PT2414333E - Reagentes e métodos de radiomarcação - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "REAGENTES E MÉTODOS DE RADIOMARCAÇÃO" A presente invenção refere-se a reagentes e métodos para a fluoração com [18F] de biomoléculas, em particular de péptidos. Os compostos marcados com F resultantes sao uteis como radiofármacos, especialmente para utilização em Tomografia por Emissão de Positrões (PET). A aplicação de péptidos bioactivos radiomarcados para diagnóstico por imagiologia está a ganhar importância na medicina nuclear. As moléculas biologicamente activas que interagem selectivamente com tipos de células específicos são úteis para a administração de radioactividade a tecidos-alvo. Por exemplo, os péptidos radiomarcados têm um potencial significativo para a administração de radionuclídeos a tumores, enfartes e tecidos infectados para diagnóstico de imagiologia e radioterapia. 0 18F, com a sua semi-vida de 110 minutos, é o nuclídeo emissor de positrões de eleição para vários estudos de imagiologia de receptor. Assim, os péptidos bioactivos marcados com 18F têm um grande potencial clínico devido à sua utilidade em PET para detectar e caracterizar quantitativamente uma grande variedade de doenças.

Uma dificuldade com a preparação de péptidos marcados com 18F é que os reagentes marcadores com 18F existentes são morosos de se prepararem. A marcação eficiente de péptidos e proteínas com 18F só é conseguida por utilização de grupos prostéticos adequados. Vários destes grupos prostéticos têm sido propostos 1 na literatura, incluindo o N-succinimidil-4-[ 18F]fluorobenzoato, m-maleimido-N-(p-[18F]fluorobenzil)-benzamida, N-(p- [18F] f luorofenil) maleimida e brometo de 4-[18F] f luorofenacilo . Quase todas as metodologias utilizadas correntemente para a marcação de péptidos e proteínas com 18F utilizam ésteres activos. 0 reagente marcador com 18F utilizado de forma mais comum é o N-succinimidil-4-[ 1SF]fluorobenzoato (SFB). 0 SFB tem a desvantagem de ser necessário 3 passos sintéticos para preparar (fluoração, hidrólise e geração de éster activo), seguido de um passo de purificação por HPLC moroso, assim, a preparação de SFB é difícil de automatizar. Além disso, a presença do anel fenilo no reagente de marcação aumenta significativamente a hidrofobicidade do produto marcado com 18F, o que pode afectar de um modo negativo o seu perfil de biodistribuição. Assim, ainda existe uma necessidade de reagentes de marcação com 18F e metodologias alternativas que permitam a rápida introdução quimiosselectiva de 18F, em particular em péptidos, em condições suaves, para dar produtos marcados com 18F. Além disso, existe uma necessidade de tais metodologias que sejam passíveis de automatização para facilitar a preparação de radiofármacos no ambiente clínico. 0 documento WO2004/002984 divulga derivados de maleimida marcados com 18F e a sua utilização para marcar macromoléculas.

De acordo com um primeiro aspecto da invenção, é proporcionado um composto de fórmula (I):

2 1 ο , ~

Num aspecto, ο marcador F esta ligado em posição orto relativamente ao azoto piridilo, de tal modo que o composto de fórmula (I) tem a fórmula (Ia):

Os compostos de fórmula (I) e (Ia) devem acrescentar vantagens significativas para a marcação com 18F de biomoléculas. Ί o

Os compostos de fórmula (I) e (Ia) podem ser marcados com F num único passo, a marcação é rápida próximo da temperatura ambiente, a purificação pode ser realizada com um sistema com base num cartucho (por exemplo, coluna Oásis MCX), o que torna a automatização mais fácil. Igualmente, o sistema piridina é conhecido por ser mais hidrófilo do que o análogo benzilo e espera-se, por conseguinte, que acrescente um impacto positivo no perfil de biodistribuição do produto 18F. Como demonstrado a seguir, o éster tetrafluorofenilico foi considerado mais estável 1 o , , durante a marcação com F do que outros esteres activos.

Os compostos de fórmula (I) e (Ia) podem ser preparados a partir do composto correspondente de fórmula (II):

(II) ou um seu sal, em que L é um grupo abandonante seleccionado de cloro, bromo, iodo, nitro e tri(alquilCi_6)amónio (adequadamente 3 trimetilamónio). Tais compostos de fórmula (II) sao novos e, assim, formam um outro aspecto da invenção.

