PT2305823E

PT2305823E - Materiais e métodos relacionados com agregação proteica em doença neurodegenerativa

Info

Publication number: PT2305823E
Application number: PT100076017T
Authority: PT
Inventors: David Horsley; Claude Michel Wischik; Charles Robert Harrington; Janet Elizabeth Rickard
Original assignee: Wista Lab Ltd
Priority date: 2001-01-15
Filing date: 2002-01-15
Publication date: 2013-07-08
Also published as: ES2353202T3; GB0101049D0; EP1352077B1; JP2004524831A; JP4422407B2; ATE483814T1; DE60237874D1; EP2305823B1; US20090075984A1; CA2697520C; US7893054B2; CA2434067C; US20040110250A1; EP2305823A1; ES2407204T3; WO2002055720A9; DK1352077T3; US7335505B2; EP1352077A2; WO2002055720A3

Description

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DESCRIÇÃO "Materiais e métodos relacionados com agregação proteica em doença neurodegenerativa"

CAMPO TÉCNICO O presente fascículo descreve modelos baseados em células e outros sistemas de teste para modelação da agregação de proteínas associadas a doença neurodegenerativa. O invento refere-se a compostos capazes de modular tal agregação.

ANTECEDENTES DO INVENTO

Condições de demência tais como a doença de Alzheimer (DA) são frequentemente caracterizadas por uma progressiva acumulação de depósitos intracelulares e/ou extracelulares de estruturas proteináceas tais como placas β-amilóides e feixes neurofibrilhares nos cérebros de pacientes afectados. O surgimento destas lesões correlaciona-se grandemente com degeneração patológica neurofibrilhar e atrofia cerebral, bem como disfunção cognitiva (Mukaetova-Ladinska, E.B. et al. (2000) Am. J. Pathol. Vol. 157, No. 2: 623-636).

Tanto as placas neuríticas como os feixes neurofibrilhares contêm filamentos helicoidais emparelhados (PHF), dos quais um constituinte principal é a proteína tau associada aos microtúbulos (Wischik et al. (1988) PNAS USA 85: 4506). As placas contêm também fibrilhas β-amilóides extracelulares derivadas do processamento anormal da proteína precursora amilóide (APP; Kang et al. (1987) Nature 325: 733) . Um artigo por Wischik et al. (em "Neurobiology of Alzheimer's Disease", 2a Edição (2000) Eds. Dawbarn, D. e Allen, S.J., "The Molecular and Cellular Neurobiology Series", Bios Scientific Publishers, Oxford) discute em detalhe o putativo papel da proteína tau na patogénese de demências neurodegenerativas.

Estudos da doença de Alzheimer indicam que a perda da forma normal de tau (Mukaetova-Ladinska et al. (1993) Am. J. 2 ΕΡ 2 305 823/ΡΤ

Pathol. 143: 565; Wischik et al. (1995a) Neurobiol. Ageing 16: 409; Lai et al. (1995b) Neurobiol. Ageing 16: 433), acumulação de PHF patológicos (Mukaetova-Ladinska et al. (1993), loc. cit.} Harrington et al. (1994a) Dementia 5: 215; Harrington et al. (1994b) Am. J. Pathol. 145: 1472; Wischik et al. (1995a), loc. cit.) e perda de sinapses no córtex frontal médio (Terry et al. (1991) Ann. Neurol. 30: 572) se correlacionam com a disfunção cognitiva associada. Além disso, a perda de sinapses (Terry et al., loc. cit.) e a perda de células piramidais (Bondareff et al. (1993) Arch. Gen. Psychiatry 50: 350) correlacionam-se ambas com medidas morfométricas de patologia neurofibrilhar reactiva a tau, que coincide, ao nível molecular, com uma redistribuição quase total do banco de proteína tau de uma forma solúvel para polimerizada (PHF) em doença de Alzheimer (Mukaetova-Ladinska et al. (1993), loc. cit.; Lai et al. (1995), loc. cit.). A tau existe em isoformas processadas alternativamente, que contêm três ou quatro cópias de uma sequência de repetição correspondendo ao domínio de ligação aos microtúbulos (Goedert, M., et al. (1989) EMBO J. 8: 393-399; Goedert, M., et al. (1989) Neuron 3: 519-526). A tau nos PHF é processada proteoliticamente num domínio central (Wischik, C.M., et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85: 4884-4888; Wischik et al. (1988) PNAS USA 85: 4506-4510); Novak, M., et al. (1993) EMBO J. 12, 365-370) que é composto por uma versão de fase deslocada do domínio de repetição; estão envolvidas apenas três repetições na interaeção estável tau-tau (Jakes, R., et al. (1991) EMBO J. 10: 2725-2729). Uma vez formados, agregados de tau semelhantes a PHF actuam como sementes para mais captura e proporcionam um molde para o processamento proteolítico da proteína tau inteira (Wischik et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93: 11213-11218).

No curso da sua formação e acumulação, filamentos helicoidais emparelhados (PHF) juntam-se primeiro para formar agregados amorfos dento do citoplasma, provavelmente a partir de oligómeros de tau iniciais que ficam truncados antes, ou no decurso, da junção de PHF (Mena, R., et al. (1995) Acta Neuropathol. 89: 50-56; Mena, R., et al. (1996) Acta Neuropathol. 91: 633-641). Estes filamentos prosseguem então para formar feixes neurofibrilhares intracelulares clássicos. 3 ΕΡ 2 305 823/ΡΤ

Neste estado, os PHF consistem num núcleo de tau truncada e um revestimento externo "felpudo" contendo tau inteira (Wischik., C.M., et al. (1996) loc. cit.) · O processo de junção é exponencial, consumindo o banco celular de tau normal funcional e induzindo nova sintese de tau para cobrir o défice (Lai, R.Y.K., et al. (1995) Neurobiology of Ageing, Vol. 16, No. 3, 433-445). Eventualmente, a degradação funcional dos neurónios progride até ao ponto de morte celular, deixando para trás um feixe extracelular. A morte celular está altamente correlacionada com o número de feixes extracelulares (Wischik et al. 2000, loc. cit.). À medida que os feixes são extrudidos para o espaço extracelular, existe perda progressiva do revestimento externo "felpudo" dos PHF de neurónios com a correspondente perda de imunorreactividade N-terminal a tau, mas conservação da imunorreactividade a tau associada ao centro de PHF (Figura 1; também Bondareff, W. et al. (1994) J. Neuropath. Exper. Neurol., Vol. 53, No. 2, 158-164) . 0 deslocamento de fase que é observado no domínio de repetição de tau incorporado nos PHF sugere que o domínio de repetição sofre uma mudança conformacional induzida durante a incorporação no filamento. Durante o surgimento da doença de Alzheimer, é considerado que este deslocamento conformacional pode ser iniciado pela ligação de tau a um substrato patológico, tal como proteínas membranares danificadas ou mutadas (ver Figura 2 - também Wischik, C.M., et al. (1997) em "Microtubule-associated proteins: modifications in disease", eds. Avila, J., Brandt, R. e Kosik, K.S. (Harwood Academic Publishers, Amsterdam) págs. 185-241).

No caso da doença de Alzheimer, as terapias farmacêuticas actuais estão centradas no tratamento sintomático da perda de transmissão colinérgica que resulta da neurodegeneração (Mayeux, R., et al. (1999) New Eng. J. Med. 341: 1670-1679). No entanto, embora os tratamentos disponíveis atrasem a progressão da doença durante até seis a doze meses, não a previnem. A identificação de fármacos que possam prevenir a agregação de tau que conduz à neurodegeneração pode proporcionar uma estratégia mais eficaz para profilaxia ou inibição da progressão da doença, que não 4 ΕΡ 2 305 823/ΡΤ iria requerer um conhecimento imediato dos diversos eventos a montante que iniciam a agregação (ver Figura 3).

Modelos e ensaios

WO 96/30766 descreve um ensaio in vitro para a agregação de tau no qual um fragmento de tau correspondendo ao domínio de repetição central, que foi adsorvido a um substrato de fase sólida, é capaz de capturar tau inteira solúvel e ligar-se a tau com elevada afinidade (ver Figura 4). Esta associação confere estabilidade contra digestão por proteases nas moléculas de tau nos domínios de repetição das moléculas de tau que se agregaram. O processo auto-propaga-se e pode ser bloqueado selectivamente através de agentes farmacêuticos protótipo (Wischik et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93 : 11213-11218) .

Embora o ensaio in vitro descrito em WO 96/30766 permita a identificação de inibidores ou moduladores da associação tau-tau, os presentes inventores reconheceram também que seriam úteis modelos baseados em células da agregação de proteínas semelhante à doença de Alzheimer. Tais modelos celulares poderiam ser utilizados na pesquisa primária de moduladores candidatos da agregação tau-tau e na pesquisa secundária de compostos já identificados no ensaio in vitro de WO 96/30766. Além disso, a demonstração da agregação de tau em células podia também ajudar na identificação de substratos celulares normais que estão envolvidos no início da agregação patológica de tau, substratos estes que podiam eles próprios ser alvos para intervenção farmacêutica.

No entanto, numerosos artigos relatando a expressão de várias construções de tau em modelos de cultura de tecidos não conseguiram demonstrar agregação (ver p.ex. Baum, L. et al. (1995) Mol. Brain Res. 34: 1-17). Por exemplo, fibroblastos 3T3 de ratinho não possuem proteína tau e apresentam assim um ambiente celular no qual pode ser expressa tau recombinante independente da tau endógena de ratinho. A transfecção de várias linhas celulares foi relatada anteriormente (Kanai et al. (1989); Goedert e Jakes (1990); Knops et al. (1991); Lee e Rook (1992); Gallo et al. (1992); Lo et al. (1993); Montejo de Garcini et al. (1994); 5 ΕΡ 2 305 823/ΡΤ

Fasulo et al. (1996)). No entanto, a expressão estável a longo prazo de tau truncada em tais linhas celulares não foi alcançada. Por exemplo, as construções de tau para os resíduos 164 ou 173 a 338 ou 352 não expressaram proteína (Lee e Rook (1992)).

Embora Fasulo et al. {Alzheimer ’s Research (1996) 2: 195-200) tenha relatado expressão transiente de tau truncada em células COS, os dados para expressão estável a longo prazo desta tau não foram mostrados. Estes investigadores concluíram a partir da utilização do sistema de transfecção transiente que a expressão de tau truncada pode ela própria não ser suficiente para induzir agregação de tau de um modo adequado para testar fármacos.

Até agora, a agregação de tau solúvel in vitro apenas tinha sido alcançada sob condições não fisiológicas e a elevadas concentrações (revisto em Wischik (2000), loc. cit.). WO 96/30766 descreve duas abordagens para estudar a agregação de tau num ambiente celular. Na primeira abordagem, tau inteira ou fragmentos de tau foram expressos estavelmente em células. Na segunda abordagem, a tau agregada foi transfectada transientemente para células através da utilização de lipofectina.

Embora ambas estas abordagens sejam úteis para o estudo da agregação tau-tau, têm algumas limitações. A transfecção de tau agregada para células utilizando lipofecção tem uma eficiência variável, tal como a produção in vitro da própria tau agregada. Além disso, o fragmento central de tau, que é a semente mais eficiente para a agregação de tau, é tóxico quando expresso estavelmente nas células, conduzindo a baixos níveis de expressão. Assim, a expressão constitutiva do fragmento de tau truncado do centro de PHF em células eucarióticas é difícil de alcançar. Os sistemas de expressão transiente permitem a optimização da expressão de tau, mas a toxicidade inerente dos fragmentos torna até estes sistemas não fiáveis. Fragmentos maiores de tau são menos tóxicos, mas estes não se agregam de modo fiável quando expressos em células. 6 ΕΡ 2 305 823/ΡΤ

Assim seria desejável desenvolver um sistema modelo alternativo, no qual a interacção entre, p.ex., moléculas de tau e semelhantes pudesse ser investigada sob condições fisiológicas, numa linha celular estável e controlável, e que pudesse ser utilizado para pesquisar potenciais agentes de diagnóstico, prognóstico ou terapêuticos de situações tais como doença de Alzheimer.

DIVULGAÇÃO DO INVENTO

Os presentes inventores consideraram um sistema de teste celular estável que pode ser utilizado para modelar o processamento proteolítico dirigido por um molde de uma proteína, cuja agregação está associada a doença neurodegenerativa. Num sistema de teste, exemplificado com a proteína tau, foi combinada a expressão constitutiva de muito baixo nível de um fragmento da proteína tau com a expressão indutível da tau inteira. A indução da tau inteira conduziu à sua conversão proteolítica num fragmento processado, confirmando que estava a ocorrer "processamento proteolítico com um molde" da tau. O sistema permite facilmente a demonstração dos efeitos de inibidores da agregação de tau através da sua inibição da produção do fragmento processado de 12 kDa a partir da tau inteira induzida. É particularmente surpreendente que um tal sistema estável possa ser alcançado apesar das propriedades tóxicas inerentes do fragmento de 12 kDa. Por exemplo, tal como demonstrado nos Exemplos abaixo, embora a truncagem parcial no terminal N ou C da tau inteira resulte em linhas celulares nas quais a expressão estável pode ser mantida, estas construções maiores mostram apenas uma fraca propensão para se agregarem, em vez de se ligarem à rede microtubular. A expressão estável de combinações de fragmentos de tau gera agregados dentro do citoplasma das células, mas este sistema não pode ser mantido de forma reprodutível. Os sistemas baseados na expressão indutível do fragmento de 12 kDa conduziram a toxicidade em resultado da imprevisível agregação intracelular do fragmento. 7 ΕΡ 2 305 823/ΡΤ

Assim parece haver uma compensação nos sistemas celulares de expressão estável entre indução de agregação e deste modo toxicidade por um lado, que produz linhas celulares que são variáveis ou não viáveis, e manutenção de linhas celulares viáveis nas quais tau tem uma baixa propensão a agregar. Apesar disto, o sistema de expressão de tau indutivel aqui descrito é estável e ainda capaz de proporcionar agregação controlada da proteína para utilizar em pesquisas e semelhantes.

Adicionalmente, a utilização do ensaio proporcionou provas de que o mecanismo de acção de certos inibidores (p.ex., fenotiazinas) da agregação proteica é principalmente de natureza espacial, em vez de essencialmente redox, como se poderia suspeitar com base na arte anterior. Esta constatação teve implicações inesperadas para a escolha, avaliação, formulação e utilização de tais compostos no contexto das doenças aqui discutidas. Em particular, mostra que a avaliação dos coeficientes de difusão pode proporcionar uma pesquisa valiosa para identificação de putativos inibidores, ou optimização da estrutura ou do estado dos conhecidos, porque os parâmetros avaliados inerentemente através da medição do coeficiente de difusão podem ser altamente relevantes para a potência dos inibidores. 0 ensaio mostra ainda que a utilização de fenotiazinas na sua forma reduzida pode ser vantajosa para aumentar as suas propriedades inibidoras. Estas observações formam a base do presente invento. É aqui descrito um método para conversão, através de processamento proteolítico, de uma proteína precursora num fragmento produto da proteína precursora, numa linha celular estável, cujo método compreende os passos de: (a) proporcionar uma linha celular estável transfectada com ácido nucleico codificando (i) um fragmento molde da proteína precursora de modo a que o fragmento molde seja constitutivamente expresso na célula a um nível que não seja tóxico para a célula; e (ii) a proteína precursora, cuja proteína é indutivamente expressa na célula em resposta a um estímulo, através do qual a interacção do fragmento molde com a proteína precursora causa uma mudança conformacional na 8 ΕΡ 2 305 823/ΡΤ proteína precursora de modo a causar agregação e processamento proteolítico da proteína precursora no fragmento produto. O método pode incluir sujeitar a célula ao estímulo de modo a que a proteína precursora seja expressa na célula. No entanto, em concretizações onde é utilizado um promotor indutível que causa níveis baixos mas detectáveis de expressão mesmo na ausência do estímulo, então o passo de estímulo pode ser omitido.

