PT2335695E - Utilização de aminaftona para a preparação dum medicamento para tratar arteriopatias - Google Patents
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Description
1
DESCRIÇÃO
"UTILIZAÇÃO DE AMINAFTONA PARA A PREPARAÇÃO DUM MEDICAMENTO PARA TRATAR ARTERIOPATIAS" 0 objecto da presente invenção consiste numa nova utilização do composto 2-hidroxi-3-metil-l,4-naftoidroquinona-2-p-aminobenzoato, conhecido pelo nome comum aminaftona (doravante definido, por simplicidade, como aminaftona), para a preparação dum medicamento para tratar arteriopatias, em que a referida arteriopatia é a doença de Raynoud secundária a conjuntivite. A aminaftona é um composto com uma actividade farmacológica conhecida e comercialmente disponível em Itália e outros países há já vários anos; em Itália, por exemplo, este composto constitui a substância activa do fármaco CAPILLAREMA, um medicamento do Laboratori Baldacci S.p.A., Pisa. É conhecida a capacidade da aminaftona para actuar na circulação capilar venosa, onde desempenha uma acção capaz de normalizar a vasopermeabilidade e aumentar a resistência capilar em situações nas quais as condições patológicas determinam alterações da microcirculação.
De facto, o fármaco é amplamente utilizado no tratamento sintomático de insuficiência venosa crónica dos membros inferiores, uma situação na qual a estase hemática afecta a microcirculação ao produzir alterações da estrutura e da funcionalidade capilar. Caracteristicas farmacológicas e clínicas deste produto foram publicadas em artigos científicos de revisão e confirmadas nestes últimos 2 anos pela utilização terapêutica para o tratamento de patologias venosas em países onde o mesmo é comercializado.
No entanto, até hoje, nunca foi demonstrado o facto de que a aminaftona possui igualmente a capacidade de antagonizar eventos patológicos relativos a um estado inflamatório da estrutura vasal arterial através de mecanismos diferentes para além daqueles actualmente conhecidos.
Villaverde C.A. et al (Rev Farmacol Clin Exp 6 (1), 9-14 (1989)) descrevem os efeitos positivos da aminaftona na alteração de microcirculação mesentérica em ratos causada por inflamação devida à administração de endotoxina.
Na literatura, é conhecida a importância do componente endotelial na aterosclerose, a microangiopatia diabética, a doença de Raynaud, a doença de Buerger, a arteriopatia obliterativa, a esclerose sistémica, a conjuntivite, a hipertensão pulmonar e, de modo geral, em todas as doenças caracterizadas por um dano endotelial e/ou remodelação vascular com consequente isquemia dos tecidos. De facto, o endotélio vascular acaba por ser um sistema que consiste de células metabolicamente activas e receptivas a estímulos fisiológicos. Os referidos estímulos controlam, numa forma meticulosa, o fluxo sanguíneo, desempenhando um papel complexo no controlo na vasoreactividade, na agregação de plaquetas e na resistência à formação de trombos.
De modo a desempenhar a sua função de modo adequado, as células endoteliais sintetizam e secretam componentes do tecido conjuntivo e moléculas com uma actividade antagonista entre elas. 3 A inflamação endotelial encontra-se na base de patologias degenerativas/inflamatórias, com um carácter evolucionário, com a presença de vacuolização, perda de integridade endotelial, infiltração perivascular de linfócitos, macrofagos, monócitos, fibroblastos e expressão cada vez maior de moléculas adesivas com a formação dum vasoconstritor endógeno forte, tal como endotelina, com uma hiperplasia consequente da intima, proliferação das células musculares suaves dos vasos e uma remodelação vascular.
De modo a reduzir esta condição flogístico-degenerativa endotelial, existem actualmente disponíveis alguns fármacos, tais como estatinas, os quais possuem, no entanto, uma desvantagem dupla: são terapêuticas caras e determinam, numa parte absolutamente não insignificante de doentes, uma forma de miopatia induzida pelas estatinas.
