3)2) 31P-RMN (161-70 MHz, CDC13, H3P04, ppm) 151,58; 151,02; 150,82; 150,48 27. 5'-O-(4,4'-Dimetoxitrifenilmetil)-2’-O-[1-(4-nitro- feniletoxi)etil]-3'-O-succinoil-uridina 221,92 mg (0,3 mmol) de 5'-O-(4,4'-dimetoxitrifenilmetil)--2'-O-[1-(4-nitrofeniletoxí)etil]-uridina são coevaporados por 2 x com 5 ml de piridina absoluta de cada vez. O resíduo é dissolvido em 7 ml de diclorometano absoluto, é misturado com 48, 86 mg (0,4 mmol) de 4-dimetilaminopiridina, 40,07 mg (0,4 mmol) de anidrido de ácido succínico e agitado de um dia para o outro à temperatura ambiente. Em seguida dilui-se a solução de reacção com diclorometano, agita-se por 2 x com 25 ml de solução saturada de hidrogenocarbonato de sódio, 3 x com 25 ml de solução de ácido cítrico a 10 % e 5 x com 30 ml de água de cada vez. Extraiem-se as fases aquosas com diclorometano e ao várias fases orgânicas são secas sobre sulfato de sódio, filtradas e concentradas em evaporador rotativo. 0 produto em bruto é purificado numa coluna de gel de 103 sílica (3,0 x 6,0 cm), é eluido com diclorometano (200 ml) e diclorometano / metanol 100:1 (200 ml), 90:1 (450 ml), 80:1 (800 ml), 70:1 (560 ml), 60:1 (300 ml), 50:1 (300 ml)e após aplicação de 1000 ml de eluente obtém-se a primeira fracção do produto. Todas as fracções que contêm o produto são reunidas e concentradas em evaporador rotativo. 0 resíduo oleoso é coevaporado por várias vezes com acetato de etilo até à formação de espuma e em seguida é seco a 40 °C sob alto vácuo. É possível isolar 0,184 g (0,219 mmol, 73 %) do produto desejado, sob a forma de uma espuma levemente amarelada. CCF (gel de sílica): Rf = 0,54 (diclorometano / metanol 9:1)

Análise: C44H45N3O14 (839, 86) calc. C 62,92 H 5,40 N 5,00 determ. 62,21 5,22 5,62 UV (metanol): \máx[nm] (Ig ε) : 202 (4,87); 233 (4,36); 266 (4,28) 1H-RMN (250 MHz, d6-DMSO, ppm) : 11,49 (s, 1H, NH); 8,11-8,08 (m, 2H, o-H a NOz(NPEE), 7,72-7,66 (m, 1H, H-C(6)); 7,45-7,20 (m, 11H, m-H a N02(NPEE), H(fenilo), m-H a OCH3)); 6,87 (d, 4H, o-H a OCH3) ) ; 5,87-5,84 (m, 1H, H--C (1')); 5,48-5,42 (m, 1H, H-C(5)); 5,27-5,23 (m, 1H, H-C <3')); 4,82-4,73 (m, 1H, CH(NPEE)); 4,58-4,53 (m, 1H, H-C(2’)); 4,14--4,12 (m, 1H, H-C (4 ' ) ) ; 3,71 (s, 6H, 0CH3) ; 3, 69-3,25 (m, 4H, 0C-CH2 (NPEE) , CH2(5')); 2,88-2,81 (m, 2H, . B-CH2 (NPEE) ) ; 2,50- -2,48 (m, 4H, CH2 (succinato)); 1,19+1,13 (2d, 3H, CH3(NPEE)) 28 . 5' -O- (4,4' -Dimetoxitrifenil) -N4- [2- (4-nitrofenil) etoxi- carbonil]-2'-0[1-(4-nitrofeniletoxl)etil)-3'-o--succinoíl-citidina

Coevaporam-se 279,6 mg (0,3 mmol) de 5'-O-(4,4'-dimetoxi-trifenilmetil)-N4-(2-(4-nitrofenil)etoxicarbonil]-20-[1- (4- 104

V

-nitrofeniletoxi) etil) -citidina por 2 x com 5 ml de piridina absoluta de cada vez, o resíduo é retomado em 7 ml de dicloro-metano absoluto, misturado com 48,86 mg (0,4 mmol) de 4-dimetilaminopíridina e 40,07 mg (0,4 mmol) de anidrido de ácido succínico e a solução de reacção é agitada de um dia para o outro à temperatura ambiente. Em seguida dilui-se com diclorometano, lava-se sucessivamente 2 x com 30 ml de solução saturada de hidrogenocarbonato de sódio, 3 x com 30 ml de solução de ácido cítrico a 10 %, 1 x com 30 ml de solução saturada de hidrogenocarbonato de sódio e 1 x com 30 ml de água. As fases aquosas são extraídas com diclorometano, as várias fases orgânicas são secas sobre sulfato de sódio, filtradas e concentradas em evaporador rotativo. O produto em bruto é carregado para purificação numa coluna de gel de sílica (3,0 x 8,0 cm), é cromatografado com diclorometano / metanol 100:1 (300 ml), 90:1 (570 ml), 85:1 (250 ml), 80:1 (240 ml), 70:1 (280 ml), 60:1 (540 ml), 50:1 (600 ml) e após aplicação de 2000 ml de eluente obtém-se a primeira fraeção do produto. As várias fraeções que contêm o produto são purificadas e concentradas em evaporador rotativo. O resíduo é coevaporado por várias vezes com acetato de etilo até à formação de espuma e em seguida é seco a 40 °C sob alto vácuo. São isolados 0,288 g (0,28 mmol, 93 %) do produto sob a forma de uma espuma levemente amarelada. CCF (gel de sílica): Rf = 0,63 (diclorometano / metanol 9:1)

Análise: C53H55N5O18 x H20 (1050, 04) calc. C 60, 62 H 5,27 N 6,66 determ. 60,89 5,59 6,19 UV (metanol): (4,42)

Xxtóxínm] (lg ε) : 202 (4,99); 236 (4, 56); 274 105 Γ L*sj 1H-RMN (250 MHz, d6-DMSO, ppm) : 10,90 (S, 1H, NH); 8,20-8,02 (m, 5H, H-C(6), o-H a N02 (NPEOC e NPEE) ) 7,58-7,21 (m, 13H, m-H a N02 (NPEE e NPEOC), H(fenilo), m-H a OCH3) 6,83-6,78 (m, 5H, H-C(5), o-H a 0CH3) ; 5,90 (m, 1H, H-C(l')); 5,22 (m, 1H, H-C(3')); 4,97-4,73 (m, 1H, CH(NPEE)); 4,50-4,35 (m, 3H, a-CH2 (NPEOC) , H-C (2' ) ) ; 4,19 (m, 1H, H--C (4' ) ) ; 3,72 (s, 6H, 0CH3) ; 3,61-3,34 (m, 4H, a-CH2(NPEE), CH2 (5 ' ) ) ; 3,07 (m, 2H, B-CH2 (NPEOC) ) ; 2,82 (m, 2H, 5-CH2 (NPEE) ) ; 2,59-2,49 (m, 4H, CH2 (succinato)); 1,20+1,09 (2d, 3H, CH3(NPEE) ) 29. 5'-O-(4,4'-Dimetoxitrifenilmetil)-N5-[2-(4-nitrofenil)- etoxicarbonil]-2'-O-[1-(4-nitrofeniletoxi)etil)-3'-O--succinoíl-adenosina

Coevaporam-se 239,0 mg (0,25 mmol) de 5'-o-(4,4'-dimetoxitrifenilmetil) -N6-[2-(4-nitrofenil)etoxicarbonil]-20-[1-(4--nitrofeniletoxi) etil)-adenosina por 2 x com 5 ml de piridina absoluta de cada vez, o resíduo é dissolvido em 5 ml de diclorometano absoluto, misturado com 40,72 mg (0,33 mmol) de 4-dimetilaminopiridina e 33,35 mg (0,33 mmol) de anidrido de ácido succínico e é agitado de um dia para o outro à temperatura ambiente. Em seguida a mistura reaccional é diluída com acetato de etilo e é agitada sucessivamente por 3 x com 30 ml de solução saturada de hidrogenocarbonato de sódio, 3 x com 30 ml de solução de ácido cítrico a 10 %, 1 x com 30 ml de solução saturada de hidrogenocarbonato de sódio e 1 x com 30 ml de água. As fases aquosas são extraídas com acetato de etilo, todas as fases orgânicas são secas sobre sulfato de sódio, filtradas e concentradas em evaporador rotativo. Dissolve-se o óleo resultante em 3 ml de acetato de etilo, adicionam-se gota a gota 7 0 ml de hexano, separa-se por filtração em filtro de vácuo o precipitado formado e seca-se a 40 °C sob alto vácuo sobre aparas de parafina. Obtêm-se 0,201 g (0,19, 76 %) do produto desejado sob a forma de um sólido amorfo, incolor. CCF (gel de sílica) : Rf = 0, 62 (diclorometano / metanol 9:1) 106

Analise: C54H55N7O17 x H2O (1074^07) calc. C 60, 38 H 5,16 N 9,12 determ. 59,91 4,91 9,14 UV (metanol): ^x[nm] (lg s) : 202 (5,02)/ 236 (4,44); 267 (4,58); (275 (4,51)] ^-RMN (250 MHz, d6-DMSO, ppm) : 12,28 (s, 1H, OH- (succinato) ) ; 10,70 (s, 1H, NH); 8,62 (s, 1H, H-C (8)); 8, 46+8, 43 (2s, 1H, H-C(2))/ 8,13 (d, 2H, o-H a N02 (NPEOC) ) ; 8,03-7,97 (m, 2H, o-H a N02 (NPEE) , 7,60 (d, 2H, m-H a N02 (NPEOC)); 7, 39-7, 09 (m, 11H, m-H a N02 (NPEE) , H(fenilo), m--H a OCH3) ) ; 6,84-6,79 (m, 4H, o-H a 0CH3) ) ; 6,18-6,12 (m, 1H, H-C(l'))/ 5, 42-5,38 (m, 2H, H-C(2')# H-C(3')); 4, 78-4, 66 (m, 1H, CH(NPEE)); 4,38 (t, 2H, a-CH2 (NPEOC) ) ; 4,27 (m, 1H, H- —C (4')) ; 3,70 (s, 6H, OCH3); 3,35-3,22 (m, 3H, H-C(5'), a- -CH2 (NPEE)); 3,12-3,02 (m, 3H, H-C (5"), B-CH2 (NPEOC)); 2,59-2,39 (m, 6H, fí-CH2 (NPEE) ) , CH2 (succinato) ) ; 1,10 + 1,01 (2d, 3H, CH3(NPEE)) 30. 5’-O-(4,4'-Dimetoxitrifenilmetil)-N2-[2-(4-nitrofenil)- etoxicarbonil]-O6- [-2-(4-nitrofenil)etil]-2'-O-[1- (4--nitrofeniletoxi)etil]-3'-O-succinoíl-guanosina