Em termos gerais, a proteína precursora será uma que, in vivo, seja capaz de sofrer uma interacção de polimerização conformacional induzida (de um modo auto-propagante) conduzindo finalmente à formação de agregados constituídos pelo fragmento produto, e associados ao estado de doença. 0 fragmento produto obtido no método daqui é uma medida do processo de agregação patológica e de proteólise que in vivo conduz à produção de um ou mais produtos tóxicos e ao estado de doença. 0 fragmento produto (ou um ou mais dos fragmentos) do presente método pode ser tóxico, ou pode simplesmente ser utilizado como um indicador do processo de agregação patológica.

As proteínas e interacções nas quais o método se baseia são discutidas em mais detalhe abaixo.

Os presentes inventores demonstraram que é inesperadamente possível expressar constitutivamente o fragmento molde a uma (primeira) concentração que não seja tóxica para a linha celular, i.e., a linha celular seja viável. Nem mostre anomalias celulares do tipo mostrado, p.ex., em WO 96/30766 na Fig. 29.

Contudo (p.ex., num momento predeterminado através da adição do estímulo) é possível semear o processamento da proteína precursora num fragmento produto (que pode ser o mesmo, amplamente equivalente, ou bastante diferente do fragmento molde) que se pode assim acumular numa (segunda, mais elevada) concentração que seja tóxica para a célula e que corresponda ao estado de doença. Isto proporciona por sua vez métodos convenientes para modelação do estado de doença 9 ΕΡ 2 305 823/ΡΤ associado aos efeitos do fragmento produto, e avaliação do efeito dos moduladores na geração do fragmento produto. São aqui igualmente descritos métodos correspondentes para qualquer um de iniciação, sementeira ou controlo do processamento proteolitico e opcionalmente agregação da proteína precursora no fragmento produto.

Em cada caso o método pode envolver a monitorização (directamente ou indirectamente) do nível de processamento proteolitico da proteína precursora.

Numa concretização do método, células fibroblastos (3T6) expressam tau inteira ("T40") sob o controlo de um promotor indutível e baixos níveis constitutivos do fragmento de tau central de PHF (fragmento de 12 kDa) . Quando a expressão de T40 é induzida neste sistema, sofre truncagem dependente da agregação dentro da célula, N-terminalmente a %a.a. 295 e C-terminalmente a %a.a. 390, produzindo deste modo níveis mais elevados do fragmento do domínio central de PHF de 12 kDa. A produção do fragmento de 12 kDa pode ser bloqueada de um modo dependente da dose através de inibidores da agregação de tau. De facto a quantificação da actividade inibidora de compostos em relação à geração proteolítica do fragmento de 12 kDa dentro das células pode ser descrita inteiramente em termos dos mesmos parâmetros que descrevem a inibição da ligação tau-tau in vitro. Isto é, a extensão da geração proteolítica do fragmento de 12 kDa dentro das células é determinada inteiramente pela extensão da ligação tau-tau através do domínio de repetição. A disponibilidade das proteases relevantes dentro da célula não é limitante.

Proteínas precursoras e doenças (incluindo tauopatias)

Tal como afirmado acima, o método pode ser baseado em torno da utilização de qualquer proteína que esteja associada a uma doença na qual a proteína sofra uma interacção de polimerização conformacional induzida, i.e., uma em que uma mudança da conformação da proteína, ou num fragmento desta, dá origem a ligação com molde e agregação de mais moléculas de proteína (precursora) de um modo auto-propagante. 10 ΕΡ 2 305 823/ΡΤ

Uma vez iniciada a nucleação, pode resultar uma cascata de agregação que envolve a polimerização conformacional induzida de mais moléculas proteicas, conduzindo à formação de fragmentos produto tóxicos em agregados que são substancialmente resistentes a mais proteólise. Pensa-se que os agregados proteicos assim formados sejam a causa imediata de neurodegeneração, demência clinica e outros sintomas patológicos deste grupo de doenças.

Os métodos preferidos são baseadas na proteína tau. Onde aqui utilizado, o termo "proteína tau" refere-se geralmente a qualquer proteína da família de proteínas tau. As proteínas tau caracterizam-se como sendo uma entre um grande número de famílias proteicas que co-purificam com microtúbulos durante ciclos repetidos de associação e dissociação (Shelanski et al. (1973) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 70: 765-768), e são conhecidas como proteínas associadas a microtúbulos (MAP). Os membros da família tau partilham as caracteristicas comuns de possuírem um segmento N-terminal característico, sequências de aproximadamente 50 aminoácidos inseridas no segmento N-terminal, que são reguladas no desenvolvimento no cérebro, uma região de repetição em cadeia característica consistindo em 3 ou 4 repetições em cadeia de 31-32 aminoácidos, e uma cauda C-terminal. MAP2 é a proteína associada a microtúbulos predominante no compartimento somatodendrítico (Matus, A., em "Microtubules" (Hyams e Lloyd, eds.) págs. 155-166, John Wiley and Sons, NY). As isoformas de MAP2 são quase idênticas à proteína tau na região de repetição em cadeia, mas diferem substancialmente tanto na sequência como na extensão do domínio N-terminal (Kindler e Garner (1994) Mol. Brain Res. 26: 218-224). Contudo, a agregação na região de repetição em cadeia não é selectiva para o domínio de repetição de tau. Assim será notado que qualquer discussão aqui em relação à proteína tau ou agregação tau-tau deve ser tomada em relação também à agregação tau-MAP2, agregação MAP2-MAP2 e por aí adiante. A Figura 5 mostra uma Tabela listando várias outras proteínas agregantes associadas a doença que podem ser utilizadas no presente método. Cada caso em que a doença ou 11 ΕΡ 2 305 823/ΡΤ doenças nas quais a iniciação da agregação e/ou mutação da(s) proteína(s) podem ter um papel está também listado. O domínio ou mutação responsável pela actividade da doença está listado, e pelo menos toda ou parte desta porção mínima da proteína estaria de preferência englobada pelo fragmento molde utilizado no presente método.

Tal como se pode observar a partir da tabela, doenças exemplares que se caracterizam por agregação proteica patológica incluem doença dos neurónios motores e doença do corpo de Lewy.

Particularmente não é apenas na Doença de Alzheimer que a proteína tau (e a função ou o processamento aberrante desta) pode ter um papel. A patogénese de distúrbios neurodegenerativos tais como a doença de Pick e a Paralisia Supranuclear Progressiva (PSP) parece correlacionar-se com uma acumulação de agregados de tau truncada patológicos no giro dentado e em células piramidais estrelares do neocórtex, respectivamente. Outras demências incluem a demência fronto-temporal (FTD); parkinsonismo ligado ao cromossoma 17 (FTDP-17); complexo desinibição-demência-parkinsonismo-amiotrofia (DDPAC); degeneração pallido-ponto-nigral (PPND); síndroma de Guam-ALS; degeneração pallido-nigro-luysiana (PNLD); degeneração cortico-basal (CBD) e outras (ver Wischik et al. 2000, loc. cit., para discussão detalhada - especialmente a Tabela 5.1). Todas estas doenças, que se caracterizam principalmente ou parcialmente por agregação anormal de tau, são aqui referidas como "tauopatias".

Assim será notado, à luz da discussão acima (e excepto onde o contexto requer de outro modo) que quando as concretizações do método são descritas em relação à proteína tau ou a proteínas semelhantes a tau (p.ex. MAP2) a descrição deve ser tomada como aplicando-se igualmente a outras proteínas discutidas acima (p.ex. β-amilóide, sinucleína, prião, etc.) ou outras proteínas que podem iniciar ou sofrer uma agregação patológica semelhante em virtude de mudança conformacional num domínio critico para propagação da agregação, ou que conferem estabilidade proteolítica ao agregado assim formado (artigo por Wischik et al. (em "Neurobiology of Alzheimer's Disease", 2a Edição (2000) Eds. 12 ΕΡ 2 305 823/ΡΤ

Dawbarn, D. e Allen, S.J., "The Molecular and Cellular Neurobiology Series", Bios Scientific Publishers, Oxford). Todas essa proteínas podem ser aqui referidas como "proteínas de doença agregantes".

Igualmente, quando é aqui feita menção a "agregação tau-tau" ou semelhante, esta pode também ser tomada para ser aplicável a outra "agregação de proteínas agregantes", tal como agregação de β-amilóide, agregação de priões e agregação de sinucleína, etc. Igualmente a "degradação proteolítica de tau" e por aí adiante.

Fragmentos Molde

Em concretizações preferidas do presente método, o fragmento molde, compreende, consiste essencialmente em, ou consiste num "fragmento central" da proteína precursora, termo que se refere à parte da proteína que é capaz de se ligar à proteína precursora para iniciar ou propagar a proteólise e agregação tal como descrito acima.

No caso de proteínas de doença que se agregam, é também provável que tais fragmentos centrais sejam os que contribuem para a estabilidade proteolítica do agregado.

Assim, por exemplo, um "fragmento central de tau" é um fragmento de tau compreendendo uma sequência proteica de tau truncada derivada da região de repetição em cadeia e que, nas condições apropriadas, é capaz de se ligar à região de repetição em cadeia de uma outra proteína tau ou uma proteína MAP2 com elevada afinidade. No caso de tau, o fragmento preferido é assim exemplificado através de, mas não se limitando a, fragmentos de tau presentes nos PHF (e, por último, feixes neurofibrilhares) em cérebros de doença de Alzheimer.

Um fragmento de tau preferido pode assim ser de cerca de (digamos) entre 295-297 prolongando-se a cerca de 390-391 (ver "dGAE" na Figura 6) embora variantes de tais fragmentos possam também ser utilizadas, tal como descrito abaixo. 13 ΕΡ 2 305 823/ΡΤ

No caso de ΑΡΡ (proteína precursora amilóide), por exemplo, pode ser preferida a expressão de um fragmento da APP que englobe o domínio Αβ dos aminoácidos 1-40 ou 1-42 como uma proteína de fusão.

Outros fragmentos centrais podem basear-se, p.ex., nos domínios discutidos com referência à Figura 5. Os fragmentos molde podem incluir domínios de duas, ou mais de duas, destas proteínas (p.ex. como fusões). O comprimento total do fragmento molde pode ser qualquer um que seja apropriado ao ensaio e ao fragmento central da proteína de doença de agregação a utilizar, mas será geralmente maior que ou igual a cerca de aproximadamente 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 aminoácidos de comprimento. No entanto, nalgumas concretizações pode ser maior de 100, 200 ou mesmo 500, se isto for desejado.

Derivados

Em todos os casos aqui quando uma proteína nomeada (p.ex. proteína precursora, fragmento molde ou central) ou uma sequência de ácido nucleico citada é discutida, um derivado ou outra variante da proteína de referência (ou ácido nucleico) correspondente pode ser utilizado conforme apropriado, desde que mantenha as características apropriadas da sequência de referência. Tais derivados partilharão também uma identidade de sequência com a sequência de referência.

Por exemplo, a proteína utilizada pode incluir um terminal N ou C prolongado, cuja extensão pode ser heteróloga à sequência da proteína. Igualmente, o derivado será um por meio de inserção, deleção ou adição de aminoácidos na sequência de referência. Por exemplo, um derivado da proteína tau, ou fragmento central de tau, compreenderá pelo menos uma sequência de aminoácidos parcial parecendo-se com a região de repetição em cadeia das proteínas tau, mas em que um ou mais dos aminoácidos da tau natural ou dos seus fragmentos foi substituído ou suprimido, ou nos quais foram inseridos outros aminoácidos.

Tais mudanças podem ser feitas para aumentar ou eliminar a actividade de ligação (sendo o ultimo caso útil para 14 ΕΡ 2 305 823/ΡΤ experiências de controlo). Os controlos podem conter deleções de sequências ou domínios para ver que efeitos podem ter na aqreqação.

Derivados preferidos podem ser os que incorporam mutações correspondentes às conhecidas ou suspeitas de estarem associadas ao estado de doença. Estas podem incluir mudanças correspondentes a P301S dentro da sequência de tau (ver Figura 7). Outras mutações incluem G272V, G389R, P301L, N279K, S305N, V337M, G272V, Κ280Δ, R406W (ver também Wischik et al. (2000) supra).

Outros derivados preferidos podem incluir repetições em cadeia dos fraqmentos centrais discutidos acima, ou domínios de ligação dentro desses fragmentos.

Ainda outros derivados podem basear-se em produtos quiméricos baseados em múltiplas proteínas de doença relacionadas nas quais as suas sequências são misturadas ou combinadas. Por exemplo, fragmentos de tau de enzimas de restrição podem ser ligados juntamente com fragmentos de MAP2 ou mesmo de um gene não relacionado para gerar derivados recombinantes. Uma estratégia alternativa para modificação dos fragmentos centrais empregaria PCR tal como descrito por Ho et al. (1989) Gene 77: 51-59 ou baralhação de ADN (Crameri et al. (1998) Nature 391).

Utilização de construções de ácido nucleico Ácidos nucleicos do, ou para utilizar no, presente método podem ser proporcionados isolados e/ou purificados a partir do seu ambiente natural, na forma substancialmente pura ou homogénea ou livres ou substancialmente livres de outros ácidos nucleicos das espécies de origem. Quando aqui utilizado, o termo "isolado" engloba todas estas possibilidades. Os ácidos nucleicos, p.ex. codificando o fragmento, serão pelo menos parcialmente sintéticos por compreenderem sequências de ácido nucleico que não se verificam juntas na natureza (não correm contiguamente) mas que foram ligadas ou combinadas artificialmente de outro modo. 15 ΕΡ 2 305 823/ΡΤ Ο ácido nucleico utilizado no método pode estar na forma de, ou ser derivado de, ADNc, ARN, ADN genómico e ácidos nucleicos modificados ou análogos de ácido nucleico. Quando uma sequência de ADN é especificada, p.ex. com referência a uma Figura, a menos que o contexto o exija de outro modo, está englobado o ARN equivalente com T substituído por U onde ocorra.

