PT2421537E - Pirazolilaminopiridinas como inibidores de fak - Google Patents

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PT2421537E
PT2421537E PT98295801T PT09829580T PT2421537E PT 2421537 E PT2421537 E PT 2421537E PT 98295801 T PT98295801 T PT 98295801T PT 09829580 T PT09829580 T PT 09829580T PT 2421537 E PT2421537 E PT 2421537E
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compound
formula
cancer
treatment
amino
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PT98295801T
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Jerry Leroy Adams
Thomas H Faitg
Neil W Johnson
Hong Lin
Jiri Kasparec
Mark Mellinger
Ren Xie
Xin Peng
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Glaxosmithkline Llc
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Description

DESCRIÇÃO "PIRAZOLILAMINOPIRIDINAS COMO INIBIDORES DE FAK"
ÁREA DA INVENÇÃO
Esta invenção refere-se a uma pirazolilamino-piridina que inibe a quinase de adesão focal (FAK), bem como as suas composições. Os compostos da presente invenção são úteis no tratamento de doenças proliferativas, incluindo, mas não limitadas a cancro.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
As tirosinas quinases desempenham um papel importante na regulação de muitos processos celulares, incluindo a proliferação celular, a sobrevivência celular e a migração celular. Sabe-se que determinadas tirosinas quinases se tornam activadas por mutação ou são anormalmente expressas em muitos cancros humanos. Por exemplo, o receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) é encontrado mutado e/ou sobre-expresso no cancro da mama, do pulmão, do cérebro, de células escamosas, do estômago e outros cancros humanos. Demonstrou-se que os inibidores selectivos da actividade de tirosina quinase do EGFR têm utilidade clinica no tratamento de cancros com EGFR mutado e/ou sobre-expresso. Assim, os inibidores selectivos de tirosinas quinases específicas são úteis no tratamento de doenças proliferativas como o cancro. A FAK (codificada pelo gene PTK2) é um não receptor de tirosina quinase que integra sinais de integrinas e receptores de factores de crescimento. Está descrito que a FAK desempenha um papel na regulação da sobrevivência, crescimento, adesão, migração e invasão celular (McLean et al. , 2005, Nat. Rev. Cancer 5:505-515).
Além disso, a FAK é regulada e activada por fosforilação em múltiplos resíduos de tirosina. A sobre-expressão de ARNm de FAK e/ou proteína foi documentada em muitos tumores sólidos humanos, incluindo mas não limitados a cancros da mama, cólon, tiróide, pulmão, ovário e próstata; mas também incluindo cancros de origem hematológica, incluindo mas não limitados a leucemia como a leucemia mielóide aguda (AML). (Owens et al. 1995, Cancer Research 55:2752-2755; Agochiya et al. 1999, Oncogene 18:5646-5653; Gabarro-Niecko et al. 2003, Cancer Metastasis Rev. 22:359-374; Recher et al. 2004, Cancer Research 64:3191-3197; Zhao e Guan, Cancer
Metastasis Rev. 28:35-49, 2009). Mais significativamente, existem provas de que a FAK fosforilada está aumentada em tecidos malignos em comparação com tecidos normais (Grisaru-Granóvski et al., 2005, Int. J. Cancer 113:372-378) e poderia representar um marcador prognóstico de metástase. A actividade de FAK está claramente implicada no cancro humano avançado e metastático (Zhao e Guan, Cancer Metastasis Rev. 28:35-49, 2009).
Demonstrou-se que a eliminação da FAK por ARNi ou expressão de uma FAK negativa dominante induz a perda de adesão e a morte celular em linhas celulares da mama e melanoma humano, e aumenta a apoptose mediada por docetaxel em células de cancro do ovário (Beviglia et al. 2003, Biochem J. 373:201-210, Smith et al. 2005, Melanoma Res. 15:357-362, Haider et al. 2005, Clin. Cancer Res. 11:8829-8836) . No entanto, verificou-se que a inibição da FAK em fibroblastos humanos normais ou células mamárias imortalizadas (MCF10A) não causa perda de fixação ou apoptose (Xu et al. 1996 Cell Growth Diff. 7:413-418) . Também se demonstrou que a inibição da FAK por expressão negativa dominante reduz o crescimento tumoral e elimina as metástases pulmonares de células de adenocarcinoma mamário num modelo de rato singénico (van Nimwegen et al. 2005, Cancer Res. 65:4698-4706). Analogamente, a inibição da FAK por shRNA inibiu a metástase do pulmão e reduziu a letalidade em 40 num modelo de murganho singénico (Mitra et al. 2006, Oncogene 25:4429-4440). Neste estudo, a re-expressão transiente do tipo selvagem, mas não FAK quinase morta, inverteu os fenótipos shRNA. A inibição da FAK por expressão negativa dominante em células de carcinoma 4T1 de murganho reduziu o crescimento e angiogénese tumoral em murganhos (Mitra et al. 2006, Oncogene 25:5969-5984) . Além disso, a perda de actividade catalítica de FAK (reconstituição de células FAK-/- com FAK sem actividade de quinase) reduziu o crescimento dos tumores v-Src em murganhos e diminuiu a angiogénese.
Assim, há provas fortes para sugerir que a inibição da actividade da FAK induz apoptose, perda de adesão, inibição do crescimento e migração celular, e que essa inibição reduz a angiogénese. Por conseguinte, os compostos que inibem a actividade da FAK seriam úteis para o tratamento do cancro. 0 WO 2008/115369 é dirigido a derivados de compostos de 2,4-diaminopiridina 5-substituídos como inibidores de quinase de adesão focal e descreve ainda métodos de utilização destes compostos no tratamento de cancro bem como métodos de preparação destes compostos por utilização de reacções de condensação.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Descreve-se compostos de fórmula (I):
ou um seu sal, em que: R1 é halogéneo, CF3, Ci-C6-alquilo, isopropenilo, (C2-C6-alcileno) C3-C6-cicloalquilo, Ci-C6-alcoxi ou ciano; em R2 quando p é diferente de 0, cada R2 é independentemente F, Cl, CF3, metilo, metoxi, CH2CF3, -(X)q-Ci-C4-alcileno-R4, - (X-Ci-C4-alcileno) q-NR5-C (O) -R6, -(X-C1-C4- alcileno) q-(NR5) q-SOx-R7, - (X-Ci-C4_alcileno) q-Y-N (R8) 2; um grupo heterocicloalquil-(R9) q com 5 a 6 membros, ou um grupo heteroaril-(R10) r com 5 a 6 membros; R3 é independentemente H, C3-C6-cicloalquilo, Ci-C6_alquilo, Ci-C6-alcoxi, Ci-C6-alcileno-R4, 0-Ci-C6-alcileno-R4 ou os grupos R3 conjuntamente com Z formam um anel cíclico com 5 a 6 membros opcionalmente substituído com metilo, C1-C4-alcileno-R4 ou C3-C6-cicloalquilo; R4 é H, - (Q) qN (R8) 2, OH, SH, Ci-C6-alcoxi, Ci-C6-tioalquilo ou um grupo heterocicloalquil-(R9) q com 5 a 6 membros; R5 é H ou Ci-C6-alquilo; R6 é H, Ci-C6-alquilo, Ci-C6-alcoxi, N(R8)2 ou um grupo heteroaril-(R10) r com 5 a 6 membros; R7 é Ci-C6-alquilo, fenil-(R9)q ou heteroaril-(R10) r com 5 a 6 membros R8 é independentemente H, Ci-C6_alquilo, -0-Ci-C6_alquilo ou, conjuntamente com o átomo de azoto ao qual estão ligados, formam um grupo heterocicloalquilo com 5 ou 6 membros; R9 é H, Ci-C6-alquilo, Ci-C6-alcoxi, -(Q)qN(R8)2, -Q-C1-C6- alquilo, Ci-C6-alquilR4 ou heterocicloalquilo com 5 a 6 membros; R10 é H, Ci-C6-alquilo, Ci-C6-alcoxi ou Q-C2-C6-alquilo; R11 é Ci-C6-alquilo, CF3, -CH2CF3, - (Q) q-Ci-C4-alcileno-R4, -Q-N(R8)2, fenil-(R5)s, um grupo heterocicloalquil-(R9) q com 5 a 6 membros ou um grupo heteroaril-(R10) r com 5 a 6 membros; R12 é H, Ci-Ce-alquilo, F, Cl, CF3, OH, CN, nitro, -COOH, -C00-Ci-C6-alquilo, -Y-N(R8)2, C3-C6-cicloalquil-R14, -(X)q-Ci-Ce-alcileno-R4, - (X-Ci-Ce-alcileno) q-NR5 -C (0) -R6, - (X-Ci-Ce- alcileno)q- (NR5) q-SOx-R7, -(X-Ci-C6-alcileno)q-Y-N(R8)2, heterocicloalquil-(R9) q, heteroaril-(R10) r ou fenil-(R15) s; R13 é H, F, Cl, Ci-c6-alquilo ou C3-C6-cicloalquilo; ou R12 e R13, conjuntamente com os átomos de carbono aos quais estão ligados, formam um grupo carbocicloalquilo ou heterocicloalquilo com 5 ou 6-membros condensado; R14 é independentemente H, Ci-C6_alquilo, -NR5-S02_R7, -Y- N (R8) 2 ou - (X) q-Ci-C6-alcileno-R4; R15 é independentemente F, Cl, CF3, Ci-C3-alquilo ou C1-C3 alcoxi; p é 0, 1, 2 ou 3; q é 0 ou 1; r é 0, 1 ou 2; s é 0, 1, 2 ou 3; x é 1 ou 2; Q é -C (0)-, -S (0)- ou -SO2-; X é NR5, 0, S, -S (0) - ou -SO2; Y é uma ligação, SO2 ou C(0); e Z é N ou CR5. A presente invenção refere-se a 2-[(5-cloro-2-{[3-metil-l-(1-metiletil))-lA-pirazol-5-il]amino} - 4-piridinil) amino]-N- (metiloxi)benzamida, que é um composto de fórmula ou um seu sal.
Noutra forma de realização, a presente invenção refere-se a uma composição compreendendo 2-[(5-cloro-2-{ [3-metil-1- (1-metiletil) ) -l/í-pirazol-5-il ] amino }-4-piridinil) -amino]-N- (metiloxi)benzamida ou um seu sal farmaceu-ticamente aceitável e um excipiente farmaceuticamente aceitável.
Noutra forma de realização, a presente invenção refere-se a 2-[ (5-cloro-2-{ [3-metil-l-(1-metiletil))-1H-pirazol-5-il]amino}-4-piridinil)-amino]-N- (metiloxi)-benzamida ou um seu sal f armaceuticamente aceitável para utilização no tratamento de cancro.
DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA INVENÇÃO
Tal como aqui utilizado, "halogeno" refere-se a fluoro, cloro, ou bromo. "Ci-C6-alquilo" refere-se a um grupo alquilo linear ou ramificado incluindo metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, t-butilo, n-pentilo e n-hexilo. "Ci-C6-alcoxi" refere-se a grupos Ci-C6-alquil-0-, incluindo grupos metoxi, etoxi, n-propoxi, iso-propoxi e n-butoxi. 0 termo "alcileno" (e.g., C2-C4-alcileno ou Ci-C6- alcileno) refere-se a um radical de hidrocarboneto linear ou ramificado tendo o número especificado de átomos de carbono. 0 grupo "alcileno-R4" refere-se a um grupo alquilo substituído ou não substituído tendo o número especificado de átomos de carbono; assim, quando R4 é H, "alcileno" é sinónimo de "alquilo"; caso contrário, alcileno é um radical bivalente. Exemplos de - (X) q-C2-C4-alcileno-R4 incluem -CH2CH2-N (CH3) 2, -CH2CH2-OH, -CH2CH (CH3) -och3, -N(CH3)-CH2-CfRCfR-piperidinilo; -O-CH2CH (CH3) OCH3 e outros semelhantes. C3-C6-cicloalquilo refere-se a um grupo ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo ou ciclo-hexilo.
Tal como aqui utilizado, "heterocicloalquilo com 5 ou 6 membros" refere-se a um grupo cicloalifático com 5 ou 6 membros que inclui um heteroátomo 0, N ou S ou uma sua combinação. Exemplos de grupos heterocicloalquilo adequados incluem os grupos pirrolidinilo, pirrolidinonilo, piperidinilo, piperazinilo, oxopiperazinilo, morfolino e tiomorfolino.