Num aspecto, L no composto de fórmula (II) é tri(alquilCi-6)amónio (adequadamente trimetilamónio), com um contra-ião adequado seleccionado dos que derivam de ácidos minerais, por exemplo, ácidos clorídrico, bromídrico, fosfórico, metafosfórico, ácido perclórico, nítrico e sulfúrico, e dos que derivam de ácidos orqânicos, por exemplo, ácidos tartárico, trifluoroacético, cítrico, málico, láctico, fumárico, benzóico, glicólico, glucónico, succínico, metanossulfónico, trifluorometanossulfónico e para-toluenossulfónico; adequadamente seleccionados de cloreto, brometo, perclorato, sulfonato, nitrato, fosfato e trifluorometanossulfonato, de um modo mais adequado, com um contra-ião trifluorometanossulfonato.

Num aspecto, o composto de fórmula (II) é:

em que X- é um contra-iao como definido acima e é, de um modo preferido, trifluorometanossulfonato. A preparação de um composto de fórmula (I) a partir do composto correspondente de fórmula (II), ou um seu sal, pode ser realizada por métodos padrão de marcação com 18F. 0 [18F] fluoreto e convenientemente preparado a partir de agua enriquecida com 0 utilizando a reacção nuclear (p,n), (Guillaume et al, Appl. Radiat. Isot. 42 (1991) 749-762) e geralmente isolado como um 4 sal, tal como Na18F, K18F, Cs18F, [18F] f luoreto de tetraalquilamónio ou [ 18F]fluoreto de tetraalquilfosfónio. Para aumentar a reactividade do [ 18F]fluoreto, pode ser adicionado um catalisador de transferência de fase, tal como um aminopoliéter ou éter coroa, por exemplo, 4,7,13,16,21,24hexaoxa-l,10-diazabiciclo[8,8,8]hexacosano (Kryptofix 2.2.2) e a reacção realizada num solvente adequado. Estas condições dão iões fluoreto reactivos. Opcionalmente, uma armadilha de radicais livres pode ser utilizada para melhorar os rendimentos de fluoração, como descrito no documento W02005/061415. 0 termo "armadilha de radicais livres" é definido como qualquer aqente que interage com radicais livres e inactiva-os. Uma armadilha de radicais livres adequada para este fim pode ser seleccionada de 2,2,6,6-Tetrametilpiperidina-N-óxido (TEMPO), 1,2-difeniletileno (DPE), ascorbato, ácido para-aminobenzóico (PABA), α-tocoferol, hidroquinona, di-t-butilfenol, β-caroteno e ácido gentísico. 0 tratamento de um composto de fórmula (II) com [ F]fluoreto pode ser realizado na presença de um solvente orgânico adequado, tais como acetonitrilo, dimetilformamida, sulfóxido de dimetilo, dimetilacetamida, tetra-hidrofurano, dioxano, 1,2-dimetoxietano, sulfolano, N-metilpirolidininona ou num liquido iónico, tais como um derivado de imidazólio (por exemplo, hexafluorofosfato de 1-etil-3-metilimidazólio), um derivado de piridínio (por exemplo, tetrafluoroborato de l-butil-4-metilpiridínio), um composto fosfónio ou composto tetralquilamónio, a uma temperatura não extrema, por exemplo, 15 °C a 50 °C, de um modo preferido, a cerca da temperatura ambiente, tal como 15 °C a 30 °C, por exemplo, 18 °C a 25 °C.

Os compostos de fórmula (II) e seus sais podem ser preparados a partir de materiais de partida comercialmente 5 disponíveis, tal como ácido 6-cloro-nicotínico. Os rendimentos para o processo global são bons (> 50%) . Os passos incluem esterificação com tetrafluorofenol activado, por exemplo, por diciclo-hexilcarbodiimida (DCC), geração do sal de trimetilamónio por tratamento do éster do ácido 6-cloro-nicotínico activo com uma solução saturada de trimetilamina em tetra-hidrofurano (THF), e geração do sal de trifluorometanossulfonato (triflato) com triflato de prata.

Após a preparação de um composto de fórmula (I), ele pode ser purificado por métodos padrão, tipicamente utilizando extracção em fase sólida, por exemplo, com uma coluna Oásis MCX™, a partir da qual o composto de fórmula (I) pode ser eluído com boa pureza utilizando uma mistura adequada de solvente orgânico/água.