Coevaporam-se 168,17 mg (0,15 mmol) de 5'-O-(4,4'-dimetoxitrifenilmetil ) -N2-[2-(4-nitrofenil)etoxicarbonil]-O6- [-2--(4-nitrofenil)etil]-2'—O-[1-(4-nitrofeniletoxi)etil)-guanosina por 3 x com 5 ml de piridina absoluta de cada vez, o resíduo é retomado em 25 ml de diclorometano absoluto, misturado com 24, 43 mg (0,2 mmol) de 4-dimetilaminopiridina e 20,01 mg (0,2 mmol) de anidrido de ácido succínico e a solução de reacção é agitada de um dia para o outro à temperatura ambiente. Em seguida dilui-se com acetato de etilo e agita-se sucessivamente 3 x com 20 ml de solução de ácido cítrico a 10 %, 2 x com 20 ml de solução de hidrogenocarbonato de sódio saturada e 2 x com 20 ml de água. As fases aquosas são extraídas com acetato de 107

f—' Lei \ etilo, todas as fases orgânicas são secas sobre sulfato de sódio, filtradas e concentradas em evaporador rotativo. Dissolve-se o residuo oleoso em 2 ml de acetato de etilo, adicionam-se gota a gota 40 ml de n-hexano, separa-se por filtração em filtro de vácuo o precipitado obtido e seca-se a 40 °C sob alto vácuo sobre aparas de parafina. Obtêm-se 0,116 g (0,095 mmol, 64 %) do produto desejado sob a forma de um sólido amorfo incolor. CCF (gel de sílica): Rf = 0,46 (tolueno / acetato de etilo / metanol 5:4:1)

Análise: C62H6oNaOi9 (1221,21) cale. C 60, 97 H 4,95 N 9,17 determ. 60,28 4,96 9,15 UV (metanol): X*.áx[nm] (lg ε) : 202 (5, 07); [214 (4,88)]; 236 (4,48); 268 (4, 64); 108 31.

Instruções gerais para a preparação de derivados de éter 4-alcoxicarboniloxibenzilvinilico ou de derivados de éter 4-aciloxibenzilvinílico 31.1 Álcool 3-fluoro-4-hidroxi-benzílico 22,8 g (0,2 mol) de 2-fluorofenol são dissolvidos em 60 ml de KOH a 20 % (0,214 mol) e a solução amarelada é aquecida a 60 °C no banho de óleo. Em seguida preenche-se 30 ml de uma solução de formaldeído a 37 % (0,370 mmol) com H2O até 100 ml e em seguida adicionam-se gota a gota no espaço de 3 horas. Os controlos por CCF indicam a criação de dois produtos principais, correspondendo o produto que corre mais à frente ao composto monoalquilado desejado. A solução, que agora é avermelhada, é mantida durante mais 3 horas a 60 °C antes de se verter a solução arrefecida em 0,5 1 de água gelada / 300 ml de acetato de etilo (AE) . Ajusta-se o pH a um valor entre 5 e 6 com cerca de 20 ml de HC1 concentrado. Após separação da fase orgânica numa ampola de decantação, aquela é lavada por duas vezes com 300 ml de tampão de fosfato a pH 6 e 300 ml de solução saturada de NaCl de cada vez, as fases aquosas conjuntas são extraídas com duas vezes 150 ml de AE e são novamente lavadas com tampão de fosfato / solução de NaCl. As fases orgânicas reunidas são secas sobre NaSC>4, filtradas e são concentradas num evaporador rotativo até formarem um óleo (cerca de 23 g) . A continuação do processamento é feita por cromatografia. Para esse fim reveste-se uma coluna (6 cm de 0) com 200 g de gel de sílica para cromatograf ia relâmpago, equilibra-se com tolueno e após aplicação do produto em bruto conduzem-se os seguintes gradientes (tol / AE em ml): 200/0, 450/50, 400/100, 350/15 300/200. Recolhe-se o eluído em fracções até 100 ml cada, reunem-se as fracções do produto (cerca de 500 ml) e concentram-se num evaporador até atingir cerca de 100 ml. Depois de raspar com uma vareta de vidro a solução é guardada no frigorífico, de um dia para o outro para cristalizar. A massa cristalina incolor é separada por filtração em filtro de vácuo, lavada 2 x com 20 ml de éter de 109 petróleo frio e seca sob alto vácuo a 250 °C.

Obtêm-se desta forma 10,3 g (7,25 mmol, 36 %) de álcool 3-fluoro-4-hidroxi-benzílico. CCF (gel de sílica): Rf = 0,52 (tol / AE = 1/2);

Ponto de fusão: 101 °C UV (metanol): λ^χ [mu] (lg ε) : 222 (3,98) 272 (3,22) 1H-RMN (250 MHz., d6-DMSO, TMS, ppm) : 9,80 (s, 1H, fenil-OH) ; 7,05 (s, 1H, H- (C2) ) ; 6,95-6,80 (m, 2H, H-(C6), H-(C-5)); 5,12 (s, 1H, benzil-OH); 4,35 (d, 2H, CH2) . 31.2 Éter 4-metoxitritil[2,5-dicloro-4-hidroxi- -benzílico] 6 g (31,1 mmol) de álcool 2,5-dicloro-4-hidroxi-benzílico são dissolvidos em 70 ml de piridina absoluta e em seguida adicionam-se-lhes 11,0 g (35,62 mmol) de cloreto de monometoxi-tritilo. A solução amarelada é agitada durante várias horas à temperatura ambiente. 0 controlo por CCF deve indicar uma reacção completa antes de se fazer parar a reacção com 20 ml de MeOH e agitação durante 30 minutos. A solução de reacção incolor é concentrada num evaporador rotativo até atingir cerca de 30 ml, é diluída com 300 ml de AE e em seguida é lavada por três vezes com 300 ml de solução de NaCl saturada de cada vez. As fases aquosas reunidas são extraídas por duas vezes com 200 ml de AE e são ainda lavadas uma vez com 200 ml de solução de NaCl saturada. As fases de AE são secas sobre Na2S04, filtradas e são concentradas num evaporador rotativo até formarem um óleo (cerca de 17 g) . Após coevaporação com duas vezes 50 ml de tolueno, o produto em bruto é purificado por cromatografia. O eluido é recolhido em fraeções até 75 ml cada, as fraeções do produto são reunidas (cerca de 300 ml) e estas são concentradas no evaporador rotativo até formarem um óleo. É coevaporado por 110 duas vezes com 30 ml de MeOH dest., provoca-se a formação de espuma com CH2CI2 dest. e α espuma é seca, tornando-se gradualmente em resina, sob alto vácuo a 25 °C. 0 rendimento situa-se em 13,51 g (27,27 mmol) a 88 % do teórico. CCF (gel de sílica): Rf = 0,32 (tol / AE = 10/1); 1H-RHN (250 MHz., ds-DMSO, TMS, ppm) : 10,65 (bs, 1H, fenil-OH); 7,48-7,10 (m, 13H, fenil-H, H-(C6)); 7,00-6,81 (m, 3H, H-(C3), o-H a -OCH3) ; 4,05 (s, 2H, CH2) ; 3,68 (s, 3H, -OCH3) . 31.3 Álcool 3-cloro-4-(2-(4-nitrofenil)etoxicarboniloxi]--benzílico 0 éter 4-metoxitritil-(3-cloro-4-hidroxi)benzílico co-evaporado com tolueno (12,1 g = 28,08 mmol) é retomado em 50 ml de CH3CN absoluto e é misturado com 9,35 g (30,0 mmol) de cloreto de 2-(p-nitrofenil)etoxicarbonil-l-metilimídazolo. Na suspensão introduzem-se em seguida 700 mg de DMAP e agita-se durante 30 minutos à temperatura ambiente, dissolvendo-se o precipitado no período de poucos minutos. No evaporador rotativo a solução de reacção é concentrada para metade, é diluída com 300 ml de AE, lavada com 200 ml de solução saturada de NaHCO.3 / NaCl, as fases aquosas recolhidas são extraídas com duas vezes 100 ml de AE e novamente lavadas com solução e NaHC03 / NaCl. As fases orgânicas reunidas são secas sobre NaS04, filtradas e são concentradas num evaporador rotativo até formarem um óleo amarelado (cerca de 24 g) . 0 produto em bruto é suficientemente puro para a cisão subsequente do éter. 0 óleo é retomado com 50 ml de CHC13 / MeOH (4/1), misturado com 1,0 g (3,17 mmol) de ácido p-toluenossulfónico à temperatura ambiente e agitado durante 2 a 3 horas. A solução de reacção é diluída com 200 ml de CHCI3 e vertida sobre solução saturada de NaHC03 fria. A fase orgânica, depois da separação numa ampola de decantação, é novamente lavada com 200 ml de solução de NaHCC>3 e 200 ml de solução saturada de NaCl, as fases aquosas são 111 {' Η i—^ ^=s=,-^ extraídas com 50 ml de CHC13 e as fases org. reunidas são secas sobre NaSCN, filtradas e são concentradas num evaporador rotativo até formarem um óleo (cerca de 25 g). A continuação da purificação é feita por cromatografia. Para esse fim reveste-se uma coluna (6 cm 0) com 250 g de gel de sílica para cromatografia relâmpago, equilibra-se com tolueno e após aplicação do produto em bruto conduzem-se os seguintes gradientes (tol / AE em ml) : 300/0, 450/50, 400/100, 350/1 50, 300/200. Recolhe-se o eluído em fracções até 50 ml cada, reunem-se as fracções do produto (cerca de 300 ml) e concentram-se num evaporador até formar um óleo. Após coevaporação com MeOH, a resina é transformada em espuma com CH2Cl2 e é seca sob alto vácuo à temperatura ambiente.

