PT2467366E - Novos compostos moduladores da actividade e ligação de fxr (nr1h4 - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

"NOVOS COMPOSTOS MODULADORES DA ACTIVIDADE E LIGAÇÃO DE FXR (NR1H4)" A presente invenção refere-se a compostos que se ligam ao receptor NR1H4 (FXR) e actuam como agonistas ou moduladores do receptor NR1H4 (FXR). A invenção refere-se ainda à utilização dos compostos para o tratamento e/ou profilaxia de doenças e/ou estados através da ligação do referido receptor nuclear pelos referido compostos.

Os organismos multicelulares são dependentes de mecanismos avançados de transferência de informação entre as células e os compartimentos do corpo. A informação que é transmitida pode ser altamente complexa e pode resultar na alteração de programas genéticos envolvidos na diferenciação, proliferação ou reprodução celular. Os sinais, ou hormonas, são muitas vezes moléculas de baixo peso molecular, tais como péptidos, ácidos gordo ou derivados de colesterol.

Muitos destes sinais produzem os seus efeitos basicamente alterando a transcrição de genes específicos. Um grupo de proteínas bem estudado que medeia a resposta de uma célula a uma variedade de sinais é a família de factores de transcrição conhecidos como receptores nucleares, aqui a seguir referidos muitas vezes como "NR". Os elementos deste grupo incluem receptores para hormonas esteróides, vitamina D, ecdisona, ácido retinóico cis e trans, hormona da tiróide, ácidos biliares, derivados de colesterol, ácidos gordos (e outros proliferadores peroxissomais) , bem como os denominados receptores órfãos, proteínas que são estruturalmente semelhantes a outros membros deste grupo, mas para as quais não existem ligandos conhecidos. Os receptores órfãos podem ser indicativos de vias de sinalização desconhecidas na célula ou podem ser receptores nucleares que funcionam sem activação do ligando. A activação da transcrição por alguns desses receptores órfãos pode ocorrer na ausência de um ligando exógeno e/ou através de vias de transdução de sinal originárias da superfície celular (D. Mangelsdorf et al., "The nuclear receptor superfamily: the second decade", Cell 1995, 83(6), 835-839; R. Evans "The nuclear receptor superfamily: a rosetta stone for physiology" Mol.

Endocrinol. 2005, 19(6), 1429-1438).

Em geral, três domínios funcionais foram definidos nos NR. Pensa-se que um domínio amino-terminal tenha alguma função regulatória. É seguido por um domínio de ligação a ADN, aqui a seguir referido como "DBD", o qual compreende normalmente dois elementos dedo de zinco e reconhece um Elemento Responsivo Hormonal específico, aqui a seguir referido como "HRE", dentro dos promotores de genes responsivos. Demonstrou-se que resíduos de aminoácidos específicos no "DBD" conferem à sequência de ADN especificidade de ligação (M. Schena "Mammalian glucocorticoid receptor derivatives enhance transcription in yeast", Science 1988, 241 (4868), 965-967). Um domínio de ligação ao ligando, aqui a seguir referido como "LBD", está na região carboxi-terminal de NR conhecidos.

Na ausência de hormona, o LBD parece interferir com a interacção do DBD com o seu HRE. A ligação da hormona parece resultar numa alteração de conformação no NR e, por este motivo, abre esta interferência (A. Brzozowski et al. , "Molecular basis of agonism and antagonism in the oestrogen receptor" Nature 1997, 389(6652), 753-758). Um NR sem o LBD activa constitutivamente a transcrição mas a um nivel baixo. É proposto que os co-activadores ou activadores transcripcionais façam a ponte entre os factores de transcrição específicos da sequência, a maquinaria de transcrição basal e, além disso, influenciem a estrutura de cromatina de uma célula alvo. Diversas proteínas, como SRC-1, ACTR e Gripl, interagem com NR de um modo melhorado pelo ligando (D. Heery et al. , "A signature motif in transcriptional co-activators mediates binding to nuclear receptors" Nature 1997, 387(6634), 733-736; T. Heinzel et al., "A complex containing N-CoR, mSin3 and histone deacetylase mediates transcriptional repression" Nature 1997, 387(6628), 16-17; K. Nettles, G. Greene "Ligand control of coregulator recruitment to nuclear receptors" Annu. Rev.

Physiol. 2005, 67, 309-333).

Os moduladores de receptor nuclear, como hormonas esteróides, afectam o crescimento e função de células específicas por ligação a receptores intracelulares e formação de complexos de receptor nuclear - ligando. Os complexos de receptor nuclear - ligando interagem depois com um elemento de resposta hormonal (HRE) na região de controlo de genes específicos e alteram a expressão de genes específicos (A. Aranda, A. Pascual "Nuclear hormone receptors and gene expression" Physiol. Rev. 2001, 81(3), 1269-1304). 0 Receptor X de farnesóides alfa (aqui a seguir também referido muitas vezes como NR1H4 quando fazendo referência ao receptor humano) é um receptor nuclear tipo 2 prototípico, o qual activa os genes após ligação à região promotora de genes alvo de um modo heterodimérico com Receptor X de Retinóides (B. Forman et al.f "Identification of a nuclear receptor that is activated by farnesol metabolites" Cell 1995, 81 (5), 687-693).

Os ligandos fisiológicos relevantes de NR1H4 são ácidos biliares (D. Parks et al., "Bile acids: natural ligands for an orphan nuclear receptor" Science 1999, 284(5418), 1365-1368; M. Makishima et al. , "Identification of a nuclear receptor for bile acids" Science 1999, 284(5418), 1362-1365). 0 mais potente é o ácido quenodesoxicólico (CDCA), o qual regula a expressão de diversos genes que participam na homeostase do ácido biliar. 0 farnesol e derivados, em conjunto denominados farnesóides, são descritos originalmente para activar o ortólogo de rato em elevada concentração, mas estes não activam o receptor humano ou de murganho. 0 FXR é expresso no fígado, ao longo de todo o tracto gastrointestinal, incluindo o esófago, estômago, duodeno, intestino delgado, cólon, ovário, glândula adrenal e rim. Além de controlar a expressão génica intracelular, o FXR parece estar também envolvido na sinalização parácrina e endócrina através da regulação positiva da expressão do Factor 15 de Crescimento de Fibroblastos de citocina (roedores ou 19 (macacos, humanos, J. Holt et al., "Definition of a novel growth factor-dependent signal cascade for the suppression of bile acid biosynthesis" Genes Dev. 2003, 17(13), 1581-1591; T. Inagaki et al., "Fibroblast growth factor 15 functions as an enterohepatic signal to regulate bile acid homeostasis" Cell Metab. 2005, 2(4), 217-225) .

Existe uma publicação que propõe um impacto directo da activação de FXR na sobrevivência de organismos infecciosos, tais como bactérias ou parasitas protozoários, por meio da regulação positiva do factor lisossomal destino/sobrevivência Taco-2 em macrófagos (P. Anandet et al., "Downregulation of TACO gene transcription restricts mycobacterial entry/survival within human macrophages" FEMS Microbiol. Lett. 2005, 250(1), 137-144). Isto pode abrir caminho para futuros estudos que avaliem a adequabilidade de FXR para actuar como alvo de fármaco para o tratamento de infecções intracelulares bacterianas ou parasiticas, tais como Tuberculose, Lepra, Leishmaniose ou Tripanossomiase, e. g., Doença de Chagas.

Os compostos moleculares pequenos, os quais actuam como moduladores de FXR foram divulgados nas publicações seguintes: documentos WO 2000/037077, WO 2003/015771, WO 2004/048349, WO 2007/076260, WO 2007/092751, WO 2007/140174, WO 2007/140183, WO 2008/051942, WO 2008/157270, WO 2009/005998, WO 2009/012125, WO 2008/025539, e WO 2008/025540. Moduladores de FXR moleculares pequenos foram recentemente revistos (R. C. Buijsman et al., "Non-Steroidal Steroidal Receptor Modulators" Curr. Med. Chem. 2005, 12, 1017-1075) . O documento WO 2000/037077 divulga compostos da seguinte fórmula geral

em que Xi é CH, N; X2 é O ou NH; R e Ri são, independentemente, H, alquilo inferior, halogéneo ou CF3; R2 é alquilo inferior; R3 e R4 são, independentemente, H, alquilo inferior, halogéneo, CF3, OH, O-alquilo ou O-poli-haloalquilo.

Numa forma de realização mais preferida o documento WO 2000/037077 divulga o composto GW4064

o qual foi também publicado, em primeiro lugar, em Maloney et al., "Identification of a chemical tool for the orphan nuclear receptor FXR" J. Med. Chem. 2000, 43(16), 2971-2974.

Akwabi-Ameyaw et al. , "Conformationally constrained Farnesoid X Receptor Agonists: Naphtoic acid-based analogs of GW4064",

Bioorg. Med. Chem. Lett. 2008, 18(15), 4339-4343 menciona as potenciais susceptibilidades deste agonista de FXR. De acordo com a publicação, o GW4064 apresenta pobre farmacocinética com uma baixa biodisponibilidade oral e uma baixa exposição plasmática, em conjunto com uma curta semi-vida no plasma. Além disso, uma porção de trans-estilbeno desta molécula e agonistas de FXR relacionados do documento WO 2000/037077 colocam a questão de um potencial toxicóforo como abordado em Kuo et al. "Induction of drugmetabolizing enzymes and toxicicity of trans-stilbene oxide in rat liver e kidney." Toxicology 1981, 22(2), 149-160 e em Sugihara et al., "Metabolic activation of the proestrogens trans-stilbene and trans-stilbene oxide by rat liver microsomes.", Toxicol. Appl. Pharmacol. 2000, 167(1), 46-54. Por fim, os autores de Akwabi-Ameyaw et al. , mencionam que a porção de trans-estilbeno de GW4064 é responsável pela sua instabilidade à luz ultravioleta. A foto-instabilidade pode transformar-se em fototoxicidade se o composto, quando administrado a humanos, for exposto a luz UV, e. g. , por deposição ou acumulação na pele (ver Colerangle JB. "Regulatory non-clinical photosafety evaluation - An attempt to merge the FDA and EMEA photosafety testing strategies." Regul. Toxicol. Pharmacol., 16 de Jul de 2009. [publicação electrónica antes da impressão] e Henry et al., "Can light absorption and photostability data be used to assess the photosafety risks in patients for a new drug molecule?" J. Photochem. Photobiol. B. 2009, 96 (1), 57-62) .

Por outro lado, este trans-estilbeno conjugado é a base para a actividade do GW4064, uma vez que os autores mencionam que a simples redução da ligação dupla para um grupo etileno resulta numa redução nas propriedades de ligação do ligando de FXR.

Consequentemente é o objectivo da presente invenção proporcionar uma solução técnica para ultrapassar as susceptibilidades da porção de trans-estilbeno contendo agonistas de FXR divulgada no documento WO 2000/037077, enquanto mantém ou até melhora a potência de ligação a FXR em oposição à redução na actividade de ligação a FXR que é observada com os análogos do ácido naftóico de GW4064 que são descritos em Akwabi-Ameyaw et al.

Este objectivo foi resolvido pela provisão de compostos da reivindicação 1. Formas de realização preferidas são divulgadas nas reivindicações, bem como na seguinte descrição. A presente invenção utiliza a conversão da dupla ligação de trans-estilbeno numa porção de ciclopropilo, a qual pode ser alcançada pela adição de carbeno, produzindo compostos que apresentam uma eliminação completa surpreendente da foto-capacidade induzida por UV, enquanto, ao mesmo tempo, ultrapassa as propriedades potencialmente tóxicas do trans-estilbeno. As misturas racémicas que são obtidas monitorizam as propriedades agonisticas de FXR que são semelhantes aos valores que são obtidos com as respectivas moléculas contendo trans-estilbeno. Além disso, a separação quiral das misturas racémicas produziu enantiómeros únicos que mostraram propriedades de ligação e transactivação de FXR ainda superiores, ao contrário das correspondentes moléculas contendo trans-estilbeno ou dos análogos de ácido naftóico relacionados que estão publicadas em Akwabi-Ameyaw et al. Assim a presente invenção proporciona uma solução superior para o problema de susceptibilidade técnica que é exercido pelos compostos de FXR contendo trans-estilbeno, como oposto a outras soluções técnicas como publicado em Akwabi-Ameyaw et al.

Os compostos da presente invenção partilham uma estrutura química comum de acordo com a fórmula (1).

em que R é seleccionado do grupo consistindo de COOR6, CONR7R8, tetrazolilo ou H, com R6 independentemente seleccionado do grupo consistindo de H, ou alquilo Ci-6 e R7 e R8, independentemente um do outro, seleccionados do grupo consistindo de H, alquilo Ci_6, haloalquilo Ci_6, alquileno-Rg Ci_6, S02-alquilo Ci_6, em que Rg é seleccionado do grupo consistindo de COOH, OH, ou S03H; A é seleccionado do grupo consistindo de fenilo, piridilo, pirazolilo, indolilo, tienilo, benzotienilo, indazolilo, benzisoxazolilo, benzofuranilo, benzotriazolilo, furanilo, benzotiazolilo, tiazolilo, cada opcionalmente substituído com urn ou dois grupos independentemente seleccionados do grupo consistindo de OH, alquilo Ci-6, cicloalquilo C3-6 ou halogéneo; Q é seleccionado do grupo consistindo de fenilo, piridilo, tiazolilo, tiofenilo, pirimidilo, cada opcionalmente substituído com um ou dois grupos independentemente seleccionados do grupo consistindo de alquilo Ci-6, halogéneo ou CF3;

em que X = CH, N, NO;

Ri é seleccionado do grupo consistindo de hidrogénio, alquilo Ci-C3, cicloalquilo C3-C6, alquilcicloalquilo C4-C5, em que alquilo C3-3 é opcionalmente substituído com 1 a 3 substituintes independentemente seleccionados de halogéneo, hidroxilo ou alcoxilo Ci-e’, R2 e R3 são independentemente seleccionados do grupo consistindo de hidrogénio, alquilo C3-C3, haloalquilo C3-C3, alcoxilo C3-C3, haloalcoxilo C3-C3 e halogéneo.

Na presente invenção o termo alquilo Ci-6 define um grupo alquilo que pode ser linear ou ramificado, de um modo preferido, linear e contém desde 1 a 6, de um modo preferido, desde 1 a 4 átomos de carbono. Os exemplos preferidos são metilo e etilo, isopropilo e t-butilo. 0 termo cicloalquilo C3-6 define um grupo cicloalquilo com desde 3 a 6 átomos de carbono. Ciclopropilo é particularmente preferido. Os exemplos de átomos de halogéneo empregues na presente invenção como substituintes como referido abaixo são F, Cl e Br, com Cl sendo preferido.

Numa forma de realização preferida, em combinação com quaisquer formas de realização acima e abaixo, os compostos da presente invenção são representados por uma estrutura de acordo com a fórmula (1).

em que R é seleccionado do grupo consistindo de COOR6, CONR7R8, tetrazolilo ou H, com R6, R7 e R8 independentemente seleccionados do grupo consistindo de H e alquilo Ci-6; A é seleccionado do grupo consistindo de fenilo, piridilo, indolilo, tienilo, benzotienilo, indazolilo, benzisoxazolilo, benzofuranilo, benzotriazolilo, furanilo, benzotiazolilo, tiazolilo, cada opcionalmente substituído com um ou dois grupos independentemente seleccionados do grupo consistindo de OH, alquilo Ci-6 e cicloalquilo C3-6; Q é seleccionado do grupo consistindo de fenilo, piridilo, tiazolilo, tiofenilo, pirimidilo, cada opcionalmente substituído com um ou dois grupos independentemente seleccionados do grupo consistindo de alquilo Ci-6, halogéneo e CF3;

em que X = CH, N, NO; RI é seleccionado do grupo consistindo de hidrogénio, alquilo C1-C3, haloalquilo C1-C3, cicloalquilo C3-C6, alquilcicloalquilo C4-C5; R2 e R3 são independentemente seleccionados do grupo consistindo de hidrogénio, alquilo C1-C3, haloalquilo C1-C3, alcoxilo C1-C3, haloalcoxilo C1-C3 e halogéneo.

De um modo preferido, R é seleccionado entre COOR6 e CONR7R8, em que R6, R7 e Rs são como definido acima, de um modo mais preferido, R é COORô, em que R6 é como definido acima, de um modo preferido, R6 é seleccionado entre H e alquilo Ci-6.

Numa forma de realização igualmente mais preferida, R é CONR7R8, em que R7 e R8 são como definido acima, de um modo mais preferido, R7 e R8 são, independentemente um do outro, seleccionados de H, alquilo inferior, alquileno-Rg C1-6, e S02-alquilo Ci-6, em que Rg é seleccionado do grupo consistindo de COOH e S03H. A é, de um modo preferido, seleccionado entre estas porções como identificadas acima, as quais não estão substituídas. De um modo mais preferido A é fenilo.

Numa forma de realização alternativa preferida em combinação com qualquer das formas de realização acima e abaixo, A é, de um modo preferido, seleccionado entre as porções heterocíclicas piridilo, pirazolilo, benzisoxazolilo e indazolilo, pelo que A não está substituído ou está substituído com um ou dois grupos independentemente seleccionado de OH, alquilo Ci_5, cicloalquilo C3-5 e halogéneo. Q é, de um modo preferido, seleccionado entre estas porções como identificadas acima, substituídas com um substituinte. De um modo preferido o substituinte é um halogéneo, de um modo mais preferido, Cl. Em particular, Q é fenilo substituído com um halogéneo, de um modo preferido Cl.

Numa forma de realização alternativa preferida em combinação com qualquer das formas de realização acima e abaixo, Q é um grupo piridilo, o qual não está substituído ou está substituído com um ou dois grupos, de um modo preferido, um grupo independentemente seleccionado do grupo consistindo de alquilo Ci_6, halogéneo e CF3.

Numa forma de realização preferida em combinação com qualquer das formas de realização acima e abaixo, Z é seleccionado entre as seguintes porções:

De um modo ainda mais preferido, Z é a seguinte unidade:

Além disso, Z é, de um modo preferido, seleccionado entre as estruturas identificadas acima onde X é CH. De um modo mais preferido, Z é, de um modo preferido, seleccionado entre as estruturas identificadas acima onde X é CH e Ri é um grupo cicloalquilo, de um modo preferido, ciclopropilo. De um modo ainda mais preferido, Z é, de um modo preferido, seleccionado entre as estruturas identificadas acima onde X é CH e Ri é um grupo cicloalquilo, de um modo preferido, ciclopropilo, e R2 e R3 representam, cada, halogéneo, de um modo muito preferido, Cl. A forma de realização mais preferida para Z é como definido acima, onde o esqueleto heterocíclico principal é a terceira estrutura identificada acima, compreendendo um anel de cinco membros com uma unidade 0-N.

Numa forma de realização igualmente preferida em combinação com qualquer das formas de realização acima e abaixo, Z é, de um modo preferido, seleccionado entre as estruturas identificadas acima onde X é N ou NO, de um modo mais preferido, X é N.

Numa forma de realização preferida em combinação com qualquer das formas de realização acima e abaixo, Ri é seleccionado do qrupo consistindo de hidrogénio, alquilo C1-3, cicloalquilo C3-6 e alquilcicloalquilo C4-5, em que alquilo C1-3 não está substituído ou está substituído com 1 a 3 substituintes, de um modo preferido, 1 ou 2 substituintes, independentemente seleccionados de halogéneo ou hidroxilo.

As combinações preferidas de R, A, Q e Z são como definido acima e a presente invenção contempla todas as combinações das formas de realização preferidas como listado acima. Numa forma de realização particular preferida R é COOR8, em que R6 é como definido acima, de um modo preferido, R6 é seleccionado entre H e alquilo Ci-6; A é fenilo; Q é seleccionado entre aquelas porções como identificado acima, substituídas com um substituinte, de um modo preferido, o substituinte é um halogéneo, de um modo mais preferido, Cl e, em particular, Q é fenilo substituído com um halogéneo, de um modo preferido, Cl; e Z é seleccionado entre as estruturas identificadas acima, onde X é CH e Ri é um grupo cicloalquilo, de um modo preferido, ciclopropilo e R2 e R3 representam, cada, halogéneo, de um modo muito preferido, Cl.

Numa forma de realização mais preferida da presente invenção, os compostos possuem uma estrutura comum de acordo com a fórmula (2)

em que

Xi é seleccionado entre CH e N, de um modo preferido, CH; R4 e R5 são independentemente seleccionados do grupo consistindo de H, alquilo Ci-6, halogéneo ou CF3, de um modo preferido, halogéneo, de um modo mais preferido Cl.

Os compostos ainda mais preferidos das fórmulas (1) ou (2) que partilham uma estrutura onde R-A é seleccionado de

ou em que na fórmula (1) ou (2) R4 é seleccionado de um grupo consistindo de isopropilo, t-butilo e ciclopropilo; R2 e R3 são independentemente seleccionados do grupo consistindo de halogéneo, alquilo C1-C3, metoxilo e trifluorometoxilo, de um modo preferido, halogéneo e, de um modo muito preferido, Cl.

Os compostos da invenção mais preferidos são como se segue. ácido 3-((2- (2-cloro-4-((5-ciclopropil-3- (2,6- diclorofenil)isoxazol-4-il)metoxi)fenil)ciclopropil)benzóico, ácido (-)-3-((2-(2-cloro-4-((5-ciclopropil-3- (2,6- diclorofenil)isoxazol-4-il)metoxi)fenil)ciclopropil)benzóico, ácido ( + )-3- (2- (2-cloro-4-((5-ciclopropil-3- (2,6- diclorofenil)isoxazol-4-il)metoxi)fenil)ciclopropil)benzóico, ácido 3-((2-(2-cloro-4-((3-(2,6-diclorofenil)-5- isopropilisoxazol-4-il)metoxi)fenil)ciclopropil)benzóico, ácido 3-((2-(2-cloro-4-((5-ciclopropil-3-(3,5-dicloropiridin-4-il)isoxazol-4-il)metoxi)fenil)ciclopropil)benzóico, 1-óxido de 4-((4-((4-(2-(3-carboxifenil)ciclopropil)-3- clorofenoxi)metil)-5-ciclopropilisoxazol-3-il)-3,5-dicloropiridina, ácido 3- ( (2- (2-cloro-4- ( (1- (2, 6-diclorof enil) -4-isopropil-lfí- l,2,3-triazol-5-il)metoxi)fenil)ciclopropil)benzóico, 4-(((4-(2-(6-(lH-tetrazol-5-il)piridin-3-il)ciclopropil)-3-clorofenoxi)metil)-5-ciclopropil-3-(2,6-diclorofenil)isoxazole, ou ácido 5-((2-(2-cloro-4-((5-ciclopropil-3- (2,6- diclorofenil)isoxazol-4-il)metoxi)fenil)ciclopropil)picolinico.

Igualmente mais preferidos são os compostos da invenção como se segue. ácido 3-((2-(6- ( (5-ciclopropil-3-(2,6-diclorofenil)isoxazol-4-il)metoxi)-2-(trifluorometilpiridin-3-il)ciclopropil)benzóico, ácido 4- ( (2- (2-cloro-4-((5-ciclopropil-3- (2,6- diclorofenil)isoxazol-4-il)metoxi)fenil)ciclopropil)benzóico, 4-(2-(2-cloro-4-((5-ciclopropil-3-(2,6-diclorofenil)isoxazol-4-il)metoxi)fenil)ciclopropil)benzoato de 1,3-di-hidroxi-2- (hidroximetil)propan-2-aminio, ácido ( + )-4-(2-(2-cloro-4-((5-ciclopropil-3- (2,6- diclorofenil)isoxazol-4-il)metoxi)fenil)ciclopropil)benzóico, ácido (-)-4-((2-(2-cloro-4-((5-ciclopropil-3- (2,6- diclorofenil)isoxazol-4-il)metoxi)fenil)ciclopropil)benzóico, ácido 6-((2-(2-cloro-4-((5-ciclopropil-3-(2,6- diclorofenil)isoxazol-4-il)metoxi)fenil)ciclopropil)-1-metil-lH-indazole-3-carboxílico, ácido ( + )-6- (2- (2-cloro-4-((5-ciclopropil-3- (2,6- diclorofenil)isoxazol-4-il)metoxi)fenil)ciclopropil)-1-metil-lH-indazole-3-carboxílico, ácido (-)-6- ( (2- (2-cloro-4-((5-ciclopropil-3- (2,6- diclorofenil)isoxazol-4-il)metoxi)fenil)ciclopropil)-1-metil-lH-indazole-3-carboxilico, 4- ( (2- (2-cloro-4-( (5-ciclopropil-3-(2,6-diclorofenil)isoxazol-4-il)metoxi)fenil)ciclopropil)-N-(metilsulfonil)benzamida, ácido 2-((4-(2-(2-cloro-4-((5-ciclopropil-3- (2,6- diclorofenil)isoxazol-4-il)metoxi)fenil) ciclopropil)benzamido)etanossulfónico, 4-((4-(2-(4-(lH-tetrazol-5-il)fenil)ciclopropil)-3-clorofenoxi)metil)-5-ciclopropil-3-(2,6-diclorofenil)isoxazole, ácido 4-((2-(2-cloro-4-((3-(2,6-diclorofenil)-5-(2- hidroxipropan-2-il)isoxazol-4-il)metoxi)fenil)ciclopropil)benzóico, ácido 5- ( (2- (2-cloro-4- ( (5-ciclopropil-3- (2,6- diclorofenil)isoxazol-4-il)metoxi)fenil)ciclopropil)-1-isopropil-lH-pirazole-3-carboxilico, ácido 6-((2-(2-cloro-4-( (5-ciclopropil-3- (2,6- diclorofenil)isoxazol-4-il)metoxi)fenil)ciclopropil)-1-isopropil-lH-indazole-3-carboxilico, ácido 4-((2-(2-cloro-4-((5-ciclopropil-3- (2,6- diclorofenil)isoxazol-4-il)metoxi)fenil)ciclopropil)-2,6-dimetilbenzóico, ácido 4-((2-(2-cloro-4-((5-ciclopropil-3- (2- (trifluorometoxi)fenil)isoxazol-4-il)metoxi)fenil)ciclopropil)benzóico, ácido ( + )-2-(4-(2-(2-cloro-4-((5-ciclopropil-3- (2,6- diclorofenil)isoxazol-4-il)metoxi) fenil)ciclopropil)benzamido)etanossulfónico, ácido (-)-2-((4-(2-(2-cloro-4-((5-ciclopropil-3-(2,6- diclorofenil)isoxazol-4-il)metoxi)fenil) ciclopropil)benzamido)etanossulfónico, ácido 2- ( (4- (2- (2-cloro-4-((5-ciclopropil-3- (2,6- diclorofenil)isoxazol-4-il)metoxi)fenil) ciclopropil)benzamido)acético, ou ácido 4-((2-(2-cloro-4-((4-(2,6-diclorofenil)-1-isopropil-lH- l,2,3-triazol-5-il)metoxi)fenil)ciclopropil)benzóico.

Os compostos descritos anteriormente podem estar na forma de um composto profármaco. "Composto profármaco" significa um derivado que é convertido num composto de acordo com a presente invenção por uma reacção com uma enzima, ácido gástrico ou semelhantes, sob um estado fisiológico no corpo vivo, e. g., por oxidação, redução, hidrólise ou semelhantes, cada das quais é realizada enzimaticamente. Exemplos do profármaco são compostos, em que o grupo amino num composto da presente invenção é acilado, alquilado ou fosforilado para formar, e. g., eicosanoilamino, alanilamino, pivaloiloximetilamino ou em que o grupo hidroxilo é acilado, alquilado, fosforilado ou convertido no borato, e. g. , acetiloxilo, palmitoiloxilo, pivaloiloxilo, succiniloxilo, fumariloxilo, alaniloxilo ou em que o grupo carboxilo é esterifiçado ou amidado. Estes compostos podem ser produzidos a partir de compostos da presente invenção de acordo com métodos bem conhecidos. Outros exemplos do profármaco são compostos, em que o carboxilato num composto da presente invenção é, por exemplo, convertido num alquil-, aril-, colina-, amino, aciloximetiléster, linolenoiléster.

Os metabolitos dos compostos da presente invenção também estão dentro do âmbito da presente invenção.

Onde possa ocorrer tautomerismo, como, e. g. , tautomerismo ceto-enol de compostos da presente invenção, as formas individuais, como, e. g., a forma ceto e enol, estão, cada, dentro do âmbito da invenção, bem como as suas misturas em qualquer proporção. 0 mesmo se aplica para estereoisómeros, como, e. g. , enantiómeros, isómeros cis/trans, confórmeros e semelhantes.

Se desejado, os isómeros podem ser separados por métodos bem conhecidos na técnica, e. g., por cromatografia liquida. 0 mesmo se aplica para enantiómeros por utilização, e. g. , de fases estacionárias quirais. Além disso, os enantiómeros podem ser isolados por conversão destes em diastereómeros, i. e., acoplamento com composto auxiliar enantiomericamente puro, subsequente separação dos diastereómeros resultantes e clivagem do resíduo auxiliar. Em alternativa, qualquer enantiómero de um composto da presente invenção pode ser obtido a partir de síntese estereosselectiva utilizando materiais de partida opticamente puros. Outro modo de obter enantiómeros puros a partir de misturas racémicas iria utilizar cristalização enantiosseletiva com contra-iões quirais.

Os compostos da presente invenção podem estar na forma de um sal ou um solvato farmaceuticamente aceitável. A expressão "sais farmaceuticamente aceitáveis" refere-se a sais preparados a partir de bases ou ácidos não tóxicos farmaceuticamente aceitáveis, incluindo bases ou ácidos inorgânicos e bases ou ácidos orgânicos. No caso dos compostos da presente invenção conterem um ou mais grupos acidicos ou básicos, a invenção também compreende os sais farmacêutica ou toxicologicamente aceitáveis correspondentes, em particular os seus sais farmaceuticamente aceitáveis. Por este motivo, os compostos da presente invenção, os quais contêm grupos acidicos, podem estar presentes nestes grupos e podem ser utilizados de acordo com a invenção, por exemplo, como sais metálicos alcalinos, sais metálicos alcalino-terrosos ou sais de amónio. Os exemplos mais precisos desses sais incluem sais de sódio, sais de potássio, sais de cálcio, sais de magnésio ou sais com amónia ou aminas orgânicas, tais como, por exemplo, etilamina, etanolamina, trietanolamina ou aminoácidos. Os compostos da presente invenção, os quais contêm um ou mais grupos básicos, i. e., grupos que podem ser protonados, podem estar presentes e podem ser utilizados de acordo com a invenção na forma dos seus sais de adição com ácidos inorgânicos ou orgânicos. 0 exemplos de ácidos adequados incluem cloreto de hidrogénio, brometo de hidrogénio, ácido fosfórico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido metanossulfónico, ácido p-toluenossulfónico, ácidos naftalenodissulfónicos, ácido oxálico, ácido acético, ácido tartárico, ácido láctico, ácido salicílico, ácido benzóico, ácido fórmico, ácido propiónico, ácido piválico, ácido dietilacético, ácido malónico, ácido succínico, ácido pimélico, ácido fumárico, ácido maleico, ácido málico, ácido sulfamínico, ácido fenilpropiónico, ácido glucónico, ácido ascórbico, ácido isonicotínico, ácido cítrico, ácido adípico e outros ácidos conhecidos pelo especialista na técnica. Se os compostos da presente invenção conterem simultaneamente grupos acidicos e básicos na molécula, a invenção também inclui, além das formas de sal mencionadas, sais interiores ou betaínas (zwiteriões) . Os sais respectivos podem ser obtidos por métodos convencionais que são conhecidos pelo especialista na técnica como, por exemplo, por colocação destes em contacto com um ácido ou base orgânica ou inorgânica num solvente ou dispersante, ou por permuta aniónica ou catiónica com outros sais. A presente invenção também inclui todos os sais dos compostos da presente invenção os quais, devido à reduzida compatibilidade fisiológica, não são directamente adequados para utilização em produtos farmacêuticos, mas os quais podem ser utilizados, por exemplo, como intermediários para reacções químicas ou para a preparação de sais farmaceuticamente aceitáveis.

