PT2323686E - Adiponectina para o tratamento de doenças pulmonares - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

ADIPONECTINA PARA O TRATAMENTO DE DOENÇAS

PULMONARES Âmbito técnico A presente invenção tem por objecto um agente, para o tratamento de doenças pulmonares, que inibe o alargamento anormal do espaço aéreo alveolar associado a alterações destrutivas das paredes alveolares provocadas pela sua lesão crónica e/ou que inibem alterações destrutivas das paredes alveolares. Técnica anterior Várias doenças pulmonares (DP) conhecidas incluem bronquite aguda devida à inflamação aguda causada por vírus ou bactérias; asma brônquica causada principalmente pela resposta inflamatória do tracto respiratório devido a eosinófilos; pneumonia intersticial causada pela inflamação do epitélio alveolar; cancro do pulmão causado por células cancerosas; e doença pulmonar obstrutiva crónica (DPOC), que é conhecida como uma doença caracterizada por inflamação pulmonar crónica causada por vários factores, especialmente fumo, levando à destruição da parede alveolar e à hipertrofia das glândulas da mucosa brônquica, resultando em falta de ar, aumento da tosse e expectoração, etc. Particularmente, uma doença antigamente chamada enfisema muitas vezes complica, em diferentes graus, uma doença anteriormente chamada de bronquite crónica. Hoje em dia, a doença pulmonar obstrutiva relacionada com estas duas doenças é referida como DPOC. 1

Diz-se que a DPOC é caracterizada pelo desenvolvimento progressivo da limitação do fluxo de ar (obstrução das vias aéreas) (documento 1 fora das patentes).

Ao contrário da bronquite crónica, em que a hipersecreção do tracto respiratório e a infecção não envolvem limitação do fluxo de ar, a limitação do fluxo de ar é considerada irreversível por resultar de lesões periféricas das vias aéreas. Tais doenças pulmonares incluem, para além da doença pulmonar obstrutiva crónica mencionada antes, enfisema e bronquite crónica, fibrose quística, bronquiectasias, tuberculose, pneumoconiose e similares.

Até à data, no que diz respeito à terapia com fármacos para a doença pulmonar, incluindo a DPOC acompanhada por uma limitação irreversível do fluxo de ar, utilizam-se fármacos tais como os estimulantes β2, agentes anti-colinérgicos e similares, com actividade broncodilatadora para prevenir ou suprimir temporariamente os sintomas. No entanto, estes fármacos, que possuem actividade broncodilatadora, não podem diminuir, durante um longo período de tempo, a deterioração da função pulmonar, que é o indicador clínico mais importante.

Muitos estudos clínicos em larga escala examinaram os efeitos da terapia utilizando, como inalantes, esteróides possuindo um efeito inibidor potente na produção de citocinas; no entanto, vários documentos relataram que os esteróides não podiam diminuir a deterioração da função pulmonar durante um longo período de tempo (ver documentos 2 a 4 fora das patentes). 2

Em relação aos efeitos da terapia das DP, utilizando fármacos que tenham efeitos inibidores na produção de oxigénio activo, não há estudos clínicos fiáveis que tenham sido realizados.

De acordo com um estudo clínico, a N-acetilcisteína, um antioxidante que é considerado como tendo um mecanismo de acção semelhante ao dos agentes para a inibição da produção de oxigénio activo, pode reduzir a frequência da exacerbação aguda da DPOC (documento 5 fora das patentes). No entanto, não há documentos que relatem que a N-acetil-cisteína exibe um efeito de diminuição da deterioração da função pulmonar durante um longo período de tempo.

Além disso, para o tratamento das DP, tem sido discutida a utilização de fármacos que inibem a actividade da fosfodiesterase IV. No entanto, relata-se que estes fármacos têm efeitos colaterais adversos, tais como náuseas, vómitos e secreção de ácido gástrico (documento 6 fora das patentes).

Tal como descrito antes, nenhum fármaco alcançou um desempenho satisfatório como um fármaco para o tratamento de doenças pulmonares crónicas e têm sido desenvolvidos fármacos que diminuam a degradação irreversível da função pulmonar, ou seja, que inibem o alargamento anormal do espaço aéreo alveolar associado a alterações destrutivas das paredes alveolares devido à sua lesão crónica e/ou que inibam as alterações destrutivas das paredes alveolares. 3

Lista de citações

Literatura de patentes LPT 1: W01996/3942 LPT 2: W01999/2157 LPT 3: patente japonesa n°. 3018186. LPT 4: patente japonesa n°.4147220. LPT 5: patente japonesa não examinada n°. 2004-16074 Literatura fora de patentes LNP 1: Pauwell, R.A.et.al, Am. J. Respir. Crit. CareMed., 2001 (163), 1256-1276 LNP 2: Pauwels RA, Lodahl CG, Laitinen LA, Schouten JP, Postma DS, Pride NB, et al. N. Engl J. Med., 1999 (340), 1948-1953 LNP 3: Vestbo J, Sorensen T, Lange P,Brix A,Torre P, Viskum K, Lancet, 1999 (353) 1819-1823 LNP 4: Burge PS, Calverley PM, Jones PW, Spencer S, Anderson JA, Maslen TK, BMJ, 2000 (320), 1297-1303 LNP 5: C. Stey, J. Steurer, S. Bachmann, T. C. Mediei, M. R. Tramer, Eur. Respir. J., 2000 (16), 253-262 LNP 6: Peter J. Barnes, N. Engl. J. Med., 2000 (343) No. 4, 269-280 LNP 7: Maeda, K. et al., Biocjem. Biophys. Res. Commun., 1996 (221), 286-289

SUMÁRIO DA INVENÇÃO O problema técnico consiste em é útil para o O objecto da presente invenção proporcionar um fármaco altamente seguro que 4 tratamento de um doente com doença pulmonar cuja função pulmonar está irreversivelmente deteriorada.

Solução para o problema

Os requerentes prepararam um modelo animal que apresenta características patogénicas clinicamente muito similares à DPOC acompanhada de uma deterioração irreversível da função pulmonar e realizaram uma extensa pesquisa utilizando este modelo animal. Como resultado, verificaram que a adiponectina, que é conhecida como uma proteina secretora semelhante ao colagéneo, segregada especificamente de células adiposas, inibe o enfisema pulmonar e os distúrbios da função pulmonar causados por tratamento com elastase e chegaram a um novo agente terapêutico altamente seguro que exibe um efeito extremamente elevado no tratamento da doença pulmonar associada a deterioração irreversível da função pulmonar, com menos efeitos secundários adversos, tais como náuseas, vómitos e secreção de ácido gástrico. A presente invenção foi realizada com base nestas constatações. A presente invenção tem por objecto um agente contendo adiponectina, para a inibição do alargamento alveolar do espaço aéreo e um agente contendo adiponectina para inibir a destruição da parede alveolar.

Item 1. Um agente para inibir o alargamento do espaço aéreo alveolar, contendo adiponectina.

Item 2. 0 agente de acordo com o item 1, em que a adiponectina está contido numa quantidade eficaz para inibir o alargamento do espaço aéreo alveolar associado a uma alteração destrutiva de uma parede alveolar. 5

Item 3. 0 agente de acordo com o item 1 ou 2, em que a adiponectina está contido numa quantidade de 0,01 a 70 % em peso.

Item 4. O agente de acordo com um qualquer dos itens 1 a 3, para utilização no tratamento de enfisema, bronquite crónica, fibrose quística, bronquiectasias, tuberculose, pneumoconiose ou doença pulmonar obstrutiva crónica.

Item 5. Um agente para inibir a destruição da parede alveolar, contendo adiponectina.

Item 6. O agente de acordo com o item 5, em que a adiponectina está contida numa quantidade eficaz para inibir uma alteração destrutiva de uma parede alveolar.

Item 7. O agente de acordo com um qualquer dos itens 5 ou 6, em que a adiponectina está contido numa quantidade de 0,01 a 70 % em peso.

Item 8. O agente de acordo com um qualquer dos itens 5 a 7, para utilização no tratamento de enfisema, bronquite crónica, fibrose quística, bronquiectasias, tuberculose, pneumoconiose ou doença pulmonar obstrutiva crónica. O agente para inibir o alargamento do espaço aéreo alveolar da presente invenção contém adiponectina numa quantidade eficaz para inibir o alargamento do espaço aéreo alveolar associada a alterações destrutivas das paredes alveolares e o agente para inibir a destruição da parede alveolar da presente invenção contém adiponectina numa 6 quantidade eficaz para inibir a destruição das paredes alveolares. A adiponectina, que é um principio activo do agente para inibir o alargamento do espaço aéreo alveolar ou do agente para inibir a destruição da parede alveolar da presente invenção é uma proteina semelhante ao colagénio segregada a partir de células adiposas. A adiponectina, que é um princípio activo do agente para inibir o alargamento do espaço aéreo alveolar ou o agente para inibir a destruição da parede alveolar (daqui em diante abreviado como "agentes terapêuticos de doenças pulmonares") da presente invenção é uma substância facilmente disponível e bem conhecida. A adiponectina comercialmente disponível ou a adiponectina preparado pelo processo conhecido, mostrado no exemplo de referência descrito a seguir podem ser usadas, de uma forma geral, na presente invenção.