Actualmente, existem igualmente disponíveis análogos moleculares dos prostanóides (endoprost) , os quais possuem a desvantagem de ser fármacos extremamente caros e de difícil administração no que se refere às vias de administração, semi-vida da molécula e efeitos secundários.
Consequentemente, mantém-se a necessidade de ser capaz de arranjar meios terapêutico novos e eficazes de modo a combater a inflamação endotelial do sistema vascular arterial, reduzindo deste modo e/ou eliminando a causa primária de arteriopatias, em particular, dum tipo degenerativo (consequentemente obtendo um melhoramento substancial ou a resolução completa da doença arterial). 0 objecto da invenção presente é facultar uma resposta à necessidade acima indicada. 4
Este e outros objectivos, os quais serão evidentes a partir da descrição detalhada que se segue, foram alcançados pelo pedido do requerente, o qual descobriu de forma completamente inesperada que um medicamento oportuno que incluía uma quantidade eficaz de aminaftona tem capacidade para prestar uma resposta apropriada aos problemas acima descritos.
Um objecto da presente invenção é a utilização de aminaftona para a preparação dum fármaco para tratar arteriopatias, em que a referida arteriopatioa é a doença de Raynaud secundária a conjuntivite.
As realizações preferidas da presente invenção são descritas nas reivindicações dependentes em anexo. A presente invenção é apresentada em detalhe na descrição que se segue. A referida invenção é ainda apresentada com a ajuda das Figuras 1 a 3 aqui incluídas, em que:
Figura 1: esta figura regista graficamente o efeito inibidor exercido pela aminaftona, em dosagens diferentes, na expressão da molécula E-selectina adesiva (ELAM-1) a partir de células endoteliais humanas ECV 304. Especificamente, a Fig. 1 apresenta a densidade da fluorescência da membrana ELAM-1, determinada por meio de análise citofluorométrica (meio canal) em diferentes amostras de células ECV 304, nas seguintes condições, respectivamente: a.) em basal (Meio) e após uma incubação de 48 horas com meio basal adicionado com aminaftona a uma dosagem de 4 mcg/ml (Amna); 5 b.) após incubação/activação durante 48 horas com IL-1β a 100 U/ml (IL-1) e, respectivamente, IL-1 adicionado com aminaftona (Amna) a concentrações de 2; 4; 5 mcg/ml.
Figura 2: esta figura apresenta, num diagrama em bloco, o efeito inibidor exercido por aminaftona, a dosagens diferentes, na produção endotelina (ET-1) a partir de células endoteliais humanas ECV 304 incubadas/activadas com IL-1β. Especificamente, a Fig. 2 apresenta o curso da produção ET-1, doseada com um EIA-Kit especifico, em amostras diferentes de ECV 304 activadas com IL-Ιβ isoladamente a 100 U/ml (IL-1) e, respectivamente, com IL-1 adicionada com aminaftona a concentrações de 2, 4, 6 mcg/ml (A2; A4; A6).
Figura 3: apresenta, num diagrama em bloco, o efeito inibidor exercido pela aminaftona, a dosagens diferentes, na produção endotelina (ET-1) a partir de células endoteliais humanas ECV 304 não-activadas. Especificamente, a Fig. 3 apresenta o curso da produção ET-1 em diferentes amostras de ECV 304 não-activadas com IL-Ιβ mas incubadas com o meio de cultura (basal) isoladamente e, respectivamente, com meio basal adicionado com aminaftona a concentrações de 2; 4; 6 mcg/ml (A2; A4 ; A6). A presente invenção refere-se à utilização de aminaftona para a preparação dum medicamento para o tratamento de arteriopatias, em que a referida arteriopatioa é a doença de Raynaud secundária a conjuntivite. A preparação do medicamento da presente invenção é realizada numa forma tradicional ao se utilizarem, dependendo do tipo de formulação que se pretende preparar, 6 técnicas preparativas conhecidas dos especialistas do sector farmacêutico. A referida preparação inclui, pelo menos, uma fase na qual uma dose terapeuticamente eficaz de substância activa aminaftona, objecto da presente invenção, é adicionada com uma quantidade de aditivos e excipientes próprios seleccionados entre: veiculos, agentes tampão, lubrificantes, dispersantes, aromatizantes, adoçantes, estabilizantes, conservantes, antioxidantes, comummente utilizados na técnica de formulação farmacêutica. Simplesmente a titulo de exemplo, absolutamente não limitativo, entre os excipientes e aditivos particularmente preferidos podem mencionar-se: amido, tween, aromas, tais como as de tangerina, uva, morango, mirtilo, todos os frutos, sacarose, glicose, acesulfame, sacarina, aspartame, ácido ascórbico, parabeno, glutamina, arginina, superóxido dismutase, glutationa. 0 referido medicamento pode ser administrado a doentes por diferentes vias de administração. Um medicamento particularmente preferido da presente invenção é formulado para administração oral.