Além disso, os compostos descritos anteriormente podem estar presentes na forma de solvatos, tal como aqueles que incluem como água solvatada ou solvatos farmaceuticamente aceitáveis, tal como álcoois, em particular etanol.

Além disso, a presente invenção proporciona composições farmacêuticas compreendendo, pelo menos, um composto da presente invenção ou um sal farmaceuticamente aceitável como ingrediente activo, em conjunto com um veículo farmaceuticamente aceitável. "Composição farmacêutica" significa um ou mais ingredientes activos e um ou mais ingredientes inertes que compõem o veículo, bem como qualquer produto que resulta, directa ou indirectamente, da combinação, complexação ou agregação de quaisquer dois ou mais dos ingredientes, ou da dissociação de um ou mais dos ingredientes, ou de outros tipos de reacções ou interacções de um ou mais dos ingredientes. Consequentemente, as composições farmacêuticas da presente invenção englobam qualquer composição produzida por mistura de, pelo menos, um composto da presente invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável. A composição farmacêutica da presente invenção pode compreender, além disso, um ou mais outros compostos como ingredientes activos, como um composto profármaco ou outros moduladores de receptor nuclear.

As composições são adequadas para administração oral, rectal, tópica, parentérica (incluindo subcutânea, intramuscular e intravenosa), ocular (oftálmica), pulmonar (inalação nasal ou bucal) ou nasal, embora a via mais adequada em qualquer determinado caso dependa da natureza e gravidade dos estados a serem tratados e da natureza do ingrediente activo. Estas podem ser, de um modo conveniente, apresentadas em formas de dosagem unitárias e preparadas por qualquer dos métodos bem conhecidos na técnica de farmácia.

Os compostos da invenção podem ser preparados por uma combinação de métodos conhecidos na técnica, incluindo os procedimentos descritos abaixo. 0 esquema I representa a reacção de um composto apropriado de fórmula I, com um composto heterociclico apropriado de fórmula II.

P = grupo protector Esquema I

Por este motivo, um composto apropriado de fórmula II, no qual Ri, R2 e R3 são definidos como na fórmula (1) e Y é um grupo abandonante e um composto apropriado de fórmula I, no qual R, A e Q são como definidos como na fórmula (1) ou um grupo que dá a R, como definido na fórmula (1), e. g. , por formação de um éster, uma amida, tetrazol ou ácido são feitos reagir para formar o composto de fórmula (1) com passos de protecções e/ou desprotecções apropriadas ou outros, conhecidos pelo especialista na técnica ou aqui divulgados. Os grupos abandonantes adequados são bem conhecidos na técnica e incluem halogenetos, particularmente cloro, bromo e iodo, ésteres de sulfonato, tal como brosilo, tosilo, metano, sulfonilo e trifluorometanossulfonilo. Um composto de fórmula I é feito reagir com um composto de fórmula II num solvente adequado, tais como acetonitrilo, dimetilformamida, tetra-hidrofurano e semelhantes na presença de um excesso de uma base adequada, tais como hidreto de sódio, carbonato de potássio, carbonato de sódio, trietilamina, diisopropiletilamina, terc-butóxido de potássio, etc. Essas reacções são realizadas normalmente a temperaturas desde a temperatura ambiente a refluxo do solvente escolhido.

Em alternativa, um composto apropriado de fórmula I, no qual R, A e Q são definidos como na fórmula (1) pode ser condensado com um composto heterociclico apropriado de fórmula II, no qual Ri, R2 e R3 são definidos como na fórmula (1) e Y é hidroxilo, utilizando uma reacção de Mitsunobu.

Os compostos em que R é um éster podem ser convertidos a compostos de fórmula (1), em que R é um ácido, por meio de métodos bem conhecidos pelo especialista na técnica. A hidrólise de ésteres alquílicos simples pode ser realizada em solventes adequados, tais como acetonitrilo, metanol, etanol, THF e suas misturas, com água a temperaturas desde cerca de 25-100 °C, com bases adequadas, tais como hidróxido de sódio, hidróxido de potássio e hidróxido de litio. No caso de R ser um éster terc-butilico o ácido correspondente pode ser formado sob condições acidicas bem conhecidas pelo especialista na técnica.

Os compostos de fórmula I e II podem ser facilmente preparados por métodos que são bem conhecidos e estabelecidos na técnica, incluindo métodos e procedimentos como aqueles aqui descritos.

Os compostos de fórmula I são preparados a partir de precursores de olefina por reacções de ciclopropanação convencionais bem conhecidas pelos especialistas na técnica (cf. H. Lebel, J-F. Marcoux, C Molinaro, A. B. Charette, Chem. Rev. 2003, 103, 977-1050) . Por exemplo, a reacção de um derivado de estilbeno opcionalmente substituído com reagente Simmons-Smith (IZnCH2I) em solventes adequados, tais como éter, THF, hexano, tolueno, diclorometano, a temperaturas entre -20 °C a cerca de refluxo do solvente escolhido produz compostos de fórmula I. Os estilbenos opcionalmente substituídos podem ser preparados por acoplamento de Horner-Emmons de um arilaldeído e de um éster fosfonato de arilmetileno ou por acoplamento de Heck de um estireno opcionalmente substituído com um iodeto ou triflato de arilbrometo opcionalmente substituído na presença de um catalisador de paládio. Como representado no esquema I, a ciclopropanação de estilbenos opcionalmente substituídos pode ser realizada após acoplamento a um heterociclo opcionalmente substituído de fórmula II.

Os compostos da invenção possuem centros quirais e podem existir em formas opticamente activas. Se for desejado um estereoisómero este pode ser preparado por métodos bem conhecidos na técnica. Por exemplo, a mistura racémica de compostos de fórmula (1) pode ser separada por cromatografia numa coluna quiral. Em alternativa, uma mistura racémica de compostos de fórmula (1), em que R é um ácido, pode ser separada por cristalização com aminas quirais adequadas, tais como a-fenetilamina, brucina, cinchonina. Os racematos também podem ser derivatizados quimicamente com outro reagente enantiopuro, tal como um álcool quiral, o qual pode ser feito reagir com a unidade -COOH para transformar as misturas racémicas em misturas de ésteres diastereoméricos que podem ser separados por métodos cromatográficos convencionais ou outra separação convencional. A separação dos enantiómeros também pode ser realizada ao nivel dos compostos racémicos de fórmula I. Os compostos opticamente activos de fórmula I podem ser depois feitos reagir com um composto heterocíclico de fórmula II como descrito no Esquema I, para dar compostos opticamente activos de fórmula (1).

Procedimentos Sintéticos

Os compostos de fórmula (II) podem ser preparados como ilustrado nos esquemas la a ld. Os compostos de isoxazole de fórmula II são preparados pela reacção de benzaldeidos opcionalmente substituídos com hidroxilamina na presença de uma base adequada, tal como trietilamina, seguido por clorinação com um agente de clorinação adequado, tal como N-cloro-succinimida. As cloroximas resultantes são feitas reagir com um β-cetoéster apropriado sob condições básicas, com uma base adequada, tal como trietilamina ou metóxido de sódio, para produzir ésteres de isoxazole. Os ésteres podem ser reduzidos aos álcoois de fórmula II com métodos bem conhecidos, tais como LAH ou DIBAL e convertidos a um grupo abandonante. Os compostos de l-aril-4-alquil-triazole de fórmula II podem ser preparados pela adição de álcoois propargílicos substituídos a azidas aromáticas substituídas e subsequente transformação do grupo hidroxilo para um grupo abandonante adequado. Os compostos de l-alquil-4-aril-triazole de fórmula II podem ser preparados pela adição de uma azida opcionalmente substituída a um éster acetileno, seguido por redução ao álcool e conversão para um grupo abandonante. Os compostos de pirazole de fórmula II são preparados pela reacção de uma opcionalmente fenil-hidrazina substituída com um 1,3-dicetoéster seguido por redução e conversão para um grupo abandonante.

Os compostos de acordo com esta invenção foram sintetizados seguindo um dos Esquemas 2 a 14, partindo de diferentes blocos de construção de clorometil-arilo (Cl-CH2-Ar) os quais foram sintetizados de acordo com os Esquemas la-d. Como ilustrado no Esquema 2, fazer reagir um dos blocos de construção de clorometil-arilo (Cl-CH2-Ar) A6a-e com o bloco de construção de aril-ciclopropil-arilo B13 e subsequente saponificação do éster metílico para o ácido livre resultou em compostos dos exemplos 1-6 (Esquema 2) . Fazer reagir o clorometil-arilo (Cl-CH2-Ar) A6e com o bloco de construção de (hetero) aril-ciclopropil-arilo C6 (Esquema 3) produziu o precursor C7 de nitrilo, o qual foi transformado no tetrazole (Exemplo 7), por reacção com NaN3 e NH4C1 ou saponificado no ácido livre (Exemplo 8, ver Esquema 3) . 0 exemplo 9 foi preparado de acordo com o esquema 4. A piridona D2 foi alquilada com o bloco de construção A6e para o intermediário D3. Uma transformação de dois passos do grupo éster no aldeído D5 foi seguido por uma reacção HWE para produzir o estilbeno como intermediário D6. A ciclopropanação e hidrólise do éster deu o composto final do exemplo 9. A síntese do composto do exemplo 10 é mostrada no esquema 5. O fosfonato E5 e 3-formilpiridina foram feitos reagir para formar o estilbeno como intermediário E12, o qual, após desprotecção e alquilação com A6e, foi ciclopropanado. A hidrólise final do éster produziu o composto do exemplo 10. O Composto do exemplo 11 foi sintetizado de acordo com o exemplo 6. O carbaldeído de benzoisoxazole F5 foi feito reagir com o fosfonato F9 para formar a estrutura de estilbeno contendo o intermediário FIO. A ciclopropanação e desprotecção produziu o composto do exemplo 11. Os compostos dos exemplos 12 a 14 foram preparados de acordo com o esquema 7, semelhante ao esquema 2, mas utilizando o 4-metoxicarbonilfosfonato G1. No esquema 8 é mostrado a síntese do composto do exemplo 15. O precursor H6 tipo estilbeno é preparado através de uma reacção de acoplamento cruzada de Heck de bromo-indazole H4 e olefina H5. A ciclopropanação e hidrólise do éster produziu o composto final do exemplo 15. O exemplo 16 é preparado de acordo com o esquema 9. O trans-estilbeno protegido por O-metilo é, em primeiro lugar, ciclopropanado e, subsequentemente, o grupo éster é transformado num grupo ciano. A O-demetilação e alquilação com A6e proporcionaram o intermediário de ciano 17, o qual foi feito reagir com azida de sódio para proporcionar o tetrazole do exemplo 16. A síntese do composto do exemplo 17 é mostrada no esquema 10. O A5a foi acetilado, seguido por bromação na posição benzílica, utilizando NBS. O tratamento com DBU e K2CO3 resultou na formação do intermediário J3, o qual foi protegido com OH, utilizando TBSOTf. A oxidação utilizando 0S04 e NaI04 foi seguida pela adição de metilmagnésio de Grignard e desprotecção de hidroxilo com TBAF, para dar J7. A reacção de Mitsunobu com I2a e saponificação do éster produziu o composto final do exemplo 17. No esquema 11 é mostrada a síntese do composto do exemplo 18. A reacção de J6 com diazometano, seguida por desprotecção de TBS, produziu o intermediário K2. Este intermediário foi convertido ao composto final do exemplo 18 de um modo semelhante ao descrito pelo exemplo 17. No esquema 12 é mostrada a síntese do composto do exemplo 19. 0 3-oxobutanoato de metilo foi feito reagir com A3a para formar o isoxazole LI resultante. A reacção com DMF-DMA seguido por tratamento com Si02 e HC1 produziu o aldeído L3, o qual foi reduzido a L4, utilizando NaBH4. Isto foi seguido por protecção com OH com 3,4-di-hidropirano, redução do éster com DIBAL-H e reacção de Mitsunobu com I2a, para produzir o intermediário L7. A saponificação do éster e desprotecção com hidroxilo produziu o composto final do exemplo 19.

Em resultado, a presente invenção refere-se a compostos de acordo com a fórmula (I) geral, os quais se ligam ao receptor NR1H4 (FXR) e actuam como agonistas ou moduladores do receptor NR1H4 (FXR). A invenção refere-se ainda à utilização dos compostos referidos para o tratamento e/ou profilaxia de doenças e/ou estados através da ligação do referido receptor nuclear pelos compostos referidos. Além disso, a presente invenção refere-se à utilização dos compostos referidos para a preparação de um medicamento para o tratamento e/ou profilaxia de doenças e/ou estados através da ligação do referido receptor nuclear pelos compostos referidos. Especificamente, a presente invenção refere-se à utilização de compostos de acordo com a fórmula (1) na preparação de um medicamento para profilaxia e/ou tratamento de estados crónicos intra-hepáticos ou algumas formas de estados colestáticos extra-hepáticos de fibrose hepática, resultante de estados colestáticos crónicos, de estados colestáticos intra-hepáticos agudos, de distúrbios inflamatórios obstrutivos ou crónicos, que surgem de composição de bilis inapropriada, de estados gastrointestinais com uma absorção reduzida de gordura dietética e vitaminas dietéticas solúveis em gordura, de doenças inflamatórias intestinais, de distúrbios lipidicos e lipoprotéicos, de Diabetes Tipo II e complicações clinicas de Diabetes Tipo I e Tipo II, de estados e doenças, as quais resultam de degeneração gordurosa e fibrótica crónica de órgãos, devido a acumulação forçada de lípidos e, especificamente, de triglicéridos e subsequente activação de vias pró-fibróticas, de obesidade e sindrome metabólico (estados combinados de dislipidemia, diabetes e índice de massa corporal anormalmente elevado), de enfarte agudo do miocárdio, de acidente vascular cerebral agudo, de trombose, a qual ocorre como um desfecho de aterosclerose obstrutiva crónica, de infecções persistentes por bactérias intracelulares ou protozoários parasíticos, de distúrbios hiperproliferativos não malignos, de distúrbios hiperproliferativos malignos, de adenocarcinoma do cólon e carcinoma hepatocelular, em particular, de esteatose hepática e síndromes associados, de insuficiência hepática ou disfunção hepática como um resultado de doenças hepáticas crónicas ou de ressecção cirúrgica hepática, de infecção por Hepatite B, de infecção por Hepatite C e/ou de efeitos colestáticos e fibróticos que estão associados com cirrose induzida por álcool ou com formas de hepatite transmitidas por vírus.

Os medicamentos como aqui referidos podem ser preparados por processos convencionais, incluindo a combinação de um composto de acordo com a presente invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável. 0 FXR é proposto como sendo um sensor nuclear de ácido biliar. Em resultado, este modula a saída sintética de ácidos biliares no fígado e a sua reciclagem no intestino (por regulação das proteínas de ligação ao ácido biliar). Mas além da fisiologia do ácido biliar, o FXR parece estar envolvido nos processos de regulação de muitos processos fisiológicos diversos, os quais são relevantes na etiologia e para o tratamento de doenças tão diversas como cálculos biliares de colesterol, distúrbios metabólicos, tal como Diabetes Tipo II, dislipidemias ou obesidade, doenças inflamatórias crónicas, tal como Doenças Inflamatórias Intestinais ou formas intra-hepáticas crónicas de colestase e muitas outras doenças (T. Claudel et al. , "The Farnesoid X receptor: a molecular link between bile acid and lipid and glucose metabolism" Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 2005, 25(10), 2020-2030; Y. D. Wang et al., "FXR: a metabolic regulator and cell protector." Cell Res. 2008, 18(11), 1087-1095. O FXR regula um padrão complexo de genes de resposta no fígado e no tracto gastrointestinal. Os produtos génicos têm impacto em diversos processos fisiológicos. No decurso da análise funcional de FXR, a primeira rede regulatória que foi analisada foi a regulação da síntese de ácido biliar. Enquanto que os LXR induzem a enzima chave da conversão de colesterol em ácidos biliares, Cyp7Al, por meio da indução do receptor nuclear regulatório LRH-1, FXR reprime a indução de Cyp7Al por meio da regulação positiva de ARNm que codifica SHP, um receptor nuclear adicional que é repressivo dominante sobre LRH-1. Uma vez que FXR se liga aos produtos finais desta via, os ácidos biliares primários, tais como ácido eólico (CA) ou ácido quenodesoxicólico (CDCA), este pode ser considerado como um exemplo de inibição por retroalimentação no nível de expressão génica (B. Goodwin et al., "A regulatory cascade of the nuclear receptors FXR, SHP-1, and LRH-1 represses bile acid biosynthesis" Mol. Cell 2000, 6(3), 517-526; T. Lu et al. "Molecular basis for feedback regulation of bile acid synthesis by nuclear receptors" Mol. Cell 2000, 6(3), 507-515).

Paralelamente à repressão da síntese de ácido biliar por meio de SHP, o FXR induz uma gama de transportadores denominados ABC (para cassete de ligação a ATP) que são responsáveis pela exportação de ácidos biliares tóxicos do citosol do hepatócito para os canaliculos, as pequenas ramificações do dueto biliar, onde se origina a bilis. Esta função hepatoprotetora de FXR tornou-se evidente em primeiro lugar com a análise de FXR de murganhos knockout (C. Sinal et al., "Targeted disruption of the nuclear receptor FXR/BAR impairs bile acid and lipid homeostasis" Cell 2000, 102(6), 731-744), onde foi mostrada a sob ou sobre-expressão de diversos transportadores de ABC no fígado. Além disso, a análise detalhada revelou que a bomba excretora principal de sais biliares BSEP ou ABCB11 (M. Ananthanarayananet et al., "Human bile salt export pump promoter is transactivated by the farnesoid X receptor/bile acid receptor" J. Biol. Chem. 2001, 276(31), 28857-28865; J. Plass et al. "Farnesoid X receptor and bile salts are involved in transcriptional regulation of the gene codification the human bile salt export pump" Hepatology 2002, 35(3), 589-596) bem como a enzima chave que medeia a transferência de lipidos das lipoproteinas para os fosfolipidos, PLTP (N. Urizar et al. "The farnesoid X-activated receptor mediates bile acid activation of phospholipid transfer protein gene expression" J. Biol. Chem. 2000, 275(50), 39313-39317) e os dois transportadores chave de membrana canalicular para fosfolipidos, MRP-2 (ABCC4) (H. Kast et al. "Regulation of multidrug resistance-associated protein 2 (ABCC2) by the nuclear receptors pregnane X receptor, farnesoid X-activated receptor, and constitutive androstane receptor" J. Biol. Chem. 2002, 277(4), 2908-2915) e MDR-3 (ABCB4) ; L. Huang et al. "Farnesoid X receptor activates transcription of the phospholipid pump MDR3" J. Biol. Chem. 2003, 278(51), 51085-51090) são alvos dirigidos para a activação transcripcional dirigida a ligando por FXR (resumida em: Μ.

Miyata "Role of farnesoid X receptor in the enhancement of canalicular bile acid output and excretion of unconjugated bile acids: a mechanism for protection against cholic acid-induced liver toxicity", J. Pharmacol. Exp. Ther. 2005, 312(2), 759-766; G. Rizzo et al. "Role of FXR in regulating bile acid homeostasis and relevance for human diseases" Curr. Drug Targets Immune Endocr. Metabol. Disord. 2005, 5(3), 289-303.) 0 facto de que o FXR parece ser o principal sensor e regulador de metabolitos para síntese, exportação e recirculação de ácidos biliares sugeriu a utilização de ligandos de FXR para induzir o fluxo biliar e troca de composição de ácido biliar para uma composição mais hidrófila. Com o desenvolvimento do primeiro ligando sintético de FXR, GW4064 (P. Maloney et al. "Identification of a chemical tool for the orphan nuclear receptor FXR" J. Med. Chem. 2000, 43(16), 2971-2974; T. Willson et al. "Chemical genomics: functional analysis of orphan nuclear receptors in the regulation of bile acid metabolism" Med. Res. Rev. 2001, 21(6) 513-522), como um composto ferramenta do ligando do ácido biliar artificial semi-sintético 6-alfa-etil-CDCA, podem ser analisados os efeitos da super-estimulação de FXR por agonistas potentes. Foi mostrado que ambos os ligandos induzem fluxo biliar em animais com o dueto biliar ligado. Além disso, além dos efeitos coleréticos, também podem ser demonstrados efeitos hepatoprotectores (R. Pellicciari et al. "6alpha-ethyl-chenodeoxycholic acid (6-ECDCA), a potent and selective FXR agonist endowed with anticholestatic activity" J. Med. Chem. 2002, 45(17), 3569-3572; Y. Liu et al. "Hepatoprotection by the farnesoid X receptor agonist GW4064 in rat models of intra- e extrahepatic cholestasis" J.

Clin. Invest. 2003, 112(11), 1678-1687). Este efeito

hepatoprotector foi adicionalmente limitado a um efeito anti-fibrótico que resulta da repressão de Inibidores de Tecido de Metaloproteinases da Matriz, TIMP-1 e 2, a indução de Metaloproteinases 2 da Matriz (MMP-2) que determinam o depósito de colagénio em células hepáticas estreladas e a subsequente redução de ARNm de alf a-colagénio e ARNm de factor de crescimento transformante beta (TGF-beta), os quais são ambos factores pró-fibróticos por agonistas de FXR (S. Fiorucci et al. "The nuclear receptor SHP mediates inhibition of hepatic stellate cells by FXR and protects against liver fibrosis", Gastroenterology 2004, 127(5), 1497-1512; S. Fiorucci et al. "A farnesoid x receptor-small heterodimer partner regulatory cascade modulates tissue metalloproteinase inhibitor-1 and matrix metalloprotease expression in hepatic stellate cells and promotes resolution of liver fibrosis" J. Pharmacol. Exp. Ther. 2005, 314(2), 584-595). Além disso, foi demonstrada a actividade anti-colestática em modelos animais de dueto biliar ligado, bem como em modelos animais de colestase induzida por estrogénio (S. Fiorucci et al., "Protective effects of 6-ethyl chenodeoxycholic acid, a farnesoid X receptor ligand, in estrogen-induced cholestasis" J. Pharmacol. Exp. Ther. 2005, 313(2) , 604-612) .

Estudos genéticos demonstraram que em formas hereditárias de colestase (Colestase Intra-hepática Familiar Progressiva = PFIC, Tipo I - IV) a localização nuclear do próprio FXR é reduzida como uma consequência de uma mutação no gene FIC1 (em PFIC Tipo I, também denominada Doença de Byler) (F. Chen et al., "Progressive familial intrahepatic cholestasis, type 1, is associated with decreased farnesoid X receptor activity" Gastroenterology. 2004, 126(3), 756-764; L. Alvarez et al., "Reduced hepatic expression of farnesoid X receptor in hereditary cholestasis associated to mutation in ATP8B1" Hum. Mol. Genet. 2004, 13(20), 2451-2460) ou os niveis de gene alvo de FXR que codifica para a bomba de exportação de fosfolipido MDR-3 são reduzidos (em PFIC Tipo III). Considerados em conjunto existe um número crescente de evidências que os compostos de ligação a FXR irão demonstrar utilidade clinica substancial no regime terapêutico de estados colestáticos crónicos, tal como Cirrose Biliar Primária (PBC) ou Colangite Esclerosante Primária (PSC) (revisto em: G. Rizzo et al. Curr. Drug Targets Immune

Endocr. Metabol. Disord. 2005, 5(3), 289-303; G. Zollner "Role of nuclear receptors in the adaptive response to bile acids and cholestasis: pathogenetic and therapeutic considerations" Mol.

Pharm. 2006, 3(3), 231-251; S. Cai et al. , "FXR: a target for cholestatic syndromes?" Expert Opin. Ther. Targets 2006, 10(3), 409-421). O profundo impacto que a activação de FXR tern no metabolismo e excreção do ácido biliar não é apenas relevante para as sindromes colestáticas mas ainda mais directamente para uma terapia contra a formação de cálculos biliares. Os cálculos biliares de colesterol formam-se devido à reduzida solubilidade do colesterol que é activamente bombeado para fora da célula hepática para o lúmen dos canaliculos. É a percentagem relativa do teor dos três principais componentes, ácidos biliares, fosfolipidos e colesterol livre que determina a formação de micelas mistas e, assim, a solubilidade evidente do colesterol livre na bilis. Os polimorfismos de FXR mapeiam os loci de característica quantitativa como um factor que contribui para a doença de cálculos biliares (H. Wittenburg "FXR e ABCG5/ABCG8 as determinants of cholesterol gallstone formation from quantitative trait locus mapping in mice", Gastroenterology 2003, 125(3), 868-881). Utilizando a ferramenta sintética de FXR do composto GW4064 pode ser demonstrado que a activação de FXR leva a uma melhoria do índice de Saturação de Colesterol (= CSI) e directamente a uma supressão da formação de cálculos biliares em murganhos C57L susceptiveis a cálculos biliares, pelo que o tratamento de fármaco em murganhos knockout com FXR não mostra efeito na formação de cálculos biliares (A. Moschetta et al., "Prevention of cholesterol gallstone disease by FXR agonists in a mouse model" Nature Medicine 2004, 10(12), 1352-1358).

Estes resultados qualificam o FXR como um bom alvo para o desenvolvimento de agonistas de moléculas pequenas que podem ser utilizados para impedir a formação de cálculos biliares de colesterol ou para impedir que se voltem a formar cálculos biliares após remoção cirúrgica ou litotripsia por ondas de choque (discutido em: S. Doggrell "New targets in and potential treatments for cholesterol gallstone disease" Curr. Opin. Investig. Drugs 2006, 7(4), 344-348).

Por este motivo, numa forma de realização da invenção, o composto de acordo com a fórmula (I) e composições farmacêuticas compreendendo o referido composto são utilizados para a profilaxia e/ou tratamento de doenças inflamatórias obstrutivas ou crónicas que surgem de composição de bilis inapropriada, tal como colelitiase, também conhecida como cálculos biliares de colesterol.

Além dos seus fortes efeitos hepatoprotectores e coleréticos, bem como ant i-f ibrót icos, que o FXR mostra após activação estimulada por moléculas pequenas no fígado, o FXR parece ter um papel na protecção do intestino da transformação neoplásica e do desenvolvimento de pólipos e a sua transição em adenocarcinoma no intestino (S. Módica et al. "Nuclear bile acid receptor FXR protects against intestinal tumorigenesis" Cancer Res. 2008, 68(23), 9589 e R.R. Ma ran et al., "Farnesoid X receptor deficiency in mice leads to increased intestinal epithelial cell proliferation and tumor development" J.

Pharmacol. Exp. Ther. 2009, 328(2), 469). Semelhante à situação no intestino, a ausência de FXR leva a um aumento elevado na formação de Carcinoma Hepatocelular (HCC), a forma mais proeminente de cancro do fígado (I. Kim et al. "Spontaneous hepatocarcinogenesis in farnesoid X receptor-null mice",

Carcinogenesis 2007, 28(5), 940 e F. Yang et al. "Spontaneous development of liver tumors in the absence of the bile acid receptor farnesoid X receptor." Cancer Res. 2007, 67(3), 863). Enquanto que um FXR funcional impede a formação de adenocarcinoma do cólon e carcinoma hepatocelular, a activação de FXR induz a regeneração do fígado após hepatectomia (W. Huang et al., "Nuclear receptor-dependent bile acid signaling is required for normal liver regeneration" Science 2006, 312 (5771), 233).

Os efeitos hepatoprotectores, anti-neoplásicos e de regeneração do fígado combinados associados com a activação de FXR podem ser terapeuticamente explorados para a utilização de agonistas de FXR no tratamento de doenças hepáticas graves. Numa forma de realização, os compostos de acordo com a invenção e composições farmacêuticas compreendendo os referidos compostos são utilizados no tratamento de doenças hepáticas, tal como cancro hepatocelular (HCC), estimulação da regeneração do fígado e melhoria dos efeitos secundários associados com ressecção hepática de grande porte, cirrose hepática independente da etiologia e prevenção ou tratamento de isquemia hepática no decurso de transplante de fígado ou cirurgia do fígado de grande porte.

Desde a descoberta do primeiro agonista de FXR sintético e da sua administração a roedores, tornou-se evidente que o FXR é um regulador chave de triglicéridos séricos (P. Maloney et al. J. Med. Chem. 2000, 43(16), 2971-2974; T. Willson et al. Med. Res. Rev. 2001, 21(6), 513-522). Ao longo dos últimos 6 anos as foram publicadas evidências acumuladas de que a activação de FXR por agonistas sintéticos levou à redução significativa de triglicéridos séricos, principalmente na forma de VLDL reduzidas, mas também para colesterol sérico total reduzido (H. Kast et al., "Farnesoid X-activated receptor induces apolipoprotein C-II transcription: a molecular mechanism linking plasma triglyceride levels to bile acids" Mol. Endocrinol. 2001, 15(10), 1720-1728; N. Urizar et al., "A natural product that lowers cholesterol as an antagonist ligand for FXR" Science 2002, 296(5573), 1703-1706; G. Lambert et al., "The farnesoid X-receptor is an essential regulator of cholesterol homeostasis" J. Biol. Chem. 2003, 278, 2563-2570; M. Watanabe et al., "Bile acids lower triglyceride levels via a pathway involving FXR, SHP, e SREBP-lc" J. Clin. Invest. 2004, 113(10), 1408-1418; A. Figge et al., "Hepatic overexpression of murine Abcbll increases hepatobiliary lipid secretion and reduces hepatic steatosis "J. Biol. Chem. 2004, 279(4), 2790-2799; S. Bilz et al. , "Activation of the farnesoid X receptor improves lipid metabolism in combined hyperlipidemic hamsters" Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 2006, 290(4), E716-722).