Os genes de adiponectina de seres humanos e de rato humano estão descritos no documento 1 de patentes como um Acrp30 humano e um Acrp30 de rato e a adiponectina humana está descrita como apMl no documento 7 fora das patentes e no documento 2 das patentes. A sequência de aminoácidos prevista, do polipéptido adiponectina, como princípio activo, que utiliza os agentes terapêuticos das doenças pulmonares da presente invenção, está descrita no documento 2 das patentes; no entanto, o documento 2 das patentes refere-se apenas ao efeito inibidor do polipéptido no crescimento das células do músculo liso e a sua disponibilidade como um agente para a prevenção ou a melhoria da arteriosclerose, um agente para a prevenção ou 7 o tratamento da restenose após angioplastia e um agente anti-inflamatório.

Além disso, o documento 3 das patentes mostra a utilidade da adiponectina, que suprime, sem macrófagos ou linfócitos, o crescimento clonal de células progenitoras de monocitóides da medula relativamente maduros na fase de diferenciação, como um agente anti-inflamatório e um supressor da propagação de células monocitóides. Além disso, o documento 4 das patentes ensina que o dominio esférico do lado do terminal C da adiponectina (correspondentes às sequências de aminoácidos SEQ ID NOS: 114 a 239 da adiponectina humana e as sequências de aminoácidos SEQ ID NOS: 111-242 da adiponectina de rato) tem o efeito de diminuir a expressão do receptor A eliminador e pode ser utilizado como um agente preventivo e terapêutico para a arteriosclerose. Da mesma forma, o documento 5 das patentes refere-se à disponibilidade do dominio esférico do lado do terminal C de adiponectina como um activador da proteina-cinase activada por AMP.

As adiponectinas que se seguem estão comercialmente disponíveis na Bio Vendor (Checoslováquia; http://www.biovendor.com/products/proteins): adiponectina recombinante globular (adiponectina globular humana (E. coli)), adiponectina recombinante produzida a partir de E. coli (adiponectina humana E. coli His), adiponectina recombinante produzido a partir de células de rim embrionário humano (adiponectina humana HEK293 Flag), adiponectina recombinante trimérica produzida a partir de células embrionárias do rim (forma trimérica de adiponectina humana (HEK)), adiponectina de baixo e elevado peso molecular produzida a partir de células humanas embrionárias de rim (adiponectina humana BPM e EPM rica em oligómero (HEK)), adiponectina de médio e elevado peso molecular produzido a partir de células embrionárias de rim humano (adiponectina humana MPM e EPM rica em oligómero (HEK)), etc.

Um exemplo especifico do polipéptido utilizado nos agentes terapêuticos das doenças pulmonares da presente invenção, como ingrediente activo, é um polipéptido conhecido como "adiponectina", codificado pelo produto de RCP e mostrado nos exemplos descritos a seguir. A sequência de ADN de comprimento completo de adiponectina humana tem 4517 pb de comprimento e a sequência de ADN que codifica um quadro de leitura aberta (QLA) tem 732 pb de comprimento, como se mostra na SEQ ID NO: 2. A sequência de aminoácidos codificada pelo QLA é composta por 244 sequências de aminoácidos, como se mostra na SEQ ID NO: 1 e a sequência do gene foi registada como o número de acesso do GenBank NM_004797. Além disso, a sequência de ADN, de comprimento completo, da adiponectina de rato tem 1 276 pb de comprimento, como se mostra na SEQ ID NO: 5 e a sequência de ADN que codifica o QLA tem 741 pb de comprimento, como se mostra na SEQ ID NO: 4. A sequência de aminoácidos codificada pelo QLA é composta por 247 sequências de aminoácidos, como se mostra na SEQ ID NO: 3 e a sequência do gene foi registada como o número de acesso do GenBank AF304466. Além disso, tem sido reconhecida a expressão do gene da adiponectina humana e de murganho, especifica para o tecido adiposo. A homologia da sequência de aminoácidos entre a adiponectina humana e a adiponectina de murganho é de 83,61 % e a homologia da sequência de ADN do QLA é de 7 9, 78 %. Um grau de homologia tão extraordinariamente elevado significa que ambas têm a mesma actividade. 9

Os requerentes verificaram que a adiponectina inibe o alargamento anormal do espaço aéreo alveolar associado a alterações destrutivas das paredes alveolares devido a lesão crónica ou implica a melhoria da função pulmonar alcançada pela inibição de alterações destrutivas das paredes alveolares e concluíram que a adiponectina pode ser utilizada preferencialmente como um fármaco.

Tal como descrito antes, uma vez que a adiponectina pode inibir o alargamento anormal do espaço aéreo alveolar associado a alterações destrutivas das paredes alveolares devido a lesão crónica, pode ser utilizada para o tratamento de doenças pulmonares, tais como o enfisema, bronquite crónica, fibrose quistica, bronquiectasias, tuberculose, pneumoconiose e DPOC.

Documento 1 de patentes: W01996/39429 Documento 2 de patentes: W01999/21577

Documento 7 não pertencente a patentes: Maeda, K. et al., B.B.R.C., (1996) Vol. 221 No.2, pp 86-289 A produção de adiponectina para utilização como ingrediente activo dos agentes terapêuticos de doenças pulmonares da presente invenção, a preparação de agentes terapêuticos de doenças pulmonares que utilizam adiponectina como ingrediente activo, etc., vão ser agora descritas.

A designação de aminoácidos, péptidos, sequências de nucleótidos, ácidos nucleicos, etc. por abreviaturas, nesta memória descritiva, está em conformidade com as regras de nomenclatura recomendadas pela IUPAC-IUB (IUPAC-IUB comunicação sobre Nomenclatura Biológica, Eur. J. Biochem., 138, 9 (1984)), "The Guidelines for Drafting of 10

Specifications Etc. Containing Nucleotide Sequence or Amino Acid Sequence Information" (Editado pelo Instituto japonês de patentes, (Julho, 1998) e as convenções em âmbitos relevantes desta técnica. A adiponectina pode ser fornecida sob a forma de uma proteína recombinante, por meio de técnicas de engenharia genética estabelecidas [por exemplo, Science, 224, 1431 (1984): Biochem. Biophys. Res. Comm., 130, 692 (1985); Proc. Natl. Acad. Sei., USA., 80, 5990 (1983)]. Neste caso, tal como o gene de adiponectina (apMl), pode-se utilizar o gene que foi anteriormente estabelecido pelos requerentes [Biochem. Biophys. Res. Commun., 221, 286-289 [1996]

Como alternativa, a adiponectina pode ser produzida pelo processo convencional para a síntese química de acordo com a informação sobre a sequência de aminoácidos codificada pelo referido gene. A produção de adiponectina, por uma técnica de engenharia genética, pode ser realizada de acordo com um processo descrito no exemplo de referência 1 a seguir. Mais especificamente, a produção compreende a produção de um ADN recombinante, com a qual o gene que codifica para a proteína objectivo pode ser expresso numa célula hospedeira, introduzindo o ADN na célula hospedeira para se obter um transformante e fazendo a cultura do transformante.

Na presente memória descritiva, um polinucleótido (molécula de ADN), abrange não só o ADN de cadeia dupla, mas também o ADN de cadeia simples, incluindo as cadeias paralelas e anti-paralelas que os compõem e não está limitado a um determinado comprimento. Assim, o 11 polinucleótido que codifica a adiponectina inclui o ADN de cadeia dupla, incluindo ADN genómico e o ADN de cadeia única (cadeia paralela) incluindo ADNc e o ADN de cadeia única (cadeia anti-paralela) que tem a sequência complementar da cadeia paralela e fragmentos de ADN sintéticos, salvo indicação em contrário. 0 polinucleótido (molécula de ADN), não é definido aqui por uma região funcional e pode incluir pelo menos uma das regiões de supressão de expressão, uma região de codificação, uma sequência lider, um exão e um intrão. 0 polinucleótido também inclui ARN e ADN. 0 polipéptido compreende a sequência de aminoácidos determinada e o polinucleótido compreende a sequência de ADN que inclui os seus fragmentos, homólogos, derivados e mutantes.