Os grupos R8 podem, conjuntamente com o átomo de azoto ao qual estão ligados, formam um anel cíclico com 5 a 6 membros, exemplos dos quais incluem os grupos pirrolidinilo, pirrolidinonilo, piperidinilo, piperazinilo, oxopiperazinilo, morfolino e tiomorfolino. 0 termo "heteroarilo" refere-se a um grupo aromático com 5 ou 6 membros contendo pelo menos um átomo de N, 0 ou S. Exemplos de grupos heteroarilo adequados incluem piridinilo, piridazinilo, pirimidinilo, pirazinilo, pirrolilo, furilo, tienilo, pirazolilo, imidazolilo, fura-zanilo, oxazolilo, tiazolilo, isoxazolilo, 1,2,3-triazo-lilo, 1,2,4-triazolilo, tetrazolilo e isotiazolilo.
Tal como aqui utilizado, "farmaceuticamente aceitável" refere-se aos compostos, materiais, composições, e formas de dosagem que são, dentro do âmbito da avaliação médica idónea, adequados para utilização em contacto com os tecidos de seres humanos e animais sem excessiva toxicidade, irritação, ou outro problema ou complicação. 0 perito na arte entenderá que podem ser preparados sais farmaceuticamente aceitáveis dos compostos de fórmula (I) . Mais particularmente, na medida em que os compostos de acordo com a fórmula (I) contêm um grupo funcional básico, e podem incluir um grupo funcional ácido, são capazes de formar sais farmaceuticamente aceitáveis por tratamento com um ácido ou base adequado. Os ácidos adequados incluem ácidos inorgânicos e ácidos orgânicos farmaceuticamente aceitáveis. Ácidos farmaceuticamente aceitáveis representativos incluem cloreto de hidrogénio, brometo de hidrogénio, ácido nítrico, ácido sulfúrico, ácido sulfónico, ácido fosfórico, ácido acético, ácido hidroxiacético, ácido fenilacético, ácido propiónico, ácido butírico, ácido valérico, ácido maleico, ácido acrílico, ácido fumárico, ácido málico, ácido malónico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido salicílico, ácido benzóico, ácido tânico, ácido fórmico, ácido esteárico, ácido láctico, ácido ascórbico, ácido p-toluenossulfónico, ácido oleico e ácido láurico.
As bases adequadas incluem bases inorgânicas, como hidretos, hidróxidos e carbonatos de lítio, sódio, potássio, cálcio, magnésio e zinco, bem como bases orgânicas, como arginina, colina, dietilenotriamina, dimetil-amina, etilenodiamina, imidazole, lisina, morfolina, proli-na e trimetilamina.
Tal como aqui utilizado, o termo "um composto de fórmula (1)" ou "o composto de fórmula (1)" refere-se a um ou mais compostos de acordo com a fórmula (I) . 0 composto de fórmula (I) pode existir numa forma cristalina ou não cristalina, ou como uma sua mistura. 0 perito na arte entenderá que podem ser formados solvatos farmaceuticamente aceitáveis para compostos cristalinos em que moléculas de solvente são incorporadas na rede cristalina durante a cristalização. As moléculas de solvente incorporadas podem ser moléculas de água ou não aquosas como moléculas de etanol, isopropanol, DMSO, ácido acético, etanolamina e acetato de etilo. As redes cristalinas que têm incorporadas moléculas de água são tipicamente referidas como "hidratos". Os hidratos incluem hidratos estequeométricos, bem como composições contendo quantidades variáveis de água. A presente invenção inclui todos esses solvatos.
Alguns dos compostos aqui descritos podem conter um ou mais átomos quirais, ou podem de outro modo ser capazes de existir como dois enantiómeros. Os compostos descritos adiante incluem misturas de enantiómeros bem como enantiómeros purificados ou misturas enriquecidas enantiomericamente. Também são proporcionados os isómeros individuais dos compostos representados pela fórmula (I), bem como quaisquer misturas suas completamente ou parcialmente equilibradas. Também são proporcionados os isómeros individuais dos compostos descritos como misturas com os seus isómeros em que um ou mais centros quirais estão invertidos.
Quando há diferentes formas isoméricas, podem ser separadas ou resolvidas uma da outra por métodos convencionais, ou qualquer dado isómero pode ser obtido por métodos sintéticos convencionais ou por sínteses estereoespecífica ou assimétrica.
Embora seja possível que, para utilização em terapêutica, um composto de fórmula (I), bem como os seus sais ou solvatos farmaceuticamente aceitáveis, possa ser administrado como uma preparação pura, i.e. sem veículo adicional, a prática mais usual é apresentar o ingrediente activo confeccionado com um veículo ou diluente. Por conseguinte, a invenção proporciona ainda uma composição farmacêutica, que inclui 2-[ (5-cloro-2-{ [3-metil-l-(1-metiletil))-lfl-pirazol-5-il]amino}-4-piridinil) -amino]-N-(metiloxi)-benzamida ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, ou um seu solvato, e um excipiente farmaceu-ticamente aceitável. A 2-[ (5-cloro-2-{ [3-metil-l-(1-metil- etil) ) -líí-pirazol-5-il ] amino }-4-piridinil) -amino ] -N- (meti-loxi)-benzamida e os seus sais ou solvatos farmaceu-ticamente aceitáveis são como descrito acima. 0 excipiente tem de ser aceitável no sentido de ser compatível com os outros ingredientes da formulação e não nocivo para quem o recebe. Também é proporcionado um processo para a preparação de uma formulação farmacêutica incluindo a mistura íntima de 2-[ (5-cloro-2-{ [3-metil-l-(1-metiletil))-líí-pirazol-5-il] amino }-4-piridinil) -amino] -N- (metiloxi) -benzamida ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, ou um seu solvato, com um excipiente farmaceuticamente aceitável.
Será entendido pelos peritos na arte que certos derivados protegidos de compostos de fórmula (I), que podem ser preparados antes de uma fase final de desprotecção, podem não ter actividade farmacológica como tais, mas podem, em certos casos, ser administrados por via oral ou oralmente ou parentericamente e subsequentemente metabolizados no organismo para formar compostos da invenção que são farmacologicamente activos. Esses derivados podem portanto ser descritos como "pró-fármacos". Será ainda entendido pelos peritos na arte que certas unidades, conhecidas pelos peritos na arte como "pró-unidades", podem ser colocadas em funcionalidades adequadas quando essas funcionalidades estão presentes nos compostos da invenção. Pró-fármacos preferidos para compostos da invenção incluem: ésteres, ésteres de carbonatos, hemi- ésteres, ésteres de fosfatos, nitro ésteres, ésteres de sulfatos, sulfóxidos, amidas, carbamatos, compostos azo, fosfamidas, glicosidos, éteres, acetais e cetais.
As composições farmacêuticas podem ser apresentadas em formas de dose unitária contendo uma quantidade predeterminada de ingrediente activo por dose unitária. Essa unidade pode conter, por exemplo, 0,5 mg a 3500 mg, preferencialmente 1 mg a 700 mg, mais preferencialmente 5 mg a 100 mg de um composto de fórmula (I), dependendo da patologia a ser tratada, da via de administração e da idade, peso e estado do doente, ou as composições farmacêuticas podem ser apresentadas em formas de dose unitária contendo uma quantidade predeterminada de ingrediente activo por dose unitária. As composições de dose unitária preferidas são as que contêm uma dose ou sub-dose diária, como aqui descrito acima, ou uma sua fracção apropriada, de um ingrediente activo. Além disso, essas composições farmacêuticas podem ser preparadas por qualquer dos métodos bem conhecidos na arte de farmácia.
As composições farmacêuticas podem ser adaptadas para administração por qualquer via apropriada, por exemplo pela via oral (incluindo bucal ou sublingual), rectal, nasal, tópica (incluindo bucal, sublingual ou transdérmica), vaginal ou parentérica (incluindo subcutânea, intramuscular, intravenosa ou intradérmica). Essas composições podem ser preparadas por qualquer método conhecido na arte de farmácia, por exemplo por associação de um composto de fórmula (I) com o(s) veiculo (s) ou excipiente (s) .
As composições farmacêuticas adaptadas para administração oral podem ser apresentadas como unidades discretas como cápsulas ou comprimidos; pós ou grânulos; soluções ou suspensões em líquidos aquosos ou não aquosos; espumas ou cremes comestíveis; ou emulsões líquidas de óleo-em-água ou emulsões líquidas de água-em-óleo.
As cápsulas são feitas por preparação de uma mistura de pós, como descrito acima, e enchimento de bainhas de gelatina formadas. Antes da operação de enchimento também podem ser adicionados à mistura em pó deslizantes e lubrificantes como sílica coloidal, talco, estearato de magnésio, estearato de cálcio ou polietilenoglicol sólido. Um agente desintegrante ou solubilizante como agar-agar, carbonato de cálcio ou carbonato de sódio também pode ser adicionado para melhorar a disponibilidade do medicamento quando a cápsula é ingerida.
Além disso, quando desejado ou necessário, aglutinantes, lubrificantes, agentes desintegrantes e agentes corantes adequados também podem ser incorporados na mistura. Os aglutinantes adequados incluem amido, gelatina, açúcares naturais como glucose ou beta-lactose, edulco-rantes de milho, gomas naturais e sintéticas como acácia, tragacanto ou alginato de sódio, carboximetilcelulose, polietilenoglicol, ceras e outros semelhantes. Os lubrificantes utilizados nestas formas de dosagem incluem oleato de sódio, estearato de sódio, estearato de magnésio, ben- zoato de sódio, acetato de sódio, cloreto de sódio e outros semelhantes. Os desintegrantes incluem, sem limitação, amido, metil celulose, agar, bentonite, goma xantana e outros semelhantes. Os comprimidos são formulados, por exemplo, por preparação de uma mistura de pós, granulação ou fluidização agregativa, adicionando um lubrificante e um desintegrante e prensagem em comprimidos. Uma mistura de pós é preparada misturando o composto, adequadamente triturado, com um diluente ou base como descrito acima, e opcionalmente com um aglutinante como carboximetilcelulose, um alginato, gelatina ou polivinilpirrolidona, um retardador de solução como parafina, um acelerador da reabsorção como um sal quaternário e/ou um agente de absorção como bentonite, caulino ou fosfato dicálcico. A mistura de pós pode ser granulada por formação de matrizes de comprimidos por meio da adição de ácido esteárico, um sal estearato, talco ou óleo mineral. A mistura lubrificada é então prensada em comprimidos. Os compostos da presente invenção também podem ser combinados com um veiculo inerte de escoamento livre e prensados em comprimidos directamente sem passar pelos passos de granulação ou fluidização agregativa. Pode ser proporcionado um revestimento protector transparente ou opaco consistindo num revestimento de selagem de goma-laca, um revestimento de açúcar ou material polimérico e um revestimento de cera polido. Pode adicionar-se corantes a estes revestimentos para distinguir diferentes dosagens unitárias.
Fluidos orais como soluções, xaropes e elixires podem ser preparados na forma de unidade de dosagem de modo a que uma dada quantidade contenha uma quantidade predeterminada de um composto de fórmula (I) . Os xaropes podem ser preparados dissolvendo o composto numa solução aquosa adequadamente aromatizada, enquanto os elixires são preparados através da utilização de um veiculo alcoólico não tóxico. As suspensões podem ser formuladas dispersando o composto num veiculo não tóxico. Também podem ser adicionados solubilizantes e emulsionantes como álcoois isoestearilicos etoxilados e éteres de polioxi etileno sorbitol, conservantes, aditivos aromatizantes como óleo essencial de hortelã-pimenta ou edulcorantes naturais ou sacarina ou outros edulcorantes artificiais, e outros semelhantes.
Quando apropriado, as composições farmacêuticas de dosagem unitária para administração oral podem ser microencapsuladas. A formulação também pode ser preparada para prolongar ou retardar a libertação, como por exemplo por revestimento ou incorporação de material em partículas em polímeros, ceras ou outros semelhantes.
As formulações farmacêuticas adaptadas para administração parentérica incluem soluções para injecção estéreis aquosas e não aquosas que podem conter anti-oxidantes, tampões, bacteriostatos e solutos que tornam a composição isotónica com o sangue do receptor pretendido; e suspensões estéreis aquosas e não aquosas que podem incluir agentes de suspensão e agentes espessantes. As composições farmacêuticas podem ser apresentadas em recipientes uni-dose ou multi-dose, por exemplo ampolas seladas e frascos, e podem ser armazenadas em estado liofilizado requerendo apenas a adição do veiculo liquido estéril, por exemplo água para injecções, imediatamente antes da utilização. As soluções e suspensões para injecção extemporânea podem ser preparadas a partir de pós, grânulos e comprimidos estéreis.
Uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto da presente invenção vai depender de vários factores incluindo, por exemplo, a idade e peso do receptor pretendido, a patologia exacta que requer tratamento e a sua gravidade, a natureza da formulação e a via de administração, e em última análise vai ser à discrição do médico que prescreve a medicação. No entanto, uma quantidade eficaz de um composto de fórmula (I) para o tratamento do cancro vai estar geralmente na gama de 0,001 a 100 mg/kg de peso corporal do receptor por dia, com vantagem na gama de 0,01 a 10 mg/kg de peso corporal por dia. Para um adulto de 7 0 kg, a quantidade real por dia seria adequadamente de 7 a 700 mg e esta quantidade pode ser administrada numa dose única por dia ou em várias (como duas, três, quatro, cinco ou seis) subdoses por dia de tal modo que a dose diária total é a mesma. Uma quantidade eficaz de um sal ou solvato, etc., pode ser determinada como uma proporção da quantidade eficaz do composto de fórmula (I) per se. Prevê-se que dosagens semelhantes seriam apropriadas para o tratamento das outras patologias referidas acima.
Tratamentos
Os compostos e composições da invenção são utilizados para tratar doenças de proliferação celular. As patologias que podem ser tratadas pelos métodos e composições aqui proporcionados incluem, mas não estão limitados a cancro, doença auto-imune, doenças fúngicas, artrite, rejeição de enxerto, doença inflamatória do intestino, proliferação induzida após procedimentos médicos, incluindo, mas não se limitados a cirurgia, angioplastia, e outros semelhantes. Entende-se que em alguns casos as células podem não estar num estado de hiper ou hipo proliferação (estado anormal) e ainda assim requerem tratamento. Por exemplo, durante a cicatrização de feridas, as células podem estar a proliferar "normalmente", mas pode ser desejado um aumento da proliferação. Assim, uma forma de realização inclui a aplicação a células ou indivíduos afectados ou em vias de afecção iminente com qualquer uma destas doenças ou patologias. Estes compostos também podem ser utilizados para o tratamento de degeneração macular associada à neovascularização, como AMD.
As composições e métodos aqui proporcionados são particularmente considerados úteis para o tratamento de cancro incluindo tumores como carcinomas da pele, mama, cérebro, carcinomas do colo do útero, carcinomas testiculares, etc. São particularmente úteis no tratamento de tumores metastáticos ou malignos. Mais particularmente, os cancros que podem ser tratados pelas composições e métodos da invenção incluem, mas não estão limitados a tipos de tumor como carcinomas e sarcomas astrocíticos, da mama, do colo do útero, colorrectais, do endométrio, do esófago, do estômago, da cabeça e pescoço, hepatocelulares, da laringe, do pulmão, oral, do ovário, da próstata e da tiróide. Mais especificamente, estes compostos podem ser utilizados para tratar: Cardíaco: sarcoma (angiossarcoma, fibrossarcoma, rabdomiossarcoma, lipossarcoma), mixoma, rabdomioma, fibroma, lipoma e teratoma; Pulmão: carcinoma broncogénico (de células escamosas, de células pequenas indiferenciado, de células grandes indiferenciado, adenocarcinoma) , carcinoma alveolar (bronquiolar), adenoma brôn-quico, sarcoma, linfoma, hamartoma condromatoso, mesote-lioma; Gastrointestinal: esófago (carcinoma de células escamosas, adenocarcinoma, leiomiossarcoma, linfoma), estômago (carcinoma, linfoma, leiomiossarcoma) , pâncreas (adenocarcinoma ductal, insulinoma, glucagonoma, gastrinoma, tumor carcinóide, vipoma), intestino delgado (adenocarcinoma, linfoma, tumor carcinóide, sarcoma de Kaposi, leiomioma, hemangioma, lipoma, neurofibroma, fibroma), intestino grosso (adenocarcinoma, adenoma tubular, adenoma viloso, hamartoma, leiomioma); Tracto genito-urinário: rim (adenocarcinoma, tumor de Wilm (nefroblastoma), linfoma, leucemia), bexiga e uretra (carcinoma de células escamosas, carcinoma de células de transição, adenocarcinoma), próstata (adenocarcinoma, sarcoma), testículo (seminoma, teratoma, carcinoma embrionário, teratocarcinoma, coriocarci-noma, sarcoma, carcinoma de células intersticiais, fibroma, fibroadenoma, tumores adenomatóides, lipoma); Fígado: hepatoma (carcinoma hepatocelular), colangiocarcinoma, hepatoblastoma, angiossarcoma, adenoma hepatocelular, hemangioma; Osso: sarcoma osteogénico (osteossarcoma), fibros-sarcoma, histiocitoma fibroso maligno, condrossarcoma, sarcoma de Ewing, linfoma maligno (sarcoma de células do retículo), mieloma múltiplo, cordoma tumoral de células gigantes maligno, osteocondroma (exostose osteocartila-ginosa), condroma benigno, condroblastoma, condromixofi-broma, osteoma osteóide e tumores de células gigantes; Sistema nervoso: crânio (osteoma, hemangioma, granuloma, xantoma, osteite deformante) , meninges (meningioma, menin-giossarcoma, gliomatose) , do cérebro (astrocitoma, medulo-blastoma, glioma, ependimoma, germinoma (pinealoma), glioblastoma multiforme, oligodendroglioma, schwannoma, retinoblastoma, tumores congénitos), neurofibroma da medula espinal, meningioma, glioma, sarcoma); Ginecológico: útero (carcinoma do endométrio), colo do útero (carcinoma cervical, displasia cervical pré-tumoral), ovários (carcinoma do ovário) (cistoadenocarcinoma seroso, cistoadenocarcinoma mucinoso, carcinoma não classificado), tumores de células da teca granulosa, tumores de células de Sertoli-Leydig, disgerminoma, teratoma maligno), vulva (carcinoma de células escamosas, carcinoma intraepitelial, adenocarcinoma, fibrossarcoma, melanoma), vagina (carcinoma de células claras, carcinoma de células escamosas, sarcoma botrióide (rabdomiossarcoma embrionário), trompas de falópio (carcinoma); Hematológicos: sangue (leucemia mielóide (aguda e crónica), leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocítica crónica, doenças mieloproliferativas, mieloma múltiplo, síndrome mielodisplásica), doença de Hodgkin, linfoma não Hodgkin (linfoma maligno); Pele: melanoma maligno, carcinoma das células basais, carcinoma das células escamosas, sarcoma de Kaposi, nevo displásico ou Mola, lipoma, angioma, dermatofibroma, quelóides, psoríase; e Glândulas supra-renais: neuroblastoma. Assim, o termo "célula cancerosa" como aqui proporcionado inclui uma célula atingida por qualquer uma das patologias acima identificadas ou com elas relacionada.
Em comparação com os derivados de 2,4-diami-nopiridina relacionados descritos noutro local, os compostos da presente invenção contêm uma função éster de ácido hidroxâmico no anel 4-aminofenilo na posição 2 e um aminopirazole na posição 2 no anel de piridina. A função de éster de ácido hidroxâmicos no anel fenilo, em comparação com a correspondente amida, aumenta a potência contra FAK na ordem de 2-5 vezes, especialmente in vitro, e melhora a selectividade para FAK em relação a outras enzimas. 0 pirazole reduz a reactividade no citocromo P450. Por conseguinte, a combinação da construção do éster do ácido hidroxâmico éster no anel fenilo com um aminopirazole na posição 2 no anel de piridina proporciona compostos com maior segurança e eficácia em relação a outros inibidores de FAK como os derivados de 2,4-diaminopiridina.
Os compostos aqui descritos podem ser combinados com ou co-administrados com outros agentes terapêuticos, em particular agentes que podem aumentar a actividade ou tempo de disposição dos compostos. As terapêuticas de associação compreendem a administração de pelo menos um composto descrito e a utilização de pelo menos um outro método de tratamento. Numa forma de realização, as terapêuticas de associação compreendem a administração de pelo menos um composto descrito e terapêutica cirúrgica. Numa forma de realização, as terapêuticas de associação compreendem a administração de pelo menos um composto descrito e radioterapia. Numa forma de realização, as terapêuticas de associação compreendem a administração de pelo menos um composto descrito e pelo menos um agente de cuidados de suporte (e.g., pelo menos um agente anti-emético). Numa forma de realização, as terapêuticas de associação compreendem a administração de pelo menos um composto descrito e pelo menos um outro agente quimioterapêutico. Numa forma de realização especifica, a invenção compreende a administração de 2-[ (5-cloro-2-{ [3-metil-l-(1-metiletil))-lfí-pira-zol-5-il]amino}-4-piridinil)-amino]-N- (metiloxi)-benzamida ou um seu sal farmaceuticamente aceitável e pelo menos um agente anti-neoplásico.
Pelo termo "co-administração" e seus derivados tal como aqui utilizado, significa-se quer a administração simultânea ou qualquer forma de administração sequencial separada de um composto inibidor da FAK, como aqui descrito, e um outro ingrediente ou ingredientes activos, conhecido como sendo útil no tratamento de cancro, incluindo quimioterapia e tratamento de radiação. 0 termo outro ingrediente ou ingredientes activos, tal como aqui utilizado, inclui qualquer composto ou agente terapêutico conhecido por ou que demonstra propriedades vantajosas quando administrado a um doente necessitado de tratamento para cancro. Preferencialmente, se a administração não for simultânea, os compostos são administrados em proximidade temporal um em relação ao outro. Além disso, não importa se os compostos são administrados na mesma forma de dosagem, e.g. um composto pode ser administrado topicamente e outro composto pode ser administrado oralmente.
Tipicamente, qualquer agente antineoplásico que tem actividade contra um tumor susceptivel a ser tratado pode ser co-administrado no tratamento de cancros específicos na presente invenção. Exemplos desses agentes podem ser encontrados em Cancer Principles and Practice of Oncology por V. T. Devita e S. Heilman (editores), 6th edition (February 15, 2001), Lippincott Williams & Wilkins Publishers. Uma pessoa com conhecimentos correntes da arte seria capaz de discernir quais as associações de agentes que seriam úteis com base nas características particulares dos fármacos e o cancro envolvido. Agentes antineoplásicos típicos úteis na presente invenção incluem, mas não estão limitados a agentes anti-microtúbulos como diterpenóides e alcaloides de vinca; complexos de coordenação de platina; agentes alquilantes como mostardas de azoto, oxazafos-forinas, alquilsulfonatos, nitrosoureias e triazenos; agentes antibióticos como antraciclinas, actinomicinas e bleomicinas; inibidores de topoisomerase II como epipo- dofilotoxinas; antimetabolitos como análogos de purina e pirimidina e compostos antifolato; inibidores de topo-isomerase I como camptotecinas; hormonas e análogos hormonais; inibidores da via de transdução de sinais; inibidores da angiogénese por tirosina quinase não receptora; agentes imunoterapêuticos; agentes pró-apoptóticos; e inibidores da sinalização do ciclo celular.
Tipicamente, qualquer agente quimioterapêutico que tem actividade contra uma neoplasia susceptível a ser tratada pode ser utilizado em associação com os compostos da invenção, desde que o agente em particular seja clinicamente compatível com terapêutica utilizando um composto da invenção. Agentes antineoplásicos típicos úteis na presente invenção incluem, mas não estão limitados a: agentes alquilantes, antimetabolitos, antibióticos antitu-morais, agentes antimitóticos, inibidores de topoisomerase I e II, hormonas e análogos hormonais; retinóides, inibidores da via de transdução de sinais, incluindo inibidores do crescimento celular ou da função do factor de crescimento, inibidores da angiogénese, e inibidores de serina/treonina quinases ou outras quinases; inibidores de quinases dependentes de ciclina; terapêuticas antisense e agentes imunoterapêuticos, incluindo monoclonais, vacinas ou outros agentes biológicos.
Os inibidores da via de transdução de sinais são os inibidores que bloqueiam ou inibem a um processo químico que evoca uma alteração intracelular. Tal como aqui utilizado esta alteração é a proliferação ou diferenciação ou a sobrevivência celular. Os inibidores da via de transdução de sinais úteis na presente invenção incluem, mas não estão limitados a, inibidores de tirosina quinases receptoras, tirosina quinases não receptoras, bloqueadores do domínio SH2/SH3, serina/treonina quinases, fosfatidil-inositol-3-0H quinases, sinalização de mioinositol e oncogenes Ras. Os inibidores da via de transdução de sinais podem ser utilizados em associação com os compostos da invenção nas composições e métodos descritos acima.