Obtêm-se 7,41 g (21,07 mmol, 74 %) de uma resina incolor.CCF (gel de sílica): Rf = 0,24 (tol / AE = 3/1); 31.4. Álcool 2,5-dicloro-4-pivaloiloxi-benzílico 0 éter 4-metoxitritil-(2,5-dicloro-4-hidroxi)benzílico (12,0 g = 24,22 mmol) coevaporado com tolueno abs. é tomado em 150 ml de CH3CN abs. e misturado com 15 ml = 13,77 g (73,93 mmol) de anidrído de ácido piválico (p.a.). Em seguida acrescentam-se 780 mg de DMPA e agita-se durante 30 minutos à temperatura ambiente. Após cerca de 30 minutos a reacção já terminou. No evaporador rotativo a solução de reacção é concentrada até cerca de 50 ml, diluída com 200 ml de AE, é lavada com 200 ml de solução sat. de NaHC03 / NaCl, as fases aquosas reunidas são extraídas por duas vezes com 100 ml de AE e novamente lavadas com solução de NaHC03 / NaCl. As fases orgânicas reunidas são secas sobre NaSC>4, são filtradas e são concentradas no evaprador rotativo até formarem um óleo amarelado. De forma análoga à das instruções 31.3 (cisão do grupo protector metoxitritilo), obtêm-se 6,01 g (21,68 mmol) de uma resina incolor. CCF (gel de sílica) : Rf = 0,2.9 (tol / AE = 3/1) 112 (s, 2H, -ch2) ; 1H-RMN (250 MHz, CDCI3, TMS, ppm) : 7,58 (s, 1H, H-(C3)); 7,12 (s, 1H, H-(C5))/ 4,70 1,38 (s, 9H, -CH3) 31.5 Éter 2-cloro-4-(2-(4-nitrofenil)etoxicarboniloxi]--benzil-vinilico

Em 120 ml de éter etilvinílico são dissolvidos 7,48 g (20,12 mmol) de álcool 2-cloro-4-[2- (4-nitrofenil)-etoxi-carboniloxi]-benzílico. Por meio de diluição com 300 ml de AE e da adição sobre 200 ml de solução de NaHC03, a reacção é feita parar. Repete-se a lavagem da fase org. com 100 ml de solução sat. de NaHC03 e 100 ml de solução sat. de NaCl. As fases aquosas reunidas são extraídas com duas vezes 100 ml de AE. As fases orgânicas reunidas são secas sobre NaS04, filtradas e concentrados no evaporador rotativo até cerca de 15 ml. A continuação da purificação é realizada por cromatografia. Para esse fim é revestida uma coluna (4 cm 0) com 150 g de gel de sílica para cromatografia relâmpago, equilibrada com tolueno e apôs aplicação do produto em bruto, elui-se com 500 ml de tolueno. Recolhe-se o eluído em fracções de 50 ml cada, purificam-se as fracções do produto (cerca e 250 ml) e concentram-se no evaporador rotativo até formar um óleo. Após coevaporação com 20 ml de MeOH dest. o óleo viscoso é seco sob alto vácuo a 25 °C. O rendimento situa-se com 6,78 g (17,95 mmol) a 82 % do teórico. CCF (gel de sílica): Rf = 0,78 (tol / AE = 10/1) ΧΗ-ΕΜΝ (250 MHz, ds-DMS0, TMS, ppm) : 8,18 (m, 2H, o-H a -N02) ; 7,50 (d, 1H, H-(C6)); 7,42 (d, 2H, o- -H a -NO2), 7,20 (d, 1H, H-(C3)); 7,05 (dd, 1H, H- (C5) ) / 6,53 (dd, 1H, vinil-H) ; 4,78 (s, 2H, -CH2) ; 4,48 (t, 2 H, ot-CH2 (NPEE)); 4,30 (dd, 1H, trans-vinil-H); 4,12 (dd, 1H, cis-vinil--H) ; 3,18 (t, 2H, fi-CHz (NPEE)). 113 1^»— -t

De forma análoga foram preparados os seguintes compostos: 31.1.a Álcool 3-cloro-4-hidroxi-benzílico

Rendimento: 23 % CCF (gel de sílica): Rf = 0,52 (tol / AE = 1/2)

Ponto de fusão: 125 °C ^-RMN (250 MHz, d6-DMSO, TMS, ppm) : 10,05 (bs, 1H, fenil-OH); 7,28 (s, 1H, H-(C2)); 7,08 (d, 1H, H- - (C6)); 6,9 (d, 1H, H-(C5)); 5,12 (bs, 1H, benzil-OH); 4,35 (s, 2H, CH2) . 31.1. b Álcool 2-cloro-4-hidroxi-benzílico Rendimento: 28 % CCF (gel de sílica): Rf = 0,52 (tol / AE = 1/2)

Ponto de fusão: 125 °C 1H-RMN (250 MHz, d6-DMSO, TMS, ppm) : 9,72 (bs, 1H, fenil-OH); 7,29 (s, 1H, H-(C2)); 6,83 (d, 1H, H- - (C 6)); 6,9 (d, 1H, H-(C5)); 5,1 (bs, 1H, benzil-OH); 4,45 (s, 2H, CH2) . 31.1. c Álcool 2,5-dicloro-4-hidroxi-benzílico Rendimento: 33 CCF (gel de sílica): Rf = 0,52 (tol / AE = 1/2)

Ponto de fusão: 144 °C ^-RMN (250 MHz, d6-DMSO, TMS, ppm) : 10,52 (bs, 1H, fenil-OH); 7,40 (s, 1H, H-(C2)); 6,95 (d, 1H, H- - (C6)); 6,9 (d, 1H, H-(C5)); 5,1 (bs, 1H, benzil-OH); 4,44 (s, 2H, CH2) . 114

V L-Cj .... ^ 31.2. a Éter 4-metoxitritil-(2-fluoro-4-hidroxi)-benzílico

Rendimento: 95 % CCF (gel de sílica): Rf = 0,38 (tol / AE = 10/1) 31.2. b Éter 4-metoxitritil-(3-cloro-4-hidroxi)-benzílico

Rendimento: 89 % (espuma / resina) CCF (gel de sílica): Rf = 0,35 (tol / AE = 10/1) 31.2. c Éter 4-metoxitritil-(2-cloro-4-hidroxi)-benzílico

Rendimento: 93 % (espuma / resina) CCF (gel de sílica): Rf = 0,52 (tol / AE = 1/2) 31.2. d Éter 4-metoxitritil-(4-hidroxi)-benzílico

Rendimento: 93 % (espuma / resina) CCF (gel de sílica): Rf = 0,52 (tol / AE = 1/2) 1H-RMN (250 MHz, CDC13, TMS, ppm) : 7,50-7,05 (m, 14H, fenil-H, m-H a fenil-OH) ; 6, 83-6, 65 (m, 4H, o-H a fenil-OH, o-H a -OCH3) ; 4,8-4,7 (bs, 1H, benzil-OH); 4,03 (S, 2H, CH2) ; 3,73 (s, 3H) , -OCH3) . 31.3. a Álcool 3-fluoro-4-[2-(4-nitrofenil)etoxi- carboniloxi]-benzílico

Rendimento: 7 8 CCF (gel de sílica): Rf = 0,22 (tol / AE = 3/1)

Ponto de fusão: 105 °C 115 f u t 31.3.b Álcool 2-cloro-4-[2-(4-nitrofenil)etoxi- carboniloxi] -benzilico

Rendimento: 76 % CCF (gel de sílica): Rf = 0,23 (tol / AE = 3/1) 1H-RMN (250 MHz, CDC13, TMS, ppm) : 8,18 (m, 2H, o-H a -N02) / 7, 48 (d, 1H, H-(C6)); 7,40 (d, 2H, m a N02), 7,14 (d, 1H, H-(C3)); 7,05 (d, 1H, H-(C5)); 4,72 (s, 2H, -CH2); 4,46 (t, 2 H, 0C-CH2 (NPEE) ) / 3,13 (t, 2H, S-CH2 (NPEE)); 1,88 (bs, 1 H, benzil-OH ?). 31.3.c Álcool 2,5-dicloro-4-(2-(4-nitrofenil)etoxi- carboniloxi]-benzilico

Rendimento: 62 % CCF (gel de sílica): Rf = 0,26 (tol / AE = 3/1)

Análise: CisH15N06Cl2 (351,74): N 3, 63 N 3,60 calc. : C 49,76 H 3,39 determ.: C 50,00 H 3,58 1H-RMN (250 MHz, d6-DMSO, TMS, ppm) : 8,18 (m, 2H, o-H a -N02) ; 7, 65-7,52 (m, 4H, m-H a -N02, H-(C3), H- (C6) ) ; 5,63 (t, 1H, benzil-OH); 4, 58-446 (m, 4H, benzil-CH2, a-CH2 (NPEE) ) ; 3,15 (t, 2H, β-Οί2 (NPEE)). 31.3.d Álcool 4-(2-(4-nitrofenil)etoxicarboniloxi]- -benzilico

Rendimento: 67 % (resina) CCF (gel de sílica): Rf = 0,52 (tol / AE = 1/2)

Análise: C16Hi5N06 (351,74): calc.: C 60,57 H 4,76 N 4,41 116

U determ.: C 60,93 H 4,81 N 4,59 UV (metanol) λ^χ [nm] (lg ε) : 4,02 (268) 1H-BMN (250 MHz, d6-DMS0, TMS, ppm) : 8,20 (d, 211, o-H a -N02) ; 7,68 (d, 1H, m-H a OCO); 7,30 (d, 2H, m a N02) ; 7,05 (d, 2H, m-H a OCO); 5,2 (t, 1H, benzil-OH); 4,50-4,25 (m, 4H, -CH2, a-CH2 (NPEE) ) ; 3,13 (t, 2H, p-CH2 (NPEE)) . 31.5. a Éter 3-cloro-4-(2-(4-nitrofenil)etoxicarboniloxi]- -benzi1-vinílico

Rendimento: 75 % (Óleo) CCF (gel de silica): Rf = 0,70 (tol / AE = 10/1)

Análise: Ci8Hi6N06C1 (377,38) calc.: C 12,33 H 3,12 N 2,34 determ.: C 12,43 H 3,23 N 4,34 1H-RMN (250 MHz, ds-DMS0, TMS, ppm) : 8,15 (m, 2H, o-H a -N02) ; 7, 45-7,73 (m, 3H, m a -N02, H-(c2)); 7,29-7,20 (dd, 1H, H-(C6) ) ; 7,13 (d, 1H, H-(C5)); 4,70 (s, 2H, -CH2) ; 4,50 (t, 2H, a-CH2 (NPEE)); 4,27(dd, 1H, trans—vinil-H); 4,10 (dd, 1H, cis-vinil-H) ; 3,13 (t, 2H, β-Οί2 (NPEE)). 31.5. b Éter 3-fluoro-4-[2-(4-nitrofenil)etoxicarboniloxi]- -benzilico