Porém, a redução dos triglicéridos séricos não é o único efeito. 0 tratamento de murganhos db/db ou ob/ob com o agonista de FXR sintético GW4064 resultou na redução marcada e combinada de triglicéridos séricos, colesterol total, ácidos gordos livres, corpos cetónicos, tal como Butirato 3-OH. Além disso, a activação de FXR combina-se com a via de sinalização de insulina intracelular em hepatócitos, resultando na produção reduzida de glucose pela gluconeogénese no figado, mas aumento concomitante no glicogénio hepático. A sensibilidade à insulina, bem como a tolerância à glucose tiveram um impacto positivo pelo tratamento com FXR (K. Stayrook et al., "Regulation of carbohydrate metabolism by the farnesoid X receptor" Endocrinology 2005, 146(3), 984-991; Y. Zhang et al. , "Activation of the nuclear receptor FXR improves hyperglycemia and hyperlipidemia in diabetic mice" Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2006, 103(4), 1006-

1011; B. Cariou et al. , "The farnesoid X receptor modulates adiposity and peripheral insulin sensitivity in mice" J. Biol. Chem. 2006, 281, 11039-11049; K. Ma et al.r "Farnesoid X receptor is essential for normal glucose homeostasis" J. Clin. Invest. 2006, 116(4), 1102-1109; D. Duran-Sandoval et al., "Potential regulatory role of the farnesoid X receptor in the metabolic syndrome" Biochimie 2005, 87(1), 93-98). Foi também recentemente observado um efeito na redução do peso corporal em murganhos sobrealimentados com uma dieta rica em lipidos (C. Lihong et al., "FXR Agonist, GW4064, Reverses Metabolic Defects in High-Fat Diet Fed Mice" American Diabetes Association (ADA) 66a sessões cientificas anuais, Junho de 2006, Resumo Número 856-P) . Esta perda de peso pode resultar da indução pelo FXR de FGF-19, um factor de crescimento de fibroblastos que é conhecido por levar à perda de peso e fenótipo atlético (J. Holt et al., Genes Dev. 2003, 17(13), 1581-1591; E. Tomlinson et al., "Transgenic mice expressing human fibroblast growth factor-19 display increased metabolic rate and decreased adiposity" Endocrinology 2002, 143(5), 1741-1747). Em recentes pedidos de patente, foi demonstrado o efeito de agonistas de FXR na redução do peso corporal (Stoffel W. et al., "Methods for inhibiting Adipogenesis and for treating Type 2 Diabetes" Pedido de Patente Internacional WO 2004/087076; S. Jones et al., "Methods of using FXR Agonists" Pedido de Patente Internacional WO 2003/080803).

Considerados em conjunto, estes efeitos farmacológicos de agonistas de FXR podem ser explorados em diferentes meios terapêuticos: pensa-se que os compostos de ligação a FXR sejam bons candidatos para o tratamento de Diabetes Tipo II devido aos seus efeitos de sensibilização à insulina, gliconeogénicos e hipolipemiantes.

Numa forma de realização, os compostos de acordo com a invenção e composições farmacêuticas compreendendo os referidos compostos são utilizados na profilaxia e/ou tratamento de Diabetes Tipo II, a qual pode ser superada por regulação positiva mediada por FXR da sensibilidade à insulina sistémica e sinalização da insulina intracelular no fígado, aumento da absorção e metabolização de glucose periférica, aumento do armazenamento de glicogénio no fígado, diminuição da produção de glucose no soro a partir da glicogénese proveniente do fígado.

Numa forma de realização adicional, os referidos compostos e composições farmacêuticas são utilizados para a profilaxia e/ou tratamento de colestase intra-hepática, tal como cirrose biliar primária (PBC), colangite esclerosante primária (PSC), colestase familiar progressiva (PFIC), cirrose induzida por álcool e colestase associada, e algumas formas de estados colestáticos extra-hepáticos ou fibrose hepática, resultante de estados colestáticos crónicos ou estados colestáticos intra-hepáticos agudos, tal como colestase induzida por estrogénio ou fármaco. A invenção também se refere a um composto de fórmula (I) ou a uma composição farmacêutica compreendendo o referido composto para a profilaxia e/ou tratamento de estados gastrointestinais com uma absorção reduzida de gordura dietética e vitaminas dietéticas solúveis em gordura, os quais podem ser superados por níveis intestinais aumentados de ácidos biliares e fosfolípidos.

Numa forma de realização adicional, o referido composto ou composição farmacêutica é utilizado para a prevenção e/ou tratamento de uma doença seleccionada do grupo consistindo de distúrbios lipídicos e lipoprotéicos, tais como hipercolesterolemia, hipertrigliceridemia e aterosclerose como um estado que se manifesta clinicamente, o qual pode ser melhorado pelo efeito benéfico de FXR na diminuição do colesterol do plasma total, diminuição dos triglicéridos séricos, aumento da conversão do colesterol hepático em ácidos biliares e aumento da eliminação e conversão metabólica de VLDL e outras lipoproteínas no fígado.

Numa forma de realização adicional, o referido composto e composição farmacêutica são utilizados para a profilaxia e/ou tratamento de doenças onde os efeitos hipolipemiantes, anti-colestáticos e anti-fibróticos combinados de medicamentos dirigidos a FXR podem ser explorados para o tratamento de esteatose hepática e síndromes associados, tal como esteato-hepatite não alcoólica ("NASH"), ou para o tratamento de efeitos colestáticos e fibróticos que estão associados com cirrose induzida por álcool ou com formas de hepatite transmitidas por virus.

Em conjunto com os efeitos hipolipidémicos foi também mostrado que a perda de FXR funcional leva a aumento de aterosclerose em murganhos ApoE knockout (E. Hanniman et al., "Loss of functional farnesoid X receptor increases atherosclerotic lesions in apolipoprotein E-deficient mice" J. Lipid Res. 2005, 46(12), 2595-2604). Por esse motivo, os agonistas de FXR podem possuir utilidade clinica como fármacos anti-ateroscleróticos e cardioprotectores. A regulação negativa de Endotelina-1 em Células do Músculo Liso Vasculares pode também contribuir para esses efeitos terapêuticos benéficos (F. He et al., "Downregulation of endothelin-1 by farnesoid X receptor in vascular endothelial cells" Circ. Res. 2006, 98(2), 192-199). A invenção também se refere a um composto de acordo com a fórmula (I) ou uma composição farmacêutica compreendendo o referido composto para tratamento preventivo e pós-traumático de distúrbios cardiovasculares, tais como enfarte do miocárdio agudo, acidente vascular cerebral ou trombose, os quais ocorrem como um desfecho de aterosclerose obstrutiva crónica.

Além de controlar a formação de pólipos intestinais e colónicos, o FXR parece ser expresso em tecido e linhas celulares do cancro da mama, mas não em tecido mamário saudável e parece interagir com o Receptor de Estrogénio em células de cancro de mama positivas para ER (K. E. Swales et al., "The farnesoid X receptor is expressed in breast cancer and regulates apoptosis and aromatase expression." Cancer Res. 2006, 66(20),

10120 e F. Journe et al., "Association between farnesoid X receptor expression and cell proliferation in estrogen receptorpositive luminal-like breast cancer from postmenopausal patients". Breast Cancer Res. Treat. 2009, 115(3), 523.

Isto iria permitir considerar o FXR também como um alvo potencial para o tratamento de doenças proliferativas, especialmente formas metastáticas de cancro que expressam uma forma responsiva de molécula pequena de FXR.

Numa forma de realização adicional, os referidos compostos e composições farmacêuticas são utilizados para a profilaxia e/ou tratamento de distúrbios hiperproliferativos malignos, tal como diferentes formas de cancro, especificamente, determinadas formas de cancro de mama, fígado ou cólon), onde a interferência com um ligando de FXR irá ter um impacto benéfico.

Por fim, o FXR parece estar também envolvido no controlo de defesa antibacteriana no intestino (T. Inagaki et ai., "Regulation of antibacterial defense in the small intestine by the nuclear bile acid receptor" Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006, 103(10), 3920-3905), embora não seja proporcionado um mecanismo exacto. A partir destes dados publicados, contudo, pode-se concluir que o tratamento com agonistas de FXR pode ser um impacto benéfico na terapia de Distúrbios Intestinais Inflamatórios (IBD), em particular aquelas formas onde a parte superior (ileal) do intestino é afectada (e. g., doença de Crohn ileal), uma vez que este parece ser o local de acção do controlo de FXR no crescimento bacteriano. Nos IBD a dessensibilização da resposta imunitária adaptativa é de algum modo prejudicada no sistema imunitário intestinal. O sobrecrescimento bacteriano pode então ser o desencadeador causativo para o estabelecimento de uma resposta inflamatória crónica. Assim, a diminuição do crescimento bacteriano por mecanismos transmitidos por FXR pode ser um mecanismo chave para impedir episódios infamatórios agudos.

Por este motivo, a invenção também se refere a um composto de acordo com a fórmula (I) ou uma composição farmacêutica compreendendo o referido composto para a prevenção e/ou tratamento de uma doença relacionada com Doenças Intestinais Inflamatórias, tal como doença de Crohn ou Colite ulcerosa. Pensa-se que a recuperação mediada por FXR da função da barreira intestinal e redução na carga bacteriana não comensal seja útil na redução da exposição de antigénios bacterianos ao sistema imunitário intestinal e pode, por esse motivo, reduzir as respostas inflamatórias. A invenção refere-se ainda a um composto ou composição farmacêutica para a profilaxia e/ou tratamento de obesidade e distúrbios associados, tais como sindrome metabólico (estados combinados de dislipidemias, diabetes e índice de massa corporal anormalmente elevado) o qual pode ser superado pela redução mediada por FXR de triglicéridos séricos, glucose no sangue e aumento da sensibilidade à insulina e perda de peso mediada por FXR.

Numa forma de realização, o referido composto ou composição farmacêutica é para tratar infecções persistentes por bactérias intracelulares ou protozoários parasíticos, tais como Mycobacterium spec. (Tratamento de Tuberculose ou Lepra), Listeria monocytogenes (Tratamento de Listeriose), Leishmania spec. (Leishmaniose), Trypanosoma spec. (Doença de Chagas; Tripanossomíase; Doença do Sono).

Numa forma de realização adicional, os compostos ou composição farmacêutica da presente invenção são úteis na prevenção e/ou tratamento de complicações clínicas de Diabetes Tipo I e Tipo II. Os exemplos dessas complicações incluem Nefropatia Diabética, Retinopatia Diabética, Neuropatias Diabéticas ou Doença Oclusiva Arterial Periférica (PAOD). Outras complicações clínicas da Diabetes estão também englobadas pela presente invenção.

Além disso, os estados e doenças que resultam da degeneração gordurosa e fibrótica crónica de órgãos devido à acumulação forçada de lípidos e, especificamente, de triglicéridos e subsequente activação de vias pró-fibróticas também pode ser prevenida e/ou tratada pela aplicação dos compostos ou composição farmacêutica da presente invenção. Esses estados e doenças englobam Esteato-hepatite Não Alcoólica (NASH) e estados colestáticos crónicos no fígado, Glomerulosclerose e Nefropatia Diabética no rim, Macula Degeneração Macular e Retinopatia Diabética no olho e doenças Neurodegenerativas, tal como Doença de Alzheimer no cérebro ou Neuropatias Diabéticas no sistema nervoso periférico.

Na utilização prática, os compostos da presente invenção podem ser combinados como o ingrediente activo em mistura íntima com um veículo farmacêutico de acordo com técnicas de composição farmacêutica convencionais. 0 veículo pode assumir uma ampla variedade de formas, dependendo da forma de preparação desejada para administração, e. g. , oral ou parentérica (incluindo intravenosa). Na preparação das composições para a forma de dosagem oral, pode ser empregue qualquer dos meios farmacêuticos usuais, tal como, por exemplo, água, glicóis, óleos, álcoois, agentes aromatizantes, conservantes, agentes corantes e semelhantes no caso de preparações líquidas orais, tal como, por exemplo, suspensões, elixires e soluções; ou veículos, tais como amidos, açúcares, celulose microcristalina, diluentes, agentes de granulação, lubrificantes, aglutinantes, agentes de desintegração e semelhantes no caso de preparações sólidas orais tais como, por exemplo, pós, cápsulas duras e moles e comprimidos, com as preparações sólidas orais sendo preferidas em relação às preparações líquidas.

Devido à sua facilidade de administração, os comprimidos e cápsulas representam a forma de porção de dosagem oral mais vantajosa, no caso em que sejam obviamente empregues veículos farmacêuticos sólidos. Se desejado, os comprimidos pode ser revestidos por técnicas aquosas ou não aquosas convencionais. Essas composições e preparações devem conter, pelo menos, 0,1 porcento de composto activo. A percentagem de composto activo nestas composições pode, naturalmente, ser variada e pode, de um modo conveniente, estar entre cerca de 2 porcento a cerca de 60 porcento do peso da unidade. A quantidade de composto activo nessas composições terapeuticamente úteis é de tal modo que será obtida uma dosagem eficaz. Os compostos activos também podem ser administrados intranasalmente como, por exemplo, gotas líquidas ou spray.

Os comprimidos, pílulas, cápsulas e semelhantes também podem conter um aglutinante, tais como goma de tragacanto, acácia, amido de milho ou gelatina; excipientes, tais como fosfato dicálcio; um agente de desintegração, tais como amido de milho, amido de batata, ácido algínico; um lubrificante, tal como estearato de magnésio; e um agente edulcorante, tais como sacarose, lactose ou sacarina. Quando uma forma unitária de dosagem é uma cápsula, esta pode conter, além dos materiais do tipo acima, um veículo líquido, tal como um óleo gordo. Vários outros materiais podem estar presentes como revestimentos ou para modificar a forma física da porção de dosagem. Por exemplo, os comprimidos podem ser revestidos com goma-laca, açúcar ou ambos. Um xarope ou elixir pode conter, além do ingrediente activo, sacarose como um agente edulcorante, metil e propilparabenos como conservantes, um corante e um aromatizante, tais como aroma de cereja ou laranja.

Uma vez que os compostos da presente invenção representam principalmente ácidos carboxílicos ou seus isoésteres aniónicos semelhantes, e uma vez que é bem conhecido que as formas de sal de compostos iónicos de fármacos podem afectar substancialmente a biodisponibilidade de compostos de fármacos, os compostos da presente invenção também podem ser utilizados como sais com vários contra-catiões para produzir uma formulação oralmente disponível. Esses catiões farmaceuticamente aceitáveis podem estar entre outros iões mono ou bivalentes, tais como amónio, os metais alcalinos sódio ou potássio ou os metais alcalino-terrosos magnésio ou cálcio, determinadas aminas farmaceuticamente aceitáveis, tais como Tris(hidroximetil)aminometano, etilenodiamina, dietilamina, piperazina ou outras, ou determinados aminoácidos catiónicos, tais como Lisina ou Arginina.

Os compostos da presente invenção também podem ser administrados parentericamente. As soluções ou suspensões destes compostos activos podem ser preparados em água, adequadamente misturados com um tensioactivo, tal como hidroxipropilcelulose. As dispersões também podem ser preparadas em glicerol, polietilenoglicóis líquidos e suas misturas em óleos. Sob condições convencionais de armazenamento e utilização, estas preparações contêm um conservante para impedir o crescimento de microorganismos.

As formas farmacêuticas adequadas para utilização injectável incluem soluções ou dispersões aquosas estéreis e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões estéreis injectáveis. Em todos os casos, a forma deve ser estéril e deve ser fluida de modo que exista fácil colocação na seringa. Esta deve ser estável sob as condições de fabrico e armazenamento e deve ser conservada contra a acção contaminante de microorganismos, tais como bactérias e fungos. 0 veículo pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (e. g., glicerol, propilenoglicol e polietilenoglicol líquido), suas misturas adequadas, e óleos vegetais.

Qualquer via de administração adequada pode ser empregue para proporcionar a um mamífero, especialmente um humano, uma dose eficaz de um composto da presente invenção. Por exemplo, oral, rectal, tópica, parentérica, ocular, pulmonar, nasal e semelhantes podem ser empregues. As formas de dosagem incluem comprimidos, trociscos, dispersões, suspensões, soluções, cápsulas, cremes, pomadas, aerossóis e semelhantes. De um modo preferido, os compostos da presente invenção são administrados oralmente. A dosagem eficaz de ingrediente activo empregue pode variar dependendo do composto particular empregue, o modo de administração, o estado a ser tratado e a gravidade do estado a ser tratado. Essa dosagem pode ser determinada facilmente por um especialista na técnica.

Quando se trata ou previne estados mediados por FXR para os quais os compostos da presente invenção são indicados, são geralmente obtidos resultados satisfatórios quando os compostos da presente invenção são administrados numa dosagem diária de desde cerca de 0,1 miligramas a cerca de 100 miligramas por quilograma de peso corporal do animal, de um modo preferido, administrado como uma única dose diária ou em doses divididas duas a seis vezes por dia, ou na forma de libertação sustida. Para os mamíferos maiores, a dosagem diária total é desde cerca de 1,0 miligramas a cerca de 1000 miligramas, de um modo preferido, desde cerca de 1 miligrama a cerca de 50 miligramas. No caso de um humano adulto de 70 kg, a dose diária total irá ser geralmente desde cerca de 7 miligramas a cerca de 350 miligramas. Este regime de dosagem pode ser ajustada para proporcionar a resposta terapêutica óptima.

Algumas abreviaturas que aparecem neste pedido são como se segue.

Abreviaturas

Abreviatura Designação m-CPBA Ácido meta-cloroperbenzóico DCM Diclorometano DIAD Azodicarboxilato de di-isopropilo DMF Dimetilformamida DMSO Dimetilsulfóxido

EtOAc Acetato de etilo EDTA Ácido 2-[2-(Bis(carboximetil)amino)etil- (carboximetil)amino]acético ESI Ionização por electrospray FXR Receptor X de Farnesóides GST Glutationa-S-transferase HPLC Cromatografia liquida de elevado desempenho IPTG Isopropil β-D-l-tiogalactopiranosida LBD Domínio de ligação ao ligando LC/MS Cromatografia Liquida - espectroscopia de massa RMN Ressonância magnética nuclear PE Éter de petróleo po Peroralmente

Rf Factor de retenção SDS Dodecil sulfato de sódio THF Tetra-hidrofurano TLC Cromatografia em camada fina TMS Tetrametilsilano TBS terc-butildimetilsililo

Os compostos da presente invenção podem ser preparados de acordo com os procedimentos dos seguintes Esquemas e Exemplos, utilizando materiais apropriados e são ainda exemplificados pelos seguintes exemplos específicos. Além disso, através da utilização dos procedimentos aqui descritos, em conjunto com aptidões convencionais na técnica, os compostos adicionais da presente invenção aqui reivindicados podem ser facilmente preparados. Os compostos ilustrados nos exemplos não são, contudo, para ser considerados como formadores do único género que é considerado como a invenção. Os exemplos ilustram ainda detalhes para a preparação dos compostos da presente invenção. Os especialistas na técnica irão perceber facilmente que as variações conhecidas das condições e processos dos seguintes procedimentos preparativos podem ser utilizados para preparar estes compostos. Os presentes compostos são geralmente isolados na forma dos seus sais farmaceuticamente aceitáveis, tal como aqueles descritos anteriormente.

As bases livres de amina correspondendo aos sais isolados podem ser produzidas por neutralização com uma base adequada, tais como hidrogenocarbonato de sódio aquoso, carbonato de sódio, hidróxido de sódio e hidróxido de potássio, e extracção da base livre de amina libertada num solvente orgânico, seguido por evaporação. A base livre de amina, isolada deste modo, pode ser ainda convertida em outro sal farmaceuticamente aceitável por dissolução num solvente orgânico, seguido por adição do ácido apropriado e subsequente evaporação, precipitação ou cristalização. Os ácidos carboxilicos livres correspondendo aos sais isolados podem ser produzidos por neutralização com um ácido adequado, tal como ácido clorídrico aquoso, hidrogenossulfato de sódio, di-hidrogenofosfato de sódio, e extracção do ácido carboxílico livre libertado num solvente orgânico, seguido por evaporação. 0 ácido carboxílico, isolado deste modo, pode ser ainda convertido em outro sal farmaceuticamente aceitável por dissolução num solvente orgânico, seguido por adição da base apropriada e subsequente evaporação, precipitação ou cristalização.

Uma ilustração da preparação de compostos da presente invenção é mostrado abaixo. A menos que indicado de outro modo nos esquemas, as variáveis têm o mesmo significado como descrito acima. Os exemplos apresentados abaixo pretendem ilustrar formas de realização particulares da invenção. Os materiais de partida adequados, blocos de construção e reagentes empregues na síntese, como descrito abaixo, são comercializados de Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Munique, Alemanha, de Acros Organics, Bélgica ou de Fisher Scientific GmbH, 58239 Schwerte, Alemanha, por exemplo, ou podem ser rotineiramente preparados por procedimentos descritos na literatura, por exemplo em "March's Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and

Structure", 5a Edição; John Wiley & Sons ou Theophil Eicher, Siegfried Hauptmann "The Chemistry of Heterocycles; Structures, Reactions, Synthesis and Application", 2a edição, Wiley-VCH 2003; Fieser et al. , "Fiesers1 Reagents for organic Synthesis" John Wiley & Sons 2000.

Exemplos Síntese de Precursores

Uma solução de 2, 6-diclorobenzaldeído Ala (25 g, 0,14 mol) em 200 mL de etanol foi adicionada a uma solução de cloridrato de hidroxilamina (11 g, 0,16 mol) e hidróxido de sódio (6,3 g, 0,16 mol) em 100 mL de água. A mistura resultante foi agitada a 90 °C, durante 24 h. 0 volume foi reduzido in vacuo em ~30 mL, o que induziu um precipitado. O balão foi então arrefecido até à temperatura ambiente e o sólido foi recolhido por filtração e lavado com água (2 x 100 mL) . O sólido foi seco sob vácuo, para dar 25,9 g de composto A2a (sólido branco, rendimento: 96%).

Um balão de fundo redondo de 500 mL foi carregado com uma solução do composto A2a (25,9 g, 0,14 mol) em 300 mL de DMF. O balão foi colocado num banho de água à temperatura ambiente. O balão foi depois carregado com NCS (18,4 g, 0,14 mol). A reacção foi agitada durante mais uma hora, depois os conteúdos foram vertidos em 400 mL de água e o produto foi extraído com 500 mL de Et20. A camada orgânica foi lavada com água (2 x 200 mL) e 100 mL de solução salina saturada saturada, depois seca sobre MgS04. Após filtração, o solvente foi removido sob pressão reduzida, para dar 29 g de composto A3a como um óleo amarelo, o qual foi utilizado na reacção seguinte sem purificação adicional.

Uma solução agitada de acetato de isobutirilo (16 g, 124,8 mmol) em 120 mL de THF seco foi tratada com uma solução de metóxido de sódio (252 mL, 0,5 M em MeOH) , seguido por uma solução de composto A3a (28 g, 124,8 mmol) em 40 mL de THF seco. Após agitação à temperatura ambiente durante 16 h, o solvente foi removido sob pressão reduzida. O resíduo foi particionado entre 800 mL de Et2<3 e 800 mL de água. A camada orgânica foi lavada com solução salina saturada, seca sobre Na2S04, filtrada, concentrada e purificada por cromatografia em sílica gel (eluente: PE/EtOAc = 10/1), para dar 24,8 g de composto A4a como um sólido branco (Rendimento: 62%).

Uma solução do composto A4a (24,8 g, 79,7 mmol) em 180 mL de THF seco foi arrefecida para 0 °C, sob atmosfera de azoto, enquanto foi adicionado LAH (3,1 g, 79,7 mmol) , gota a gota. A reacção foi deixada a aquecer lentamente à temperatura ambiente, durante 2 h. 0 balão foi novamente arrefecido para 0 °C e 5 mL de MeOH foram cuidadosamente adicionados ao longo de um período de 10 minutos. Foi adicionada solução saturada de Na2S04 e o sólido formado foi filtrado sobre um rolhão de Celite. Este foi concentrado para dar 21 g de composto A5a como um sólido amarelo (Rendimento: 93%).

A uma solução de benzotrizole (6,77 g, 73,7 mmol) em 100 mL de DCM seco foi adicionado S0C12 (8,76 g, 73,7 mmol) a 0 °C, e agitado à temperatura ambiente durante 1 hora. A mistura resultante foi adicionada à solução do composto A5a (21 g, 7 3,7 mmol) em 200 mL de DCM seco à temperatura ambiente e agitado durante 1,5 h. Foram adicionados 60 mL de água à mistura para mitigar a reacção e a mistura foi extraída com DCM. A camada orgânica foi lavada com solução de NaOH aquosa 1 N, seca sobre Na2S04, filtrada, concentrada e purificada por cromatografia em sílica gel (eluente: PE/EtOAc = 10/1), para dar 21,7 g de composto A6a como um sólido branco (Rendimento: 97,2%). RMN de ΤΗ (400 MHz, CDC13) : δ 1,47 (d, J= 6,8 Hz, 6H) , 3,35 (m, 1H), 4,31 (s, 2H), 7,38-7,48 (m, 3H).

A uma solução do composto A3a (105 g, 0,47 mol) em 400 mL de TEA foi adicionado 3-ciclopropil-3-oxopropanoato de etilo (100 g, 0,70 mol). A mistura foi agitada à temperatura ambiente, de um dia para o outro. O solvente foi removido sob pressão reduzida e purificado por cromatografia em sílica gel (eluente: PE/EA = 10/1), para dar 87 g de composto A4e como um sólido branco (Rendimento: 57%) .

A uma solução do composto A4e (80 g, 0,26 mol) em 300 mL de THF seco foi adicionado DIBAL-H (360 mL, 0,54 mol) a 0 °C, sob atmosfera de N2, e agitado à temperatura ambiente durante 4 h. A reacção foi mitigada por MeOH (80 mL) e HC1 (1 M) , extraída com EA e a camada orgânica foi lavada por solução salina saturada. Esta foi concentrada sob pressão reduzida para dar 55 g de composto em bruto A5e utilizado na reacção seguinte sem purificação adicional.

À solução de benzotrizole (17,85 g, 194,3 mmol) em 100 mL de DCM seco foi adicionado S0C12 (23,09 g, 73,7 mmol) a 0 °C, e agitado à temperatura ambiente durante 1 hora. A mistura resultante foi adicionada à solução do composto A5e (55 g, 194,3 mmol) em 500 mL de DCM seco à temperatura ambiente e agitada durante 1,5 h. Foram adicionados 120 mL de água à mistura para mitigar, e a mistura foi extraída com DCM. A camada orgânica foi lavada com solução aquosa de NaOH 1 N, seca sobre Na2S04, filtrada, concentrada e purificada por cromatografia em sílica gel (eluente: PE/EA = 10/1), para dar 47,4 g de composto A6e como um sólido branco (Rendimento: 81%) . RMN de ΤΗ (400 MHz, CDC13) : δ 1,23-1,33 (m, 4H) , 2,14 (m, 1H), 4,40 (s, 2H), 8,31 (s, 2H).

A uma solução do composto Alb (5,00 g, 28,4 mmol) em 40 mL de EtOH foi adicionada uma mistura de NaOH (1,37 g, 34,1 mmol) e NH2OH · HC1 (2,37 g, 34,1 mmol) em 15 mL de H20. A mistura resultante foi agitada a 90 °C, durante 12 h. O volume foi concentrado sob pressão reduzida por ~10 mL, e o sólido foi recolhido por filtração. Este foi lavado com água e seco sob vácuo, para dar 5,0 g de composto A2b como um sólido branco (Rendimento: 92%).

Um balão de fundo redondo de 100 mL foi carregado com uma solução do composto A2b (5,0 g, 26,2 mmol) em 50 mL de DMF. O balão foi colocado num banho de água à temperatura ambiente. O balão foi depois carregado com NCS (4,13 g, 31,4 mmol) . A reacção foi agitada durante mais 12 h, depois os conteúdos foram concentrados sob pressão reduzida. O resíduo foi diluído com Et20, lavado com água e solução salina saturada, seco sobre Na2S04, filtrado e concentrado, para dar 5,3 g de composto A3b como um óleo amarelo, o qual foi utilizado na reacção seguinte sem a purificação adicional.

Uma solução agitada de 3-ciclopropil-3-oxopropanoato de etilo (3,88 g, 24,5 mmol) em 40 mL de THF seco foi tratada com 15 mL de Et3N, seguido por uma solução do composto A3b (5 g, 22,25 mmol) em 30 mL de THF seco. Após agitação à temperatura ambiente durante 18 h, o solvente foi removido sob pressão reduzida. O resíduo resultante foi particionado com 100 mL de

Et20 e 40 mL de água. A camada orgânica foi lavada com solução salina saturada, seca sobre Na2S04, filtrada, concentrada e purificada por cromatografia em silica gel (eluente: PE/EtOAc = 10/1), para dar 3,25 g de composto A4b como um sólido branco (Rendimento: 45%).

A uma solução do composto A4b (2,0 g, 6,10 mmol) em 30 mL de THF anidro foi adicionado DIBAL-H (25,6 mL, 25,60 mmol), gota a gota, a -10 °C, durante 15 min, sob atmosfera de N2. A mistura resultante foi agitada à mesma temperatura durante 3 h. Mitigada com água e extraída com EA, a camada orgânica foi lavada com solução salina saturada, seca sobre Na2S04. Evaporação do solvente para dar o produto em bruto, o qual foi purificado adicionalmente por cromatografia flash em sílica gel (eluente: PE/EtOAc = 2/1), para dar 0,44 g de composto A5b como um sólido branco (Rendimento: 25%).

À solução de benzotriazole (0,84 g, 9,1 mmol) em 20 mL de DCM seco foi adicionado S0C12 (1,08 mg, 9,1 mmol), a 0 °C, gota a gota. A mistura resultante foi agitada durante 30 min à temperatura ambiente sob atmosfera de N2. A solução resultante foi transferida para um funil de adição e adicionado, gota a gota, durante 10 min a uma solução agitada do composto A5b (2,0 g, 7,0 mmol) em 20 mL de DCM seco. Após agitação durante 1 hora, a suspensão resultante foi filtrada para remover o cloridrato de benzotriazole. O filtrado foi lavado duas vezes com 30 mL de água, 30 mL de solução de NaOH 1 N e 30 mL de solução salina saturada, consecutivamente, seco sobre Na2S04 anidro, filtrado, concentrado e purificado por cromatografia em sílica gel (eluente: PE/EtOAc = 10/1), para dar 0,91 g de composto A6b como um sólido branco (Rendimento: 42.3%) . RMN de ΤΗ (400 MHz, CDC13) : δ 1,21-1,35 (m, 4H) , 2,14-2,18 (m, 1H) , 4,38 (s, 2H) , 8,67 (s, 2H) .

A uma solução agitada de A6b (0,53 g, 1,75 mmol) em 10 mL de DCM foi adicionado m-CPBA (0,65 mg, 3,60 mmol) à temperatura ambiente. Após agitação durante 18 h, à temperatura ambiente, a mistura reaccional foi mitigada com solução saturada de NaHC03, extraída com DCM, lavada com água e solução salina saturada, seca sobre Na2S04 anidro, filtrada, concentrada e purificada por cromatografia flash em silica gel (eluente: PE/EtOAc = 5/1), para dar 318 mg de composto A6c como um sólido branco (Rendimento: 57%). RMN de ΤΗ (400 MHz, CDC13) : δ 1,23-1,33 (m, 4H) , 2,14 (m, 1H), 4,40 (s, 2H), 8,31 (s, 2H).

Uma solução de 2,6-diclorofenilazida (F, 25 g, 0,13 mol) em tolueno (100 ml) e álcool acetilénico (G, 52,1 g, 0,53 mol) foi colocado em refluxo sob árgon durante 35 h. 0 tolueno foi removido sob vácuo e os produtos resultantes foram purificados cuidadosamente por cromatografia em coluna e foram isolados dois produtos de triazole como sólidos, Composto A5d (4,5 g, 23%) e Composto A5x (6,5 g, 34%).

A uma solução do composto A5d (2,00 g, 7,0 mmol) em 20 mL de DCM e 2 mL de CC14 foi adicionado PPh3 (3,67 g, 14,0 mmol) . Depois, a solução foi agitada à temperatura ambiente durante 4 h, a TLC e LCMS indicaram que a reacção estava terminada. Esta foi concentrada sob pressão reduzida e purificada por cromatografia flash em sílica gel (eluente: PE/EtOAc = 10/1), para dar 2,02 g de composto A6d como um sólido branco (Rendimento: 95%). RMN de ΤΗ (400 MHz, CDC13) : δ 1,51-1,49 (d, 6H) , 3,24-3,21 (m, 1H), 4,48 (s, 2H), 7,52-7,50 (t, 1 H), 7,58-7,54 (d, 2H).