As composições preferidas para administração oral são, por exemplo, em forma de cápsulas, grânulos, soluções ou suspensões prontas para beber, pós ou granulados em saquetas (para serem suspensas ou dissolvidas em água ou bebidas não alcoólicas e não carbonadas no momento da utilização) ou formas semelhantes, comprimidos, formulações efervescentes. 0 medicamento da presente invenção pode igualmente ser formulado numa forma revestida, laçada, encapsulada ou microencapsulada de modo a se tornar gastro-resistente. 7 0 referido medicamento pode igualmente ser formulado como uma forma de libertação controlada de modo a libertar selectivamente as substâncias activas no trato intestinal, particularmente o cólon.
No entanto, não são excluidas outras formas de administração, como uma função do tipo de doente e afecção de arteriopatia a ser tratada. Na verdade, pode ser prevista a formulação para administração por via parentérica ou transdérmica.
Numa realização preferida da invenção, o referido medicamento contém a substância activa aminaftona numa quantidade entre 30 e 150 mg/dose; de preferência, de 50 a 100 mg/dose. O referido medicamento é, normalmente, administrado ao doente a uma dosagem entre, em média, 75 e 450 mg/die; de preferência, de 50 a 300 mg/die; mais preferencialmente, de 75 a 225 mg/die.
Tal como descrito na secção experimental que se segue e nas Figuras 1 a 3 presentemente incluídas, o medicamento da presente invenção, incluindo aminaftona, revelou um efeito protector directo do endotélio vascular arterial através do bloqueio de células e mecanismos transcripcionais, os quais se encontram envolvidos no dano endotelial.
Na seguinte parte experimental, a título de exemplo, é apresentada uma série de testes, realizados "in vitro", os quais confirmam a eficácia da aminaftona, facultada pela companhia farmacêutica Laboratori Baldacci S.p.A., ao inibir a produção, a partir de células endoteliais arteriais inflamadas, de moléculas adesivas e do vasoconstritor endógeno forte endotelina. 8
Introdução A acção da aminaftona tem sido estudada in vitro na expressão de E-selectina (doravante apresentada como ELAM-1) e na produção endotelina-1 (doravante apresentada como ET—1) de células activadas de linhagem ECV 304, activadas e não com ou sem incubação com interleucina-ΐβ (em resumo, IL-Ιβ). IL-Ιβ representa uma molécula também produzida em humanos em condições de inflamação e é responsável por essas séries de alterações que se enquadram no contexto de respostas de estados agudos aos estímulos.