Rendimento: 87 % (Óleo) CCF (gel de silica): Rf = 0,72 (tol / AE = 10/1)

Análise: CiSHi6N06F (361,33) calc.: C 12,33 H 3,12 N 2,34 determ.: c 12,43 h 3,23 n 4,34 117 I—^ I—^ f r~ \l ^H-RMN (250 MHz, ds-DMSO, TMS, ppm) : 8,18 (m, 2H, o-H a -NOz) / 7,40 (m, 2H, m a -NOz) ; 7,21-7,06 (m, 3H, H-(C2), H-(C5), H— (C6) ) ; 6,52 (dd, 1H, vinil-H) ; 4,72 (s, 2H, -CH2); 4,50 (t, 2H, a-CH2 (NPEE) ) ; 4,28 (dd, 1H, trans--vinil-H) ; 4,09 (dd, 1H, cis-vinil-H) ; 3,13 (t, 2H, β-0Η2 (NPEE)). 31.5.c Éter 2,5-cloro-4-(2-(4-nitrofenil)etoxi- carboniloxi]-benzil-vinílico

Rendimento: 84 % CCF (gel de sílica): Rf = 0,78 (tol / AE = 10/1)

Ponto de fusão: 48 °C

Análise: Ci8Hi5N06Cl2 (412,23): calc.: C 52,45 H 3,67 N 3,40 determ.: C 52,07 H 3,73 N 3,83 1H-RMN (250 MHz, CDCl3, TMS, ppm) : 8,18 (d, 2H, o-H a N02) ; 7,57 (s, 1H, H- (C6) ) ; 7,41 (d, 2H, m-H a -N02); 7,21 (s, 1H, H-(C6) ) ; 6,53 (s, 1H, (CH (Cl2BnNPEOC) ? 4,78 (s, 2H, benzil-CH2) ; 4,53 (t, 2H, a-CH2 (NPEE)); 4,37/4,29 (d, 1H, trans-vinil-H) ; 4,13 (dd, 1H, cis-vinil-H); 3,17 (t, 2H, β-CHz (NPEE)) . 31, 5.d Éter 4-(2-(4-nitrofenil)etoxicarboniloxi]—benzil- -vinílico

Rendimento: 89 %

CCF (qel de sílica): Rf = 0,88 (tol / AE = 3/1) Ponto de fusão: 64 °C

Análise: CisH^NOe (343, 33) : calc.: C 62,97 H 4,99 N 4,08 118

V

determ.: C 62,92 H 5,00 N 4,04 UV (metanol) λ^χ [nm] (lg ε) : 268 (4, 01) 1H-RMN (250 MHz, d6-DMSO, TMS, ppm) : 8,18 (d, 2H, o-H a N02) ; 7,47-7,31 (m, 4H, m-H a -N02, m-H a -OCO); 7,12 (m, 2H, o-H a -OCO); 6,52 (q, 1H, CH (BnNPEOC) ; 4,73 (s, 2H, benzil-CH2) ; 4,48 (t, 2H, a-CH2 (NPEE)); 4,31/4,28 (d, 1H, trans-vinil-H); 4,08 (dd, 1H, cis-vinil-H) ; 3,15 (t, 2H, B-CH2 (NPEE)). 31.5.e Éter 2, 5-dicloro-4-pivaloiloxi-benzil-vinilico

Rendimento: 58 % (Óleo) CCF (gel de sílica): Rf = 0,81 (tol / AE = 20/1)

Análise: Ci4H1603C12 (303,19): calc.: C 12,33 H 3,12 N 2,34 determ.: C 12, 43 H 3,23 N 4, 34 ^-RMN (250 MHz, CDCI3, TMS , ppm) : 7,53 (s, 1H, H-(C 6)) ; 7, 15 (S, 1H, H- (C3) ) ; 6,53 (q, CH(ClzBnOEE) ; 4,78 (s, 2H, benzil-CH2) ; 4, 36/4, 28 (d, 1H, trans--vinil-H-); 4,13 (dd, 1H, cis-vinil-H); 1,38 (s, 9H, -CH3) . 32.1 2'-0-1-(3-Fluoro-4-[2-[4-nitrofenil)-etoxicarboniloxi]- -benziloxi)-etil-3',5'-tetraisopropil-dissiloxano-1,3--diil-uridina

Dissolvem-se 3,50 g (7,19 mmol) de uridina protegida em 3', 5' em 30 ml de tolueno absoluto e coevapora-se por duas vezes num evaporador rotativo. Então recolhe-se a espuma em 80 ml de tolueno abs., introduzem-se 3,20 g (8,86 mmol) do éter vinílico dissolvido em 64 ml de tolueno abs. e mistura-se a solução incolor com 10 ml (100 mg = 0,52 mmol) de uma solução mãe de p-TsOH*H2C em dioxano abs. (1,0 g/100 ml). Depois do se 119 V 1 agitar de um dia para o outro à temperatura ambiente (controlo por CCF) , a solução de reacção transparente é diluída r.om AE até 300 ml e é agitada por duas vezes cora 100 ml de solução de NaHC03 e 100 ml de solução de NaCl sat. As fases aquosas são extraídas com 100 ml de AE, as fases orgânicas reunidas são secas sobre NaS04, filtradas e concentradas em evaporador rotativo. A continuação da purificação è realizada por cromatografia em coluna com 4 cm de diâmetro, revestida com 120 g de gel de sílica para cromatografia relâmpago e equilibrada com tolueno (gradiente do eluente (tol / AE / MeOH em ml) : 200/0, 200/20, 250/50, 10/100 (PI +P2)/ fraeções com 50 ml cada. As fraeções do produto são concentradas em evaporador rotativo e são coevaporadas por várias vezes com MeOH / CH2CI2.

Desta forma obtêm-se 4,67 g (5,51 mmol, 77 %) de uma espuma incolor composta pelos dois diastereómeros (PI + P2). CCF (gel de sílica): Rf = 0,60/0,65 (tol / AE = 1/1)

Análise: C39H54N3O13SÍ2F (848, 04) calc.: C 55,24 H 6,42 N 4,96 determ.: C 55,06 H 6,48 N 5,07 UV (metanol): λ^χ [nm] (lg ε): 265 (4,33) 1H-RMN (250 MHz, CDC13, TMS, ppm): 8, 93/8, 73 (bs, 1H, -NH) ; 8,19 (m, 2H, o-H a N02) ; 7, 93/7, 84 (d, 1H, H—(C6)) ; 7,18-6,87 (m, 3H, H-(C2), H-(C5), H-(C6)); 5,78/5,68 (s, 1H, H-(C1')); 5,685,59 (m, 1H, H-(C5)), 5,14 (m, 1H, CH(2 FPNPE); 4,78-4, 46 (m, 4H, benzil-CH2, a-CH2 (NPEE)); 4,29-3,41 (m, 5H, H-(C2'), H-(C3'), H-(C4'), H-(C5T), H-(-C5,r); 3,14 (t, 2H, ã-CHz (NPEE)); 1,49 (t, 2H, CH3(2FPNPE); 120

U t 32.1.a 2’-0-1-{3-Cloro-4-[2-(4-nitrofenil)etoxi- carboniloxi]-benzoiloxi}-etil-3', 5'-tetra i sopropil--dissiloxano-1,3-diil-uridina

Rendimento: 86 % CCF (gel de silica): Rf = 0,64/0,68 (tol / AE = 1/1)

Análise: C39H54N3O13SÍ2CI (864,50) calc. : C 54,19 H 6,30 N 4,86 determ.: C 54,14 H 6,39 N 4,88 UV (metanol) : Xmáx [nm] (lg ε) : 264 (4;28) benzoiloxi}-etil-3',5'-tetraisopropil-dissiloxano-1,3-diil--uridina

Rendimento: 7 9 % CCF (gel de sílica): Rf = 0,69/0,65 (tol / AE = 1/1)

Analise: C39Hs4N30i3SÍ2Cl (864, 50) calc.: C 54,19 H 6,30 N 4,86 determ.: C 54,13 H 6,44 N 4,82 UV (metanol): A™áx [nm] (lg ε) : 265 (4,29) 32.1.C 2’-0-1-(2-Dicloro-4-(2-(4-nitrofenil)etoxi- carboniloxi]-benzoiloxi}-etil-3',5'-tetraisopropil--dissiloxano-1,3-diil-uridina

Rendimento: 76 % (espuma) CCF (gel de sílica): Rf = 0,69/0,66 (tol / AE - 1/1)

Análise: C39H53N3O13SÍ2CI2 (898,94) calc.: C 52,11 H 5,94 N 4,67 determ.: C 52,06 H 5,05 N 4,57 121 t 32.1. d 2'-0-1-{4-(2-(4-Nitrofenil)etoxicarboniloxi]- -benzoiloxi}-etil-3', 5' -tetraisopropil-dissiloxano--1,3-diil-uridina

Rendimento: 44 % (espuma) CCF (gel de sílica): Rf = 0,84/0,82 (tol / AE = 1/3)

Análise: C39H55N3O13SÍ2 (830, 05) cale.: C 56,43 H 6,68 N 5,06 determ.: C 56,32 H 6,71 N 5,04 UV (metanol): λ„^χ [nm] (lg ε) : 264 (4,30) 32.1. e 2'-0-1-(2,5-Dicloro-4-pivaloiloxibenziloxi)-etil- -3',5'-tetraisopropil-dissiloxano-1,3-diil-uridina (espuma) CCF (gel de sílica): Rf = 0,72/0,79 (tol / AE = 1/1)

Análise: C35H54N2O10SÍ2CI2 (789, 90) calc.: C 53,22 H 6,89 N 3,55 determ.: C 53,87 H 7,09 N 3,61 32.2 2'-0-1-(3-Fluoro-4-[2-(4-nitrofenil)etoxicarboniloxi]- -benziloxi)etil-uridina

4,33 g (5,11 mmol) de 2'-O-l-{3-fluoro-4-[2-(4-nitro-fenil)etoxicarboniloxi]-benzoiloxi)etil-3',5'-tetraisopropil-dissiloxano-1, 3-diil-uridina são tomados numa solução mãe de TBAFx3H20 (50 mg/ml) / ACOH (50 mg/ml) em dioxano (abs.) e são agitados de um dia para o outro à temperatura ambiente. A solução é concentrada num evaporador rotativo (45 °C) até atingir um volume residual de cerca de 20 ml e o produto em bruto é carregado numa coluna (d = 5 cm) . A coluna é revestida com 150 g de gel de sílica para cromatografia relâmpago e é equilibrada com tolueno (gradiente do eluente (tol / AE / MeOH 122 em ml) : 200/0, 200/20, 250/50, 200/100, 150/150, 150/150/15 1 5/1 50/30, 150/150/30m PI +P2); fracções com 50 ml cada) . As fracções do produto são concentradas em evaporadór rotativo e são coevaporadas por várias vezes com MeOH / CH2C12.