Os inibidores da angiogénese quinases receptoras também podem encontrar utilização na presente invenção. Os inibidores da angiogénese relacionadas com VEGFR e TIE-2 estão discutidos acima em relação a inibidores da transdução de sinais (ambos são tirosina quinases receptoras). Outros inibidores podem ser utilizados em associação com os compostos da invenção. Por exemplo, os anticorpos anti-VEGF, que não reconhecem VEGFR (a tirosina quinase receptora), mas ligam-se ao ligando; inibidores de moléculas pequenas de integrina (alfav betas) que inibem a angiogénese; a endostatina e a angiostatina (não RTK também) podem ser úteis em associação com os compostos da invenção. Um exemplo de um anticorpo VEGFR é o bevacizumab (AVASTIN®). Vários inibidores de receptores de factores de crescimento estão em desenvolvimento e incluem antagonistas de ligandos, anticorpos, inibidores da tirosina quinases, oligonucleotidos antisense e aptâmeros. Qualquer destes inibidores de receptores de factores de crescimento podem ser utilizados em associação com os compostos da invenção em qualquer das composições e métodos/utilizações aqui descritos. 0 trastuzumab (Herceptin®) é um exemplo de um inibidor do anticorpo anti-erbB2 da função do factor de crescimento. Um exemplo de um anticorpo anti-erbBl inibidor da função de factores de crescimento é o cetuximab (Erbitux™, C225). 0 bevacizumab (Avastin) é um exemplo de um anticorpo monoclonal dirigido contra VEGFR. Exemplos de pequenas moléculas inibidoras de receptores do factor de crescimento epidérmico incluem, mas não estão limitados a lapatinib (Tykerb ™) e erlotinib (Tarceva®). 0 mesilato de imatinib (Gleevec®) é um exemplo de um inibidor de PDGFR. Exemplos de inibidores de VEGFR incluem pazopanib, ZD6474, AZD2171, PTK787, sunitinib e sorafenib. 0 pazopanib e os compostos de Fórmula I e os seus sais têm particular interesse.
Os agentes antimicrotúbulos ou antimitóticos são agentes específicos de fase activos contra os microtúbulos de células tumorais durante a M ou a fase de mitose do ciclo celular. Exemplos de agentes antimicrotúbulos incluem, mas não estão limitados a diterpenos e alcaloides de vinca.
Os diterpenóides, que são derivados de fontes naturais, são agentes anticancerígenos de fase específica que operam nas fases G2/M do ciclo celular. Crê-se que os diterpenóides estabilizam a subunidade β-tubulina dos microtúbulos, por ligação a esta proteína. A desmontagem da proteína parece então ser inibida com a mitose a ser parada e seguindo-se a morte celular. Exemplos de diterpenóides incluem, mas não estão limitados a paclitaxel e o seu análogo docetaxel. 0 paclitaxel, 4,10-diacetato 2-benzoato 13-éster com (2R,3S)-N-benzoí1-3-fenilisosserina de 5β,20-εροχί-1,2α,4,7β,10β, 13a-hexa-hidroxi-tax-ll-en-9-ona, é um produto diterpeno natural isolado da árvore teixo do Pacífico Taxus brevifolia e que está disponível comercialmente como uma solução injectável TAXOL®. É um membro da família taxano de terpenos. Foi isolado pela primeira vez em 1971 por Wani et al. J. Am. Chem. Soc., 93: 2325, 1971), que caracterizou a sua estrutura por métodos químicos e de cristalografia de raios X. Um mecanismo para a sua actividade relaciona-se com a capacidade do paclitaxel para se ligar a tubulina, inibindo deste modo o crescimento de células cancerígenas. Schiff et al., Proc. Natl. Acad. USA, 77:1561-1565 (1980); Schiff et al., Nature, 277:665-667 (1979); Kumar, J. Biol. Chem. 256:10435-10441 (1981). Para uma revisão da síntese e actividade anticancerígena de alguns derivados do paclitaxel ver: D. G. I. Kingston et al., Studies in Organic Chemistry vol. 26, intitulado "New trends in Natural Products Chemistry 1986", Attaur-Rahman, P. W. Le Quesne, Eds. (Elsevier, Amsterdam, 1986), páginas 219-235. 0 paclitaxel foi aprovado para utilização clinica no tratamento do cancro do ovário refractário nos Estados Unidos (Markman et al., Yale Journal of Biology and Medicine, 64:583, 1991; McGuire et al., Ann. Intern. Med., 111:273, 1989) e para o tratamento de cancro da mama (Holmes et al., J. Nat. Cancer Inst., 83:1797, 1991). É urn candidato potencial para tratamento de neoplasias na pele (Einzig et al., Proc. Am. Soc. Clin. Oncol., 20:46) e carcinomas da cabeça e pescoço (Forastire et al., Sem. Oncol., 20:56, 1990). O composto também mostra potencial para o tratamento da doença poliquística do rim (Woo et al. , Nature, 368: 750, 1994), cancro do pulmão e malária. O tratamento de doentes com paclitaxel resulta na supressão da medula óssea (linhagens celulares múltiplas, Ignoff, R. J. et al., Cancer Chemotherapy Pocket Guide, 1998) relacionada com a duração de dosagem acima de uma concentração limiar (50 nM) (Kearns, C. M. et al., Seminars in Oncology, 3(6), páginas 16-23, 1995). O docetaxel, (2R,3S)-N-carboxi-3-fenilisosserina, éster N-terc-butílico, 13-éster com 5β-20-θροχί-1,2α,4,7β, ΙΟβ,13a-hexa-hidroxitax-ll-en-9-ona 4-acetato 2-benzoato, tri-hidrato, encontra-se disponível comercialmente como uma solução injectável como TAXOTERE®. O docetaxel está indicado para o tratamento de cancro da mama. O docetaxel é um derivado semi-sintético do paclitaxel q.v., preparado utilizando um precursor natural, a 10-desacetil-bacatina III, extraída das agulha do teixo europeu. A toxicidade limitante da dose de docetaxel é a neutropenia.
Os alcaloides de vinca são são agentes antineoplásicos específicos de fase derivados da planta pervinca. Os alcaloides de vinca actuam na fase M (mitose) do ciclo celular por se ligarem especificamente à tubulina. Consequentemente, a molécula de tubulina ligada é incapaz de polimerizar em microtúbulos. Crê-se que a mitose é parada na metafase seguindo-se a morte celular. Exemplos de alcaloides de vinca incluem, mas não estão limitados a vinblastina, vincristina e vinorrelbina. A vinblastina, sulfato de vincaleucoblastina, está disponível comercialmente como VELBAN® como uma solução injectável. Embora tenha uma possível indicação como terapêutica de segunda linha de vários tumores sólidos, está principalmente indicada no tratamento de cancro dos testículos e vários linfomas, incluindo a doença de Hodgkin; e linfomas linfocíticos e histiocíticos. A mielossupressão é o efeito secundário limitante da dose de vinblastina. A vincristina, vincaleucoblastina, 22-oxo-, sulfato, está disponível comercialmente como ONCOVIN® como uma solução injectável. A vincristina está indicada para o tratamento de leucemias agudas e também encontrou utilização em regimes de tratamento para linfomas malignos Hodgkin e não Hodgkin. A alopécia e efeitos neurológicos são o efeito secundário mais comum da vincristina e em menor extensão ocorrem efeitos de mielosupressão e mucosite gastrointestinal. A vinorrelbina, 3',4'-didesidro-4'-desoxi-C'-norvincaleucoblastina [R-(R*,R*)-2,3-di-hidroxibutanodioato (1:2) (sal)], disponível comercialmente como uma solução injectável de tartarato de vinorrelbina (NAVELBINE®), é um alcaloide de vinca semissintético. A vinorrelbina está indicada como um agente individual ou em associação com outros agentes quimioterapêuticos, como a cisplatina, no tratamento de vários tumores sólidos, especialmente do pulmão de células não pequenas, da mama avançado, e cancros da próstata refractários a hormonas. A mielossupressão é o efeito secundário mais comum limitante da dose de vinorrelbina.
Os complexos de coordenação de platina são agentes anticancerígenos não específicos de fase, que são interactivos com o ADN. Os complexos de platina entram nas células tumorais, sofrem aquação e formam reticulações intra- e inter-cadeias com ADN causando efeitos biológicos adversos ao tumor. Exemplos de complexos de coordenação de platina incluem, mas não estão limitados a cisplatina e carboplatina. A cisplatina, cis-diaminodicloroplatina, está disponível comercialmente como PLATINOL® como uma solução injectável. A cisplatina está indicado principalmente para o tratamento de cancro dos testículos e do ovário metas-táticos e cancro avançado da bexiga. Os efeitos secundários que limitam a dose primária da cisplatina são nefrotoxicidade, que pode ser controlada por hidratação e diurese, e ototoxicidade. A carboplatina, diamino [ 1,1-ciclobutano-dicar-boxilato(2-)-0,0'] de platina, encontra-se disponível comercialmente como PARAPLATIN® como uma solução injectável. A carboplatina está indicada principalmente na primeira e segunda linha de tratamento do carcinoma avançado do ovário. A supressão da medula óssea é a toxicidade limitante da dose da carboplatina.
Os agentes alquilantes são agentes antican-cerígenos não específicos de fase e electrófilos fortes. Tipicamente, os agentes alquilantes formam ligações covalentes, por alquilação, ao ADN através de unidades nucleófilas da molécula de ADN, como grupos fosfato, amino, sulfidrilo, hidroxilo, carboxilo e imidazole. Essa alquilação impede a função dos ácidos nucleicos, levando à morte celular. Exemplos de agentes alquilantes incluem, mas não estão limitados a mostardas de azoto como ciclo-fosfamida, melfalan, clorambucil; sulfonatos de alquilo como bussulfano; nitrosoureias, como carmustina; e triazenos como dacarbazina. A ciclofosfamida, mono-hidrato do 2-óxido de 2-[bis(2-cloroetil)amino]tetra-hidro-2H-l,3,2-oxazafosforina, encontra-se disponível comercialmente como uma solução injectãvel ou comprimidos como CYTOXAN®. A ciclofosfamida está indicada como um agente individual ou em associação com outros agentes quimioterapêuticos, no tratamento de linfomas malignos, mieloma múltiplo e leucemias. Alopécia, náuseas, vómitos e leucopenia são os efeitos secundários mais comuns limitantes da dose da ciclofosfamida. 0 melfalano, 4-[bis (2-cloroetil)amino]-L-fenil-alanina, está disponível comercialmente como uma solução injectável ou comprimidos como ALKERAN®. 0 melfalano está indicado para o tratamento paliativo de mieloma múltiplo e carcinoma epitelial do ovário não operável. A supressão da medula óssea é o efeito secundário mais comum limitante da dose do melfalano. 0 clorambucil, ácido 4-[bis(2-cloroetil)amino] benzenobutanóico, está disponível comercialmente na forma de comprimidos LEUKERAN®. 0 clorambucil está indicado para o tratamento paliativo da leucemia linfática crónica, e linfomas malignos linfossarcoma, linfoma folicular gigante e doença de Hodgkin. A supressão da medula óssea é o efeito secundário mais comum limitante da dose do clorambucil.
0 bussulfano dimetanossulfonato de 1,4-buta-nodiol, está disponível comercialmente na forma de comprimidos MYLERAN®. 0 bussulfano está indicado para o tratamento paliativo da leucemia mielóide crónica. A supressão da medula óssea é o mais comum dos efeitos secundários limitantes da dose do busulfano. A carmustina, 1,3-[bis (2-cloroetil)-1-nitroso-ureia, está disponível comercialmente como frascos individuais de material liofilizado como BiCNU®. A carmustina está indicada para o tratamento paliativo como um agente individual ou em associação com outros agentes para tumores cerebrais, mieloma múltiplo, doença de Hodgkin, e linfomas não Hodgkin. A mielossupressão atrasada é o mais comum dos efeitos secundários limitantes da dose da carmustina. A dacarbazina, 5-(3,3-dimetil-l-triazeno)-imida-zole-4-carboxamida, está disponível comercialmente como frascos individuais de material como DTIC-Dome®. A dacarbazina está indicada para o tratamento de melanoma maligno metastático e em combinação com outros agentes para o tratamento de segunda linha da doença de Hodgkin. Náusea, vómitos, anorexia e são os efeitos secundários mais limitantes da dose da dacarbazina.
