PT2464382T - Terapia de combinação de um anticorpo anti-cd20 afucosilado e bendamustina - Google Patents

Terapia de combinação de um anticorpo anti-cd20 afucosilado e bendamustina Download PDF

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Description

DESCRIÇÃO
Terapia de combinação de um anticorpo anti-CD20 afucosilado e bendamustina A presente invenção refere-se à terapia de combinação de um anticorpo anti-CD20 afucosilado e bendamustina para o tratamento de cancro.
Antecedentes da invenção
Anticorpos afucosilados
As funções efetoras dos anticorpos monoclonais mediadas por células podem ser melhoradas por manipulação do seu componente oligossacárido como descrito em Umana, P., et al., Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180; e US 6602684. Os anticorpos do tipo IgGl, que são os anticorpos mais utilizados na imunoterapia do cancro, consistem em glicoproteinas com um sitio de glicosilação ligada a N conservado em Asn2 97 em cada domínio CH2. Os dois oligossacáridos biantenados complexos ligados a Asn297 estão inseridos entre os domínios CH2, formando contactos extensos com o esqueleto polipeptídico, sendo a sua presença essencial para que o anticorpo possa mediar funções efetoras, tais como a citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC) (Lifely, MR, et al., Glycobiology 5 (1995) 813-822, Jefferis, R. , et al., Immunol. Rev. 163 (1998) 59-76; Wright, A., e
Morrison, S.L., Trends Biotechnol. 15 (1997) 26-32). Umana,
P., et al., Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180 e WO 99/154342 mostraram que a sobre-expressão em células de ovário de hamster chinês (CHO) da β(1,4)-Ν-acetilglicosaminiltransferase III ("GnTIII"), uma glicosiltransferase que catalisa a formação de oligossacáridos bisseccionados, aumenta significativamente a atividade ADCC in vitro dos anticorpos. Alterações na composição do hidrato de carbono em N297 ou a sua eliminação afetam também a ligação de Fc a FcyR e Clq (Umana, P., et al. , Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180; Davies, J., et al. , Biotechnol. Bioeng. 74 (2001) 288-294; Mimura, Y., et al. , J. Biol. Chem. 276 (2001) 45539-45547; Radaev, S., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 16478-16483; Shields, R.L., et al. , J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604; Shields, R.L., et al., J. Biol. Chem. 277 (2002) 26733-26740; Simmons, L.C., et al., J. Immunol. Methods 263 (2002) 133-147).
Foram divulgados estudos que analisam as atividades de anticorpos fucosilados e afucosilados, incluindo anticorpos anti-CD20 (por exemplo, Lida, S., et al., Clin. Cancer Res. 12 (2006) 2879-2887; Natsume, A., et al., J. Immunol. Methods 306 (2005) 93-103; Satoh, M., et al., Expert Opin. Biol.
Ther. 6 (2006) 1161-1173; Kanda, Y., et al., Biotechnol.
Bioeng. 94 (2004) 680-688; Davies, J., et al., Biotechnol.
Bioeng. 74 (2001) 288-294. CD20 e anticorpos anti-CD20 A molécula CD20 (também denominada antigénio de diferenciação restrito a linfócitos B humanos ou Bp35) é uma proteína transmembranar hidrofóbica localizada em linfócitos B maduros e pré-B, que se encontra extensivamente descrita (Valentine, MA et al., J. Biol. Chem. 264 (1989) 11282-11287; e Einfeld, D.A., et al., EMBO J. 7 (1988) 711-717; Tedder, T.F., et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 85 (1988) 208-12; Stamenkovic, I., et al. , J. Exp. Med. 167 (1988) 1975-80; Tedder, T.F., et al., J. Immunol. 142 (1989) 2560-8). O CD20 é expresso em mais de 90% de linfomas não-Hodgkin de células B (LNH) (Anderson, KC et al., Blood 63 (1984) 1424-1433)) mas não é encontrado nem em células estaminais hematopoiéticas, células pró-B, células plasmáticas normais, nem noutros tecidos normais (Tedder, TF, et al., J, Immunol. 135(2) (1985) 973-979).
Existem dois tipos diferentes de anticorpos anti-CD20 que diferem significativamente no seu modo de ligação a CD20 e nas suas atividades biológicas (Cragg, M.S., et al., Blood 103 (2004) 2738-2743; e Cragg, M.S., et al., Blood 101 (2003) 1045-1051). Os anticorpos de tipo I como, por exemplo, o rituximab, são potentes na citotoxicidade mediada pelo complemento, enquanto os anticorpos de tipo II, tais como tositumomab (Bl), 11B8, AT80 ou anticorpos B-Lyl humanizados, iniciam efetivamente a morte da célula-alvo por apoptose independente das caspases com concomitante exposição a fosfatidilserina.
As caracteristicas comuns dos anticorpos anti-CD20 de tipo I e tipo II estão resumidas na Tabela 1.
Tabela 1: Propriedades dos anticorpos anti-CD20 de tipo
I e tipo II
0 documento W02009053038 refere-se à terapia de combinação de um anticorpo anti-CD20 de tipo II com um inibidor do proteassoma.
Bendamustina A bendamustina (nomes comerciais Ribomustin e Treanda, também conhecida como SDX-105) é uma mostarda azotada utilizada no tratamento de leucemia linfocitica crónica (LLC) (Kath, R., et al., J. Cancer Res. Clin. Oncol. 127 (2001) 48-54) e de linfoma não-Hodgkin (LNH). Pertence à família de fármacos designados agentes alquilantes. Está também a ser investigada para o tratamento de sarcoma (Bagchi, S., Lancet Oncol. 8 (2007) 674) . A bendamustina tem sido utilizada como agente terapêutico com outros agentes diferentes, incluindo rituximab (Cheson, B.D., et al. , J Clin Oncol. 27(9) 2009 1492-501; Knauf, W., Expert Rev Anticancer Ther. (2) 9 (2009) 165-74; Plosker, G.L., et al., Drugs. 68(18) (2008) 2645-60).
Descrição Abreviada da Invenção
Foi agora inesperadamente constatado que a combinação de bendamustina e de um anticorpo anti-CD20 afucosilado, o referido anticorpo compreendendo uma sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada (VH) de SEQ ID NO: 7 e uma sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve (VL) de SEQ ID NO: 20, apresenta efeitos antiproliferativos sinérgicos (por exemplo, mais do que aditivos) em comparação com a combinação com o anticorpo anti-CD20 não afucosilado rituximab. A invenção compreende a utilização do referido anticorpo anti-CD20 afucosilado, tendo uma quantidade de fucose de 60% ou menos da quantidade total de oligossacáridos (açúcares) em Asn297, no fabrico de um medicamento para o tratamento de um cancro que expressa CD20 em combinação com bendamustina.
Outro aspeto da invenção é o referido anticorpo anti-CD20 afucosilado, tendo uma quantidade de fucose de 60% ou menos da quantidade total de oligossacáridos (açúcares) em Asn297, para utilização no tratamento de um cancro que expressa CD20 em combinação com bendamustina.
Numa concretização, a quantidade de fucose está compreendida entre 40% e 60% da quantidade total de oligossacáridos (açúcares) em Asn297.
Noutra concretização, a quantidade de fucose é 0% da quantidade total de oligossacáridos em Asn297.
Em algumas formas de realização, o anticorpo anti-CD20 é um anticorpo IgGl.
Noutra forma de realização, o referido cancro que expressa CD20 é um linfoma não-Hodgkin de células B (LNH).
Numa concretização, o anticorpo B-Lyl humanizado é administrado numa dosagem de 800 a 1200 mg nos dias 1, 8, 15 de um ciclo de dosagem de 6 semanas, e depois numa dosagem de 800 a 1200 mg no dia 1 de até cinco ciclos de dosagem de 4 semanas, e a bendamustina é administrada numa dosagem de 80 mg/m2 a 110 mg/m2 nos dias 1 e 2 de até seis ciclos de dosagem de 4 semanas. É igualmente revelada uma composição que compreende um anticorpo anti-CD20 afucosilado, tendo uma quantidade de fucose de 60% ou menos, e bendamustina para o tratamento de cancro.
Descrição Minuciosa da Invenção A invenção compreende a utilização de um anticorpo anti-CD20 afucosilado de isótipo IgGl ou IgG3 (preferencialmente de isótipo IgGl) , tendo uma quantidade de fucose de 60% ou menos da quantidade total de oligossacáridos (açúcares) em Asn297, o referido anticorpo compreendendo uma sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada (VH) de SEQ ID NO: 7 e uma sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve (VL) de SEQ ID NO: 20, no fabrico de um medicamento para o tratamento de um cancro que expressa CD20 em combinação com bendamustina. Numa concretização, o anticorpo anti-CD20 afucosilado liga-se a CD20 com uma KD de 10 ~9 M a 10~13 mole/1.
Numa concretização, a quantidade de fucose está compreendida entre 40% e 60% da quantidade total de oligossacáridos (açúcares) em Asn297. 0 termo "anticorpo" engloba as várias formas de anticorpos, incluindo mas não se limitando a anticorpos inteiros, anticorpos humanos, anticorpos humanizados e anticorpos geneticamente modificados como anticorpos monoclonais, anticorpos quiméricos ou anticorpos recombinantes, bem como fragmentos de tais anticorpos desde que sejam mantidas as propriedades caracteristicas de acordo com a invenção. Os termos "anticorpo monoclonal" ou "composição de anticorpo monoclonal" como aqui utilizados referem-se a uma preparação de moléculas de anticorpo de uma única composição de aminoácidos. Em conformidade, o termo "anticorpo monoclonal humano" refere-se a anticorpos que apresentam uma única especificidade de ligação, com as regiões variável e constante derivadas de sequências de imunoglobulina de linha germinal humana. Numa concretização, os anticorpos monoclonais humanos são produzidos por um hibridoma que inclui uma célula B obtida a partir de um animal não humano transgénico, por exemplo, um rato transgénico, tendo um genoma que compreende um transgene da cadeia pesada humana e um transgene da cadeia leve humana leve fundidos a uma célula imortalizada.
0 termo "anticorpo quimérico" refere-se a um anticorpo monoclonal que compreende uma região variável, isto é, região de ligação, de uma fonte ou espécie, e pelo menos uma porção de uma região constante derivada de uma fonte ou espécie diferente, normalmente preparado por técnicas de ADN recombinante. São especialmente preferidos anticorpos quiméricos que compreendem uma região variável murina e uma região constante humana. Tais anticorpos quiméricos murinos/humanos são o produto de genes de imunoglobulina expressos que compreendem segmentos de ADN que codificam regiões variáveis de imunoglobulina murina e segmentos de ADN que codificam regiões constantes de imunoglobulina humana. Outras formas de "anticorpos quiméricos" abrangidos pela presente invenção são aquelas em que a classe ou subclasse foi modificada ou alterada em relação ao anticorpo original. Tais anticorpos "quiméricos" são também denominados "anticorpos de classe alterada". Os métodos para produzir anticorpos quiméricos envolvem técnicas convencionais de ADN recombinante e de transfeção de genes bem conhecidas na arte. Ver, p. ex., Morrison, S.L., et al., Proc. Natl. Acad Sei. USA 81 (1984) 6851-6855; US 5 202 238 e US 5 204 244. O termo "anticorpo humanizado" refere-se a anticorpos nos quais a framework ou "regiões determinantes de complementaridade" (CDR) foram modificadas para compreender as CDR de uma imunoglobulina de especificidade diferente da especificidade da imunoglobulina parental. Numa concretização preferida, uma CDR murina é enxertada na região framework de um anticorpo humano para preparar o "anticorpo humanizado". Ver, p. ex., Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327; e Neuberger, M.S., et al., Nature 314 (1985) 268-270. O termo "anticorpo humano", conforme utilizado aqui, pretende incluir anticorpos com regiões variáveis e constantes derivadas de sequências de imunoglobulina de linha germinal humana. Os anticorpos humanos são bem conhecidos no estado da técnica (van Dijk, MA, e van de Winkel, JG, Curr. Opin. Pharmacol. 5 (2001) 368-374) . Com base nesta tecnologia, podem ser produzidos anticorpos humanos contra uma grande variedade de alvos. Exemplos de anticorpos humanos estão descritos, por exemplo, em Kellermann, SA, et al., Curr Opin Biotechnol. 13 (2002) 593-597. 0 termo "anticorpo humano recombinante", conforme utilizado aqui, pretende incluir todos os anticorpos humanos que são preparados, expressos, criados ou isolados por meios recombinantes, tais como os anticorpos isolados a partir de uma célula hospedeira, como uma célula NSO ou CHO, ou a partir de um animal (p. ex., um rato) que é transqénico, com qenes de imunoglobulina humana, ou anticorpos expressos por meio de um vetor de expressão recombinante transfetado numa célula hospedeira. As regiões variável e constante de tais anticorpos humanos recombinantes são derivadas de sequências de imunoglobulina de linha germinal humana numa forma rearranjada. Os anticorpos humanos recombinantes de acordo com a invenção foram submetidos a hipermutação somática in vivo. Assim, as sequências de aminoácidos das regiões VH e VL dos anticorpos recombinantes são sequências que, embora derivadas e relacionadas com as sequências VH e VL da linha germinal humana, podem não existir naturalmente in vivo no repertório da linha germinal humana de anticorpos.