Os mutantes do polinucleótido (ADN mutante) incluem mutantes alélicos de ocorrência natural, mutantes que não ocorrem naturalmente e mutantes com eliminações, substituições, adições e inserções. Mas, estes mutantes que codificam o polipéptido têm praticamente a mesma função que a função do polipéptido codificado pelo polinucleótido antes da mutação. Não é necessário que ocorra a mutação do polipéptido (modificação da sequência de aminoácidos) por ocorrência natural, por exemplo, a mutação ou modificação pós-translacional e podem ser as feitas artificialmente, utilizando a proteina de ocorrência natural (por exemplo, adiponectina humana). Os mutantes anteriores do poliptido incluem variantes alélicas, homólogos e mutantes naturais que possuem pelo menos 80 %, preferencialmente 95 % e mais 12 preferivelmente 99 % de homologia com o polipéptido, antes da mutação. A homologia do polipéptido ou do polinucleótido pode ser analisada através da medição utilizando o programa FASTA (Clustal, V., Methods Mol. Biol., 25, 307-318(1994)). Como processo mais simples e preferido para a análise de homologia, é possível exemplificar o processo no qual a sequência é armazenada num suporte (por exemplo, disco flexível, CD-ROM, disco duro, unidade de disco externo, DVD, etc.) capaz de ser lido por computador e, em seguida, pesquisa-se a base de dados de sequências conhecidas, de acordo com o procedimento de pesquisa bem conhecido, usando a sequência armazenada. Exemplos específicos da base de dados de sequências conhecida incluem os seguintes:

Base de dados de ADN do Japão (DDBJ) (http://www.ddbj.nig.ac.jp/);

Genebank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/web/Genebank/Index.htlm); e a European Molecular Biology Laboratory Nucleic Acid Sequence Database (EMBL) (http://www.ebi.ac.uk/ebi docs/embl db.html). Há muitos algoritmos de pesquisa de homologia para a análise da homologia disponíveis para aqueles especialista na matéria. Um exemplo inclui um programa chamado como programa BLAST. Há 5 procedimentos de BLAST neste programa. Três deles (BLASTN, BLASTX e TBLASTX) foram concebidos para a verificação da sequência de nucleótidos. Os dois restantes foram concebidos para a verificação da sequência de proteínas (Coulson, Trends in Biotechnology, 12: 76-80 13 (1994); Birren, et al., Genome Analysis, 1: 543-559 (1997)).

Além disso, estão disponíveis na técnica programas adicionais, por exemplo, um programa de alinhamento de sequências e um programa para identificar as sequências mais distantemente separadas para a análise da sequência identificada. 0 ADN mutante é silencioso (não há alteração num resíduo de aminoácido codificado por uma sequência de ácido nucleico mutado) ou conservador para os aminoácidos codificada por este. A seguir mostram-se exemplos de substituições conservadoras de aminoácidos.

Resíduo original de aminoácido Resíduo de aminoácido substituído de forma conservadora.

Ala Ser Arg Lis Asn Gin OU His Asp Glu Cis Ser Gin Asn Glu Asp Gli Pro His Asn OU Gin lie Leu ou Vai Leu lie ou Vai Lis Arg, Asn ou Glu Met Leu OU lie Fen Met, Leu ou Tir Ser Tre Tre Ser Trp Tir Tir Trp OU Fen Vai lie ou Leu

Geralmente, um ou mais codões que codificam um resíduo de Cis afecta uma ligação de dissulfureto do polipéptido particular.

Pensa-se que a substituição do resíduo de aminoácido que geralmente afecta as características da proteína inclui o seguinte: 14 a) a substituição de um resíduo hidrófobo por um resíduo hidrófilo, por exemplo, a substituição de Leu, Ile, Fen, Vai ou Ala com Ser ou Tre; b) a substituição do resíduo de aminoácido excepto com Cis e Pro com Cis ou Pro; c) a substituição do resíduo possuindo uma cadeia lateral electricamente positiva, por exemplo, Lis, Arg ou His, com um resíduo electricamente negativo, por exemplo, Glu ou Asp; e d) a substituição do resíduo de aminoácido com uma cadeia lateral muito grande, por exemplo, Fen com o resíduo de aminoácido não tendo cadeia lateral, por exemplo, Gli. A adiponectina compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 ou 3 ou a sequência de aminoácidos que possui uma ou mais eliminações, inserções, substituições ou adições de aminoácidos na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 ou 3 e tem uma actividade inibidora do alargamento do espaço aéreo alveolar e/ou um efeito de melhoria da função pulmonar. A adiponectina pode ser o polipéptido expresso num sistema de expressão de proteínas utilizando Escherichia coli ou um sistema de expressão de proteínas utilizando baculovírus (AcNPV) mostrado nos exemplos descritos a seguir, por tecnologia de recombinação genética ou o polipéptido obtido por síntese química.

Como exemplo específico da sequência de aminoácidos de adiponectina, é possível exemplificar uma das SEQ ID NO: 1 ou 3. A sequência de aminoácidos de adiponectina não se limita a uma das SEQ ID NO: 1 ou 3 e podem ser uma das que 15 (homólogas) tem uma certa homologia com a mesma. Os homólogos podem incluir os polipéptidos compreendendo a sequência de aminoácidos que possui uma ou mais eliminações, inserções, substituições ou adições de aminoácidos, na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 ou 3 e possuindo uma actividade inibidora do alargamento do espaço aéreo alveolar e/ou a actividade inibidora da destruição da parede alveolar e o efeito de melhoria da função pulmonar (a actividade de inibir o alargamento anormal do espaço aéreo alveolar associada a alterações destrutivas das paredes alveolares devido a lesão crónica e/ou a actividade de inibição de alterações destrutivas das paredes alveolares).

Especificamente, os efeitos de melhoria da função pulmonar por meio da adiponectina incluem um efeito de melhoria ou de redução de uma diminuição da capacidade dos pulmões para respirar ou um aumento na resistência à respiração num tracto respiratório (em especial o tracto broncoalveolar) de mamíferos, tal como seres humanos.

Como célula hospedeira, podem-se utilizar as células derivadas de eucariotos e de procariotos. A célula eucariótica inclui células de vertebrados e células de microrganismos eucarióticos. Como célula de um vertebrado, as linhas celulares COS de macaco (Cell, 23, 175 (1981)), a linha de células de ovário de hamster chinês e a linha de células correspondente deficiente em di-hidrofolato-redutase Natl. Acad. Sei., EUA., 77, 4216 (1980)) e similares são frequentemente usadas, mas não são escolhas exclusivas.

Como vector de expressão com origem num animal vertebrado, um vector com uma sequência de promotor 16 localizado a montante do gene a ser expresso, pode-se utilizar um sítio de corte de ARN (precursor), um local de poliadenilação e uma sequência de terminação da transcrição. Se necessário, o vector pode ainda ter uma origem de replicação. Como exemplo desse vector de expressão, pode mencionar-se pSV2dhfr comportando um promotor precoce de SV40 (Mol. Cell. Biol., 1, 854 (1981)).

Como microrganismos eucarióticos, geralmente utilizam-se leveduras. Destes, as leveduras do género Saccharomyces podem ser usadas com vantagem. Como vector de expressão derivado de um microrganismo eucariótico, tal como uma levedura, pode-se utilizar pAM82 tendo um promotor para o gene de fosfatase ácida (Proc. Natl. Acad. Sei., EUA, 80, 1 (1983)).

Como hospedeiro procariótico utiliza-se geralmente Escherichia coli e Bacillus subtilis. Quando são utilizados como hospedeiros, utilizando um vector de plasmido capaz de se replicar no microorganismo hospedeiro, é possível utilizar convenientemente um plasmido de expressão obtido por incorporação de um promotor e uma sequência de SD (Shain e Dalgarano) e um codão de iniciação (por exemplo, ATG) necessário para a iniciação da síntese das proteínas a montante do gene de modo que o gene pode ser expresso neste vector. Como referido, a Escherichia coli como hospedeiro, utiliza-se geralmente a K12 de E. coli e, como vector, utiliza-se geralmente o pBR322 ou o produto da sua modificação. No entanto, não se trata de escolhas exclusivas, mas também se podem utilizar as diversas estirpes bacterianas e vectores. Exemplos do promotor que pode ser utilizado são promotor de triptofano (trp), o promotor lpp, o promotor lac e o promotor PL/PR. 17

Como vector para células de insecto, pode-se exemplificar um vector de baculovirus (Takara), no qual se incorporou ADNc de adiponectina. Especificamente, o produto expresso da presente invenção pode ser obtido através da introdução do vector de expressão de baculovirus em que tenha sido incorporado o ADNc de adiponectina que tem sido incorporado, em células BmN4 de cultura ou larvas de bicho-da-seda (Bombyx morl) utilizando um virus de poliedrose nuclear (BmNPV) do bicho-da-seda para expressar e isolar a partir de um meio de cultura ou de um fluido corporal do bicho-da-seda, por cromatografia. 0 produto expresso da presente invenção também pode ser obtido através da incorporação do ADNc de adiponectina no virus da poliedrose nuclear (AcNPV) deAutographa californica, que o expressa em células Sf9 de Spodoptera frugiperda ou células de Tn5 deTrichoplusia ni e também a purificado a partir de um sobrenadante de cultura, por cromatografia. A introdução do ADN recombinante resultante na célula hospedeira para a transformação pode ser efectuada de acordo com o processo conhecido. 0 transformante resultante pode ser posto em cultura de acordo com processos convencionais, em que a proteina recombinante objectivo é expressa e produzida (acumulada ou segregada) intracelularmente, extracelularmente ou na membrana celular. Como meio utilizado para a cultura, podem ser utilizados vários meios adequadamente seleccionado e utilizado de acordo com a célula hospedeira usada. A cultura pode também ser realizada em condições adequadas para o crescimento da célula hospedeira. 18

Se necessário, a adiponectina obtida do modo anterior pode ser isolada e purificada por meio de diversos procedimentos de separação, utilizando as suas caracteristicas físicas, químicas e outras (Biochemical Data Book II, 1175-1259, primeira edição, Ia impressão, 23 de Junho de 1980, publicado por Tokyo Kagaku Dojin, K.K.; Biochemistry, 25 (25), 8274 (1986); Eur. J. Biochem., 163, 313 (1987), etc.). Mais especificamente, os referidos isolamento e purificação podem ser conseguidos pelo tratamento de reconstituição convencional, o tratamento com um um agente de precipitação de proteínas (coagulação), centrifugação, processo de choque por pressão osmótica, tratamento com ultra-sons, ultrafiltração, vários tipos de cromatografia em líquido, tal como a cromatografia de peneiro molecular (filtração em gel), cromatografia de adsorção, cromatografia de permuta iónica, cromatografia por afinidade, cromatografia líquida de alta resolução (CLAR), etc. e diálise utilizados isoladamente ou em combinação.