Tal como descrito acima, os ácidos nucleicos podem codificar derivados ou outras variantes partilhando homologia com as sequências de referência em questão. De preferência, o ácido nucleico e/ou a sequência de aminoácidos em questão partilharão cerca de 50%, ou 60%, ou 70%, ou 80% de identidade, de preferência pelo menos cerca de 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% da sequência sobre a qual a variante se baseia. A semelhança ou homologia podem ser definidas e determinadas através do programa TBLASTN, de Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10, que tem uma utilização padrão na arte, ou, e este pode ser preferido, o programa padrão BestFit, que é parte do Wisconsin Package, Versão 8, Setembro de 1994, (Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA, Wisconsin 53711) utilizando os parâmetros por defeito. Uma fórmula comum para o cálculo das condições de rigor necessárias para alcançar hibridação entre moléculas de ácido nucleico com uma homologia de sequência especificada é: Tm = 81,5°C + 16,6 Log[Na+] + 0,41 (% G+C) - 0,63 (% de formamida) - 600/#pb no duplex.

As sequências de ácido nucleico que codificam as proteínas ou polipéptidos apropriados podem ser facilmente preparados pelo perito na arte utilizando a informação e as referências aqui contidas e técnicas conhecidas na arte (por exemplo, ver Sambrook, Fritsch e Maniatis, "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, e Ausubel et al., "Short Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, 1992). Estas técnicas incluem (i) a utilização da reacção em cadeia da polimerase (PCR) para amplificar amostras do ácido nucleico relevante, p.ex. de fontes genómicas, (i i) síntese química, ou (iii) a preparação de sequências de ADNc. 16 ΕΡ 2 305 823/ΡΤ Ο ADN codificando p.ex. fragmentos centrais de tau pode ser gerado e utilizado de qualquer modo adequado conhecido dos peritos na arte, incluindo através da tomada do ADN codificador, identificação dos locais de reconhecimento por enzimas restrição adequados de ambos os lados da porção a expressar, e corte da referida porção do ADN. Podem ser feitas modificações às sequências codificadoras da proteína (p.ex., tau), p.ex. utilizando mutagénese dirigida ao local.

Construções

Assim, a divulgação proporciona moléculas de ácido nucleico codificando as proteínas precursoras e fragmento molde apropriados. Tal como discutido abaixo, estas podem estar presentes na mesma construção ou em construções diferentes e, em último caso, podem também ser proporcionadas composições compreendendo dois ou mais tipos de construção.

As sequências de ácido nucleico que permitem que um vector se replique numa ou mais células hospedeiras seleccionadas são bem conhecidas para uma variedade de bactérias, leveduras e vírus. Por exemplo, várias origens virais (SV40, polioma, adenovírus, VSV ou BPV) são úteis para vectores de clonagem em células de mamífero. Vectores de expressão compreendendo um ácido nucleico tal como aqui descrito podem, por exemplo, estar na forma de um plasmídeo, cosmídeo, partícula virai, fago ou qualquer outro vector ou construção adequados que possam ser tomados por uma célula e expressos apropriadamente.

Os vectores de expressão conterão um promotor que esteja operativamente ligado à sequência de ácido nucleico codificando a proteína de interesse, de modo a dirigir a síntese do ARNm. Promotores reconhecidos por uma variedade de potenciais células hospedeiras são bem conhecidos. "Operativamente ligado" significa unido como parte da mesma molécula de ácido nucleico, posicionado de modo adequado e orientado para que a transcrição seja iniciada a partir do promotor. O ADN operativamente ligado a um promotor está "sob controlo transcricional" do promotor. A transcrição a partir de vectores em células hospedeiras de mamífero é controlada, por exemplo, por promotores obtidos a partir dos genomas de 17 ΕΡ 2 305 823/ΡΤ vírus tais como vírus de polioma, vírus da varíola aviária, adenovírus (tais como Adenovírus 2), vírus de papiloma bovino, vírus do sarcoma das aves, citomegalovírus, um retrovírus, vírus da hepatite B, e Vírus Símio 40 (SV40), por promotores de mamífero heterólogos, p.ex. o promotor da actina ou um promotor de imunoglobulina, e por promotores de choque térmico, desde que tais promotores sejam compatíveis com os sistemas de células hospedeiras. Os vectores de expressão utilizados em células hospedeiras eucarióticas (células de levedura, fungos, insecto, vegetais, animais, humanas ou nucleadas de outros organismos multicelulares) conterão também sequências para a terminação da transcrição e para estabilização do ARNm. O promotor utilizado para o fragmento molde será "constitutivo". Este promotor pode ser suficientemente fraco para que o nível do fragmento molde expresso na célula não seja ele próprio (directamente) detectável utilizando técnicas convencionais, para além (indirectamente) do seu efeito na proteína precursora, conduzindo a agregação e processamento proteolítico desta (i.e. eficazmente indetectável quando a referida agregação é inibida). Tais promotores podem ser seleccionados por um perito na arte à luz da presente divulgação sem demasiado esforço tal como os listados acima.

No caso da proteína precursora, o promotor é "indutível" - o mesmo é dizer, e é bem entendido pelos peritos na arte, a expressão é "ligada" ou aumentada em resposta a um estímulo aplicado. A natureza do estímulo varia entre os promotores. Alguns promotores indutíveis causam níveis de expressão pequenos ou indetectáveis (ou nenhuma expressão) na ausência do estímulo apropriado. Outros promotores indutíveis causam expressão constitutiva detectável na ausência do estímulo. Seja qual for o nível de expressão na ausência do estímulo, a expressão a partir de qualquer promotor indutível aumenta na presença do estímulo correcto. Em experiências abaixo, foi utilizado um promotor Lac indutível.

Os vectores de expressão podem também conter um ou mais genes de selecção. Os genes de selecção típicos codificam proteínas que (a) conferem resistência a antibióticos ou 18 ΕΡ 2 305 823/ΡΤ outras toxinas, ρ.ex. ampicilina, neomicina, metotrexato ou tetraciclina, (b) deficiências auxotróficas do complemento, ou (c) fornecimento de nutrientes críticos não disponíveis em meios complexos, p.ex., o gene codificando a D-alanina-racemase para Bacilli. Um exemplo de marcadores seleccionáveis adequados para células de mamífero são os que permitem a identificação de células competentes para tomar o ácido nucleico desejado codificando a proteína, tal como DHFR ou timidina-cinase. Uma célula hospedeira apropriada, quando é empregue DHFR de tipo selvagem, é a linha celular CHO deficiente na actividade de DHFR, preparada e propagada tal como descrito por Urlaub et al. (1980) Proc. Natl. Acad Sei USA 77:4 216. Um gene de selecção adequado para utilizar em levedura é o gene trpl presente no plasmídeo Rp7 de levedura (Stinchcomb et al. (1979) Nature 282: 39; Kingsman et al. (1979) Gene 7: 141; Tschemper et al. (1980) Gene 10: 157). O gene trpl proporciona um marcador seleccionável para uma estirpe mutante de levedura sem a capacidade de crescer em triptofano, por exemplo, ATCC No. 44076 ou PEP4-1 (Jones (1977) Genetics 85: 12).

Assim um vector típico pode incluir uma origem de replicação, uma ou mais sequências proteicas operativamente ligadas a um promotor constitutivo ou indutível conforme apropriado, uma sequência de terminação da transcrição, um elemento estimulador, um gene marcador. A construção de vectores adequados contendo vários destes componentes emprega técnicas de ligação padrão que são conhecidas do perito na arte.

Transformação É também aqui divulgado um processo para a produção de uma célula estável para utilizar num método tal como descrito acima, cujo processo compreende os passos de: a) introdução numa célula de um ácido nucleico codificando (i) um fragmento molde da proteína precursora de modo a que o fragmento molde seja constitutivamente expresso na célula a um nível que não seja tóxico para a célula; e (ii) a proteína precursora de modo a que a proteína de doença seja indutivamente expressa na célula em resposta a um estímulo. 19 ΕΡ 2 305 823/ΡΤ A introdução, que pode ser geralmente referida sem limitação como "transformação", pode empregar qualquer técnica disponível. Para células eucarióticas, técnicas disponíveis adequadas podem incluir transfecção com fosfato de cálcio, DEAE-Dextrano, electroporação, transfecção mediada por lipossomas e transdução utilizando retrovírus ou outros vírus, p.ex. vacínia ou, para células de insecto, baculovírus. O tratamento com cálcio empregando cloreto de cálcio, tal como descrito em Sambrook et ai., supra, ou electroporação é geralmente utilizado para procariotas ou outras células que contenham barreiras substanciais de parede celular. A infecção com Agrobacterium tumefaciens é utilizada para transformação de certas células vegetais, tal como descrito por Shaw et al. (1983) Gene 23:315 e WO 89/05859 publicado a 29 de Junho de 1989.

Para células de mamífero sem tais paredes celulares, pode ser empregue o método de precipitação com fosfato de cálcio de Graham e van der Eb (1978) Virology 52: 456-457. Os aspectos gerais de transformações de sistemas de células hospedeiras de mamífero foram descritos na Patente U.S. N°. 4399216. As transformações para levedura são tipicamente realizadas de acordo com o método de Van Solingen et al. (1977) J. Bact. 130: 946 e Hsiao et al. (1979) Proc. Natl.

Acad. Sei. (USA) 76: 3829. No entanto, podem também ser utilizados outros métodos para a introdução de ADN em células, tal como através de microinjecção nuclear, electroporação, fusão de protoplastos bacterianos com células intactas, ou policatiões, p.ex., polibreno, poliornitina. Para várias técnicas para transformação de células de mamífero, ver Keown et al. (1990) Methods in Enzymology 185: 527-537 e Mansour et al. (1988) Nature 336: 348-352. Células hospedeiras Células hospedeiras adequadas para utilizar nos métodos e processos podem incluir bactérias, células eucarióticas tais como células de mamífero e levedura, e sistemas de baculovírus.

As linhas celulares de mamífero disponíveis na arte para expressão de um polipéptido heterólogo incluem células 20 ΕΡ 2 305 823/ΡΤ fibroblastos 3Τ6, células HeLa, células de rim de hamster bebé, células COS, linha de rim de macaco CV1 transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651), células de ovário de hamster chinês/-DHFR (CHO, Urlaub e Chasin (1980) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77: 4216); células de sertoli de ratinho (TM4, Mather (1980) Biol. Reprod. 23: 243-251); células de pulmão humano (W138, ATCC CCL 75); células de figado humano (Hep G2, HB 8065); células de tumor mamário de ratinho (MMT 060562, ATCC CCL51); e muitas outras.

Hospedeiros procarióticos adequados incluem mas não se limitam a eubactérias, tais como organismos Gram-negativos ou Gram-positivos, por exemplo, Enterobacteriaceae tais como E. coli. Várias estirpes de E. coli estão disponíveis ao público, tais como a estirpe MM294 de E. coli K12 (ATCC 31446); E. coli X1776 (ATCC 31537); estirpe de E. coli W3110 (ATCC 27325) e K5 772 (ATCC 53635). Micróbios eucarióticos tais como fungos filamentosos ou leveduras são também hospedeiros para vectores de clonagem ou expressão adequados. Saccharomyces cerevisiae é um microrganismo hospedeiro eucariótico inferior vulgarmente utilizado. A selecção da célula hospedeira apropriada é considerada como estando dentro da perícia na arte. É aqui também divulgada uma célula hospedeira contendo ácido nucleico heterólogo tal como descrito acima. O ácido nucleico pode ser integrado no genoma (p.ex. cromossoma) da célula hospedeira. A integração pode ser promovida pela inclusão de sequências que promovam recombinação com o genoma, de acordo com técnicas padrão. Alternativamente, o ácido nucleico pode estar num vector extracromossómico dentro da célula, ou pelo contrário identificadamente heterólogo ou estranho à célula. A célula pode ser produzida através de um método descrito acima (introdução da construção de ácido nucleico) ou ser o ancestral de uma tal célula. São também proporcionadas linhas celulares correspondentes. As linhas celulares preferidas podem ser baseadas na linha celular de fibroblastos, p.ex., 3T6. 21 ΕΡ 2 305 823/ΡΤ

As células hospedeiras transfectadas ou transformadas com os vectores de expressão ou clonagem aqui descritos podem ser cultivadas num meio nutriente convencional modificado conforme apropriado para indução dos promotores, selecção dos transformantes, ou amplificação dos genes codificando as sequências desejadas. As condições de cultura, tais como meio, temperatura, pH e semelhantes, podem ser seleccionadas pelo perito na arte sem demasiada experimentação. Em geral, os princípios, protocolos, e técnicas práticas para maximização da produtividade de culturas celulares podem ser verificados em "Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach", M. Butler, ed. JRL Press, (1991) e Sambrook et al., supra. A expressão génica pode ser confirmada numa amostra directamente, por exemplo, através dos convencionais Southern blotting, Northern blotting para quantificar a transcrição de ARNm (Thomas (1980) Proc. Natl Acad Sei. USA, 77: 5201-5205)), dot blotting (análise de ADN), ou hibridação in situ, utilizando uma sonda marcada apropriadamente, com base na sequência da proteína de doença de agregação. Alternativamente, podem ser empregues anticorpos que podem reconhecer duplexes específicos, incluindo duplexes de ADN, duplexes de ARN, e duplexes híbridos de ADN-ARN ou duplexes de ADN-proteina. A expressão génica, alternativamente, pode ser medida através de métodos imunológicos tais como coloração imuno-histoquímica de células ou secções de tecido, e ensaio da cultura celular, para quantificar directamente a expressão do produto do gene. Os anticorpos úteis para coloração imuno-histoquímica e/ou ensaio de fluidos da amostra podem ser monoclonais ou policlonais e podem ser preparados em qualquer mamífero. Convenientemente, os anticorpos podem ser preparados contra uma sequência nativa do polipéptido de doença de agregação.

Assim, os métodos aqui descritos podem ter como implicação causar ou permitir a expressão dos ácidos nucleicos aqui discutidos, p.ex. através da cultura de células hospedeiras sob condições para expressão do gene 22 ΕΡ 2 305 823/ΡΤ (presença de estímulo) de modo a que seja produzido o fragmento produto.

Detecção de agregação e/ou processamento proteolitico e/ou fragmento tóxico

Em várias concretizações, o progresso do processamento proteolitico ou da agregação (ou modulação deste - ver abaixo) pode ser detectado directamente ou indirectamente através da monitorização da concentração ou do nível de qualquer uma ou mais das seguintes espécies: a proteína precursora; o fragmento produto; quaisquer fragmentos subproduto formados durante o processo; um agregado de qualquer um destes (p.ex. baseado em coeficientes de sedimentação).

Assim, tal como exemplificado com determinadas proteínas tau e fragmentos (com base no fragmento 297-351 e T40), a agregação pode ser monitorizada com base em níveis crescentes de uma espécie processada de 12 kDa, derivada principalmente da proteína precursora.

Alguns métodos de detecção de proteínas são discutidos em relação à expressão génica de cima. Quando são utilizados anticorpos ou fragmentos destes em concretizações do método, estes podem ser produzidos através de técnicas convencionais. Os anticorpos policlonais podem ser criados p.ex. através de injecção do correspondente antigénio tau num animal, de preferência um coelho, e de recuperação do anti-soro através de purificação por imunoafinidade, na qual o anticorpo policlonal é passado por uma coluna à qual o antigénio está ligado e é então eluído de um modo convencional. De preferência, são utilizados anticorpos monoclonais que são selectivos para epitopos de tau e podem ser preparados através do método de Kohler e Milstein. Os anticorpos monoclonais adequados para epitopos de tau podem ser modificados através de métodos conhecidos para proporcionar fragmentos Fab ou fragmentos (Fab')2, concretizações de anticorpos quiméricos, humanizados ou de cadeia simples.