Conforme utilizado aqui, os termos "ligação" ou "ligação de modo especifico" referem-se à ligação do anticorpo a um epitopo do antigénio tumoral num ensaio in vitro, de preferência num ensaio de ressonância de plasmão (BIAcore, GE-Healthcare Uppsala, Suécia) , com antigénio de tipo selvagem purificado. A afinidade de ligação é definida pelos termos ka (constante de velocidade para a associação do anticorpo do complexo anticorpo/antigénio), kD (constante de dissociação) e KD (kD/ka) . Ligação ou ligação de modo especifico significa uma afinidade de ligação (KD) de 10 8 mole/1 ou menos, de preferência de 10~9 M a 10"13 mole/1. Deste modo, um anticorpo afucosilado de acordo com a invenção está especificamente ligado ao antigénio tumoral com uma afinidade de ligação (KD) de 10 ~8 mole/1 ou menos, preferencialmente de 1(T9 M a 1(T13 mole/1. O termo "molécula de ácido nucleico", conforme utilizado aqui, pretende incluir moléculas de ADN e moléculas de ARN. Uma molécula de ácido nucleico pode ser de cadeia simples ou de cadeia dupla, mas de preferência é ADN de cadeia dupla.
Os "domínios constantes" não estão diretamente envolvidos na ligação do anticorpo a um antigénio, mas estão envolvidos nas funções efetoras (ADCC, ligação ao complemento e CDC). A "região variável" (região variável de uma cadeia leve [VL] , região variável de uma cadeia pesada [VH]) como aqui utilizado denota cada uma do par de cadeias leve e pesada que estão envolvidas diretamente na ligação do anticorpo ao antigénio. Os domínios das cadeias variáveis leve e pesada humanas têm a mesma estrutura geral, e cada domínio compreende quatro regiões framework (FR) cujas sequências estão amplamente conservadas, ligadas por três "regiões hipervariáveis" (ou regiões determinantes de complementaridade, CDRs). As regiões framework adotam uma conformação de folha b e as CDRs podem formar loops que ligam a estrutura de folha b. As CDRs em cada cadeia são mantidas na sua estrutura tridimensional pelas regiões framework e formam, juntamente com as CDRs da outra cadeia, o local de ligação ao antigénio.
Os termos "região hipervariável" ou "porção de um anticorpo que se liga ao antigénio" quando aqui utilizados referem-se aos resíduos de aminoácidos de um anticorpo que são responsáveis pela ligação ao antigénio. A região hipervariável compreende resíduos de aminoácidos das "regiões determinantes de complementaridade" ou "CDRs". As regiões "framework" ou "FR" são aquelas regiões de domínio variável diferentes dos resíduos da região hipervariável, conforme aqui definidos. Por conseguinte, as cadeias leve e pesada de um anticorpo compreendem, do terminal N ao terminal C, os domínios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 e FR4. Especialmente, a CDR3 da cadeia pesada é a região que mais contribui para a ligação ao antigénio. As regiões CDR e FR são determinadas de acordo com a definição padrão de Rabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) e/ou os resíduos de urn "loop hipervariável". A bendamustina é ácido 4-[5-[bis(2-cloroetil)amino]-1-metilbenzimidazol-2-il] butanoico. Os nomes comerciais são Ribomustin e Treanda; a bendamustina é também conhecida como SDX-105. A bendamustina é uma mostarda azotada utilizada no tratamento de leucemia linfocítica crónica (LLC) (Rath, R. et al. , J. Cancer Res. Clin. Oncol. 127 (2001) 48-54) e do linfoma não-Hodgkin (LNH). Pertence à família de fármacos designados agentes alquilantes. Está também a ser investigada para o tratamento de sarcoma (Bagchi, S., Lancet Oncol. 8 (2007) 674). O termo "anticorpo afucosilado" refere-se a um anticorpo de isótipo IgGl ou IgG3 (preferencialmente de isótipo IgGl) com um padrão alterado de glicosilação na região Fc em
Asn297, possuindo um nível reduzido de resíduos de fucose. A glicosilação de IgGl ou IgG3 humanas ocorre em Asn297, como glicosilação com oligossacáridos complexos biantenados fucosilados no núcleo, terminada com até 2 resíduos Gal. Estas estruturas são designadas por resíduos de glicano GO, G1 (0Cl,6 ou 0Cl,3) ou G2, dependendo da quantidade de resíduos Gal terminais (Raju, T.S., BioProcess Int. 1 (2003) 44-53). A glicosilação de tipo CHO das partes Fc do anticorpo está descrita, por exemplo, por Routier, F.H., Glycoconjugate J. 14 (1997) 201-207. Os anticorpos expressos de forma recombinante em células hospedeiras CHO não glicomodifiçadas são usualmente fucosilados em Asn297, numa quantidade de pelo menos 85%. Note-se que o termo "um anticorpo afucosilado", conforme utilizado aqui, inclui um anticorpo que não tem fucose no seu padrão de glicosilação. É do conhecimento comum que a posição típica do resíduo glicosilado num anticorpo é a asparagina na posição 297 de acordo com o sistema de numeração da UE ("Asn297"). O "sistema de numeração da UE" ou "índice da UE" é geralmente utilizado quando se refere a um resíduo numa região constante da cadeia pesada da imunoglobulina (p. ex., o índice da UE referido em Rabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) expressamente aqui incorporado por referência).
Assim, um anticorpo afucosilado de acordo com a invenção significa um anticorpo de isótipo IgGl ou IgG3 (preferencialmente de isótipo IgGl) em que a quantidade de fucose é de 60% ou menos da quantidade total de oligossacáridos (açúcares) em Asn297 (o que significa que pelo menos 40% ou mais dos oligossacáridos da região Fc em Asn297 são afucosilados). Numa concretização, a quantidade de fucose está compreendida entre 40% e 60% dos oligossacáridos da região Fc em Asn297. Noutra forma de concretização , a quantidade de fucose é de 50% ou menos e, ainda noutra forma de concretização, a quantidade de fucose é de 30% ou menos dos oligossacáridos da região Fc em Asn297. Numa concretização alternativa, a quantidade de fucose é 0% dos oligossacáridos da região Fc em Asn297. De acordo com a invenção, "quantidade de fucose" significa a quantidade do referido oligossacárido (fucose) na cadeia de oligossacárido (açúcar) em Asn2 97, relacionada com a soma de todos os oligossacáridos (açúcares) ligados a Asn 297 (p. ex., estruturas complexas, híbridas e de manose elevada), determinada por espetrometria de massa MALDI-TOF e calculada como valor médio (um procedimento detalhado para determinar a quantidade de fucose está descrito, p. ex., no documento W02008/077546). Além disso, numa concretização, os oligossacáridos da região Fc são bissetados. O anticorpo afucosilado, de acordo com a invenção, pode ser expresso numa célula hospedeira glicomodifiçada, manipulada para expressar pelo menos um ácido nucleico codificante de um polipéptido que possui atividade GnTIII em quantidade suficiente para fucosilar parcialmente os oligossacáridos na região Fc. Numa concretização, o polipéptido com atividade GnTIII é um polipéptido de fusão. Alternativamente, de acordo com US 6 946 292, a atividade de al,6-fucosiltransferase da célula hospedeira pode ser diminuída ou eliminada para gerar células hospedeiras glicomodifiçadas. A quantidade de fucosilação do anticorpo pode ser predeterminada, p. ex., quer por condições de fermentação (p. ex., tempo de fermentação), quer pela combinação de pelo menos dois anticorpos com diferentes quantidades de fucosilação. Tais anticorpos afucosilados e respetivos métodos de glicomanipulação estão descritos nos documentos WO 2005/044859, WO 2004/065540, WO 2007/031875, Umana, P., et al., Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180, WO 99/154342, WO 2005/018572, WO 2006/116260, WO 2006/114700, WO 2005/011735, WO 2005/027966, WO 97/028267, US2006/0134709, US2005/0054048, US2005/0152894, WO 2003/035835, WO 2000/061739. Estes anticorpos glicomanipulados exibem uma ADCC aumentada. Outros métodos de glicomanipulação que produzem anticorpos afucosilados de acordo com a invenção estão descritos, p. ex., em Niwa, R., et al., J. Immunol. Methods 306 (2005) 151-160; Shinkawa, T., et al., J Biol Chem, 278 (2003) 3466-3473; WO 03/055993 ou US2005/0249722.
Assim, um aspeto da invenção é a utilização de um anticorpo anti-CD20 afucosilado de isótipo IgGl ou IgG3 (preferencialmente de isótipo IgGl) que se liga especificamente ao CD20, tendo uma quantidade de fucose de 60% ou menos da quantidade total de oligossacáridos (açúcares) em Asn297, compreendendo o referido anticorpo uma sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada (VH) de SEQ ID NO: 7 e uma sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve (VL) de SEQ ID NO: 20, no fabrico de um medicamento para o tratamento de cancro em combinação com bendamustina. Numa concretização, a quantidade de fucose está compreendida entre 40% e 60% da quantidade total de oligossacáridos (açúcares) em Asn297. CD20 (também conhecido como o antigénio de linfócitos B CD20, o antigénio de superfície dos linfócitos B Bl, Leu-16, Bp35, BM5 e LF5; a sequência é caracterizada pela entrada P11836 da base de dados SwissProt) é uma proteína transmembranar hidrofóbica, com um peso molecular de aproximadamente 35 kD, localizada em linfócitos B maduros e pré-B. (Valentine, M.A., et al., J. Biol. Chem. 264(19) (1989) 11282-11287; Tedder, T.F., et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 85 (1988) 208-212; Stamenkovic, I., et al. , J. Exp. Med. 167 (1988) 1975-80; Einfeld, D.A., et al., EMBO J. 7 (1988) 711-7; Tedder, T.F., et al., J. Immunol. 142 (1989) 25 60-25 68) . 0 gene humano correspondente é o membro 1 da subfamília A de 4 domínios transmembranares, também conhecido como MS4A1. Este gene codifica um membro da família de genes 4A transmembranar. Os membros desta família de proteínas nascentes são caracterizados por aspetos estruturais comuns e limites semelhantes no splicing de intrões/exões, além de exibirem padrões de expressão únicos entre células hematopoiéticas e tecidos não linfoides. Este gene codifica a molécula de superfície dos linfócitos B que desempenha um papel no desenvolvimento e diferenciação de células B em células plasmáticas. Este membro da família está localizado em llql2, entre um grupo de membros da família. O splicing alternativo deste gene resulta em duas variantes de transcrição que codificam a mesma proteína.
Os termos "CD20" e "antigénio CD20" são aqui utilizados indistintamente e incluem quaisquer variantes, isoformas e espécies homólogas de CD20 humano que são expressas naturalmente por células, ou são expressas em células transfetadas com o gene CD20. A ligação de um anticorpo da invenção ao antigénio CD20 medeia a morte de células que expressam CD20 (p. ex., uma célula tumoral) por inativação do CD20. A morte das células que expressam CD20 pode ocorrer por um ou mais dos seguintes mecanismos: Indução da morte celular/apoptose, ADCC e CDC.
Sinónimos de CD20, conforme reconhecido na técnica, incluem o antigénio de linfócitos B CD20, o antigénio de superfície de linfócitos B Bl, Leu-16, Bp35, BM5 e LF5. O termo "anticorpo anti-CD20", de acordo com a invenção, é um anticorpo que se liga especificamente ao antigénio CD20. Dependendo das atividades biológicas e propriedades de ligação dos anticorpos anti-CD20 ao antigénio CD20, podem distinguir-se dois tipos de anticorpos anti-CD20 (anticorpos anti-CD20 de tipo I e de tipo II) de acordo com Cragg, M.S. et al., Blood 103 (2004) 2738-2743; e Cragg, M.S., et al.,
Blood 101 (2003) 1045-1051, ver Tabela 2.
Tabela 2: Propriedades dos anticorpos anti-CD20 de tipo
I e de tipo II
Exemplos de anticorpos anti-CD20 de tipo II incluem, p. ex. , o anticorpo IgGl humanizado B-Lyl (um anticorpo IgGl humanizado quimérico, conforme revelado no documento W02005/044859), IgGl de 11B8 (conforme revelado no documento W02004/035607) e IgGl de AT80. Tipicamente, os anticorpos anti-CD20 de tipo II de isótipo IgGl apresentam propriedades CDC caracteristicas. Os anticorpos anti-CD20 de tipo II apresentam uma CDC diminuída (se isótipo IgGl) em comparação aos anticorpos de tipo I do isótipo IgGl.
Exemplos de anticorpos anti-CD20 de tipo I incluem, p. ex., rituximab, HI47, IgG3 (ECACC, hibridoma) , IgGl de 2C6 (conforme revelado em WO 2005/103081), IgGl de 2F2 (conforme revelado nos documentos WO 2004/035607 e WO 2005/103081) e IgGl de 2H7 (conforme revelado no documento WO 2004/056312).
Os anticorpos anti-CD20 afucosilados de acordo com a invenção são, numa forma de concretização, um anticorpo anti-CD20 de tipo II, numa concretização mais específica, o anticorpo anti-CD20 de tipo II é um anticorpo B-Lyl humanizado afucosilado.
Os anticorpos anti-CD20 afucosilados de acordo com a invenção têm uma citotoxicidade celular dependente de anticorpos aumentada (ADCC), ao contrário dos anticorpos anti-CD20 sem fucose reduzida.