As células ECV 304 são uma linha celular humana que apresentam muitas caracteristicas de células endoteliais e que é comummente utilizada para estudar, de forma estandardizada, as funções celulares da mesma. A selecção de parâmetros para ser avaliada foi motivada ao se determinar o papel abrangido pela expressão da E-selectina em estados prematuros de lesões endoteliais flogísticas degenerativas. Em humanos, a expressão da E-selectina desempenha um papel importante em patologias vasculares arteriais ao promover a adesão de plaquetas e a adesão e a migração de células inflamatórias. Por outro lado, a produção de endotelina-1 foi analisada uma vez que é fundamental em processos típicos de vasoconstrição e remodelação vascular da lesão endotelial. A endotelina-1 (ET-1) é, de facto, mencionada como um dos princípios patogénicos determinantes de muitas patologias humanas, por exemplo: hipertensão pulmonar primitiva e secundária, doença de Raynaud secundária, arteriopatias inflamatórias e aterosclerose; promove ainda a cardiomiopatia hipertrófica e o aumento da tensão arterial. 9
Materiais e métodos
Diluição de aminaftona. 0,5 g de aminaftona em pó (ex companhia Baldacci de Pisa, Itália) foram dissolvidos em 5 ml de DMSO (dimetilsulfóxido); 50 μΐ desta solução foram diluidos em 5 ml de DMSO e, subsequentemente, 100 μΐ desta segunda solução foram juntos a 1 ml com PBS (solução salina tamponada com fosfato). Esta solução em PBS foi utilizada como uma solução-mãe para ser diluida com o meio de cultura completo de modo a se obter concentrações finais de aminaftona 2, 4, 5 e 6 pg/ml, respectivamente, nos diferentes testes experimentais. A selecção destas concentrações foi realizada com base em concentrações terapêuticas in vivo do fármaco Capillarema acima mencionado. Células.
Linhas celulares ECV 304: estas são células provenientes do cordão umbilical duma recém-nascida japonesa e espontaneamente imortalizadas na fase 136 (distribuídas por Colecção de Culturas Celulares). Estas células são cultivadas num meio completo que consiste em: meio 199, L-glutamina 1%, penicilina/estreptomicina 1% (Invitrogen) com uma adição de 10% FCS (soro fetal de bovino) (Hy-clone).
Análise quantitativa citofluorométrica dos efeitos da aminaftona na molécula adesiva de E-selectina expressa em CD 6 2 (ELAM-1) . Células da linha ECV304, cultivadas em pratos de Petri de 28 cm2, foram estimuladas com IL-Ιβ a 100 U/ml (Roche) 10 durante 48 horas num meio completo e meio completo adicionado com aminaftona à concentração de 2; 4; 5 pg/ml, respectivamente. Estas concentrações são equivalentes às concentrações alcançadas " in vivo" através da administração de Capillarema per os à dosagem padrão de 3 cápsulas/dia (cápsulas com 75 mg de substância activa por dia) . Para além disso, as células não tratadas com IL-Ιβ foram incubadas num meio completo adicionado com aminaftona isoladamente a uma concentração de 4 pg/ml.
Amostras, após lavagem com PBS, foram colhidas a partir de pratos de cultura através dum tratamento com tripsina-EDTA. A expressão de moléculas adesivas foi detectada através de incubação durante 20 minutos com 7 μ1/106 de anticorpo monoclonal humano CD62-E-PECy5 (ELAM-1) (Becton-Dickinson). A especificidade de ligação foi assegurada pela adição do isótopo de controlo. Após lavagem e ressuspensão na solução de fixação (1% paraformaldeído, PFA em PBS), as amostras foram analisadas utilizando-se citometria de fluxo com Software FACSdiva (Becton-Dickinson). Os dados foram expressos como fluorescência média de canal e percentagem de fluorescência de células positivas. Todas as experiências foram repetidas 5 vezes em amostras de células independentes provenientes de diferentes sessões experimentais.
Avaliação de produção da endotelina (ET-1). a) EIA-kit - Foram colhidos sobrenadantes de amostras de células ECV304, cultivadas como acima descrito, tratadas com IL-Ιβ a 100 U/ml durante 6-12-24 e 36 horas ou com IL-1β a 100 U/ml adicionados com aminaftona à concentração de 2; 4; 6 pg/ml, respectivamente. Para além disso, as 11 amostras não estimuladas com IL-Ιβ foram incubadas com a adição de aminaftona isolada a 2; 4; 6 μg/ml. A concentração de ET-1 que existe nos sobrenadantes foi quantificada através de Kit de Endotelina-1 EIA (CAYMAN Chemical) num intervalo entre 0 e 250 pg/ml. Este teste imunométrico é baseado na técnica "sanduíche" com um anticorpo duplo.
