JP2012522052A - 放射性標識試薬及び方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、生体分子、特にペプチドの［¹⁸Ｆ］フッ素化のための試薬及び方法に関する。こうして得られる¹⁸Ｆ標識化合物は、放射性医薬品として、具体的には陽電子放出断層撮影法（ＰＥＴ）で使用するための放射性医薬品として有用である。
【選択図】なし

Description

本発明は、生体分子、特にペプチドの［¹⁸Ｆ］フッ素化のための試薬及び方法に関する。こうして得られる¹⁸Ｆ標識化合物は、放射性医薬品として、具体的には陽電子放出断層撮影法（ＰＥＴ）で使用するための放射性医薬品として有用である。

放射性標識された生物活性ペプチドを診断イメージングのために応用することは、核医学において重要性を増しつつある。特定の細胞タイプと選択的に相互作用する生物学的活性分子は、標的組織に放射能を送達するために有用である。例えば、放射性標識ペプチドは、診断イメージング及び放射線療法のため、腫瘍、梗塞巣部及び感染組織に放射性核種を送達するための大きな潜在的可能性を有している。約１１０分の半減期を有する¹⁸Ｆは、多くのレセプターイメージング調査のために最適な陽電子放出核種である。したがって、¹⁸Ｆ標識された生物活性ペプチドは、多種多様の疾患を定量的に検出して特性決定するためにＰＥＴで利用できるので大きな臨床的可能性を有している。

¹⁸Ｆ標識ペプチドの製造に関する難点の１つは、既存の¹⁸Ｆ標識試薬が製造するのに多くの時間を要することである。¹⁸Ｆによるペプチド及びタンパク質の効率的な標識は、好適な補欠分子族を用いることでのみ達成される。文献中には、Ｎ−スクシンイミジル−４−［¹⁸Ｆ］フルオロベンゾエート、ｍ−マレイミド−Ｎ−（ｐ−［¹⁸Ｆ］フルオロベンジル）ベンズアミド、Ｎ−（ｐ−［¹⁸Ｆ］フルオロフェニル）マレイミド及び４−［¹⁸Ｆ］フルオロフェナシルブロミドを含む数種のかかる補欠分子族が提唱されている。¹⁸Ｆによるペプチド及びタンパク質の標識のために現在使用されている方法のほとんどすべてが、活性エステルを利用している。最も普通に使用されている¹⁸Ｆ標識試薬は、Ｎ−スクシンイミジル−４−［¹⁸Ｆ］フルオロベンゾエート（ＳＦＢ）である。ＳＦＢは、それを製造するために３つの合成段階（フッ素化、加水分解及び活性エステル生成）並びにそれに続いて時間のかかるＨＰＬＣ精製段階を必要とし、したがってＳＦＢの製造は自動化するのが難しいという欠点を有している。さらに、標識試薬中にフェニル環が存在することは、¹⁸Ｆ標識生成物に高い疎水性を付与し、これがその生体分布プロファイルに悪影響を及ぼすことがある。したがって、特にペプチド中に¹⁸Ｆを温和な条件下で迅速かつ化学選択的に導入して¹⁸Ｆ標識生成物を与えることができる代わりの¹⁸Ｆ標識試薬及び方法に対するニーズが依然として存在している。さらに、かかる方法であって、臨床現場での放射性医薬品の調製を容易にするための自動化に適した方法に対するニーズも存在している。