Os anticorpos podem ser modificados de vários modos. De facto o termo "anticorpo" deve ser entendido como cobrindo 23 ΕΡ 2 305 823/ΡΤ qualquer substância de ligação possuindo um domínio de ligação com a especificidade necessária. Assim o método pode utilizar fragmentos de anticorpo, derivados, equivalentes funcionais e homólogos de anticorpos, incluindo moléculas sintéticas e moléculas cuja forma imita a de um anticorpo permitindo-lhe ligar-se a um antigénio ou epitopo.

Em termos gerais, quando os anticorpos são empregues para detecção, o anticorpo pode possuir uma molécula repórter. Alternativamente, a detecção de ligação pode ser efectuada através da utilização de um segundo anticorpo capaz de ligação a um primeiro anticorpo não marcado, especifico de tau. Neste caso, o segundo anticorpo está ligado a uma molécula repórter.

Os anticorpos podem ser utilizados em qualquer sistema de imunoensaio conhecido na arte, incluindo, mas não limitado a: radioimunoensaios, ensaios em "sanduíche", imunoensaios enzimáticos (ELISA); imunoensaios fluorescentes, imunoensaios de proteína A, etc. Tipicamente, é utilizado um método de imunoblot. De preferência o imunoensaio é efectuado na fase sólida, tal como será bem conhecido dos peritos. Por exemplo, um anticorpo pode ser adsorvido a, p.ex., uma coluna de ensaio e a amostra celular pode então ser lavada através da coluna sob condições adequadas para permitir a ligação ao anticorpo da fase sólida de qualquer agregado da proteína de interesse, p.ex., um agregado tau-tau. 0 excesso de reagente é lavado e a ligação da proteína agregada à coluna pode então ser detectada através de qualquer meio adequado, p.ex., tal como exemplificado acima e abaixo.

Os anticorpos monoclonais preferidos são como se segue:

Os que reconhecem o terminal N ou terminal C do epitopo de tau permitem a medição da ligação entre espécies de tau truncadas e inteiras. Especialmente úteis são os anticorpos que reconhecem epitopos específicos de humanos. Um tal anticorpo (designado 27/499) reconhece um epitopo especifico de humano situado na região entre Gly-16 e Gln-26 de tau, e permite deste modo a medição da ligação entre espécies de tau inteiras, desde que uma seja derivada de uma fonte não humana (Lai (1995); "The role of abnormal 24 ΕΡ 2 305 823/ΡΤ phosphorylation of tau protein in the development of neurofibriliary pathology in Alzheimer's disease", PhD Thesis, University of Cambridge). - Os que reconhecem o fragmento central de tau truncado em Glu-391. Um exemplo é mAb 423 (Novak et al. (1993), loc. cit.) . Este anticorpo permite a detecção da ligação de um fragmento central de tau truncado terminando em Glu-391 a um fragmento semelhante terminando em Ala-390, que não é reconhecido por mAb 423. Esta truncagem ocorre naturalmente no curso de montagem de PHF na doença de Alzheimer (Mena et al. (1995), (1996), loc. cit.; Novak et al. (1993), loc. cit.; Mena et al. (1991), loc. cit.). Adicionalmente, quando tau é ligada através do domínio de repetição in vitro, a digestão com uma protease (p.ex. pronase) gera um fragmento detectável através de mAb 423 (ver Wischik et al., 1996, loc cit). Nos aspectos preferidos do presente método, uma vez que se refere à proteína tau, este anticorpo pode ser utilizado para distinguir a geração de fragmento produto clivado proteoliticamente (terminação em Glu-391) a partir da expressão constitutiva do fragmento molde (Ala-390).

Os que reconhecem um epitopo genérico de tau no domínio de repetição. Uma concretização preferida utiliza um anticorpo (p.ex. MAb 7.51). Quando é para detectar a agregação de tau-MAP2 ou MAP2-MAP2, pode ser utilizado um anticorpo que detecte um epitopo genérico de MAP2. 0 anticorpo 7.51 reconhece um epitopo genérico de tau localizado na antepenúltima repetição de tau (Novak et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88: 5837-5841), que está ocluso quando a tau está ligada numa configuração imunoquimica semelhante a PHF mas pode ser exposto após tratamento com ácido fórmico (Harrington et al. (1990), (1991), loc. cit.; Wischik et al. (1995a), loc. cit.). Tau normal solúvel ou tau ligada a microtúbulos, pode ser detectada utilizando mAb 7.51 sem tratamento com ácido fórmico (Harrington et al. (1991), loc. cit.; Wischik et al. (1995a), loc. cit.). A ligação de tau inteira no ensaio de ligação tau-tau está associada a oclusão parcial do epitopo do mAb 7.51. 25 ΕΡ 2 305 823/ΡΤ Ο anticorpo 27/342 reconhece um epitopo genérico de tau não especifico da espécie localizado entre Ser-208 e Ser-238 que está parcialmente ocluso no curso da interacção tau-tau (Lai, loc. cit.).

Os locais de ligação de alguns anticorpos monoclonais são mostrados na Figura 6.

Pesquisa de moduladores e inibidores

Tal como descrito acima, a presente divulgação refere-se à utilização de um sistema tal como aqui proporcionado, num método de modelação e identificação de agentes terapêuticos para tratamento das doenças aqui discutidas.

Um método típico para avaliação da capacidade de um agente para modular a agregação e/ou o processamento proteolítico de uma proteína precursora num produto em resposta à interacção com um fragmento molde, pode compreender: (a) proporcionar uma célula ou linha celular estável tal como discutido acima, (b) a sujeição da célula ao estímulo de modo a que a proteína precursora seja expressa na célula e onde a interacção do fragmento molde com a proteína precursora causa uma mudança conformacional na proteína de modo a causar agregação e processamento proteolítico da proteína precursora num fragmento produto, (c) a monitorização da produção do fragmento produto na presença do agente, (d) opcionalmente a comparação do valor obtido no passo (c) com um valor de referência. 0 valor de referência pode basear-se na observação histórica ou pode basear-se em experiências de controlo realizadas em paralelo, p.ex. nas quais um membro do ensaio (fragmento molde, proteína precursora, estímulo, agente) está modificado ou ausente.

Os vários métodos descritos acima podem compreender o passo adicional de correlação do resultado do passo (d) com a actividade moduladora do agente ou agentes. 26 ΕΡ 2 305 823/ΡΤ

Assim um método de identificação de um modulador da agregação de uma proteína associada a uma doença na qual a proteína sofre uma interacção conformacional induzida, pode compreender a realização de um método para indução de agregação tal como descrito acima na presença de um ou mais agentes suspeitos de serem capazes de modular (p.ex. inibir ou reverter) a agregação. O grau de agregação (e opcionalmente de processamento proteolítico) pode ser observado na presença ou ausência do agente, e os valores relativos correlacionados com a sua actividade como modulador.

Por exemplo, pode ser adicionada uma substância de teste a um sistema celular tal como descrito acima, e as células incubadas durante um período de tempo suficiente para permitir a ligação e demonstrar a inibição da ligação. O complexo de tau ligado pode ser detectado, p.ex. utilizando um anticorpo marcado de modo adequado tal como MAb 7.51 num immunoblot do extracto celular total, ou qualquer outro método de detecção adequado.

Quando é empregue um método de pesquisa para este fim, i.e. para a identificação de compostos moduladores/ inibidores, pode ser utilizado um ensaio não competitivo ou competitivo. Por exemplo, num ensaio competitivo do tipo bem conhecido na arte, o efeito de um inibidor ou modulador conhecido pode ser comparado na presença ou ausência de mais substâncias ou agentes de teste, para determinar a capacidade da substância de teste para competir com o inibidor/modulador conhecido pela ligação à proteína de interesse. São igualmente proporcionados métodos de produção de moduladores (por exemplo, inibidores) que estão descritos acima, mas que adicionalmente compreendem o passo de produção do modulador assim identificado.

Especificidade da inibição

Os métodos de pesquisa podem ser utilizados para pesquisar compostos que demonstrem as propriedades de inibição competitiva selectiva de agregação de proteína relacionada com doença (p.ex. ligação tau-tau, tau-MAP2, ou 27 ΕΡ 2 305 823/ΡΤ de outra proteína), sem interferência com qualquer ligação "normal" na qual a proteína precursora participe (p.ex. tau ou MAP2 à tubulina, ou por analogia, outras proteínas precursoras com os seus parceiros de ligação até ao ponto em que estes são conhecidos).

Especif icamente no caso de tau, um método para determinação de qualquer possível interferência da ligação de tau, MAP2 ou um derivado destes à tubulina através de potenciais inibidores/moduladores, compreende o contacto de uma preparação de tubulina despolimerizada ou microtúbulos estabilizados com taxol com o agente, seguido de detecção da ligação tau-tubulina ou MAP2-tubulina. A ligação tau-tubulina pode também, por exemplo, ser demonstrada através de uma distribuição citosquelética normal, tal como descrito em p.ex. WO 96/30766. Os métodos para a preparação de proteínas de tubulina ou fragmentos destas, possivelmente em combinação com parceiros de ligação, são conhecidos na arte e são descritos p.ex. por Slobada et al. (1976, em: "Cell Mobility" (R. Goldman, T. Pollard e J. Rosenbaum, eds.), Cold Spring Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, págs. 1171-1212). Métodos análogos para outras proteínas possuindo funções "de doença" e "normais" ocorrerão aos peritos na arte à luz da presente divulgação.

Viabilidade celular

Quando desejado, os métodos podem incluir ainda o passo de teste da viabilidade das células expressando a proteína molde e opcionalmente a proteína precursora, p.ex. através da utilização de um estojo de ensaio de lactato-desidrogenase (Sigma).

No caso onde está a ser investigada a agregação tau-tau, tau-MAP2 ou MAP2-MAP2 (ver acima, em "especificidade"), este passo pode também proporcionar uma indicação de qualquer interferência pelo agente de teste na ligação de tau ou MAP2 à tubulina, uma vez que a inibição ou interferência na ligação tau-tubulina ou MAP2-tubulina se correlacionará até certo ponto com uma menor capacidade das células para se dividirem, e assim com menor viabilidade celular. 28 ΕΡ 2 305 823/ΡΤ A viabilidade celular pode ser utilizada para derivar um valor de DL50 para o agente.

Os inibidores preferidos terão um índice terapêutico (DL50/B50 - ver discussão da Figura 9) de pelo menos 2, 5, 10 ou 20.

Escolha do agente de teste

Os compostos que são testados podem ser qualquer um que seja desejado para avaliar a actividade relevante.

Os métodos podem servir como pesquisas primárias, para identificar novos inibidores/moduladores, ou como pesquisas secundárias para estudar inibidores/moduladores conhecidos em mais detalhe.

Os agentes podem ser compostos químicos naturais ou sintéticos. Os anticorpos que reconhecem um agregado de proteína semelhante a doença de Alzheimer e/ou que modulam a agregação de proteína semelhante a doença de Alzheimer formam uma classe de putativos compostos inibidores ou moduladores em relação ao processo de agregação. Mais habitualmente, serão testados compostos químicos relativamente pequenos, de preferência que sejam capazes de atravessar a barreira hematoencefálica. Outras qualidades que podem ser desejáveis estabelecer em conjunto com (antes, simultaneamente com, ou após) a utilização do presente invento, incluem: actividade cardiovascular minimamente nociva, não tóxica para a medula óssea; mínima toxicidade hepática e renal; boa absorção oral; forma não metabolizada a inactiva, e por aí adiante. Tal como os peritos na arte estarão a par, estes testes podem ser efectuados numa base comercial através de métodos bem estabelecidos para compostos que seja desejado testar desde modo.

Para uma substância de teste típica e putativo modulador, quando possível, a solubilidade será primeiro determinada, p.ex. a partir do índice Merck. Quando a substância é solúvel em solução aquosa, pode ser preparada uma solução de reserva concentrada p.ex. a 5-20 mM em PBS. 29 ΕΡ 2 305 823/ΡΤ

Imediatamente antes da utilização esta pode ser diluida com meio de cultura de tecidos para dar uma solução de reserva de trabalho p.ex. a 100 μΜ e introduzida nas células para dar uma concentração final entre 0-10 μΜ para a maioria dos compostos. Naturalmente, se for desejado testar compostos a uma concentração superior a 10 μΜ, a concentração da solução de reserva de trabalho pode ser aumentada apropriadamente.

Quando a substância não é solúvel em solução aquosa, as soluções de reserva podem ser feitas num solvente apropriado (determinado a partir do índice Merck ou experimentalmente), p.ex. etanol a 5-29 nM. Esta pode novamente ser diluida com meio de cultura de tecidos imediatamente antes da utilização para dar uma solução de trabalho, p.ex. à concentração de 100 μΜ, e adicionada às células para dar uma concentração final de p.ex. 0-10 μΜ para a maioria dos compostos de teste. Tal como acima, para testar compostos a uma concentração superior a 10 μΜ a concentração da solução de trabalho será aumentada conforme apropriado. 0 perito na arte notará que a quantidade de substância ou composto de teste que é adicionada num ensaio de pesquisa, e de facto o modo como é introduzida, pode ser determinada pelos peritos na arte, se necessário através da utilização de uma série de ensaios. Quando o composto administrado e a linha celular têm condições óptimas em conflito (p.ex., em termos de pH ou força iónica, etc.) deve ser ensaiada uma variedade de condições para encontrar um nivel óptimo de compromisso. As concentrações iniciais podem ser seleccionadas para estarem a um nivel em que possam ser realisticamente utilizadas no contexto terapêutico, i.e., seriam não letais para um paciente (ver comentários sobre dosagens abaixo). À luz da presente divulgação, uma tal abordagem não apresentará qualquer esforço adicional ao perito na arte.

Pesquisa de fenotiazinas São aqui igualmente descritos compostos identificados por um método de pesquisa como aqui proporcionado, e composições compreendendo esses inibidores/moduladores de polimerização conformacional induzida de uma proteína. 30 ΕΡ 2 305 823/ΡΤ

Tal como descrito p.ex. em WO 96/30766, entre os agentes que se verificou serem capazes de inibir polimerização conformacional induzida patológica de proteínas tais como tau estão certas diaminofenotiazinas. Exemplos incluem tionina, azul de metileno (MB), cloreto de tolónio e azul de dimetilmetileno (DMMB) que são de particular interesse como potenciais agentes terapêuticos para utilizar na prevenção de agregação tau-tau em doenças tais como doença de Alzheimer.

De forma interessante, como descrito com mais detalhes nos Exemplos, os presentes inventores utilizaram os métodos aqui descritos para demonstrar que o mecanismo de acção de compostos tais como o MB em polimerização conformacional induzida tal como a agregação tau-tau é principalmente de natureza espacial. Adicionalmente, demonstrou-se que o potente efeito inibidor espacial, p.ex. das diaminofenotiazinas sobre a ligação tau-tau, é dependente do coeficiente de difusão do composto. As várias implicações destas observações em termos de pesquisa e formulação de compostos estão discutidas adiante com mais detalhes.