Por "anticorpo anti-CD20 afucosilado com citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC) aumentada" entende-se um anticorpo anti-CD20 afucosilado, tal como este termo é aqui definido, apresentando uma ADCC aumentada conforme determinado por qualquer método adequado conhecido pelas pessoas competentes na especialidade. Um ensaio in vitro aprovado para a ADCC é o seguinte: 1) o ensaio utiliza células alvo que se sabe expressarem o antigénio alvo reconhecido pela região de ligação ao antigénio do anticorpo; 2) como células efetoras, o ensaio utiliza células mononucleares de sangue periférico humano (PBMCs), isoladas a partir do sangue de um dador saudável escolhido aleatoriamente; 3) o ensaio é realizado de acordo com o seguinte protocolo: i) as PBMCs são isoladas utilizando procedimentos convencionais de centrifugação por densidade e são suspensas a 5 x 106 células/ml em meio de cultura de células RPMI; ii) as células alvo são cultivadas por métodos convencionais de cultura de tecidos, colhidas na fase de crescimento exponencial com uma viabilidade superior a 90%, lavadas em meio de cultura de células RPMI, marcadas com 100 micro-Curies de 51Cr, lavadas duas vezes com meio de cultura de células e ressuspensas em meio de cultura de células a uma densidade de 105 células/ml; iii) 100 microlitros da suspensão final de células alvo são transferidos para cada poço de uma placa de microtitulação de 96 poços; iv) o anticorpo é diluído em série, de 4000 ng/ml para 0,04 ng/ml, em meio de cultura de células, e 50 microlitros das soluções de anticorpo resultantes são adicionados às células alvo na placa de microtitulação de 96 poços, testando em triplicado várias concentrações de anticorpo cobrindo toda a referida gama de concentrações; v) para os controlos de libertação máxima (MR) , 3 poços adicionais na placa contendo as células alvo marcadas recebem 50 microlitros de uma solução aquosa a 2% (VN) de detergente não iónico (Nonidet, Sigma, St. Louis) em vez da solução de anticorpo (ponto iv acima); vi) para os controlos de libertação espontânea (SR), 3 poços adicionais na placa contendo as células alvo marcadas recebem 50 microlitros de meio de cultura de células RPMI em vez da solução de anticorpo (ponto iv acima); vii) a placa de microtitulação de 96 poços é então centrifugada a 50 x g durante 1 minuto e incubada durante 1 hora a 4 °C; viii) são adicionados 50 microlitros da suspensão de PBMC (ponto i acima) a cada poço para produzir uma proporção efetor: célula alvo de 25: 1 e as placas são colocadas numa incubadora sob atmosfera de CO2 a 5% a 37 °C durante 4 horas; ix) o sobrenadante isento de células de cada poço é colhido e a radioatividade libertada experimentalmente (ER) é quantificada com um contador gama; x) a percentagem de lise específica é calculada para cada concentração de anticorpo de acordo com a fórmula (ER-MR) / (MR-SR) x 100, onde ER é a radioatividade média quantificada (ver ponto ix acima) para essa concentração de anticorpo, MR é a radioatividade média quantificada (ver ponto ix acima) para os controlos MR (ver ponto v acima) e SR é a radioatividade média quantificada (ver ponto ix acima) para os controlos SR (ver ponto vi acima); 4) "aumento da ADCC" é definido como um aumento da percentagem máxima de lise específica observada na gama de concentração de anticorpos testada acima e/ou como uma redução da concentração de anticorpo necessária para atingir metade da percentagem máxima de lise específica observada na gama de concentrações de anticorpos testada acima. O aumento da ADCC é relativamente à ADCC medida através do ensaio anterior, mediada pelo mesmo anticorpo, produzida pelo mesmo tipo de células hospedeiras, utilizando os mesmos métodos padrão de produção, purificação, formulação e armazenamento que são conhecidos pelas pessoas competentes na especialidade, mas que não foi produzida por células hospedeiras manipuladas para sobre-expressar GnTIII. O referido "aumento da ADCC" pode ser obtido por glicomanipulação dos referidos anticorpos, o que significa melhorar as referidas funções naturais efetoras de anticorpos monoclonais mediadas por células através da manipulação do seu componente oligossacárido, conforme descrito em Umana, P., et al., Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180 e US 6602684. O termo "citotoxicidade dependente do complemento (CDC)" refere-se à lise de células alvo de tumor humano pelo anticorpo de acordo com a invenção na presença de complemento. A CDC é determinada preferencialmente pelo tratamento de uma preparação de células que expressam CD20, com um anticorpo anti-CD20 de acordo com a invenção e na presença de complemento. A CDC é detetada se o anticorpo induzir, a uma concentração de 100 nM, a lise (morte celular) de 20% ou mais das células tumorais após 4 horas. O ensaio é realizado preferencialmente com células tumorais marcadas com 51Cr ou Eu e determinação de 51Cr ou Eu libertados. Os controlos incluem a incubação das células alvo tumorais com complemento, mas sem o anticorpo. O anticorpo "rituximab" (anticorpo de referência; exemplo de um anticorpo anti-CD20 de tipo I) é um anticorpo monoclonal quimérico geneticamente modificado contendo domínio constante murino gama 1 humano dirigido contra o antigénio CD20 humano. Este anticorpo quimérico contém domínios constantes gama 1 humanos e é identificado pelo nome "C2B8" em US 5736137 (Andersen et al.) emitida a 17 de abril de 1998, atribuída à IDEC Pharmaceuticals Corporation. O rituximab está aprovado para o tratamento de doentes com linfoma não-Hodgkin de células B recidivo, ou refratário de baixo grau, ou folicular, positivo para CD20. Estudos do mecanismo de ação in vitro demonstraram que o rituximab exibe citotoxicidade dependente do complemento humano (CDC) (Reff, M.E., et al., Blood 83(2) (1994) 435-445). Além disso, exibe atividade significativa em ensaios que medem a citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC). O rituximab não é afucosilado.
0 termo "anticorpo B-Lyl humanizado" refere-se ao anticorpo B-Lyl humanizado conforme revelado nos documentos WO 2005/044859 e WO 2007/031875, que foi obtido a partir do anticorpo anti-CD20 monoclonal murino B-Lyl (região variável da cadeia pesada (VH) murina: SEQ ID NO: 1; região variável da cadeia leve (VL) murina: SEQ ID NO: 2 - ver Poppema, S. e Visser, L., Biotest Bulletin 3(1987)131-139) por quimerização com um domínio constante humano de IgGl e subsequente humanização (ver documentos WO 2005/044859 e WO 2007/031875 ) . Estes "anticorpos B-Lyl humanizados" são revelados em pormenor nos documentos WO 2005/044859 e WO 2007/031875. O "anticorpo B-Lyl humanizado" aqui descrito tem uma região variável da cadeia pesada (VH) selecionada do grupo de SEQ ID NO: 3 a SEQ ID NO: 20 (de B-HH2 a B-HH9 e de B-HL8 a B-HL17 de WO 2005/044859 e WO 2007/031875). Especialmente preferidas são as Seq. ID n.2s 3, 4, 7, 9, 11, 13 e 15 (B- HH2, B-HH3, B-HH6, B-HH8, B-HL8, B-HL11 e B-HL13 de WO 2005/044859 e WO 2007/031875). Numa forma de concretização específica, o "anticorpo B-Lyl humanizado" tem uma região variável da cadeia leve (VL) de SEQ ID No. 20 (B-KV1 de WO 2005/044859 e WO 2007/031875). Numa concretização específica, o "anticorpo B-Lyl humanizado" tem uma região variável da cadeia pesada (VH) de SEQ ID NO: 7 (B-HH6 de WO 2005/044859 e WO 2007/031875) e uma região variável da cadeia leve (VL) de SEQ ID No. 20 (B-KV1 de WO 2005/044859 e WO 2007/031875) . Além disso, numa forma de concretização, o anticorpo B-Lyl humanizado é um anticorpo IgGl. De acordo com a invenção, tais anticorpos B-Lyl humanizados afucosilados são glicomanipulados (GE) na região Fc de acordo com os procedimentos descritos nos documentos WO 2005/044859, WO 2004/065540, WO 2007/031875, Umana, P. et al. Nature
Biotechnol. 17 (1999) 176-180 e WO 99/154342. Numa concretização da invenção, o anticorpo anti-CD20 utilizado é B-Lyl humanizado afucosilado glicomanipulado conhecido como B-HH6-B-KV1 GE. Tais anticorpos B-Lyl humanizados glicomanipulados têm um padrão alterado de glicosilação na região Fc, tendo preferencialmente um nível reduzido de resíduos de fucose. Numa concretização, a quantidade de fucose é de 60% ou menos da quantidade total de oligossacáridos em Asn297 (numa concretização, a quantidade de fucose está compreendida entre 40% e 60%, noutra concretização a quantidade de fucose é de 50% ou menos, e ainda noutra concretização a quantidade de fucose é de 30% ou menos, e ainda noutra forma de concretização a quantidade de fucose é de 0%) . Além disso, numa concretização específica, os oligossacáridos da região Fc são bissetados. Estes anticorpos B-Lyl humanizados glicomodifiçados apresentam uma ADCC aumentada. 0 componente oligossacárido pode afetar significativamente as propriedades importantes para a eficácia de uma glicoproteina terapêutica, incluindo a estabilidade física, a resistência ao ataque de proteases, as interações com o sistema imunitário, a farmacocinética e a atividade biológica específica. Tais propriedades podem depender não apenas da presença ou ausência dos oligossacáridos, mas também das estruturas específicas destes. Podem ser feitas algumas generalizações entre a estrutura dos oligossacáridos e a função das glicoproteínas. Por exemplo, certas estruturas de oligossacáridos medeiam a depuração rápida das glicoproteínas da corrente sanguínea através de interações com específicas proteínas que se ligam a hidratos de carbono, enquanto outras podem ser ligadas por anticorpos e desencadear reações imunes indesejadas. (Jenkins, N., et al., Nature Biotechnol. 14 (1996) 975-981).
As células de mamífero são hospedeiros excelentes para a produção de glicoproteínas terapêuticas devido à sua capacidade de glicosilar proteínas na forma mais compatível para aplicação humana. (Cumming, D.A., et al., Glycobiology 1 (1991) 115-30; Jenkins, N., et al., Nature Biotechnol. 14 (1996) 975-981). As bactérias muito raramente glicolisam proteínas e, tal como outros tipos de hospedeiros comuns, por exemplo, células de leveduras, fungos filamentosos, insetos e plantas, resultam em padrões de glicosilação associados à depuração rápida da corrente sanguínea, interações imunes indesejáveis e, em alguns casos específicos, atividade biológica reduzida. Entre as células de mamíferos, as células de ovário de hamster chinês (CHO) têm sido as mais habitualmente utilizadas nas duas últimas décadas. Além de proporcionarem padrões de glicosilação adequados, estas células permitem a geração uniforme de linhas celulares clonais geneticamente estáveis e altamente produtivas. Podem ser cultivadas a altas densidades em biorreatores simples, utilizando meios isentos de soro, e permitem o desenvolvimento de bioprocessos seguros e reprodutíveis. Outras células animais utilizadas habitualmente incluem células de rim de hamster bebé (BHK) , células de mieloma de rato NSO e SP2/0. Mais recentemente, foi também testada a produção a partir de animais transgénicos. (Jenkins, N., et al., Nature Biotechnol. 14 (1996) 975-981).
Todos os anticorpos contêm estruturas de hidratos de carbono em posições conservadas nas regiões constantes da cadeia pesada, sendo que cada isótipo possui uma matriz distinta de estruturas de hidratos de carbono ligados a N, afetando de modo variável a montagem, secreção ou atividade funcional das proteínas. (Wright, A., e Monison, S.L., Trends Biotech. 15 (1997) 26-32). A estrutura do fixado hidrato de carbono ligado a N varia consideravelmente com o grau de processamento, e pode incluir oligossacáridos complexos de manose elevada, multirramifiçados bem como biantenados. (Wright, A., e Morrison, S.L., Trends Biotech. 15 (1997) 26-32). Tipicamente, há processamento heterogéneo das estruturas de núcleo do oligossacárido ligadas a um local de glicosilação específico, de tal modo que até mesmo os anticorpos monoclonais existem como glicoformas múltiplas. Do mesmo modo, foi demonstrado que grandes diferenças na glicosilação de anticorpos ocorrem entre linhas celulares, e até pequenas diferenças são observadas para uma dada linha celular cultivada sob diferentes condições de cultura. (Lifely, MR, et al., Glycobiology 5 (8) (1995) 813-22).
Uma forma de obter grandes aumentos de potência ao mesmo tempo que se mantém um processo de produção simples e se evitam potenciais efeitos secundários significativos indesejáveis é aumentar as funções efetoras naturais de anticorpos monoclonais mediadas por células através da manipulação do seu componente oligossacárido, conforme descrito em Umana, P. , et al., Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180 e US 6602684. Os anticorpos do tipo IgGl, que são os anticorpos mais utilizados na imunoterapia do cancro, consistem em glicoproteinas com um sitio de glicosilação ligada a N conservado em Asn297 em cada domínio CH2. Os dois oligossacáridos biantenados complexos fixados em Asn297 estão inseridos entre os domínios CH2, formando contactos extensos com o esqueleto polipeptídico, sendo a sua presença essencial para que o anticorpo possa mediar funções efetoras, tais como a citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC) (Lifely, MR, et al., Glycobiology 5 (1995) 813-822, Jefferis, R. , et al., Immunol. Rev. 163 (1998) 59-76; Wright, A., e Morrison, SL, Trends Biotechnol. 15 (1997) 26-32).