Desta forma obtêm-se 2,75 g (4,54 mmol, 89 %) de uma espuma incolor composta pelos dois diastereómeros (Pl + P2). CCF (gel de sílica): Rf = 0,45/0,47 (tol / AE / MeOH = 5/4/1)

Análise! C27H28N3O12SÍ2F (605,53) calc.: c 53,56 H 4, 66 N 6,94 determ.: c 52,86 H 4, 83 N 6, 91 x 0,5 H20 calc.: c 52,77 H 4,76 N 6, 84 UV (metanol): Xmâx[nrn] (lg ε) : 264 (4, 30) 1H-RMN (250 MHz, d6-DMSO, TMS, ppm) : 11,28 (bs, 1H, -NH); 8,18 (m, 2H, o-H a NOz); 7,95/7,80 (m, 1H, H- (C6) ) ; 7,63-7,09 (m, 5H,m-H a N02, H-(C2'"), H-(C5'"), h- ~(C6'"); 5,91 (m, 1H, H- (Cl') ) ; 5,53 (m, 1H, H-(C5)); 5,29- -5,09 (m, 2H, HO-(C3'), HO(C5'); 4,95 (m, 1H, CH(2FPNPE); 4,70--4,36 (m, 4H, benzil-CH2, a-CH2 (NPEE) ) ; 4,26 (t, 1H, H-(c2'), 4,06 (m, 1H, H-(C3'); 3,87 (m, 1H, H(C4'); 3,78-3,48 (m, 2H, H-- (C5'), H-(-C5"); 3,12 (t, 2H, B-CH2 (NPEE)); 1,46/1,38 (d, 3H, CH3 (2FPNPE) . 32.2.a 2'-O-l-{3-Cloro-4-[2-(4-nitrofenil)etoxi- carboniloxi]-benziloxi)etil-uridina

Rendimento: 97 % (espuma) CCF (gel de sílica): Rf = 0,64/0,68 (tol / AE / MeOH = 5/4/χ)

Análise: C27H28N3O12CI (621,88) calc.: C 52,14 H 4,54 N 6,76 determ.: c 51,77 h 4,56 N 6,53 123 u UV (metanol): Xmãx [nm] (lg ε) : 265 (4,27) 32.2. b 2'-0-1-{2-Cloro-4-[2-(4-nitrofenil)etoxi- carboniloxi]-benziloxi)etil-uridina

Rendimento: 82 CCF (gel de sílica): Rf = 0,61/0,63 (tol / AE / MeOH = 5/4/i)

Análise: C27H28N3O12CI (621, 88) cale.: C 52,14 H 4,54 N 6,76 determ.: C 51,91 H 4,70 N 6,76 UV (metanol): XmáX [nm] (lg ε) : 264 (4,25) 32.2. c 2'-0-1-{2,5-Dicloro-4-[2-(4-nitrofenil)etoxi- carboniloxi]-benziloxi)etil-uridina

Rendimento: 69 % (espuma) CCF (gel de sílica): Rf = 0,66/0,69 (tol / AE = 1/1)

Análise: C27H27N3O12CI2 (656,43) calc.: C 49,40 H 4,15 N 6,40 determ.: C 48,99 H 4,31 N 6,29 32.2. d 2'-o-l-(4-[2-(4-Nitrofenil)etoxicarboniloxi]- -benziloxi)-etil-uridina

Rendimento: 80 % de cristais amarelados CCF (gel de sílica): Rf = 0,65/0,66 (tol / AE / MeOH = 5/4/1)

Análise: C27H29N3O12CI (587,54) calc.: C 55,20 H 4,97 N 7,15 determ.: C 54,91 H 5,03 N 7,13 UV (metanol) : Xmfkií (4,30) [nm] (lg ε) : 264 124 y t 32.2.e 2'-0-1-(2-Dicloro-4-pivaloiloxibenziloxi)-etil- -uridina (espuma) CCF (gel de sílica): Rf = 0,72/0,79 (tol / AE = 1/1) Análise: C23H28NZO9CI2 (547,39) calc.: C 50, 47 H 5,16 N 5, 12 determ.: C 50,31 H 5, 42 N 5,12 UV (metanol): ^máx [nm] (lg ε) : 261 (3,99) 32.3. 2'-0-1-{3-Fluoro-4-[2-(4-nitrofenil)etoxicarboniloxi]- -benziloxi)-etil-S'-DMTR-uridína 2,44 g (4,03 mmol) de 2'-0-1-{3-fluoro-4-[2-(4-nitro-fenil)etoxicarboniloxi]-benziloxi)-etil-uridina previamente secos são coevaporados por duas vezes com 10 ml de tolueno abs. em evaporador rotativo, em seguida são tomados em 20 ml de piridina absoluta e seguidamente são misturados com 2,05 g (6,06 mmol) de DMTR-C1. A solução de reacção é deixada sob agitação de um dia para o outro à temperatura ambiente e a reacção é interrompida adicionando 10 ml de MeOH e prosseguindo a agitação durante mais 20 minutos. Em seguida a solução é concentrada em evaporador rotativo sob vácuo até formar um óleo, é tomada com 250 ml de AE e é agitada com 150 ml de solução sat. de NaHCCb e por duas vezes com 150 ml de solução sat. de NaCl. A fase aquosa é extraída com 150 ml de AE, as fases org. reunidas são secas com Na2S04, filtradas e concentradas até formarem um óleo. A continuação da purificação é realizada através de cromatografia, numa coluna com 4 cm de diâmetro, revestida com 130 g de gel de sílica para cromatografia relâmpago e equilibrada com tolueno (gradiente do eluente (tol / AE em ml), 300/0, 300/30, 300/50, 250/50, 210/70, 150/50, 150/100, 150/150, 100/200, fracções com 100 ml cada) . As fracções do produto são concentradas em evaporador rotativo e são coevaporadas por várias vezes com MeOH / CH2C12. Desta forma obtém-se 3,76 g (3,98 mmol, 98 %) de uma eopuma 125 incolor composta pelos dois diastereómeros (PI + P2). CCF (gel de sílica): Rf = 0,57/0,59 (tol / AE / MeOH = 5/4/1) 1H-RMN (250 MHz, CDC13, TMS, ppm): 8,5 (bs, 1H, -NH); 8,18 (m, 2H, o-H a -NOz) ; 7,96/7, 87 (d, 1H, H-(C6)); 7,42-7,00 (m, 14H, fenil-H, m-H a -OCH3, m-H a -N02, H--(C2'"J, H-(C5'")/ H- (C6' ' ' ) ; 6, 88-6,79 (m, 4H, o-H a - -OCH3); 6,04/5,95 (d. 1H, H-(C); 5,27 (m, 1H, H-(C5)); 5,14 (m, 1H, CH(2FPNPE), 4,78-4,29 (m, benzil-CH2 β-ΟΗ2 (NPEE), H- - (C2' ) , H-(C3r); 4,07 (m, 1H, H’-(C4')); 3,78 (s, 6H, -OCH3) / 3,51 (m, 2H, H-(C5'), H-(C5"); 2,74/2,58 (d, 1H, HO-(C3'); 1,46/1,40 (d, 3H, CH3 (2FPNPE)) . 32.4 2r —0—1—{3-Fluoro-4-[2-(4-nitrofenil)etoxicarboniloxi]— benziloxi}etil-5'-O-DMTR-uridina-3'-O-fosfato de β--cianoetil-N,N-diisopropilamida 600 mg (0,66 mmol) de 2'-O-l-{3-fluoro-4-[2-(4-nitrofenil) etoxicarboniloxi]—benziloxi}etil-5'-O-DMTR-uridina seca são carregados num balão de 50 ml, são secos de um dia para o outro sob alto vácuo e em seguida são tomados com 20 ml de CH3CN abs. Adiciona-se-lhes 6 ml (2,7 mmol) de uma solução mãe de reagente de fosfitilação (0,45 mmol/ml de CH3CN abs.) e 6 ml de uma solução mãe de tetrazolo (10 mg/ml) e agita-se durante mais 12 h à temperatura ambiente. Vertendo sobre 300 ml de uma solução de NaHC03 / AE (1/1) interrompe-se a reacção. Separam--se as fases numa ampola de decantação, agitam-se de novo com 150 ml de AE e lavam-se as fases orgânicas reunidas, por duas vezes com 100 ml de solução de NaCl sat. cada vez. Após secagem sobre Na2SOí e filtração, concentra-se em evaporador rotativo até formar um óleo. A continuação da purificação é realizada por cromatografia. Para esse fim reveste-se uma coluna com 2 cm de diâmetro com 20 g de gel de sílica rápido e condiciona-se com tolueno (gradiente do eluente (tol / AE em ml) : 100/20, 210/70; fracções até 10 ml cada) . As fracções do produto são concentradas em evaporador rotativo e são trituradas com 10 ml 126 de cada CH2C12 / MeOH. Secam-se à temperatura ambiente sob alto vácuo.