国際公開第２００４／００２９８４号パンフレット

本発明の第１の態様に従えば、次の式（Ｉ）の化合物が提供される。

一態様では、¹⁸Ｆラベルがピリジル窒素に対してオルト位に結合する結果、式（Ｉ）の化合物は次の式（Ｉａ）を有する。

式（Ｉ）及び式（Ｉａ）の化合物は、生体分子の¹⁸Ｆ標識に関して顕著な利点を付与するはずである。式（Ｉ）及び式（Ｉａ）の化合物は一段階で¹⁸Ｆ標識することができ、標識は室温付近で迅速であり、精製はカートリッジ式システム（例えば、Ｏａｓｉｓ ＭＣＸカラム）を用いて行うことができ、これは自動化を一層容易にする。また、ピリジン系はベンジル類似体より親水性であることが知られており、したがって¹⁸Ｆ−生成物の生体分布プロファイルに良い影響を与えることが期待される。下記に実証されるように、テトラフルオロフェニルエステルは¹⁸Ｆ標識中に他の活性エステルより安定であることが判明している。

式（Ｉ）及び式（Ｉａ）の化合物は、対応する次の式（ＩＩ）の化合物又はその塩から製造できる。

式中、Ｌはクロロ、ブロモ、ヨード、ニトロ及びトリ（Ｃ_1-6アルキル）アンモニウム（好適にはトリメチルアンモニウム）から選択される脱離基である。かかる式（ＩＩ）の化合物は新規であり、したがって本発明の追加の態様をなしている。

一態様では、式（ＩＩ）の化合物中のＬはトリ（Ｃ_1-6アルキル）アンモニウム（好適にはトリメチルアンモニウム）であり、鉱酸（例えば、塩酸、臭化水素酸、リン酸、メタリン酸、過塩素酸、硝酸及び硫酸）から導かれるもの並びに有機酸（例えば、酒石酸、トリフルオロ酢酸、クエン酸、リンゴ酸、乳酸、フマル酸、安息香酸、グリコール酸、グルコン酸、コハク酸、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸及びｐ−トルエンスルホン酸）から導かれるものから選択される適当な対イオンを伴っている。かかる対イオンは、好適には塩化物イオン、臭化物イオン、過塩素酸イオン、硫酸イオン、硝酸イオン、リン酸イオン及びトリフルオロメタンスルホン酸イオンから選択され、さらに好適にはトリフルオロメタンスルホン酸イオンである。

一態様では、式（ＩＩ）の化合物は次式の化合物である。

式中、Ｘ^-は上記に定義したような対イオンであり、好ましくはトリフルオロメタンスルホン酸イオンである。

対応する式（ＩＩ）の化合物又はその塩から式（Ｉ）の化合物を製造するのは、標準的な¹⁸Ｆ標識方法によって行うことができる。［¹⁸Ｆ］フッ化物イオンは、簡便には（ｐ，ｎ）核反応を用いて¹⁸Ｏ濃縮水から製造され（Ｇｕｉｌｌａｕｍｅ ｅｔ ａｌ，Ａｐｐｌ．Ｒａｄｉａｔ．Ｉｓｏｔ．４２（１９９１）７４９−７６２）、一般にＮａ¹⁸Ｆ、Ｋ¹⁸Ｆ、Ｃｓ¹⁸Ｆ、［¹⁸Ｆ］フッ化テトラアルキルアンモニウム又は［¹⁸Ｆ］フッ化テトラアルキルホスホニウムのような塩として単離される。［¹⁸Ｆ］フッ化物イオンの反応性を高めるためには、アミノポリエーテル又はクラウンエーテル（例えば、４，７，１３，１６，２１，２４−ヘキサオキサ−１，１０−ジアザビシクロ［８．８．８］ヘキサコサン（Ｋｒｙｐｔｏｆｉｘ ２．２．２）のような相間移動触媒を添加し、適当な溶媒中で反応を実施すればよい。これらの条件は反応性のフッ化物イオンを与える。任意には、国際公開第２００５／０６１４１５号に記載されているように、フリーラジカル捕捉剤を用いてフッ素化収率を向上させることができる。「フリーラジカル捕捉剤」という用語は、フリーラジカルと相互作用してそれを不活性化する任意の薬剤として定義される。この目的のために好適なフリーラジカル捕捉剤は、２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−Ｎ−オキシド（ＴＥＭＰＯ）、１，２−ジフェニルエチレン（ＤＰＥ）、アスコルビン酸塩、パラアミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）、α−トコフェロール、ヒドロキノン、ジ−ｔ−ブチルフェノール、β−カロテン及びゲンチシン酸から選択できる。