Os antibióticos antineoplásicos são agentes não específicos de fase que se ligam ou intercalam com o DNA. Tipicamente, essa acção resulta em complexos estáveis de DNA ou ruptura de cadeias, o que perturba a função normal dos ácidos nucleicos conduzindo à morte celular. Exemplos de agentes antineoplásicos antibióticos incluem, mas não estão limitados a actinomicinas como dactinomicina, antraciclinas como daunorrubicina e doxorrubicina, e bleomicinas. A dactinomicina, também conhecida como actino-micina D, está disponível comercialmente em forma injectável como COSMEGEN®. A dactinomicina está indicada para o tratamento do tumor de Wilm e rabdomiossarcoma. Náusea, vómitos eanorexia e são os efeitos secundários mais comuns limitantes da dose da dactinomicina. A daunorrubicina, cloridrato de (8S-cis-)-8-acetil-10-[(3-amino-2,3,6-tridesoxi-(-L-lixo-hexo-pirano-sil) oxi]-7,8,9, 10-tetra-hidro-6, 8,11-tri-hidroxi-l-metoxi- 5.12- naftacenodiona, está disponível comercialmente como uma forma injectável lipossomal como DAUNOXOME® ou como um injectável como CERUBIDINE®. A daunorrubicina está indicada para indução da remissão no tratamento da leucemia não linfocítica aguda e sarcoma de Kaposi associado a VIH avançado. A mielossupressão é o efeito secundário mais comum limitante da dose da daunorrubicina. A doxorrubicina, cloridrato de (8S,10S)—10—[(3— amino-2,3,6-tridesoxi-a-L-lixo-hexopiranosil)oxi]-8-glico-loílo, 7,8,9,10-tetra-hidro-6,8,11-tri-hidroxi-l-metoxi- 5.12- naftacenodiona, está disponível comercialmente como uma forma injectável como RUBEX® ou ADRIAMYCIN RDF®. A doxorrubicina está indicada principalmente para o tratamento da leucemia linfoblástica aguda e leucemia mieloblástica aguda, mas também é um componente útil no tratamento de alguns tumores sólidos e linfornas. A mielossupressão é o efeito secundário mais comum limitante da dose da doxorrubicina. A bleomicina, uma mistura de antibióticos glicopeptídicos citotóxicos isolados de uma estirpe de Streptomyces verticillus, está disponível comercialmente como BLENOXANE®. A bleomicina está indicada como um tratamento paliativo, como um agente individul ou em associação com outros agentes, de carcinoma de células escamosas, linfomas e carcinomas testiculares. As toxicidades pulmonar e cutânea são os efeitos secundários mais comuns limitantes da dose da bleomicina.
Os inibidores de topoisomerase II incluem, mas não estão limitados a epipodofilotoxinas.
As epipodofilotoxinas são agentes antineoplásicos específicos de fase derivados da planta mandrágora. As epipodofilotoxinas tipicamente afectam as células das fases S e G2 do ciclo celular através da formação de um complexo ternário com a topoisomerase II e ADN causando quebras nas cadeias do ADN. As quebras das cadeias acumulam-se e segue-se a morte celular. Exemplos de epipodofilotoxinas incluem, mas não estão limitados a etoposido e teniposido. 0 etoposido, 9-[4,6-0-(R)-etilideno-p-D-glucopi-ranosido de 4'-desmetil-epipodofilotoxina], está disponível comercialmente como uma solução injectável ou como cápsulas
VePESID® e é vulgarmente conhecido como VP-16. 0 etoposido está indicado como um agente individual ou em associação com outros agentes quimioterapêuticos, no tratamento de cancros do testículo e do pulmão de células não pequenas. A mielossupressão é o efeito secundário mais comum do etoposido. A incidência de leucopenia tende a ser mais grave do que a de trombocitopenia. 0 teniposido, 9-[4, 6-0-(R)-tenilideno-p-D-gluco-piranosido] de 4'-desmetil-epipodofilotoxina, está disponível comercialmente como uma solução injectável como VUMON® e é vulgarmente conhecido como VM-26. 0 teniposido está indicado como um agente individual ou em associação com outros agentes quimioterapêuticos, no tratamento de leucemia aguda em crianças. A mielossupressão é o efeito secundário mais comum limitante da dose do teniposido. 0 teniposido pode induzir tanto leucopenia como trombocitopenia .
Os agentes neoplásicos antimetabolitos são agentes antineoplásicos específicos de fase que actuam na fase S (síntese de ADN) do ciclo celular por inibição da síntese do ADN ou por inibição da síntese de bases de purina ou pirimidina e limitando assim a síntese do ADN. Por conseguinte, a fase S não decorre e segue-se a morte celular. Exemplos de agentes antineoplásicos antimetabolitos incluem, mas não estão limitados a fluoro-uracilo, metotrexato, citarabina, mercaptopurina, tioguanina e gemcitabina. 0 5-fluoro-uracilo, 5-fluoro-2,4-(1H,3H)pirimidi-nodiona, está disponível comercialmente como fluoro-ura-cilo. A administração de 5-fluoro-uracilo leva à inibição da síntese de timidilato e também é incorporada tanto em ARN como em ADN. 0 resultado é tipicamente a morte celular. 0 5-fluoro-uracilo está indicado como um agente individual ou em associação com outros agentes quimioterapêuticos, no tratamento de carcinomas da mama, cólon, recto, estômago e pâncreas. A mielossupressão e a mucosite são efeitos secundários limitantes da dose do 5-fluoro-uracilo. Outros análogos de fluoropirimidina incluem 5-fluoro desoxiuridina (floxuridina) e monofosfato de 5-fluoro-desoxiuridina. A citarabina, 4-amino-l-p-D-arabinofuranosil-2 (1H)-pirimidinona, está disponível comercialmente como Cytosar-U® e é vulgarmente conhecida como Ara-C. Crê-se que a citarabina apresenta especificidade de fase celular na fase S por inibição do alongamento da cadeia de ADN por incorporação terminal de citarabina na cadeia de ADN em crescimento. A citarabina está indicada como um agente individual ou em associação com outros agentes quimioterapêuticos no tratamento de leucemia aguda. Outros análogos de citidina incluem 5-azacitidina e 2' , 2'-difluo-rodesoxicitidina (gemcitabina). A citarabina induz leuco-penia, trombocitopenia e mucosite. A mercaptopurina, mono-hidrato de 1,7-di-hidro-6H-purino-6-tiona, está disponível comercialmente como PURINETHOL®. A mercaptopurina apresenta especificidade de fase celular na fase S por inibição da síntese de ADN por um mecanismo ainda não especificado. A mercaptopurina está indicada como um agente individual ou em associação com outros agentes quimioterapêuticos, no tratamento de leucemia aguda. A mielossupressão e a mucosite gastrointestinal são efeitos secundários esperados da mercaptopurina em doses elevadas. Um análogo de mercaptopurina útil é a azatioprina. A tioguanina, 2-amino-l,7-di-hidro-6H-purina-6-tiona, está disponível comercialmente como TABLOID®. A tioguanina apresenta especificidade de fase celular na fase S por inibição da síntese de ADN por um mecanismo ainda não especificado. A tioguanina está indicada como um agente individual ou em associação com outros agentes quimioterapêuticos, no tratamento de leucemia aguda. A mielossupressão, incluindo leucopenia, trombocitopenia e anemia, é o efeito secundário mais comum limitante da dose de administração da tioguanina. No entanto, ocorrem efeitos secundários gastrointestinais e podem ser limitantes da dose. Outros análogos de purina incluem pentostatina, eritro-hidroxinoniladenina, fosfato de fludarabina e cladribina. A gemcitabina, monocloridrato de 2'-desoxi-2',2'-difluorocitidina (isómero β), está disponível comercialmente como GEMZAR®. A gemcitabina apresenta especificidade de fase celular na fase S e por bloqueamento da progressão das células através da fronteira Gl/S. A gemcitabina está indicada em associação com a cisplatina no tratamento do cancro do pulmão de células não pequenas localmente avançado e individualmente no tratamento de cancro do pâncreas localmente avançado. A mielossupressão, incluindo leuco-penia, trombocitopenia e anemia, é o efeito secundário mais comum limitante da dose de administração da gemcitabina. 0 metotrexato, ácido N-[4[[ (2,4-diamino-6-pteri-dinil)metil]metilamino]benzoíl]-L-glutâmico, está disponível comercialmente como metotrexato de sódio. 0 metotrexato apresenta efeitos de fase celular especificamente na fase S por inibição da síntese do ADN, reparação e/ou replicação através da inibição da redutase do ácido di-hidrofólico que é necessário para a síntese de nucleotidos de purina e timidilato. 0 metotrexato está indicado como um agente individual ou em associação com outros agentes quimiote-rapêuticos, no tratamento de coriocarcinoma, leucemia das meninges, linfoma não Hodgkin, e carcinomas da mama, cabeça, pescoço, ovário e bexiga. A mielossupressão (leucopenia, trombocitopenia e anemia) e a mucosite são um efeito secundário esperado da administração do metotrexato.
As camptotecinas, incluindo, camptotecina e derivados de camptotecina, estão disponíveis ou em desenvolvimento como inibidores da topoisomerase I. Crê-se que a actividade citotóxica das camptotecinas está relacionada com a sua actividade inibidora da topoisomerase I. Exemplos de camptotecinas incluem, mas não estão limitados a irinotecano, topotecano, e as várias formas ópticas de 7- (4-metilpiperazino-metileno)-10,ll-etilenodioxi-20-campto-tecina descritas adiante. O irinotecano HC1, (4 S)-4,ll-dietil-4-hidroxi-9-[(4-piperidinopiperidino)carboniloxi]-lH-pirano [3',4',6,7] indolizino[1,2-b]quinolino-3, 14 (4H,12H)-diona, está dis ponível comercialmente como uma solução injectável CAMPTOSAR®. O irinotecano é um derivado de camptotecina que se liga, juntamente com o seu metabolito activo SN-38, ao complexo de topoisomerase I-ADN. Crê-se que a citotoxi-cidade ocorre como um resultado de quebras irreparáveis nas cadeias duplas causadas por interacção da topoisomerase I:ADN:irintecano ou complexo ternário de SN-38 com enzimas de replicação. O irinotecano está indicado para o tratamento de cancro metastático do cólon ou do recto. Os efeitos secundários limitantes da dose de cloridrato de irinotecano são mielossupressão, incluindo neutropenia, e os efeitos gastrointestinais, incluindo diarreia. O topotecano HC1, monocloridrato de (S)-10-[(dimetilamino)metil]-4-etil-4,9-di-hidroxi-lH-pirano-[3,4,6,7]indolizino[1,2-b]-quinolino-3,14-(4H, 12H)-diona, está disponível comercialmente como uma solução injectável HYCAMTIN®. O topotecano é um derivado de camptotecina que se liga ao complexo de topoisomerase I-ADN e impede a religação da quebra das cadeias individuais causadas por topoisomerase I em resposta a tensão torsional da molécula de ADN. 0 topotecano está indicado para tratamento de segunda linha do carcinoma metastático do ovário pulmão e cancro do pulmão de células pequenas. 0 efeito secundário limitante da dose de topotecano HC1 é a mielossupressão, principalmente neutropenia.
Os esquemas seguintes ilustram como compostos de fórmula (I) da presente invenção podem ser preparados. Os solventes específicos e condições reaccionais referidos também são ilustrativos.
Esquemas
Os compostos de fórmula (I) podem ser preparados pelos métodos descritos no Esquema 1 adiante. Os compostos de fórmula (II) e (III) estão disponíveis comercialmente ou podem ser sintetizados utilizando técnicas convencionais na arte. 0 grupo L para o composto (III) representa um grupo abandonante como F ou Cl. Os compostos de fórmula (II) e (III) pode reagir em condições de refluxo ou de micro-ondas para dar o intermediário (IV). A reacção de adição é tipicamente feita utilizando solventes polares próticos, como n-butanol ou iso-propanol. Alternativamente, pode utilizar-se condições reaccionais de condensação catalisada por um metal. Quando o composto (II) inclui um grupo funcional que necessita de protecção, por exemplo um grupo hidroxilo ou amino, é utilizado com vantagem um grupo protector apropriado. Pode então fazer-se reagir os compostos de fórmula (IV) com um aminopirazole (V), que está disponível comercialmente ou que pode ser sintetizado utilizando técnicas convencionais na arte, para dar um composto de fórmula (I). A reacção é tipicamente realizada na presença de um catalisador de metal, como um sal de paládio, juntamente com um ligando fosfina adequado. Alternativamente, a reacção pode ser realizada com uma quantidade catalítica de um ácido como ácido clorídrico ou trifluoroacético e num solvente adequado como água, 1,4-dioxano ou iso-propanol ou uma sua combinação; a reacção é com vantagem realizada a uma temperatura elevada, por exemplo, em condições de refluxo, ou utilizando um aparelho de micro-ondas. 0 catalisador ácido está tipicamente presente numa quantidade de 10-30% molar em relação ao composto de fórmula (I).
Os compostos de fórmula (VIII) podem ser convenientemente preparados pelos métodos descritos no Esquema 1, mas começando com uma antranilamida (VI) adequada, como representado no Esquema 2.
0 composto (VI) pode conter substituintes adicionais. Por exemplo, como ilustrado no Esquema 3, a benzoxazina (IX), que está disponível comercialmente ou é sintetizada utilizando técnicas convencionais na arte, pode ser aberta no anel com uma amina para formar a benzamida (X) , que pode então ser submetida a adição com o composto (III) para se obter o composto de fórmula (XI).