Desta forma, obtêm-se 650 mg (0,587 mmol, 89 %) de uma espuma incolor. CCF (gel de sílica): Rf = 0,65/0,57 (tol / AE / MeOH = 5/4/1)

Análise C57H64PN3Oi5F (1109,13): calc.: C 61,73 H 5,82 N 6,31 determ.: C 61,56 H 5,82 N 5,67 UV (metanol): λπώΧ[ηπι] (lg ε) : 264 (4,30) 1H-RMN (250 MHz, CDCl3, TMS, ppm) : 8,18 (m, 2H, o-H a -N02) ; 8, 09-7,84 (bs/m, 2H, -NH, H-(C6)); 7,46-7,00 (m, 14H, fenil-H, m-H a -OCH3, m-H a -N02, H- (C2" ') , H-(C5'"); H-(C'"6)); 6, 87-6, 76 (m, 4H, o-H a -OCH3);, 6, 08/5, 96 (m, 1H, H—(Cl *)) ; 5,27 (m, 1H, H-(C%)); 5,14 (m, 1H, CH(2FPNPE) , 4,77-4,42 (m, benzil-CH2, a-CH2 (NPEE) , H-(C2’), H-(C3’), 4,29-4,13 (m, 1H, H'-(C4’)); 3,97-3,33 (m, 12H, -OCH3, POCH2, N-CH, H-(C5'), H-(C5"))/ 3,15 (t, 5-CH2 (NPEE)); 2,63- -2,33 (m, 2H, CH2-CN; 1,50/0, 98 (m, 15H, CH3(2FPNPE), CH(CH3)2); 31P-RMN (400 MHz, CDC13, H3P04, ppm) : 151,18; 150,87; 150,61; 150,36 33. Sínteses de oligorribonucleótidos com sequências unitárias e grupo de protecção 2'-0-NPE intacto 33.1 Utilização de nucleósido-fosfitamidas com o resíduo cianoetilo como grupo de protecção

Uma uridina ligada ao suporte (Exemplo 27) constitui a extremidade 3' do oligonucleótido a sintetizar, isto é, após cisão do grupo dmtr pode-se condensar a primeira uridina- 127

L·, t -fosfitamida (Exemplo 14). A determinação dos rendimentos de condensação faseados é realizada por meio de medição da absorção do catião de di-metoxitritilo a 498 nm. As nucleósido-fosfitamidas são preparadas sob a forma de soluções 0,1 M em acetonitrilo absoluto.

5'-HO-(UUU UUU UUU UUU) *-0H * = protegido por 2'-O-[1-(4-nitrofeniletoxi)etil] (2'-0-NPEE) O tempo de condensação para a síntese do dodecâmero da uridina é de 1200 segundos.

Depois da cisão do último grupo 5' -O-DMTR, foi possível calcular o rendimento de condensação médio com 100 %. Depois da cisão do oligómero do suporte obtém-se cerca de 46 DO265 de dodecmero da uridina. 0 rendimento total do produto calculado situava-se a 100 %. 33.2 5'-HO-(AAA AAA AAA A)'*-0H (* = protegido por 2'-0- -NPEE) A síntese do decâmero da adenosina com o grupo 2'-0-NPEE (utilização do Exemplo 21) tem início com uma adenosina ligada ao material de suporte através de um 3'O-succinato (Exemplo 29). O tempo de condensação foi de 1200 segundos. O rendimento de condensação médio após 8 condensações é de 100 %. O ribonucleótido com o decâmero de adenosina é separado so suporte com o grupo 5'-O-DMTR intacto. Obtém-se (determinação por fotometria) 24 D026o (tritilo on). O produto em bruto obtido tritilo-on é purificado por meio de OPC (Oligonucleotide

Purification Cartridges - Cartuxos de Purificação de

Oligonucleótidos). Obtém-se o oligómero desejado, limpo de eventuais sequências defeituosas, na sua forma tritilo-off (após cisão do grupo DMTR com ácido trifluoroacético a 2 %). 128

j---- L-H u

Para uma purificação OPC aplica-se 18,7 DO260 e obtém-se 10 DO260 de ribonucleótido purificado, o qns corresponde a um rendimento de 54 %. 33.3 5'-HO-(CCC CCC CCC C)*-0H (* = protegido por 2'-0-NPEE) A partir dos Exemplos 17 e 28. O tempo de condensação do ribonucleótido com o decâmero de citidina foi de 1200 segundos. Uma vez que se obtém o ribonucleótido na sua forma tritilo-on após cisão do suporte, só se podem tomar em consideração 8 condensações para a determinação do rendimento de condensação médio. Este é de 91 %. O rendimento calculado do produto situa-se a 74 %, relativamente à primeira condensação.

Após a separação amoniacal do suporte obtêm-se 17,5 DO270 do produto em bruto. O produto em bruto é submetido a uma purificação OPC. É em seguida obtido sob a sua forma titilo--of f. 33.4 5'-HO-(GGG GGG GGG G) *-OH (* = protegido por 2-O-NPEE) A partir dos Exemplos 30 e 26.

No caso desta síntese, o tempo de condensação foi reduzido para 700 segundos a partir da quinta condensação. O rendimento de condensação médio foi de 93 %. A partir da primeira condensação, obtém-se um rendimento do produto de 52 %. Obtém-se 20 a 23 D027i de ribonucleótido tritilo on após a separação do suporte. O produto em bruto é purificado por meio de OPC. O oliqómero tritilo off é obtido com um rendimento de 60 %(12,8 D0271). 129 34. Γ \

Utilização de nucleósido-fosfitamidas com o resíduo NPE como grupo de protecção do fosfato

Em todas as sínteses descritas em seguida são utilizadas nucleósido-fosfitamidas com o grupo de protecção fosfato-NPE.

34.1 5'-HO-(UUU UUU UUU U)*-OH 5'-HO-(UUU UUU UUU UUU) *-0H (* = protegido por 2r-0--NPEE)

Utilização dos Exemplos 27 e 18.

No caso das duas sequências acima indicadas são utilizados tempos de condensação de 1200 segundos.

Os rendimentos de condensação médios situam-se em 98 % no caso do decâmero da uridina e em 99 % no caso do dodecâmero da uridina. Os rendimentos do produto calculados situam-se em 83 % ou 88 %. Obtêm-se ambos os oligómeros após a separação do suporte sob a forma tritilo-off. No caso do decâmero da uridina o rendimento bruto situa-se em 31,6 DO265, no caso do dodecâmero situa-se em 33,8 D0265· 34.2

5' -HO- (AAA AAA AAA A) *-0H 5' -HO- (AAA AAA AAA A) *-0H 5'-HO-(AAA AAA AAA A)*-H0 (* = protegido por 2'-0-NPEE)

Sintetizaram-se três ribonucleótidos de adenosina decâmeros com três cargas diferentes de adenosina-fosfitamida. Utilização dos Exemplos 29 e 22. Os rendimentos médios de condensação situam-se em 95 % (composto 2) ou 98 % (compostos 1 + 3) . 0 tempo de condensação foi de 1200 segundos. A última sequência foi purificada por meio de OPC. 130 L-Ij 34.3 5'-HO-(CCC CCC CCC C)*-OH (* = protegido por 2'-0-NPEE) Utilização dos Exemplos 28 e 18. 0 rendimento médio de condensação foi de 89 % após 8 condensações. O produto em bruto foi obtido na sua forma tritilo-on após separação amoniacal do suporte, obtém-se 18,1 DO273 que são submetidos a uma purificação OPC. O ribonucleótido de citidina tritilo-off é obtido com um rendimento de 77 % (14,0 D0273)

35. Electroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) das sequências de ARN protegidas por 2'-0-NPEE 0 gel de poliacrilamida analítico (PAGE) é realizado sob condições desnaturantes.

Em seguida as placas de electroforese em gel são sililadas com cloreto de trimetilsilílo a 20 % em diclorometano. Para a representação da PAGE a 20 % são dissolvidos 0,21 mmol de ureia, 1 ml de água, 3 ml de tampão de electroforese em gel e 15 ml de solução de acrilamida em banho de água aquecido e em seguida arrefece-se em banho de gelo. Após adição de 1 ml de solução de persulfato de amónio a 1,6 % e 20 ml de tetra-metilenodiamina (TEMED), verte-se a solução para polimerização entre as placas de vidro. Serve de electrólito o tampão de electroforese em gel numa diluição de 10 vezes. 0 tampão de electroforese em gel é preparado dissolvendo 0,89 ml de tris (hidroximetil) aminometano, 0,89 mol de ácido bórico e 23 mmol de Na2EDTA’2 H20 num litro de água e ajustando o pH a 8.

Após a colocação das amostras nas câmaras já preparadas, revela-se o gel durante 3 horas a 300 volt. As bandas de oligo-nucleótidos são coloridas conforme as manchas do método all, tornando-se visíveis. 131 t

r Lc- K

Devido ao facto de o cromatograma de HPLC dos oligorribo-nucleôtidos protegidos por 2'-0-NPEE (coluna RP-1R) não permitir uma indicação clara quanto ao seu grau de pureza, deve-se discutir neste ponto o PAGE de cada um dos ribonucleótidos. Número Sequência Rendimento i condensação 1 5 Ή0- (UUU UUU UUU U) *~0H 98 % 2 5'-HO-(UUU UUU UUU UUU)*-0H 99 % 3 5'-HO-(UUU UUU UUU UUU)*-OH 101 % 4 5'-HO-(AAA AAA AAA A)*-OH 98 % 5 51 -HO- (ΑΆΑ AAA AAA A) *-OH 95 % (* = protegido por 2'-0-NPEE)

As sequências 1, 2 e 5 foram sintetizadas com nucleósido--fosfitamidas que possuem o resíduo NPE como grupo de protecção do fosfato. As 3 e 4, com os que possuem como protecção de fosfato o grupo cianoetilo. Tal como já é de esperar, devido aos rendimentos médios de condensação das sequências 1 a 4, devem ocorrer muito poucas sequências defeituosas ou mesmo nenhumas. Este facto é confirmado por meio de PAGE. Obtém-se uma banda para as sequências 1 a 4. 0 mesmo se passa no caso da sequência 5, apesar do rendimento de condensação algo pior, de 95 %. No caso das sequências 1 a 5, trata-se de produtos em bruto (tritilo-off) depois da separação do suporte. Nos casos 1 a 5 não foram realizados mais nenhuns passos de purificação. 132 Número

Sequência

Rendimento médio de condensação 6 51 -HO- (AAA AAA AAA A)*-0H 98 % 7 5 ' -HO- (AAA AAA AAA A) *-OH 100 % 8 5'-HO-(CCC CCC CCC C)*-OH 91 % 9 5'-HO-(GGG GGG GGG G)*-OH 93 % (* = protegido por 2'-0-NPEE) A sequência 6 foi sintetizada com uma fosfitamida que possui como grupo de protecção do fosfato o resíduo NPE. As sequências 7 a 9 foram preparadas como fosfitamidas que apresentam o grupo cianoetilo como protecção do fosfato. As 6 a 9 foram purificados por OPC após a separação amoniacal do suporte. São obtidas sob a sua forma tritilo-off.