A solução de 2-bromo-l,3-diclorobenzeno (13 g, 58 mmol), 2,2-dimetil-2-silabut-3-ino (90 mL, 64 mmol), Cul (100 mg, 5,5 mmol), PPh3 (200 mg, 0,75 mmol) e Pd(PPh3)2Cl2 (235 mg, 0,335 mmol) em 35 mL de NEt3 foi colocada em refluxo num tubo vedado sob atmosfera de N2 durante 24 h. A TLC e LCMS indicaram que a reacção estava terminada. Esta foi concentrada e foi adicionado EtOAc. A solução foi lavada com água e solução salina saturada, seca sobre Na2SC>4, filtrada, concentrada e purificada por cromatografia flash em sílica gel (eluente: PE/EA = 100/0), para dar 13 g de composto em bruto Alf como um óleo (rendimento 40%, pureza 70%).

À solução de composto em bruto Alf (13 g, 48,4 mmol) em 200 mL de MeOH foi adicionado K2CO3 (13 g, 94,3 mmol) e a mistura foi agitada à temperatura ambiente, de um dia para o outro, sob atmosfera de N2. Esta foi filtrada e concentrada sob pressão reduzida, para dar 4,1 g de composto A2f como um sólido branco (Rendimento: 56,1%).

À solução do composto A2f (2 g, 12 mmol) em 40 mL de THF seco foi adicionado n-BuLi (5,6 mL, 2,5 M em hexano, 14 mmol), a -78 °C, sob atmosfera de N2, e a solução foi agitada a esta temperatura durante 30 min. Depois, a solução de cloroacetato de etilo (1,65 g, 15 mmol) em 10 mL de THF seco foi adicionada a -78 °C. A mistura foi agitada durante 4 h. A solução resultante foi vertida em solução saturada de NH4C1 e foi adicionado EtOAc para extrair duas vezes. As camadas orgânicas combinadas foram secas sobre Na2SC>4, filtradas, concentradas sob pressão reduzida e purificadas por cromatografia flash em sílica gel (eluente: PE/EA = 50/1), para dar 1,25 g de composto A3f como um sólido amarelo (Rendimento: 44,5%).

A solução do composto A3f (3 g, 12,4 mmol) e 2-azidopropano (20 mL) foram aquecidos a 110 °C durante 24 h na autoclave.

Estes foram concentrados e purificados por cromatografia flash em sílica gel (eluente: PE/EA = 4/1), para dar 1 g de composto A4f como um sólido amarelo (Rendimento: 34,8%) .

A uma solução gelada do composto A4f (1 g, 1,38 mmol) em 10 mL de THF anidro foi adicionado LAH (2 M em THF, 2,76 mmol), gota a gota. Após a adição, a solução reaccional foi agitada a esta temperatura, durante 2 h. A TLC indicou que a redução estava terminada. Foram adicionados, lentamente, 10 mL de MeOH, para mitigar, seguido pela solução saturada de Na2SC>4. O sólido formado foi removido por filtração e a solução foi concentrada sob pressão reduzida e purificada por cromatografia flash em silica gel (eluente: PE/EA = 1/4), para dar 180 mg de composto A5f como um sólido amarelo (Rendimento: 45,7%) . RMN de ΤΗ (400 MHz, CDC13) δ: 7,41-7,43 (m, 2H) , 7,30-7,32 (m, 1H) , 4,91-4,97 (m, 1 H) , 4,58-4,59 (d, J = 5,6 Hz, 2H) , 2,70-2,73 (br, 1H), 1,72 (s, 3H), 1,70 (s, 3H).

A solução do composto A5f (200 mg, 0,70 mmol) , CC14 (1 mL, 10,4 mmol) e PPh3 (368 mg, 1,40 mmol) em 5 mL de DCM anidro foi agitada à temperatura ambiente durante 2 h. Esta foi concentrada sob pressão reduzida e purificada por cromatografia flash em silica gel (eluente: PE/EA = 3/1), para dar 100 mg de composto A6f como um óleo amarelo (Rendimento: 47,1%) . RMN de ΤΗ (400 MHz, CDC13) δ: 7,45-7,47 (m, 2H) , 7,36-7,39 (m, 1H) , 4,81-4,85 (m, 1 H) , 4,51 (s, 1 H) , 1,78 (s, 3H) , 1,74 (s, 3H) .

Foi adicionado S0C12 (113,3 g, 0,96 mol) a 700 mL de metanol seco, lentamente, a 0 °C. Após agitação durante 1 hora, à temperatura ambiente, o composto Bl (80 g, 0,48 mol) foi adicionado e agitado durante 1,5 h. A mistura foi concentrada e foi adicionada solução aquosa de NaHCCh para mitigar. A suspensão foi extraída duas vezes com DCM. As camadas orgânicas combinadas foram secas sobre Na2S04, filtradas e concentradas, para dar 85 g de composto B2, o qual foi utilizado na reacção seguinte sem purificação adicional.

A uma solução do composto B2 (60 g, 0,31 mol) em 500 mL de MeOH foi adicionada uma solução de NaOH (12,4 g, 0,31 mol) em 200 mL de MeOH. A mistura foi agitada, de um dia para o outro, à temperatura ambiente. Esta foi concentrada e o resíduo foi dissolvido em 500 mL de água e extraído com Et20. A solução aquosa foi acidificada com solução concentrada de HC1 para pH = 2, o precipitado branco formado foi recolhido e seco sob vácuo, para dar 4 6 g de composto em bruto B3 como um sólido branco.

A uma solução do composto B3 (46 g, 0,3 mol) em 700 mL de THF seco foi adicionada uma solução de BH3 em THF (1 M, 600 mL, 0,60 mol) a 0 °C, sob atmosfera de N2, durante 20 min. Depois, a solução foi agitada, de um dia para o outro, à temperatura ambiente. Para mitigar a reacção, foi adicionada, lentamente, solução aquosa de ácido acético a 50% (400 mL). A mistura reaccional foi concentrada e, depois, particionada entre EtOAc e água. A fase orgânica foi lavada com solução aquosa de Na2C03 a 10%, H20 e solução salina saturada, consecutivamente. Esta foi seca sobre Na2S04, filtrada, concentrada sob pressão reduzida e purificada por cromatografia em sílica gel (eluente: PE/EtOAc = 10/1), para dar 28 g de composto B4 como um sólido branco (Rendimento em três passos: 54%) .

À solução do composto B4 (28 g, 0,168 mol) em 700 mL de Et20 foi adicionado PBr3 (17,4 mL, 0,185 mol), gota a gota. A solução foi agitada durante 2 h e, depois, a reacção foi vertida em 500 mL de água gelada. A camada aquosa foi extraída com Et20. As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com NaHC03 saturado, água e solução salina saturada, consecutivamente. A fase orgânica foi seca sobre Na2S04, filtrada e concentrada sob pressão reduzida, para dar 34 g de composto B5 como um óleo (rendimento: 70%) .

Uma mistura do composto B5 (34 g, 148 mmol) em 34 mL de trietoxifosfina foi aquecida, a 175 °C, durante 4 h. A mistura foi concentrada sob pressão reduzida, para dar 40 g de composto B6 utilizado na reacção seguinte sem purificação adicional.

A uma solução do composto B7 (150 g, 1,17 mol) , hidróxido de cálcio (375 g, 5,07 mol) e carbonato de sódio (420 g, 3,96 mol) em 1,5 L de água foi adicionado clorofórmio (270 g, 2,29 mol) durante 80 min e a mistura foi colocada em refluxo sob atmosfera de N2 durante 3 h. A mistura reaccional foi arrefecida num banho de gelo. Foram adicionados 1 L de HC1 aquoso concentrado e 1 L de clorofórmio. A mistura foi agitada e após a separação de fase a camada aquosa foi descartada. A camada orgânica foi seca com Na2S04, concentrada e purificada por cromatografia em silica gel (eluente: PE/EtOAc = 10/1) para dar 28 g de composto B8 como um sólido branco (Rendimento: 15,3%).

A uma solução do composto B8 (11 g, 70,1 mmol) em 300 mL de DCM seco foi adicionado TBDMSCI (12,7 g, 84,2 mmol), TEA (19,6 mL, 140,2 mmol) e DMAP (100 mg, cat.) . A reacção foi agitada à temperatura ambiente durante 1 hora. Esta foi concentrada sob pressão reduzida para dar 18,5 g de composto em bruto B9, utilizado na reacção seguinte sem purificação adicional.

A uma solução do composto B9 (23 g, 80,6 mmol) em 320 mL de THF seco foi adicionado hidreto de sódio (60% em óleo mineral, 5 g, 123 mmol), a 0 °C, durante 30 min. A esta mistura resultante foi adicionada uma solução do composto B6 (18,5 g, 61,5 mmol) em 160 mL de THF seco, a 0 °C, e a solução foi agitada à temperatura ambiente durante 3 h. A mistura foi mitigada por solução saturada de NH4C1 e extraída com EtOAc. A camada orgânica foi lavada com solução salina saturada, seca sobre Na2S04, filtrada, concentrada para dar 23 g de composto B10, utilizado na reacção seguinte sem purificação adicional.

A uma solução do composto B10 (23 g, 80,6 mmol) em 450 mL de DCM seco foi adicionado TBDMSCI (12,7 g, 84,2 mmol), TEA (19,6 mL, 161,2 mmol) e DMAP (0,5 g, cat.) . A reacção foi agitada à temperatura ambiente durante 1 hora. Esta foi concentrada sob pressão reduzida e purificada por cromatografia em sílica gel (eluente: PE/EtOAc = 30/1), para dar 11,8 g de composto Bll como um sólido branco (Rendimento em três passos: 41,8%).

A uma solução de dietilzinco (290 mL, 1 M em hexano, 290 mmol) em 600 mL de DCM seco foi adicionado diiodoetano (46 mL, 580 mmol), a -78 °C. A solução foi agitada durante 30 min e, depois, a mistura foi aquecida para -30 °C. Foi adicionado TFA (38 g, 290 mmol) à mistura e agitado durante 30 min. A solução do composto Bll (11,8 g, 29 mmol) em 200 mL de DCM foi adicionada à mistura e a mistura foi agitada, de um dia para o outro, à temperatura ambiente. A mistura reaccional foi mitigada com 500 mL de HC1 aquoso 1 N. A camada orgânica foi lavada com solução salina saturada, seca sobre Na2S04, filtrada, concentrada até à secura e purificada por cromatografia flash em sílica gel (eluente: PE/EtOAc = 20/1), para dar 4,5 g de composto B12 como um óleo (Rendimento: 36,9%).

Uma solução do composto B12 (4,5 g, 10,8 mmol) e TBAF-H20 (11 g, 42,1 mmol) em 300 mL de THF seco foi agitada durante 10 min à temperatura ambiente. Foi adicionada água (100 mL) e a mistura foi extraída com 500 mL de EtOAc. A camada orgânica foi lavada com solução salina saturada, seca sobre Na2S04, concentrada sob pressão reduzida e purificada por cromatografia flash em sílica gel (eluente: PE/EtOAc = 10/1), para dar 2,0 g de composto em bruto B13 com 80% de pureza (UV-HPLC) como um óleo amarelo.

A uma solução do composto em bruto B13 (200 mg, 0,66 mmol) e composto A6a (200 mg, 0,66 mmol) em 5 mL de DMF foi adicionado K2C03 (184 mg, 1,33 mmol). A mistura foi aquecida, de um dia para o outro, a 60 °C, depois arrefecida para temperatura ambiente, diluída com água (10 mL) e extraída com 30 mL de EtOAc. A camada orgânica foi lavada duas vezes com solução salina saturada, seca sobre Na2S04, filtrada, concentrada e purificada por cromatografia flash em sílica gel (eluente: PE/EtOAc = 20/1), para dar 220 mg de composto Bl4a como um sólido branco (Rendimento: 59,8%).

A uma solução do composto em bruto B13 (200 mg, 0,66 mmol) e composto A6b (200 mg, 0,66 mmol) em 5 mL de DMF foi adicionado K2C03 (184 mg, 1,33 mmol). A mistura foi aquecida, de um dia para o outro, a 60 °C, depois arrefecida para temperatura ambiente, diluída com água (10 mL) e extraída com 30 mL de EtOAc. A camada orgânica foi lavada duas vezes com solução salina saturada, seca sobre Na2SC>4, filtrada, concentrada e purificada por cromatografia em sílica gel (eluente: PE/EtOAc = 20/1), para dar 100 mg de composto Bl4b como um sólido branco (Rendimento: 27,2%).

A uma solução do composto em bruto B13 (200 mg, 0,66 mmol) e composto A6c (211 mg, 0,66 mmol) em 5 mL de DMF foi adicionado K2C03 (184 mg, 1,33 mmol). A mistura foi aquecida, de um dia para o outro, a 60 °C, depois, arrefecida para temperatura ambiente, diluída com água (10 mL) e extraída com 30 mL de EtOAc. A camada orgânica foi lavada duas vezes com solução salina saturada, seca sobre Na2S04, filtrada, concentrada e purificada por cromatografia flash em sílica gel (eluente: PE/EA = 8/1), para dar 140 mg de composto Bl4c como um sólido branco (Rendimento: 38,1%) .

A uma solução do composto em bruto B13 (200 mg, 0,66 mmol) e composto A6d (200 mg, 0,66 mmol) em 5 mL de DMF foi adicionado K2CO3 (184 mg, 1,33 mmol). A mistura foi aquecida, de um dia para o outro, a 60 °C, depois, arrefecida para temperatura ambiente, diluída com água (10 mL) e extraída com 30 mL de EtOAc. A camada orgânica foi lavada duas vezes com solução salina saturada, seca sobre Na2SC>4, filtrada, concentrada e purificada por cromatografia flash em sílica gel (eluente: PE/EA = 10/1), para dar 103 mg de composto Bl4d como um sólido branco (Rendimento: 28,0%) .

A uma solução do composto em bruto B13 (1 g, 3,3 mmol, 1,00 eq) e A6e (1 g, 3,3 mmol, 1 eq) em 30 mL de DMF foi adicionado K2C03 (1,4 g, 9,9 mmol, 3,00 eq) . A mistura foi aquecida, de um dia para o outro, a 60 °C, depois, arrefecida para temperatura ambiente, diluída com água (50 mL) e extraída com Et20 (200 mL) . A camada orgânica foi lavada com solução salina saturada, seca sobre Na2SC>4, filtrada, concentrada e purificada por cromatografia flash em sílica gel (eluente: PE/EtOAc = 20/1), para dar 1,2 g de Bl4e utilizado na reacção seguinte sem purificação adicional.

A uma solução do composto B14b (100 mg, 0,18 mmol) em 5 mL de THF e 2 mL de H20 foi adicionado Li0H-H20 (74 mg, 1,8 mmol) e, depois, a mistura foi agitada, à temperatura ambiente, durante 24 h. A mistura foi concentrada e diluída com 10 mL de H20, foi adicionado HC1 aquoso 1 N para acidificar a mistura para pH = 5. A mistura foi extraída com EtOAc e a camada orgânica foi lavada com solução salina saturada, seca sobre Na2SC>4, filtrada, concentrada e o resíduo foi purificado por cromatografia em sílica gel (eluente: PE/EAtOAc = 3/1), para dar 30 mg de Exemplo 1 (ácido 3-(2-(2-cloro-4-((5-ciclopropil-3-(3,5-dicloropiridin-4-il)isoxazol-4-il)metoxi)fenil)ciclopropi)-benzóico) como um sólido branco (Rendimento: 30,8%). RMN de ΤΗ (400 MHz, CDC13) δ: 1,23 (m, 2H) , 1,31 (m, 2H) , 1.47 (m, 2H) , 2,09 (m, 1 H) , 2,17 (m, 1H) , 2,39 (m, 1H) , 4,84 (s, 2H) , 6,65 (dd, J= 1,6 Hz, 8,4 Hz, 1H) , 6,84 (d, J= 1,6 Hz, 1 Η), 6,99 (d, J = 8,4 Hz, 1 Η), 7,43-7,48 (m, 2Η) , 7,97 (m, 2Η) , 8,64 (s, 2Η) ; A pureza da LCMS (fase móvel: 60%-95% de acetonitrilo-Água- 0,01% de TFA) é >95%, Rt = 3,304 min; MS Calcd.: 554; MS Encontrada: 555 (M+H)+.

A uma solução do composto Bl4c (140 mg, 0,24 mmol) em 5 mL de THF e 2 mL de H20 foi adicionado Li0H-H20 (100 mg, 2,4 mmol), e, depois, a mistura foi agitada, à temperatura ambiente, durante 24 h. A mistura foi concentrada e diluída com 10 mL de H20, foi adicionado HC1 aquoso 1 N para acidificar a mistura para pH = 5. A mistura foi extraída com EtOAc e a camada orgânica foi lavada com solução salina saturada, seca sobre Na2SC>4, filtrada, concentrada e purificada por cromatografia em sílica gel (eluente: PE/EtOAc = 1/1), para dar 40 mg de

Exemplo 2 (1-óxido de 4-(4-( (4-(2-(3-carboxifenil)ciclopropil)-3-clorofenoxi)metil)-5-ciclopropilisoxazol-3-il)-3,5-dicloropiridina) como um sólido branco (Rendimento: 29,3%). RMN de ΤΗ (400 MHz, CDC13) δ: 1,21-1,33 (m, 4H) , 1,44-1,50 (m, 2H) , 2,10-2,19 (m, 2H) , 2,39 (m, 1 Η) , 4,85 (s, 2H) , 6,67 (dd, J = 2,4 Hz, 8,4 Hz, 1H) , 6,88 (d, J = 2,4 Hz, 1 H) , 7,02 (d, J = 8,4 Hz, 1H) , 7,40-7,48 (m, 2H) , 7,95 (m, 2H) , 8,31 (s, 2H) ; A pureza da LCMS (fase móvel: 40%-95% de Acetonitrilo-Água-0,01% de TFA) é >95%, Rt = 3,421 min; MS Calcd.: 570; MS Encontrada: 571 (M+H)+.

A uma solução do composto Bl4d (103 mg, 0,18 mmol) em 10 mL de THF e 5 mL de H20 foi adicionado Li0H-H20 (76 mg, 1,8 mmol) e, depois, a mistura foi agitada, à temperatura ambiente, durante 24 h. A mistura foi concentrada e diluída com 10 mL de H20, foi adicionado HC1 aquoso 1 N para acidificar a mistura para pH = 5. A mistura foi extraída com EtOAc e a camada orgânica foi lavada com solução salina saturada, seca sobre Na2S04, filtrada, concentrada e purificada por cromatografia em sílica gel (eluente: PE/EtOAc = 2/1), para dar 80 mg de Exemplo 3 (ácido 3-(2-(2-cloro-4-((1-(2,6-diclorofenil)-4-isopropil-lH-l,2,3-triazol-5-il)metoxi)fenil)ciclopropil)benzóico) como um sólido branco (Rendimento: 79,6%). RMN de ΤΗ (400 MHz, CDC13) δ: 1,45 (m, 8Η) , 2,08 (m, 1 Η), 2,38 (m, 1Η) , 3,24 (m, 1H) , 4,92 (s, 2H) , 6,67 (d, J = 8,0 Hz, 1H) , 6,82 (S, 1H) , 7,00 (d, J = 8,8 Hz, 1H) , 7,41 - 7,52 (m, 5H) , 7, 94-7, 98 (m, 2H) ; A pureza da LCMS (fase móvel: 60%-95% de Acetonitrilo-Água- 0,01% de TFA) é >95%, Rt = 3,082 min; MS Calcd.: 555; MS Encontrada: 556 (M+H)+.

A uma solução do composto Bl4e em 30 mL de THF e 15 mL de H20 foi adicionado Li0H-H20 (3 g) e, depois, a mistura foi agitada, à temperatura ambiente, durante 24 h. Esta foi concentrada e diluída com 30 mL de H20, foi adicionado HC1 aquoso 1 N para acidificar a mistura. A mistura foi extraída com EtOAc. A camada orgânica foi lavada com solução salina saturada, seca sobre Na2SC>4, filtrada, concentrada e purificada por cromatografia em sílica gel (eluente: PE/EtOAc = 20/1), para dar 320 mg de Exemplo 4 (ácido 3-(2-(2-cloro-4-((5-ciclopropil-3-(2,6-diclorofenil)isoxazol-4-il)metoxi)fenil)- ciclopropil)benzóico racémico) como um sólido branco (Rendimento: 17,5%%). RMN de ΤΗ (CDC13, 400 MHz) δ: 1,14-1,18 (m, 2H) , 1,24-1,31 (m, 2H) , 1,41-1,46 (m, 2H) , 2,07-2, 08 (m, 1H) , 2,15-2,17 (m, 1H) , 2,35-2,37 (m, 1H) , 4,78 (s, 2H) , 6,67 (dd, J = 2,4 Hz, 8,8 Hz, 1 H) , 6,84 (d, J= 2,4 Hz, 1H) , 6,96 (d, J= 8,4 Hz, 1H) , 7,30-7,34 (m, 1H) , 7,38-7,45 (m, 4H) , 7, 92-7, 95 (m, 2H) . A pureza da LCMS (fase móvel: 60%-95% de Acetonitrilo-Água-0,01% de TFA) é >97%, Rt = 3,699 min; MS Calcd.: 553; MS Encontrada: 554 (M+H)+.

Resolução de ácido 3-(2-(2-cloro-4-((5-cictopropil-3-(2,6-diclorofenil)isoxazol-4-il)metoxi)fenil)-ciclopropil)benzóico racémico em enantiómeros: 290 mg de ácido 3- (2-(2-cloro-4-((5-ciclopropil-3-(2,6-diclorofenil)isoxazol-4-il)metoxi)fenil)-ciclopropil)benzóico racémico foram separados por HPLC quiral preparativa com coluna quiral (coluna: CHIRALPAK AD-H; Tamanho da coluna: 0,46 cm I.D. x 15 cm L; Fase móvel: Hexano/EtOH/HOAc = 50/50/0,1 (v/v/v);

Caudal: 0,5 mL/min; Comprimento de onda: UV 220 nm; Equipamento de HPLC: Shimadzu LC 20 com detector UV SPD-20A) para dar 137 mg de ácido (-)-3-(2-(2-cloro-4-((5-ciclopropil-3-(2, 6- diclorofenil)isoxazol-4-il)metoxi)fenil)ciclopropil)benzóico (Rt = 7,250 min, % de ee: >98%) e 132 mg de ácido (+)-3-(2-(2-cloro-4- ( (5-ciclopropil-3-(2,6-diclorofenil)isoxazol-4-il) -metoxi)fenil)ciclopropil)benzóico (Rt = 8,930 min, % de ee: >98%) . ácido (-)-3-(2-(2-cloro-4-((5-ciclopropil-3- (2,6- diclorofenil)isoxazol-4-il)metoxi)fenil)ciclopropil)benzóico (Exemplo 5a) RMN de ΤΗ (CDC13 , 400 MHz) δ: 1,14-1,18 (m, 2H) , 1,24-1,31 (m, 2H) , 1,41-1,46 (m, 2H) , 2,07-2, 08 (m, 1H) , 2,15-2,17 (m, 1H) , 2,35-2,37 (m, 1H) , 4,78 (s, 2H) , 6,67 (dd, J = 2,4 Hz, 8.8 Hz, 1H) , 6,84 (d, J= 2,4 Hz, 1H) , 6,96 (d, J= 8,4 Hz, 1H) , 7.30- 7,34 (m, 1H) , 7,38-7,45 (m, 4H) , 7, 92-7, 95 (m, 2H) . A pureza da LCMS (fase móvel: 60%-95% de Acetonitrilo-Água- 0,01% de TFA) é >97%, Rt = 3,692 min; MS Calcd.: 553; MS Encontrada: 554 (M+H)+.

Rotação óptica: [a]D25 = -92 ° (MeOH, c = 0,3)

Para a configuração absoluta dos centros quirais ver o esquema 14. ácido (+)-3-(2-(2-cloro-4-((5-ciclopropil-3-(2,6- diclorofenil)isoxazol-4-il)metoxi)fenil)ciclopropil)benzóico (Exemplo 5b) RMN de 2H (CDCÍ3 , 400 MHz) δ: 1,14-1,18 (m, 2H), 1,24-1,31 (m, 2H) , 1,41-1,46 (m, 2H) , 2,07-2, 08 (m, 1H) , 2,15-2,17 (m, 1H) , 2,35-2,37 (m, 1H) , 4,78 (s, 2H) , 6,67 (dd, J = 2,4 Hz, 8.8 Hz, 1H), 6,84 (d, J= 2,4 Hz, 1H) , 6,96 (d, J= 8,4 Hz, 1H) , 7.30- 7,34 (m, 1H), 7,38-7,45 (m, 4H) , 7, 92-7, 95 (m, 2H) . A pureza da LCMS (fase móvel: 60%-95% de Acetonitrilo-Água-0,01% de TFA) é >97%, Rt = 3,690 min; MS Calcd.: 553; MS Encontrada: 554 (M+H)+.

Rotação óptica: [a]D25 = -91° (MeOH, c = 0,3)

Para a configuração absoluta dos centros quirais ver o esquema 14 .

A uma solução do composto Bl4a (220 mg, 0,39 mmol) em 6 mL de THF e 3 mL de H20 foi adicionado Li0H-H20 (162 mg, 3,9 mmol), e, depois, a mistura foi agitada, à temperatura ambiente, durante 24 h. Esta foi concentrada e diluída com 10 mL de H20. Foi adicionado HC1 aquoso 1 N para acidificar a mistura para pH = 4 e a mistura foi extraída com EtOAc. A camada orgânica foi lavada com solução salina saturada, seca sobre Na2SC>4, filtrada, concentrada e purificada por cromatografia em sílica gel (eluente: PE/EtOAc = 3/1), para dar 80 mg de Exemplo 6 (ácido 3- (2-(2-cloro-4-((3-(2,6-diclorofenil)-5-isopropil-isoxazol-4-il)metoxi)fenil)ciclopropil)benzóico) como um sólido branco (Rendimento: 37,3%). RMN de ΤΗ (400 MHz, CDC13) δ: 1,45 (m, 8Η) , 2,09 (m, 1Η) , 2,38 (m, 1H) , 3,35 (m, 1H) , 4,73 (s, 2H) , 6,67 (dd, J= 2,4 Hz, 8,4 Hz, 1H) , 6,83 (d, J= 2,4 Hz, 1 Η) , 6,99 (d, J= 8,8 Hz, 1H) , 7,34-7,48 (m, 5H), 7,95 (m, 2H) ; A pureza da LCMS (fase móvel: 80%-95% de Acetonitrilo-Água- 0,01% de TFA) é >95%, Rt = 3,983 min; MS Calcd.: 555; MS Encontrada: 556 (M+H)+.

Uma solução do composto Cl (78,0 g, 456 mmol) e CuCN (45,2 g, 502 mmol) em 400 mL de DMF foi colocada em refluxo durante 3 h. A mistura foi concentrada sob vácuo e o resíduo purificado por cromatografia em sílica gel (eluente: PE/EtOAc = 10/1), para dar 7,7 g de composto C2 como um sólido branco (Rendimento: 14,3%).

Uma solução do composto C2 (7,5 g, 63,6 mmol), benzoilperóxido (0,54 g, 2,24 mmol) e iV-bromosuccinimida (12,5 g, 70,2 mmol) em 100 mL de CC14 foram colocados em refluxo durante 2 h. A suspensão resultante foi filtrada e o filtrado foi diluído com 400 mL de DCM, levado com uma solução saturada de bicarbonato de sódio, seca sobre MgS04, filtrada e concentrada sob pressão reduzida. O resíduo foi purificado por cromatografia flash em sílica gel (eluente: PE/EtOAc = 10/1), para dar 3,3 g de composto em bruto C3 como um sólido amarelo, utilizado na reacção seguinte sem purificação adicional.

Uma solução do composto C3 (3,3 g, 16,8 mmol) em 30 mL de trietoxifosfina foi aquecida para 175 °C, durante 4 h. A mistura foi concentrada sob pressão reduzida, para dar 3,99 g de composto C4, o qual foi utilizado no passo seguinte sem purificação adicional.

A uma solução do composto C4 (3,90 g, 15,4 mmol) em 40 mL de THF seco foi adicionado hidreto de sódio (1,23 g, 60% em óleo mineral, 30,8 mmol), a 0 °C, durante 30 min. A esta mistura resultante foi adicionada uma solução do composto B9 (4,15 g, 15,4 mmol) em 40 mL de THF seco, a 0 °C, e a solução foi agitada à temperatura ambiente, durante 3 h. A mistura foi mitigada com solução saturada de NH4C1 e extraída com EtOAc. A camada orgânica foi lavada com solução salina saturada, seca sobre Na2S04, filtrada, concentrada e purificada por cromatografia em sílica gel (eluente: PE/EtOAc = 10/1), para dar 2,11 g de composto C5 como um sólido branco (Rendimento: 37,1 %).

A uma solução do composto C5 (2,10 g, 5,68 mmol) e Pd(OAc)2 (0,3 g) em 30 mL de Et20 foi adicionada uma solução de CH2N2 em Et20 (70 mL, 280 mmol), a -50 °C, sob atmosfera de N2. Depois, a solução foi aquecida, lentamente, para temperatura ambiente e agitada durante mais 4 h. A mistura reaccional foi filtrada, concentrada e o resíduo foi purificado por cromatografia flash em sílica gel (eluente: PE/EtOAc = 10/1), para dar 1,68 g de composto C6 como um sólido branco (Rendimento: 77,1%) .

A uma solução do composto C6 (600 mg, 1,56 mmol) em 10 mL de DMF foi adicionado NaH (188 mg, 60% em óleo mineral, 4,68 mmol), a 0 °C, e agitada durante uma hora à temperatura ambiente. Depois, o composto A6e (472 mg, 1,56 mmol) foi adicionado sob agitação, seguido por agitação, de um dia para o outro, à temperatura ambiente. A solução foi vertida em 10 mL de água gelada e extraída com 20 mL de DCM. A camada orgânica foi lavada duas vezes com água e duas vezes com solução salina saturada, consecutivamente e seca sobre Na2SC>4. O solvente foi removido sob pressão reduzida e o resíduo foi purificado por cromatografia em sílica gel (eluente: PE/EtOAc = 10/1), para dar 370 mg de composto C7 como um sólido branco (rendimento: 44,2%).

A uma solução do composto C7 (220 mg, 0,41 mmol) em 5 mL de DMF foi adicionado NaN3 (66 mg, 1,02 mmol), NH4C1 (54 mg, 1,02 mmol) e, depois, a mistura foi agitada a 100 2C, de um dia para o outro. Após arrefecimento para a temperatura ambiente, o DMF foi removido e, depois, foi adicionada água (10 mL) e a mistura foi acidificada com HC1 aquoso 1 N para pH =4. O sólido formado foi recolhido por filtração e lavado com EtOAc e Et20, para dar 29 mg de Exemplo 7 (4-((4-(2-(6-(lH-tetrazol-5- il)piridin-3-il)ciclopropil)-3-clorofenoxi)metil)-5-ciclopropil-3-(2,6-diclorofenil)isoxazole) como um sólido amarelo (rendimento: 12,2%). RMN de ΤΗ (400 MHz, DMSO-d6) δ 1,12-1,22 (m, 4H) , 1,63 (s, 2H) , 2,19 (m, 1H) , 2,38 (m, 1 H) , 2,43 (m, 1H) , 4,91 (S, 2H) , 6,76 (d, J = 8,4 Hz, 1H) , 6,94 (d, J = 1,2 Hz, 1 H) , 7,14 (d, J = 8,4 Hz, 1H) , 7,56 (m, 1H) , 7,64 (m, 2H) , 7,83 (d, J= 7,6 Hz, 1H) , 8,13 (d, J= 8,0Hz, 1 H) , 8,72 (s, 1H) ; A pureza da LCMS (fase móvel: 60-95% de Acetonitrilo-Água- 0,1% de TFA) é >95%, Rt = 2,886 min; MS Calcd.: 578; MS Encontrada: 579 (M+l).