Alternativamente, a adiponectina mencionados antes também pode ser produzida pelo processo geral para a síntese química baseado na informação da sequência de aminoácidos. O processo inclui os processos convencionais em fase líquida e em fase sólida para a síntese de péptidos. Em mais pormenor, cada um destes processos inclui a chamada técnica de alongamento por etapas, que compreende a condensação da componente de aminoácidos uma após a outra para a extensão da cadeia de acordo com a informação da sequência de aminoácidos e a técnica de condensação de fragmentos, que compreende a síntese de péptidos de fragmentos cada um constituído por várias resíduos de aminoácidos em avanço e acoplando-os em conjunto, um após o outro, de acordo com a referida informação. 19

Um processo de condensação utilizado para a sintese de péptidos também pode ser realizado em conformidade com os processos convencionais. Exemplos de processos-padrão incluem um processo com azida, um processo de anidro ácido misto, um processo de DCC, um processo com éster activo, um processo de oxidação e redução, a um processo com DPPA (difenilfosforilazida), um processo com DDC + aditivo (1-hidroxibenzotriazole N-hidroxisuccinamida, N-hidroxi-5-norborneno-2, 3-dicarboxi-imida) e o processo de Woodward. 0 dissolvente que pode ser utilizado nesses processos pode ser adequadamente seleccionado entre dissolventes que são bem conhecidos por serem de utilização em reacções de condensação de formação de péptidos. Exemplos destes dissolventes incluem N,N-dimetilformamida (DMF) , dimetil-sulfóxido (DMSO), hexafosforamida, dioxano, tetra-hidro-furano (THF), acetato de etilo, etc. e as suas misturas.

Após a reacção de sintese de péptidos anterior, o aminoácido que não está envolvido na reacção ou o grupo carboxilo do péptido pode ser protegido com um éster de alquilo inferior, tal como éster metilico, éster etílico e éster de terc-butilo e éster de aralquilo, tal como éster de benzilo, éster de p-metoxibenzilo e éster de p-nitrobenzilo, geralmente por esterificação. 0 grupo hidroxilo de um amino ácido tal como um resíduo de tirosina que possui um grupo funcional na cadeia lateral pode ser protegido com acetilo, benzilo, benziloxicarbonilo, terc-butilo ou similar, embora esta protecção não seja necessariamente indispensável. 20

Além disso, o grupo guanidino de um resíduo de arginina pode ser protegido com um grupo de protecção adequado, tal como nitro, tosilo, p-metoxibenzenos-sulfonilo, metileno-2-sulfonilo, benziloxicarbonilo, iso-borniloxicarbonilo ou adamantiloxicarbonilo.

As reacções para a eliminação desses grupos protectores dos aminoácidos ou péptidos protegidos ou a partir da proteína final, podem ser efectuadas em conformidade com os processos vulgarmente utilizados, tais como um processo de redução catalítica ou um processo utilizando amoníaco líquido/metal de sódio, ácido fluorídrico, ácido bromídrico, ácido clorídrico, ácido trifluoroacético, ácido acético, ácido fórmico ou ácido metanossulfónico e similares. A adiponectina assim obtida pode ser purificada por meio de vários processos, tais como processos que utilizam uma resina de permuta iónica, cromatografia de partição e a cromatografia em gel e um processo de distribuição em contra-corrente normalmente utilizado no campo da química de péptidos.

Os agentes terapêuticos de doenças pulmonares da presente invenção compreendem, como princípio activo, a adiponectina ou um seu sal aceitável sob o ponto de vista farmacológico. 0 sal inclui sais com metais alcalinos, metais alcalino-terrosos e amónio, tais como sais de sódio, potássio, lítio, cálcio, magnésio, bário e amónio. Estes sais podem ser produzidos por processos bem conhecidos na técnica. 0 sal mencionado antes inclui ainda sais de adição de ácido que podem ser preparados por reacção de adiponectina com um ácido orgânico ou inorgânico adequado, numa forma conhecida per se. Exemplos de sais de adição de 21 ácido são o cloridrato, bromidrato, sulfato, bissulfato, acetato, oxalato, valerato, oleato, laurato, borato, benzoato, lactato, fosfato, p-toluenossulfonato (tosilato), citrato, maleato, fumarato, succinato, tartarato, sulfonato, glicolato, ascorbato, benzenossulfonato, napsilato e sais similares.

Os agentes terapêuticos de doenças pulmonares da presente invenção são geralmente fornecidas e colocadas em uso, sob a forma de uma preparação farmacêutica contendo uma quantidade eficaz, sob o ponto de vista farmacológico, do principio activo em conjunto com um veiculo apropriado sob o ponto de vista farmacêutico. 0 veiculo que pode ser utilizado nessas preparações farmacêuticas inclui vários diluentes e/ou excipientes, tais como cargas, extensores, ligantes, humectantes, desintegrantes, tensioactivos, lubrificantes e similares. Estes veiculos são eventualmente utilizados de acordo com uma forma farmacêutica unitária da formulação resultante.

As formas farmacêuticas unitárias das preparações farmacêuticas podem ser seleccionadas de várias formas de acordo com o objectivo da terapia. Exemplos típicos incluem formas sólidas tais como comprimidos, pílulas, pós, pós finos, grânulos e cápsulas e formas líquidas, tais como soluções, suspensões, emulsões, xaropes e elixires. Estas preparações são classificadas, por via de administração, em preparações orais, preparações parentéricas, preparações trans-nasais, preparações vaginais, supositórios rectais, comprimidos sublinguais, pomadas e similares e cada uma pode ser formulada e moldada ou de outro modo tratada por um procedimento farmacêutica estabelecido. Além disso, essas preparações farmacêuticas podem conter vários 22 aditivos que podem ser formulados em preparações farmacêuticas comuns, tais como estabilizantes, agentes antibacterianos, tampões, agentes de isotonicidade, agentes quelantes, agentes de controlo do pH e agentes tensioactivos. 0 estabilizante inclui albumina do soro humano e L-aminoácidos, sacáridos e derivados de celulose. Podem ser utilizados isoladamente ou em combinação com um agente tensioactivo ou similar. Particularmente, uma tal combinação pode contribuir para uma maior estabilidade do principio activo.

Os L-aminoácidos não estão particularmente limitados e incluem glicina, cisteina, ácido glutâmico, etc.

Os sacáridos não estão particularmente limitados, mas incluem monossacáridos tais como glicose, manose, galactose e frutose; álcoois de açúcar, tais como manitol, inositol e xilitol; dissacáridos tais como sacarose, maltose e lactose; e polissacáridos tais como dextrano, hidroxi-propil-amido, sulfato de condroitina e ácido hialurónico e os seus derivados.

Os agentes tensioactivos não estão particularmente limitados e podem utilizar-se tensioactivos iónicos e não iónicos. Exemplos de tensioactivos são ésteres de alquilo, sorbitano e polioxietileno-glicol, éteres alquilicos e de polioxietileno, ésteres de sorbitano e monoacilo e glicéridos de ácidos gordos.

Os derivados de celulose não estão particularmente limitados, mas incluem metilcelulose, etilcelulose, hidroxietilcelulose, hidroxipropilcelulose, hidroxipropil-metilcelulose, carboximetilcelulose sódica, etc. 23

Os sacáridos podem ser usados, num valor de pelo menos cerca de 0,0001 mg e, de preferência, dentro da gama de cerca de 0,01 a cerca de 10 mg por 1 yg de princípio activo. Os tensioactivos podem ser usados, num valor de pelo menos cerca de 0,00001 mg e, de preferência, dentro da gama de cerca de 0,0001 a cerca de 0,01 mg por 1 yg de princípio activo. A albumina de soro humano pode ser usada num valor de pelo menos cerca de 0,0001 mg e, de preferência, dentro da gama de cerca de 0,001 a cerca de 0,1 mg por 1 yg de princípio activo. Os aminoácidos podem ser usados dentro de um intervalo de pelo menos cerca de 0,001 e cerca de 10 mg por 1 yg de princípio activo. Os derivados de celulose podem ser usados, num valor de pelo menos cerca de 0,00001 mg e, de preferência, dentro da gama de cerca de 0,0 01 a cerca de 0,1 mg por 1 yg de princípio activo. A quantidade do princípio activo contida nas preparações farmacêuticas da presente invenção pode ser adequadamente seleccionada numa ampla gama. É adequado que a quantidade de princípio activo seja normalmente de cerca de 0,00001 a cerca de 70 % em peso e, de preferênci,a cerca de 0,0001 a cerca de 5 % em peso. O tampão que pode ser eventualmente incorporado nas preparações farmacêuticas inclui ácido bórico, ácido fosfórico, ácido acético, ácido cítrico, ácido ε-amino-capróico, ácido glutâmico e os seus sais correspondentes (por exemplo, sais com metais alcalinos ou metais alcalino-terrosos, tais como sais de sódio, potássio, cálcio magnésio). O agente de isotonicidade inclui cloreto de sódio, cloreto de potássio, açúcares e glicerina. O agente quelante inclui edetato de sódio e ácido cítrico. 24

As preparações farmacêuticas da presente invenção podem ser preparadas como uma preparação liquida e, adicionalmente, podem ser transformadas num forma posológica liofilizada obtida por liofilizaçao da formulação farmacêutica, a qual é preparada numa concentração apropriada para ser utilizada por dissolução num tampão contendo solução salina.