b) RT-PCR em Tempo Real específico para Pre-Pro-ET-1 (PPET-1). A expressão do gene PPET-1 foi detectada às 6-12-24-36 horas, respectivamente, nas amostras: tratadas com IL-Ιβ (100 U/ml); tratadas com IL-Ιβ (100 U/ml) adicionadas com aminaftona (2; 4; 6 pg/ml); não-estimuladas por IL-Ιβ mas tratadas com aminaftona isolada. A técnica RT-PCR baseada na tecnologia Taq-Man foi utilizada (Applied Biosystems, Foster City, CA) , através dum sistema de determinação de sequência ABI PRISM 7000 (Applied Biosystems). 2-4 μΐ foram colhidos de cada cADN, diluídos 1:5, num volume final de 25 μΐ. PCR mix contendo lx TaqMan Universal PCR Master Mix com enzima Ampo-Erase UNG; um iniciador específico e uma sonda FAM-labelled mix (Assay-On-Demand Gene Expression Products; Applied Biosystems). Na primeira amplificação, a enzima AmpliTaq Gold foi activada durante 10 minutos a 95°C. Todos os genes foram depois amplificados: uma primeira fase de 15 segundos. A 95°C; uma segunda fase de 1 minuto a 60°C; todas para 50 ciclos totais. A quantificação do PPET-1 mARN específico foi normalizada para a expressão do gene constitutivo gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase (GAPDH). As quantificações relativas da expressão do gene foram possíveis pela utilização do método CT comparativo (AACT). O valor de CT foi definido como o número de ciclos PCR 12 necessários para ultrapassar os sinais de fluorescência (definidos como 10 vezes o desvio padrão da variação basal). O valor de ACT foi definido como a diferença entre CT de PPET-1 mARN e CT de GAPDH mARN. O curso da expressão PPET mARN foi computorizado de acordo com a fórmula 2-(AACT) , em que AACT acaba por ser a diferença entre cada ACT e o ACT da amostra que possui o mARN mais baixo (calibrador).
Análise Estatística
Para a análise estatística, foi utilizada a análise de variância (Análise de Variância simples - One-Way ANOVA) através duma versão software 12,0 (SPSS Inc., Chicago, IL).
Comentário sobre os Resultados
Expressão de moléculas adesivas A análise citofluorométrica demonstrou que a aminaftona tem capacidade para reduzir, numa forma estatisticamente significativa, a expressão da E-selectina (ELAM-1) em células ECV304 (MC: média ± desvio padrão: 219 ± 8,3; % células positivas 19,4 ± 1,7) relativamente a células incubadas com o meio de cultura completo isoladamente (MC: média ± desvio padrão: 250 ± 22 p<0,05; % células positivas 29,1 ± 3,1; p<0,05). Para além disso, foi demonstrado que a aminaftona inibe, com um curso dose-dependente, a expressão de moléculas adesivas em células activadas; (células incubadas com IL-Ιβ 100 U/ml: MC: média ± desvio padrão: 369,6 ± 30,5; % células positivas: 38,4 ± 3,7); (células incubadas com IL-Ιβ 100 U/ml na presença de aminaftona 2 mcg/ml: MC: Média + desvio padrão: 332,2 ± 36,8) p<0,001; % células positivas 36,6 ± 4,5 p=n.s.); (células incubadas com IL-Ιβ 100 U/ml na presença de aminaftona 4 mcg/ml: MC: 13 média + desvio padrão: 278,4 ± 16,2 p<0,001 % células positivas: 28,2 ± 2,9) p<0,001; (células incubadas com IL-1β 100 U/ml na presença de aminaftona 5 mcg/ml: MC: média + desvio padrão: 252,6 ± 10,3 p<0,001; % células positivas 27,2 ± 3,7 p<0,001) . Os resultados, expressos como fluorescência média de canal (MC) são apresentados na Figura 1 e confirmam a actividade inibidora exercida pela aminaftona na expressão da molécula adesiva da E-selectina.