Uma solução do composto C7 (150 mg, 0,28 mmol), KOH (1,57 g, 28 mmol) em 15 mL de etanol e 6 mL de água foram agitados a 100 °C, durante 4 h. A mistura foi arrefecida para a temperatura ambiente e concentrada. O resíduo foi dissolvido em 30 mL de água, acidificada com HC1 aquoso 1 N para pH = 4 e o sólido formado foi recolhido por filtração. O sólido foi lavado por EtOAc e seco sob vácuo, para dar 45 mg de Exemplo 8 (ácido 5- (2- (2-cloro-4-((5-ciclopropil-3-(2,6-diclorofenil)isoxazol-4-il)metoxi)-fenil)ciclopropil)picolínico) como um sólido branco (rendimento: 29%). RMN de ΤΗ (400MHz, DMSO-d6) δ 8,52 (s, 1H) , 7,88 (d, J = 7,2 Hz, 1H), 7,54-7,65 (m, 4H), 7,11 (d, J= 8,8 Hz, 1H), 6,93 (d, J= 2,8 Hz, 1H) , 6,74 (dd, J= 2,4 Hz, 8,4 Hz, 1H) , 4,91 (s, 2H) , 2,45 (m, 1H) , 2,33 (m, 1H) , 2,11 (m, 1H) , 1,52-1,59 (m, 2H) , 1,11- 1,20 (m, 4H) ; A pureza da LCMS (fase móvel: 50-95% de Acetonitrilo-Água- 0,1% de TFA) é >95%, Rt = 3,023 min; MS Calcd.: 554; MS Encontrada: 555 (M+l).

A uma solução do Exemplo 8 (460 mg, 0,83 mmol) e Pd(0Ac)2 (0,08 g) em 10 mL de THF seco foi adicionada uma solução de CH2N2 em Et20 (5 mL, 20 mmol) à temperatura ambiente e, depois, a solução foi agitada a esta temperatura durante 2 h. A TLC e LCMS indicaram que a metilação estava terminada e o AcOH foi adicionado para mitigar. Esta foi concentrada sob pressão reduzida e purificada por cromatografia flash em sílica gel (eluente: PE/EA = 5/1), para dar 345 mg de composto C8 como um óleo amarelo (Rendimento: 73,1%).

340 mg do composto C8 foram separados por HPLC

preparativo quiral, com uma coluna quiral (coluna: CHIRALPAK AD-H; Tamanho da coluna: 0,46 cm I.D. x 15 cm L; Fase móvel: Hexano/EtOH/HOAc = 60/40/0,1 (v/v/v); Caudal: 1,0 mL/min;

Comprimento de onda: UV 220 nm; Equipamento de HPLC: Shimadzu LC 20 com detector UV SPD-20A) para dar 106 mg de C8a (Rt = 6,923 min, % de ee: > 8%) e 119 mg de C8b (Rt = 8,907 min, % de ee: >97%).

À solução do composto C8a (106 mg, 0,19 mmol) em 5 mL de THF e 2 mL de H20 foi adicionado Li0H-H20 (8 mg, 1,9 mmol) e, depois, a mistura foi agitada, à temperatura ambiente durante, 4 h. Esta foi concentrada, diluída com 5 mL de H20 e foi adicionada solução aquosa de HC1 1 N para acidificar a mistura para pH = 5. O sólido formado foi recolhido e o bolo de filtro foi lavado com 3 mL de água. O sólido foi adicionado a 2 mL de água e a suspensão foi agitada durante 2 h. O sólido foi novamente filtrado e o bolo de filtro foi lavado com 2 mL de água. Este foi filtrado, foi adicionado EtOAc, seco sobre Na2S04, filtrado e concentrado sob pressão reduzida, para dar 98 mg de Exemplo 8a ácido ( (-)-5-(2-(2-cloro-4-((5-ciclopropil-3-(2,6- diclorofenil)isoxazol-4-il)metoxi)fenil)ciclopropil)picolinico) como um sólido amarelo (Rendimento: 93,6%) . RMN de (DMSO-d6, 400 MHz) δ: 1,12-1,22 (m, 4H) , 1,57-1,64 (m, 2H), 2,16 (m, 1H), 2,37 (m, 1H), 2,48 (m, 1H), 4,91 (s, 2H), 6,75 (dd, J = 2,4 Hz, 8,4 Hz, 1H) , 6,93 (d, J = 2,4 Hz, 1H) , 7,13 (d, J = 8,4 Hz, 1H) , 7,56 (m, 1H) , 7,64 (m, 2H) , 7,73 (dd,

J = 2,4 Hz, 8,4 Hz, 1H) , 7,97 (d, J = 8,0 Hz, 1H) , 8,63 (d, J = 1, 6 Hz, 1H) ; A pureza da LCMS (fase móvel: 50%-95% de Acetonitrilo-Água-0,05% de TFA) é >97%, Rt = 3,124 min; MS Calcd.: 554; MS Encontrada: 555 (M+l).

Rotação óptica: [a]D25 = -127 2 (CHC13, c = 0,3) .

De um modo semelhante ao descrito para o exemplo 8a, foram obtidos 112 mg de Exemplo 8b (ácido (+)-5-(2-(2-cloro-4-((5-ciclopropil-3-(2,6-diclorofenil)isoxazol-4-il)metoxi)fenil)ciclopropil)picollnico). RMN de ΤΗ (DMSO-dg, 400 MHz) δ: 1,12-1,22 (m, 4H) , 1,57-1,64 (m, 2H), 2,16 (m, 1H), 2,37 (m, 1H), 2,48 (m, 1H), 4,91 (s, 2H), 6,75 (dd, J= 2,4 Hz, 8,4 Hz, 1H) , 6,93 (d, J= 2,4 Hz, 1H) , 7,13

(d, J = 8,4 Hz, 1 H) , 7,56 (m, 1H) , 7,64 (m, 2H) , 7,73 (dd, J = 2,4 Hz, 8,4 Hz, IH) , 7,97 (d, J= 8,0 Hz, 1H) , 8,63 (d, J= 1,6

Hz, 1H); A pureza da LCMS (fase móvel: 40%-95% de Acetonitrilo-Água-0,05% de TFA) é >97%, Rt = 3,551 min; MS Calcd.: 554; MS Encontrada: 555 (M+l).

Rotação óptica: [a]D25 = +128 2 (CHC13, c = 0,29) .

Uma mistura de acrilamida (210 g, 1,14 mol), composto Dl (700 mL, 4,73 mol) e ácido p-toluenossulfónico (7 g, 38,29 mmol) em 3500 mL de tolueno seco foi colocada em refluxo durante 48 h, com remoção azeotrópica de água. A mistura reaccional foi concentrada in vacuo e o resíduo foi purificado por cromatografia flash em silica gel (eluente: PE/EA = 10/1) para dar 25 g de composto D2 como um sólido branco (rendimento: 9,3%).

Uma solução do composto D2 (25 g, 105,48 mmol) e NBS (22,53 g, 126,58 mol) em 250 mL de CC14 foi aquecida sob refluxo, durante 18 h. O precipitado resultante foi removido por filtração e o filtrado foi concentrado sob pressão reduzida para dar um sólido que foi purificado por cromatografia flash em sílica gel (eluente: PE/EA = 10:1), para dar 17,35 g de composto D3 como um sólido branco (rendimento: 70%).

À solução do composto D3 (4,34 g, 18,46 mmol) em 20 mL de DMF foram adicionados o composto A6e (5,56 g, 18,46 mmol) e K2C03 (2,55 g, 18,46 mmol) . A mistura foi aquecida, de um dia para o outro, a 60 °C. A TLC e LCMS indicaram que a reacção estava terminada. A mistura foi concentrada sob pressão reduzida e purificada por cromatografia em sílica gel (eluente: PE/EA = 6/1), para dar 6,33 g de composto D4 como um sólido branco (Rendimento: 68%).

A uma suspensão de LAH (0,46 g, 12,6 mmol) em 50 mL de THF seco, uma solução do composto D4 (6,33 g, 12,6 mmol) em 50 mL de THF seco foi adicionado a 0 °C e a mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 2 h. Foi adicionado MeOH à solução resultante para mitigar, seguido por solução saturada de Na2SC>4. O sólido formado foi removido por filtração e o filtrado foi concentrado e purificado por cromatografia em sílica gel (eluente: PE/EA= 4/1), para dar 4,17 g de composto D5 como um sólido verde-claro (rendimento: 72,0%).

À solução do composto D5 (3 g, 6,55 mmol) em 30 mL de CHCI3 foi adicionado MnCç activo (2,28 g, 26,2 mmol) e, depois, a suspensão foi colocada em refluxo durante 3. A mistura reaccional foi filtrada e o bolo de filtro foi lavado com CHC13 quente, depois o filtrado foi concentrado para dar 2,81 g de composto D6 como um sólido amarelo, utilizado na reacção seguinte sem purificação adicional.

À solução do composto B6 (2,3 g, 8,06 mmol) em 30 mL de THF seco foi adicionado hidreto de sódio (0,5 g, 12,3 mmol), a 0 °C, durante 30 min. A esta mistura resultante foi adicionada a solução do composto D6 (2,81 g, 6,16 mmol) em 20 mL de THF seco, a 0 °C, e a solução foi agitada, à temperatura ambiente, durante 3 h. A mistura foi mitigada por solução saturada de NH4C1 e extraída com EtOAc. A camada orgânica foi lavada com solução salina saturada, seca sobre Na2S04, filtrada, concentrada e purificada por cromatografia em sílica gel (eluente: PE/EA = 10/1), para dar 0,98 g de composto D7 como um sólido branco (Rendimento: 27,3%).

À solução do composto D7 (970 g, 1,65 mmol) e Pd(OAc)2 (150 mg) em 20 mL de Et20 foi adicionada uma solução de CH2N2 em Et20 (20 mL, 80 mmol), a -50 °C, sob atmosfera de N2. Depois, a solução foi aquecida, lentamente, para a temperatura ambiente e agitada durante mais 4 h. A TLC e LCMS indicaram que a reacção estava correcta. Filtrada, concentrada e purificada por cromatografia flash em sílica gel (eluente: PE/EA = 10/1), para dar 37 8 mg de composto em bruto D8 como um sólido branco (Rendimento: 38,6%).

À solução do composto D8 (367 mg, 0,61 mmol) em 10 mL de THF e 4 mL de H20 foi adicionado Li0H-H20 (200 mg, 4,76 mmol) e, depois, a mistura foi agitada, à temperatura ambiente, durante 24 h. A mistura reaccional foi concentrada e diluída com 10 mL de H20, foi adicionada solução aquosa de HC1 1 N para acidificar a mistura para pH = 5, a qual foi extraída depois com EtOAc. A camada orgânica foi lavada com solução salina saturada, seca sobre Na2S04, filtrada, concentrada e purificada por cromatografia em sílica gel (eluente: PE/EA = 1/3), para dar 140 mg de Exemplo 9 (ácido 3-(2-( 6-((5-ciclopropil-3-(2,6- diclorofenil)isoxazol-4-il)metoxi)-2-(trifluorometil)piridin-3-il)ciclopropil)benzóico)como um sólido branco (Rendimento: 39,1%). RMN de ΤΗ (400 MHz, DMSO-d6) δ: 1,16 (m, 4H) , 1,60 (m, 2H) , 2,30 (m, 3H) , 5,28 (s, 2H) , 6,87 (d, J= 8,4 Hz, 1H) , 7,44 (s, 2H), 7,50 (m, 1H), 7,55 (m, 2H), 7,70 (m, 1H), 7,76 (m, 2H); A pureza da LCMS (fase móvel: 70%-95% de Acetonitrilo-Água-0,01% de TFA) é >97%, Rt = 3,033 min; MS Calcd.: 588; MS Encontrada: 589 (M+l).

À solução do composto B8 (10 g, 64,1 mmol) em 100 mL de CH3CN foram adicionados K2C03 (18,0 g, 130,4 mmol) e Mel (20 mL, 321,0 mmol). A reacção foi agitada à temperatura ambiente, de um dia para o outro. A mistura reaccional foi concentrada sob pressão reduzida para dar 11 g do composto em bruto E2, utilizado na redução seguinte sem a purificação adicional.

À solução do composto E2 (10 g, 61,8 mmol) em 100 mL de

EtOH foi adicionado NaBH4 (5.0 g, 123,6 mmol) e a mistura foi agitada à temperatura ambiente, durante 2 h, sob atmosfera de N2. Foi adicionada solução de HC1 1 N para mitigar. A mistura reaccional foi concentrada sob pressão reduzida e foi adicionado EtOAc para extrair duas vezes. As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com água e solução salina saturada, consecutivamente, secas sobre Na2S04, filtradas, concentradas e purificadas por cromatografia em sílica gel (eluente: PE/EA = 2/1), para dar 10 g de composto E3 como um óleo (Rendimento: 94,2%).

À solução do composto E3 (10 g, 58,1 mmol) em 100 mL de DCM seco foi adicionado PBr3 (31,2 g, 116,2 mmol) sob atmosfera de N2 à temperatura ambiente e a solução foi agitada a esta temperatura durante 2 h. A solução resultante foi vertida em água gelada e a camada orgânica foi seca sobre Na2S04, filtrada e concentrada sob pressão reduzida para dar 13,5 g do composto E4 como um óleo castanho, utilizado na reacção seguinte sem a purificação adicional.

A solução do composto E4 (13,5 g, 57,7 mmol) em 50 mL de trietoxif osf ina foi aquecida a 175 °C, durante 4 h. A mistura reaccional foi concentrada sob pressão reduzida para dar 17 g dr composto E5, utilizado na reacção seguinte sem purificação adicional.

A uma solução do composto E6 (50 g, 0,25 mol) em 400 mL de THF anidro foi adicionada uma solução de BH3 em THF (1 M, 500 mL, 0,50 mol), gota a gota, no arrefecimento com um banho de gelo. Após a adição, a solução reaccional foi agitada à temperatura ambiente, de um dia para o outro. A TLC indica que a redução estava terminada. 400 mL de MeOH foram adicionados, lentamente, para mitigar. A mistura foi concentrada sob pressão reduzida e purificada por cromatografia flash em sílica gel (eluente: PE/EA = 1/1), para dar 15 g de composto E7 como um sólido branco (Rendimento: 32,2%).

A solução do composto E7 (15 g, 80,2 mmol), 2H-3,4-di-hidropirano (26,9 g, 160,4 mmol) e p-TsOH (1,5 g, 8,7 mmol) em 200 mL de DCM anidro foi agitada à temperatura ambiente durante 2 h. Foi adicionada água e a fase orgânica foi lavada com solução salina saturada, seca sobre Na2S04, filtrada e concentrada sob pressão reduzida, para dar 23 g de composto em bruto E8 como um óleo, utilizado na reacção seguinte sem purificação adicional.

Um recipiente de autoclave foi carregado com o composto em bruto E8 (23 g, 80,2 mmol), PdCl2 (dppf) 2 (1,15 g, 2% em moles) e

trietilamina (16,2 g, 160,4 mmol) em 200 mL de metanol. O recipiente foi purgado três vezes com azoto e três vezes com monóxido de carbono. O vaso foi pressurizado para 2 MPa com monóxido de carbono e aquecido para 100 °C. A reacção foi, por este motivo, agitada de um dia para o outro, depois, deixada a arrefecer até à temperatura ambiente. A solução resultante foi filtrada através de uma almofada de silica e o bolo de filtro foi lavado com 50 mL de MeOH. O filtrado foi concentrado e purificado por cromatografia flash em silica gel (eluente: PE/EA = 8/1) para dar 18 g de composto E9 como um sólido amarelo (Rendimento em dois passos: 89,4%).

A uma solução do composto E9 (18 g, 71,7 mmol) em 200 mL de MeOH foi adicionado p-TsOH (22,8 g, 120,0 mmol). Depois, a solução foi agitada à temperatura ambiente durante 2 h. A mistura foi concentrada e foram adicionados, consecutivamente, água e EtOAc. A fase orgânica foi lavada com solução salina saturada, seca sobre Na2S04, filtrada e concentrada para dar 40,8 g do composto em bruto E10 como um liquido incolor, utilizado na reacção seguinte sem purificação adicional.

À solução do composto em bruto E10 (40,8 g, 71,7 mmol) em 300 mL de CHC13 foi adicionado Mn02 activo (31,2 g, 358,5 mmol), e, depois, a suspensão foi colocada em refluxo, durante 7 h. A TLC indicou que a oxidação estava correcta. A mistura reaccional foi filtrada e o bolo foi lavado com CHCI3 quente, depois, o filtrado foi concentrado, para dar 10,3 g de composto Eli como um sólido branco (Rendimento em dois passos: 87,1%) .

À solução do composto E5 (17 g, 58,2 mmol) em 200 mL de THF seco foi adicionado hidreto de sódio (4,66 g, 116,4 mmol), a 0 °C, durante 30 min. À mistura resultante foi adicionada a solução do composto Eli (9,6 g, 58,2 mmol) em 80 mL de THF seco, a 0°C, e a solução foi agitada à temperatura ambiente durante

1 h. A mistura foi mitigada com água e extraída com EtOAc. A camada orgânica foi lavada com solução salina saturada, seca sobre Na2S04, filtrada, concentrada e purificada por cromatografia em sílica gel (eluente: PE/EA = 5/1), para dar 9,55 g de composto E12 como um sólido amarelo (Rendimento: 54,2%).

À solução do composto E12 (9,55 g, 31,5 mmol) em 100 mL de DCM seco foi adicionado BBr3 (29,8 mL, 315 mmol), a -70 °C, sob atmosfera de N2 e, depois, a solução foi agitada à temperatura ambiente durante 1 h. A TLC e LCMS indicaram que a desmetilação estava terminada. A solução foi arrefecida novamente para -30 °C e foram adicionados 50 mL de MeOH para mitigar. A mistura foi concentrada sob pressão reduzida e água e foi adicionado DCM ao resíduo. A camada orgânica foi seca sobre Na2SC>4, filtrada e concentrada, para dar 10,1 g de composto em bruto E13 como um sólido castanho, utilizado no acoplamento seguinte sem purificação adicional.

À solução do composto em bruto E13 (10,1 g, 31,5 mmol) e composto A6a (9,51 g, 31,5 mmol) em 50 mL de DMF foi adicionado Κ2003 (43,47 g, 315 mmol). A mistura foi aquecida, de um dia para o outro, a 60 °C. Esta foi filtrada, concentrada sob pressão reduzida, diluída com 100 mL de H20 e extraída com 300 mL de EtOAc. A camada orgânica foi lavada duas vezes com água e solução salina saturada, consecutivamente, seca sobre Na2S04, filtrada, concentrada e purificada por cromatografia em sílica gel (eluente: PE/EA = 5/1), para dar 4,75 g de composto E14 como um sólido amarelo (Rendimento: 27,2%).

À solução do composto E14 (4,0 g, 7,22 mmol) e Pd(OAc)2 (0,4 g) em 60 mL de Et20 foi adicionada a solução de CH2N2 em Et20 (70 mL, 280 mmol), a -50 °C, sob atmosfera de N2. Depois, a solução foi aquecida lentamente para a temperatura ambiente e agitada durante mais 4 h. A TLC e LCMS indicaram que a reacção estava correcta. Esta foi filtrada, concentrada e purificada por cromatografia flash em sílica gel (eluente: PE/EA = 4/1), para dar 1,53 g de composto E15 como um sólido amarelo (Rendimento: 37,3%) .

À solução do composto E15 (1,53 g, 2,69 mmol) em 40 mL de THF e 10 mL de H20 foi adicionado Li0H-H20 (1,51 g, 36 mmol) e, depois, a mistura foi agitada, à temperatura ambiente, durante 24 h. Esta foi concentrada, diluída com 50 mL de H20 e foi adicionada solução aquosa de HC1 1 N para acidificar a mistura para pH = 5. O sólido formado foi recolhido e o bolo foi lavado com 20 mL de água. O sólido foi adicionado a 50 mL de água e a suspensão foi agitada durante 2 h. O sólido foi novamente filtrado e o bolo foi lavado com 20 mL de água. Depois, o sólido foi purificado por HPLC preparatória para dar 705 mg de Exemplo 10 (ácido 5-(2-(2-cloro-4-((5-ciclopropil-3-(2, 6-diclorofenil)isoxazol-4-il)metoxi)fenil)ciclopropil)nicotínico) como um sólido amarelo (Rendimento: 47,3%) . RMN de ΤΗ (400 MHz, CD3OD δ: 1,23 (m, 4H) , 1,58-1, 69 (m, 2H) , 2,20 (m, 1H) , 2,35 (m, 1H) , 2,45 (m, 1H) , 4,91 (S, 2H) , 6,74 (dd, J= 2,8 Hz, 8,8 Hz, 1H) , 686 (d, J= 2,8 Hz, 1H) , 7,11 (d, J= 8,4 Hz, 1H) , 7,45-7,54 (m, 3H) , 8,37 (S, 1H) , 8,77 (s, 1H), 9,02 (s, 1H); A pureza da LCMS (fase móvel: 50%-95% de Acetonitrilo-Água-0,01% de TFA) é >97%, Rt = 3,007 min; MS Calcd.: 554; MS Encontrada: 555 (M+l).

A uma solução de ácido 5-bromossalicilcarbo-hidroxâmico F2 (21,6 g) em tetra-hidrofurano (60 mL) foi adicionado cloreto de tionilo (10 mL) , gota a gota, com agitação a 10-20 °C. Após ser agitado durante 2 h à mesma temperatura, a mistura reaccional foi evaporada sob pressão reduzida e o resíduo foi dissolvido em dioxano (60 mL) e arrefecido para 0-5 °C. Foi adicionada trietilamina (38 mL) à mistura reaccional e agitada à temperatura ambiente, durante 1 hora. 0 solvente foi evaporado sob pressão reduzida e foi adicionada água gelada (300 mL) ao resíduo. A mistura foi ajustada para pH 2 com ácido clorídrico concentrado e os cristais precipitados foram filtrados e lavados com água. O composto F3 (17,5 g, 88%) foi obtido como cristais em agulha incolores, por recristalização a partir de acetato de etilo.

A uma suspensão do composto F3 (1 g, 4,67 mmol) em DMF (10 mL) foi adicionado NaH (0,23 g, 9,35 mmol). A mistura resultante foi agitada à temperatura ambiente durante 1 h. Depois, a mistura foi arrefecida para 5 °C e foi adicionado clorometil metil éter (0,45 g, 80,5 mol), seguido por agitação à mesma temperatura durante 1 h. A mistura foi vertida em água gelada e extraída com éter. A camada orgânica foi lavada com solução salina saturada, seca sobre MgSCg, concentrada e purificada por cromatografia em coluna flash de sílica gel, para dar o composto F4 (1,1 g, rendimento 92%). RMN de iH (300 MHz, DMSO-d6) : δ 8,01-8,02 (d, 1H) , 7,79-7,82 (dd, 1H) , 7, 64-7, 67 (d, 1H), 5,52 (s, 2H) , 3,51 (s, 3H) .

A uma solução do composto F4 (2 g, 7,7 mmol) em THF anidro (20 mL), foi adicionado n-BuLi (2,5 M em hexano, 4,6 mL), gota a gota, a -78 °C, sob protecção de N2 e a mistura foi agitada, a -78 °C, durante 1 h. Depois, foi adicionado DMF anidro (11,6 mmol, 0,9 mL) , gota a gota, a -78 °C, e a mistura foi agitada, a -78 °C, durante mais 1 h. Foi adicionada NH4C1 aquoso saturado para mitigar a reacção e a mistura foi extraída com acetato de etilo. A camada orgânica foi lavada com solução salina saturada, seca sobre MgS04 e concentrada. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna flash de sílica gel para dar o composto F5 (800 mg, rendimento 50%). RMN de ΤΗ (300 MHz, DMSO-d6) : δ 10,07 (s, 1H) , 8,38 (d, 1H) , 8,11-8,15 (dd, 1 H) , 7, 80-7,82 (d, 1H) , 5,55 (S, 2H) , 3,53 (s, 3H) .

À solução do composto F6 (5,1 g, 12,1 mmol) em 10 mL de

EtOH foi adicionado NaBH4 (0,92 g, 24,2 mmol). Depois, a solução foi agitada durante 1 hora à temperatura ambiente. Foi concentrada e foi adicionado EtOAc. A solução foi lavada com água e solução salina saturada, seca sobre Na2SC>4, filtrada e concentrada sob pressão reduzida, para dar 4,19 g de composto em bruto F7 como um sólido branco, utilizado na reacção seguinte sem a purificação adicional.

À solução do composto F7 (4 g, 9,46 mmol) em 30 mL de Et20 seco foi adicionado PBr3 (2,56 g, 9,46 mmol) sob atmosfera de N2 a 0 °C. Após agitação durante 0,5 horas, a TLC e LCMS indicaram que a reacção estava terminada. A solução resultante foi vertida na solução saturada de NaHC03 e a camada orgânica foi lavada com água e solução salina saturada. Esta foi seca sobre Na2S04, filtrada e concentrada, para dar 3, 99 g de F8 em bruto como um sólido amarelo, utilizado na reacção seguinte sem a purificação adicional.

A solução do composto F8 (2 g, 4,12 mmol) em 15 mL de trietoxifosfina foi aquecida, a 175 °C, durante 2 h. Foi concentrada sob pressão reduzida para dar 2,3 g do composto F9 como um óleo, utilizado na reacção seguinte sem a purificação adicional.

À solução do composto F9 (2,3 g, 4,12 mmol) em 20 mL de THF seco foi adicionado hidreto de sódio (247 mg, 6,18 mmol), a 0 °C, durante 30 min. A esta mistura resultante foi adicionada a solução do composto F5 (0,85 g, 4,12 mmol) em 160 mL de THF seco, a 0 °C, e a solução foi agitada à temperatura ambiente durante 3 h. A mistura foi mitigada por solução saturada de NH4C1 e extraída com EtOAc. A camada orgânica foi lavada com solução salina saturada, seca sobre Na2S04, filtrada, concentrada, para dar 311 mg de composto FIO como um sólido castanho (Rendimento: 12,7%).

À solução do composto FIO (311 mg, 0,52 mmol) e Pd(OAc)2 (0,1 g) em 10 mL de THF seco foi adicionada a solução de CH2N2 em Et20 (10 mL, 40 mmol), a -50 °C, sob atmosfera de N2. Depois, a solução foi aquecida, lentamente, para a temperatura ambiente e agitada durante mais 4 h. A TLC e LCMS indicaram que a reacção estava correcta. Foi filtrada, concentrada e purificada por cromatografia flash em sílica gel (eluente: PE/EA = 4/1), para dar 214 mg de composto Fll como um sólido amarelo (Rendimento: 67,5%) .

A uma solução do composto Fll (214 mg, 0,35 mmol) em 5 mL de 1,4-dioxano, foi adicionado ácido clorídrico 3 Μ (1 mL) e esta mistura foi agitada, de um dia para o outro, à temperatura ambiente. Depois, foram adicionados água e acetato de etilo à mistura reaccional. A camada orgânica foi lavada com solução salina saturada, seca sobre MgS04 e concentrada. 0 resíduo foi purificado por TLC preparativa, para dar 22 mg de Exemplo 11 como um sólido amarelo (Rendimento: 11,1 %). RMN de ΤΗ (400 MHz, CDC13) δ: 1,18 (m, 2H) , 1,30 (m, 2H) , 1,45 (m, 2H) , 2,13-2,19 (m, 2H) , 2,35 (m, 1H) , 4,81 (s, 2H) , 6,70 (d, J = 6,4 Hz, 1 Η) , 6,87 (s, 1H) , 6,99 (d, J = 8,4 Hz, 1H) , 7,36 (m, 2H) , 7,43 (m, 2H) , 7,50 (d, J= 8,8 Hz, 1H) , 7,59 (S, 1H); A pureza da LCMS (fase móvel: 40%-95% de Acetonitrilo-Água) é 90%, Rt = 2,966 min; MS Calcd.: 566; MS Encontrada: 567 (M+l).

À solução do composto B9 (31 g, 110 mmol) em 300 mL de THF seco foi adicionado hidreto de sódio (8,8 g, 220 mmol), a 0 °C, durante 30 min. A esta mistura resultante foi adicionada a solução do composto G1 (20,1 g, 130 mmol) em 160 mL de THF seco a, 0°C, e a solução foi agitada à temperatura ambiente, durante 3 h. A mistura foi mitigada por solução saturada de NH4C1 e extraída com EtOAc. A camada orgânica foi lavada com solução salina saturada, seca sobre Na2S04, filtrada, concentrada e purificada por cromatografia flash em sílica gel (eluente: PE/EA = 10/1), para dar 25 g de composto 3 como um sólido amarelo (Rendimento: 78,9%).

À solução do composto em bruto G2 (25 g, 86,8 mmol) e composto A6e (26,2 g, 86,8 mmol) em 100 mL de DMF foi adicionado K2C03 (56, 9 g, 173, 6 mmol) . A mistura foi aquecida, de um dia para o outro, a 60 °C. Foi arrefecida para a temperatura ambiente, diluída com 10 mL de H20 e extraída com 300 mL de EtOAc. A camada orgânica foi lavada duas vezes com solução salina saturada, seca sobre Na2SC>4, filtrada, concentrada e purificada por cromatografia flash em sílica gel (eluente: PE/EA = 20/1), para dar 30 g de composto 4 como um sólido branco (Rendimento: 62,5%).

À solução do composto G3 (30 g, 54,2 mmol) e Pd(OAc)2 (3 g) em 300 mL de Et20 foi adicionada a solução de CH2N2 em Et20 (700 mL, 2,80 mol) , a -50 °C, sob atmosfera de N2. Depois, a solução foi aquecida, lentamente, para a temperatura ambiente e agitada durante mais 4 h. A TLC e LCMS indicaram que a reacção estava correcta. Foi filtrada, concentrada e purificada por cromatografia flash em sílica gel (eluente: PE/EA = 10/1), para dar 24 g de composto G4 como um óleo (Rendimento: 78%).