Na moldagem da composição farmacêutica da presente invenção, para a forma de um comprimido, podem ser utilizados como veículos, vários excipientes, tais como lactose, sacarose, cloreto de sódio, glicose, ureia, amido, carbonato de cálcio, caulino, celulose cristalina, ácido silícico e fosfato de potássio; ligantes tais como água, etanol, propanol, xarope simples, solução de glicose, solução de amido, solução de gelatina, carboximetil-celulose, hidroxipropil-celulose, metil-celulose e polivinil-pirrolidona; agentes desintegrantes, tais como carboximetil-celulose sódica, carboximetil-celulose de cálcio, hidroxipropil-celulose pouco substituída, amido anidro, alginato de sódio, pó de agar, pó de laminarano, hidrogeno-carbonato de sódio e carbonato de cálcio; tensioactivos tais como éster de ácido gordo de sorbitano e polioxietileno, sulfato de laurilo e sódio e monoglicérido de estearilo; inibidores de desintegração tais como sacarose, estearina, manteiga de cacau e óleo hidrogenado; promotores da absorção tais como base de amónio quaternário e sulfato de laurilo e sódio; humectantes tais como glicerina e amido; adsorventes tais como amido, lactose, caulino, bentonite e ácido silícico coloidal; e lubrificantes tais como talco purificado, sal de ácido esteárico, pó de ácido bórico e polietileno-glicol. 25

Além disso, se necessário, os comprimidos obtidos podem ser revestidos com os materiais de revestimento convencionais para preparar comprimidos revestidos com açúcar, comprimidos revestidos com gelatina, comprimidos entéricos, comprimidos revestidos com uma película ou comprimidos de camada dupla ou com várias camadas.

Os comprimidos podem ser preparados utilizando como veículo, excipientes tais como glicose, lactose, amido, manteiga de cacau, óleo vegetal hidrogenado, caulino e talco; ligantes tais como goma-arábica em pó, goma de tragacanta em pó, gelatina e etanol e agentes de desintegração tais como laminarano e agar.

Em geral, as cápsulas podem ser preparadas misturando o princípio activo com os veículos mencionados antes, de acordo com um processo usual para delimitar o princípio activo numa cápsula de gelatina dura, cápsula de gelatina mole ou similar. A preparação líquida para administração oral inclui soluções, emulsões, suspensões, xaropes e elixires. Cada uma pode ser preparada utilizando um diluente inerte convencional; por exemplo, um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacológico, inclusive água. A preparação líquida pode ser ainda complementada com vários agentes auxiliares, tais como um agentes de molhagem, um emulsionante e/ou um agente de suspensão e pode ser preparado pelo procedimento estabelecido. A preparação líquida para administração parentérica, por exemplo uma solução, emulsão ou suspensão, estéril, aquosa ou não aquosa de solução, pode ser preparada usando um diluente tal como água, álcool etílico, propileno- 26 glicol, polietileno-glicol, álcool isoestearilico etoxilado, álcool isoestearilico polioxilado, ésteres de ácidos gordos e sorbitano polietoxilados e óleos vegetais tais como azeite. A preparação liquida pode ser completada com um éster orgânico, que pode ser injectado ou infundido, tais como oleato de etilo. Essas preparações podem ainda ser completadas com um agente de solubilização, tampão, agente de molhagem, emulsionante, agente de suspensão, conservante, dispersante e outros aditivos.

Tais preparações farmacêuticas podem ser esterilizadas por filtração através de um filtro de bactérias, incorporação de um bactericida, tratamento por irradiação, tratamento com calor ou similar. Além disso, tais preparações farmacêuticas podem ser, cada uma, providenciadas sob a forma de uma composição sólida esterilizada, a qual pode ser dissolvida em água esterilizada ou num meio esterilizável apropriado para esterilização extemporânea.

Podem preparar-se supositórios rectais e preparações vaginais utilizando veiculos tais como o polietileno-glicol, manteiga de cacau, um álcool superior, um éster de álcool superior, gelatina e um glicérido semi-sintético.

As pomadas tais como pastas, cremes e géis podem ser preparados usando um diluente ou diluentes como vaselina branca, parafina, glicerina, derivados de celulose, propileno-glicol, polietileno-glicol, silicones, bentonite e óleos vegetais tais como azeite.

As preparações farmacêuticas para administração transnasal ou sublingual podem ser preparadas utilizando um excipiente-padrão bem conhecido ou excipientes na forma convencional. 27

Além disso, caso seja necessário, as preparações farmacêuticas da presente invenção podem ser completadas com agentes corantes, conservantes, perfumes, aromatizantes, adoçantes ou outras composições farmacêuticas. 0 processo para administrar a preparação farmacêutica não está limitado, mas é seleccionado de acordo com a forma de posológica, a idade do doente, o género e outras condições e o estado da doença. Por exemplo, os comprimidos, pílulas, soluções, suspensões, emulsões, grânulos e cápsulas são administrados oralmente. As injecções são administradas intravenosamente quer isoladamente ou em mistura com uma infusão comum, tal como glicose e aminoácido e, se necessário, administradas isoladamente por via intramuscular, intradérmica, subcutânea ou intraperitoneal. Os supositórios são administrados intra-rectalmente. As preparações vaginais são administradas pela vagina, as preparações nasais são administradas pelo nariz, as preparações sublinguais são administradas na cavidade oral, e as pomadas são administrados topicamente por via percutânea.

Para transformar o princípio activo da presente invenção, numa forma de pó, o ingrediente pode ser pulverizado de acordo com processos usuais. Por exemplo, o princípio activo pode ser pulverizado usando lactose, amido ou similar e, em seguida, agitado para se obter uma mistura homogénea.

Entre os processos de administração, a administração pulmonar (inalação) é mais vantajosa do que a administração por via oral, porque os alvéolos do pulmão são os órgãos-alvo do tratamento e a exposição directa ao local da lesão 28 do tecido alveolar é possível, o que evita efeitos secundários generalizados. A quantidade de adiponectina contida no agente terapêutico da presente invenção não está limitada e pode ser adequadamente seleccionada a partir de uma vasta gama. A adiponectina está geralmente contido numa quantidade de cerca de 0,01 a cerca de 70 % em peso, de preferência cerca de 0,1 a cerca de 50 % em peso e, mais preferivelmente, cerca de 0,3 a cerca de 30 % em peso na composição farmacêutica. A quantidade do princípio activo contida na preparação farmacêutica e a dosagem não estão particularmente limitadas, mas pode ser seleccionada numa vasta gama, de acordo com o efeito terapêutico desejado, o processo de administração, o período de tratamento e a idade do doente, o género e outras condições. A dosagem é geralmente seleccionada de modo que a concentração do princípio activo no sangue seja, de preferência, de cerca de 0,1 a cerca de 500 yg/ml e, mais preferivelmente, cerca de 1 a cerca de 50 yg/ml. Esta preparação pode ser administrada uma vez ou em algumas doses divididas, por dia. A dose de agente terapêutico da presente invenção selecciona-se, adequadamente, de acordo com o processo de utilização, a idade do doente, o género e outras condições e a gravidade da doença. A quantidade de adiponectina pode ser, geralmente, de cerca de 0,1 yg a cerca de 20 mg.

Efeitos vantajosos da invenção O agente contendo adiponectina para inibir o alargamento do espaço aéreo alveolar ou o agente contendo 29 adiponectina para inibir a destruição da parede alveolar, da presente invenção, possui um excelente efeito de diminuição da deterioração da função pulmonar, tal como a obstrução do fluxo de ar e é altamente eficaz para o tratamento de doenças pulmonares acompanhadas de deterioração irreversível da função pulmonar. 0 agente contendo adiponectina para inibir o alargamento do espaço aéreo alveolar ou o agente contendo adiponectina para inibir a destruição da parede alveolar da presente invenção é um fármaco altamente seguro com menos efeitos secundários adversos, tais como náuseas, vómitos, secreção de ácido gástrico, etc.