Produção de Endotelina (ET-1) O EIA-kit confirma a tendência, já observada a um nível de transcrição genética de PRE-PRO-ET-1, de acordo com a qual a aminaftona tende a reduzir a produção de ET-1 a partir de amostras de células ECV304, tanto estimuladas com IL-1 como incubadas com o meio de cultura isolado. Para além disso, registou-se que esta inibição na produção de ET-1 resultou como confirmada em todos os momentos e teve um curso dependente de dose. (Fig. 2 e 3). A tendência para um decremento linear da concentração de ET-1 em momentos diferentes com concentrações cada vez maiores de aminaftona alcançou um significado estatístico nos seguintes casos: 6 horas: IL-1β vs. IL-1 β + aminaftona 4 mcg/ml: p<0,001 ; IL-1β vs. IL-1β + aminaftona 6 mcg/ml: p =0 , 000; 12 horas: IL-1β vs. IL-1 β + aminaftona 4 mcg/ml: p<0,05; IL-1 β vs. IL-1β + aminaftona 6 mcg/ml: p= 0, 000; 36 horas: IL-Ιβ vs. IL-1 β + aminaftona 6 mcg/ml: p=0,000.
No que respeita às células não-activadas com IL-1 mas incubadas com o meio de cultura isolado adicionado com 14 aminaftona a concentrações crescentes, o signifj_Cado estatístico foi alcançado nos seguintes casos: 12 horas: meio basal vs. aminaftona 6 mcg/ml: P<0,05· 24 horas: meio basal vs. aminaftona 4 mcg/ml: P<0,05· meio basal vs. aminaftona 6 mcg/ml: p<0,05; 36 horas: meio basal vs. aminaftona 4 mcg/ml: P<0,000; meio basal vs. aminaftona 6 mcg/ml: p=0,000.
Os resultados obtidos são apresentados nas Figuras 2 e 3 em anexo e confirmam a actividade inibidora exercida pela aminaftona na produção da endotelina-1. Os resultados experimentais acima apresentados confirmam a nova utilização da aminaftona, de acordo com o que tem sido descrito e reivindicado na presente invenção. 15
REFERENCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO Ά presente listagem de referências citadas pela requerente é apresentada meramente por razões de conveniência para o leitor. Não faz parte da patente de invenção europeia. Embora se tenha tomado todo o cuidado durante a compilação das referências, não é possível excluir a existência de erros ou omissões, pelos quais o IEP não assume nenhuma responsabilidade.
Literatura não relacionada com patentes, citada na descrição • VILLAVERDE C.A. et al. Rev Farmacol Clin Exp, 1989, vol. 6 (1), 9-14 [0005]
Claims (6)
1 REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de aminaftona para a preparação dum medicamento para o tratamento de arteriopatias, em que a referida arteriopatia é a doença de Raynaud secundária a conjuntivite.
2. Utilização, de acordo com a reivindicação 1, em que o referido medicamento se destina a administração entérica ou parentérica.
3. Utilização, de acordo com a reivindicação 1, em que o referido medicamento se destina a administração oral.
4. Utilização, de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3, em que o referido medicamento contém aminaftona numa quantidade entre 30 e 150 mg/dose; de preferência de 50 a 100 mg/dose.
5. Utilização, de acordo com a reivindicação 3, em que o referido medicamento inclui ainda uma quantidade de excipientes seleccionados entre: veículos, agentes tampão, lubrificantes, dispersantes, aromatizantes, adoçantes, estabilizantes, conservantes, antioxidantes, comummente utilizados na técnica de formulação farmacêutica.
6. Utilização, de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 5, em que a dosagem diária do referido medicamento está compreendida entre 30 e 350 mg/dia; de preferência, de 50 a 300 mg/dia; mais preferencialmente, de 75 a 250 mg/dia.
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