À solução do composto G4 (24 g, 42,3 mmol) em 200 mL de THF e 50 mL de H20 foi adicionado Li0H-H20 (17,77 g, 423 mmol) e, depois, a mistura foi agitada, à temperatura ambiente, durante 24 h. Foi concentrada e diluída com 200 mL de H20, foi adicionada solução aquosa de HC1 1 N para acidificar a mistura para pH = 4, a qual foi, depois, extraída com EtOAc. A camada orgânica foi lavada com solução salina saturada, seca sobre Na2S04, filtrada, concentrada e purificada por cromatografia em sílica gel (eluente: PE/EA = 3/1), para dar 16,35 g de Exemplo 12 como um sólido branco (Rendimento: 37,3%). RMN de iH (400 MHz, CDC13) δ: 1,13 (m, 2H) , 1, 18 (m, 2H) , 1, 53 (m, 2H) , 2, 10 (m, 1H) , 2,31 (m, 1H) , 2,46 (m, 1H) , 4,89 (s, 2H) , 6,73 (dd, J= 2,4 Hz, 8,4 Hz, 1H) , 6,91 (d, J = 2,4 Hz, 1 H) , 7,08 (d, J = 8,8 Hz, 1H) , 7,30 (d, J = 8,4 Hz, 2H) , 7,55 (m, 1H), 7,63 (m, 2H), 7,85 (d, J=8,4 Hz, 2H); A pureza da LCMS (fase móvel: 30%-95% de Acetonitrilo-Água) é >95%, Rt = 2,875 min; MS Calcd.: 553; MS Encontrada: 554 (M+l).

A quantidade apropriada de trometamina é adicionada a 1 g do Exemplo 12 (ácido livre), de modo que o composto parental e o seu contra ião estejam numa proporção equimolar. É adicionado etanol (30 mL). A mistura é agitada a 55 °C até à completa solubilização (cerca de 1 h) e o solvente é, depois, removido sob vácuo. É adicionado isopropanol, lentamente, até a película estar completamente solubilizada, enquanto o meio é agitado a 75 °C. A amostra é depois lentamente arrefecida de 75 °C para a temperatura ambiente, por diminuição da temperatura em 2 graus a cada 15 minutos. O sobrenadante é removido do balão. O pó é seco sob vácuo dinâmico durante 2 h, a 70 °C. O pó é depois seco a 40 °C, durante 4 h. RMN de ΤΗ (400 MHz, CDC13) δ: 1,09-1,18 (m, 4H) ; 1,39-1,46 (m, 2H) ; 1, 98-2,06 (m, 1H) ; 2,21-2,28 (m, 1H) ; 2,40-2,45 (m, 1H); 3,44 (s, 6H); 4,87 (s, 2H); 6,15 (bs, 6H); 6,70 (dd, J1 = 18,8 Hz, J2 = 2,5 Hz, 1H) ; 6,87 (d, J = 2,5 Hz, 1); 7,01 (d, J = 8,8 Hz, 1H) ; 7,14 (d, J = 8,2 Hz, 2H) ; 7,49-7,54 (m, 1H) ; 7,57-7,61 (m, 2H) ; 7,79 (d, J= 8,2 Hz, 2H) ;

Tf= 143 °C.

3,5 g de G4 (racémico) foram separados por HPLC preparativa quiral com uma coluna quiral (coluna: CHIRALPAK IA; Tamanho da coluna: 0,46 cm I.D. x 15 cm L; Fase móvel: Hexano/Álcool isopropilico = 70/30 (v/v); Caudal: 1 mL/min; Comprimento de onda: UV 254 nm; Equipamento de HPLC: Shimadzu LC 20 com detector UV SPD-20A) , para dar 1,5 g de G4a (Rt = 4,262 min, % de ee: > 99%) e 1,5 g de G4b (Rt = 5,008 min, % de ee: >99%).

A uma solução de G4a (1,5 g, 2,65 mmol) em 20 mL de THF e 15 mL de H20 foi adicionado Li0H-H20 (800 mg, 19 mmol) e, depois, a mistura foi agitada, a 50 °C, de um dia para o outro. Foi concentrada sob pressão reduzida, diluída com 5 mL de H20 e foi adicionada solução aquosa de HC1 1 N para acidificar a mistura para pH =4. O sólido formado foi filtrado e seco in vacuom para dar 1,1 g de Exemplo 12b (ácido ( + )-4-(2-(2-cloro-4-((5- ciclopropil-3-(2,6-diclorofenil) isoxazol-4- il)metoxi)fenil)ciclopropil)benzóico) como um sólido branco (Rendimento: 75,2%). RMN de ΤΗ (400 MHz, CDC13) δ: 1,13 (m, 2H) , 1,18 (m, 2H) , 1,53 (m, 2H) , 2,10 (m, 1H) , 2,31 (m, 1H) , 2,46 (m, 1H) , 4,89 (s, 2H) , 6,73 (dd. J = 2,4 Hz, 8,4 Hz, 1H) , 6,91 (d, J = 2,4 Hz, 1H) , 7,08 (d, J = 8,8 Hz, 1 H) , 7,30 (d, J = 8,4 Hz, 2H) , 7,55 (m, 1H), 7,63 (m, 2H), 7,85 (d, J= 8,4 Hz, 2H); A pureza da LCMS é (fase móvel: 60%-95% de Acetonitrilo- Água-0,05% de TFA) >98%, Rt = 3,632 min; MS Calcd.: 553; MS Encontrada: 554 (M+l); HPLC quiral (Coluna: Chiral pak AD-H 250*4.6; Fase móvel: 93/7 Hexano/EtOH): % de ee é 100%, Rt = 16,408;

Rotação óptica: [a]D25 = +132 0 (MeOH, c = 0,295) .

A uma solução do G4b (1,5 g, 2,65 mmol) em 20 mL de THF e 15 mL de H20 foi adicionado Li0H-H20 (800 mg, 19 mmol) e, depois, a mistura foi agitada, a 50 °C, de um dia para o outro. Foi concentrada sob pressão reduzida, diluída com 5 mL de H20 e foi adicionada solução aquosa de HC1 1 N para acidificar a mistura para pH =4. O sólido formado foi filtrado e seco in vacuom para dar 1,1 g de Exemplo 12c (ácido (-)-4-(2-(2-cloro-4-((5-ciclopropil-3-(2,6-diclorofenil) isoxazol-4- il)metoxi)fenil)ciclopropil)benzóico) como um sólido branco (Rendimento: 75,2%). RMN de ΤΗ (400 MHz, CDC13) δ: 1,13 (m, 2Η) , 1,18 (m, 2Η) , 1,53 (m, 2Η) , 2,10 (m, 1Η) , 2,31 (m, 1H) , 2,46 (m, 1H) , 4,89 (s, 2H) , 6,73 (dd, J= 2,4 Hz, 8,4 Hz, 1H) , 6,91 (d, J= 2,4 Hz, 1H), 7,08 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 7,30 (d. J=8,4 Hz, 2H), 7,55 (m, 1H) , 7,63 (m, 2H) , 7,85 (d, J = 8,4 Hz, 2H) ; A pureza da LCMS (fase móvel: 60%-95% de Acetonitrilo-Água- 0,05% de TFA) é >98%, Rt = 3,632 min; MS Calcd.: 553; MS Encontrada: 554 (M+l); HPLC quiral (Coluna: Chiral pak AD-H 250*4,6; Fase móvel: 93/7 Hexano/EtOH): % de ee é 100%, Rt = 24,411;

Rotação óptica: [a]D25 = -140 , 6 0 (MeOH, c = 0,31) .

Uma solução aquosa arrefecida (0 °C) de NaN02 (6,1 g, 88,5 mmol, 27 mL de água) foi adicionada a uma solução arrefecida (0 °C) de composto Hl disponível comercialmente (20 g, 88,5 mmol) em NaOH aquoso (96 mL, 96 mmol, 1 N) . As soluções combinadas foram adicionadas lentamente a H2S04 aquoso arrefecido (9,2 mL de H2S04 concentrado, 80 mL de água) por meio de um funil de adição com a ponta abaixo da superfície da solução de ácido. Foi adicionado gelo à reacção para manter a 0 °C e foi adicionado éter para controlar a formação de espuma, como necessário. Após agitação durante mais 10 min, a solução de diazónio foi adicionada, lentamente, a uma mistura arrefecida de SnCl2-2H20 (50 g, 221 mmol) em HC1 concentrado (80 mL) , por meio de um funil de adição com a ponta abaixo da superfície da solução de ácido. Foi adicionado gelo à reacção para manter a 0 °C e foi adicionado éter para controlar a formação de espuma, como necessário. Após agitação durante mais uma hora a 0 °C, a mistura reaccional foi agitada à temperatura ambiente, de um dia para o outro. Filtrado, o pó amarelo dourado foi dissolvido em NaOH aquoso, lavado com éter, precipitado com HC1 aquoso, filtrado e seco, para dar 20 g de composto em bruto H2 como pó amarelo, utilizado na reacção seguinte sem a purificação adicional.

A uma solução do composto H2 (20 g, 84 mmol) em 200 mL de MeOH seco foi adicionado, gota a gota, H2S04 concentrado (15,4 g, 168 mmol) , a 0-5 °C. A mistura resultante foi colocada em refluxo de um dia para o outro. A mistura reaccional foi filtrada, evaporada e vertida em água (50 mL) . A solução foi ajustada para pH = 7 com uma solução aquosa saturada de NaHCCg, extraída com éter (50*3 mL) , seca sobre MgS04, concentrada e purificada por cromatografia flash em sílica gel (eluente: PE/EA = 1/1), para dar 7,1 g de composto H3 como um sólido amarelo (rendimento: 35%) .

A uma mistura do composto H3 (7 g, 27,45 mmol) e carbonato de potássio (45 g, 137,25 mmol) em 200 mL de CH3CN foi adicionado CH3I (19,60 g, 138 mmol) à temperatura ambiente. A mistura reaccional foi agitada à temperatura ambiente durante 15 h. Foi concentrada sob pressão reduzida, diluída com água e extraída com EtOAc (10 mL*3) . Os orgânicos combinados foram secos sobre Na2S04 e concentrados sob pressão reduzida. O resíduo em bruto é purificado por cromatografia flash (eluente: PE/EA = 4:1), para dar 4,9 g de composto H4 como um sólido amarelo (Rendimento: 70%).

A uma solução agitada de n-BuLi (4 mL, solução 2,5 M em Hexano, 10 mmol) em 30 mL de THF seco foi adicionado brometo de metiltrifenilfosfónio (3,57 g, 10 mmol) durante um período de 5 min, a -60 °C. A mistura reaccional foi agitada durante 4 h a esta temperatura. À solução cor de laranja resultante foi adicionada a solução do composto F6 (4,21 g, 10 mmol) em 5 mL de THF seco, gota a gota, a -60 °C. A solução tornou-se incolor e foi deixada a arrefecer até à temperatura ambiente. Foram adicionados 20 mL de água para mitigar e foi extraída duas vezes com EtOAc. As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com solução salina saturada e, depois, secas sobre MgS04 anidro. O solvente foi removido para dar 4,53 g de composto em bruto H5, utilizado na reacção de Heck seguinte sem a purificação adicional.

Uma mistura de composto H5 (3,57 g, 10 mmol) , composto H6 (3,57 g, 10 mmol), tri(ortotolilfosfina) (3,57g, 10 mmol) e TEA (3,57 g, 10 mmol) em 5 mL de DMF foi colocada num banho pré-aquecido a 100 °C. Foi adicionado Pd2 (dba)3 (3,57 g, 10 mmol) e a mistura foi mantida a 100 °C durante 16 h. Após arrefecer à temperatura ambiente, a mistura foi dividida em EtOAc/água/NaHS04 (pH <4). As camadas orgânicas foram lavadas com água, solução salina saturada e, depois, secas sobre MgSCg. Após a evaporação do solvente, o material em bruto foi purificado por cromatografia flash em silica gel (eluente: PE/EA = 5/1), para dar 1,40 g de composto H6 como um sólido branco (Rendimento: 23%) .

À solução do composto H6 (400 mg, 0,66 mmol) e Pd(OAc)2 (200 mg) em 20 mL de Et20 foi adicionada a solução CH2N2 em Et20 (20 mL, 80 mmol), a -50 °C, sob atmosfera de N2. Depois, a solução foi aquecida, lentamente, à temperatura ambiente e agitada durante mais 4 h. A TLC e LCMS indicaram que a reacção estava correcta. Esta foi filtrada, concentrada e purificada por cromatografia flash em sílica gel (eluente: PE/EA = 10/1), para dar 27 8 mg de composto em bruto H7 como um sólido branco (Rendimento: 68%).

À solução do composto H7 (278 mg, 0,45 mmol) em 10 mL de THF e 4 mL de H20 foi adicionado Li0H-H20 (188 mg, 4,48 mmol) e, depois, a mistura foi agitada à temperatura ambiente, durante 24 h. Esta foi concentrada e diluída com 10 mL de H20 e foi adicionada uma solução aquosa de HC1 1 N para acidificar a mistura para pH = 5, a qual foi depois extraída com EtOAc. A camada orgânica foi lavada com solução salina saturada, seca em Na2SC>4, filtrada, concentrada e purificada por cromatograf ia em sílica gel (eluente: PE/EA = 1/1), para dar 130 mg de Exemplo 13 como um sólido branco (Rendimento: 48%). RMN de ΤΗ (400 MHz, DMSO-d6) δ: 1,16 (m, 4H) , 1,59 (m, 2H) , 2,23 (m, 1H), 2,39 (m, 1H), 2,48 (m, 1H), 4,09 (s, 3H), 4,91 (s, 2H) , 6,75 (dd, J = 2,4 Hz, 8,8 Hz, 1H) , 6,92 (d, J = 2,4 Hz, 1H) , 7,12 (d, J = 8,8 Hz, 1H) , 7,20 (d, J = 8,4 Hz, 1H) , 7,56 (m, 2H) , 7,64 (m, 2H) , 7,96 (d, J= 8,4 Hz, 1 H) , 12,88 (s, 1H) ; A pureza da LCMS (fase móvel: 30%-95% de Acetonitrilo-Água) é >95%, Rt = 3,258 min; MS Calcd.: 607; MS Encontrada: 608 (M+l).

600 mg de H7 (racémico) foram separados por HPLC preparativa quiral com uma coluna quiral (coluna: CHIRALPAK IA; Tamanho da coluna: 0,46 cm I.D. x 15 cm L; Fase móvel: Hexano/álcool etilico/DEA = 50/50/0, 1 (v/v/v) ;

Caudal: 1,0 mL/min; Comprimento de onda: UV 254 nm; Equipamento de HPLC: Shimadzu LC 20 com detector UV SPD-20A) , para dar 210 mg de H7a (Rt = 5,325 min, % de ee: >99%) e 186 mg de H7b (Rt = 6,804 min, % de ee: >99%).

À solução de H7a (210 mg, 0,35 mmol) em 5 mL de THF e 2 mL de H20 foi adicionado Li0H-H20 (8 mg, 1,9 mmol) e, depois, a mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 4 h. Esta foi concentrada, diluída com 5 mL de H20 e foi adicionada solução aquosa de HC1 1 N, para acidificar a mistura para pH = 5. Foi adicionado EtOAc para extrair duas vezes e as fases orgânicas combinadas foram secas sobre Na2S04, filtradas, concentradas sob pressão reduzida e purificadas por cromatografia flash em sílica gel (eluente: PE/EA = 1/2), para dar 108 mg de

Exemplo 13a (ácido ( + )-6-(2-(2-cloro-4-((5-ciclopropil-3-(2,6-diclorofenil)isoxazol-4-il)metoxi)fenil)ciclopropil)-1-metil-lH-indazole-3-carboxílico) como um sólido amarelo (Rendimento: 50,8%). RMN de ΤΗ (400 MHz, CDC13) δ: 1,18 (m, 2H) , 1,32 (m, 2H) , 1,51 (m, 2H), 2,19 (m, 1H), 2,45 (m, 1H), 4,18 (S, 3H), 4,82 (s, 2H) , 6,71 (dd, J = 2,4 Hz, 8,4 Hz, 1 H) , 6,87 (d, J = 1,6 Hz, 1H) , 7,01 (d, J = 8,4 Hz, 1H) , 7,23 (m, 2H) , 7,36 (m, 1H) , 7,43 (m, 2H), 8,17 (d, J= 8,4 Hz, 1H); A pureza da LCMS (fase móvel: 60%-95% de Acetonitrilo-Água- 0,05% de TFA) é >98%, Rt = 3,144 min; MS Calcd.: 607; MS Encontrada: 608 (M+l); HPLC quiral (Coluna: Chiral pak AD-H 250*4,6; Fase móvel: 65/35 Hexano/EtOH): % de ee é 100%, Rt = 13,101;

Rotação óptica: [a]D25 = +159 ° (MeOH, c = 0,300) .

De um modo semelhante ao descrito para o Exemplo 13a, foi obtido o Exemplo 13b (ácido (-)-6-(2-(2-cloro-4-((5-ciclopropil-3-(2,6-diclorofenil)isoxazol-4-il)metoxi)fenil)ciclopropil)-1-metil-lH-indazole-3-carboxílico) (120 mg; Rendimento: 59,2%): RMN de ΤΗ (400 MHz, CDC13) δ: 1,10-1,21 (m, 6H) , 1,56 (m, 2H) , 2,20 (m, 1H) , 2,35 (m, 1H) , 2,45 (m, 1H) , 4,09 (s, 3H) , 4,89 (s, 2H) , 6,74 (dd, J = 2,4 Hz, 8,8 Hz, 1 Η) , 6,91 (d, J = 2,0 Hz, 1H) , 7,12 (m, 2H) , 7,53 (m, 2H) , 7,62 (m, 2H) , 7,99 (d, J = 8,4 Hz, 1H); A pureza da LCMS (fase móvel: 60%-95% de Acetonitrilo-Água- 0,05% de TFA) é >98%, Rt = 3,180 min; MS Calcd.: 607; MS Encontrada: 608 (M+l); HPLC quiral (Coluna: Chiral pak AD-H 250*4.6; Fase móvel: 65/35 Hexano/EtOH): % de ee é 99,7%, Rt = 30,037;

Rotação óptica: [a]D25 = -161° (MeOH, c = 0,300) .

À solução do composto Exemplo 12 (400 mg, 0,72 mmol) e uma gota de DMF em 10 mL de DCM anidro, foi adicionada uma solução 2 M de cloreto de oxalilo (0,75 mL, 1,5 mmol) em DCM anidro, a 0 °C e, depois, a solução foi agitada à temperatura ambiente durante 2 h. Esta foi concentrada sob pressão reduzida e o resíduo foi diluído com 10 mL de THF anidro. A solução foi adicionada a DIEA (0,25 mL, 1,5 mmol), metanossulfonamida (14,3 mg, 1,5 mmol) e DMAP (10 mg). A solução foi agitada de um dia para o outro. Esta foi concentrada sob pressão reduzida e purificada por HPLC preparativa, para dar 40 mg de Exemplo 14 como um sólido branco (Rendimento: 8,8%) . RMN de ΤΗ (400 MHz, CDC13) δ 1,16-1,21 (m, 2H) , 1,24-1,34 (m, 2H) , 1,52 (m, 2H) , 2,04 (m, 1H) , 2,18 (m, 1H) , 2,44 (m, 1H) , 3,47 (s, 3H) , 4,81 (s, 2H) , 6,69 (dd, J = 2,8 Hz, 8,4 Hz, 1H) , 6,86 (d, J = 2,4 Hz, 1H) , 6,98 (d, J = 8,4 Hz, 1H) , 7,31 (m, 2H) , 7,35 (m, 1H) , 7,44 (m, 2H) , 7,80 (d, J= 8,4 Hz, 2H) , 8,57 (s, 1H); A pureza da LCMS (fase móvel: 60%-95% de Acetonitrilo-Água- 0,05% de TFA) é >95%, Rt = 3,255 min; MS Calcd.: 630; MS Encontrada: 631 (M+l).

A solução do composto Exemplo 12 (500 mg, 0,90 mmol) e HATU (500 mg, 1,32 mmol) em 20 mL de DMF seco foi agitada, a 0 °C, durante 30 min, depois, foi adicionado ácido 2-aminoetanessulfónico (150 mg, 1,2 mmol), seguido por DIEA (0,4 mL) . Após agitação à temperatura ambiente, durante 18 h, a mistura reaccional foi concentrada sob pressão reduzida e purificada por HPLC preparativa, para dar 250 mg de Exemplo 15 como um sólido branco (Rendimento: 42%). RMN de ΤΗ (400 MHz, CD3OD) δ 1,17-1,24 (m, 4H) , 1,41 1,54 (m, 2H) , 2,04 (m, 1H) , 2,346 (m, 2H) , 3,09 (m, 2H) , 3,82 (m,

2H) , 4,90 (s, 2H) , 6,72 (dd, J= 2,8 Hz, 8,8 Hz, 1H) , 6,82 (d, J = 2,4 Hz, 1H) , 7,05 (d, J = 8,4 Hz, 1H) , 7,28 (d, J = 8,8 Hz, 2H) , 7,46-7,55 (m, 3H) , 7,77 (d, J = 8,0 Hz, 2H) , 7,94 (s, 1H) ; A pureza da LCMS (fase móvel: 20%-95% de Acetonitrilo-Água) é >95%, Rt = 4,099 min; MS Calcd.: 660; MS Encontrada: 659 (M-l).

A uma solução do composto G1 (65 g, 240 mmol) em 500 mL de THF seco foi adicionado hidreto de sódio (12 g, 288 mmol) , a 0 °C, durante 30 min. A esta mistura resultante foi adicionada a solução do composto E2 (41 g, 240 mmol) em 300 mL de THF seco a 0 °C e a solução foi agitada à temperatura ambiente durante 3 h. A mistura foi mitigada por solução saturada de NH4C1 e extraída com EtOAc. A camada orgânica foi lavada com solução salina saturada, seca sobre Na2S04, filtrada, concentrada e purificada duas vezes por cromatografia flash em sílica gel (eluente: PE/EA = 10/1), para dar 72,5 g de composto II como um sólido branco (Rendimento: 100%) .

A uma solução do composto II (20 g, 66,2 mmol) e Pd(OAc)2 (3,5 g) em 200 mL de Et20 foi adicionada a solução de CH2N2 em

Et20 (250 mL, 1 mol), a -50 °C, sob atmosfera de N2. Depois, a solução foi aquecida, lentamente, para a temperatura ambiente e agitada durante mais 4 h. A LCMS indicou que a reacção não estava terminada. Esta foi filtrada e concentrada. Foram adicionados 200 mL de Et20 seco ao resíduo, seguido por Pd(OAc)2 (2 g) . Depois, a solução de CH2N2 em Et20 (150 mL, 0,6 mol) foi adicionada, a -50 °C, sob atmosfera de N2. Depois, a solução foi aquecida, lentamente, para a temperatura ambiente e agitada durante mais 4 h. A LCMS indicou que a reacção estava terminada e foi purificada por cromatografia flash em sílica gel (eluente: PE/EA = 50/1), para dar 9 g de composto 12 como um sólido branco sujo (Rendimento: 43%).

Esta reacção foi reconduzida três vezes utilizando a mesma qualidade com as mesmas condições e foram obtidos 26 g de composto 12 (Rendimento: 43,2%).

Uma mistura agitada do composto 12 (10,5 g, 33,23 mmol) e Li0H-H20 (6, 98 g, 166,1 mmol) dissolvida em 20 mL de água e 100 mL de THF foi agitada, de um dia para o outro, a 55 °C. A mistura foi concentrada sob pressão reduzida, tratada com uma solução aquosa de HC1 6 N para ajustar o pH para 1 e agitada durante mais 30 min. O precipitado resultante foi recolhido por filtração, lavado com água e seco in vacuo, para dar 9,1 g de composto 13 como um sólido branco (Rendimento: 90,7%) .

A uma solução do composto 13 (4,5 g, 15,0 mmol) em 30 mL de DCM anidro foi adicionado SOCI2 (2 mL, 28,2 mmol) e, depois, esta solução foi agitada à temperatura ambiente durante 1,5 h. Esta foi concentrada sob pressão reduzida e o resíduo foi diluído com THF. Esta solução foi adicionada à solução de NH3 6 N em THF a 0 °C e, depois, esta solução foi agitada à temperatura ambiente durante 2 h. Esta foi concentrada sob pressão reduzida e foram adicionados 100 mL de água. O sólido formado foi recolhido e seco in vácuo, para dar 4,0 g de composto 14 como um sólido branco (Rendimento: 88,6%).

A uma solução do composto 14 (4,0 g, 13 mmol) em 60 mL de THF anidro foram adicionados DIEA (4,0 g, 31 mmol) e TFAA (5,5 g, 26 mmol) e, depois, esta mistura foi agitada durante 4 h, à temperatura ambiente. Esta foi concentrada sob pressão reduzida e o resíduo foi diluído com 100 mL de EtOAc. A solução foi lavada consecutivamente com solução aquosa de NaHC03 e solução salina saturada. Foi seca sobre Na2SC>4, filtrada, concentrada sob pressão reduzida e purificada por cromatografia flash em sílica gel (eluente: PE/EA = 10/1), para dar 3,5 g de composto 15 como um sólido branco (Rendimento: 95,1%) .

A uma solução do composto 15 (3,5 g, 12 mmol) em 70 mL de DCM anidro foi adicionado BBr3 (5 mL, 52,9 mmol), a -78 °C e, depois, esta solução foi agitada a -78 °C, durante 1 hora. Foi adicionado MeOH a esta mistura para mitigar e, depois, esta solução foi vertida em 200 mL de solução saturada de NaHCCt. Esta foi concentrada sob pressão reduzida e foi adicionado Et2<3 para extrair duas vezes. As camadas orgânicas combinadas foram secas sobre Na2S04, filtradas, concentradas sob pressão reduzida e purificadas por cromatografia flash em silica gel (eluente: PE/EA = 8/1), para dar 2,2 g de composto 16 como um sólido branco (Rendimento: 68,2%).

A uma solução do composto 16 (2,1 g, 8,0 mmol) em 15 mL de DMF foram adicionados o composto A6e (2,5 g, 8,3 mmol) e K2CO3 (2,2 g, 16 mmol) e, depois, esta solução foi agitada de um dia para o outro, a 50 °C. Esta foi arrefecida para a temperatura ambiente e diluída com EtOAc. A solução foi lavada com água e solução salina saturada, seca sobre Na2S04, filtrada, concentrada sob pressão reduzida e purificada por cromatografia flash em sílica gel (eluente: PE/EA = 1/10), para dar 2,1 g de composto 17 como um sólido branco (Rendimento: 49,2%).

A uma solução do composto 17 (400 mg, 0,8 mmol) em 5 mL de DMF foram adicionados NH4C1 (140 mg, 2,64 mmol) e NaN3 (140 mg, 2,15 mmol) e, depois, esta solução foi aquecida de um dia para o outro, a 100 °C. Esta foi arrefecida para a temperatura ambiente e concentrada sob pressão reduzida. O resíduo foi diluído com EtOAc e lavado três vezes com água, a camada orgânica foi seca sobre Na2S04, filtrada, concentrada sob pressão reduzida e purificada por HPLC preparativa, para dar 130 mg de Exemplo 16 como um sólido branco (Rendimento: 28,2%) . RMN de (400 MHz, DMSO-d6) δ 1,12-1,22 (m, 4H) , 1,51-1,58 (m,2H), 2,10-2,14 (m, 1H), 2,32-2,36 (m, 1H), 2,45-2,49 (m, 1H), 3,18 (s, 1H) , 4,91 (s, 2H) , 6,73-6,76 (dd, J = 2,4 Hz, 8,8 Hz, 1H) , 6,93 (d, J = 2,0 Hz, 1 H) , 7,11 (d, J = 8,8 Hz, 1H) , 7,44 (d, J = 8,4 Hz, 2H) , 7,56 (m, 1H) , 7,64 (d, J = 7,6 Hz, 2H) , 7,96 (d, J= 7,6 Hz, 2H) ; A pureza da LCMS (fase móvel: 50%-95% de Acetonitrilo-Água-0,05% de TFA) é >95%, Rt = 3,962 min; MS Calcd.: 577; MS Encontrada: 578 (M+l).

À solução do composto 12 (5 g, 15,8 mmol) em 40 mL de DCM seco foi adicionado BBr3 (14,8 mL, 158 mmol), a -70 °C, sob atmosfera de N2 e, depois, a solução foi agitada à temperatura ambiente durante 1 hora. A TLC e LCMS indicaram que a desmetilação estava terminada. A solução foi arrefecida novamente para -30 °C e foram adicionados 50 mL de MeOH para mitigar. Esta foi concentrada sob pressão reduzida e foram adicionados água e DCM ao resíduo. A camada orgânica foi seca sobre Na2SC>4, filtrada, concentrada sob pressão reduzida e purificada por cromatografia flash em sílica gel (eluente: PE/EA = 10/1), para dar 3,9 g de I2a como um sólido amarelo (Rendimento: 81,7%).

RMN de ΤΗ (400 MHz, CDC13) δ: 1,49 (m, 2H) , 2,08 (m, 1H) , 2,41 (m, 1H) , 3,94 (s, 3H) , 6,74 (dd, J = 2,4 Hz, 8,4 Hz, 1H) , 6,92 (d, J = 2,4 Hz, 1H) , 7,01 (d, J = 8,4 Hz, 1H) , 7,25 (d, J = 8,0 Hz, 2H), 8,00 (d, J= 8,4 Hz, 2H).

A uma solução do composto A5e (12 g, 42 mmol), em 200 mL de DCM foi adicionado Et3N (12 g, 120 mmol) e, depois, (Ac)20 (12 g, 120 mmol) . A solução foi agitada, de um dia para o outro, à temperatura ambiente e, depois, a mistura de resíduo foi lavada com água e solução salina saturada, seca sobre Na2SC>4, filtrada e concentrada sob pressão reduzida e purificada por cromatografia flash em sílica gel (eluente: PE/EtOAc = 15/1), para dar 13 g de composto Jl como um óleo incolor (Rendimento: 94%).

A uma solução do composto Jl (13 g, 40 mmol) em 300 mL de CCI4 foi adicionado NBS (7,8 g, 45 mmol) e esta solução foi agitada a refluxo durante 1 hora. A solução resultante foi concentrada sob pressão reduzida e purificada por cromatografia flash em sílica gel (eluente: PE/EtOAc = 15/1), para dar 12,5 g de composto J2 como um óleo (Rendimento: 77%).

A um solvente do composto J2 (12,5 g, 30,8 mmol) em 200 mL de THF foi adicionado DBU (10 g) e esta solução foi agitada, de um dia para o outro, à temperatura ambiente. Esta solução foi concentrada sob pressão reduzida para dar um resíduo. A esta mistura de resíduo, a qual foi dissolvida em 80 mL de MeOH e 40 mL de H20 foi adicionado K2CO3 (6 g, 43,5 mmol) e esta solução foi agitada à temperatura ambiente durante 30 min. A solução resultante foi mitigada com água e concentrada sob pressão reduzida. A suspensão foi extraída três vezes com EtOAc e as fases orgânicas combinadas foram secas sobre Na2S04, filtradas, concentradas sob pressão reduzida e purificadas por cromatografia flash em silica gel (eluente: PE/EtOAc = 5/1), para dar 8 g de composto J3 como um óleo (Rendimento: 90%).

A uma solução do composto J3 (8 g, 28 mmol) e DIEA (24 mL) em 150 mL de THF anidro foi adicionado TBSOTf (8,2 g, 31 mmol) , a 0 °C e, depois, a solução foi agitada de um dia para o outro à temperatura ambiente. A solução resultante foi mitigada com água, a 0°C, e extraída três vezes com EtOAc. As fases orgânicas combinadas foram secas sobre MgS04, filtradas, concentradas in vacuo e purificadas por cromatografia flash em sílica gel (eluente: PE/EtOAc = 15/1), para dar 9 g de composto J4 como um óleo incolor (Rendimento: 90%).