Breve descrição dos desenhos A fig. 1 representa um gráfico que mostra que a adiponectina tem uma actividade inibidora, dependente da dose, no alargamento do espaço aéreo alveolar, causada pelas palterações destrutivas progressivas das paredes alveolares. A fig. 2 mostra secções de tecidos indicando a progressão das alterações destrutivas das paredes alveolares e a actividade inibidora da adiponectina na destruição progressiva da parede alveolar.

Descrição das modalidades Exemplo de preparação 1 30 A composição farmacêutica da presente invenção na formulação injectável foi preparada adicionando e misturando 100 yg/mL de adiponectina humana (tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1), 0,01 mg/mL de

Tween 80 (polioxietileno (20) mono-oleato de sorbitano; polisorbato 80), 15 mg/mL de dextrano 40, 0,1 mg/mL de cisteina e 1,0 mg/ml de ASH), em tampão de citrato sódico de ácido citrico (pH 6,0), filtrando a mistura (utilizando um filtro de membrana de 0,22 ym), depois distribuindo o filtrado, de forma esterilizada, por frascos de 1 ml e iofilizando. A formulação pode ser usada dissolvendo-a em 1 ml de solução salina e utilizando-a.

Exemplo de preparação 2 A composição farmacêutica da presente invenção na formulação injectável foi preparada adicionando e misturando 10 yg/0,1 mL de adiponectina humana (tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1), 5 mg de ácido cisteico e 1 mg de albumina do soro humano (ASH) , por frasco, em água destilada para injecção, enchendo um frasco com a solução resultante, com 1 mL e liofilizando-a.

Exemplo de preparação 3 A composição farmacêutica da presente invenção, na formulação injectável, foi preparada por adição de 0,5 mg de adiponectina, 80 mg de cloreto de sódio, 20 mg de manitol, 34,5 mg de fosfato de sódio e 45 mg de PEG, em 10 ml de água destilada para injecção, seguido de filtração asséptica, distribuindo-se o filtrado, até 1 mL, num frasco asséptico e liofilizando-a.

Exemplo de referência 1 31

Produção de uma adiponectina humana recombinante (1) Expressão de adiponectina humana em Escherichia coli 1) RCP de adiponectina humana 0 gene de adiponectina humana e a sequência de aminoácidos por ele codificada foram assim depositados no GenBank com os números de acesso NM 004797 e D45371, respectivamente. A região de codificação (CDS) está ilustrada como a sequência desde a 27a à 761a das sequências de nucleótidos. A sequência de aminoácidos dela deduzida está ilustrada na SEQ ID NO: 1. Nesta sequência, os residuos 1 a 14 constituem um péptido sinal e os residuos 15 a 244 representam a adiponectina humana madura. 0 gene de adiponectina humana foi amplificado por RCP usando como matriz o plasmido doado pelo Dr. Funahashi, do segundo departamento de medicina interna, da Osaka University School of Medicine.

Foi feito de modo que a sequência de 693 pb, desde o 69° ao 761° nucleótido da sequência de adiponectina humana, fosse amplificada com um local Ndel na extremidade 5' e um sitio BamHI na extremidade 3', sendo os iniciadores de RCP produzidos através de um sintetizador automático de ADN. As sequências dos iniciadores de RCP estão ilustrtadas na SEQ ID NO: 6 (directa) e NO: 7 (inversa). 2) Subclonagem do gene de adiponectina humana (apMl) O produto de RCP obtido na etapa 1) anterior foi subclonado no vector pT7 Blue T (Novagen) e confirmou-se 32 que não havia nenhuma mutação na sua sequência de nucleótidos (pT7-apMl). 3) Preparação de um vector de expressão 0 vector de expressão pET3c (Novagen) foi digerido com Ndel e BamHI para recuperar um fragmento de aproximadamente 4600 pb. Por outro lado, o pT7-apMl obtido na etapa 1) anterior foi digerido com Ndel e BamHI para recuperar um fragmento de aproximadamente 700 pb. Estes fragmentos foram ligados e o vector de expressão assim obtido foi denominado pET3c-apMl. 4) Expressão em Escherichia coli A estirpe BL21(DE3)pLisS de E. coli hospedeira foi transformada com pET3c-APML produzida na etapa anterior 3) e posta em cultura em 2xT.Y.Amp. (16 g de triptona, 10 g de extracto de levedura e 5 g de NaCl) . Quando o organismo tiver entrado na fase de crescimento logarítmico, adiciona-se IPTG (isopropil-p-D-tiogalactopiranósido) para induzir a produção de uma adiponectina humana recombinante (apMl). As células de E. coli antes e após esta indução por IPTG e o corpo de inclusão (a fracção insolúvel de E. coli) depois da referida indução por IPTG foram recolhidas e submetidas a EGPA-SDS e a "Western blotting" para confirmar a expressão de adiponectina humana. 5) Resultados e discussão O produto de expressão em E. coli, obtido da forma descrita antes era uma proteína de 230 resíduos 33 correspondentes a 15Gli a 244Asn, exclusiva da sequência de sinal da sequência de aminoácidos de adiponectina humana, com a adição de Met derivado do codão de iniciação na extremidade do terminal N. A E. coli obtida pelo processo descrito antes foi analisada por EGPA-SDS. Como resultado, uma banda de aproximadamente 30 kD pode ser confirmada na célula de E. coli e do corpo de inclusão após a indução com IPTG.

Em seguida, realizou-se a análise por "Western blotting" utilizando dois tipos de anticorpos (anticorpos policlonais (péptidos sintéticos)). Ambos os anticorpos reagiram com a referida banda de aproximadamente 30 kD, ao passo que não se detectou nenhuma com a E. coli hospedeira. A banda anterior, de aproximadamente 30 kD, foi excisada para investigar a sequência dos seus 10 resíduos de aminoácidos no terminal N. A sequência era a mesma que a sequência esperada, com a supressão de Met do terminal N tendo sido encontrada uma população menor.

Tornou-se claro, dos resultados anteriores, que a adiponectina humana recombinante tinha sido expressa como uma proteína de aproximadamente 30 kD. A maior parte do adiponectina humana recombinante expressa tinha-se acumulado intracelularmente como um corpo de inclusão. (2) Purificação da adiponectina humana recombinante (apMl) a partir de E. coli 34 A purificação do adiponectina humana recombinante, a partir de E. coli, foi realizada pelo procedimento em 5 etapas que se segue. 1) Cultura de E. coli A BL21 (DE3) pLisS de E. coli (Novagen), transformada com o vector de expressão pET3c-apMl foi pré-cultivada em 2xT.Y.Amp.Cm. (16 g de triptona, 10 g de extracto de levedura, 25 yg/ml de cloranfenicol e 5 g de NaCl) (37 °C, cultura agitada). No dia seguinte, a cultura foi diluída com 100 volumes de 2xT.Y.Amp. e incubou-se. Após 2 a 3 horas de incubação, quando o valor da D055o do fluido da cultura se tornou 0,3 a 0,5, adicionou-se IPTG até a uma concentração final de 0,4 mM para induzir a produção de adiponectina humana recombinante (apMl). Cerca de 3 a 5 horas após a adição de IPTG, o fluido de cultura foi centrifugado (5000 rpm, 20 min., 4 °C) e o sedimento de E. coli assim obtido foi preservado por congelação. 2) Preparação de vim corpo de inclusão a partir de E. coli

Fez-se uma suspensão dos peletes de E. coli em Tris-HC1 50 mM (pH 8,0) e tratou-se com lisozima, a 37 °C, durante 1 hora. Em seguida, adicionou-se Triton X-100 (Katayama Kagaku) até a uma concentração final de 0,2 %.

Tratou-se esta solução com ultra-sons (Branson Sonifier, controle de saída 5, 30 seg.) e centrifugou-se (12 000 rpm, 30 min, 4 °C) e recuperaram-se os peletes. Este sedimento foi suspenso em 25 ml de Triton X-100 a 0,2 % completado com Tris-HCl 50 mM (pH 8,0) e a suspensão foi tratada com ultra-sons (nas mesmas condições que anteriormente). 35 A solução resultante foi centrifugada e o sedimento foi lavado pelo mesmo procedimento descrito antes. 0 sedimento assim obtido foi tomado como o corpo de inclusão. 3) Redobragem do corpo de inclusão 0 corpo de inclusão foi solubilizado com uma pequena quantidade de cloridrato de guanidina.HC1 7 M, Tris HC1 100 mM (pH 8,0) e 2ME a 1 %. Adicionou-se esta solução, gota a gota, a um volume maior 200 vezes de ureia 2 M, Tris-HCl 20 mM (pH 8,0), diluiu-se e deixou-se repousar, a 4 °C, durante 3 noites. 4) Concentração da solução redobrada A solução redobrada, após a redobragem anterior, foi centrifugada (9 000 rpm, 30 min, 4 °C) e o sobrenadante foi concentrado até cerca de 1/100 por ultrafiltração, usando uma membrana YM-10 da Amicon. Este concentrado foi dialisado contra Tris-HCl 20 mM (pH 8,0) e o produto dialisado foi filtrado através de um filtro de 0,45 ym.