Esta constatação é particularmente inesperada quando se considera a descrição da utilização destes compostos no estado da técnica. Assim, por exemplo, estes compostos eram anteriormente conhecidos como sendo úteis no tratamento de meta-hemoglobinemia, onde se demonstrou que a sua acção é mediada pela redução catalítica de hemoglobina oxidada por transferência de electrões a partir do fornecimento intrínseco da célula de nucleótidos de piridina reduzidos (veja-se, p.ex. Hauschild, F. (1936) Arch. Exp. Pathol. Pharmacol. 182:118; "Pharmacological Basis of Therapeutics", First Edition (1941), Goodman e Gilman; Hrgovic, Z. (1990) Anãsth. Intensivther. Notfallmed. 25: 172; e Cudd, L. et al. (1996) Vet Human Toxicol. 38(5): 329) e na profilaxia de psicose maníaco-depressiva (Narsapur, S.L. (1983) Journal of Affective Disorders 5:155; Naylor, G.J. (1986) Biol. Psychiatry 21:915). Apesar disto, o MB, a tionina e o cloreto de tolónio são realmente agentes oxidantes intrinsecamente fracos e, na ausência de um fornecimento de nucleótidos de piridina reduzidos, oxidam proteínas tais como hemoglobina (Morse, E. (1988) Annals of Clin. Lab. Sei. 18(1):13). Este 31 ΕΡ 2 305 823/ΡΤ efeito tóxico pode ser utilizado para inactivar virus, e o MB tem sido consequentemente explorado terapeuticamente num processo para remoção de HIV e virus da hepatite de produtos do sangue (Chapman, J. (1994), Transfusion Today 20:2; Wagner, S. J. (1995) Transfusion 35(5):407). Pensa-se que o mecanismo de acção deste efeito envolve a intercalação de MB no ADN. O composto é impulsionado para um estado redox mais elevado por fotoactivação e, quando cai de novo para o seu estado fundamental, produz oxigénio singuleto que oxida o ADN e o inactiva (Ben-Hur, E. et ai. (1996) Transfusion Medicine Reviews, Vol. X, No. 1: 15; Margolis-Nunno, H. et al. (1994), Transfusion 34(9): 802). A exploração do efeito tóxico de diaminofenotiazinas fotoactivadas foi igualmente sugerida para o tratamento do cancro. No interior das células, os compostos que foram fotoactivados para a forma oxidada podem danificar a mitocôndria (Darzynkiewicz, Z. et al. (1988), Câncer Research 48: 1295) e/ou os microtúbulos (Stockert, J. et al. (1996) Câncer Chemother. Pharmacol. 39: 167).

Assim, numa revisão do estado da técnica, é evidente que foram propostos dois mecanismos possíveis para explicar a acção de compostos tais como o MB e a tionina sobre entidades tais como ADN ou proteínas. O primeiro é a redução catalítica, p.ex. de proteínas oxidadas, por meio de transferência de electrões de nucleótidos de piridina reduzidos na célula. O segundo mecanismo proposto é a oxidação, e consequente inactivação, p.ex. de ADN, por uma forma fotoactivada, oxidada, de compostos tais como o MB. À luz destes dois mecanismos, podia ser razoável assumir que o efeito inibidor da associação tau-tau de compostos tais como o MB era também atribuível a uma actividade redox. Ou seja, pode-se assumir que estes compostos inibem a polimerização conformacional induzida tal como a associação tau-tau actuando como agentes oxidantes fracos ou como agentes de redução catalítica.

Assim, o trabalho dos presentes inventores, ao demonstrar que o mecanismo de acção é principalmente de natureza espacial, tem implicações inesperadas para a escolha, determinação, formulação e utilização destes compostos no contexto das doenças aqui discutidas. 32 ΕΡ 2 305 823/ΡΤ

Em particular, foram identificados certos compostos como produtos terapêuticos exequíveis que teriam sido descartados com base no resultado de ensaios do estado da técnica. Especificamente, Wischik et al. 1996 (loc cit) reportaram na páqina 1217 que a concentração de MB necessária para a inibição era superior à que podia ser atinqida clinicamente. Contudo, os resultados aqui mostram que a redução de MB modifica a sua capacidade de empilhamento de tal modo que aumenta o seu potencial inibidor para um nível em que se torna clinicamente relevante para o tratamento de, p.ex. uma doença associada à aqreqação de tau. Isto é discutido com mais detalhes adiante em relação à medição de coeficientes de difusão (que são também determinados, em parte, pela capacidade do composto 'empilhar'). A Fiqura 8 mostra a estrutura de apenas alquns dos compostos que foram testados no ensaio à base de células. As Fiquras 9-16 demonstram a potência acrescida de certos compostos na forma reduzida, mais alguns compostos de controlo.

Assim, num aspecto do presente invento é divulgada a utilização de uma diaminofenotiazina na preparação de uma composição medicamentosa para utilização no tratamento ou profilaxia de uma tauopatia, em que a preparação compreende o passo de pré-redução da diaminofenotiazina de modo que esta esteja presente pelo 80, 90, 95 ou 99% na forma reduzida (leuco-), e em que a diaminofenotiazina é pré-reduzida por adição de um agente redutor exógeno, e em que a forma reduzida é liofilizada, e em que a diaminofenotiazina pré-reduzida (leuco-) tem a fórmula: (I)

R 11 9 11 R,

R, R 33 ΕΡ 2 305 823/ΡΤ em que Rl, R3, R4, R6, R7 e R9 são independentemente seleccionados entre hidrogénio, halogéneo, hidroxi, carboxi, alquilo, haloalquilo ou alcoxi substituídos ou não substituídos; R5 é hidrogénio; e cada um de RIO e Rll é independentemente seleccionado entre hidrogénio, hidroxi, carboxi, alquilo, haloalquilo ou alcoxi substituídos ou não substituídos; ou é um seu sal farmaceuticamente aceitável.

Preferivelmente, o composto é uma diaminofenotiazina que possui 0, 2, 3 ou 4 grupos metilo em torno do núcleo de diaminofenotiazina. Preferivelmente, a diaminofenotiazina está assimetricamente metilada (p.ex., cloreto de tolónio, Azure A, Azure B e tionina).

Preferivelmente o composto é seleccionado entre Azul de Metileno, cloreto de Tolónio, Tionina, Azure A, Azure B ou Azul de 1,9-Dimetilmetileno.

As fenotiazinas para utilização no presente invento podem ser fabricadas através dos processos referidos em textos padrão (p.ex. Merck Manual, Houben-Weyl, Beilstein, E. III/IV 27, 1214 ff, J. Heterocycl. Chem. 21, 613 (1984)).

Em alternativa à administração destes compostos directamente, eles podem ser administrados na forma de um precursor, para conversão na forma activa por um agente de activação produzido em, ou direccionado para, as células a tratar. Por exemplo, o azul de metileno pode ser administrado na forma de um precursor, ou pode ele próprio servir como precursor do composto Azure A.

Estabilização da forma reduzida

Sabe-se que alguns destes compostos de interesse circulam no corpo predominantemente na forma reduzida. Por exemplo, para uma discussão da farmacocinética do MB, veja-se p.ex. DiSanto, A. et al. (1972) Journal Pharm. Sei. 61 (7): 1086 e DiSanto, A. et al. (1972) Journal Pharm. Sei 34 ΕΡ 2 305 823/ΡΤ 61(7):1090. Verifica-se que apenas a forma reduzida de compostos como o MB atravessa a barreira hematoencefálica (Chapman, D.M. (1982) Tissue and Cell 14 (3) :475; Miiller, T. (1992) Acta Anat. 144:39; Miiller, T. (1994) J. Anat. 184:419; Becker, H. et al. (1952) Zeitschrift fur Naturforschung 7:493; Miiller, T. (1995) It. J. Anat. Embryol. 100 (3) : 179; Miiller, T. (1998) Histol. Histopathol. 13:1019).

Referências como estas ilustram que a forma reduzida de compostos como o MB representa uma formulação exequível e farmaceuticamente aceitável para administração a sujeitos. O MB foi anteriormente utilizado clinicamente numa preparação oral. Testes toxicológicos adicionais são contudo necessários antes de se alcançada a sua aceitação clínica. A semivida do MB e compostos relacionados (p.ex. cloreto de tolónio) no sangue é de aproximadamente 100 minutos. É evidente que formulações de libertação lenta de compostos com estas semividas relativamente curtas podem melhorar substancialmente a disponibilidade do composto e portanto a sua eficácia terapêutica. A Figura 17 mostra que compostos como os aqui discutidos diferem grandemente na sua extensão de redução nas condições do ensaio (excesso de DTT de aprox. 500:1, aos 120 minutos). Como mostra esta figura, a tionina é completamente reduzida sob estas condições, o cloreto de tolónio é reduzido para um nível intermédio e o MB e o DMMB são relativamente pouco reduzidos. As quantidades de redutor vulgarmente utilizadas necessárias para atingir, digamos, 90% de redução da forma oxidada em 10 minutos, antes da administração\absorpção, podem não ser exequíveis (p.ex. razão de 2000:1 de DTT para MB) .

Como ilustra a Figura 18, a extensão da redução de MB sob condições fisiológicas pode ser grandemente acelerada ao permitir a redução ao longo da noite e depois liofilizando a forma reduzida. O liofilizado fica reduzido em 90% em 10 minutos, após solubilização em condições que imitam a acidez gástrica (HC1 5 mM). Cápsulas contendo uma forma da diaminofenotiazina pré-reduzida com ácido ascórbico a uma razão em mg de 1,5-2 representam uma formulação adequada, se não óptima, para utilização terapêutica. 35 ΕΡ 2 305 823/ΡΤ

As mesmas considerações aplicam-se a outros compostos, tais como tionina e cloreto de tolónio, que são mais prontamente reduzidos do que o MB, mas cuja extensão da redução pode ser acelerada de uma maneira como a descrita acima.

Assim, os agentes de fenotiazina do presente invento são proporcionados como compostos pré-reduzidos em preparações liofilizadas, opcionalmente na presença de um agente estabilizante.

Um agente para a estabilização da forma preferida do composto activo (i.e. uma forma do composto possuindo um abaixo coeficiente de difusão, p.ex. a forma completamente reduzida do composto) pode ser um agente redutor ou antioxidante. O agente pode servir tanto para converter uma forma do composto inibidor (p.ex. a forma oxidada) na sua forma preferida (p.ex. a forma reduzida), como para estabilizar essa forma preferida (p.ex. reduzida). Alternativamente, o composto inibidor pode ser adicionado à composição na sua forma preferida (p.ex. já reduzida), de modo a que o agente sirva meramente para manter o composto nesta forma. É particularmente adequado para utilização na conversão para, e/ou estabilização de, a forma reduzida do agente activo (p.ex. a diaminofenotiazina) compreendido nas formulações do presente invento, o antioxidante ascorbato. O ascorbato foi anteriormente utilizado para minimizar os danos oxidativos de proteínas (Parkkinen J. (1996), "Thrombosis and Haemostasis" 75(2): 292). Uma formulação como aqui proporcionada pode assim compreender vantajosamente uma diaminofenotiazina, especialmente MB, cloreto de tolónio, DMMB ou tionina, em combinação com ascorbato, em proporções, concentrações e dosagens adequadas.

Em outras concretizações a forma reduzida (leuco-) pode ser favorecida pela adição ou selecção de grupos constituintes apropriados. 36 ΕΡ 2 305 823/ΡΤ

Assim, aspectos do invento incluem adicionalmente um método de preparação de um medicamento para utilização no tratamento ou profilaxia de uma doença como descrito acima, método este que compreende o passo de redução do composto (de modo que está pelo menos 80, 90, 95 ou 99% reduzido) e a sua estabilização numa composição liofilizada na forma reduzida, antes da administração de uma dose apropriada a um paciente que necessite da mesma.

Dosagem de terapêuticos A administração é preferivelmente numa "quantidade profilacticamente eficaz" ou numa "quantidade terapeuticamente eficaz" (conforme o caso, embora profilaxia possa ser considerada terapia), sendo esta suficiente para apresentar beneficio ao indivíduo. A real quantidade administrada, e a taxa e horário da administração, dependerão da natureza e gravidade da doença a tratar. A prescrição do tratamento, p.ex. decisões sobre a dosagem, etc., é da responsabilidade dos clínicos gerais e outros médicos, e tipicamente tem em conta o distúrbio a tratar, a condição do paciente individual, o local de entrega, o método de administração e outros factores conhecidos dos profissionais. A penetração no SNC do MB após administração sistémica foi descrita por Muller (1992; Acta Anat. 144:39). Sabe-se que o Azure A e o Azure B ocorrem como produtos normais da degradação metabólica do MB (Disanto e Wagner (1972a) J. Pharm. Sei. 61: 598; Disanto e Wagner (1972b) J. Pharm. Sei. 61: 1086). A farmacocinética e a toxicidade do cloreto de tolónio em ovelhas está discutida por Cudd et ai. (1996) Vet Human Toxic 38 (5) 329-332.