［¹⁸Ｆ］フッ化物による式（ＩＩ）の化合物の処理は、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ジメチルアセトアミド、テトラヒドロフラン、ジオキサン、１，２−ジメトキシエタン、スルホラン又はＮ−メチルピロリジノンのような好適な有機溶媒或いはイミダゾリウム誘導体（例えば、１−エチル−３−メチルイミダゾリウムヘキサフルオロホスフェート）、ピリジニウム誘導体（例えば、１−ブチル−４−メチルピリジニウムテトラフルオロボレート）、ホスホニウム化合物又はテトラアルキルアンモニウム化合物のようなイオン性液体の存在下において、例えば１５〜５０℃の極端でない温度、好ましくは１５〜３０℃（例えば、約１８〜２５℃）のような周囲温度付近で行うことができる。

式（ＩＩ）の化合物及びその塩は、６−クロロニコチン酸のような商業的に入手できる出発原料から製造できる。プロセス全体に関する収率は良好である（＞５０％）。段階には、例えばジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）で活性化されたテトラフルオロフェノールによるエステル化、活性６−クロロニコチン酸エステルをトリメチルアミンの飽和テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）溶液で処理することによるトリメチルアンモニウム塩の生成、及び銀トリフレートによるトリフルオロメタンスルホン酸塩（トリフレート）の生成が含まれる。

式（Ｉ）の化合物の製造後、通例は例えばＯａｓｉｓ ＭＣＸ（商標）カラムによる固相抽出を用いる標準的な方法によってそれを精製すればよい。かかるカラムからは、適当な有機溶媒／水混合物を用いて式（Ｉ）の化合物を良好な純度で溶出できる。

本発明のさらに別の態様に従えば、式（Ｉ）の化合物を次の式（ＩＩＩ）の化合物と反応させて次の式（ＩＶ）の¹⁸Ｆ−生成物を得ることを含んでなる¹⁸Ｆ−フッ素化方法が提供される。

式（Ｉ）の化合物と式（ＩＩＩ）の化合物との反応は、適当な溶媒（例えば、２〜１１、好適には３〜１１のｐＨ範囲内の水性緩衝液）中において、５〜７０℃の極端でない温度、好ましくは周囲温度で実施できる。

式（ＩＩＩ）及び式（ＩＶ）中、好適な標識用生体分子はペプチドである。かかるペプチドには、オクトレオチドのようなソマトスタチン類似体、ボンベシン、血管作用性小腸ペプチド、走化性ペプチド類似体、α−メラノサイト刺激ホルモン、ニューロテンシン、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐペプチド及びその類似体、ヒトプロインスリン結合ペプチド、エンドセリン、アンギオテンシン並びにホルミル−ノルロイシル−ロイシル−フェニルアラニル−ノルロイシル−チロシル−リシンがある。好ましい標識用生体分子は、国際公開第０１／７７４１５号及び同第０３／００６４９１号に記載されているもののようなＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐペプチド及びその類似体である。好ましいペプチドは次式のフラグメントを含んでいる。

特定の一態様では、式（ＩＩＩ）又は式（ＩＶ）中の生体分子は次の式（Ａ）のペプチドである。

式中、Ｘ⁷は−ＮＨ₂又は次式の基である。

式中、ａは１〜１０の整数であり、好ましくはａは１である。

当業者には容易に理解される通り、本発明の方法は、タンパク質、ホルモン、オリゴヌクレオチド及び抗体フラグメントのような他の生体分子並びに薬物様小分子の¹⁸Ｆ−フッ素化によって各種のＰＥＴトレーサーを得るためにも使用できる。