5) CLAR de permuta aniónica com DEAE-5PW A amostra obtida na etapa 4) anterior foi isolada e purificada por cromatografia liquida de alta resolução (CLAR) de permuta aniónica com DEAE-5PW (Tosoh Corporation). Como tampão inicial, utilizou-se Tris-HCl 20 mM (pH 7,2) e fez-se a eluição com NaCl (gradiente de 0 -> 1 M de NaCl/60 ml), sob monitorização da absorvência a 280 nm. O produto eluido foi recolhido em fracções de 1 ml e cada fracção foi analisada por EGPA-SDS. 6) Resultados e discussão 36

Como a adiponectina humana recombinante (apMl) tinha sido expressa como um corpo de inclusão em E. coli, a sua purificação foi feita por solubilização e redobragem do corpo de inclusão. Como resultado, a adiponectina humana recombinante foi solubilizada e separada na coluna de permuta aniónica. As fracções de pico (fracções n° 30-37) foram analisados por EGPA-SDS. Como resultado, observou-se uma banda de aproximadamente 30 kD. Nesta análise, detectou-se uma banda de mancha ténue no fundo, mas como a maioria da proteína foi considerada como sendo adiponectina humana recombinante (apMl), esta banda de aproximadamente 30 kD (adiponectina humana recombinante) foi utilizada como antigénio na subsequente imunização de coelhos e ratos e como o princípio activo dos agentes terapêuticos de doenças pulmonares da presente invenção. (3) Preparação de anticorpos policlonais e monoclonais anti-adiponectina humana 1) Preparação do anticorpo policlonal A adiponectina humana recombinante, 100 pg/corpo, foi misturada com adjuvante completo numa proporção de 1:1 e imunizaram· -se 5 coelhos com a mistura, 8 vezes, a intervalos de 2 semanas, para se obter um anticorpo policlonal anti-adiponectina humano (códigos de identificação: OCT9101-OCT9105). 2) Preparação do anticorpo monoclonal A adiponectina humana recombinante, 20 pg/corpo, foi misturada com adjuvante completo, numa proporção de 1:1 e 37 os murganhos foram imunizados com a mistura, 3 vezes, a intervalos de 2 semanas. Em seguida, realizou-se a imunização final, sem o adjuvante, 3 dias antes da fusão celular. A fusão celular entre as células do baço do rato e as células de mieloma foi realizada pelo processo com PEG e seleccionou-se o hibridoma em meio HAT. 0 rastreio de uma linha de células produtora de anticorpos contra adiponectina humana foi realizado por ELISA, utilizando uma imuno-placa revestida com o antigénio (adiponectina humana recombinante) e clonou-se o hibridoma pelo processo de diluição limitativa.

Do mesmo modo, obtiveram-se 11 linhas de hibridoma que produzem o anticorpo anti-adiponectina humana, designadas por KOCO9101-KOCO9111. Depositou-se um hibridoma, entre os vários, no Instituto Nacional de Biociências e Tecnologia Humana, do Ministério de Comércio Internacional e da Indústria do Japão (NIBH, Higashi 1-1-3, Tsukuba-shi, Ibaraki, Japão) em 8 de Jun. de 1998 (data do depósito original) (código de identificação atribuído pelo Instituto de deposição: KOCO9108) e o pedido para conversão para o depósito sob o Tratado de Budapeste foi registado em 7 de Outubro de 1998. 0 número de acesso do depósito final é o seguinte: FERM BP-6542.

Os hibridomas, como clones individuais, foram administrados, respectivamente, intraperitonealmente, a ratinhos tratados antecipadamente com pristano e recolheu-se o fluido ascítico (código de identificação: ANOC9101-9111). 3) Purificação de anticorpos 38 0 anti-soro de coelho (anticorpo policlonal) e o fluido ascítico de rato (anticorpo monoclonal) foram purificados, respectivamente, utilizando uma coluna de proteína A. (4) Expressão de adiponectina humana em células de animais 0 ADNc da adiponectina foi excisado com EcoRI e inserido no sítio EcoRI do vector de expressão pClneo (Promega Corp.)· As células de COS-I (ATCC CRL1650) foram transfectadas com a adiponectina humana pClneo anterior utilizando LlipofectAMINE (GIBCO BRL) e colheu-se o sobrenadante da cultura e as células, após 72 horas. 5) "Western Blotting" da adiponectina humana

Em primeiro lugar, o extracto de tecido adiposo, as células COS-1, o sobrenadante da cultura de células COS-I, o plasma humano saudável e a adiponectina humana recombinante foram submetidos a EGPA-SDS 2ME(+) e transferidos para uma membrana de nitrocelulose.

Fez-se reagir esta membrana com o anticorpo monoclonal anti-adiponectina humana (ANOC9104) e, em seguida, com o anticorpo marcado com PRS (peroxidase de rábano silvestre) e fez-se a detecção com ECL (reagente de detecção de mancha de Western, Amersham).

Como resultado, detectou-se uma banda de, aproximadamente, 35 kD para o extracto de tecido adiposo, a célula de adiponectina humana pClneo/COS-1 e plasma de ser humano saudável, mas não se observou para células de pClneo/COS-1 ou o para sobrenadante da cultura de células de pClneo/COS-1. 39

Com o sobrenadante da cultura de células de adiponectin humana pClneo/COS-1, pôde-se confirmar uma banda de 35 kD, embora fosse demasiado fraca na sua intensidade para ser facilmente discernivel.

Exemplo de referência 2

Fez-se uma cultura, em larga escala, de células OHC que expressam adiponectina de murganho fundida com His-Tag do terminal N (clone n ° 5) e recolheu-se o sobrenadante resultante. Utilizando uma resina de Ni-NTA, purificou-se a adiponectina marcada com His.

Exemplo de referência 3 0 ADN de comprimento completo, como se mostra na SEQ NO: 5, de adiponectina ratinho, foi integrado num vector de expressão e expresso em E. coli, proporcionando uma grande quantidade de adiponectina de murganho expressa. 0 sobrenadante de E. coli desagregado foi aplicado a uma coluna aberta de DEAE-Sepharose e realizou-se a eluição utilizando NaCl num gradiente de 0 M a 1 M. As fracções eluidas foram então recolhidas e submetidas a fraccionamento com sulfato de amónio saturado a 30 %.

Aplicou-se o sobrenadante a uma coluna aberta de butilo da Toyopearl e a eluição foi realizada com um gradiente de 30 % a 0 % de sulfato de amónio saturado. Finalmente, fez-se a filtração em gel para purificar a adiponectina de murganho.

Exemplo 1 40

Usando modelos de murganhos (C57BL/6J) que tinham desenvolvido uma doença pulmonar como resultado do tratamento com elastase, examinou-se a adiponectina quanto aos efeitos terapêuticos na doença pulmonar obstrutiva crónica caracterizada pela limitação irreversível do fluxo de ar.

Uma vez destruídas as paredes alveolares do modelo de murganho por meio de uma administração intratraqueal, de uma só vez, de elastase, a destruição da parede alveolar continuou cronicamente depois, expandindo as lesões do enfisema (controlo na figura 2). Tais alterações estão indicadas pela intercepção linear média, que é um índice de avaliação geralmente utilizado (Dunnill, M.S. Thorax (1962) 17, p320-328) . 0 grau de destruição da parede alveolar é avaliado através da medição do tamanho dos alvéolos individuais.

Assim, no modelo de murganho, o tratamento com elastase provoca a destruição da parede alveolar, resultando assim na expansão do diâmetro alveolar, o que é equivalente a lesões de enfisema e a insuficiência da função pulmonar. A administração intratraqueal, de uma só vez, de elastase a murganhos resultou na destruição das paredes alveolares e num consequente colapso dos vasos sanguíneos, causando hemorragia transitória e infiltração de neutrófilos nos alvéolos; no entanto, esta inflamação desapareceu em três dias. Assim, na experiência, pode-se verificar que o efeito da adiponectina não deriva de uma acção inibidora da elastase. 41

Distribuíram-se 6 ratinhos fêmeas, com 7 semanas de idade (C57BL/6L, Japan Charles River Co., Ltd.), em 4 grupos (A a D, 6 murganhos por grupo) com base no peso do corpo, utilizando uma randomização estratificada (SAS Institute Japan, R8.1), como se mostra no quadro 1. Cada rato foi submetido a anestesia com pentobarbital.