Para a tionina, que é aqui especif icamente exemplificada, uma dosagem diária entre 1 e 1000 mg pode ser adequada, preferivelmente dividida em 1 a 8 doses unitárias, que podem, por exemplo, ser da mesma quantidade. Será contudo notado que estes limites dados acima podem ser ultrapassados quando necessário, o que poderá ser apropriado com outros compostos do invento que não a tionina, que têm superior ou inferior actividade ou biodisponibilidade. 37 ΕΡ 2 305 823/ΡΤ A Figura 19 mostra a variação dos niveis tecidulares de MB vs a dose IV. A farmacocinética do azul de metileno foi estudada nos seres humanos, nos cães e nos ratos por DiSanto e Wagner, J Pharm Sei 1972, 61:1086-1090 e 1972, 61:1090-1094. Outros dados sobre a excreção urinária em seres humanos estão também disponíveis em Moody et al., Biol Psych 1989, 26: 847-858. Combinando os dados sobre a excreção urinária do MB em seres humanos, é possível derivar um modelo global para a distribuição de MB após uma única dose de 100 mg num indivíduo de 70 kg, assumindo absorção instantânea (Fig. 19B) . A excreção urinária contabiliza 54 - 98% da dose ingerida. Esta variabilidade é muito provavelmente devida à variabilidade na absorção, embora não possa ser excluída a variabilidade no metabolismo. Dos dados de excreção urinária é possível calcular que a depuração completa do corpo é de 56 mg/kg/h. Portanto, a dosagem necessária para atingir uma concentração tecidular alvo eficaz de 4 μΜ é de 1,73 mg/kg/dia (0,58 mg/kg tds) se houvesse absorção completa. Contudo, de Moody et al., é evidente gue a excreção urinária total, e portanto a biodisponibilidade efectiva, é em si uma função da dose. A dose oral necessária para entregar 1,73 mg/kg/dia é de aproximadamente 2x a dosagem calculada com base na depuração completa do corpo. Assim, a real dose necessária é da ordem de 3,2 mg/kg/dia. Esta é próxima da dosagem oral mínima de rotina utilizada clinicamente em seres humanos, p.ex. no tratamento de infecção crónica do tracto urinário (390 mg/dia) . A dosagem oral de manutenção nos seres humanos é portanto de aproximadamente 225 mg/dia, ou 75 mg tds. Os níveis tecidulares de pico são atingidos após aproximadamente lhe a semivida tecidular é de cerca de 12 horas. O azul de metileno existe na forma oxidada azul carregada, e na forma reduzida leuco-metileno incolor não carregada. Mostrámos experimentalmente em células que a concentração tecidular alvo em células necessária para prevenir a agregação de tau em 50% (ie a EC50) é de 4 μΜ para o azul de metileno reduzido, e gue é a forma leuco- gue é preferencialmente activa. É mostrado por DiSanto e Wagner (1972) gue aproximadamente 78% do azul de metileno recuperado 38 ΕΡ 2 305 823/ΡΤ na urina está na forma reduzida, e de estudos anatómicos após administração iv, a única forma que está ligada a tecidos é a forma reduzida incolor, que fica oxidada na coe azul por exposição ao ar após dissecação post-mortem. A única forma de azul de metileno que atravessa a barreira hematoencefálica após administração iv é a forma reduzida (Muller, Acta Anat 1992, 144:39-44 e Becker e Quadbeck, 1952). Portanto, o azul de metileno absorvido oralmente é muito rapidamente reduzido no corpo, e assim permanece até à excreção, possivelmente sofrendo outra modificação química que o estabilize numa forma reduzida. É altamente provável que a variabilidade na absorção oral seja determinada largamente pela eficiência da redução inicial no tracto GI. Uma maneira de conseguir mais absorção fiável é portanto pré-reduzir o azul de metileno com ácido ascórbico. Mostrámos com estudos in vitro que esta conversão é bastante lenta, de modo que demora 3 horas a atingir 90% de redução do azul de metileno em água na presença de uma razão de 2x em mg de ácido ascórbico. Portanto, a dosagem de azul de metileno que é mais provável que assegure uma absorção fiável será de 3,5 mg/kg/dia de azul de metileno pré-reduzido durante pelo menos 3 horas na presença de 7 mg/kg/dia de ácido ascórbico. É igualmente possível que o MB possa ser activo em menores concentrações no Homem, e que uma gama de doses clinicamente exequíveis seja portanto de 20 mg tds, 50 mg tds ou 100 mg tds, combinadas com uma razão de 2x em mg de ácido ascórbico de modo a atingir mais do que 90% de redução antes da ingestão.

Formulação e administração de terapêuticos

Os compostos adequados, tais como os que possuem uma fórmula como apresentado acima ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis, podem ser incorporados em composições deste aspecto do presente invento após testes adicionais quanto à toxicidade. As composições podem incluir, em adição aos constituintes acima, excipientes, transportadores, tampões, estabilizantes ou outros materiais farmaceuticamente aceitáveis bem conhecidos dos peritos na especialidade. Estes 39 ΕΡ 2 305 823/ΡΤ materiais não deverão ser tóxicos e não deverão interferir com a eficácia do ingrediente activo. A natureza precisa do transportador ou outro material pode depender da via de administração.

Quando a composição é formulada numa composição farmacêutica, a sua administração pode ser efectuada parentericamente tal como oralmente, na forma de pós, comprimidos, comprimidos revestidos, drageias, cápsulas de gelatina duras e moles, soluções, emulsões ou suspensões, nasalmente (p.ex. na forma de sprays nasais) ou rectalmente (p.ex. na forma de supositórios). Contudo, a administração pode também ser efectuada parentericamente tal como por via intramuscular, intravenosa, cutânea, subcutânea ou intraperitoneal (p.ex. na forma de soluções para injecção).

Quando a composição farmacêutica está na forma de um comprimido, pode incluir um transportador sólido tal como gelatina ou um adjuvante. Para o fabrico de comprimidos, comprimidos revestidos, drageias e cápsulas de gelatina duras, os compostos activos e seus sais de adição de ácido farmaceuticamente aceitáveis podem ser processados com excipientes inorgânicos ou orgânicos, farmaceuticamente inertes. Podem ser utilizados lactose, amido de milho ou seus derivados, talco, ácido esteárico ou seus sais, etc., por exemplo, tais como excipientes para comprimidos, drageias e cápsulas de gelatina duras. Os excipientes adequados para cápsulas de gelatina moles são, por exemplo, óleos vegetais, ceras, gorduras, polióis semi-sólidos e líquidos, etc.

Quando a composição está na forma de uma formulação farmacêutica líquida, incluirá geralmente um transportador líquido tal como água, petróleo, óleos animais ou vegetais, óleo mineral ou óleo sintético. Podem também ser incluídos solução salina fisiológica, solução de dextrose ou outro sacárido ou glicóis tais como etilenoglicol, propilenoglicol ou polietilenoglicol. Outros excipientes adequados para o fabrico de soluções e xaropes são, por exemplo, água, polióis, sacarose, açúcar invertido, glucose, trealose, etc. Os excipientes adequados para soluções para injecção são, por exemplo, água, álcoois, polióis, glicerol, óleos vegetais, etc. 40 ΕΡ 2 305 823/ΡΤ

Os excipientes adequados para supositórios são, por exemplo, óleos naturais ou endurecidos, ceras, gorduras, polióis semi-liquidos ou líquidos, etc.

Adicionalmente, as preparações farmacêuticas podem conter agentes conservantes, solubilizantes, substâncias que aumentam a viscosidade, agentes estabilizantes, agentes molhantes, agentes emulsionantes, agentes edulcorantes, agentes corantes, agentes aromatizantes, sais para várias a pressão osmótica, tampões ou agentes de revestimento.

Para injecção intravenosa, cutânea ou subcutânea, ou infusão intra-cateter no cérebro, o ingrediente activo estará na forma de uma solução aquosa parentericamente aceitável que está isenta de pirogénios e possui pH, isotonicidade e estabilidade adequadas. Os peritos na especialidade relevante são bem capazes de preparar soluções adequadas utilizando, por exemplo, veículos isotónicos tais como Cloreto de Sódio para Injecção, Injecção de Ringer, Injecção de Ringer Lactada. Conservantes, estabilizantes, tampões e/ou outros aditivos podem ser incluídos conforme necessário.

Uma composição de acordo com as utilizações do presente invento podem ser administradas isoladamente, ou em combinação com outros tratamentos, seja simultânea ou sequencialmente, dependendo da condição ou doença a tratar.

De acordo com o presente invento, as formulações aqui proporcionadas podem ser utilizadas para a profilaxia ou tratamento de doença de Alzheimer, doença dos neurónios motores, doença do corpo de Lewy, doença de Pick ou Paralisia Supranuclear Progressiva, ou qualquer outra condição ou doença em que está implicada a polimerização conformacional induzida de uma proteína (veja-se a Figura 5). Em particular, como se descreve adiante em detalhe, a formulação pode ser utilizada para o bloqueio, a modulação e a inibição da associação tau-tau patológica.

Podem encontrar-se exemplos das técnicas e protocolos acima mencionados em "Remington's Pharmaceutical Sciences", 16th edition, Osol, A. (ed.), 1980. 41 ΕΡ 2 305 823/ΡΤ

Num aspecto adicional, o presente invento refere-se à utilização de uma composição do aspecto anterior, no prognóstico ou no tratamento de uma condição em que está implicada a polimerização conformacional induzida de uma proteína. A condição pode ser uma doença tal como a doença de Alzheimer.

Utilização de difusão constante como pesquisa

Como apresentado acima, por conversão de um composto na sua forma reduzida, e/ou estabilização da sua forma reduzida, a potência inibidora do composto pode ser optimizada.

Contudo, como descrito com mais detalhes nos exemplos adiante, surpreendentemente, o potencial redox de um composto não determina directamente a sua actividade inibidora em relação à polimerização conformacional induzida de proteínas, e, portanto, nem o modelo de oxidação nem um modelo de redução catalítica são relevantes para um entendimento da actividade de compostos como inibidores da agregação tau-tau.

Os inventores verificaram que existe uma forte correlação inversa entre o potencial inibidor de um composto em relação à ligação tau-tau e o quadrado ou o cubo do seu coeficiente de difusão. 0 coeficiente de difusão é determinado pela quantidade de empilhamento de moléculas sem carga num cátodo. Experimentalmente, isto pode ser determinado por medição do fluxo de corrente numa pilha redox ao potencial de redução. 0 coeficiente de difusão está inversamente correlacionado com o grau de agregação das espécies sem carga (i.e. reduzidas) no interior da camada de Helmholtz que se forma no cátodo. Estes agregados formam-se através de interacções de empilhamento pi entre os sistemas de anel fenol.

Num modelo, quanto menor o coeficiente de difusão, maior a tendência para empilhar, e mais potente é o composto na inibição da polimerização conformacional induzida de 42 ΕΡ 2 305 823/ΡΤ proteínas tal como a ligaçao tau-tau, como reflectido por um baixo K±. O empilhamento de diaminofenotiazinas pode ser menos favorecido quando a molécula está na forma oxidada, uma vez que esta forma tem carga, e portanto pode-se conceber que repele outras moléculas afins. Este fenómeno pode assim explicar a maior eficácia da forma reduzida de diaminofenotiazinas na inibição da agregação de tau (veja-se p . ex. a Figura 9) .

Assim, uma determinação do coeficiente de difusão (dependente da 'capacidade de empilhamento', que é por sua vez dependente do formato e da carga) pode ser um passo útil no desenvolvimento de moduladores eficazes. Um destes parâmetros estereoquimicamente relevantes é o coeficiente de difusão que pode ser diminuído proporcionando diaminofenotiazinas na sua forma reduzida.

Assim, os presentes inventores ensinam aqui que a eficácia de um composto no bloqueio, modulação ou inibição da polimerização conformacional induzida de uma proteína (aqui adiante referida como "potência inibidora" pode ser testada num método de ensaio que inclui o passo de medição do coeficiente de difusão do composto. 0 passo de medição do coeficiente de difusão do agente de teste pode ser incorporado em qualquer etapa de um programa de pesquisa mais amplo para identificação ou optimização de moduladores putativos ou estabelecidos. 0 método mais amplo irá tipicamente incluir mais passos de ensaio como aqui descrito, ou no estado da técnica (p.ex. WO 96/30766). Assim, neste último caso, por exemplo, quando se pretende pesquisar agentes que bloqueiam, modulam ou inibem a agregação tau-tau, o método pode incluir os passos de contacto de: (a) uma proteína tau ou um seu derivado contendo o fragmento nuclear de tau, com; (b) uma substância a testar quanto à sua capacidade para bloquear, modular ou inibir a agregação tau-tau; e 43 ΕΡ 2 305 823/ΡΤ (c) uma proteína tau marcada ou um seu derivado marcado que é capaz de se ligar à proteína tau do passo (a) ou uma proteína tau ou um seu derivado que é distinto da proteína tau do passo (a) e também é capaz de se ligar à proteína tau do passo (a). O coeficiente de difusão pode ser medido através de qualquer meio adequado, por exemplo de acordo com o método de Murthy e Reddy (J Chem Soc., Faraday Trans J 1984, 80. 2745-2750). Esta publicação também incluiu alguns valores determinados de coeficientes de difusão para corantes de fenotiazina.

Assim, o coeficiente de difusão pode adequadamente ser medido por voltametria cíclica num meio ácido aquoso, em que a magnitude do fluxo de corrente numa pilha redox é testado ao potencial de redução do composto. O método pode incluir o passo de realização de testes adicionais ao agente, p.ex. para determinar a sua especificidade como inibidor ou modulador da polimerização conformacional induzida de uma proteína particular (p.ex. tau), ou para determinar a sua aceitabilidade ou adequabilidade farmacêuticas como agente para administração a um animal. O surpreendente ensinamento aqui proporcionado, de que a eficácia de um agente no bloqueio, modulação ou inibição da polimerização conformacional induzida de uma proteína está dependente, pelo menos em parte, do coeficiente de difusão do agente, pode ser utilizado na optimização da eficácia de um agente. Os presentes inventores estabeleceram que a potência inibidora de um agente relativamente à polimerização conformacional induzida de uma proteína está inversamente relacionada com o quadrado ou o cubo do seu coeficiente de difusão. Por outras palavras, a potência inibidora de uma agente pode ser optimizada proporcionando o agente numa forma em que o seu coeficiente de difusão é minimizado.

Os aspectos do invento serão mais bem compreendidos com referência às seguintes Figuras e dados experimentais, apresentados apenas a título de exemplo. 44 ΕΡ 2 305 823/ΡΤ

FIGURAS A Figura 1 mostra uma ilustração esquemática da estrutura de um filamento helicoidal emparelhado (cima) e da imunoquimica de feixes neurofibrilhares durante a progressão da doença de Alzheimer (baixo). A Figura 2 mostra um esquema conceptual em que factores de nucleação críticos proporcionam uma "semente" que inicia a captura de tau, que se torna então autocatalítica. A Figura 3 mostra um putativo modelo patogénico da doença de Alzheimer. A agregação de tau é um processo proximal antes da insuficiência do transporte axonal e consequente morte neuronal. A cascata de agregação de tau pode ser desencadeada por um evento de sementeira/nucleação que surja de mudanças a montante ou de mutações primárias no gene de tau. A Figura 4 mostra como a indução de tau inteira pode conduzir à sua conversão no fragmento de 12 kDa, desde que exista alguma tau de 12 kDa preexistente na célula. A Figura 5 mostra uma tabela listando proteínas que têm um papel em doenças de agregação de proteínas. São também listadas as próprias doenças, o domínio de agregação e/ou a mutação que se crê estar envolvida, e o putativo tamanho (máximo) das subunidades de fibrilha. É dada uma ou mais referências da literatura para cada proteína. A Figura 6 mostra uma ilustração esquemática dos locais de ligação de vários anticorpos monoclonais a diferentes formas de tau truncadas em N e C. A Figura 7 mostra as sequências nucleotídica e de aminoácidos prevista de uma isoforma da proteína tau humana. A sequência foi deduzida a partir do clone de ADNc htau40. A Figura 8 mostra as estruturas de tionina, cloreto de tolónio, clorpromazina e tacrina. 45 ΕΡ 2 305 823/ΡΤ A Figura 9 dá os dados do ensaio celular para diaminofenotiazinas, e uma antroquinona estruturalmente aparentada juntamente com valores aparentes de Kl, determinados tal como aqui descrito. Nas Figuras e Exemplos daqui, um outro parâmetro, B50, foi calculado para expressar actividade de um modo directamente relacionado com as condições do ensaio baseado em células e proporcionando portanto uma indicação da concentração tecidular que será necessária para alcançar a correspondente actividade in vivo. 0 valor de B50 é a concentração do composto de teste utilizado no ensaio celular no qual a produção relativa da banda de 12 kDa a partir da tau inteira foi reduzida para 50% da observada na ausência do composto. Existe uma relação linear simples entre o valor aparente de Kl e o valor de B50 como se segue: B50 celular = 0,0217 χ Kl

Para comparar a utilidade relativa de compostos como agentes terapêuticos, pode ser desejado calcular um valor de DL50. Quando as propriedades inibidoras são semelhantes, os compostos preferidos para utilização clinica podem ser os que têm o valor de DL50 mais elevado. Um indice terapêutico (Rxlndx) pode ser calculado para cada um dos compostos testados nos ensaios celulares como se segue:

Rxlndx = DL50/B50 A toxicidade dos compostos pode ser medida através do número de células após uma exposição de 24 horas ao composto utilizando um estojo de ensaio de lactato-desidrogenase ΊΌΧ-7 (Sigma Biosciences) de acordo com as instruções do fabricante após lise das células restantes. Alternativamente, pode ser utilizado um estojo de Promega UK (CytoTox 96), novamente de acordo com as instruções do fabricante. A Figura 10 mostra os resultados da utilização de tionina reduzida no método aqui descrito, com base no conjunto de dados de 7 experiências. Os dados celulares observados para a produção da banda de 12 kDa podem ser intimamente ajustados (i.e., observados vs previstos, coeficiente de correlação >0,9), a uma função padrão 46 ΕΡ 2 305 823/ΡΤ descrevendo a inibição da ligação tau-tau in vitro. Para obter este ajuste, é necessário fazer duas assunções, que são consistentes com os resultados de outros estudos baseados em células e in vitro: 1) a concentração intracelular de tau é de aproximadamente 500 nM; 2) a afinidade de ligação tau-tau é de 22 nM.