Um composto de fórmula (XII) pode ser preparado por reacção de um composto de fórmula (II) com um composto de fórmula (XIII) . Esta reacção pode ser realizada como descrito no Esquema 1. Pode então fazer-se reagir os compostos de fórmula (XII) com um composto de fórmula (XIV) para dar compostos de fórmula (I) . A reacção pode ser realizada num solvente inerte, na presença de um catalisador de metal e do ligando apropriado.
Certos compostos de fórmula (I) também podem ser preparados como descrito no Esquema 5. Pode fazer-se reagir primeiro o grupo amino do composto de fórmula (XV) com diceteno seguido por acilação e tratamento com uma hidrazina. 0 composto com a fórmula (XVI) pode então ser obtido por tratamento com ácido, e depois faz-se reagir com um composto de fórmula (II) para dar um composto de fórmula (I) . Esta última reacção pode ser efectuada como descrito no Esquema 1.
Os compostos de fórmula (V) podem ser preparados pela condensação de uma hidrazina substituída (XVIII) com a ciano-cetona apropriada (XVII), por exemplo, de acordo com os procedimentos de Honma, T. et al. J. Med. Chem. 2002, Vol. 44 (26), 4628-4640 ou Adachi, I. et al. Chemical &
Pharmaceutical Bulletin 1987, 35(8), 3235-52, como representado no Esquema 6.
Esquema 7
Um composto de fórmula (XXI) também pode ser preparado como descrito no Esquema 7. O nitrilo de fórmula (XIV) pode ser hidrolisado a um ácido carboxilico de fórmula (XX) e depois condensado com uma amina para dar compostos de fórmula (XXI).
PARTE EXPERIMENTAL
Doseamento bioquímico da actividade de FAR
Ensaio 1: FAK marcada com GST (marcada com gluta-tiona S-transferase) foi adquirida a Invitrogen (PV3832) (www.invitrogen.com). A actividade da FAK foi medida por monitorização da fosforilação de um substrato peptídico (Ac-RRRRRRSETDDYAEIID-NH2 (SEQ ID NO: 1) i.e. Ac-Arg-Arg-
Arg-Arg-Arg-Ser-Glu-Thr-Asp-Asp-Tyr-Ala-Glu-Ile-Ile-Asp-NH2) na presença de um ATP radiomarcado. Para medir os ini-bidores de FAK, os compostos foram primeiro preparados como uma solução mãe lOx em DMSO a 10%. Uma pequena porção de cada solução (4 mL) foi adicionada a uma placa com 96 poços (Corning, 3884). Uma solução de GST-FAK 6 nM foi preparada em tampão de reacção l,lx contendo HEPES 44 mM, pH = 7,2, MgCÍ2 11 mM, MnCÍ2 2,2 mM, DTT 1,1 mM e Tween-20 a 0,011%. Em seguida, 2 0 pL da solução de GST-FAK 6 nM foram pré-incubados com os compostos durante 30 min à temperatura ambiente. A reacção foi iniciada pela adição de 16 pL de substratos (péptido 62,5 pM, ATP 5 pM e 33Ρ-γ-ΑΤΡ -0,02 mCi/mL) preparado no tampão de reacção acima referido. A reacção foi deixada prosseguir durante 90 min antes de ser desactivada com 40 pL de H3PO4 a 1%. Uma porção da mistura reaccional (60 pL) foi transferida para uma placa com filtro de fosfocelulose (Millipore; www.millipore.com, MAPHNOB50) e incubada durante 20 minutos. A placa foi filtrada, lavada três vezes com 150 pL de H3PO4 a 0,5% e seca a 50 °C durante 30 min. Após a adição de 60 pL de Microscint-20 à placa, a radioactividade foi medida utilizando um TopCount (PerkinElmer; www.PerkinElmer.com).
Ensaio 2: Preparou-se Flag-His-TEV-FAKl no laboratório. FAK humana de comprimento completo foi expressa utilizando baculovirus em células Sf9 com marcadores FLAG-6xHis no terminal N a que se seguiu um sitio de clivagem TEV (FLAG-6xHis-TEV-huFAK). A actividade da FAK foi determinada por monitorização da fosforilação de substrato LANCE Ultra NH2-(ULight)-CSETDDYAEIID-COOH (SEQ ID NO: 2) (C = cisteina, S = serina, E = ácido glutâmico, T = treonina, D = ácido aspártico, Y = tirosina, A = alanina, I = isoleucina) (adquirido a Perkin Elmer Life Sciences) . Para determinar os inibidores de FAK, os compostos foram primeiro preparados como uma solução mãe lOOx em DMSO a 100%. Uma pequena porção de cada solução do composto (50 nL) foi adicionada a uma placa de microtitulação preta com 384 poços de baixo volume (Greiner 784076). Uma solução de His-Flag-TEV-FAKl 1,2 nM foi preparada em tampão de reacção IX contendo Tris/Tris-HCl 40 mM, MgCÍ2 10 mM, CHAPS 1 mM, a um pH de 7,5, com DTT 1 mM adicionado. 2,5 pL da solução de Flag-FAK 1,2 nM foram adicionados às placas e pré-incubados com os compostos durante 30 min à temperatura ambiente. Em seguida, 2,5 pL de solução de substrato (0,1 pM de substrato especifico P2 FAK-tide (Lance Ultra NH2-(ULight) -CSETDDYAEIID-COOH (SEQ ID NO: 2) de Perkin Elmer), ATP 10 μΜ e tampão de reacção IX descrito acima), foram adicionados à placa para iniciar a reacção. Após incubação durante 120 minutos à temperatura ambiente, a reacção é desactivada por adição de 5 yL de EDTA a 20 mM e anticorpo Eu-Anti-pTyr 5 nM em tampão de detecção IX LANCE. Após uma incubação de 30 minutos à temperatura ambiente, a placa é lida num Viewlux da Perkin Elmer com um filtro de excitação de 320-340 nm e medição da emissão a 615 nm medindo a 665 nm. A razão de 665 nm/615 nm é utilizada para normalização dos dados. A Tabela A seguinte apresenta dados específicos para um composto do Exemplos adiante tal como realizado em ambos os ensaios anteriores. Estes dados foram gerados em pelo menos um ensaio do doseamento assinalado; ensaios repetidos podem ter dado ou podem dar leituras que variam em certa medida em relação a estes dados.
Exemplos de química
Os seguintes exemplos de química são apenas para fins ilustrativos e não se destinam a limitar o âmbito da presente invenção. Os compostos foram designdos utilizando o software ACD Name (Advanced Chemistry Development, www.acdlabs.com).
Um espectrómetro de massa de quadrupolo único PE Sciex API 150 (PE Sciex, Thornhill, Ontário, Canadá) foi operado utilizando ionização por electropulverização no modo de detecção de iões positivos. O gás de nebulização foi gerado a partir de um gerador de ar zero (Balston Inc., Haverhill, Massachusetts; www.parker.com) e administrado a 65 psi e o gás de cortina era azoto de alta pureza proveniente de um recipiente Dewar de azoto liquido a 50 psi. A tensão aplicada na agulha de electropulverização foi de 4,8 kv. 0 orifício foi regulado para 25 V e espectrómetro de massa foi digitalizado a uma velocidade de 0,5 digitalização/s utilizando uma massa de passo de 0,2 amu e recolhendo os dados do perfil. Método A, LCMS. As amostras são introduzida no espectrómetro de massa utilizando um amostrador automático CTC PAL (LEAP Technologies, Carrboro, NC) equipado com uma seringa Hamilton de 10 yL que fazia a injecção numa válvula de injecção de 10 portas Valeo. A bomba de HPLC era uma Shimadzu LC-lOADvp (Shimadzu Scientific Instruments, Columbia, Md.) pperada a 0,3 mL/min e um gradiente linear de 4,5% de A a 90% de B em 3,2 min com um tempo de espera de 0,4 min. A fase móvel era composta por 100% de (H2O a 0,02% de TFA) no vaso A e 100% de (CH3CN a 0,018% de TFA) no vaso B. A fase estacionária é Aquasil (C18) e as dimensões da coluna são 1 mm χ 40 mm. A detecção foi por UV a 214 nm, dispersão de luz evaporativa (ELSD) e MS. Método B, LCMS. Alternativamente, foi utilizado um sistema de HPLC analítico Agilent 1100 com um LC/MS e operado a 1 mL/min e um gradiente linear de 5% de A a 100% de B em 2,2 min com 0,4 min de tempo de espera. A fase móvel era composta por 100% de (H2O a 0,02% de TFA) no vaso A e 100% de (CH3CN 0,018% de TFA) no vaso B. A fase estacionária era Zobax (C8) com um tamanho das partículas de 3,5 ym e as dimensões da coluna eram 2,1 mm χ 50 mm. A detecção foi efectuada por UV a 214 nm, dispersão de luz evaporativa (ELSD) e MS. Método B, LCMS. Alternativamente, utilizou-se um MDSSCIEX API 2000 equipado com uma coluna capilar de (50 x 4, 6 mm, 5 ym) . A HPLC foi realizada num sistema de UPLC Agilent série 1200 equipado com coluna Zorbax SB-C18 (50 x 4,6 mm, 1,8 ym) eluindo com tampão de CH3CN: acetato de amónio. As reacções foram realizadas no microondas (CEM Discover).
Os espectros de 1H-NMR (daqui em diante "NMR") foram registados a 400 MHz utilizando um instrumento Bruker Avance de 400 MHz, utilizando o Gestor de ACD Spect ver. 10 para reprocessamento. As multiplicidades indicadas são: s = singuleto, d = dupleto, t = tripleto, q = quarteto, m = multipleto, dd = dupleto de dupletos, dt = dupleto de tripletos, etc. e br indica um sinal largo. HPLC analítica: Os produtos foram analisados por um sistema de cromatografia analítica Agilent 1100, com uma coluna Zorbax XDB-C18 de 4,5 χ 75 mm (3,5 ym) a 2 mL/min com um gradiente de 4 min de 5% de CH3CN (0,1% de ácido fórmico) até 95% de CH3CN (0,1% de ácido fórmico) em H2O (0,1% ácido fórmico) e com um tempo de espera de 1 min. HPLC preparativa: Os produtos foram purificados utilizando um sistema de cromatografia preparativa Gilson com uma coluna YMC CombiPrep ODS-A D.I. de 75 χ 30 mm (5 ym) (www.waters.com) a 50 mL/min com um gradiente de 10 min de 5% de CH3CN (0,1% de ácido fórmico) até 95% de CH3CN (0,1% de ácido fórmico) em H2O (0,1% ácido fórmico) e 2 minutos de tempo de espera; alternativamente, os produtos foram purificados utilizando um sistema de cromatografia preparativa Agilent 1100, com uma coluna Gemini C18 com 100 χ 30 mm (5 ym) a 60 mL/min com um gradiente de 10 min desde 5% de CH3CN (0,1% de ácido fórmico) até 95% de CH3CN (0,1% de ácido fórmico) em H2O (0,1% de ácido fórmico) e um tempo de espera de 2 min. A cromatografia preparativa em fase normal foi realizada utilizando um sistema Analogix IntelliFlash 280 com colunas SuperFlash Sepra Si 50. Alternativamente, a HPLC de fase inversa foi realizada num Agilent utilizando uma coluna Zorbax SB-C18 (21,2 x 250 mm, 7 ym) eluindo com CH3CN: tampão de acetato de amónio (10 yM) a pH 6,8.
EXEMPLOS
Intermediário 1 Ácido 2 - [ (2,5-dicloro-4-piridinil)amino]benzóico
Uma mistura de 2,5-dicloro-4-iodopiridina (10 g, 36,5 mmol), ácido 2-aminobenzóico (4,85 g, 35,4 mmol), DPEphos [éter bis(2-difenilfosfinofenílico)] (1,6 g, 2,97 mmol), acetato de paládio(II) (160 mg, 0,713 mmol) e K3PO4 (20 g, 94 mmol) foi desgaseifiçada e aquecida a 120°C (temperatura do banho de óleo) durante 20 h. Após 20 h, a LCMS mostrou que havia 33% (em relação ao produto desejado) de material de partida remanescente. Adicionou-se outros 160 mg de Pd(OAc)2 à mistura e aqueceu-se a 120°C durante mais 24 h. A LCMS mostrou conversão completa. A mistura foi arrefecida até à temperatura ambiente, seguida por filtração e lavagem com EtOAc. Os sólidos foram acidificados até pH = 7-8, a que se seguiu filtração. No entanto, a mistura era uma pasta e os sólidos recolhidos não puderam ser completamente secos. Os sólidos (11 g) foram acidificados com HCl 6 N até pH = 1. A pasta resultante foi filtrada e lavada com água e TBME. O sólido foi seco em vácuo sobre P2O5 durante 2 dias para dar o composto em epígrafe (7,32 g, 60,2% de rendimento). MS: M (C12H8CI2N2O2) = 283, 11, (M+H) + = 283,8; XH NMR (400 MHz, DMSO) δ ppm 13,6 (s, 1H) 10,2 (s, 1H) , 8,3 (s, 1H) , 8,0 (d, 1H) , 7,6 (q, 2H) , 7,3 (s, 1H) , 7,2 (m, 1H) .