Foi anteriormente demonstrado que a sobre-expressão em células de ovário de hamster chinês (CHO) de β(1,4)-Ν-acetilglicosaminiltransferase 111 ("GnTII17y") , uma glicosiltransferase que catalisa a formação de oligossacáridos biseccionados, aumenta significativamente a atividade ADCC in vitro de um anticorpo monoclonal quimérico antineuroblastoma (chCE7) produzido por células CHO manipuladas. (Ver Umana, P., et al., Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180; e WO 99/154342, cujo conteúdo é aqui integralmente incorporado por referência). O anticorpo chCE7 pertence a uma grande classe de anticorpos monoclonais não conjugados que possuem afinidade e especificidade tumorais elevadas, mas têm pouca potência para serem clinicamente úteis quando produzidos a nível industrial em linhas celulares padrão sem a enzima GnTIII (Umana, P. et al. Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180). Esse estudo foi o primeiro a mostrar que se podiam alcançar grandes aumentos na atividade ADCC por manipulação das células produtoras de anticorpos no sentido de expressar GnTIII, o que também conduziu a um aumento na proporção de oligossacáridos biseccionados associados à região constante (Fc), incluindo oligossacáridos não fucosilados bissecionados, acima dos níveis encontrados em anticorpos naturais. 0 termo "cancro", conforme aqui utilizado, inclui linfomas, leucemias linfocíticas, cancro do pulmão, cancro pulmonar não de pequenas células (CPNPC), cancro pulmonar das células bronquioloalveolares, cancro dos ossos, cancro do pâncreas, cancro da pele, cancro da cabeça ou pescoço, melanoma cutâneo ou intraocular, cancro do útero, cancro do ovário, cancro retal, cancro da região anal, cancro do estômago, cancro gástrico, cancro do cólon, cancro da mama, cancro do útero, carcinoma das trompas de Falópio, carcinoma do endométrio, carcinoma do colo do útero, carcinoma da vagina, carcinoma da vulva, doença de Hodgkin, cancro do esófago, cancro do intestino delgado, cancro do sistema endócrino, cancro da glândula tiroide, cancro da glândula paratiroideia, cancro da glândula suprarrenal, sarcoma dos tecidos moles, cancro da uretra, cancro do pénis, cancro da próstata, cancro da bexiga, cancro do rim ou uréter, carcinoma de células renais, carcinoma da pélvis renal, mesotelioma, cancro hepatocelular, cancro biliar, neoplasias do sistema nervoso central (SNC), tumores do eixo espinal, glioma do tronco cerebral, glioblastoma multiforme, astrocitomas, schwannomas, ependimonas, meduloblastomas, meningiomas, carcinomas de células escamosas, adenoma pituitário, incluindo versões refratárias de qualquer um dos cancros anteriores, ou uma combinação de um ou mais dos cancros anteriores. Numa concretização, o termo "cancro" refere-se a um cancro que expressa CD20. 0 termo "expressão do antigénio CD20" pretende indicar um nível significativo de expressão do antigénio CD20 numa célula, preferencialmente na superfície celular de uma célula T ou B, mais preferencialmente de uma célula B, de um tumor ou cancro, respetivamente, de preferência um tumor não sólido. Os doentes com um "cancro que expressa CD20" podem ser determinados por ensaios convencionais conhecidos na técnica. Por exemplo, a expressão do antigénio CD20 pode ser medida por deteção imuno-histoquímica (IHC), FACS ou deteção com base em PCR do mARN correspondente. 0 termo "cancro que expressa CD20", conforme utilizado aqui, refere-se a todos os cancros nos quais as células cancerosas apresentam uma expressão do antigénio CD20. De preferência, o cancro que expressa CD20, conforme utilizado aqui, refere-se a linfomas (de preferência linfomas não-Hodgkin [LNH] de células B) e leucemias linfociticas. Estes linfomas e leucemias linfociticas incluem, p. ex., a) linfomas foliculares, b) linfomas de pequenas células não clivadas/linforna de Burkitt (incluindo linfoma de Burkitt endémico, linfoma de Burkitt esporádico e linfoma de não Burkitt) c) linfomas da zona marginal (incluindo linfoma de células B da zona marginal extranodal (linfomas do tecido linfoide associado a mucosas, MALT), linfoma de células B da zona marginal nodal e linfoma da zona marginal esplénica), d) linfoma de células do manto, e) linfoma de células grandes (incluindo linfoma difuso de grandes células [LDGCB], linfoma difuso de células mistas, linfoma imunoblástico, linfoma primário do mediastino de células B, linfoma angiocêntrico-linfoma pulmonar de células B) , f) leucemia de células pilosas, g) linfoma linfocitico, macroglobulinemia de Waldenstrom, h) leucemia linfocitica aguda (LLA) , leucemia linfocitica crónica (LLC)/linfoma linfocitico pequeno, leucemia prolinfocitica de células B, i) neoplasias de células plasmáticas, mieloma de células plasmáticas, mieloma múltiplo, plasmocitoma, j) doença de Hodgkin.
Numa outra forma de concretização, o cancro que expressa CD20 é um linfoma não-Hodgkin (LNH) de células B. Noutra concretização, o cancro que expressa CD20 é um linfoma de células do manto, leucemia linfocitica aguda (LLA), leucemia linfocitica crónica (LLC), linfoma difuso de células grandes de células B (LDGCB), linfoma de Burkitt, leucemia de células pilosas, linfoma folicular, mieloma múltiplo, linfoma da zona marginal, transtorno linfoproliferativo pós-transplante, linfoma associado ao VIH, macroglobulinemia de Waldenstrom ou linfoma primário do SNC. 0 termo "um método de tratamento" ou seu equivalente, quando aplicado a, por exemplo, cancro, refere-se a um procedimento ou curso de ação concebido para reduzir ou eliminar o número de células cancerosas num doente ou para aliviar os sintomas de um cancro. "Um método de tratamento" de cancro ou outro distúrbio proliferativo não significa necessariamente que as células cancerosas ou o outro distúrbio serão, de facto, eliminados, que o número de células ou o distúrbio será, de facto, reduzido, ou que os sintomas de um cancro ou do outro distúrbio serão, de facto, aliviados. Muitas vezes, um método de tratamento de cancro será realizado mesmo perante uma baixa probabilidade de sucesso, pois, tendo em conta o historial médico e a esperança de sobrevivência estimada de um doente, é esperado que induza um curso benéfico global de ação.
Os termos "coadministração" ou "coadministrar" referem-se à administração dos referidos anticorpo anti-CD20 afucosilado e bendamustina na forma de uma única formulação ou de duas formulações separadas. A coadministração pode ser simultânea ou sequencial em qualquer ordem, havendo preferencialmente um período de tempo enquanto ambos (ou todos) os agentes ativos exercem simultaneamente as suas atividades biológicas. 0 referido anticorpo anti-CD20 afucosilado e a bendamustina são coadministrados de modo simultâneo ou sequencial (p. ex., via intravenosa (iv) por perfusão contínua [uma para o anticorpo anti-CD20 e uma eventualmente para a bendamustina] ) . Quando ambos os agentes terapêuticos são coadministrados sequencialmente, a dose é administrada no mesmo dia em duas administrações separadas ou um dos agentes é administrado no dia 1 e o segundo é coadministrado desde o dia 2 ao dia 7, de preferência desde o dia 2 ao dia 4. Assim, o termo "sequencialmente" significa no prazo de 7 dias após a dose do primeiro componente (bendamustina ou anticorpo), de preferência no prazo de 4 dias após a dose do primeiro componente; e o termo "simultaneamente" significa ao mesmo tempo. Os termos "coadministração" a respeito das doses de manutenção do referido anticorpo anti-CD20 afucosilado e bendamustina significam que as doses de manutenção podem ser coadministradas simultaneamente se o ciclo de tratamento for apropriado para ambos os fármacos, p. ex., todas as semanas. Por exemplo, ou a bendamustina é administrada entre cada primeiro e terceiro dia e o referido anticorpo afucosilado é administrado todas as semanas, ou as doses de manutenção são coadministradas sequencialmente, quer no espaço de um dia ou de vários dias. É óbvio que os anticorpos são administrados ao doente numa "quantidade terapeuticamente eficaz" (ou simplesmente "quantidade eficaz"), que é a quantidade do respetivo composto ou combinação que provocará a resposta biológica ou médica de um tecido, sistema, animal ou ser humano que o investigador, veterinário, médico ou outro clinico pretendem alcançar. A quantidade de coadministração do referido anticorpo anti-CD20 afucosilado e da bendamustina, bem como o momento da coadministração, dependerão do tipo (espécie, sexo, idade, peso, etc.) e da condição clinica do doente a ser tratado, e da gravidade da doença ou condição clinica a ser tratada. 0 anticorpo é adequadamente administrado ao doente de uma vez só ou ao longo de uma série de tratamentos.
Se a administração for intravenosa, o tempo da perfusão inicial para o referido anticorpo anti-CD20 afucosilado ou bendamustina pode ser mais longo do que os tempos das perfusões subsequentes, por exemplo, aproximadamente 90 minutos para a perfusão inicial e aproximadamente 30 minutos para as perfusões subsequentes (se a perfusão inicial tiver sido bem tolerada).
Consoante o tipo e a gravidade da doença, cerca de 1 pg/kg a 50 mg/kg (p. ex., 0,1-20 mg/kg) do referido anticorpo anti-CD20 afucosilado, e de 1 pg/kg a 50 mg/kg (p. ex., 0,1-20 mg/kg) de bendamustina são possíveis dosagens iniciais para a coadministração de ambos os fármacos ao doente. Numa concretização, a dosagem preferencial do referido anticorpo anti-CD20 afucosilado (preferencialmente, o anticorpo B-Lyl humanizado afucosilado) estará na gama de cerca de 0,05 mg/kg a cerca de 30 mg/kg. Assim, uma ou mais doses de cerca de 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg, 10 mg/kg ou 30 mg/kg (ou qualquer combinação das mesmas) podem ser administradas ao doente. Numa concretização, a dosagem de bendamustina estará na gama de 0,01 mg/kg a cerca de 30 mg/kg, p. ex., de 0,1 mg/kg a 10,0 mg/kg. Consoante o tipo (espécie, sexo, idade, peso, etc.) e a condição clínica do doente e o tipo de anticorpo anti-CD20 afucosilado, a dosagem e o regime de administração do referido anticorpo afucosilado e da bendamustina podem diferir, p. ex., o referido anticorpo anti-CD20 afucosilado pode ser administrado, p. ex. , entre cada uma a três semanas e a bendamustina pode ser administrada diariamente, ou entre cada dois e dez dias. Poderá ser administrada uma dose de ataque inicial mais elevada, seguida de uma ou mais doses inferiores.
Numa forma de concretização preferida, a dosagem preferida do referido anticorpo anti-CD20 afucosilado (de preferência o anticorpo B-Lyl humanizado afucosilado) será de 800 a 1200 mg nos dias 1, 8, 15 de um ciclo de dosagem de 6 semanas, e depois numa dosagem de 800 a 1200 mg no dia 1 de até cinco ciclos de dosagem de 4 semanas, e a dosagem preferida de bendamustina será, por exemplo, de 80 mg/m2 a 110 mg/m2 (numa concretização, de 110 mg/m2, noutra forma de realização, de 90 mg/m2) nos dias 1 e 2 (perfundida intravenosamente ao longo de 30 minutos nos dias 1 e 2) de até seis ciclos de dosagem de 4 semanas. Alternativamente, a dosagem do referido anticorpo anti-CD20 afucosilado pode ser de 800 a 1200 mg (p. ex., 1000 mg) no dia 1 de até oito ciclos de dosagem de 3 semanas.
Numa concretização, o medicamento é útil para prevenir ou reduzir metástases ou maior disseminação num doente que sofre de cancro, preferencialmente um cancro que expressa CD20. O medicamento é útil para aumentar a duração de sobrevivência de um tal doente, aumentando a sobrevivência livre de progressão de tal doente, aumentando a duração da resposta, resultando numa melhoria estatisticamente significativa e clinicamente significativa do doente tratado, conforme medida pela duração de sobrevivência, sobrevivência livre de progressão, grau de resposta ou duração da resposta. Numa forma de concretização específica, o medicamento é útil para aumentar o grau de resposta num grupo de doentes.
No contexto desta invenção, no tratamento contra o cancro de combinação de anticorpo anti-CD20 afucosilado e bendamustina, podem ser utilizados outros agentes citotóxicos, quimioterapêuticos ou contra o cancro, ou compostos que melhoram os efeitos de tais agentes (p. ex., citocinas). Estas moléculas estão adequadamente presentes em combinação em quantidades eficazes para o objetivo pretendido. Numa concretização, o referido tratamento de combinação de anticorpo anti-CD20 afucosilado e bendamustina é utilizado sem esses outros agentes citotóxicos, quimioterapêuticos ou contra o cancro, ou sem compostos que melhoram os efeitos de tais agentes.