Quadro 1

Grupo Tratamento com elastase Substância administrada (concentração) Dose de adiponectina (mg/rato) (50 μΐ) Número do ratos A Não realizada - - 6 B Realizada Solução salina normal - 6 C Realizada Adiponectina (0,02 mg/ml) 0,001 6 D Realizada Adiponectina (0,2 mg/ml) 0,01 6

Subsequentemente, usando um pulverizador (um produto da Penn Century Inc.), administrou-se, por via intratraqueal, através da laringe, uma solução de soro fisiológico (solução salina normal da Otsuka produzida pela Otsuka Pharmaceutical Factory Inc.) e elastase neutrófila humana (produzido por Elastin Products Co., Inc.), aos ratinhos do grupo A e aos murganhos dos grupos B a D, administrou-se, respecitivamente, um volume de 50 μΐ/rato. A dosagem de elastase foi de 20 U/rato. Três dias após a administração intratraqueal de elastase, administrou-se, intratraquealmente, adiponectina, uma vez por dia, durante 18 dias, aos ratinhos do grupo C, numa dose de 0,001 mg/ratinho e aos ratinhos do grupo D, numa dose de 0,01 mg/murganho. A adiponectina usada na administração foi obtida por dissolução, num dissolvente (Tris-HCl 50 mM (pH 8,0), NaCl 0,5 M) de adiponectina de murganho derivada de células OHC obtida no exemplo de referência 2 anterior. A adiponectina foi diluída com uma quantidade adequada de solução salina normal, até a uma concentração de 0,2 mg/ml ou 0,02 mg/ml em uso. As soluções de cada concentração foram divididas em unidades diárias de dosagem e 42 preservadas por congelação, a -20 °C, até à data de administração. No momento da utilização, descongelou-se a solução congelada. No grupo de controlo de elastase (grupo B) , administrou-se, no mesmo período, uma solução salina normal, em vez da adiponectina. A adiponectina ou a solução salina normal foram administradas por via intratraqueal, através da laringe do rato, sob anestesia por inalação de isoflurano, num volume de 50 μΐ/rato, usando um pulverizador. Após 18 dias de administração intratraqueal contínua, cada rato foi sacrificado por hemorragia da aorta abdominal, sob anestesia por inalação de isoflurano. O pulmão foi extirpado e submetido a fixação da perfusão com uma solução tamponada neutra de formalina a 10 %. O tecido pulmonar fixado foi então embebido em parafina, foi submetido a um seccionamento em camadas finas, corado com tricrómio da Masson e corado com HE no Bio Patologia Institute Co., Ltd. 0 tecido patológico foi avaliado através da medição da intercepção linear média, que é um indicador objectivo dos danos alveolares. A intercepção linear média (LM) foi calculada utilizando a fórmula: Lm = N x L/m, em que N é o número de linhas transversais, L é o comprimento de uma linha transversal e m representa o número total de intersecções das paredes alveolares com as linhas transversais.

Análise Estatística

Para examinar as actividades dos fármacos, realizou-se o teste de Dunnett por comparação do grupo de controlo da elastase (grupo B) com os grupos C e D. Cada teste foi realizado em conformidade com o teste de duas caudas e o nível de signif icância foi fixado em 5 %. O teste foi 43 realizado usando o programa informático SAS (SAS Institute Japão, R8.1). Os resultados estão ilustrados na fig.l. A intercepção linear medida foi de 152,5 ± 14,7 pm no grupo B, enquanto foi de 115,2 ± 17,3 ym no grupo C e 81,7 ± 20,4 ym no grupo D. Demonstraram-se actividades inibidoras significativas, de acordo com a dosagem de adiponectina (média ± DP, P < 0,05). No grupo A, a interceptação linear foi de 73,0 ±6,6 ym.

Os resultados revelam que a administração pulmonar continua de adiponectina tem actividade, dependente da dose, de redução do aumento da intercepção linear média causada pelo tratamento com elastase.

Especificamente confirmou-se que a administração continua de adiponectina suprimia o alargamento do espaço aéreo alveolar causado pelo progresso das alterações destrutivas das paredes alveolares. A fig. 2 mostra secções de tecido que indicam o progresso das alterações destrutivas das paredes alveolares. Isto revela que o progresso de destruição das paredes alveolares em grupos que recebem a administração continua de adiponectina (grupos C e D) está, obviamente, mais inibido do que no grupo de controlo (grupo B) e esta actividade inibidora é maior no grupo D.

Especificamente confirmou-se que a administração continua de adiponectina suprimia o desenvolvimento de alterações destrutivas das paredes alveolares.

LISTA DE SEQUÊNCIAS <110> OTSUKA PHARMACEUTICAL CO. , LTD. 44

PULMONARES

<120> AGENTE PARA 0 TRATAMENTO DE DOENÇAS <130> P09-96 <150> JP 2008-217721 <151> 2008-8-27 <160> 7

<170> Patentln versão 3.1 <210> 1 <211> 244 <212> PRT <213> homo sapiens. <4 0 0> 1

Met Leu teu Leu Gly 1 5 Asp Gin Glu Thr Thr 20 tys Gly Ala cys Thr 35 His Asn Gly Ala Pro 50 Lys Gly Glu Lys Gly 65 Gly Glu Thr Gly Vâl 85 ile Gin Gly Arg Lys 100 ser Ala Phe ser vai 115 pro ile Arg Phe Thr 130 Gly ser Thr Gly Lys 145 Ala Tyr His ile Thr 165 Lys tys Asp Lvs Ala 180 Asn vai asd Gin Ala 135 asp Gin val rrp Leu 210 ryr Ala Asp Asn Asp 225 His ASp Thr Asn

Leu Leu Ala 10 Gly Val Leu Gly Ile Pro Arg Asp Gly 60 ile Gly Pro 75 Gly Pro Arg 90 Glu Gly Ala Tyr Val Thr Asn Gin Gin 1.40 Ile Pro Gly 155 Asp Val tys 170 ryr Asp Gin teu Leu hís Glu Gly Glu 220 Phe Thr Gly 235

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Leu pro Gly His 15 Leu Pro Leu pro 30 Gly his Pro Gly 45 Thr pro Gly Glu Lys Gly Asp Ile 80 Gly phe Pro Gly 95 Tyr val Tyr Arg 110 ile pro Asn Met 125 Asn His Tyr Asp Leu ryr Tyr Phe 160 val ser Leu Phe 175 Tyr Glrt Glu Asn 190 Leu g1u val Gly 205 Arg Asn Gly Leu Phe Leu teu Tyr 240 <210> 2 <211> 735 <212> ADN <213> homo sapiens. <22 0> <221> CDS <222> (D . · .(735) 45 <4 Ο Ο> 2 atgctgttqc tgggagctgt acgactcaâg ggcccggagt gegggcatcc cagggcatcc acccctggtg agaagggtga ggtgaaaccq gaqtacccgg aaaggagaac ctggagaagg âcttacgtta ctatccccaa aaccactatg atggctccac gcctaccaca tcacagtcta gctatqctct tcacctatqa gtgctcctgc atctqgaggt cgtaatggac tctatgctga catgacacca actga tctactgcta cctgcttccc gggccataat gààaggagat ggctgàaggt tqcctatgta càtgcccatt tggtaaattc tatgaaggat tcagtaccag gggcgaccaa taãtgacaat ttagctctgc ccgggcatga ccaggaaacc ctgcccaagg gggcctgcac aggttggatg ggggececag gccgtgatgg cagagatggc ccaggtctta ttggtcctaa gggagacatc ccccgaqgct ttccgggaat ccàaggcagg taecgcteag cattcagtgt gggattggag cgctttacta agatcttcta câatcagcaa càctgcaaca ttcctgggct gtactacttt gtgaagotca gcctctteaa gaaggacaag gaaaatàatg tggaccaggc ctccggctct gtctggctcc aggtgtatgg gqaaggagag gactccacct tcacaggctt tcttctctac 60 120 ISO 240 300 360 420 480 S4Ô 000 660 720 735

<210> 3 <211> 247 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 3

Met teu teu teu 6ln G Ala teu teu 1 Ala GlU ASp ASp vai Thr thr Thr 20 pro pro pro tys Gly Thr cys Ala 35 40 ii e pro Gly xle His vai Gly Thr 50 55 Thr pro Gly ialil tys ciy Glu Lys 65 70 Vai Gly tys Gly Glu Thr gly Asp 85 Gly Gly phe pro oiy Thr Pro Arg 100 Tyr vai Tyr 11$ Arg Ser Ala Phe ser 120 vai pro ASO val pro xle Phe 130 Is a Gly ASO HiS Tyr ASp Gly Ser Thr 145 150 His Xle teu Tyr Tyr Phe Ser Tyr 165 Ala Ser Leu Phe tys ISO tys ASp Lys Gin Ala Gih Glu tys Asn vai ASp 195 200 Glu vai Gly ASp Gin vai Trp Leu ASO 210 Gly teu Tyr Ala Asp 215 ASA val 225 His 230 teu Leu Tyr Asp Thr Asr» 245

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<210> 6 <211> 29 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> oligonucleótico como sequência iniciadora (directa) para a adiponectina <4 0 0> 6 aacatatggg gcatgaccag gaaaccacg 29

<210> 7 <211> 29 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> oligonucleótico como sequência iniciadora (inversa) para a adiponectina <400> 7 aaggatcctc agttggtgtc atggtagag 29 Lisboa, 5 de Julho de 2013. 48

Claims (4)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Agente para se utilizar na inibição do alargamento do espaço aéreo alveolar caracterizado pelo facto de conter adiponectina.
2. 2. Agente, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se utilizar a adiponectina que está contida numa quantidade de 0,01 a 70 % em peso.
3. 3. Agente, para se utilizar na inibição da destruição das paredes alveolares caracterizado pelo facto de conter adiponectina.
4. 4. Agente, para se utilizar de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo facto de a adiponectina estar contida numa quantidade de 0,01 a 70 % em peso. Lisboa, 5 de Julho de 2013. 1