Exemplo de Referência A 2-({5-Cloro-2-[ (l-etil-3-metil-li7-pirazol-5-il) amino] - 4-piridinil}amino)-N- (metiloxi)benzamida
a) 2-[ (2,5-Dicloro-4-piridinil)amino]-N- (metiloxi)-benzamida
Um recipiente foi carregado com ácido 2 — [ (2,5 — dicloro-4-piridinil)amino]benzóico (1,0 g, 3,53 mmol), cloridrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida (677 mg, 3,53 mmol) e hidroxibenzotriazole (HOBT) (541 mg, 3.53 mmol) em N, N-dimetilformamida (DMF, 7,0 mL) e foi agitado à temperatura ambiente durante 30 min. A esta solução adicionou-se cloridrato de metoxilamina (0,3 g, 3.53 mmol) e a mistura reaccional foi agitada durante mais 10 min. A mistura reaccional foi arrefecida a 0°C utilizando um banho de gelo. A esta mistura reaccional adicionou-se diisopropiletilamina (1,2 mL, 7,06 mmol) e a mistura foi agitada à temperatura ambiente de um dia para o outro. Após concentração em vácuo, o resíduo foi processado utilizando uma solução aquosa saturada de NaHCCb e CH2CI2. A fase orgânica foi lavada com solução aquosa saturada de cloreto de sódio e depois seca sobre MgSCL e filtrada. 0 CH2CI2 foi removido por evaporação rotativa. 0 material em bruto foi aplicado numa coluna de gel de sílica e eluído por MeOH em CH2CI2 com NH4OH a 0,1%, o que deu o produto desejado 2-[ (2,5-dicloro-4-piridinil)amino]-N- (metiloxi)-benzamida (850 mg, 2,72 mmol, rendimento de 77%) MS: M (C13H11CI2N3O2) = 312,15, (M+H)+ = 312, 314; XH NMR (400 MHz, CLOROFÓRMIO-d) δ ppm 9,57 (br s, 1H) , 8,72 (s, 1H) , 8,22 (s, 1H) , 7,51-7,67 (m, 3H) , 7,25 (s, 1H) , 7,07-7,21 (m, 1H) , 3, 92 (s, 3H) . b) 2-({5-Cloro-2-[ l-etil-3-metil-l7í-pirazol-5-il) amino] - 4-piridinil}amino)-N- (metiloxi)benzamida
Um tubo de micro-ondas de 20 mL foi carregado com 2-[(2,5-dicloro-4-piridinil)amino]-N- (metiloxi)benzamida (100 mg, 0,320 mmol), l-etil-3-metil-lH-pirazol-5-amina (60,1 mg, 0,481 mmol), carbonato de césio (313 mg, 0,961 mmol), 1,4-dioxano (5,0 mL) e THF (1,0 mL) . A mistura reaccional foi desgaseifiçada com azoto durante 10 min. Adicionou-se então (±)-2,2'-bis(difenilfosfino)-1, 1'-binaftaleno (19,95 mg, 0,032 mmol) e acetato de paládio(II) (3,60 mg, 0,016 mmol) numa quantidade mínima de 1,4-dioxano. O tubo foi selado e a mistura reaccional foi aquecida num forno de microondas de 160°C durante 40 min. A suspensão resultante foi arrefecida até à temperatura ambiente e filtrada através de celite. 0 filtrado foi evaporado até à secura e a mistura reaccional em bruto foi purificada por HPLC de fase inversa para dar o composto em epígrafe como um sólido (16 mg, rendimento de 24%) MS: M(Ci9H2iClN602) = 400, 86, (M+H)+ = 401; ΧΗ NMR (400 MHz,
MeOD) δ ppm 7,92 (s, 1H), 7,44-7,66 (m, 3H), 7,11-7,25 (m, 1H) , 6,61 (s, 1H) 5,99 (s, 1H) 3,98 (q, J = 7,3 Hz, 2H) , 3,80 (s, 3H), 2,21 (s, 3H), 1,32 (t, J = 7,2 Hz, 3H).
Exemplo la 2- [ (5-Cloro-2-{ [3-metil-l- (1-metiletil) -l-H-pirazol-5-il]amino}-4-piridinil)amino]-N- (metiloxi)benzamida
Um tubo de micro-ondas foi carregado com ΙΕ (2,5-dicloro-4-piridinil)amino]-N- (metiloxi)benzamida (70 mg, 0,224 mmol), {3-metil-l-(1-metiletil)-lH-pirazol-5-ami- na (70 mg, 0,503 mmol) e carbonato de césio (230 mg, 0,706 mmol) . A mistura reaccional foi desgaseifiçada com azoto durante 10 min. Ao mesmo tempo, adicionou-se BINAP (50 mg, 0,080 mmol) e acetato de paládio(II) (10 mg, 0,045 mmol). A mistura reaccional foi aquecida num micro-ondas a 160°C durante 40 min. O material em bruto foi purificado por HPLC de fase inversa (Gilson), eluindo com CH3CN/H2O com 0,1% de ácido fórmico que deu o composto em epígrafe (15 mg, 15%); MS: M (C20H23CIN6O2) = 414,89, (M+H)+ = 415, 416; ΧΗ RMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO-d) δ ppm 9,42 (br s, 1H), 8,71 (br s, 1H), 8,02 (s, 1H) , 7,54 (br s, 1H) 7,06 (t, J = 7,5 Hz, 1H) 6,48 (s, 1H) , 6,32 (br s, 1H) , 5,86 (s, 1H) 4,47 (dt, J = 13,4, 6,7 Hz, 1H) 3,92 (s, 3H) , 2,26 (s, 3H) 1,41-1,43 (d, J = 6,6 Hz, 2H) .
Intermediário 2 2 - [ (2,5-Dicloro-4-piridinil)amino]benzonitrilo
A solução de 2,5-dicloro-4-iodopiridina (100 g, 365 mmol), 2-aminobenzonitrilo (43,1 g, 365 mmol) e trifosfato de potássio (233 g, 1,095 mmol) em 1,4-dioxano (2,5 L) foi desgaseifiçado por uma corrente de N2. A esta solução adicionou-se DPEphos (15,73 g, 29,2 mmol) e acetato de paládio (3,28 g, 14,60 mmol). A mistura reaccional foi agitada a refluxo durante 18 horas. A solução foi filtrada através de 0,5 polegadas de Celite e 0,2 polegadas de sílica. A solução foi evaporada. O sólido foi suspenso em éter dietílico e filtrado. O éter dietílico foi concentrado e o sólido resultante foi filtrado. Isolou-se 2— [(2,5 — dicloro-4-piridinil)amino]benzonitrilo (80 g, 288 mmol, 79% de rendimento) como um sólido cor de laranja. 1H NMR (400 MHz, DMSO-cU) δ ppm 6,49 (s, 1H) 7,50 (td, J = 7,58, 1,01
Hz, 1H) 7,56 (d, J = 7,58 Hz, 1H) 7,80 (td, J = 7,83, 1,77
Hz, 1H) 7,95 (dd, J = 7,83, 1,52 Hz, 1H) 8,26 (s, 1H) 9,05 (br s, 1H) ; HPLC Rt = 2,88 min, MS (ESI): 263, 9, 265,9 [M+H]+.
Intermediário 3 2- [ (5-Cloro-2-{ [3-metil-l- (1-metiletil) -lff-pirazol-5-il]amino}-4-piridinil)amino]benzonitrilo
A solução de 2-[(2,5-dicloro-4-piridinil)amino]-benzonitrilo (110 g, 396 mmol), 3-metil-l-(1-metiletil)-1H-pirazol-5-amina (55,1 g, 396 mmol) e carbonato de césio (387 g, 1,187 mmol) em 1,4-dioxano (2,5 L) foi desgaseificada por uma corrente de N2, e adicionou-se 2,2'— bis(difenilfosfino)-1,1'-binaftilo (BINAP) (19,71 g, 31,7 mmol) seguido por acetato de paládio (3,55 g, 15,83 mmol). A mistura reaccional foi aquecida a refluxo de um dia para o outro sob N2. A mistura reaccional foi filtrada e o liquido foi concentrado. Adicionou-se acetato de etilo (1500 mL) seguido por HC1 1 M (1000 mL) . As camadas foram separadas. O acetato de etilo foi lavado com HC1 1 M até não ser observado produto por HPLC (1000 mL no total, 1 x).
As fases de HC1 foram combinados e lavadas com acetato de etilo (3 x 1000 mL) , até que o pico do produto estivesse relativamente puro na camada de HC1. A camada de HC1 foi então basificada com NaOH (50 p/p seguido por 1 M) até pH 4 resultando numa solução turva. Adicionou-se acetato de etilo (2000 mL) e as camadas foram separadas. O acetato de etilo foi lavado com solução aquosa saturada de cloreto de sódio e evaporado. Após neutralização - a seguir à adição de acetato de etilo - a mistura reaccional foi filtrada para se obter algum produto. O isolamento do produto durante a evaporação também pode ser realizado por filtração de sólido branco, que provém das águas mães. Todos os sólidos e produtos evaporados foram combinados. Isolou-se 2- [ (5-cloro-2-{ [3-metil-l- (1-metiletil) -liH-pira-zol-5-il]amino}-4-piridinil) amino]benzonitrilo (80 g, 207 mmol, 52,4 % de rendimento) como um sólido amarelo. 1H NMR (400 MHz, DMSO-de) δ ppm 1,24 (d, J = 6,57 Hz, 6H) 2,08 (s, 3H) , 4,34 (quin, J = 6,57 Hz, 1H) 5,87 (s, 1H) , 5,97 (s, 1H) 7,41 (td, J = 7,58, 1,01 Hz, 1H) 7,47 (d, J = 8,08 Hz, 1H) 7,75 (td, J = 7,83, 1,52 Hz, 1H) 7,90 (dd, J = 7,83,
1,52 Hz, 1H) 7,94 (s, 1H) 8,42 (d, J = 17,43 Hz, 2H); HPLC
Rt = 2,36 min, MS (ESI): [M+H]+ = 367,1, 368,1.
Intermediário 4 Ácido 2-[ (5-cloro-2-{ [3-metil-l-(1-metiletil)-lA-pirazol-5-il]-amino}-4-piridinil)amino]benzóico
2- [ (5-Cloro-2-{ [3-metil-l- (1-metiletil) -lH-pira-zol-5-il]amino}-4-piridinil) amino]benzonitrilo (80 g, 218 mmol) foi dissolvido em 1,4-dioxano (1,5 L) e adicionou-se NaOH 1 M (1,500 mL, 1,500 mmol). A suspensão foi aquecida a refluxo de um dia para o outro. Após arrefecimento até à temperatura ambiente, adicionou-se acetato de etilo (1 L) e as camadas foram separadas. A camada aquosa foi lavada com 1 L de acetato de etilo. Ambas as camadas orgânicas foram combinaas e lavadas com NaOH 0,1 Μ (1 L) até não ser observado nenhum produto na fase orgânica. Os extractos orgânicos foram depois descartados. As fases aquosas combinadas foram depois lavadas com 1 L de acetato de etilo. A camada aquosa foi depois acidificada com ácido acético (muito lentamente até pH ~7). O sólido foi filtrado e isolou-se ácido 2-[(5-cloro-2-{[3-metil-l-(1-metiletil)-lA-pirazol-5-il]-amino}-4-piridinil)amino]benzóico (67 g, 165 mmol, 76% de rendimento) como um sólido amarelo. 1H NMR (400 MHz, DMSO-de) δ ppm 1,28 (d, J = 6,57 Hz, 6H) 2,11 (s, 3H) , 4,41 (quin, J = 6,57 Hz, 1H) 5,96 (s, 1H) , 6,83 (s, 1H) 7,09 (ddd, J = 8, 02, 5, 12, 3, 03 Hz, 1H) , 7,40 (1H), 7,52-7,61 (m, 2H) , 7,91-8,16 (m, 2H) , 8,55 (s, 1H) 10,17 (br s, 1H) 13,64 (br s, 1H); HPLC Rt = 2,35 min, MS (ESI): [M+H]+ = 386,1.