式（ＩＩＩ）の化合物は、例えば、Ａｔｈｅｒｔｏｎ，Ｅ．ａｎｄ Ｓｈｅｐｐａｒｄ，Ｒ．Ｃ．；“Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”；ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ：Ｏｘｆｏｒｄ，１９８９中に記載されている固相ペプチド合成法のような標準的ペプチド合成法によって製造できる。式（ＩＩＩ）の化合物中への第一アミン基の導入は、ペプチドのＮ末端又はＣ末端の反応、或いはペプチド配列中に含まれる何らかの他の官能基であって、その修飾がベクターの結合特性に影響を及ぼさない官能基との反応によって達成できる。第一アミン基は、好ましくはペプチドのアミン官能基と活性化酸との反応による安定なアミド結合の形成によって導入され、ペプチド合成の実施中又は実施後に導入される。前駆体が酸である場合、第一アミンは、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）又はＮ−［（ジメチルアミノ）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾロ［４，５−ｂ］ピリジン−１−イルメチレン］−Ｎ−メチルメタンアミニウムヘキサフルオロホスフェートＮ−オキシド（ＨＡＴＵ）のようなインサイチュ活性化剤を用いて導入できる。

以下、例示のみを目的として本発明を例証する。

実施例１：６−フルオロニコチン酸２，３，５，６−テトラフルオロフェニルエステルの合成

２−トリメチルアンモニウムニコチン酸の２，３，５，６−テトラフルオロフェノール（Ｔｆｐ）活性エステルを、６−クロロニコチン酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）から出発する３つの段階で合成した。ヘキサンからの晶出後、５０ｍＬのジオキサン中においてジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）（３．９６ｍｇ、１９ｍｍｏｌ）で活性化された２，３，５，６−テトラフルオロフェノール（３．２５ｍｇ、１９ｍｍｏｌ）により６−クロロニコチン酸（３ｇ、１９ｍｍｏｌ）をエステル化したところ、６−クロロニコチン酸のＴｆｐエステルが７３％の収率で得られた。活性６−クロロニコチン酸ｔｆｐエステル（１ｇ、３．２７ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中のトリメチルアミン飽和溶液（１５ｍＬ）中で処理（２時間の連続バブリング）することでトリメチルアンモニウム塩を生成させたところ、塩化物イオンを対イオンとするトリメチルアンモニウム塩が４５％の収率で得られた。塩はテトラヒドロフラン溶液から沈殿するので、未反応材料は濾別することができた。トリフレート塩の生成は２つの方法で生成させることができる。即ち、アセトニトリル中において対応する塩化物塩を１．２モル過剰の銀トリフレートで処理するか、或いはトリメチルシリルトリフルオロメタンスルホネートで処理すればよい。操作が簡単であり、分取クロマトグラフィーが不要である点で、後者が好ましい選択肢である。いずれの方法もほぼ定量的である。

最初に、合成した前駆体（９．２ｍｇ）を、アセトニトリル（０．７ｍｌ）中のＫ２２２（１０ｍｇ）及びＫＦ（１．１ｍｇ）によって¹⁹Ｆで標識した。２７℃でアセトニトリル−ｄ₆中の¹Ｈ−ＮＭＲを用いて¹⁹ＦとＴｆｐエステルとの反応を調べることで、反応動力学及び生成した不純物を評価した。

比較例
２−トリメチルアンモニウムニコチン酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルを６−クロロニコチン酸から合成し、上記の方法と同様にして¹⁹Ｆで標識した。

結果
両エステルは良好な収率（６−クロロニコチン酸から出発して＞３０％）で合成され、室温のアセトニトリル中においてフッ化物と容易に反応した。ＮＨＳエステルはＴｆｐエステルより加水分解を受けやすく、したがってそれ以上は評価しなかった。Ｔｆｐエステルの反応を３０分間にわたり¹Ｈ−ＮＭＲによって調べたところ、室温でフッ化物の迅速な取込みが示され、２．５分後には３２％の出発原料が所望のフッ素化生成物に転化された。１組の実験では、７０％のフッ素化生成物が２０分未満で得られた。所望の生成物と共に、２種のニコチン酸誘導体が副生物として同定された。