A solução do composto J4 (2 g, 5 mmol), 2,6-lutidina (1 g, 10 mmol), NaOI4 (4,27 g, 20 mmol) e 0s04 (300 mg) em 40 mL de 1,4-dioxano e 15 mL de água foram agitados à temperatura ambiente durante 2 h. A solução resultante foi diluída com água e extraída três vezes com EtOAc. As fases orgânicas combinadas foram lavadas duas vezes com solução aquosa de NaHCCq, secas sobre Na2S04, filtradas, concentradas sob pressão reduzida e purificadas por cromatografia flash em sílica gel (eluente: PE/EtOAc = 15/1), para dar 1,8 g de composto J5 como um óleo (Rendimento 94%).

À solução do composto J5 (1,6 g, 4 mmol) em 40 mL de THF anidro foi adicionado MeMgCl (3 M, 3,2 mL, 9,6 mmol) durante 30 min, a -30 °C, sob atmosfera de N2. A solução foi agitada a -30°C ~ -20°C, durante 3 h. Foram adicionados 30 mL de solução aquosa de NH4C1 para mitigar. A camada de água foi extraída duas vezes com DCM. As fases orgânicas combinadas foram secas sobre Na2S04, filtradas, concentradas sob pressão reduzida e purificadas por cromatografia flash em sílica gel (eluente: PE/EA = 30/1), para dar 1,2 g de composto J6 como um óleo incolor (Rendimento: 72,2%).

À solução de J6 (1,2 g, 2,9 mmol) em 40 mL de THF anidro foi adicionado TBAF (1 M, 2,9 mL, 2,9 mmol) durante 30 min, a 0 °C, sob atmosfera de N2. A mistura reaccional foi agitada a -5 °C ~ 0 °C, durante 3 h. A TLC indicou que a reacção estava completa. Foram adicionados 30 mL de solução aquosa de NH4C1 para mitigar. A camada de água foi extraída duas vezes com DCM. As camadas orgânicas combinadas foram secas sobre Na2S04, filtradas, concentradas e purificadas por cromatografia flash em sílica gel (eluente: PE/EA = 10/1), para dar 500 mg de composto J7 (Rendimento: 57%).

À mistura do composto J7 (500 mg, 1,65 mmol), composto I2a (500 mg, 1,65 mmol) e Ph3P (875 mg, 3,7 mmol) em 50 mL de THF seco foi adicionado, gota a gota, DEAD (675 mg, 3,7 mmol), a 0 °C, sob atmosfera de N2 e a solução foi agitada de um dia para o outro à temperatura ambiente. Depois, foram adicionados lentamente 10 mL de MeOH. A solução foi removida por evaporação e o resíduo foi purificado por cromatografia em coluna flash de sílica gel (eluente: PE/EA = 5/1), para dar 600 mg de composto J8 como um sólido (Rendimento: 62%).

À solução do composto J8 (200 mg, 0,34 mmol) em 5 mL de THF e 2 mL de H20 foi adicionado Li0H-H20 (42 mg, 1,0 mmol) e, depois, a mistura foi agitada de um dia para o outro à temperatura ambiente. Esta foi concentrada e diluída com H20. Foi adicionada solução aquosa de HC1 1 N para ajustar o pH para 5, a qual foi extraída com DCM. A camada orgânica foi lavada com solução salina saturada, seca sobre Na2S04, filtrada, concentrada e purificada por cromatografia flash em sílica gel (eluente: PE/EA = 2/1), para dar 50 mg de Exemplo 17 (ácido 4-(2-(2-cloro-4-((3-(2,6-diclorofenil)-5-(2-hidroxipropan-2-il)isoxazol-4-il)metoxi)fenil)ciclopropil)benzóico) como um sólido branco (Rendimento: 24%). RMN de ΤΗ (DMSO, 400 MHz) δ: 1,47-1,61 (m, 8H) , 2,09-2,12 (m, 1H) , 2,29-2,34 (m, 1H) , 5,04 (s, 2H) , 5,98 (s, 1H) , 6,64-6,66 (m, 1H), 6,81-6,82 (m, 1H), 7,06-7,08 (m, 1H) 7,29-7,32 (m, 2H), 7,53-7,57 (m, 1H) , 7,61-7,63 (m, 2H) , 7, 84-7, 86 (m, 2H) , 12,80 (s, 1H) . A pureza LCMS da (fase móvel: 30%-95% de Acetonitrilo- Água) é >95%, Rt = 3,11 min; MS Calcd.: 571; MS Encontrada: 572 (M+l).

À solução do composto J6 (600 mg, 1,45 mmol) e Ts0H-H20 (6 mg, 0,034 mmol) em 20 mL de THF foi adicionado CH2N2 (5 M, 14,5 mmol em Et20) , a 0 °C e, depois, a mistura foi agitada de um dia para o outro à temperatura ambiente. A camada orgânica foi lavada com solução salina saturada, seca sobre Na2SC>4, filtrada, concentrada e purificada por cromatografia flash em silica gel (eluente: PE/EA = 10/1), para dar 300 mg de composto Kl como um óleo amarelo (Rendimento: 50%) . Síntese do Composto K2

À solução do composto Kl (300 mg, 0,7 mmol) em 40 mL de THF anidro foi adicionado TBAF (1 M, 0,7 mL, 0,7 mmol) durante 30 min, a 0 °C, sob atmosfera de N2. A mistura reaccional foi agitada a -5 °C ~ 0°C, durante 3 h. A TLC indicou que a reacção estava completa. 30 mL solução aquosa de NH4C1 foram adicionados para mitigar. A camada de água foi extraída duas vezes com DCM. As camadas orgânicas combinadas foram secas sobre Na2SC>4, filtradas, concentradas sob pressão reduzida e purificadas por cromatografia flash em sílica gel (eluente: PE/EA = 2/1), para dar 150 mg de composto K2 como um óleo incolor (Rendimento: 68%). Síntese do Composto K3

À mistura do composto K2 (150 mg, 0,47 mmol), I2a (142 mg, 0,47 mmol) e Ph3P (247 mg, 0,94 mmol) em 30 mL de THF anidro seco foi adicionado, gota a gota, DEAD (172 mg, 0,94 mmol) , a 0 °C, sob atmosfera de N2 e a solução foi agitada, de um dia para o outro, à temperatura ambiente. Depois foram adicionados, lentamente, 5 mL de MeOH. A solução foi concentrada e o resíduo foi purificado por cromatografia flash em coluna em sílica gel (eluente: PE/EA = 5/1), para dar 150 mg de composto K3 como um sólido (Rendimento: 53%). Síntese do Exemplo IS:

À solução do composto K3 (150 mg, 0,25 mmol) em 5 mL de THF e 2 mL de H20 foi adicionado Li0H-H20 (42 mg, 1,0 mmol) e, depois, a mistura foi agitada de um dia para o outro, à temperatura ambiente. Esta foi concentrada e diluída com H20. Foi adicionada solução aquosa de HC1 1 N para ajustar o pH para 5, o qual foi extraído com DCM. A camada orgânica foi lavada com solução salina saturada, seca sobre Na2S04, filtrada, concentrada e purificada por cromatografia flash em sílica gel (eluente: PE/EA = 2/1) para dar 45 mg de Exemplo 18 ácido 4-(2-(2-cloro-4-((3-(2,6-diclorofenil)-5-(2-metoxipropan-2-il)isoxazol-4-il)metoxi)fenil)ciclopropil)benzóico (Rendimento: 30%). RMN de ΤΗ (CD3OD, 400 MHz) δ: 1,48-1,54 (m, 2H) , 1,67 (s, 6H) , 2,06-2,08 (m, 1H) , 2,37-2,39 (m, 1H) , 3,29 (s, 3H) , 4,97 (s, 2H) , 6,65-6,67 (m, 1H), 6,75-6,76 (m, 1H), 7,03-7,05 (m, 1H) 7,28-7,30 (m, 2H), 7,47-7,54 (m, 3H) , 7, 95-7, 97 (m, 2H) ; A pureza de LCMS (fase móvel: 40%-95% de Acetonitrilo-Água) é >95%, Rt = 3,27 min; MS Calcd.: 587; MS Encontrada: 586 (M-l).

Esquema 12

Síntese do Composto Ll

À solução de 3-oxobutanoato de metilo (8,9 g, 40 mmol, 1,0 eq) e composto A3a (4,64 g, 40 mmol, 1,0 eq) em 70 mL de THF foi adicionado MeONa (2,16 g, 40 mmol, 1,0 eq) e, depois, a mistura foi agitada à temperatura ambiente, durante 16 h. A reacção foi lavada com solução de HC1 1 N, extraída com EtOAc, seca sobre Na2SC>4, concentrada sob pressão reduzida e purificada por cromatografia flash em sílica gel (eluente: PE/EA = 10/1), para dar 4,3 g de composto Ll como um sólido amarelo (Rendimento: 38%). Síntese do Composto L2

A solução do composto Ll (4,3 g, 15 mmol, 1 eq) em 60 mL de DMF e 60 mL de DMF-DMA foi aquecida, a 110 °C, durante 3 h. A reacção foi concentrada sob pressão reduzida e purificada por cromatografia flash em sílica gel (PE/EA = 10/1), para dar 3,86 g de composto L2 como um sólido amarelo (Rendimento: 76%). Síntese do Composto L3

À solução do composto L2 (2,16 g, 6,3 mmol, 1,0 eq) e Si02 (em 22 mL de água) em 54 mL de THF, depois os 44 mL de solução concentrada de HC1 foi adicionada, gota a gota, a 40 °C, durante 1 hora. A reacção foi filtrada, extraída com EtOAc, lavada com água, seca sobre Na2S04, concentrada sob pressão reduzida, para dar 1,99 g de composto L3 como um óleo amarelo (Rendimento: 99%). Síntese do Composto L4

À solução do composto L3 (1,99 g, 6,4 mmol, 1,0 eq) em 20 mL de EtOH foi adicionado NaBH4 (266 mg, 7 mmol, 1,1 eq) a, 0 °C, durante 20 min. Depois, foi adicionada solução aquosa de HC1 (1 mol/L) até a cor da reacção desaparecer. A reacção foi lavada com água, extraída com EtOAc, seca sobre Na2S04, concentrada sob pressão reduzida, para dar 2,01 g de composto L4 como um sólido amarelo (Rendimento: 99%). Síntese do Composto L5

À solução do composto L4 (2,0 g, 6,3 mmol, 1,0 eq) e ácido p-toluenossulfónico (16 mg, 0,06 mmol, 0,01 eq) em 80 mL de DCM anidro foi adicionado 3,4-di-hidro-2/í-pirano (800 mg, 9,5 mmol, 1,5 eq) , gota a gota, sob atmosfera N2 e a solução foi agitada, de um dia para o outro, à temperatura ambiente. A mistura reaccional foi lavada duas vezes com 40 mL de solução aquosa de NaHCCb e a camada aquosa foi extraída três vezes com 100 mL de DCM. As camadas orgânicas combinadas foram secas sobre Na2S04, filtradas, concentradas e purificadas por cromatografia flash em coluna em sílica gel (eluente: PE/EA = 10/1), para dar 1,0 g de composto L5 como um óleo (Rendimento: 40%). Síntese do Composto L6

À solução de L5 (1,0 g, 2,5 mmol, 1,00 eq) em 40 mL de THF anidro foi adicionado DIBAL-H (1 M, 10 mL, 3,75 eq) durante 30 min, a -30 °C, sob atmosfera de N2. A mistura reaccional foi agitada, a -5 °C ~ 0 °C, durante 3 h. A TLC indicou que a reacção estava completa. Foram adicionados 30 mL de solução aquosa de NH4C1 para mitigar. A camada de água foi extraída duas vezes com DCM. As camadas orgânicas combinadas foram secas sobre Na2S04, filtradas, concentradas e purificadas por cromatografia flash em sílica gel (eluente: PE/EA = 5/1), para dar 800 mg de composto L6 como um óleo amarelo pálido (Rendimento: 86%). Síntese do Composto L7

À mistura do composto L6 (372 mg, 1 mmol, 1,0 eq) , I2a (302 mg, 1 mmol, 1,0 eq, preparado de acordo com o procedimento para B13) e Ph3P (524 mg, 2 mmol, 2,0 eq) em 20 mL de THF anidro seco foi adicionado, gota a gota, DEAD (348 mg, 2 mmol, 2,0 eq), a 0 °C, sob atmosfera N2 e a solução foi agitada, de um dia para o outro, à temperatura ambiente. Depois, foram adicionados, lentamente, 10 mL de MeOH. A solução foi removida por filtração e o resíduo foi purificado por cromatografia em coluna flash de sílica gel (eluente: PE/EA = 10/1), para dar 170 mg de composto L7 como um sólido (Rendimento: 26%). Síntese do Composto L8

À solução do composto L7 (170 mg, 0,26 mmol, 1,00 eq) em 5 mL de THF e 1 mL de H20 foi adicionado Li0H-H20 (110 mg, 2,6 mmol, 10 eq) e, depois, a mistura foi agitada de um dia para o outro, à temperatura ambiente. Esta foi concentrada e diluída com H20. Foi adicionada solução aquosa de HC1 1 N para ajustar o pH para 5, a qual foi extraída com DCM. A camada orgânica foi lavada com solução salina saturada, seca sobre Na2SC>4, filtrada, concentrada, para dar 150 mg de composto L8 como um sólido branco (Rendimento: 90%). Síntese do Exemplo 19:

À solução do composto L8 (150 mg, 0,23 mmol, 1,00 eq) em 5 mL de MeOH foi adicionado Ts0H-H20 (65 mg, 0,34 mmol, 1,5 eq) e, depois, a mistura foi agitada de um dia para o outro, à temperatura ambiente. Esta foi concentrada e diluída com H20, a qual foi extraída com DCM. A camada orgânica foi lavada com solução salina saturada, seca sobre Na2S04, filtrada, concentrada e purificada por cromatografia flash em silica gel (eluente: PE/EA = 2/1), para dar 50 mg de Exemplo 19 ácido (4 - (2 - (2-cloro-4-((3-(2,6-diclorofenil)-5-(2- hidroxietil)isoxazol-4-il)metoxi)fenil)-ciclopropil)benzóico) como um sólido branco (Rendimento: 34%). RMN de ΤΗ (DMSO, 400 MHz) δ: 1,48-1,55 (m, 2H) , 2,01-2,11 (m, 1H) , 2,31-2,32 (m, 1H) , 3,09-3,12 (m, 2H) , 3,74-3, 78 (m, 2H) , 4,87 (s, 2H) , 4,99-5,01 (m, 1H) , 6, 67-6,70 (m, 1H) , 6, 84-6, 85 (m, 1H) , 7, 07-7, 09 (m, 1H) 7,30-7,32 (m, 2H) , 7,55- 7,64(m, 3H) , 7,85-7, 87(m, 2H) ; A pureza da LCMS (fase móvel: 10%-95% Acetonitrilo-Água) é >95%, Rt = 3,19 min; MS Calcd.: 557; MS Encontrada: 556 (M-l).

Esquema 13

Síntese do Composto M2:

À solução do composto Ml (5 g, 27,2 mmol) em 30 mL de DMF foi adicionado NaH a 60% (1,20 g, 30 mmol), a 0 °C, e a solução foi agitada durante 0,5 horas. Depois, uma solução de 2-iodopropano (5,1 g, 30 mmol) em 10 mL de DMF foi adicionada, gota a gota, a 0 °C, e a mistura foi agitada durante 2,5 h, à temperatura ambiente. Foi adicionada água para mitigar a reacção e a solução foi extraída três vezes com EtOAc. As camadas orgânicas combinadas foram lavadas três vezes com água e duas vezes com solução salina saturada, consecutivamente, secas sobre Na2S04, filtradas, concentradas sob pressão reduzida e purificadas por cromatografia flash em sílica gel (eluente: PE/EA = 5/1), para dar 2 g de composto M2 (Rendimento: 18%). Síntese do Composto M3:

À solução do composto M2 (2 g, 8,85 mmol) em 20 mL de MeOH foi adicionada uma solução de KOH em MeOH (10 mL de uma solução 2,2 M) e a solução foi agitada, a 20 °C, durante 24 h. Após remoção do solvente sob vácuo, a baixa temperatura, o resíduo foi dissolvido em 20 mL de água e a solução foi neutralizada com HC1 aquoso 1 N (10 mL, 10 mmol) . Após ser agitado durante 20 h, a 0 °C, o sólido formado foi filtrado e o bolo foi lavado com água, para dar 1,16 g de composto M3 como um sólido branco (Rendimento: 62%). Síntese do Composto M4:

A uma solução agitada de composto M3 (1 g, 4,8 mmol) em 10 mL de THF anidro foi adicionado BH3-Me2S (1 mL, 2 M em THF), a 0 °C, sob atmosfera de N2, e esta solução foi agitada à temperatura ambiente, de um dia para o outro, foi adicionada água para mitigar a reacção e a solução resultante foi extraída duas vezes com EtOAc. As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com solução salina saturada, secas sobre Na2S04, filtradas, concentradas sob pressão reduzida e purificadas por cromatografia flash em sílica gel (eluente: PE/EA = 3/1), para dar 578 mg de composto M4 como um óleo incolor (Rendimento: 70%). Síntese do intermediário M5:

A uma solução agitada de cloreto de oxalilo (0,4 mL, 5,28 mmol) em 5 mL de DCM anidro foi adicionada uma solução de DMSO (0,38 mL, 5,28 mmol) em 1 mL de DCM anidro, a -30 °C. Após ser agitada durante 20 min, a solução do composto M4 (578 mg, 2,92 mmol) em 2 mL de DCM anidro foi adicionada em partes, a -30°C. A solução foi agitada durante mais 1 hora e, depois, foi adicionado Et3N (1,4 mL, 10,2 mmol), a -30 °C. Após agitação, de um dia para o outro, à temperatura ambiente, foram adicionados 20 mL de DCM para diluir a mistura reaccional, lavada com ácido cítrico e, depois, solução salina saturada. A solução foi seca sobre Na2S04, filtrada, concentrada sob pressão reduzida e purificada por cromatografia flash em sílica gel (eluente: PE/EA = 5/1), para dar 400 mg de M5 como um sólido branco (Rendimento: 69,4%).

Exemplos adicionais:

Esquema 14, Elucidação da configuração absoluta do exemplo

Síntese do Composto Nl

A uma solução do composto B6 (14,3 g, 50 mmol) em 70 mL de THF seco foi adicionado hidreto de sódio (2,4 g, 60 mmol) a 0 °C, durante 30 min. A esta mistura resultante foi adicionada a solução de composto E2 (8,5 g, 50 mmol) em 50 mL de THF seco, a 0 °C, e a solução foi agitada à temperatura ambiente durante 3 h. A mistura foi mitigada por solução saturada de NH4C1 e extraída com EtOAc. A camada orgânica foi lavada com solução salina saturada, seca sobre Na2S04, filtrada, concentrada e purificada por cromatografia flash em sílica gel (eluente: PE/EA = 50/1), para dar 7,7 g de composto Nl como um sólido branco (Rendimento: 51%). Síntese do Composto N2

A uma solução do composto Nl (7,7 g, 25,5 mmol) e Pd(OAc)2 (1 g) em 50 mL de THF anidro foi adicionada uma solução de CH2N2 em Et20 (25 mL, -100 mmol), a -50 °C, sob atmosfera de N2. Depois, a solução foi aquecida, lentamente, para a temperatura ambiente e agitada durante mais 4 h. A TLC e LCMS indicaram que a reacção estava correcta. Esta foi concentrada e purificada por cromatografia flash em silica gel (eluente: PE/EA = 50/1), para dar 5,1 g de composto N2 como um óleo (Rendimento: 63,3%) .

Separação por HPLC quiral

1,7 g de composto N2 (racémico) foi separado por HPLC quiral preparativo, com uma coluna quiral (coluna: CHIRALPAK IA; Tamanho de coluna: 0,4 6 cm I.D. x 15 cm L; Fase móvel: Hexano/Álcool isopropilico = 80/20 (v/v); Caudal: 1,0 mL/min; Comprimento de onda: UV 254 nm; Equipamento de HPLC: Shimadzu LC 20 com detector UV SPD-20A) , para dar 534 mg de composto N2a (Rt = 5,143 min, % de ee: >99%) e 577 mg de composto N2b (Rt = 6,325 min, % de ee: >99%). Síntese do Composto N3

A uma solução do composto N2b (500 mg, 1,58 mmol) em 10 mL de THF e 3 mL de H20, foi adicionado Li0H-H20 (664 mg, 15,8 mmol) e, depois, a mistura foi agitada, a 40 °C, durante 4 h. Esta foi concentrada, diluída com 5 mL de H20 e foi adicionada solução aquosa de HC1 1 N para acidificar a mistura para pH = 4. Foi adicionado EtOAc para extrair duas vezes e as fases orgânicas combinadas foram secas sobre Na2SC>4, filtradas, concentradas sob pressão reduzida e purificadas por cromatografia flash em silica gel (eluente: PE/EA = 1/3), para dar 430 mg de composto N3 como um sólido branco (Rendimento: 90,1%). Síntese do Sal N3b

A solução do composto N3 (200 mg, 0, 66 mmol) e (S)-1-feniletilamina (80 mg, 0,66 mmol) em 5 mL de tolueno seco foi colocada em refluxo, de um dia para o outro. Esta foi arrefecida para a temperatura ambiente e o sólido formado foi recolhido. O sólido foi lavado com 1 mL de tolueno arrefecido, seco in vácuo, para dar 137 mg de sal N3b com pureza de HPLC e RMN >99%. RMN de (400 MHz, DMSO-d6) δ: 1,37 (d, J = 6,4 Hz, 3H) , 1,47 (m, 2H), 2,15 (m, 1H), 2,30 (m, 1H), 3,77 (s, 3H), 4,17 (m, 1H) , 6,90 (dd, J = 2,4 Hz, 8,8 Hz, 1H) , 7,04 (d, J = 2,4 Hz, 1H) , 7,16 (d, J= 8,8 Hz, 1H) , 7,26 (t, J= 7,2 Hz, 1H) , 7,33 (m, 4H), 7,44 (d, J= 7,2 Hz, 2H), 7,73 (m, 2H).

Crescimento de cristais e determinação de configuração absoluta de N3b

O sal N3b (100 mg) foi dissolvido em 30 mL de EtOH anidro, seguido por 1,8 mL de n-hexano (o hexano foi adicionado até a solução se tornar ligeiramente turva). A solução foi filtrada e colocada separada na prateleira na caixa seca ( — 20 °C) . Após 3 dias, formaram-se cristais incolores.

De acordo com a análise sob ampliação de baixa resolução (10X), foi escolhido um cristal.

Tamanho do cristal 0,35 x 0,15 x 0,14 mm

Parâmetros de célula unitária a = 11,898(5)Â α = 90° com desvio padrão b = 6,801(3)Â β = 92,725(5)° c = 13,836(5)Â y = 90°

Volume celular unitário 1118,3(7) Â3 Símbolo do grupo de espaço P21

Valor Z 2

Densidade calculada 1,259 g/cm3

Temperatura em estudo (em K) 293 (2)K

Fator R Ri = 0,0992 WR2 = 0,1918

Com base nos dados cristalográficos de raios-X do sal N3a, a sua configuração absoluta é (S,S). Síntese do Composto N2b a partir do N4

A uma solução de ácido em bruto N4 (120 mg, 0,21 mmol) em 5 mL de THF foi adicionada uma solução de CH2N2 em Et20 (0,7 mL, 2,80 mmol), a -50 °C, sob atmosfera de N2. Depois, a solução foi aquecida, lentamente, para a temperatura ambiente e agitada durante mais 4 h. A TLC indicou que a reacção estava correcta. Esta foi concentrada e purificada por TLC preparativa, para dar 21 mg de N2b como um sólido branco (Rendimento em dois passos: 32,3%). RMN de ΤΗ (400 MHz, CDC13) δ: 1,47 (m, 2Η) , 2,12 (m, 1 Η), 2,40 (m, 1Η) , 3,82 (s, 3H) , 3,95 (s, 3H) , 6,80 (dd, J = 2,4 Hz, 8,4 Hz, 1H) , 6,97 (d, J = 2,4 Hz, 1 Η) , 7,06 (d, J = 8,4 Hz, 1H) , 7,41 (m, 2H), 7,89 (dd, J= 2,4 Hz, 6,4 Hz, 2H) .

Análise de HPLC quiral (coluna quiral: CHIRALCEL OD;

Tamanho de coluna: 4,6*250 mm; Fase móvel: Hexano/EtOH/AcOH = 60/40/0, 1 (v/v/v)) ; Caudal: 0,8 mL/min) : Rt = 9,312 min (enantiómero de primeira eluição, em comparação com o racemato). Síntese do Composto N5

Uma solução do Exemplo 5b ( ( + )-Isómero) (50 mg, 0,09 mmol) e solução de HC1 6 N (5 mL) em 5 mL de dioxano foi aquecida a,

85 °C, durante 4 h, e foi adicionado EtOAc para extrair. A camada orgânica foi lavada com solução salina saturada, seca sobre Na2S04, filtrada e concentrada sob pressão reduzida, para dar 51 mg de ácido em bruto N5, utilizado na reacção seguinte sem purificação adicional. Síntese do Composto N2b a partir do N5

A uma solução de ácido em bruto N5 (51 mg, 0,09 mmol) em 5 mL de THF foi adicionada uma solução de CH2N2 em Et20 (1 mL, 4,00 mmol), a -50 °C, sob atmosfera de N2. Depois, a solução foi aquecida, lentamente, para a temperatura ambiente e agitada de um dia para o outro. A LCMS indicou que a reacção estava correcta. Esta foi concentrada e purificada por TLC preparativa, para dar 23 mg de N2b como um sólido branco (Rendimento em dois passos: 80,9%). RMN de ΤΗ (400 MHz, CDC13) δ: 1,47 (m, 2H) , 2,12 (m, 1H) , 2.40 (m, 1H) , 3,82 (s, 3H) , 3,95 (s, 3H) , 6,80 (dd, J = 2,4 Hz, 8,4 Hz, 1H), 6,97 (d, J= 2,4 Hz, 1 Η), 7,06 (d, J= 8,4 Hz, 1H), 7.41 (m, 2H), 7,89 (dd, J= 2,4 Hz, 6,4 Hz, 2H).

Análise de HPLC quiral (coluna quiral: CHIRALCEL OD;

Tamanho da coluna: 4,6*250 mm; Fase móvel: Hexano/EtOH/AcOH = 60/40/0, 1 (v/v/v)) ; Caudal: 0,8 mL/min) : Rt = 9, 466 min (enantiómero de primeira eluição, em comparação com o racemato).

Ensaios

Ensaio da actividade de FRET A determinação de uma interacção peptídica de cofactor mediada por ligando para quantificar a ligação do ligando ao receptor nuclear FXR foi realizada como se segue: Preparação do domínio de ligação ao ligando FXR alfa humano: 0 LBD do FXR alfa humano foi expresso em estirpe de E. coli BL21 (DE3) como uma proteína de fusão GST marcada N-terminalmente. 0 ADN que codifica o domínio de ligação ao ligando de FXR foi clonado no vector pDEST15 (Invitrogen) . A expressão ficou sob controlo de um promotor T7 indutível por IPTG. Os limites de aminoácido do domínio de ligação ao ligando foram os aminoácidos 187-472 com entrada de Base de dados NM_005123 (RefSeq). Expressão e purificação do FXR-LBD: Uma pré-cultura, de um dia para o outro, de uma estirpe de E.coli transformada foi diluída 1:20 em meio LB-Ampicilina e cultivada, a 30 °C, para uma densidade óptica de OD60o=0,4-0,6. A expressão génica foi depois induzida por adição de 0,5 mM de IPTG. As células foram incubadas durante mais 6 h, a 30 °C, 180 rpm. As células foram recolhidas por centrifugação (7000 x g, 7 min, temperatura ambiente) . Por litro de cultura celular original, as células foram ressuspensas em tampão de lise de 10 mL (50 mM de Glucose, 50 mM de Tris pH 7,9, 1 mM de EDTA e 4 mg/mL de lisozima) e deixada em gelo durante 30 min. As células foram depois submetidas a sonicação e os detritos celulares foram removidos por meio de centrifugação (22000 x g, 30 min, 4 °C) . Por 10 mL de sobrenadante, foram adicionados 0,5 mL de pasta de Glutationa sefarose 4B pré-lavada (Qiagen) e a suspensão foi mantida em rotação lenta durante 1 h, a 4 °C. As esferas de Glutationa sefarose 4B foram peletizadas por centrifugação (2000 x g, 15 s, 4 °C) e lavadas duas vezes em

tampão de lavagem (25 mM de Tris, 50 mM de KC1, 4 mM de MgCl2 e 1 M de NaCl) . O pélete foi ressuspenso em 3 mL de tampão de eluição por litro de cultura original (tampão de eluição: 20 mM de Tris, 60 mM de KC1, 5 mM de MgCl2 e 80 mM de glutationa adicionada imediatamente antes da utilização como pó) . A suspensão foi deixada em rotação durante 15 min, a 4 °C, as

esferas foram peletizadas e eluídas novamente com metade do volume de tampão de eluição em relação à primeira vez. Os eluatos foram agrupados e dialisados, de um dia para o outro, em 20 mM de tampão Hepes (pH 7,5) contendo 60 mM de KCI, 5 mM de MgCl2, bem como 1 mM de ditiotreitol e 10% (v/v) de glicerol. A proteína foi analisada por SDS-Page. O método mede a capacidade dos ligandos putativos de modular a interacção entre o domínio de ligação ao ligando (LBD) de FXR expresso por bactéria purificada e um péptido biotinilado sintético com base nos resíduos 676-700 de SRC-1 (LCD2, 676-700) . A sequência do péptido utilizado foi

B-CPSSHSSLTERHKILHRLLQEGSPS-COOH, em que o terminal N estava biotinilado (B) . O domínio de ligação ao ligando (LBD) de FXR foi expresso como proteína de fusão com GST em células BL-21, utilizando o vector pDEST15. As células foram lisadas por sonicação e as proteínas de fusão purificadas sobre glutationa sefarose (Pharmacia) de acordo com as instruções do fabricante. Para a selecção dos compostos para a sua influência na interacção FXR-péptido, foi aplicada a tecnologia LANCE de

Perkin Elmer. Este método baseia-se na transferência de energia, dependente de ligando, de dador para um fluoróforo aceitador ligado ao parceiro de ligação de interesse. Para facilidade de manuseamento e redução da interferência da fluorescência do composto, a tecnologia LANCE utiliza marcas de fluoróforos genéricas e foram realizados Ensaios de detecção resolvidos no tempo num volume final de 25 yL numa placa de 384 poços, num tampão à base de Tris (20 mM de Tris-HCl pH 7,5; 60 mM de KC1, 5 mM de MgCl2; 35 ng/pL de BSA), contendo 20-60 ng/poço de FXR-LBD recombinantemente expressos fundidos a GST, 200-600 nM de péptido biotinilado N-terminalmente, representando os aminoácidos SRC1 676-700, 200 ng/poço de conjugado

Estreptavidina-xIAPC (Prozyme) e 6-10 ng/poço de W1024-antiGST Eu (Perkin Elmer). O teor de DMSO das amostras foi mantido a 1%. Após a geração da mistura de ensaio e diluição dos ligandos potencialmente moduladores de FXR, o ensaio foi equilibrado durante um hora no escuro, à temperatura ambiente, em placas FIA pretas de 384 poços (Greiner) . O sinal LANCE foi detectado por um Contador Multimarca VICTOR2VTM Perkin Elmer. Os resultados foram visualizados por representação gráfica da proporção entre a luz emitida a 665 e 615 nm. É observado um nível basal de formação de FXR-péptido na ausência do ligando adicionado. Os ligandos que promovem a formação de complexo induzem um aumento dependente da concentração no sinal florescente resolvido no tempo. Seria esperado que os compostos que se ligam igualmente bem ao FXR monomérico e ao complexo FXR-péptido não apresentassem nenhuma alteração no sinal, enquanto que seria esperado que os ligandos que se ligam preferencialmente ao receptor monomérico induzisse uma diminuição dependente da concentração no sinal observado.