Uma vez mais, também neste caso o PAGE indica um grau de pureza extraordinário dos oligorribonucleótidos 6 a 9 sintetizados. Em todos os casos obtém-se exclusivamente uma banda, isto é, os oligorribonucleótidos 6 a 9 estão isentos de sequências defeituosas. 36. Sínteses de oligorribonucleótidos com sequências mistas

5' -HO- (CUC CGG UUC GAU UCC GGA CUC GUC CAC CAU) *-0H 5'-HO-(UUG GCG UGG AGA GGU CUC CGG UUC GAU UCC GGA CUC GUC CAC CAG)*-0H (* = protegido por 2'-0-NPEE)

Utilização dos Exemplos 27, 30, 14, 21, 17 e 26. 0 tempo de condensação no caso das duas sequências foi de 700 segundos. Obtêm-se em ambos os casos rendimentos médios de condensação de 99 %. Em ambas as sínteses obtém-se um rendimento do produto de 45 %. O oligómero tríacontâmero é obtido, depois da separação do 133 t suporte, na sua forma tritilo-off em 95 D0264, o tetraconta-pentâmero como composto tritilo-on em 85 a 93 D02<S3. 0 oligonucleótido tetracontapentâmero (17,0 DO263) é submetido a purificação OPC. Obtém-se o produto purificado sob forma tritilo-off em 8,6 DO263 (rendimento 51 %) . 37. Separação do grupo de protecção 2'-0-NPEE das sequências de ARN sintetizadas. 1. Por cada 1,0 DO de oligonucleótidos são adicionados 100 μΐ de um pTsOH a 4 % (cloreto de metileno / metanol 4:1) .

Passado um tempo de reacção de duas horas, cada uma das amostras é neutralizada com solução de amoníaco 0,84 M / metanol e concentrada em evaporador rotativo Speed vac)

2. Num primeiro passo de purificação, os fragmentos de ARN livres são precipitados com acetato de sódio a partir de etanol, sob a forma de sais de Na+. Por cada 1,0 DO de oligor-ribonucleótidos adicionam-se 10 a 20 μΐ de solução de acetato de sódio 0,1 M a pH 7. Com um volume de etanol de 4 a 5 vezes provoca-se a precipitação do ARN de um dia para o outro a -40 °C. 3. Os sais de Na+ do ARN resultantes são purificados por meio de cromatografia RP-18. Os picos do produto são recolhidos e concentrados em evaporador rotativo Speed vac. A pureza dos oligorribonucleótidos livres resultantes deste processo de separação é agora verificada por meio de HPLC (RP-18) e PAGE.

Análises dos oligorribonucleótidos livres.

Os ensaios analíticos dos oligorribonucleótidos totalmente desprotegidos são realizados em material reversed-phase (RP-18) . Λ fase móvel é constituída por acetonitrilo / sistema de 134 L· t f il tampão (1:1) e tampão de acetato de tríetilamónio 0,1 M a pH 7. A coluna RP-18 é eluida com um gradiente linear desde 2,5 % até 50 % de acetonitrilo, no período de 52 minutos. O sistema tampão é preparado com água estéril.

Constantes experimentais: Bornba inteligente Merck-Hitatchi-I- -6200 100 RP-18, 5 μπι, I = 125 mm, d = 4 mm.

Fase móvel:

Tempo (min) % A 0 5 95 2 5 95 32 40 60 52 100 0 55 100 0 60 5 95 135

Foram desprotegidas as seguintes sequências:

Número do ARN protegido por 2'-0-NPEE 1 5' -HO-UUU 3 5' -HO-UUU 7 5' -HO-AAA 10 5' -HO-CCC 9 5' -HO-GGG 11 5' -HO-CUC CAU-OH

Sequência

UUU UUU U-OH UUU UUU UUU-OH AAA AAA A-OH CCC CCC C-OH GGG GGG G-OH

CGG UUC GAU UCC GGA CUC GUC CAC

12 5'-HO~UUG GCG UGG AGA GGU CUC CGG UUC GAU

UCC GGA CUC GUC CAC CAG-OH

Os cromatogramas de HPLC indicam em todos os casos um pico unitário, o que permite tirar a conclusão de que os fragmentos de ARN purificados totalmente desprotegidos apresentam um elevado grau de pureza. 38. Ensaio de estabilidade

Para verificar a estabilidade, incubaram-se os seguintes derivados de uridina em solução de HC1 0,05 N / MeOH (1:2), 30 mol, 20 °C, pH 2,0 (Quadro 1) ou em solução de ácido acético a 80 % 30 mol, 20 °C (Quadro 2) e determinou-se o período de semidesintegração para a desprotecção: 136 I----- .(% Quadro 1: (valores +/- 10 %)

137 (Ρ ^ ^-Ç*

138

U _R_ OII -ch2-ch2-s-II 0 \ /

-CH2-CH2-CN -CH2-CH2-NQ2

0,N -ch2- \ / -NO, ti/2 min 3120 3370 4030 cerca de 14000 139

Quadro 2: Valores +/- 5 %

140 f t í----

141

Abreviaturas: 4-DMAP 4-dimetilaminopiridina DMTR dimetoxitritilo NPE para-nitrofeniletoxilo NPEE 1-(para-nitrofeniletoxi)etilo NPEOC para-nitrofeniletoxicarbonilo TBDMS terc.-butildimetilsililo

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Claims (5)

1. r U, t- REIVINDICAÇÕES 1. Processo para a preparação de um composto da fórmula I

   W=P—u

   W=P—u

   c2 em que n é um número de 1 a 150; L significa oxi, sulfanodiilo ou imina; BB independentemente entre si é 1 Γ u

   t

   e Ε representa OH ou NH2 e Y representa hidrogénio, alquilo-Ci-Ch, flúor, cloro, bromo ou alcenilo-C2-C6 ou alcinilo-C2-C6; ou tíb pode significar, para além das basco 2 núcleosídicas | L-C naturais, também outras bases nucleosídicas modificadas, como 5-(hidroximetil)uridina, 5-amino--uridina, pseudo-uridina, di-hidro-uridina, inosina, 8-aza-7-desaza-adenosina, tubercidina, nebularina, xantosina, 2-aminoadeno3ina, etenoadenosina, 7-desaza-guanosina, 04-metiltim.idina, N6-metiladenosina, 06--metiIguanosina ou nucleósidos de piridoplrimidina,- W significa, independentemente entre si, oxigénio ou enxofre; T representa, independentemente entre si, hidrogénio, -OCH3, -O-CH2CH3, -0-CH2-CH=CH2 ou OH, sendo OH pelo menos uma vez; Y' representa oxi, sulfanodiilo, imina, (CH2)k ou N(CH2)k, em que k significa um número inteiro de 1 a 18; U representa hidroxilo, mercapto, SeH, alcoxilo-Ci-Cie, alquilo-Ci-Cie»· arilo-C6-C20, aril-C6-Ci4-alquilo-Ci-C8, NHR17, NR17R18 ou um resíduo da fórmula (OCH2CH2)cO(CH2)c-CH2R20, em que R17 significa alquilo-Ci-Ci8, arilo-C6-C2o, aril-C6-Ci4--alquilo-C1-Cg, - (CH2) d“ [NH (CH2-) d] d'“NR19R19, em que d significa um número inteiro de 2 a 6 e d' significa um número inteiro de 0 a 6, e R18 representa alquilo-Ci-Cis, arilo-Cg-C2o , aril-C6-Cx4~ -alquilo-Ci-Ce ou, no caso de NR17R18, em conjunto com R17 e com o átomo de azoto a que se encontram ligados significa um anel heterocíclico pentagonal ou hcxagonal, que adieionalmente pode contar um outro heteroátomo da série 0, S e N; R19 independentemente entre si significa hidrogénio ou alquilo-Ci-C6 ou alcoxil-Ci-Cí-alquilo-Ci-Cg; 3 c significa um número inteiro de 1 a 100; c' significa um número inteiro de 0 a 18; R20 significa hidrogénio ou um grupo funcional como hidroxilo, amina, NHR17, COOH, C0NH2, COOR21 ou flúor, cloro ou bromo, em que R21 é alquilo-Ci-Ch; C1 e C2 são iguais ou diferentes e representam hidrogénio, alquilo-Ci-Ci8, alcenilo-Cz-Ci8, alcinilo--C2-C18, alquil-Ci-Cie-carbonilo, alcenil-C2-Ci8~ -carbonilo, alcinil-C2-Ci8~carbonilo, arilo-Cs-C2o, aril--C6-Ci4-alquilo-Ci-C8 ou um resíduo da fórmula II W em que W possui o significado anteriormente definido; Q e Q' independentemente um do outro representam hidroxilo, mercapto, SeH, alcoxilo-Ci-C22 ou -0- (CH2) b-NR15R15, com b igual a 1 a 6 e R15 e R16 independentemente um do outro significam hidrogénio, alquilo-Ch-Che, arilo-C6-C2o, aril-Cs-Ci4--alquilo-Ci-C8, aril-C6~Ci4-alcoxilo-Ci-C8, em que arilo significa também heteroarilo e arilo possui eventualmente 1, 2 a 3 substituintes iguais ou diferentes da série carboxilo, amina, nitro, alquil-Ci-Cí-amina, alcoxilo-Cx-Ce, hidroxilo, flúor, cloro, bromo e ciano, ou significa alquil--Ci-Cis-mercapto, NHR17, NR17R18, em que R17 e R18 possuem os significados anteriormente definidos, ou em conjunto com o átomo de azoto a que se encontram ligados formam um anel triangular a hexagonal, ou 4 u, Q e Qrrepresentam um resíduo da fórmula III W -Y- Y- u w I -P-u -Y [III) g' g em que g e g' são iguais a 0 ou 1, h é igual a 0 a 10, G significa alquileno-C2~Ci2, aril-Ce-C^-dialquileno-Ci-Ce, arileno-C6-CiS, eventualmente substituído uma a três vezes por flúor, cloro, bromo, amina, hidroxilo, alquilo-Ci-Cig, alcoxilo-Ci-Ci8, alcoxi-Ci-Ci8-carbonilo, arilo-C6-Ci4, aril-C6-Ci4-alquilo-Ci-CiB ou aril-C6-Ci4--alcoxilo-Ci~C8, um grupo da fórmula (CH2CH2N' ) Í.CH2CH2 ou (CH2N')iCH2, em que i é um número inteiro de 1 a 11, e N' representa oxi, sulfanodiilo, imina ou metileno e W, U e Y' possuem os significados anteriormente definidos; ou Q e Q' significam um grupo que favorece a assimilação intracelular ou que serve de marcação de uma sonda de ADN ou que inicia a reticulação ou a cisão de análogos de oligonucleótidos durante a hibridação destes aos ácidos nucleicos alvo, podendo também na fórmula I a sequência de ácidos nucleicos ser interrompida uma ou 5 várias vezes por adaptadores da fórmula III e podendo formar conjugados segundo processos conhecidos também por meio de bases nucleicas ou por meio da espinha dorsal de diésteres fosfóricos ou diésteres fosfotiónicos; caracterizado por a) se proteger um composto da fórmula IV