実施例２：６−フルオロニコチン酸２，３，５，６−テトラフルオロフェニルエステルと官能化ＲＧＤペプチドとの反応
アセトニトリル／０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ９）の１：１溶液（全量３ｍＬ）中において、実施例１のフッ素化生成物（１ｍｇ）と適宜に官能化されたＲＧＤペプチド（５ｍｇ、国際公開第０１／７７４１５号及び同第０３／００６４９１号に記載されているようにして製造された）とを反応させることで、ＬＣ−ＭＳにより分析して所望の生成物が得られた。ＬＣ−ＭＳ条件：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ Ｃ１８（２） ３μ ２×５０ｍｍ、移動相Ａ：水／０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、移動相Ｂ：アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ、流量：０．６ｍＬ／分、５分で１０〜３０％Ｂ。保持時間（Ｒｔ）＝３．４２分、Ｍ＋Ｈ⁺（期待値１３８１．５、実測値１３８１．６）。

実施例３：６−［ ¹⁸ Ｆ］フルオロニコチン酸２，３，５，６−テトラフルオロフェニルエステルの放射合成

Ｎ₂下で１００℃に９分間加熱することにより、水性［¹⁸Ｆ］フッ化物（１５０ＭＢｑ以下）を１５ｍｇのＫｒｙｐｔｏｆｉｘ ２２２及び３ｍｇの重炭酸カリウム（ＫＨＣＯ₃）の存在下で共沸的に乾燥した。この間に、２×１ｍＬのアセトニトリルを添加して蒸発させた。４０°に冷却した後、トリメチル−［５−（２，３，５，６−テトラフルオロ−フェノキシカルボニル）ピリジン−２−イル］アンモニウムメタンスルホネートの溶液（１ｍＬのアセトニトリル中７ｍｇ）を添加した。反応器を４０℃に１０分間加熱して標識を行った。標的¹⁸Ｆ−化合物の生成を確認するために冷参照標準を同時注入しながら、粗反応混合物をラジオＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）及びラジオＴＬＣ（薄層クロマトグラフィー）に付した。取込み収率は、ラジオＴＬＣ（ｎ＝３）で分析して通例５０〜８０％であった。

ラジオＴＬＣ：予備被覆シリカゲルプレート６０ Ｆ₂₅₄（Ｍｅｒｃｋ社）、勾配：ｎ−ヘキサン／酢酸エチル（５０：５０）。インスタントイメージャー（Ｐａｃｋａｒｄ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ社）を用いて、ＴＬＣプレート上での放射能分布を測定した。Ｒｆ：０．６５。

ラジオＨＰＬＣ：γ線検出器（Ｂｉｏｓｃａｎフローカウント）と直列にＵＶ検出器を備えたＡｇｉｌｅｎｔシステム（１１００シリーズ）上で分析用ラジオＨＰＬＣを実施した。Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ Ｃ１８（２）カラム（１５０×４．６ｍｍ，５μｍ）、流量：１．０ｍＬ／分、勾配：２０分で２０〜８０％Ｂ。（２１４ｎｍ及び２５４ｎｍでのＵＶ検出をγ線検出器と併用した）。Ｒｔ：１４．４分。

精製
２ｍＬのアセトニトリル中に［¹⁸Ｆ］フルオロニコチン酸２，３，５，６−テトラフルオロフェニルエステルを含む粗反応混合物を蒸留水で３０％アセトニトリルまで希釈した。水溶液を（製造者の推奨条件に従ってコンディショニングした）カートリッジ付きのＯａｓｉｓ ＭＣＸに通した。次いで、カートリッジを５ｍＬの蒸留水で洗った。次いで、精製された生成物を１００％アセトニトリルによって９０％を超える放射化学純度でカラムから溶出した。未反応前駆体トリメチル−［５−（２，３，５，６−テトラフルオロ−フェノキシカルボニル）ピリジン−２−イル］アンモニウムメタンスルホネートはすべてカートリッジ上に残留した。