Tais agentes incluem, por exemplo: agentes alquilantes ou agentes com uma ação alquilante, tais como ciclofosfamida (CTX, p. ex., citoxano®) , clorambucilo (CHL, p. ex., Leukeran®) , cisplatina (CisP, p. ex., Platinol®) , bussulfano (p. ex., Myleran®) , melfalano, carmustina (BCNU), estreptozotocina, trietilenomelamina (TEM), mitomicina C e semelhantes; antimetabolitos, tais como metotrexato (MTX), etoposido (VP16, p. ex., Vepesid®), 6-mercaptopurina (6MP), 6-tiocguanina (6TG), citarabina (Ara-C), 5-fluorouracilo (5-FU) , capecitabina (p. ex., Xeloda®), dacarbazina (DTIC) e semelhantes; antibióticos, tais como actinomicina D, doxorrubicina (DXR, p. ex., Adriamicina®), daunorrubicina (daunomicina), bleomicina, mitramicina e semelhantes; alcaloides, como alcaloides de vinca, tais como vincristina (VCR), vinblastina, e semelhantes; e outros agentes antitumorais, tais como paclitaxel (p. ex., Taxol®) e derivados de paclitaxel, agentes citostáticos, glicocorticoides, tais como dexametasona (DEX, p. ex., Decadron®) e corticosteroides, tais como prednisona, inibidores de enzimas de nucleosideos, tais como hidroxiureia, enzimas que reduzem o número de aminoácidos, tais como asparaginase, leucovorina e outros derivados de ácido fólico e semelhantes, diversos agentes antitumorais. Os seguintes agentes também podem ser utilizados como agentes adicionais: amifostina (por exemplo, Etyol®), datinomicina, mecloretamina (mostarda de azoto), estreptozocina, ciclofosfamida, lomustina (CCNU), doxorubicina lipo (p. ex., Doxil®), gemcitabina (p. ex., Gemzar®) daunorubicina lipo (p. ex., Daunoxome®), procarbazina, mitomicina, docetaxel (p. ex., Taxotere®), aldesleucina, carboplatina, oxaliplatina, cladribina, camptotecina, CPT 11 (irinotecano), 10-hidroxi-7- etil-camptotecina (SN38), floxuridina, fludarabina , ifosfamida, idarrubicina, mesna, interferão beta, interferão alfa, mitoxantrona, topotecano, leuprolide, megestrol, melfalano, mercaptopurina, plicamicina, mitotano, pegaspargase, pentostatina, pipobromano, plicamicina, tamoxifeno, tenipósido, testolactona, tioguanina, tiotepa, mostarda de uracilo, vinorelbina, clorambucilo. Preferencialmente, o tratamento de combinação de anticorpo anti-CD20 afucosilado e bendamustina é utilizado sem estes agentes adicionais. A utilização dos agentes citotóxicos e contra o cancro descritos acima, bem como de fármacos antiproliferativos contra o cancro dirigidos a um alvo, tais como os inibidores da proteína-quinase, em regimes quimioterapêuticos, está geralmente bem caracterizada nas técnicas de terapia do cancro, e o seu uso no presente contexto é abrangido pelas mesmas considerações no que toca à monitorização da tolerância e eficácia, bem como ao controlo das vias de administração e dosagens, com alguns ajustamentos. Por exemplo, as dosagens reais dos agentes citotóxicos podem variar com a resposta de células cultivadas do doente determinada por métodos de histocultura. Geralmente, a dosagem será inferior à quantidade utilizada na ausência de outros agentes adicionais.
As dosagens típicas de um agente citotóxico eficaz podem estar nas gamas recomendadas pelo fabricante e, quando sugerido por respostas in vitro ou respostas em modelos animais, podem ser reduzidas até cerca de uma ordem de magnitude da concentração ou quantidade. Assim, a dosagem real dependerá da avaliação do médico, da condição clínica do doente e da eficácia do método terapêutico com base na reatividade in vitro de células malignas primárias cultivadas ou de uma amostra de tecido histocultivada, ou das respostas observadas em modelos animais adequados.
No contexto desta invenção, uma quantidade eficaz de radiação ionizante pode ser aplicada e/ou um radiofármaco pode ser utilizado em adição ao tratamento de combinação de anticorpo anti-CD20 afucosilado e bendamustina contra o cancro que expressa CD20. A fonte de radiação pode ser externa ou interna ao doente a ser tratado. Quando a fonte é externa ao doente, a terapia é conhecida como radioterapia de feixe externo (EBRT). Quando a fonte de radiação é interna ao doente, o tratamento é chamado braquiterapia (BT). Os átomos radioativos para utilização no contexto desta invenção podem ser selecionados do grupo que inclui, entre outros, rádio, césio-137, irídio-192, amerício-241, ouro-198, cobalto-57, cobre-67, tecnécio-99, iodo-123, iodo-131 e índio-111. É também possível marcar o anticorpo com tais isótopos radioativos. De preferência, o tratamento de combinação de anticorpo anti-CD20 afucosilado e de bendamustina é utilizado sem essa radiação ionizante. A radioterapia é um tratamento padrão para o controlo de tumores não ressecáveis ou inoperáveis e/ou de metástases tumorais. Resultados melhores foram observados quando a radioterapia foi combinada com quimioterapia. A radioterapia baseia-se no princípio de que uma radiação de dose elevada administrada a uma área alvo resultará na morte de células reprodutoras em tecidos tumorais e normais. 0 regime de dosagem de radiação é geralmente definido em termos de dose absorvida de radiação (Gy), tempo e fracionamento, e deve ser cuidadosamente definido pelo oncologista. A quantidade de radiação que um doente recebe dependerá de várias considerações, mas as duas mais importantes são a localização do tumor em relação a outras estruturas ou órgãos críticos do corpo e a extensão à qual o tumor se espalhou. Um curso de tratamento típico para um doente submetido a radioterapia será um programa de tratamento ao longo de um período de 1 a 6 semanas, com uma dose total entre 10 e 80 Gy administrada ao doente numa única fração diária de cerca de 1,8 a 2,0 Gy, 5 dias por semana. Numa forma de concretização preferida desta invenção, há sinergia quando tumores em doentes humanos são tratados com o tratamento de combinação da invenção e com radiação. Por outras palavras, a inibição do crescimento tumoral por meio dos agentes que constituem a combinação da invenção é aumentada quando combinada com radiação, opcionalmente com outros agentes quimioterapêuticos ou contra o cancro. Os parâmetros das radioterapias adjuvantes estão, por exemplo, incluídos no documento WO 99/60023.
Os anticorpos anti-CD20 afucosilados podem ser administrados a um doente de acordo com métodos conhecidos, tais como administração intravenosa como um bolus ou por perfusão contínua durante um período de tempo, pelas vias intramuscular, intraperitoneal, intracerebrospinal, subcutânea, intra-articular, intrassinovial, ou intratecal. Numa concretização, tais anticorpos são administrados por administração intravenosa ou subcutânea. A bendamustina pode ser administrada a um doente de acordo com métodos conhecidos, p. ex. , por administração intravenosa como um bolus ou perfusão contínua ao longo de um período de tempo, pelas vias intramuscular, intraperitoneal, intracerebrospinal, subcutânea, intra-articular, intrassinovial, intratecal ou perorai. De acordo com uma forma de concretização, tal anticorpo é administrado por administração intravenosa ou intraperitoneal.
Conforme aqui utilizado, pretende-se que um "transportador farmaceuticamente aceitável" inclua qualquer material compatível com administração farmacêutica, incluindo solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotónicos e retardadores de absorção e outros materiais e compostos compatíveis com administração farmacêutica. Exceto se qualquer meio ou agente convencional for incompatível com o composto ativo, está prevista a sua utilização nas composições da invenção. Nas composições, podem também ser incorporados compostos ativos suplementares.
Composições farmacêuticas
As composições farmacêuticas podem ser obtidas processando o anticorpo anti-CD20 e/ou a bendamustina de acordo com a presente invenção com veículos inorgânicos ou orgânicos farmaceuticamente aceitáveis. Por exemplo, é possível utilizar lactose, amido de milho ou seus derivados, talco, ácido esteárico ou seus sais e semelhantes, como veículos para comprimidos, comprimidos revestidos, drageias e cápsulas de gelatina dura. Como veículos adequados para cápsulas de gelatina mole são referidos, por exemplo, óleos vegetais, ceras, gorduras, polióis semissólidos e líquidos e afins. No entanto, dependendo da natureza da substância ativa, não são normalmente necessários veículos no caso de cápsulas de gelatina mole. Veículos adequados para a produção de soluções e xaropes são, por exemplo, água, polióis, glicerol, óleo vegetal e semelhantes. Veículos adequados para supositórios são, por exemplo, óleos naturais ou endurecidos, ceras, gorduras, polióis semilíquidos ou líquidos, e semelhantes.
Além disso, as composições farmacêuticas podem conter conservantes, solubilizantes, estabilizadores, agentes humectantes, emulsionantes, adoçantes, corantes, aromatizantes, sais para variar a pressão osmótica, tampões, agentes de mascaramento ou antioxidantes. Podem também ainda conter outras substâncias terapeuticamente valiosas. E divulgada uma composição que compreende tanto o referido anticorpo anti-CD20 afucosilado com uma quantidade de fucose de 60% ou menos (numa forma de concretização, o referido anticorpo é um anticorpo B-Lyl humanizado afucosilado) como bendamustina, para utilização no tratamento de cancro, em particular, cancro que expressa CD20. A referida composição farmacêutica pode ainda compreender um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis. A presente invenção divulga ainda uma composição farmacêutica, em particular para utilização contra o cancro, que compreende (i) uma primeira quantidade eficaz de um anticorpo anti-CD20 afucosilado com uma quantidade de fucose de 60% ou menos (numa forma de concretização, um anticorpo B-Lyl humanizado afucosilado), e (ii) uma segunda quantidade eficaz de bendamustina. Tal composição compreende opcionalmente veículos e/ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis.
As composições farmacêuticas de somente anticorpo anti-CD20 afucosilado são preparadas para armazenamento por mistura de um anticorpo do grau de pureza desejado com veículos, excipientes ou estabilizantes farmaceuticamente aceitáveis opcionais (Remington's Pharmaceutical Sciences 16.a edição, Osol, A. (ed.)), na forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Os veículos, excipientes ou estabilizadores aceitáveis são não tóxicos para os recetores nas dosagens e concentrações empregues e incluem tampões, tais como de fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes, incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (tais como cloreto de octadecildimetilbenzilamónio; cloreto de hexametónio; cloreto de benzalcónio; cloreto de benzetónio; fenol, álcool butilico ou benzílico; alquilparabenos, tais como metil- ou propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipéptidos de baixo peso molecular (menos do que cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina do soro, gelatina, ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, ou lisina; monossacáridos, dissacáridos, e outros hidratos de carbono, incluindo glicose, manose, ou dextrinas; agentes quelantes, tais como EDTA; açúcares, tais como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; contraiões formadores de sais, tais como sódio; complexos metálicos (por exemplo, complexos de Zn-proteína); e/ou tensioativos não iónicos, tais como TWEEN™, PLURONICS™ ou polietilenoglicol (PEG) .
As composições farmacêuticas de bendamustina podem ser semelhantes às descritas acima para o anticorpo anti-CD20 afucosilado.
Numa outra forma de concretização da invenção, o anticorpo anti-CD20 afucosilado e a bendamustina são formulados em duas formulações separadas.
Os ingredientes ativos podem ser aprisionados em microcápsulas preparadas, por exemplo, por técnicas de coacervação ou por polimerização interfacial, por exemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulose ou de gelatina e microcápsulas de poli(metilmetacrilato) , respetivamente, em sistemas coloidais de entrega de fármacos (por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina, microemulsões, nanoparticulas e nanocápsulas), ou em macroemulsões. Tais técnicas são divulgadas em Remington's Pharmaceutical Sciences 16.a edição, Osol, A. (ed.) (1980).
Podem ser preparadas preparações de libertação sustentada. Os exemplos adequados de preparações de libertação sustentada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos contendo o anticorpo, matrizes estas que estão sob a forma de artigos moldados, p. ex., filmes ou microcápsulas. Exemplos de matrizes de libertação sustentada incluem poliésteres, hidrogéis (por exemplo, poli (2-hidroxietilmetacrilato) ou poli(álcool vinílico)), poliláctidos (US 3 773 919), copolímeros de ácido L-glutâmico e gama-etil-L-glutamato, etileno-acetato de vinilo não degradável, copolímeros degradáveis de ácido láctico-ácido glicólico tais como LUPRON DEPOT™ (microesferas injetáveis compostas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico e acetato de leuprolide) e ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico.
As formulações a utilizar para administração in vivo são geralmente estéreis. Isto é facilmente conseguido por filtração através de membranas de filtração estéreis. É igualmente revelado um método para o tratamento de cancro que compreende a administração a um doente que necessite de tal tratamento de (i) uma primeira quantidade eficaz de um anticorpo anti-CD20 afucosilado com uma quantidade de fucose de 60% ou menos, (numa forma de concretização, um anticorpo B-Lyl humanizado afucosilado); e de (ii) uma segunda quantidade eficaz de bendamustina.
Numa concretização, a quantidade de fucose está entre 40% e 60%.
Preferencialmente, o referido cancro é um cancro que expressa CD20.
Preferencialmente, o referido cancro que expressa CD20 é um linfoma não-Hodgkin de células B (LNH).
De preferência, o referido anticorpo anti-CD20 afucosilado é um anticorpo anti-CD20 de tipo II.
De preferência, o referido anticorpo é um anticorpo B-Ly1 human i z ado.
De preferência, o referido anticorpo B-Lyl humanizado é administrado numa dosagem de 800 a 12 00 mg nos dias 1, 8, 15 de um ciclo de dosagem de 6 semanas, e depois numa dosagem de 800 a 1200 mg no dia 1 de até cinco ciclos de dosagem de 4 semanas, e a bendamustina é administrada numa dosagem de 80 mg/m2 a 110 mg/m2 nos dias 1 e 2 de até seis ciclos de dosagem de 4 semanas.