   (IV) em que B representa

   6

   em que R3 significa em cada caso independentemente um grupo da fórmula o, ou V_/^A V-ΧΛ o. -O-CH,-CH- R4 representa hidrogénio ou 2-(p-nitrofenil)etilo; R5 significa 7 OU / CH\

   O-CH2 ch2-

   no2

   Y possui o significado anteriormente definido; ou B pode, para além das bases nucleosídicas naturais, também representar outras bases nucleosídicas modificadas, cujos grupos amina ou hidroxilo estão protegidos por grupos protectores apropriados, como o grupo para-nitrofeniletiloxicarbonilo, o grupo benzoílo e o grupo para-(t-butil)benzoílo para os grupos hidroxilo e os grupos benzoílo, para-(t-butil)benzoílo, para-nitrofeniletiloxicarbonilo, isobutirilo, para- -(Lerc-butil)fenilacetilo para os grupos amina, nas posições 3' e 5' de acordo com processos conhecidos; b) em seguida fazer reagir o composto protegido com o éter vinílico da fórmula V, 8

   u

   ΐ

   (V) em que r significa 1 ou 2 e X representa arilo-C6-Ci2, em que arilo pode possuir um ou mais substituintes seleccionados de hidroxilo, mercapto, nitro, flúor, cloro, bromo, alquilo-Ci-C6, alcoxilo-Ci-Ce, alquil-Ci-Cg-mercapto, alcenilo-Ca-Ce, alcinilo-C3-Ce, C(0)0H, C(0)NH2, C (0) O-alquilo-Ci-Cis, C (O) 0-arilo-C6-Ci2, C (O)-alquilo-Cx-Cis, C(0)-arilo--C6-Ci2, 0-C(0)NH2, 0-C(0)0-alquilo-Ci-Ci8, 0-C(0)0- -arilo-C6-Ci2, 0-C (0)-alquilo-Ci~Ci8, 0-C (0)-arilo-C6-Ci2, 0-C (0) - [Cl^lr-X1 ou O-CÍOO-t^lr-X1, sendo X1 = arilo--Ce-Ci?, que pode eventualmente conter um a três substituintes seleccionados de amina, hidroxilo, nitro, alquilo-Ci-Cg, alcoxilo-Ci-Csr alcoxi-Ci-Cô-carbonilo, flúor, cloro ou bromo; quando r=l, X representa ainda fenilo ou alcoxil-Ci-Cí--fenilo; quando r=2, X representa ainda CN, S-fenilo, S02-fenilo, N-ftalimida ou N02; de modo análogo a processos conhecidos e efectuar o processamento final igualmente de acordo com processos conhecidos; c) cindir novamente os grupos protectores em 5' e em 3', igualmente por analogia com processos conhecidos; d) introduzir o grupo protector em 5' com R2 = dimetoxitritilo, monometoxitritilo, pixilo ou tritilo de acordo com processos conhecidos, obtendo-se deste modo um composto da fórmula VI 9 Ρ

   \ Ο

   (VI) em que R1 representa -[CH2]r-X/ em que r e X possuem os significados anteriormente definidos; R2 representa dimetoxitritilo, monometoxitritilo, pixilo ou tritilo; e B possui o significado anteriormente definido; e) fazer reagir o composto da fórmula VI com um composto da fórmula VII

   (VII) em que Z' representa OR9 ou alquilo-Ci-Ci8, alcoxilo-Ci-Cie, arilo--C6-C2o ou aril-C6-Ci4-alquilo-Ci-C8; R7 e R8 são iguais ou diferentes e significam alquilo-Ci-Cs ou cicloalquilo-C5-Ci2, benzilo ou fenilo ou, em conjunto com 0 átomo de azoto a que se encontram ligados, um anel heterociclico saturado ou insaturado, com eventualmente outros heteroátomos e substituintes; e R9 representa um grupo da fórmula 10

   -ch2—-ch2

   no2 CH2—CH2—C=N Cl

   CH3 ou um grupo benzilo, o qual não possui substituintes ou possui um a quatro substituintes no anel, em que o ou os substituinte(s) é (são) independentemente entre si flúor, cloro, bromo ou um grupo (grupos) alquilo-Ci-C4, nitro, metoxilo ou carboxilo; Z representa cloro ou bromo ou um resíduo da fórmula NR7R8, em que R7 e R8 possuem os significados anterior-mente definidos; na presença de uma base com uma trialquil-Ci-C4~amina ou, quando Z é um resíduo da fórmula NR7R8, então na presença de um composto da fórmula [HNR12R13R14] (+)AM, em que R12, R13 e R14 podem ser iguais ou diferentes e significam um grupo alquilo-Ci-C4 e A = flúor, cloro ou bromo, em especial cloro, ou tetrazolo, obtendo-se um composto da fórmula VIII

   (VIII) em que R1, R2, R7, R8, Z' e B possuem os significados anteriormente definidos; lazer-se reagir o composto VI obtido segundo d) por 11

   meio de processos conhecidos com 1 a 10 equivalentes de um adaptador, como anidrido sncoinico, num solvente orgânico apropriado, eventualmente após adição de um catalisador, obtendo-se um composto da fórmula IX

   em que R1, R2 e B possuem os significados anteriormente definidos, e em seguida processar de acordo com processos conhecidos, em que o resíduo de ácido succínico na posição 3' serve de adaptador para estes na síntese dos polímeros de suporte utilizados e em alternativa aos adaptadores de ácido succínico podendo ser utilizados também outros adaptadores; g) acoplar o composto da fórmula X

   O (X) em que R2 e B possuem os significados anteriormente definidos; V representa hidrogénio, 0-alquilo-Cx-CiB, O-alconilo--Ci-Cie, O-alcinilo-Ci-Cie ou -O-CH (CH3) -OR1, em que R1 possui o significado anteriormente definido, de acordo com processos conhecidos, ao suporte sólido; 12 L-ij h) cindir o grupo protector em 5' de acordo com processos conhecidos; i) fazer reagir o composto obtido com um composto da fórmula XI

   Z' em que R1 2 3 4 5, R7, R8, V, Z' e B possuem os significados anteriormente definidos e j) oxidar o composto obtido de acordo com processos conhecidos; k) repetir as fases de reacção h a j até ao comprimento de cadeia pretendido; 13 1 retirar o oligonucleótido do suporte por meio de 2 processos conhecidos e cindir os grupos protectores no 3 fosfato e bases nucleotidicas igualmente de acordo com 4 processos conhecidos, obtendo-se o composto da fórmula 5 XII

   em que n, L, BB, W, V, Y', U, C1 e C1 possuem os significados anteriormente definidos; m) incubar o composto da fórmula XII em meio ácido com uma solução de ácido p-toluenossulfónico a 1 a 30 % num solvente orgânico apropriado durante 0,5 a 10 h, em seguida neutralizar e após a remoção do solvente por evaporação e depois de purificar obter o composto da fórmula I. 14 1 Composto da fórmula VI

   em que B, R1 e R2 possuem os significados definidos na reivindicação 1.
2. 3. Composto da fórmula VI de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por R1 representar -[CH2]r-X/ em que quando r = 1, X representa arilo-C6-Ci2, em que arilo pode conter um a três substituintes seleccionados de flúor, cloro, bromo, alquilo-Ci~C4, alcoxilo-Ci-C4, O-C (0) - tCH2]r-X1 ou 0-C(0)0-[CH2]r-x\ sendo X1 = arilo--C6-Ci2, que pode eventualmente conter iam a três substituintes seleccionados de alquilo-Ci~C4, alcoxilo--C1-C4, flúor, cloro ou bromo, quando r = 2, X representa de preferência 4-nitrofenilo e R2 representar dimetoxitritilo.
3. 4. Composto da fórmula VIII 15

   em que B, Z', R1, Rz, R7 e R8 possuem os significados definidos na reivindicação 1. Composto da fórmula VIII de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por R1 representar -[CH2]r-X e quando r = 1, X representar arilo-C6-Ci2, em que arilo pode conter um a três substituintes seleccionados de flúor, cloro, bromo, alquilo-Ci-C,j, alcoxilo-Ci-C4, O-CÍOJ-tC^r-X1 ou 0-C (0) 0- [CH2] r-^1, sendo X1 = arilo--C6-C12, que pode eventualmente conter um a três substituintes seleccionados de alquilo-Ci-C4, alcoxilo--C1-C4, flúor, cloro ou bromo; quando r = 2, X representar de preferência 4-nitro-fenilo; R2 representar dimetoxitritilo; Z' representar OR9; R7 e R8 serem iguais ou diferentes e significarem iso-propilo, cicloalquilo-C5-CB, benzilo ou fenilo ou, em conjunto com o átomo de azoto a que se encontram ligados, um anel heterocíclico saturado ou insaturado, que pode conter eventualmente outros heteroátomos, como morfolina, e substituintes, como ésteres de 0(C)0--alguilo-Ci-Cd; e 16

   Y representar hidrogénio, CH3 ou 1-propinilo.

   t
4. 6. Composto das fórmulas VI e VIII de acordo com as reivindicações 2 a 5, caracterizado por B representar
5. 7. Composto da fórmula XII

   17 c1 \ L· .0. BB

   0 V 1 W=P—u BB O-\ o.

   O W=P-U ,o. n -BB (XII) V Y c2 caracterizado por

   V independentemente entre si, representar hidrogénio, -O-alquilo-Ci-Cis, -O-alcenilo-Ci-Cis, -0-alcinilo-Ci-Ci8 ou -O-CH (CH3)-OR1, em que R1 possui o significado definido na reivindicação 1, representando pelo menos uma vez -O-CH(CH3)-OR1; Y' representar oxi, sulfanodiilo, imina, (CH2)k ou N(CH2)k, em que k significa um número inteiro de 1 a 18; 18 e BB, C1, C2, L, V, W, U, Yf e n possuem os significados definidos na reivindicação 1. Lisboa, 31 de Maio de 2001 O AGENTE OFICIAL DA PROPRIEDADE INDUSTRIAL

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