実施例４：遊離アミノ官能基を有する環状ＲＧＤペプチドに対する６−［ ¹⁸ Ｆ］フルオロニコチン酸２，３，５，６−テトラフルオロフェニルエステルのコンジュゲーション

精製された６−［¹⁸Ｆ］フルオロニコチン酸２，３，５，６−テトラフルオロフェニルエステルをアセトニトリル／水の１：１溶液１．５ｍＬに溶解した溶液に、アセトニトリル及び０．１Ｍ ＮａＨＰＯ₄の１：１溶液１ｍＬに溶解した３ｍｇの適宜に官能化されたＲＧＤペプチド（Ｍｗ：１２５８．４７）を添加した。得られたｐＨ９の混合物を４０℃に加熱した。３０分後、混合物の小アリコートをラジオＨＰＬＣで分析した。ラジオクロマトグラムは、６５％を超える収率で所望の生成物に転化したことを示していた。生成物はその¹⁹Ｆ−参照標準と共溶出した。

ラジオＨＰＬＣ：γ線検出器（Ｂｉｏｓｃａｎフローカウント）と直列にＵＶ検出器を備えたＡｇｉｌｅｎｔシステム（１１００シリーズ）上で分析用ラジオＨＰＬＣを実施した。Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ Ｃ１８（２）カラム（１５０×４．６ｍｍ，５μｍ）、流量：１．０ｍＬ／分、勾配：２０分で０〜４０％Ｂ。（２１４ｎｍ及び２５４ｎｍでのＵＶ検出をγ線検出器と併用した）。Ｒｔ：１０．０分。

Claims (10)

1. 次の式（Ｉ）の化合物。
   
2. 次の式（Ｉａ）を有する、請求項１記載の化合物。
   
3. 次の式（ＩＩ）の化合物又はその塩。
   （式中、Ｌはクロロ、ブロモ、ヨード、ニトロ及びトリ（Ｃ_1-6アルキル）アンモニウム（好適にはトリメチルアンモニウム）から選択される脱離基である。）
4. Ｌがトリ（Ｃ_1-6アルキル）アンモニウム（好適にはトリメチルアンモニウム）である、請求項３記載の式（ＩＩ）の化合物又はその塩。
5. 次式の化合物である、請求項３又は請求項４記載の式（ＩＩ）の化合物。
   （式中、Ｘ^-は対イオンであり、好ましくはトリフルオロメタンスルホン酸イオンである。）
6. 請求項１又は請求項２で定義された式（Ｉ）又は式（Ｉａ）の化合物を次の式（ＩＩＩ）の化合物と反応させて次の式（ＩＶ）の¹⁸Ｆ−生成物を得ることを含んでなる¹⁸Ｆ−フッ素化方法。
   
7. 生体分子がペプチドである、請求項６記載の方法。
8. 生体分子が、オクトレオチドのようなソマトスタチン類似体、ボンベシン、血管作用性小腸ペプチド、走化性ペプチド類似体、α−メラノサイト刺激ホルモン、ニューロテンシン、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐペプチド及びその類似体、ヒトプロインスリン結合ペプチド、エンドセリン、アンギオテンシン並びにホルミル−ノルロイシル−ロイシル−フェニルアラニル−ノルロイシル−チロシル−リシンから選択されるペプチドである、請求項６又は請求項７記載の方法。
9. 生体分子が次式のフラグメントを含む、請求項６乃至請求項８のいずれか１項記載の方法。
   
10. 生体分子が次の式（Ａ）のペプチドである、請求項６乃至請求項９のいずれか１項記載の方法。
    （式中、Ｘ⁷は−ＮＨ₂又は次式の基である。
    （式中、ａは１〜１０の整数であり、好ましくはａは１である。））