De acordo com um outro aspecto da invenção, é proporcionado um método para fluoração com 18F compreendendo a reacção de um composto de fórmula (I) com um composto de fórmula (III) :

(l) biomolécula H2N— 1 s , para dar um produto F de formula (IV)

6 A reacção de um composto de fórmula (I) com um composto de fórmula (III) pode ser realizada num solvente adequado, por exemplo, num tampão aquoso na gama de pH 2 a 11, adequadamente 3 a 11, e a uma temperatura não extrema de desde 5 até 70 °C, de um modo preferido, à temperatura ambiente.

As biomoléculas adequadas de fórmulas (III) e (IV) para marcação são péptidos, os quais podem incluir análogos de somatostatina, tais como octreotida, bombesina, péptido intestinal vasoactivo, análogos de péptido quimiotáctico, hormona que estimula o α-melanócito, neurotensina, péptido Arg-Gly-Asp e seus análogos, péptido de conexão da pró-insulina humana, endotelina, angiotensina e formil-norleucil-leucil-fenilalanil-norleucil-tirosil-lisina. Os péptidos preferidos para marcação são péptido Arg-Gly-Asp e seus análogos, tais como os descritos nos documentos WOOl/77415 e W003/006491. Os péptidos preferidos compreendem o fragmento:

Num aspecto particular, a biomolécula na fórmula (III) ou (IV) é um péptido de fórmula (A): 7 s

em que a é um inteiro de 1 a 10, de um modo preferido, a é 1.

Tal como será entendido pelo especialista na técnica, os métodos da invenção também podem ser utilizados para a fluoração com 18F de outras biomoléculas, tais como proteínas, hormonas, oligonucleótidos e fragmentos de anticorpos, bem como pequenas moléculas do tipo fármaco para proporcionar uma variedade de marcadores de PET.

Os compostos de fórmula (III) podem ser preparados por métodos padrão de síntese peptídica, por exemplo, síntese de peptídica em fase sólida, por exemplo, como descrito em Atherton, E. e Sheppard, R.C.; "Solid Phase Synthesis"; IRL Press: Oxford, 1989. A incorporação do grupo amina primária num composto de fórmula (III) pode ser realizada por reacção do N ou C-terminal do péptido ou com algum outro grupo funcional contido na sequência peptídica, modificação que não afecta as características de ligação do vector. O grupo amina primária é introduzido, de um modo preferido, pela formação de uma ligação amida estável formada por reacção de uma função amina peptidica com um ácido activado e introduzido durante ou após a síntese peptidica. Quando o precursor é um ácido, então a amina primária pode ser introduzida utilizando agentes activadores in situ, tais como hexafluorofosfato de 2-(lH-benzotriazol-l-il)-1,1,3,3-tetrametilurónio (HBTU) ou hexafluorofosfato de N-[(dimetilamino)-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]piridin-l-ilmetileno]-N-metilmetanamínio N-óxido (HATU). A invenção será agora ilustrada apenas como exemplo.

EXEMPLOS

Exemplo 1. Síntese de Éster 2,3,5,6-tetrafluoro-fenílico do ácido 6-fluoro-nicotínico

0 éster 2,3,5,6-tetrafluorofenol (Tfp) activo do ácido 2-trimetilamónio-nicotínico foi sintetizado em três passos a partir de ácido 6-cloro-nicotínico (Sigma-Aldrich). A esterificação de ácido 6-cloro-nicotínico (3 g, 19 mmol) com 2,3,5,6-tetrafluorofenol (3,25 mg, 19 mmol)) activado por diciclo-hexilcarbodiimida (DCC) (3,96, 19 mmol) em 50 mL de dioxano seguido de cristalização em hexano deu o éster tfp do 9 ácido β-cloro-nicotínico com rendimento de 73%. A geração do sal de trimetilamónio por tratamento do éster tfp do ácido β-cloro-nicotínico activo (1 g, 3,27 mmol) numa solução saturada de trimetilamina (borbulhar contínuo durante duas horas) em tetra-hidrofurano (THF) (15 mL) deu o sal de trimetilamónio com cloreto como contra-ião com rendimento de 45%. 0 material que não reagiu pode ser removido por filtração uma vez que o sal precipita da solução de tetra-hidrofurano. A geração do sal triflato pode ser realizada de duas maneiras; por tratamento do sal cloreto correspondente com triflato de prata, em excesso molar de 1,2, em acetonitrilo ou por tratamento com trifluorometanossulfonato de trimetilsililo. 0 último é a escolha preferida uma vez que o tratamento da reacção é mais simples e não é necessária cromatografia preparativa. Ambos os métodos são praticamente quantitativos.