Para avaliar o potencial inibitório dos compostos, foram determinados os valores de EC50 para os compostos de exemplo, bem como para os compostos comparativos como referido abaixo na

Tabela 1.

Ensaio de um híbrido de mamífero (MlH) A determinação de uma transactivação accionada pelo promotor Gal4 mediado por um ligando para quantificar a activação mediada pela ligação ao ligando de FXR foi realizada como se segue: A parte de ADNc que codifica o domínio de ligação ao ligando de FXR foi clonado num vector pCMV-BD (Stratagene) como uma fusão ao domínio de ligação de ADN de GAL4 de levedura sob o controlo do promotor CMV. Os limites de aminoácido do domínio de ligação ao ligando foram os aminoácidos 187-472 com entrada de Base de dados NM_005123 (RefSeq). 0 plasmídeo pFR-Luc (Stratagene) foi utilizado como o plasmídeo repórter, contendo um promotor sintético com cinco repetições em tandem dos locais de ligação da levedura GAL4, conduzindo a expressão do gene luciferase de Photinus pyralis (pirilampo Americano) como o gene repórter. De modo a melhorar a precisão experimental, o

plasmídeo pRL-CMV (Promega) foi co-transfectado. 0 pRL-CMV contém o promotor de CMV constitutivo, controlando a expressão da luciferase de Renilla reniformis. Todos os ensaios do gene repórter de GaL4 foram realizados em células HEK293 (obtidas de DSMZ, Braunschweig, Alemanha) cultivas em MEM com L-Glutamina e BSS de Earle suplementado com 10% de soro bovino fetal, 0,1 mM de aminoácidos não essenciais, 1 mM de piruvato de sódio e 100 porções de Penicilina/Estreptavidina por mL, a 37 °C, em 5% de C02. O meio e suplementos foram obtidos de Invitrogen. Para o ensaio, foram plaqueadas 5 x 105 células por poço em placas de 96 poços em MEM de 100 pL por poço sem Vermelho de Fenol e L-Glutamina e com BSS de Earle suplementado com 10% de carvão/dextrano tratado com FBS (HyClone, South Logan, Utah), 0,1 mM de aminoácidos não essenciais, 2 mM de glutamina, 1 mM de piruvato de sódio e 100 porções de Penicilina/Estreptavidina por mL, incubadas a 37 °C em 5% de C02. No dia seguinte, as células estavam em >90% de confluência. O meio foi removido e as células foram transfectadas transientemente utilizando 20 pL por poço de um OptiMEM - reagente de transfecção à base de polietilenoimina (OptiMEM, Invitrogen; Polietilenoimina, Aldrich Cat N2 40,827-7) incluindo os três plasmídeos descritos anteriormente. O MEM com a mesma composição que a utilizada para plaquear as células foi adicionado 2-4 h após a adição da mistura de transfecção. Depois, foram adicionados os stocks de composto, pré-diluídos em MEM (concentração final do veículo não excedendo 0,1%). As células foram incubadas durante mais 16 h antes das actividades da luciferase de pirilampo e renila serem medidas sequencialmente no mesmo extracto celular utilizando um sistema de Ensaio de Luciferase de Luz Dupla (Dyer et al., Anal. Biochem. 2000, 282, 158-161). Todas as experiências foram realizadas em triplicados.

Para avaliar a potência agonística de FXR dos compostos de exemplo, bem como para os compostos de referência do documento WO 2000/037077, foram determinadas gamas de potência nos ensaios de FRET e M1H como referido abaixo na Tabela 1.

(A= EC50 < 10 nM; B = 10 < EC50 < 100 nM; C = EC50 > 100 nM)

Determinação da farmacocinética em rato, murganho e macaco

Os compostos foram aplicados peroralmente por gavagem a 5 mg/kg cada e por injecção i.v. a 1 mg/kg cada a ratos C57BI/6J ou Sprague Dawley machos com 12 semanas de idade e as concentrações plasmáticas dos itens de teste foram determinadas por LC-MS/MS após pontos temporais, como indicado. No caso de macacos Cinomolgos (Macacca mulatta), a dose foi ajustada para 12 mg/kg p.o., não foi administrada injecção i.v. (Figura la, lb e Tabela 2) .

Tabela 2: Os parâmetros farmacocinéticos não compartimentais do Exemplo 4 e do Exemplo 12 em macacos após administração oral a um nivel de dose de 12 mg/kg.

Uma solução de 2,5 mg/mL de cada item de teste foi produzida por diluição destes no transportador, 0,5% de Hidroxipropilmetilcelulose (p/v) em 20 mM de soro fisiológico tamponado com fosfato pH 7,4. As soluções foram agitadas, de um dia para o outro, à temperatura ambiente e aquecidas para 40 °C durante 10 minutos, resultando numa suspensão completamente homogénea. A aplicação foi realizada por administração da solução, peroralmente, aos murganhos, com um volume de aplicação de 5 mL/kg. Para cada ponto temporal foram utilizados três murganhos ou ratos. No caso dos macacos Cinomolgos foram obtidas amostras sanguíneas por punção venal repetida. As amostras sanguíneas foram tratadas com Li-heparina durante o procedimento de colheita e armazenadas em gelo até centrifugação a 645 g (5 min, 4°C) . O plasma foi recolhido e mantido a -20 °C até ser analisado. A 50 pL da amostra de plasma, foram adicionados 6 pL de acetonitrilo contendo um padrão interno. As amostras foram agitadas vigorosamente e centrifugadas durante 10 minutos, a 6000 g e 20 °C. Uma alíquota do sobrenadante livre de partículas foi transferido para frasquinhos amostrais de 200 pL e, subsequentemente, submetida a LC MS/MS para quantificação. Foram determinadas as concentrações plasmáticas em vários pontos temporais e estão representadas graficamente em relação aos tempos de amostragem como mostrado na Figura 2.

Inesperadamente, verificou-se que os agonistas de FXR aqui descritos apresentam níveis plasmáticos aumentados após administração oral in vivo quando comparados a agonistas de FXR conhecidos descritos na técnica anterior.

Tabela 3: Concentração plasmática versus perfil de tempo de GW4064, Exemplo 4 e Exemplo 12 em Ratos Macho Sprague Dawley após administração intravenosa num nivel de dose de 1 mg/kg

Exemplo 12 (1 mg/kg i.v.)

Como um exemplo, o Exemplo 4 e Exemplo 12 mostraram níveis plasmáticos substancialmente mais elevados em Ratos Macho C57/bl6 e Sprague Dawley quando comparados a GW4064, como representado na Figura lc e Tabela 3.

Tabela 4: Parâmetros Farmacocinéticos Médios de GW4064, Exemplo 4 e Exemplo 12 em Ratos Macho Sprague Dawley após Administração Intravenosa de 1 mg/kg de compostos.

*Co para Intravenoso; N2 de AUC (0-4) (h *ng/mL) para i.v.

Tabela 5: Parâmetros Farmacocinéticos Médios de Exemplo 4 e Exemplo 12 em Ratos Macho Sprague Dawley após Administração Oral de 5 mg/kg de compostos.

Verifica-se que a biodisponibilidade oral absoluta para o Exemplo 4 é 8,8% e para o Exemplo 12 é 30,95%.

Determinação de efeitos hipolipemiantes em murganhos db/db

Os compostos foram aplicados peroralmente por gavagem a 2x5 mg/kg cada a murganhos db/db C57 BLKS lepr_/~ iniciando com a idade de 12 semanas. Os animais foram colocados numa Dieta Rica em Gorduras (ssniff EF R/M 12330 com 59% (kcal) de gordura de Ssniff, Soest, Alemanha) durante duas semanas antes do início da gavagem. O sangue inicial foi recolhido por sangramento retro-orbital. As amostras sanguíneas foram tratadas com Li-heparina durante o procedimento de colheita e armazenadas em gelo até centrifugação a 645 g (5 min, 4 °C) . O plasma foi recolhido e mantido a -20 °C até ser ensaiado. Os triglicéridos totais e colesterol total foram medidos numa alíquota de 3 pL de plasma utilizando os kits comerciais LabAssayTM Triglyceride (Código N2 290-63701) e LabAssayTM Cholesterol (Código N2 294-65801) de Wako Diagnostics (Neuss, Alemanha). Para avaliar o efeito farmacológico dos compostos, os valores médios de triglicéridos e colesterol plasmáticos por grupo de dosagem foram comparados entre os valores iniciais e após 8 semanas de tratamento.

Enquanto que o tratamento de GW4064 resultou numa redução não significativa de -6% em relação ao transportador na glucose sanguínea em jejum após 3 dias de dosagem a 2 x 5 mg/kg/dia, o tratamento com o Exemplo 5 resultou numa diminuição de -16% em relação ao transportador nesta abordagem. Além disso, o Exemplo 5 apresentou uma redução significativa nos lípidos plasmáticos após 3 dias de dosagem a 2 x 5 mg/kg/dia com uma redução de -24,0% no colesterol total e uma redução de -24,2% nos triglicéridos totais, quando comparados com o transportador de controlo.

Actividade in vivo de compostos seleccionados em experiências animais

Os murganhos C57/bl6 (Elevage Janvier, França) com idade de 8 semanas foram colocados numa dieta rica em gordura (60% de kcal de gordura, Sniff, Soest, Alemanha, Cat. N2 E15771-30 (Mod. Surwit) + 0,5% de colesterol (Sigma-Aldrich, Alemanha) adicionado) durante 4 semanas. As amostras sanguíneas iniciais foram recolhidas após jejum, de um dia para o outro, e a glucose plasmática em jejum, foi determinada utilizando um dispositivo Roche Accucheck. Em paralelo, foi gerado plasma com Li-heparina para a determinação dos valores iniciais dos níveis de triglicéridos totais (TG) e colesterol total (TC) . Os animais foram mantidos na dieta de HFD + 0,5% de colesterol durante 8 semanas e, semanalmente, foram recolhidas amostras sanguíneas para a monitorização dos níveis plasmáticos de TG e TC, utilizando kits de análise enzimática convencionais (WAKO Diagnostics, Neuss, Alemanha). Os compostos de teste foram dissolvidos em 100% de gordura de palma e, depois, misturados em alimentos derretidos para uma ingestão diária estimada de 30 mg/kg, com base no consumo alimentar médio no período de adaptação à HFD de 4 semanas. As Figuras 4 e 5 mostram o desenvolvimento dos valores de TG e TC.

Após o sacrifício dos murganhos, os triglicéridos e o colesterol hepáticos foram determinados utilizando o método de Folch (J. Folch et al., "A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues." J. Biol. Chem. 1957, 226, 497-509), com modificações. Em resumo, os tecidos hepáticos congelados foram homogeneizados e extraídos duas vezes com Hexano/2-Propanol (3:2) (30 mg de tecido/1 mL de solvente orgânico) . A camada orgânica foi removida e seca. O pélete resultante foi dissolvido em 0,5 mL de soro fisiológico tamponado com fosfato contendo 0,1% (p/v) de SDS. O teor em triglicéridos e colesterol foi medido por reagentes enzimáticos específicos (Wako Diagnostics, Neuss, Alemanha). O ARN foi isolado utilizando Reagente ARNzol RT (Fermentas) e os níveis de ARNm foram determinados por reacção em cadeia de polimerase quantitativa com transcrição reversa (qRT-PCR) utilizando QPCR Rox Mix Absoluto (Invitrogen) e uma máquina PCR em tempo real de Applied Biosystems (CA) . As sequências do iniciador e sonda (5' a 3') utilizadas foram: SHP, Dir CACCAGACTCCATTCCACG; Rev CTACCCTCAAGAACATTCCAGG; sonda 56-FAM/CAGTGATGTCAACGTCTCCCATGATAG e BSEP, Dir CTGACTGTTGAT AGGCGATGG; Rev CCTCATACGGAAACCCAAGATC; sonda 5 6-FAM/ATGGCT ACCTCAGCACTGGACAAT. Todas as amostras foram corridas em duplicado. A expressão génica (Figura 6) foi expressa em porções arbitrárias e normalizadas relativamente em relação à proteína de ligação de caixa TATA do gene de manutenção (TBP, Dir AAGAAAGGGAGA ATCATGGACC; Rev GAGTAAGTCCTGTGCCGTAAG; sonda:56~ FAM/CCTGAGCAT/Zen/AAGGTGGAAGGCT GTT). A expressão génica de BSEP e SHP foi 6 vezes mais elevada em murganhos tratados com o Exemplo 12.

Determinação da foto-estabilidade a UV

Os compostos de interesse foram dissolvidos utilizando etanol e o seu espectro UV foi analisado para determinar a sua Àmax para estabelecer um comprimento de onda de irradiação para ser utilizado no estudo (ver Fig. 2) . O melhor comprimento de onda para testar a estabilidade a UV da dupla ligação -CH=CH-foi determinado como 254 nm. 0 material adicional dos compostos foi depois dissolvido em etanol deuterado e os RMN de ΤΗ (400 MHz) foram analisados (T=0). Cada amostra foi depois

recuperada do tubo de RMN e submetida a irradiação de UV (254 nm) durante 4 h, 15 h e 70 h. Nos respectivos pontos temporais as amostras individuais foram analisadas novamente por RMN de ΤΗ e o sinal para os protões -CH=CH- avaliados para determinar a percentagem de ligação dupla que permaneceu intacta. Outras alterações nos sinais de deslocamento químico foram também analisadas para alterações adicionais na estrutura geral das moléculas.

Ao contrário do Exemplo 4 (ácido 3-(2-(2-cloro-4-((5-ciclopropil-3-(2,6-diclorofenil)isoxazol-4- il)metoxi)fenil)ciclopropil)benzóico racémico), os compostos GW4064 e PX20535 sofreram grandes alterações no espectro de RMN de após irradiação UP prolongada. Com base na integração relativa dos sinais de RMN de ΤΗ, menos que 30% do GW4064 e 45% do PX20535 estão ainda presentes na mistura, o que sugere, por sua vez, que 70% do GW4064 foi decomposto após 70 h. O exemplo 4 pareceu estar inerte nas 70 h de irradiação UV a lambda = 254 nm (ver Fig. 3a-I).

Um esquema experimental diferente, mais rápido, foi utilizado para investigar um conjunto mais amplo de compostos, em comparação com GW4064. As substâncias foram dissolvidas em DMSO de grau de reagente (99,5%, Karl Roth) a uma concentração de 250 μΜ. A solução de DMSO foi espalhada ao longo de uma lamela de vidro de sílica para uma profundidade de, aproximadamente, 2 mm e irradiada utilizando um conjunto de lâmpadas UV definidas para emissão de 366 nM (Benda Instruments,

Wiesloch, Alemanha) utilizando um conjunto de tubo de 8 W colocado, aproximadamente, 2,5 cm dos materiais alvo. A solução foi amostrada antes da irradiação (T=0 min) e em vários intervalos subsequentemente. Os stocks e amostras foram mantidos em tubos envolvidos em película afastadas da luz directa. As amostras foram injectadas (2 pL) directamente num Sistema LCMS para análise sem qualquer preparação adicional. Os resultados estão representados na Figura 3m e mostram a foto-estabilidade mais elevada dos compostos da presente invenção (Exemplos 12, 12c, 20, 16, 14) em comparação com a porção de estilbeno contendo GW4064.

Lisboa, 22 de Janeiro de 2015

Claims (15)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Composto de acordo com a seguinte fórmula (1), um seu enantiómero, diastereómero, tautómero ou sal farmaceuticamente aceitável

   em que R é seleccionado do grupo consistindo de COOR6, CONR7R8, tetrazolilo ou H, com R6 independentemente seleccionado do grupo consistindo de H ou alquilo Ci-6, e R7 e R8, independentemente um do outro, seleccionados do grupo consistindo de H, alquilo Ci-6, haloalquilo Ci-6, alquileno-Rg Ci-6, S02-alquilo 03-6, em que Rg é seleccionado do grupo consistindo de COOH, OH ou S03H; A é seleccionado do grupo consistindo de fenilo, piridilo, pirazolilo, indolilo, tienilo, benzotienilo, indazolilo, benzisoxazolilo, benzofuranilo, benzotriazolilo, furanilo, benzotiazolilo, tiazolilo, cada, opcionalmente substituído com um ou dois grupos independentemente seleccionados do grupo consistindo de OH, alquilo Ci_6, cicloalquilo C3-6 ou halogéneo; Q é seleccionado do grupo consistindo de fenilo, piridilo, tiazolilo, tiofenilo, pirimidilo, cada, opcionalmente substituído com um ou dois grupos independentemente seleccionados do grupo consistindo de alquilo Ci_6, halogéneo ou CF3;

   em que X = CH, N, NO; Ri é seleccionado do grupo consistindo de hidrogénio, alquilo C1-C3, cicloalquilo C3-C6, alquilcicloalquilo C4-C5, em que o alquilo Ci_3 está opcionalmente substituído com 1 a 3 substituintes independentemente seleccionados de halogéneo, hidroxilo ou alcoxilo Ci-6; R2 e R3 são independentemente seleccionados do grupo consistindo de hidrogénio, alquilo C3-C3, haloalquilo C3-C3, alcoxilo C3-C3, haloalcoxilo C3-C3 e halogéneo.
2. 2. Composto de acordo com a reivindicação 1 em que R é seleccionado do grupo consistindo de COOR6, CONR7R8, tetrazolilo ou H, com R6, R7 e R8 independentemente seleccionados do grupo consistindo de H e alquilo Ci-6; A é seleccionado do grupo consistindo de fenilo, piridilo, indolilo, tienilo, benzotienilo, indazolilo, benzisoxazolilo, benzofuranilo, benzotriazolilo, furanilo, benzotiazolilo, tiazolilo, cada, opcionalmente substituído com um ou dois grupos independentemente seleccionados do grupo consistindo de OH, alquilo Ci-6 e cicloalquilo C3-6; Q é seleccionado do grupo consistindo de fenilo, piridilo, tiazolilo, tiofenilo, pirimidilo, cada, opcionalmente substituído com um ou dois grupos independentemente seleccionados do grupo consistindo de alquilo 03-6, halogéneo e CF3;

   em que X = CH, N, NO; Ri é seleccionado do grupo consistindo de hidrogénio, alquilo Ci-C3, haloalquilo Ci-C3, cicloalquilo C3-C6 e alquilcicloalquilo C4-C5; R2 e R3 são independentemente seleccionados do grupo consistindo de hidrogénio, alquilo Ci-C3, haloalquilo Ci-C3, alcoxilo Ci-C3, haloalcoxilo Ci-C3 e halogéneo.
3. 3. Composto de acordo com a reivindicação 1 ou 2, possuindo a seguinte estrutura

   em que Xi é CH ou N; R4 e R5 são independentemente seleccionados do grupo consistindo de H, alquilo Ci-6, halogéneo e CF3; R-A é seleccionado de R-A=

   ou Ri é seleccionado do grupo consistindo de isopropilo, t-butilo e ciclopropilo; R2 e R3 são independentemente seleccionados do grupo consistindo de halogéneo, alquilo C3-C3, metoxilo e trifluorometoxilo.
4. 4. Composto de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3, em que A é fenilo; Q é fenil opcionalmente substituído, de um modo preferido, substituído com um substituinte, de um modo preferido, halogéneo; X é CH; Ri é cicloalquilo; e R2 e R3 são, cada, halogéneo.
5. 5. Composto de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4 seleccionado entre: ácido 3- ( (2- (2-cloro-4-((5-ciclopropil-3-(2,6- diclorofenil)isoxazol-4-il)metoxi)fenil)ciclopropil) benzóico ácido (-)-3-((2-(2-cloro-4-((5-ciclopropil-3- (2,6- diclorofenil)isoxazol-4-il)metoxi)fenil)ciclopropil) benzóico ácido ( + )-3-(2-(2-cloro-4-((5-ciclopropil-3- (2,6- diclorofenil)isoxazol-4-il)metoxi)fenil)ciclopropil) benzóico ácido 3-((2-(2-cloro-4-((3-(2,6-diclorofenil)-5- isopropilisoxazol-4-il)metoxi)fenil)ciclopropil)benzóico ácido 3-((2-(2-cloro-4-((5-ciclopropil-3- (3,5- dicloropiridin-4-il)isoxazol-4- il)metoxi)fenil)ciclopropil)benzóico 1-óxido de 4-((4-((4-(2-(3-carboxifenil)ciclopropil)-3-clorofenoxi)metil)-5-ciclopropilisoxazol-3-il)-3,5-dicloropiridina ácido 3-((2-(2-cloro-4-((1-(2,6-diclorofenil)-4-isopropil-lH-l,2,3-triazol-5-il)metoxi)fenil)ciclopropil)benzóico 4 - ( ( (4 - (2 - (6 - (lH-tetrazol-5-il)piridin-3-il)ciclopropil)-3-clorofenoxi)metil)-5-ciclopropil-3- (2,6-diclorofenil)isoxazole ácido 5- ( (2- (2-cloro-4- ( (5-ciclopropil-3- (2,6- diclorofenil)isoxazol-4- il)metoxi)fenil)ciclopropil)picolínico.
6. 6. Composto de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4 seleccionado entre ácido 3- ( (2- (6- ( (5-ciclopropil-3- (2,6- diclorofenil)isoxazol-4-il)metoxi)-2-(trifluorometil)piridin-3-il)ciclopropil)benzóico ácido 4-((2-(2-cloro-4-((5-ciclopropil-3- (2,6- diclorofenil)isoxazol-4-il)metoxi)fenil)ciclopropil)benzóico 4- (2- (2-cloro-4-((5-ciclopropil-3-(2,6-diclorofenil)isoxazol-4- il)metoxi)fenil)ciclopropil)benzoato de 1,3-di-hidroxi-2-(hidroximetil)propan-2-aminio ácido (+)-4-(2-(2-cloro-4-((5-ciclopropil-3-(2,6- diclorofenil)isoxazol-4- il)metoxi)fenil)ciclopropil)benzóico ácido (-)-4-((2-(2-cloro-4-((5-ciclopropil-3- (2,6- diclorofenil)isoxazol-4- il)metoxi)fenil)ciclopropil)benzóico ácido 6-((2-(2-cloro-4-((5-ciclopropil-3- (2,6- diclorofenil)isoxazol-4-il)metoxi)fenil)ciclopropil)-1-metil-lH-indazole-3-carboxilico ácido ( + )-6-(2-(2-cloro-4-((5-ciclopropil-3- (2,6- diclorofenil)isoxazol-4-il)metoxi)fenil)ciclopropil)-1-metil-lH-indazole-3-carboxilico ácido (-)-6-((2-(2-cloro-4-((5-ciclopropil-3- (2,6- diclorofenil)isoxazol-4-il)metoxi)fenil)ciclopropil)-1-metil-lH-indazole-3-carboxílico 4- ( (2- (2-cloro-4-((5-ciclopropil-3-(2, 6- diclorofenil)isoxazol-4-il)metoxi)fenil)ciclopropil)-N-(metilsulfonil)benzamida ácido 2- ( (4- (2- (2-cloro-4-((5-ciclopropil-3- (2,6- diclorofenil)isoxazol-4- il)metoxi)fenil)ciclopropil)benzamido)etanossulfónico 4- ( ( (4- (2- (4- (lH-tetrazol-5-il)fenil)ciclopropil)-3-clorofenoxi)metil)-5-ciclopropil-3- (2,6-diclorofenil)isoxazole ácido 4-((2-(2-cloro-4-((3-(2,6-diclorofenil)-5-(2- hidroxipropan-2-il)isoxazol-4- il)metoxi)fenil)ciclopropil)benzóico ácido 5-((2- (2-cloro-4-((5-ciclopropil-3- (2,6- diclorofenil)isoxazol-4-il)metoxi)fenil)ciclopropil)-1-isopropil-lH-pirazole-3-carboxilico ácido 6-((2-(2-cloro-4-((5-ciclopropil-3- (2,6- diclorofenil)isoxazol-4-il)metoxi)fenil)ciclopropil)-1-isopropil-lH-indazole-3-carboxílico ácido 4-((2-(2-cloro-4-((5-ciclopropil-3- (2,6- diclorofenil)isoxazol-4-il)metoxi)fenil)ciclopropil)-2,6-dimetilbenzóico ácido 4-((2-(2-cloro-4-((5-ciclopropil-3- (2- (trifluorometoxi)fenil)isoxazol-4-il)metoxi)fenil)ciclopropil)benzóico ácido ( + )-2- (4- (2- (2-cloro-4-((5-ciclopropil-3-(2,6- diclorofenil)isoxazol-4- il)metoxi)fenil)ciclopropil)benzamido)etanossulfónico ácido (-)-2-((4-(2-(2-cloro-4-((5-ciclopropil-3- (2,6- diclorofenil)isoxazol-4- il)metoxi)fenil)ciclopropil)benzamido)etanossulfónico ácido 2-((4-(2-(2-cloro-4-((5-ciclopropil-3- (2,6- diclorofenil)isoxazol-4- il)metoxi)fenil)ciclopropil)benzamido)acético ácido 4-((2- (2-cloro-4-((4-(2,6-diclorofenil)-1-isopropil- lH-l,2,3-triazol-5-il)metoxi)fenil)ciclopropil)benzóico.
7. 7. Composto de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 6 para utilização na profilaxia e/ou tratamento de doenças mediadas por FXR.
8. 8. Composto de acordo com a reivindicação 7 para utilização na profilaxia e/ou tratamento de estados colestáticos intra-hepáticos crónicos ou algumas formas de estados colestáticos extra-hepáticos, ou fibrose hepática resultante de estados colestáticos crónicos ou estados colestáticos intra-hepáticos agudos; e/ou para utilização na profilaxia e/ou tratamento de distúrbios inflamatórios obstrutivos ou crónicos do fígado; e/ou para utilização na profilaxia e/ou tratamento de cirrose hepática; e/ou para utilização na profilaxia e/ou tratamento de esteatose hepática e sindromes associados, efeitos colestáticos ou fibróticos que estão associados com cirrose induzida por álcool ou com formas de hepatite transmitidas por virus; e/ou para utilização na profilaxia e/ou tratamento de insuficiência hepática ou isquemia hepática após ressecção hepática de qrande porte; e/ou para utilização na profilaxia e/ou tratamento de esteato-hepatite associada a quimioterapia (CASH); e/ou para utilização na profilaxia e/ou tratamento de insuficiência hepática aguda; e/ou para utilização na profilaxia e/ou tratamento de Doenças Intestinais Inflamatórias.
9. 9. Composto de acordo com a reivindicação 7 para utilização na profilaxia e/ou tratamento de distúrbios lipidicos e lipoprotéicos; e/ou para utilização na profilaxia e/ou tratamento de Diabetes Tipo II e complicações clinicas de Diabetes Tipo I e Tipo II, incluindo nefropatia diabética, neuropatia diabética, retinopatia diabética e outros efeitos observados de Diabetes de longa duração clinicamente manifestados; e/ou para utilização na profilaxia e/ou tratamento de estados e doenças, que resultam de degeneração gordurosa e fibrótica crónica de órgãos devido a acumulação forçada de lípidos e, especificamente, de triglicéridos e subsequente activação de vias pró-f ibróticas, tais como Doença de Figado Gordo Não Alcoólica (NAFLD) ou Esteato-hepatite Não Alcoólica (NASH); e/ou para utilização na profilaxia e/ou tratamento de obesidade ou sindrome metabólico (estados combinados de dislipidemia, diabetes ou indice de massa corporal anormalmente elevado); e/ou para utilização na profilaxia e/ou tratamento de enfarte do miocárdio agudo, acidente vascular cerebral agudo ou trombose, que ocorre como desfecho da aterosclerose obstrutiva crónica.
10. 10. Composto de acordo com a reivindicação 7 para utilização na profilaxia e/ou tratamento de distúrbios hiperproliferativos não malignos e distúrbios hiperproliferativos malignos, especificamente de carcinoma hepatocelular, adenoma do cólon e polipose, adenocarcinoma do cólon, cancro da mama, adenocarcinoma do pâncreas, esófago de Barrett e outras formas de doenças neoplásicas do tracto gastrointestinal e do figado.
11. 11. Utilização de um composto de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 6 para a preparação de um medicamento para a profilaxia e/ou tratamento de doenças mediadas por FXR.
12. 12. Utilização de acordo com a reivindicação 11 para a profilaxia e/ou tratamento de estados colestáticos intra-hepáticos crónicos ou algumas formas de estados colestáticos extra-hepáticos, ou fibrose hepática resultante de estados colestáticos crónicos ou estados colestáticos intra-hepáticos agudos; e/ou para a profilaxia e/ou tratamento de distúrbios inflamatórios obstrutivos ou crónicos do fígado; e/ou para a profilaxia e/ou tratamento de cirrose hepática; e/ou para a profilaxia e/ou tratamento de esteatose hepática e síndromes associados, efeitos colestáticos ou fibróticos que estão associados com cirrose induzida por álcool ou com formas de hepatite transmitidas por vírus; e/ou para a profilaxia e/ou tratamento de insuficiência hepática ou isquemia hepática após ressecção hepática de grande porte; e/ou para a profilaxia e/ou tratamento de esteato-hepatite associada a quimioterapia (CASH); e/ou para a profilaxia e/ou tratamento de insuficiência hepática aguda; e/ou para a profilaxia e/ou tratamento de Doenças Intestinais Inflamatórias.
13. 13. Utilização de acordo com a reivindicação 11 para a profilaxia e/ou tratamento de distúrbios lipídicos e lipoprotéicos; e/ou para a profilaxia e/ou tratamento de Diabetes Tipo II e complicações clinicas de Diabetes Tipo I e Tipo II, incluindo nefropatia diabética, neuropatia diabética, retinopatia diabética e outros efeitos observados de Diabetes de longa duração clinicamente manifestados; e/ou para a profilaxia e/ou tratamento de estados e doenças, que resultam de degeneração gordurosa e fibrótica crónica de órgãos devido a acumulação forçada de lípidos e, especificamente, de triglicéridos e subsequente activação de vias pró-f ibróticas, tais como Doença de Fígado Gordo Não Alcoólica (NAFLD) ou Esteato-hepatite Não Alcoólica (NASH); e/ou para a profilaxia e/ou tratamento de obesidade ou síndrome metabólico (estados combinados de dislipidemia, diabetes ou índice de massa corporal anormalmente elevado); e/ou para a profilaxia e/ou tratamento de enfarte do miocárdio agudo, acidente vascular cerebral agudo ou trombose, que ocorre como desfecho da aterosclerose obstrutiva crónica.
14. 14. Utilização de acordo com a reivindicação 11 para a profilaxia e/ou tratamento de distúrbios hiperproliferativos não malignos e distúrbios hiperproliferativos malignos, especificamente de carcinoma hepatocelular, adenoma do cólon e polipose, adenocarcinoma do cólon, cancro da mama, adenocarcinoma do pâncreas, esófago de Barrett e outras formas de doenças neoplásicas do tracto gastrointestinal e do figado.
15. 15. Composto de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 6 para utilização como um medicamento. Lisboa, 22 de Janeiro de 2015