Utilizando estas assunções, a função para a actividade celular prevista através do modelo de inibição padrão é:

Actividade = [tau]/([tau]Kd*(1+[tionina]/Kl)) e pode ser resolvida através de métodos numéricos padrão para derivar um valor para Kl aparente. Tal como indicado, o valor para a forma reduzida de tionina é 100 nM que é essencialmente o mesmo que o observado para a ligação tau-tau in vitro a uma concentração de tau de 500 nM, onde o valor de kDa para a ligação tau-tau sabe-se ser de 22 nM. Portanto, a actividade da tionina, quando a leitura é produção do produto truncado de 12 kDa a partir da tau inteira, pode ser explicada quantitativamente com base na extensão da inibição da ligação tau-tau ocorrendo ao longo do domínio de repetição dentro da célula. Isto confirma que a extensão da ligação tau-tau determina a produção da unidade central de tau proteoliticamente estável do PHF dentro da célula.

Todas as análises celulares subsequentes das actividades de outros compostos estão relatadas no mesmo formato padronizado, com as mesmas assunções em relação à concentração intracelular de tau (500 nM) e à afinidade da ligação tau-tau (22 nM) ao longo do domínio de repetição. A Figura 11 mostra os resultados para condições nas quais os agentes redutores foram omitidos (i.e., tionina oxidada cf. Figura 10).

Novamente a actividade celular é prevista através do modelo de inibição padrão:

Actividade [tau]/([tau]Kd*(1+[Tion. Ox.]/Kl)) 47 ΕΡ 2 305 823/ΡΤ

Neste caso, a tionina tem agora um valor de Kl aparente de 1200 nM. Isto confirma que é necessário que as diaminofenotiazinas estejam na forma reduzida para serem activas. Uma conclusão semelhante foi tirada da análise dos dados de ligação in vitro (resultados não mostrados). A Figura 12 mostra que através da utilização de condições redutoras ou parcialmente redutoras o azul-de-metileno parece ser muito mais activo no ensaio baseado em células que o previsto a partir de estudos in vitro nos quais a duração do ensaio (1-2 horas) não foi suficiente para alcançar redução. A actividade celular é novamente prevista através do modelo de inibição padrão:

Actividade = [tau]/([tau]Kd*(1+[MB]/Kl))

No ensaio celular, o valor de Kl aparente para o azul de metileno é de 123 nM, o que está dentro do mesmo intervalo que a tionina e o cloreto de tolónio. Tal como indicado na Figura 9, a concentração de tecido cerebral correspondente (i.e., valor de B50) necessária para inibir a agregação de tau seria de 2-3 μΜ. A Figura 13 mostra os dados da actividade baseada em células correspondentes para o cloreto de tolónio reduzido, indicando novamente que o valor de Kl previsto derivado de estudos in vitro pode ser utilizado para descrever a produção do fragmento de 12 kDa a partir da tau inteira nas células. A actividade celular é prevista através do modelo de inibição padrão:

Actividade = [tau]/([tau]Kd*(1+[TC]/Kl))

Isto proporciona mais confirmação da validade do procedimento de análise matemática utilizado. 48 ΕΡ 2 305 823/ΡΤ A Figura 14 mostra que DH12 (antroquinona) que é estruturalmente aparentada com as diaminofenotiazinas é inactiva nas condições do ensaio.

As Figuras 15 e 16 mostram análises semelhantes às dadas acima nas Figuras 9-14 mas para a clorpromazina e tacrina, respectivamente. Utilizando as mesmas assunções (concentração de tau de 415 nM, e Kd da ligação tau-tau de 22 nM) e actividade celular prevista através do modelo de inibição padrão:

Actividade = [tau]/([tau]Kd*(1+[cpz]/Kl)) os valores de Kl aparente para a clorpromazina e tacrina (2117 nM e 802 nM, respectivamente) são superiores aos antecipados a partir de estudos in vitro. A Figura 17 mostra a extensão da redução de vários compostos na presença de DTT.

A Figura 18 mostra a percentagem de redução de MB representada contra a razão de MB:Vitamina C. A Figura 19(a) mostra que através da assunção de uma concentração tecidular alvo de 4 μΜ (i.e. 1,5 yg/g) é possível determinar a partir dos dados de DiSanto e Wagner (1972) que concentrações tecidulares desta grandeza seriam alcançadas a uma dosagem IV de 0,11 mg/kg. A Figura 19(b) mostra um modelo para a distribuição de MB após uma dose única de 100 mg num sujeito de 70 kg, assumindo uma absorção instantânea. A Figura 20 resume os resultados para a expressão transiente de fragmentos de tau em células 3T3 e COS-7 com base nos dados de experiências microscópicas e bioquímicas. A expressão de fragmentos de tau recombinantes em células eucarióticas foi efectuada como se segue. Oito construções de tau expressas transientemente em células 3T3 e células COS-7 foram examinadas através de imuno-histoquímica e immunoblots. A extensão da expressão em cada tipo celular 49 ΕΡ 2 305 823/ΡΤ foi dada semi-quant itat ivamente com base em ambos os conjuntos de resultados: sem expressão detectável; ±, imunorreactividade muito fraca; + a ++++, níveis crescentes de imunorreactividade positiva. Em todos os casos, para obter os resultados foi utilizado o mAb 7.51 com cada construção. Adicionalmente, a especificidade foi confirmada para cada construção através da utilização de um painel de anticorpos contra diferentes domínios da proteína tau (mAb 499, T14, Taul, 342, 7.51, 423 e T46). Sequências de Kozak estavam ausentes nas primeiras seis construções, mas estavam presentes nas construções de ADNc 7 e 8. A Figura 21 ilustra a expressão indutivel da tau humana inteira em fibroblastos 3T6 em duas linhas celulares. T40.22 mostra o derrame de fundo de baixo nível da tau inteira no estado não induzido ("U"), e níveis elevados de expressão após adição de IPTG (i.e. induzida, "I") . T40.37 mostra o mesmo, mas níveis inferiores de expressão sem indução. A Figura 22 mostra um resultado de um sistema vector triplo. Um vector permitindo expressão constitutiva de nível muito baixo do fragmento de 12 kDa foi introduzido em linhas celulares nas quais a expressão indutivel da tau inteira tinha sido já alcançada (de facto a linha celular T40.22 mostrada na Figura 21 acima). São introduzidos níveis baixos de IPTG para induzir a expressão da tau inteira. A IPTG 0 μΜ, há uma expressão de nível muito baixo da banda de 12 kDa, e baixa expressão "de derrame de fundo" da tau inteira. À medida que progressivamente mais tau inteira é induzida através da introdução de níveis mais elevados de IPTG, mais da tau inteira é convertida na espécie de 12 kDa. A Figura 23 mostra os efeitos inibidores da tionina reduzida. Em cada conjunto de pistas, há produção indutivel da banda de 12 kDa na presença de concentrações crescentes de IPTG induzindo níveis mais elevados de T40. À medida que a concentração de tionina aumenta, a produção da banda de 12 kDa a partir de T40 é suprimida. A Figura 24 mostra quantitativamente os resultados da Figura 23. Na ausência de tionina, a indução de T40 a concentrações crescentes de IPTG conduz a uma maior produção 50 ΕΡ 2 305 823/ΡΤ correspondente do fragmento de 12 kDa. Na presença de tionina 2 μΜ, existe ainda indução de T40, mas não é convertida no fragmento de 12 kDa. A Figura 25 mostra um comparativo dos valores in vitro de Kl para vários compostos em nM. Os valores de Kl referem-se às condições de ensaio particulares utilizadas (DTT:composto 500:1, 120 minutos - ver Figura 17).

As Figuras 26 e 27 mostram o efeito inibidor na ligação tau-tau de fenotiazinas possuindo 0, 2, 3 ou 0, 4, 6 grupos metilo, respectivamente. A Figura 28 mostra a derivação de dois parâmetros úteis para medição da inibição da associação tau-tau através dos compostos de teste. STB é a ligação padronizada relativamente à observada na ausência de composto, tomada como a média observada a 1 e 10 yg/ml. Tal como descrito em WO 96/30766, um valor de STB de 1,0 representa uma ligação equivalente à observada na ausência de composto, enquanto um valor de 0,2 indica que a ligação foi reduzida para uma média de 20% a concentrações do composto de teste de 1 e 10 pg/ml. LB50 é o log 10 da razão molar de compostortau produzindo 50% de ligação tau-tau em comparação com a observada na ausência do composto (B50). A Figura 29 mostra a relação entre os parâmetros STB e LB50. Pode mostrar-se que STB é uma função linear da LB50. STB é uma função logarítmica da razão molar de composto:tau à qual a ligação tau-tau é reduzida em 50%. LB50 é o log da razão molar de composto em relação à tau à qual a ligação tau-tau é 50% da observada na ausência de composto. LB50 = 0,05+(2,65xSTB) r=0,95 A determinação de B50 in vitro requer que exista algum grau de inibição da ligação tau-tau e um valor de 50% é obtido por extrapolação. A determinação de STB não requer tal procedimento de extrapolação. 51 ΕΡ 2 305 823/ΡΤ A Figura 30 mostra compostos para os quais foram determinados os valores tanto de STB como de B50. Assumindo que a concentração total de tau nas células é de aproximadamente 500 nM (i.e. a concentração de tau utilizada no ensaio), os valores de B50 proporcionam uma aproximação no ensaio in vitro à concentração (i.e. (500xB50) nM) à qual se pode esperar actividade nos sistemas celulares. A Figura 31 mostra a relação formal entre o valor de LB50 in vitro e o valor do log de Kl para a série de diaminofenotiazinas. A Figura 32 mostra a relação entre o número de grupos metilo numa diaminofenotiazina (NMETH) e o potencial redox (E) e o coeficiente de difusão (DIF). Os caracteres em itálico indicam os coeficientes de correlação (R) e os valores p após exclusão de MB. A Figura 33 mostra a relação entre a percentagem de composto que é reduzida, como determinado experimentalmente, e o potencial de redução conhecido do composto. O potencial de redução prevê a extensão observada de redução das diaminofenotiazinas. A Figura 34a mostra que não existe uma relação clara entre a potência inibidora e a extensão da redução de compostos. A Figura 34b mostra que a potência inibidora não é determinada simplesmente pelo potencial de redução. A Figura 35 mostra que a potência inibidora pode estar relacionada directamente com o coeficiente de difusão (que é uma medida da tendência da forma reduzida para empilhar e agregar).

As Figuras 36 e 37 mostram as relações previstas entre os valores estimados para LB50 ("ESTLB50") e STB ("ESTSTB"), respectivamente, e o potencial de redução e o coeficiente de difusão, em que é dado maior peso ao coeficiente de difusão. 52 ΕΡ 2 305 823/ΡΤ A Figura 38 mostra a estrutura cristalina do Azul de metileno. A Figura 39 mostra a ligação tau-tau na presença de DTT 1 mM, como medida no ensaio em fase sólida de WO 96/30766. Utilizaram-se dois anticorpos diferentes para detectar a ligação tau-tau, nomeadamente mAb 342 (topo) e 499 (fundo). O eixo vertical representa a ligação tau-tau, o eixo horizontal mostra a concentração de tau de comprimento completo na fase aquosa, e a legenda mostra as várias concentrações de tau na fase sólida. Como se pode observar, a ligação tau-tau ocorre ainda na presença de DTT. A Figure 40 mostra várias espécies de fragmentos de tau e dupletos que estão presentes sem indução ("U") e após indução ("I") numa linha celular aqui descrita. Estas incluem espécies com mobilidades equivalentes a 12/14 kD, ~25/27 kD, -30/32 kD, -36/38 kDa e -42/44 kDa (ver Exemplo 3). A Figura 41 (a) mostra como o fragmento de 12 kDa surge através de processamento proteolitico induzido por molde de moléculas de tau inteira em posições aproximadas mostradas pelas pontas de seta. A Figura 41(b) mostra como as espécies de 25/27 kDa surgem através do processamento proteolitico induzido por molde de moléculas de tau inteira em posições aproximadas mostradas pelas pontas de seta. A Figura 42 mostra um gráfico das mobilidades em gel aparentes das espécies das Figuras 40-41 e seus comprimentos em resíduos de aminoácidos. A Figura 43 mostra os fragmentos das Figuras 40-42 a intervalos de ~34 resíduos ou ~17 resíduos que é o equivalente a uma única repetição de tau, ou metade desta. Todos os fragmentos podem ser gerados a partir de um agregado heptamérico básico como um simples conjunto de clivagens proteolíticas que ocorrem nas posições indicadas pelas pontas de seta. A Figura 44 mostra estes mesmos fragmentos por ordem decrescente de comprimento e crescente de mobilidade em gel. 53 ΕΡ 2 305 823/ΡΤ A Figura 45 mostra que DMMB é surpreendentemente potente no modelo celular. A sua actividade inibidora pôde ser observada na ausência de indução por IPTG e após indução (ver Exemplo 4). A Figura 46 mostra a actividade de DMMB na expressão limiar das espécies de 12/14 kDa, utilizando o mesmo conjunto de assunções em relação à concentração intracelular de tau e à afinidade de ligação tau-tau in vitro utilizadas nas Figs. 10-16. A actividade celular é prevista através do modelo de inibição padrão: actividade = [tau]/([tau]Kd*(1+[DMMB]/Ki)) DMMB tem um KI aparente dentro da célula de 4,4 nM, e o valor de B50 celular é de -100 nM.

EXEMPLOS

Materiais e Métodos Gerais

Produção de linhas celulares 3T6H

As células 3T6 foram Fibroblastos de Embrião Albino de Ratinho Swiss ECACC No: 86120801.