Cl'

N o

OH Tfp-OH, DCC

Dioxano, RT, de um dia para o outro

THF, RT, 2 horas Trimetilamina (gás)

Trifluorometanossulfonato de prata em acetonitrilo ou trifluorometanossulfonato

0 precursor sintetizado (9,2 mg) foi inicialmente marcado com 19F por meio de K222 (10 mg) e KF (1,1 mg) em acetonitrilo 10 (0,7 mL) . A reacção de 19F com o éster Tfp foi estudada utilizando RMN de 9Η em acetonitrilo-d6 a 27 °C para analisar as cinéticas reaccionais e as impurezas formadas.

Exemplo Comparativo O éster de IV-hidroxissuccinimida (NHS) do ácido 2-trimetilamónio-nicotinico foi sintetizado a partir de ácido 6-cloro-nicotinico e marcado com 19F por analogia aos métodos acima. RESULTADOS:

Ambos os ésteres foram sintetizados com bons rendimentos (> 30% a partir do ácido 6-cloro-nicotínico) e reagiram prontamente com fluoreto em acetonitrilo à temperatura ambiente. O éster NHS foi mais propenso a hidrólise do que o éster Tpf e, assim, não foi mais avaliado. Os estudos da reacção de éster Tfp por RMN de ΤΗ durante 30 minutos mostrou a incorporação rápida de fluoreto à temperatura ambiente, após 2,5 minutos 32% do material de partida foi convertido no produto fluorado desejado. Num conjunto de experiências, 70% do produto fluorado foi obtido em menos de 20 minutos. Dois derivados de ácido nicotinico foram identificados como produtos secundários juntamente com o produto desejado. 11

Exemplo 2; Reacçao de Éster 2,3,5,6-tetrafluoro-fenílico do ácido 6-fluoro-nicotínico com péptido RGD funcionalizado A reacção do produto fluorado do Exemplo 1 (1 mg) com um péptido RGD adequadamente funcionalizado (5 mg, preparado como descrito nos documentos WO 01/77415 e WO 03/006491) numa solução 1:1 de acetonitrilo fosfato de sódio 0,1 M, pH 9 (total de 3 mL) deu o produto desejado como analisado por LC-MS. Condições de LC-MS: Phenomenex Luna C18(2) 3 μ 2 x 50 mm, fase móvel A; Água/ácido trifluoroacético (TFA) a 0,1%, fase móvel B:

Acetonitrilo/TFA a 0,1%, fluxo de 0,6 mL/min, 10-30% de B durante 5 min. Tempo de retenção (Rt) = 3,42 minutos, M+H+ (esperado 1381,5, encontrado 1381,6).

12

Exemplo 3: Radiossíntese de Éster 2,3,5,6-tetrafluoro-fenílico do ácido 6-[ 18F]fluoro-nicotínico

1 R · O [ FJfluoreto aquoso (ate 150 MBq) foi seco de um modo azeotrópico na presença de 15 mg de Krytptofix 222 e 3 mg de bicarbonato de potássio (KHCO3) aquecendo sob N2 a 100 °C durante 9 minutos. Durante este tempo 2 x 1 mL de acetonitrilo foram adicionados e evaporados. Após arrefecimento a 40 °C, foi adicionada uma solução de metanossulfonato de trimetil-[5-(2,3,5,6-tetrafluoro-fenoxicarbonil)-piridin-2-il]-amónio (7 mg em 1 mL de acetonitrilo). O vaso reaccional foi aquecido a 40 °C durante 10 minutos para efectuar a marcação. A mistura reaccional em bruto foi submetida a radio-HPLC (cromatografia líquida de elevado dsempenho performance) e radio-TLC (cromatografia em camada fina) com a co-injecção com o padrão de referência frio para confirmar a geração do composto 18F alvo. Os rendimentos de incorporação foram tipicamente entre 50-80%, como analisado por radio-TLC (n = 3). Radio-TLC: Placas de sílica gel pré-revestidas 60 F254 (Merck), Gradiente de n-Hexano/Acetato de etilo 50:50. Foi utilizado o Instant Imager (Packard BioScience) para medir a distribuição radioactiva nas placas de TLC. Rf: 0,65.