Conforme utilizado aqui, o termo "doente" refere-se preferencialmente a um ser humano que necessite de tratamento com um anticorpo anti-CD20 afucosilado (p. ex., um doente que sofra de cancro que expressa CD20) para qualquer finalidade, e mais preferencialmente, um ser humano com necessidade de tal tratamento para tratar cancro ou uma condição ou lesão pré-cancerosa. No entanto, o termo "doente" pode também referir-se a animais não humanos, preferencialmente mamíferos, tais como cães, gatos, cavalos, vacas, porcos, ovelhas e primatas não humanos, entre outros. A invenção compreende ainda um anticorpo anti-CD20 afucosilado, tendo uma quantidade de fucose de 60% ou menos, compreendendo o referido anticorpo uma sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada (VH) de SEQ ID NO: 7 e uma sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve (VL) de SEQ ID NO: 20, para utilização no tratamento de um cancro que expressa CD20 em combinação com bendamustina. A invenção compreende ainda um anticorpo anti-CD20 afucosilado, tendo uma quantidade de fucose de 60% ou menos, compreendendo o referido anticorpo uma sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada (VH) de SEQ ID NO: 7, e uma sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve (VL) de SEQ ID NO: 20, e bendamustina para utilização no tratamento de um cancro que expressa CD20.
De preferência, o cancro que expressa CD20 é um linfoma não-Hodgkin de células B (LNH).
De preferência, o referido anticorpo B-Lyl humanizado é administrado numa dosagem de 800 a 1200 mg nos dias 1,8, 15 de um ciclo de dosagem de 6 semanas, e depois numa dosagem de 800 a 1200 mg no dia 1 de até cinco ciclos de dosagem de 4 semanas, e a bendamustina é administrada numa dosagem de 80 mg/m2 a 110 mg/m2 nos dias 1 e 2 de até seis ciclos de dosagem de 4 semanas.
Os exemplos e figuras que se seguem são dados para auxiliar a compreensão da presente invenção, cujo verdadeiro âmbito está definido nas reivindicações anexas.
Listagem de Sequências SEQ ID NO: 1 sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada (VH) do anticorpo monoclonal murino anti- CD20 B-Lyl. SEQ ID NO: 2 sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve (VL) do anticorpo monoclonal murino anti-CD20 B-Lyl. SEQ ID NO: 3-19 sequências de aminoácidos da região variável da cadeia pesada (VH) de anticorpos B-Lyl humanizados (de B-HH2 a B-HH9, B-HL8 e de B-HL10 a B-HL17). SEQ ID NO: 20 sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve (VL) do anticorpo B-Lyl humanizado B-KV1.
Descrição das Figuras
Figura 1 Atividade antitumoral in vivo do tratamento combinado de um anticorpo anti-CD20 afucosilado de tipo II (B-HH6-B-KV1 GE) com bendamustina, em comparação à combinação de rituximab (anticorpo anti-CD20 de tipo I focusilado) e bendamustina e em comparação às respetivas monoterapias.
Procedimentos experimentais
Procedimentos experimentais A atividade antitumoral do tratamento combinado de um anticorpo anti-CD20 de tipo II (B-HH6-B-KV1 GE) com bendamustina
Agentes de teste 0 anticorpo anti-CD20 afucosilado B-HH6-B-KV1 GE (B-Lyl humanizado afucosilado, B-HH6-B-KV1 glicosilado, ver WO 2005/044859 e WO 2007/031875) foi fornecido como uma solução-mãe (9,4 mg/ml) por GlycArt, Schlieren, Suíça. O tampão de anticorpo incluía histidina, trealose e polissorbato 20. A solução de anticorpo foi diluída apropriadamente em PBS a partir da solução-mãe para injeções prévias.
Rituximab de grau clínico (Mabthera) foi obtido de Hoffmann La Roche, Basileia. A bendamustina (Ribomustin®) foi adquirida da Mundipharma GmbH, Limburg an der Lahn, Alemanha. As diluições necessárias foram ajustadas a partir da fornecida solução-mãe de 2,5 mg/ml.
Linhas celulares e condições de cultura A linha celular humana de linfoma de células de manto Z138 foi cultivada normalmente em DMEM suplementado com 10% de soro bovino fetal (PAA Laboratories, Áustria) e 2 mM de L-glutamina, a 37 °C, numa atmosfera saturada de água e a 8% de CO2. A passagem 4 foi utilizada para o transplante. As células foram coinjetadas com Matrigel.
Animais
Ratos fêmeas SCID bege; com 3 a 4 semanas de idade à chegada (adquiridos a Charles River, Sulzfeld, Alemanha) foram mantidos sob condições específicas isentas de agentes patogénicos, com ciclos diários de 12 h de luz/12 h de escuridão de acordo com as orientações recomendadas (GV-Solas, Felasa, TierschG). 0 protocolo de estudo experimental foi revisto e aprovado pelo governo local. Após a chegada, os animais foram mantidos na parte de quarentena da instalação para animais durante uma semana a fim de se acostumarem ao novo ambiente e para observação. A monitorização contínua da saúde foi efetuada regularmente. Alimentos dietéticos (Provimi Kliba 3337) e água (pH acidificado de 2,5-3) foram fornecidos ad libitum.
Monitorização
Os animais foram controlados diariamente quanto a sintomas clínicos e deteção de efeitos adversos. Para a monitorização ao longo do teste, o peso dos animais foi documentado duas vezes por semana e o volume tumoral foi medido com um compasso após o estadiamento.
Tratamento dos animais 0 tratamento dos animais começou no dia da aleatorização, 19 dias após a inoculação das células tumorais. 0 anticorpo anti-CD20 afucosilado humanizado B-HH6-B-KVl GE ou o rituximab foram administrados i.p. como agentes individuais nos dias de estudo 19 e 2 6, na dosagem indicada de 1 mg/kg. O veículo correspondente foi administrado nos mesmos dias. A bendamustina foi administrada i.p. nos dias 19, 20, 21 e 22, a 3 mg/kg.
Nos grupos de terapia de combinação, o agente quimioterapêutico foi administrado 8 horas após os dois anticorpos no dia 19.
Estudo da inibição do crescimento tumoral in vivo
No final do teste, no dia 33 após a inoculação de células tumorais, registou-se inibição do crescimento tumoral (ICT) , conforme apresentado na Tabela 1, nos animais que receberam rituximab, anticorpo anti-CD20 B-HH6-B-KV1 GE, combinação de rituximab e bendamustina, ou combinação de anticorpo anti-CD20 e bendamustina, respetivamente, em comparação ao grupo de controlo. 0 tratamento com bendamustina por si só não apresentou qualquer atividade antitumoral no presente teste.
Observou-se mais do que um efeito aditivo quando se compara o grupo de combinação anticorpo anti-CD20 B-HH6-B-KV1 GE/bendamustina ao tratamento de anticorpo anti-CD20 B-HH6-B- KV1 GE por si só.
Avaliação estatística 0 estudo terminou no dia 33. A avaliação estatística baseou-se na sAUC. 0 crescimento tumoral foi inibido de forma estatisticamente significativa no grupo 2 (B-HH6-B-KV1 GE, 1 mg/kg, Uma vez por semana, i.p.) conforme indicado por um TCR de 0,72 (IC 0,59-0,86), no grupo 3 (rituximab, 1 mg/kg, uma vez por semana, i.p.) conforme indicado por um TCR de 0,78 (IC 65-0, 93), no grupo 5 (B-HH6-B-KV1 GE, 1 mg/kg, uma vez por semana, i.p., em combinação com bendamustina, 3 mg/kg, 19-22 dias de estudo, i.p.) conforme indicado por um TCR de 0,46 (IC 0,34-0,59) e no grupo 6 (rituximab, 1 mg/kg, uma vez por semana, i.p.,em associação com bendamustina, 3 mg/kg, 19-22 dias de estudo, i.p.) conforme indicado por um TCR de 0,67 (IC 0,54-0,81) em comparação ao grupo veículo (grupo 1). O Grupo 4 (bendamustina, 3 mg/kg, 19-22 dias de estudo, i.p.) mostrou um crescimento tumoral comparável ao do grupo de controlo no final do estudo. A combinação de B-HH6-B-KV1 GE com bendamustina revelou um efeito mais do que aditivo (sinérgico) e estatisticamente significativo na inibição do crescimento tumoral em comparação aos tratamentos individuais analisados pelo teste de Tukey-Kramer (p< 0,001) (ver Tabela 1 e Figura 1)
Tabela 1: TCR paramétrico com Intervalos de Confiança (IC) baixos e altos com base em sAUC e ICT (%)
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
<110> Roche Glycart AG <120> Terapia de combinação de um anticorpo anti-CD20 afucosilado e bendamustina < 130> 26255 <150> 09010489,4 < 151> 14-08-2009 < 1 6 0 > 2 7 <170> Patentln version 3.5 <210 > 1 < 211 > 112 <212 > PRT <213> Mus sp. < 2 2 0 >
<221> MISC__FEATURE <223> sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada (VH) do anticorpo anti-CD20 monoclonal murino <400> 1
Gly Pro Glu Leu Vai Lys Pro Gly Ala Ser Vai Lys He Ser Cys Lys 15 10 15
Ala Ser Gly Tyr Ala Fhe Ser Tyr Ser Trp Met Asn Trp Vai Lys Leu 20 25 30
Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp He Gly Arg Tie Phe Pro Gly Asp 35 40 45 G.ly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr 50 55 60
Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Met Gin Leu Thr Ser Leu Thr 65 ?0 15 80
Ser Vai Asp Ser Ala Vai Tyr Leu Cys Ala Arg Asn Vai Phe Asp Gly 85 90 95
Tyr Trp Leu Vai Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ala 100 105 110 < 2 10 > 2
< 211> 103 <212 > PRT <213 > Mus sp. <: 2 2 0 >
< 2 21> MISC_FEATURE <223> sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve (VL) do anticorpo anti---CD20 monoclonal murino B-Lyl < 4 0 0 > 2
Asn Pro val Thr Leu Gly Thr Ser Ala Ser lie Ser Cys Arg ser Ser 1 5 .10 15
Lys Ser Leu Leu His Ser Asrs Gly He fhr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu 20 25 “ " 30
Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Gin Leu Leu lie Tyr Gin, «et Ser Asp 35 40 45
Leu Vai Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr 50 55 60
Asp Phe Thr Leu Arg Tie Ser Atg Val G.i.ti Ala Glu Asp Val Gly Vai 65 70 75 80
Tyr Tyr Cys Ala Gin Asn Leu Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly 85 90 95
Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg 100 <: 2 10 > 3
< 211> 113 <212 > PRT <213> Artificial <22 0 > <223> sequências de aminoácidos da região variável da cadeia, pesada (VH) do anticorpo B-Lyl humanizado (B--1-LH2) < 4 0 0 > 3
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15
Ser Vai Lys Vai Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser 20 25 30
Trp Met Asn Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 <50 45
Gly Arg lie Fhe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60
Lys Gly Arg Vai Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu teu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Asn vai phe Asp Gly Tyr Trp Leu Vai Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110
The Leu Vai Thr Vai Ser Ser 115 <210> 4 <211> 119
< 212 > PRT < 213 > Art i f i c ia1 <220 > <223> sequências de aminoácidos da região variável da cadeia pesada (VH) do anticorpo B-Lyl humanizado (B-HH3) < 4 00 > 4
Gin Val Gin Leu val Gin Ser Gly Ala Glu Vai Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 IS
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser 20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Arg lie Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr He Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Leu Cys 95 90 95
Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110
Thr Leu val Thr Val Ser Ser 115 <210 > 5 < 211> 119 <212 > PRT <213> Artificial <: 2 2 0 > <223> sequências de aminoácidos da região variável da cadeia pesada (VH) do anticorpo B-Lyl humanizado (B-HH4) < 4 0 0 > 5
Sin Vaí Gin Leu Va.l. Gin Ser Gly Ala Gin Val I.ys lys Pro Sly Ala 1 5 10 15
Ser Val Lys Vai Ser Cys Lys Val Ser Sly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser 20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Sly Gin Sly leu Glu frp Met 35 40 45
Glv Arg He Phe Pro Giy Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60
lys Sly Arg Val Thr lie Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyres 70 75 SO
Met Glu Leu Ser Ser Lea Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp leu Val Tyr Trp Gly Gin Gly
100 105 HO
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 6