Exemplo lb 2- [ (5-Cloro-2-{ [3-metil-l- (1-metiletil) -lil-pirazol-5-il]amino}-4-piridinil)amino]-N- (metiloxi)benzamida
A uma solução de ácido 2-[ (5-cloro-2-{ [3-metil-l-(1-metiletil)-lH-pirazol-5-il]amino}-4-piridinil)amino]-benzóico (67 g , 174 mmol) e 1-hidroxibenzotriazole (29,3 g, 191 mmol) em N,N-dimetilformamida (700 mL) adicionou-se cloridrato de N-(3-dimetilaminopropil)-N'-etilcarbodiimida (36, 6 g, 191 mmol) e a solução foi agitada durante 30 minutos. Adicionou-se cloridrato de O-metil-hidroxilamina (15,95 g, 191 mmol) e a solução foi agitada durante 15
minutos adicionais, arrefecida até 0°C e adicionou-se diisopropiletilamina (91 mL, 521 mmol) gota a gota. A mistura reaccional foi agitada de um dia para o outro à temperatura ambiente. Adicionou-se água (4000 mL) e a solução foi acidificada com ácido acético (20 mL). A solução foi extraída com 2 x 2 L de acetato de etilo. A fase orgânica foi lavada com água (1 L) , solução aguosa saturada de cloreto de sódio e seca sobre MgSCb, filtrada e evaporada. Isolou-se 2-[ (5-cloro-2-{ [3-metil-l-(1- metiletil)-lU-pirazol-5-il]amino}-4-piridinil)amino]-N-(metiloxi)benzamida (74 g, 164 mmol, 94% de rendimento, 92% puro) como uma espuma amarela. 1H NMR (400 MHz, DMSO-cU) δ ppm 1,27 (d, J = 6,57 Hz, 6H) 2,10 (s, 3H) , 3,71 (s, 3H) , 4,39 (quin, J = 6,51 Hz, 1H) 5,93 (s, 1H) 6,66 (s, 1H) , 7,08-7,19 (m, 1H) , 7,49-7, 64 (m, 3H) , 7,98 (s, 1H) , 8,50
(s, 1H) , 9,50 (s, 1H) 11,93 (s, 1H) ; HPLC Rt = 2,13 min, MS (ESI): [M+H]+ = 415,1.
Purificação dos produtos do Exemplo la e lb
Dissolveu-se 2- [ (5-cloro-2-{ [3-metil-l-(1-metil-etil) -lfí-pirazol-5-il] amino} - 4-piridinil) amino] -N- (metilo-xi)benzamida (173,3 g, 63,5% p/p, 265,2 mmoles) em acetato de etilo (3,50 L, 20 volumes) e aqueceu-se a cerca de 50°C. A esta solução foi adicionou-se Si-tiol (gel de sílica funcionalizado) (87 g, 50% de carga). A mistura foi mantida a cerca de 50°C durante 16-20 horas. Em seguida, separou-se o gel de sílica Si-tiol por filtração. O bolo de filtração foi lavado com acetato de etilo (2x200 mL de cada vez) e os filtrados foram combinados. Em seguida os filtrados combinados foram lavados com formato de amónio aquoso 1 M a pH 9,4 (5x1 L cada), lavados com água, solução aquosa saturada de cloreto de sódio e secos sobre sulfato de magnésio. 0 EtOAc seco foi filtrado e evaporado até à secura dando uma espuma amarela. Secou-se a 50-55°C durante cerca de 2 horas até um peso constante de 160 g. Este material foi suspenso em cloreto de metileno (800 mL, 5 volumes), aquecido a refluxo para dar uma solução e filtrado. A solução foi arrefecida a 20-25°C. O produto cristalizou por arrefecimento. Após cerca de 2 horas, o produto foi recolhido por filtração e lavado com cloreto de metileno. O sólido branco foi seco a 50-55°C durante 14-16 horas até um peso constante. Isolou-se 2-[ (5-cloro-2-{ [3-metil-1- (1-metiletil) -lA-pirazol-5-il ] amino }-4-piridinil) -amino]-N- (metiloxi)benzamida (85,0 g, 204, 9 mmoles, 77% de rendimento global) como um sólido branco. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 1,27 (d, J = 6,57 Hz, 6H) 2,10 (s, 3H) , 3,70 (s, 3H) , 4,39 (quin, J = 6,57 Hz, 1H) 5,92 (s, 1H) 6,66 (s, 1H) , 7,02-7,24 (m, 1H) , 7,45-7, 68 (m, 3H) , 7,98 (s, 1H) , 8,48 (s, 1H), 9,49 (br s, 1H) 11,91 (s, 1H). C18 HPLC RT = 6,2 minutos (99,0% de pureza). MS (ESI): 415,0 [M+H]+.
Suspendeu-se 2- [ (5-cloro-2-{ [3-metil-l-(1-metiletil) -líí-pirazol-5-il] amino} - 4-piridinil) amino] -N- (metilo-xi)benzamida (235,2 g de peso total, teor doseado de 228,0 g, 549,5 mmoles) em acetato de etilo (7,1 L, 30 volumes). A mistura foi aquecida a cerca de 50-55°C para se obter uma solução turva. A solução turva foi filtrada. À solução filtrada adicionou-se HC1 2,0 M em éter dietílico (210 g, 281 mL, 1,02 equiv.) ao longo de 15-20 minutos. Por adição de HC1 observou-se uma suspensão branca. Agitou-se à temperatura ambiente durante cerca de 16-20 horas. O produto foi recolhido por filtração e lavado com acetato de etilo (2 x 500 mL cada) . O bolo húmido foi seco a 50-55°C/<5 mm Hg durante 16-20 horas até um peso constante. Isolou-se 2- [ (5-cloro-2-{ [3-metil-l- (1-metiletil) -líí-pira-zol-5-il]amino}-4-piridinil)amino]-N- (metiloxi)-benzamida, monocloridrato, (245,9 g, 544,7 mmoles, 96% de rendimento) como um sólido branco. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 1,32 (d, J = 6,57 Hz, 6H) 2,18 (s, 3H) , 3,70 (s, 3H) , 4,35-4,62 (m, 1H) , 6,12 (br s, 1H ) 6,60 (br s, 1H) , 7,19-7,41 (m, 1H) , 7,48-7,75 (m, 3H) , 8,09 (s, 1H) , 9,59-9, 99 (m, 2H) 11,98 (br s, 1H) . C18 HPLC RT = 6,1 minutos (99,6% de pureza). MS (ESI): 414,8 [M+H]+.
Lisboa, 28 de maio de 2015

Claims (15)

  1. REIVINDICAÇÕES 1. 2-[(5-Cloro-2-{[3-metil-l-(1-metiletil))-1H-pirazol-5-il]amino}-4-piridinil)amino]-N- (metiloxi)-benzamida, que é um composto de fórmula (Ia)
    ou um seu sal.
  2. 2. Sal farmaceuticamente aceitável do composto de fórmula (Ia) tal como definido na reivindicação 1.
  3. 3. Composto de fórmula (Ia) tal como definido na reivindicação 1.
  4. 4. Sal monocloridrato do composto de fórmula (Ia) tal como definido na reivindicação 1.
  5. 5. Composição farmacêutica compreendendo um composto de fórmula (Ia) ou um seu sal farmaceuticamente aceitável tal como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1 a 4 e um excipiente farmaceuticamente aceitável.
  6. 6. Composto de fórmula (Ia) ou um seu sal far-maceuticamente aceitável tal como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1 a 4 para utilização em terapêutica .
  7. 7. Composto de fórmula (Ia) ou um seu sal far-maceuticamente aceitável tal como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1 a 4 para utilização no tratamento de cancro.
  8. 8. Utilização de um composto de fórmula (Ia) ou um seu sal farmaceuticamente aceitável tal como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1 a 4 na preparação de um medicamento para utilização no tratamento de cancro.
  9. 9. Associação de (a) um composto de fórmula (Ia) ou um seu sal f armaceuticamente aceitável tal como reivindicado em qualquer uma das reivindicações das reivindicações 1 a 4 e (b) pelo menos um aqente antineoplásico.
  10. 10. Associação de acordo com a reivindicação 9, em que o agente antineoplásico é um inibidor de seri-na/treonina quinases.
  11. 11. Associação tal como reivindicada na reivindicação 9 ou a reivindicação 10 para utilização no tratamento de cancro.
  12. 12. Utilização de uma associação tal como reivindicada reivindicação na 9 ou na reivindicação 10 na preparação de um medicamento para utilização no tratamento de cancro.
  13. 13. Composto para utilização tal como reivindicada na reivindicação 7, ou associação para utilização tal como reivindicada na reivindicação 11, ou utilização tal como reivindicada na reivindicação 8 ou a reivindicação 12, em que o cancro é mesotelioma.
  14. 14. Composto para utilização de acordo com a reivindicação 7, ou associação para utilização tal como reivindicada na reivindicação 11, ou utilização tal como reivindicada na reivindicação 8 ou a reivindicação 12, em que o cancro é cancro do ovário.
  15. 15. Composto para utilização tal como reivindicado na reivindicação 7, ou associação para utilização tal como reivindicada na reivindicação 11, ou utilização tal como reivindicada na reivindicação 8 ou a reivindicação 12, em que o cancro é glioblastoma multiforme. Lisboa, 28 de maio de 2015 REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO Esta lista de referências citadas pelo requerente é apenas para conveniência do leitor. A mesma não faz parte do documento da patente europeia. Ainda que tenha sido tomado o devido cuidado ao compilar as referências, podem não estar excluídos erros ou omissões e o IEP declina quaisquer responsabilidades a esse respeito. Documentos de patentes citadas na Descrição - WO 2008115369 A Literatura que não é de patentes citada na Descrição * aí àísí fiV-fv C&fiSKA :¾¾.¾. yíS. S. * Csiso-ftf .sjyS Afscibí.s of Oswsogy. 4 Wffiiífis Psjs^fiíírc 15 Γ eam»r/ 2G0t * OVVÊRO <s1 ai, Gsííí.w fisswffi. 1395. voí. 53. Í738-27S& » WAfíí eí ai.J AitK Çtttim 3®\, 1371. vol 93 2¾.¾ * ÁéoeHsrA eí íís soss. wí % S64«vS8í>S SCMffF st aí, í-v&í, 3½¾ Acasí Scí UBA ΊΜΜ3 voi - GA£á!*RO^£CKO et ai Cansei Εΰν 77, 1361-1663 3033 yoí 783 339-374 * ΐ 2?? 633-697 - mcnm et sf. cs#w íítfx^íoíi. aw. p. > kumar.-/ wt vet.^e í&í^iw) 'Í13Í0.19? * 7HACi; SSJAíí *?*¥. ííKíS v>7 ' $^>^‘0 0, G-S.MNOSTGN ei : m :$í>yííi *r n«w ttew* *t#>m p«í>«4«8 CA«?ais&y *9&ο * SRfS£U43RA?<OVSKY ei aí. wí j 2003. EílAVteí 1f-s3i\ 7í4 2t>. 213-233 «*. i 1 3. 378-376 * ttARKMAN «t *i. Ym Joums «tf Btoto&y »n«f m& * 7HAO ; ΦΙΛΗ. CSfwer M&iastasY te, 2009, vísi. *sí>'í«S. 19!>t, w.3 M, 583 2«, 35-49 * MCGCíRÊ St ai, -Ti" í*»fSf« Ktsé.Vm lit, * SEVSeUAeiai&i.Vs.^C Wm.v& 375,291-319 ®75: * HOLMES- «t aí, 3 ítfat Çaaw 1991, s«í, 53. ·* SMfFH et *1, Mfitetxxrui ffe*, S905, *>! 15. 357-382 47W * ÍHNZSG, pf>x- ê/n S-:x Gkr· Orwí, vcm CO, 46 * HAÍ,GE9 «t aí CA Γ«ΐ,·,ΐ.ί *« ,Y65 VT i; S02&3836 * FORASTS8E. &,«>·; Ofissi, 1220, wi, 20, 56 * tli *1 aí, Cí5í? SffiWfíi a>-.i Dip 1ã%. vol 7. 413-4 56 - WOG. ftíafcff® 19S>4. V& HA. 750 * tôttòfF. R,j, Ganc-ts? Cte&K-iPAiap* Pock&t Gvxíí· , > YAH ««SWtô^í »t at. Gmmr »es. 203&. vei 55 1« 46l3£M70S * KêáRMS, C.M. SmiSnsin in Ow$ote$ff. it95. Asl 1 * »ITRA «í ai, OSíC'feH-M* 2034 νϊχ í,\ 4429-4440 {Sí, 10-23 * HONMA T et ai J mi. Cftt-m, 3002 vc-5 44 ;2&í * StíTKA aí «f, 2<XJS; voí 73, 3363-3334 4383-4343 * AOACHt, í aí í(5 Cíivimcfif 0 P(iava»:A:-iPcii BuM» m. 1987, «3. 35 {8K 3835-38
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