Radio-HPLC: A radio-HPLC analítica foi realizada num sistema Agilent (série 1100) com detector de UV equipado em série com um detector γ (Bioscan flow-count). Coluna Phenomenex Luna C18(2) (150 x 4,6 mm, 5 μιη) , fluxo de 1,0 mL/min com 13 gradiente de 20-80% de B durante 20 min. (A detecção por UV a 214 e 254 nm foi combinada com um detector γ). Rt 14,4 min.

Purificação A mistura reaccional em bruto contendo Éster 2,3,5,6-tetrafluoro-fenilico do acido [ F]fluoro-nicotinico, em 2 mL de acetonitrilo, foi diluída para 30% de acetonitrilo com água destilada. A solução aquosa foi passada por um cartucho Oásis MCX Plus (acondicionado de acordo com as recomendações do fabricante) . O cartucho foi depois enxaguado com 5 mL de água destilada. O produto purificado foi depois eluído da coluna com 100% de acetonitrilo numa pureza radioquímica superior a 90%. Todos os restos de precursor não reagido metanossulfonato de trimetil-[5-(2,3,5,6-tetrafluoro-fenoxicarbonil)-piridin-2-il]-amónio permaneceram no cartucho.

Exemplo 4: Conjugação de Éster 2,3,5,6-tetrafluoro-fenilico do ácido 6-[ 18F]fluoro-nicotínico a um péptido RGD cíclico com funcionalidade amino livre

14 A uma solução do Éster 2,3,5,6-tetrafluoro-fenílico do ácido 6-[18F]fluoro-nicotínico purificado em 1,5 mL de solução 1:1 de acetonitrilo/água, foi adicionado 3 mg de péptido RGD adequadamente funcionalizado (Mw: 1258,47) dissolvidos em 1 mL de solução 1:1 de acetonitrilo e NaHP04 a 0,1 Μ. A mistura resultante com um pH de 9 foi aquecida a 40 °C. Após 30 minutos, uma pequena aliquota da mistura foi analisada por radio-HPLC. O radiocromatograma mostrou conversão do produto desejado com mais de 65% de rendimento. O produto co-eluiu com o seu padrão de referência 19F.

Radio-HPLC: A radio-HPLC analítica foi realizada num sistema Agilent (série 1100) com detector de UV equipado em série com um detector γ (Bioscan flow-count). Coluna Phenomenex Luna C18(2) (150 x 4,6 mm, 5 pm) , fluxo de 1,0 mL/min com um gradiente de 0-40% de B durante 20 min. (A detecção por UV a 214 e 254 nm foi combinada com um detector γ). Rt 10,0 min.

Lisboa, 29 de Abril de 2013 15

Claims (10)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Composto de fórmula (I):

   (l)
2. 2. Composto de acordo com a reivindicação 1 de fórmula (Ia):
3. 3. Composto de fórmula (II):

   (II) ou um seu sal, em que L é um grupo abandonante seleccionado de cloro, bromo, iodo, nitro e tri(alquilCi-6)amónio (adequadamente trimetilamónio).
4. 4. Composto de fórmula (II) ou um seu sal de acordo com a reivindicação 3, em que L é tri (alquilCi-6) amónio (adequadamente trimetilamónio).
5. 5. Composto de fórmula (II) de acordo com a reivindicação 3 ou 4 que é:

   X- em que X- é um contra-ião e é, de um modo preferido, trifluorometanossulfonato.
6. 6. Método para a fluoração com 18F compreendendo a reacção de um composto de fórmula (I) ou (Ia), como definido na reivindicação 1 ou 2, com um composto de fórmula (III):

   18 para dar um produto F de formula (IV) :
7. 7. Método de acordo com a reivindicação 6, em que a biomolécula é um péptido. 2
8. 8. Método de acordo com a reivindicação 6 ou 7, em que a biomolécula é um péptido seleccionado de análogos de somatostatina, tais como octreotida, bombesina, péptido intestinal vasoactivo, análogos de péptido quimiotáctico, hormona que estimula o cx-melanócito, neurotensina, péptido Arg-Gly-Asp e seus análogos, péptido de conexão da pró-insulina humana, endotelina, angiotensina e formil-norleucil-leucil-fenilalanil-norleucil-tirosil-lisina.
9. 9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 8, em que a biomolécula compreende o fragmento:
10. 10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 9, em que a biomolécula é um péptido de fórmula (A):

    HN=( HN NH2 (A) 3 em que X7 é -NH2 ou NH„ em que a é um inteiro de desde 1 a 10, de um modo preferido, a é 1. Lisboa, 29 de Abril de 2013 4