< 211> 119 <212> PRT <213> Artificial < 2 2 0 > <223> sequências de aminoacidos da região variável da cadeia pesada (VH) ao anticorpo B-Lyi humanizaao <,B-HH5) < 4 0 0 > 6
Gin Vai Gin teu Vai Gin Ser Gly Ala Glu Vai Lys Lys Pro Glv Ser 1 5 10 15*
Ser Vai Lys; Vai Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser 20 25 30
Trp Met Ser Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Arg lie Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asm Gly Lys Phe 50 55 60
Lys Gly Arg Vai Thr lie Thr Ala As» Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Lee Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Asn Vai Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Vai Tyr Trp Giy Gin Gly
100 105 UO
Thr Leu vai Thr Vai Ser Ser 115 <210 > 7 < 211> 119 <212 > PRT <213> Artificial <22 0 > <223> sequências de aminoáeidos da região variável da cadeia pesada (VH) do anticorpo B-Lyl humanizado (B-HH6) < 4 0 0 > 7
Gin Vai Gin Leu vai Gin Set Gly Ala Giu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 S .10 is
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser ?0 25 30
Trp lie Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Arg lie Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr lie Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 7 6 80
Met GIu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Gly Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 86 90 05
Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210 > 8
< 211> 119 <212 > PRT <213 > Art ificia1 <22 0 > <223> sequências cie aminoácidos cia região variável da cadeia pesada (VH) do anticorpo B-Lyl humanizado (B-HH7) < 4 0 0 > 8
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Giu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser 20 25 30
Trp lie Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Levi Glu Trp Met 35 40 45
Gly Arg He Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr lie Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115
< 2 10 > 9 <211> 119 <212 > PRT < 213 > Artificia1 < 2 2 0 > <223> sequências de arninoácidos da região variável da cadeia pesada (VH) do anticorpo B-Lyl humanizado (B-HH.8) <40 0 > 9
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala 61». V.al Lys lys Pro Gly Ala 1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Tyr Ser 20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Arg He Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60
Lys Gly Arq Val Thr He Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 ' 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 10 < 2 11> 119 <212 > PRT <213> Artificial <220> <223> sequências de aminoácidos da região variável da cadeia pesada (VH) do anticorpo B-Lyl humanizado (B-H.H9) < 4 0 0 > 10
Gin Vai C-In Leu Vai Çln Ser Cly Ala GIu Vai .Lys Lys Pro Sly Ala i 5 10 15
Ser Vai Lys Vai Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Tyr Ser 20 £5 30
Trp Met Asr. Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Gla Trp Met 35 40 45
Gly Arg lie Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60
Lys Gly Arg Vai Thr Ilô Thr Ala Asp lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Asn Vai Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Vai Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110
Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 115 < 2 10 > 11
< 2 11> 119 <212 > PRT <213> Artificia1 < 2 2 0 > i2 2 3> sequências de aminoácidos da região variável da cadeia pesada (VH) ao anticorpo B-Lyl humanizado (B-HL8) <400 > 11
Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Giy Giy Gly Leu Vai Lys Pro Giy Gly 1 &amp; 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Ser 20 25 30
Trp Net Asn Trp Vai Arg Gin Alá Pro Gly 'Lys Gly Leu Glu Trp Vai 35 40 45
Gly Arg lie Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60
Lys Gly Arg Vai Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 05 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 00 93
Ala Arg Asn Vai Phe Asp Giy Tyr Trp Leu Vai Tyr Trp Gly Gin Gly ICO 105 110
Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 115 <210> 12 < 211> 119 <212> PRT <213> Artificial <22 0 > <223> sequências de aminoácidos da região variável da cadeia pesada (VH) do anticorpo B-Lyl humanizado (B-HL10) < 4 0 0 > 12
Glu Vai Gin leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Ly.s Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Sor Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala I?he Ser Tyr Ser 20 25 30
Trp Met Άsn Trp Vai Árg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Léu Glu Trp Vai .35 40 45
Gly Arg lie Ebe pro Gly Asp G'ly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe 50” 55 60
Lys Gly Arg Vai Thr lie Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 ?5 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Asn Vai Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Vai Tyr Trp Gly Gin Giy 100 105 110
Thr Leu vai Thr Vai Ser Ser 115 <210 > 13 < 211> 119
< 212 > PRT <213> A rtificia1 <220 > <223> sequências de aminoácidos da região variável da cadeia pesada (VH) do anticorpo 33-Lyl humanizado (B-HL11) < 4 0 0 > 13
Gin Val Gin Leu Val GXu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Ser 20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Gly Arg lie Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr lie Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 < 210 > 14
< 211> 119 <212 > PRT < 213 > Ar r. i f i c i a. 1 < 2 2 0 > <223> sequências de aminoácidos da região variável da cadeia pesada (VH) do anticorpo B-Lyl humanizado (B-HL12) < 4 0 0 > 14
Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Ala Gly Leu Vai Lys Pro Gly Gly
1 5 10 IS
Ser Leu Arg Leu Ser Cya Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Ser 20 25 30
Trp Met Asn Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Arg He Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60
Lys Gly Arg Vai Thr lie Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Asn Vai Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Vai Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110
Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 115 < 2 10 > 15 <211> 113
< 212 > PRT <213> Art ificia1 <220 > <223> sequências de aminoácidos da região variável da cadeia pesada (VH) do anticorpo B-Lyl humanizado (B-HL13) < 4 0 0 > 15
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Lys Pro Glv Giy 1 S ‘10 1$
Ser Leu Arg Leu Ser Cvs Ala Ala Ser Giy Phe Thr Phe Ser Tyr Ser 20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Lea Glu Trp Met 35 40 45
Gly Arg tie Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr He Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Sex Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ale Arg Aon Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Giy Gin Gly 100 10S 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 16 <211> 119
<212> PRT <213> Artificial <220> <223> sequências de aminoácidos da região variável da cadeia pesada (VH) do anticorpo B-Lyl humanizado (B-HL14) < 4 0 0 > 16
Giu Vai Gin Léu Vai Giu Sar Gly Gly Gly Leu Lys Lys Pro Gly Gly Ϊ S 10 " 15
Ser Leu Arg Leu Ser Çys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Ser 20 25 30
Trp Met Asn Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 ' 45
Gly Arg lie Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys phe 50 55 60
Lys Gly Arg V«1 Thr Xle Thr Ala Asp Lys Sei: Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 8.5 90 95
Ala Arg Asn Vai Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Vai Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110
Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 11,5 <210> 17 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial < 2 2 0 > <223> sequências de aminoácidos da região variável da cadeia pesada (VH) do anticorpo B-Lyl humanizado (B--HL15) <400 > 17
Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Lys Pro Gly Ser 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Ser 20 25 30
Trp Met Asn Trp Vai Arg Gin Ala Pro Cly Lys Gly Leu Clu Trp Met 35 40 45
Gly Arg lie Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60
Lys Gly Arg Vai Thr Xle Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Slu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 ~ 95
Ala Arg Asn Vai Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Vai Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110
Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 115 <210> 18 < 211> 119
< 212 > PRT <213> Art i.f icia 1 <220 > <223> sequências de aminoácidos da região variável da cadeia pesada (VH) do anticorpo B-Lyl humanizado (B-HLl6) < 4 0 0 > 18
Girt Vai Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arq Val Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Ser 20 25 30
Trp Met Asa Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Arg He Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe SO 55 60
Lys Gly Arg Val Thr lie Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 30 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 HO
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 < 210 > 19 <211> 119 <212> PRT <213 > Artif ic i a1 <220> <223> sequências de aminoácídos da região variável da cadeia pesada (vH) do anticorpo B-Lyl humanizado (B---HLI /} <400 > 19
Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Lys Pró Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Pise Thr ?he Ser Tyr Ser 20 25 30
Trp Met Asn Trp Vsl Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Arg tie PMe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60
Lys Gly Arg Vai Thr lie Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Alá Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 50 95
Ala Arg Asn Vai Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Vai Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 1.10
Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 115 < 210 > 2 0 <211> 115
< 212 > PRT <213> Artificial <220> <223> sequências de aminoácidos da região variável da cadeia pesada (VH) do anticorpo B-Lyl humanizado (B-KV1) <4 00> 20
Asp lie Val Met Thr Gin Thr Pro Leu Sex Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15
Glu pro Ala Ser He Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Sis Ser 20 25 30
Asn Gly lie Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gin Lys Pro <31 y Gin Ser 35 40 45
Pro Gin Leu Leu He Tyr Gin Met Ser Asn Leu Val Ser Giy Val Pro 50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys He 65 70 15 80
Ser Arg Val Gin Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gin Asn 85 90 95
Leu Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Glv Gly Gly Thr Lvs Val Glu lie Lys 100 " 105 1.10
Arg Thr Val 115 < 2 10 > 21 <211> 144
< 212 > PRT < 213 > Homo s ap iens < 4 0 0 > 21
Met Trp Leu Gin Ser Leu Leu Leu Leu Gly Thr Val Ala Cys Ser lie 1 5 10 15
Ser Ala Pro Ala Arg Ser Pro Ser Pro Ser Thr Gin Pro Trp Glu Ris 20 25 30
Val Asn Ala He Gin Glo Ala Arg Arg Leu Leu Asn Leu Ser Arg Asp 35 m 45
Thr Ala Ala Sly: Met Asn Glu Thr Val Glu Val lie Ser Glu Met Phe 50 55 60
Asp Leu Gin Glu Rrg Thr Cys Leu Gin Thr Arg Leu Glu Leu fyr Lys 65 10 7 b 80
Gin Gly Leu Arg Gly Ser Leu Thr Lys Leu Lys Gly Pro Leu Thr Ket 85 90 95
Met Ala Ser His Tyr Lys Gin His Cys Pro Pro Thr Pro Glu Thr Ser 100 105 110
Cys Ala Thr Gin lie lie Tfec· phe Glu Ser Phe Lys Glu Asn Leu Lys 115 120 125
Asp Phe Leu Leu Val. lie Pro Phe Asp Cys Trp Glu Pro Val Gin Glu 130 135 140 < 210 > 22 < 211> 144
< 2 1.2 > PRT < 213 > Homo sapiens <400> 22
Met Trp Leu Gin. Ser Leu Leu Leu Leu Gly Thr Val Ala Cys Ser lie 1 5 10 15
Ser Ala Pro Gly Arg Ser Pro Ser Pro Ser Thr Gin Pro Trp Giu His 20 25 30
Val Asn Ala He Gin Glu Ala Arg Arg Leu Leu As ft Leu Ser Arg Asp 35 40 45
Thr Ala Ala Glu Met Asn Glu Thr Val Glu val lie Ser Giu Met Phe 50 55 60
Asp Leu Gin Glu Pro Thr Cys Leu Gin Thr Arg Leu Glu Leu Tyr Lys 65 70 ?5 80
Gin Gly Leu Arg Gly Ser Leu Thr Lys Leu Lys Gly Pro Leu Thr Met 85 90 95
Met Ala Ser His Tyr Lys Gin His Cys Pro Pro Thr Pro Glu Thr Ser 100 105 110
Cys Ala Thr Gin Thr lie Thr Phe Glu Ser Phe Lys Glu Ash. Leu Lys 115 120 125
Asp Phe Leu Leu Val He Pro Phe Asp Cys Trp Glu Pro Val Gin Glu 130 135 540 <210 > 23 <211> 152
< 212 > PRT <213> Homo sapiens <400> 23
Met Ser Arg Leu Pro Val Leu Leu Leu Leu Gin Leu Leu Val Arg Pro
1 S IQ IS
Gly Leu Gin Ala Pro Met Thr Gin Thr Thr Pro Leu Lys Thr Ser Trp 20 25 30
Val Asa Cys Ser As π Met lie Asp G.l u lie lie Thr His Leu Lys Gin 35 40 45
Pro Pro Leu Pro Leu Leu Asp Phe Asa Asn Leu Asn Gly Glu Asp Gin 50 55 60
Asp lie Leu Met Glu Asn Asn Leu Arg Arg Pro Asn Leu Glu Ala Phe 65 70 75 80
Asn Arg Ala Val Lys Ser Leu Gin Asn Ala Ser Ala lie Glu Ser He 85 9Q 95
Leu Lys Asn Leu Leu Pro Cys Leu Pro Leu Ala Thr Ala Ala Pro Thr 100 105 no
Arg His Pro lie His He Lys Asp Gly Asp Trp Asn Glu Phe Arg Arg 115 120 125
Lys Leu Thr Phe Tyr Leu Lys Thr Leu Glu Asn Ala Gin Ala Gin Gin 130 135 140
Thr Thr Leu Ser Leu Ala He Phe 145 ISO
< 2 10 > 2 4 <211> 152 <212> PRT < 213 > Homo s api en s < 4 0 0 > 2 4
Met Ser Arg Leu £*?© Vai Lea Lea Leu Lea Sin Leu Léu Vai Arg Pro 1 5 10 15
Gly Leu Gin Ala Pro Met Thr Gin Thr Thr Ser Leu Lys Thr Ser Trp 20 25 30
Va.l Aon Cys Ser Asn Met Tie Asp Glu lie lie Thr His Leu Lys Gin 35 40 45
Pro Pro Leu Pro Leu Leu Asp Phe Asn Ser Leu Asn Gly Glu Asp Gin 50 55 00
Asp lie Leu Met Glu Asn Asn Leu Arg Arg Pro Asn Leu Glu Ala Phe 65 70 75 80
Asn Arg Ala Val Lys Ser Leu Gin Asn Ala Ser Ala He Glu Ser lie 85 90 95
Leu Lys Asn Leu Leu Pro Cys Leu Pro Leu Ala Thr Ala Ala Pro Thr 100 105 HO
Arg His Pro lie His lie Lys Asp Gly Asp Trp Asn Glu: Phe Arg Arg 115 120 125
Lys Leu Thr Phe Tyr Leu Lys Thr Leu Glu Asn Ala Gin Ala Gin Gin 130 135 140
Thr Thr Leu Ser Leu Ala lie Phe 145 150 <210> 25 <211> 152
<212> PRT < 213 > Homo s ap i e ns <«00> 25
Met: Ser Arg Leu Pro Va.l Leu Leri Leu Leu Gin Leu Leu val Arg Pro
1 5 t.O IS
Gly Leu Gin Ala Pro Mel: Thr Gin Thr Thr Ser Leu Lys Thr Ser Trp 20 25 30
Val Asn Cys Ser Asn Met lie Asp Glu lie lie Thr Arg Leu Lys Gin 35 40 45
Pro Pro Leu Pro Leu Leu Asp Phe Asn Asn Leu Asn Gly Glu Asp Gin 50 55 00
Asp lie Leu Met Glu Asa Asn Leu Arg Arg Pro Asn leu Glu Ale Phe 65 ?0 75 80
Asn Arg Ala Vai Lys Ser Leu Gin Asa Ala Ser Ma lie Glu Set; lie 85 50 95
Leu Lys Asa Leu Leu Pro Cys Leu Pro Leu Ala Thr Ala Ala Pro Thr 100 105 110
Arg His Pro lie His lie Lys Asp Gly Asp Trp Asn Glu Phe Arg Arg 115 120 125
Lys Leu Thr Phe Tyr Ley Lys Thr Leu Glu Asn Ala Gin Ala Gin Gin 130 135 140
Thr Thr Leu Ser Leu Ala lie Phe 145 150 <210 > 26 <211> 554
< 212 > PRT <213> Homo sapiens <400> 26
Met Thr Ala Pro Gly Ala Ala Gly Arg Cys Pro Pro Thr Thr Trp Leu 1 5 10 15
Gly Ser Leu Leu Leu Leu Val Cys Leu Leu Ala Ser Arg Ser He Thr 20 25 30
Glu Glu Val Ser Glu Tyr Cys Ser His Met lie Gly Ser G.ly His Leu 35 40 45
Gin Ser Leu Gin Arg Leu lie Asp Ser Gin Met Glu Thr Ser Cys Gin 50 55 60 lie Thr Phe Glu Phe Val Asp Gin Glu Gin Leu Lys Asp Pro Val Cys 65 70 75 80
Tyr Leu Lys Lys Ala Phe Leu Leu Val Gin Asp lie Met Glu Asp Thr 85 90 95
Met Arg Phe A*rg Asp Asn Thr Pro Asn Ala lie Ala He Val Gin Leu 100 105 110
Gin Glu Leu Ser Leu Arg Leu Lys Ser Cys Phe Thr Lys Asp Tyr Glu 115 120 125
Glu His Asp Lys Ala Cys Val Arg Thr Phe Tyr Glu Thr Fro Leu Gin 130 " 135 140
Leu Leu Glu Lys Val Lys Asn Val Phe Asn Glu Thr Lys Asn Leu Leu 145 150 155 160
Asp Lys Asp Trp Asn lie Phe Ser Lys Asn Cys Asn Asn Ser Phe Ala 165 170 175
Glu Cys Ser Ser Gin Asp Val Val Thr Lys Pro Asp Cys Asn Cys Leu 180 185 190
Tyr Pro Lys Ala lie Pro Ser Ser Asp Pro Ala Ser Val Ser Pro His 195 200 205
Gin Pro Leu Ala Pro Ser Me;: Ala Pro Val Ala Gly Lee Thr Trp Glu 2.10 21S 220
Asp Ser Glu Gly Thr Glu Gly Ser Ser Leu Leu Pro Gly Glu Gin Pro 225 230 235 240
Leu His Thr Val Asp Pro Gly Ser Ala Lys Gin Axg Pro Pro Arg Ser 245 250 253
Thr Cys Gin Ser Phe Glu Pro Pro Glu Thr Pro Val Val Lys Asp Ser 260 265 270
Thr lie Gly Gly Ser Pro Gin Pro Arg Pro Ser Val Gly Ala Phe Asn 275 280 285
Pro Gly Met Glu Asp lie Leu Asp Ser Ala Met Gly Thr Asn Trp Val 290 295 300
Pro Glu Glu Ala Ser Gly Glu Ala Ser Glu lie Pro Val Pro Gin Gly 305 310 315 320
Thr Glu Leu Ser Pro Ser Arg Pro Gly Gly Gly Ser Met Gin Thr Glu 325 330 335
Pro Ala Arg Pro Ser Asn Phe Leu Ser Ala Ser Ser Pro Leu Pro Ala 340 34 5 .350
Ser Ala Lys Gly Gin Gin Pro Ala Asp Val Thr Gly Thr Ala Leu Pro 355 360 365
Arg Val Gly Pro Val Arg Pro Thr Gly Gin Asp Trp Asn His Thr Pro 370 375 360
Gin Lys Thr Asp His Pro Ser Ala Leu Leu Arg Asp Pro Pro Glu Pro 385 390 395 400
Gly Ser Pro Arg lie Ser Ser Leu Arg Pro Gin Gly Leu Ser Asn Pro 405 410 4.15
Ser Thr Leu Ser Ala Gin Pro Gin Leu Ser Arg Ser Hls Ser Ser Gly 120 425 430
Ser Vai Leu Pro Leu Gly Glu Leu Glu Gly Arg Arg Ser Thr Arg Asp 435 440 445
Arg Arg Ser Pro Ala Glu Pro Glu Gly Gly Pro Ala Ser Glu Gly Ala 450 455 460
Ala Arg Pro Leu Pró Arg Phe Asn Ser Vai Pro Leu Tbr Asp Thr Gly 46S 470 475 480 Hís Glu Arg Gin Ser Glu Gly Ser Ser Ser Pro Gin Leu Gin Glu Ser 485 450 405
Vai Phe bis Leu Leu Vai Pro Ser Vai Ile Leu Vai Leu Leu Ala vai 500 SOS 510
Gly Gly Leu Leu Phe lyr Arg Trp Arg Arg Arg Ser His Gin Glu Pro 515 520 " 525
Gin Arg Ala Asp Ser Pro Leu Gin Gin Pro Glu Gly Ser Pro Leu Thr 530 535 540 G.In Asp Asp Arg Gin Vai Glu Leu Pro Vai 545 ' 550 <210> 27 <211> 554
<212 > PRT < 213 > Hemo s ap i ens <400> 27
Met Thr Ala Pro Gly Ala Ala Gly Arg Cys Pro Pro Thr Thr Trp Leu 1 5 10 15
Gly Ser Leu Leu Leu Leu Val Cys Leu Leu Ala Ser Arg Ser lie Thr 20 25 30
Glu Glu Val Ser Glu Tyr Cys Ser His Met lie Gly Ser Gly His Leu 35 40 45
Gla $et Leu Gin Arg Leu lie Asp Ser Gin Met Glu Thr Ser Cys Gin 50 55 60 lie Thr Phe Glu Phe Val Asp Gin Glu Gin Leu Lys Asp Pro Val Cys 65 70 75 80 'i'yr Leu Lys Lys Ala Phe Leu Leu Val Gin Asp lie Met Glu Asp Thr 85 90 95
Met Arg Phe Arg Asp Asn Thr Pro Asn Ala lie Ala He Val Gin Leu 100 105 U0
Gin Glu Leu Ser Ley Arg Leu Lys Ser Cys Phe Thr Lys Asp Tyr Glu 115 120 125
Glu His Asp Lys Ala Cys Val Arg Thr Phe Tyr Glu Thr Pro Leu Gin 130 135 140
Leu Leu Gla Lys Val Lys Asn Val Phe Asn Glu Thr Lys Asn Leu Leu 145 150 155 160
Asp Lys Asp Trp Asn lie Phe Ser Lys Asn Cys Asn Asn Ser Phe Ala 165 170 175
Glu Cys Ser Ser Gin Asp Val Val Thr Lys Pro Asp Cys Asn Cys Leu ISC 185 190
Tyr Pro Lys Ala lie Pro Ser Ser Asp Pro Ala Ser Val Ser Pro His 195 200 205
Gin Pro Leu Ala Pro Ser Met Ala Pro Val Ala Gly Leu Thr Trp Glu 210 215 220
Asp Ser Glu Gly Thr Glu Gly Ser Ser Leu Leu Pro Gly Glu Gin Pro 225 230 235 240
Leu His Thr Val Asp Pro Gly Ser Ala Lys Gin Arg Pro Pro Arg Ser 245 250 255
Thr Cys Gin Ser Phe Giu Pro Pro Glu Thr Pro Val Val Lys Asp Ser 260 265 . 270
Thr He Gly Gly Ser Pro Gin Pro Arg Pro Ser Val Gly Ala Phe Asn 275 280 285
Pro Gly Met Glu Asp He Leo Asp Ser Ala Met Gly Thr Asn Trp Val 290 295 300
Pro Glu Glu Ala Ser Gly Glu Ala Ser Glu He Pro Val Pro Gin Gly 305 310 315 320
Thr Glu Leu Ser Pro Ser Arg Pro Gly Gly Gly Ser Met Gin Thr Glu 325 330 335
Pro Ala Arg Pro Ser Asn Phe Leu Ser Ala Ser Ser Pro Leu Pro Ala 340 345 350
Ser Ala Lys Gly Gin Gin Pro Ala Asp Val Thr Gly Thr Ala Leu Pro 355 360 365
Arg Val Gly Pro Val Arg Pro Thr Gly Gin Asp Trp Asn His Thr Pro 370 375 380
Gin Lys Thr Asp His Pro Ser Ala Leu Leu Arg Asp Pro Pro Glu Pro 385 390 395 400
Gly Ser Pro Arg lie Ser Ser Leu Arg Pro Gin Gly Leu Ser Asn Pro 405 410 415
Ser Thr Leu Ser Ala Gin Pro Gin Leu Ser Arg Ser His Ser Ser Gly 420 425 430
Ser Val Leu Pro Leu Gly Glu Lou Glu Gly Arg Ara Ser Thr Arg Asp 435 '440 ' 445
Arg Arg Ser Pro Ala Glu Pro Glu Gly Gly Pro Ala Ser Glu Gly Ala 450 455 460
Ala Arg Pro Leu Pro Arg Phe Asn Ser Val Pro Leu Thr Asp Thr Gly 465 470 475 480
His Glu Arg Gin Ser Glu Gly Ser Phe Ser Pro Gin Leu Gin Glu Ser 485 490 495
Vai Phe His Lev Leu Val Pro Ser Val lie Leu Val Leu Leu Ala Val 500 505 510
Gly Gly Leu Leu Phe Tyr Arg Trp Arg Arg Arg Ser His Gin Glu Pro 515 520 525
Gin Arg Ala Asp Ser Pro Leu Glu Gin Pro Glu Gly Ser Pro Leu Thr 530 535 540
Gin Asp Asp Arg Gin Val Glu Leu Pro Val 545 550

Claims (10)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Utilização de um anticorpo anti-CD20 afucosilado com uma quantidade de fucose de 60% ou menos da quantidade total de oligossacáridos (açúcares) em Asn297, no fabrico de um medicamento para o tratamento de cancro em combinação com bendamustina, caracterizada pelo facto de o referido cancro ser um cancro que expressa CD20 e em que o referido anticorpo compreende uma sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada (VH) de SEQ ID NO: 7 e uma sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve (VL) de SEQ ID NO: 20.
  2. 2. Utilização de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo facto de a quantidade de fucose estar compreendida entre 40% e 60%.
  3. 3. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizada pelo facto de o referido cancro que expressa CD20 ser um linfoma não-Hodgkin (LNH) de células B.
  4. 4. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizada pelo facto de serem administrados em adição um ou mais outros agentes citotóxicos, quimioterapêuticos ou contra o cancro, ou compostos ou radiação ionizante que melhoram os efeitos destes agentes.
  5. 5. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, caracterizada pelo facto de o referido anticorpo ser administrado numa dosagem de 800 a 1200 mg nos dias 1, 8, 15 de um ciclo de dosagem de 6 semanas, e depois numa dosagem de 800 a 1200 mg no dia 1 de até cinco ciclos de dosagem de 4 semanas, e a bendamustina ser administrada numa dosagem de 80 mg/m2 a 110 mg/m2 nos dias 1 e 2 de até seis ciclos de dosagem de 4 semanas.
  6. 6. Anticorpo anti-CD20 afucosilado com uma quantidade de fucose de 60% ou menos da quantidade total de oligossacáridos (açúcares) em Asn297, para utilização no tratamento de cancro em combinação com bendamustina, caracterizado pelo facto de o referido cancro ser um cancro que expressa CD20 e em que o referido anticorpo compreende uma sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada (VH) de SEQ ID NO: 7 e uma sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve (VL) de SEQ ID NO: 20.
  7. 7. Anticorpo de acordo com a utilização da reivindicação 6, caracterizado pelo facto de a quantidade de fucose estar compreendida entre 40% e 60 %.
  8. 8. Anticorpo de acordo com a utilização de qualquer uma das reivindicações 6 ou 7, caracterizado pelo facto de o referido cancro que expressa CD20 ser um linfoma não-Hodgkin (LNH) de células B.
  9. 9. Anticorpo de acordo com a utilização de qualquer uma das reivindicações de 6 a 8, caracterizado pelo facto de serem administrados em adição um ou mais outros agentes citotóxicos, quimioterapêuticos ou contra o cancro, ou compostos ou radiação ionizante que melhoram os efeitos de tais agentes.
  10. 10. Anticorpo de acordo com a utilização de qualquer uma das reivindicações de 6 a 9, caracterizado pelo facto de o referido anticorpo ser administrado numa dosagem de 800 a 1200 mg nos dias 1, 8, 15 de um ciclo de dosagem de 6 semanas, e depois numa dose de 800 a 1200 mg no dia 1 de até cinco ciclos de dosagem de 4 semanas, e a bendamustina ser administrada numa dosagem de 80 mg/m2 a 110 mg/m2 nos dias 1 e 2 de até seis ciclos de dosagem de 4 semanas.
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