Para o sistema indutivel, as experiências empregaram Lac Switch” de Stratagene utilizando o vector p3'SS para expressar a proteína repressora de Lac e pOPRSVICAT para expressar a tau inteira sob o controlo do repressor de Lac. A expressão é induzida através da adição de IPTG.

Inicialmente as células 3T6 foram transfectadas, através de electroporação, com o plasmídeo p3'SS e as colónias seleccionadas através de resistência à higromicina. 5 clones que expressavam níveis variáveis da proteína repressora de Lac (determinados através de imunocitoquímica) foram apanhados, e foram também mantidas as células não clonadas para comparação. 54 ΕΡ 2 305 823/ΡΤ

Produção do vector pOPRSVT40 A inserção de T40 para clonagem no vector pOPRSVICAT foi preparada através de PCR com polimerase Vent (NEB) utilizando iniciadores (mostrados abaixo) que incluíam um local NotI e um codão de início e de terminação conforme apropriado. O produto de PCR e o vector pOPRSVICAT foram cortados com Notl e purificados. O vector foi desfosforilado para prevenir re-ligação, e a inserção ligada no vector utilizando protocolos padrão. A mistura de ligação resultante foi transfectada para células E. coli competentes e as células plaqueadas em placas de amp. As colónias foram apanhadas e semeadas em quadrículas numa nova placa de amp. As colónias foram levantadas para membrana de nylon Hybond-N 0,45 pm (Amersham) e os possíveis positivos seleccionados através de hibridação de colónias utilizando dGA marcadas com (oí-32P) dCTP (Amersham) (utilizando um estojo de oligomarcação (Pharmacia Biotech) e purificadas numa coluna Nap-10 (Pharmacia Biotech)). A hibridação foi realizada a 65°C de um dia para o outro em tampão Church seguido de lavagens 2x20 min em lavagem Church. As colónias positivas, marcadas com sonda radioactiva, foram detectadas através de exposição das membranas a película de raios X de um dia para o outro a -70°C.

As colónias positivas foram seleccionadas e criadas, depois verificadas por PCR e digeridas por restrição para confirmar a presença da inserção. A utilização de um único local de restrição para a clonagem significa que T40 se pode inserir no vector em ambas as orientações. A orientação das inserções foi determinada de modo a seleccionar colónias com o vector contendo T40 na orientação correcta para expressão.

Iniciadores utilizados 5'-3' T40—Wotl inicio 5' -gtc gac tct aga qqc qqc cqc ATG GCT GAG CCC CGG CAG GAG-3' 55 ΕΡ 2 305 823/ΡΤ 3'-5' Τ40—Wotl terminação 5’-act ctt aag ggt cqc qqc cgc TCA CAA CAA ACC CTG CTT GGC CAG -3'

Not I A complementaridade da sequência com a sequência de T40 é mostrada em maiúsculas, os codões de início e terminação estão marcados. O local Not I a adicionar é mostrado sublinhado. A sequência restante, mostrada em minúsculas, é uma ponta solta de 13 pares de bases para permitir que a enzima Not I corte eficientemente. Esta era complementar à sequência no vector plasmídico de hTau40 para permitir uma liqação eficiente dos iniciadores.

Determinação da orientação da inserção A orientação foi determinada utilizando uma enzima de restrição que corte a inserção uma vez e o vector no máximo algumas vezes, e que dê um padrão de digestão de restrição diferente para cada orientação. HindIII verifica estes critérios para pOPRSVT40. Se a inserção estiver ausente são produzidas duas bandas de restrição. Se a inserção estiver presente são produzidas três bandas e o tamanho das bandas depende da orientação da inserção tal como mostrado abaixo.

Orientação Directa (correcta) 5385 pb 1030 pb 381 pb

Orientação Inversa 6101 pb 381 pb 314 pb

Produção de células expressando T40 sob o controlo de um promotor indutível 0 plasmídeo pOPRSVT40 foi produzido e purificado através de centrifugação em gradiente de CsCl. Este foi transfectado (através de electroporação) para células 3T6H (expressando a proteína repressora de Lac) produzidas tal como descrito acima. As células positivas foram seleccionadas através de resistência a G418 (a 500 pg/ml). As colónias resistentes foram apanhadas e criadas. O nível de expressão da T40 inteira com e sem adição de IPTG foi determinado com 56 ΕΡ 2 305 823/ΡΤ anticorpos anti-tau através de imunocitoquímica e Western blot.

Produção de pZeo295-391 O plasmídeo pZeo295-391 foi desenhado para expressar proteína correspondendo ao fragmento truncado de tau (resíduos 295-391; ver abaixo). Foi utilizado um sistema constitutivo (pcDNA3.1 de InVitrogen, Holanda) - o plasmídeo confere resistência ao antibiótico zeocina. O ADNc para esta região foi amplificado através de reacção em cadeia da polimerase (PCR), utilizando iniciadores oligonucleotídicos específicos (com sentido e anti-sentido; ver abaixo). 0 iniciador com sentido continha um local EcoRI e o anti-sentido um local BamHI. Os fragmentos foram subclonados em pcDNA3.1(-)zeo (Invitrogen, Holanda) que tinha sido digerido com FcoRI e BamHI. O ADN inserido está a jusante de uma sequência promotora de citomegalovírus e a montante de um sinal de poliadenilação. 0 plasmídeo contém a sequência de ADN para a expressão de resistência a ampicilina e zeocina para selecção em bactérias e células eucarióticas, respectivamente. A autenticidade do ADN inserido foi confirmada através da sequenciação inteira de ambas as cadeias.

Sequências nucleotídica e de aminoácidos para o fragmento de tau truncada 295-391 gataatatcaaacacgtcccgggaggcggcagtgtgcaaatagtctacaaaccagtt.gacctgagca aggtgacctccaagtgtggctcattaggcaa catccatcataaaccaggaggtggccaggtggaagtaaaatctgagaagcttgacttcaaggacaga gtccagtcgaagattgggtccctggacaatat cacccacgtccctggcggaggaaataaaaagattgaaacccacaagctgaccttccgcgagaacgcc aaagccaagacagaccacggggcggag

DNIKHVPGGGSVQIVYKPVDLSKVTSKCGSLGNIHHKPGGGQVEVKSEKLDFKDRVQSKIGSLDNIT

HVPGGGNKKIETHKLTFRENAKAKTDHGAE 57 ΕΡ 2 305 823/ΡΤ iniciador com sentido 295

met asp29S 5' “ CGG_AAT_TCC acc atc gat aat atc aaa cac gtc CCG - 3'

EcoRI iniciador anti-sentido 391 stop glu 391 5* - C GCG GGA TCC TCA CTC CGC CCC GTG GTC TGT CTT GGC - 3'

BamHI

Os codões de início e terminação estão a cheio e os locais de restrição EcoRI e BamHI a adicionar estão sublinhados.

Cultura de tecidos das células para ensaio 0 meio utilizado foi DMEM (com Glutamax I, piruvato, 4,5 g/1 de glicose) de Life Technologies, Escócia. Isto foi suplementado com FCS a 10% (Helena BioSciences) , 50 U/ml de penicilina, 50 pg/ml de estreptomicina, mais outro antibiótico conforme apropriado para a selecção e manutenção do plasmídeo relevante. As concentrações de antibiótico foram 200 pg/ml de higromicina (selecção e manutenção de p3'SS), 500 pg/ml de G418 (selecção e manutenção de pOPRSVT40), 400 ou 200 pg/ml de zeocina (selecção ou manutenção de pZeo295-391) .

As células são criadas a 37°C, numa atmosfera húmida de CO2 a 5%. As células são mantidas em caixas de 10 cm, e divididas quando se aproximam da confluência. O meio é removido, as células são lavadas com PBS e as células são libertadas através de tripsinização com 1 ml de solução de tripsina/EDTA/caixa de 10 cm. As células são ressuspensas em meio fresco a uma diluição de 1:10, ou opcionalmente num intervalo de diluições de 1:5 a 1:20 (aproximadamente 5000 para 20000 células/cm2) .

Para testar fármacos, as células são plaqueadas em placas de 6 poços ou 24 poços a uma densidade inicial que 58 ΕΡ 2 305 823/ΡΤ lhes permitirá crescer até 50-80% de confluência dentro de 24 horas. Os fármacos são adicionados ao poço a várias concentrações, a expressão de tau inteira é induzida através da adição de IPTG a 0-50 μΜ. As células são criadas durante mais 24 horas e depois colhidas para análise através de SDS PAGE/Western blotting.

Preparação de proteína tau

Tau recombinante (clone htau40) e tau solúvel em ácido perclórico extraídas de cérebro de rato e humano foram preparadas tal como descrito anteriormente (Goedert, M. & Jakes, R. (1990) EMBO J. 9: 4225; Goedert, M. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90: 5066).

Electroforese em gel e blotting

As células criadas tal como delineado acima são lavadas uma vez com PBS, depois lisadas em 50 μΐ (placas de 24 poços) ou 100 μΐ (placas de 6 poços) de tampão Laemli. As amostras foram armazenadas a -20°C, fervidas durante 4 min antes de correr em géis de acrilamida a 15% utilizando o sistema mini-gel de BioRad miniProtean III. A proteína é transferida para membrana de PVDF através de Western blotting utilizando o sistema tampão CAPs. As membranas são incubadas em tampão de bloqueio (leite em pó magro a 5% (Marvel), Tween 20 a 0,1% em PBS) durante 1 h de um dia para o outro. A proteína tau é detectada através de incubação das membranas com mAb 7.51 diluído 1:5 com tampão de bloqueio durante 1-3 h ou de um dia para o outro, lavando bem com PBS/Tween 20 a 0,1%, incubando com diluição 1:5000 de HRP anti-ratinho em tampão de bloqueio durante 1 h, e lavando bem com PBS/Tween 20 a 0,1%. O anticorpo ligado é detectado através de reacção ECL detectada em hiperfilme ECL (Amersham).

As membranas são digitalizadas para um computador num digitalizador de mesa Hewlett Packard Scanjet 6100C a 600 dpi e guardadas como ficheiros tiff. A densitometria das bandas de T40 e dGAE é efectuada com o programa Scananalysis num Apple Power Mac G3. 59 ΕΡ 2 305 823/ΡΤ

Preparação do fármaco A tionina, o azul de metileno, DMMB, e o cloreto de tolónio são todos preparados como uma reserva 1 mM em ddH20. Antes de utilizar é preparada uma reserva diluída a 100 μΜ em HBSS que é adicionada directamente ao meio nas células.

Para o fármaco oxidado este é preparado simplesmente através da diluição da reserva 1 mM em HBSS e esterilizando por filtração.

Para o fármaco reduzido a solução 1 mM é tratada com ácido ascórbico e DTT para produzir fármaco 0,5 mM, ácido ascórbico 50 mM, DTT 50 mM, esta é deixada repousar durante 15 min (passa de azul a incolor) antes de fazer a reserva diluída. Esta é diluída em HBSS para produzir fármaco 100 μΜ, ácido ascórbico 10 mM, DTT 10 mM e esterilizada por filtração. As células são tratadas com o fármaco a várias concentrações, mas para o fármaco reduzido as concentrações de ácido ascórbico e DTT são mantidas sempre a 400 μΜ através da utilização de quantidades apropriadas de reserva reduzida 100 μΜ, reserva oxidada 100 μΜ e ácido ascórbico 10 mM/reserva de DTT.

Electroforese em gel com SDS e immunoblotting

Procedimentos padrão de electroforese e immunoblotting foram utilizados tal como descrito anteriormente (Wischik, C.M. et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85: 4506; Novak, M., et al. (1993) EMBO J. 12: 365; Jakes, R. et al. (1991) EMBO J. 10: 2725). Os immunoblots foram revelados com o estojo ABC (Vector Laboratories). Os anticorpos monoclonais (mAb) 7.51, 21.D10, 499 e 342 foram utilizados como fluidos sobrenadantes de cultura de hibridoma não diluídos. O mAb AT8 (Innogenetics, Bélgica) foi utilizado a uma diluição 1/1000. Os mAb anti-tau 7.51 (que reconhece um epítopo na última repetição; ver Novak, M. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88 : 5837), 423 (que reconhece tau truncada C- terminalmente no resíduo Glu-391; ver Wischik, C.M. et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85: 4506; Novak, M. et al. (1993) EMBO J. 12: 365), 499 (que reconhece um segmento de tau específico de humano entre os resíduos Gly-14 e Gln-26; 60 ΕΡ 2 305 823/ΡΤ

ver Wischik, C.M. et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93: 11213), e 342 (que reconhece um segmento entre os resíduos Ser-208 e Pro-251). O mAb 21.D10 foi criado contra o extracto de cérebro A68-tau (Lee, V.M.-Y. et al. (1991)

Science 251: 675).

Ensaio de ligação de tau

Isto foi realizado basicamente tal como descrito em Wischik, C.M., et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93: 11213. A tau de fase sólida (0-20 pg/ml) foi revestida em placas de microtitulação de 96 poços de poli(cloreto de vinilo) em tampão carbonato 50 mM a 37°C durante 1 h. A placa foi lavada duas vezes com Tween 20 a 0,05%, depois bloqueada com Marvel a 2% em PBST durante 1 h a 3 7°C. Após lavagem de novo, a placa foi incubada durante lha 37°C com tau em fase aquosa (0-300 pg/ml em PBST contendo gelatina a 1%). No presente pedido, foi também adicionado DTT 1 mM. A placa foi lavada duas vezes e incubada durante lha 37°C com mAb 499 ou 342, diluído com um volume igual de Marvel a 2% em PBST. Após lavagem, anticorpo de cabra anti-ratinho conjugado com peroxidase de rábano (1/1000 em PBST) foi incubado durante lha 37°C. A placa foi lavada e incubada com solução de substrato contendo tetrametilbenzidina e H2O2 e a taxa de mudança da absorvância medida utilizando um leitor de placas Vmax (Molecular Diagnostics, Califórnia) tal como descrito anteriormente (Harrington, C.R. et al. (1990) J. Immunol. Meth. 134: 261).

Cada experiência foi efectuada em triplicado e incluiu controlos nos quais estava ausente a tau tanto em fase sólida como aquosa, e também com cada uma das duas ausente.

Análise de dados

Isto foi efectuado tal como descrito em Wischik et al. (supra) e as curvas foram ajustadas de acordo com a equação de Langmuir com os programas Kaleidagraph (Synergy,

Filadélfia) ou Systat (SPSS Inc., Chicago) utilizando a aproximação quasi-Newton. Os coeficientes de correlação de ajuste de curvas são dados nas Figuras. 61 ΕΡ 2 305 823/ΡΤ

Exemplo 1 - Expressão constitutiva de tau inteira, truncada e mutada

Tentou-se a expressão de tau em linhas celulares eucarióticas para gerar um modelo celular de agregação de tau sob condições fisiológicas que não sofresse das limitações das abordagens baseadas em lipofectina. Isto envolve a expressão de tau inteira e de fragmentos de tau truncados tanto para tau normal como para tau possuindo mutações patogénicas.

Tau inteira

Quando a tau inteira normal (T40) foi transfectada para células (3T3 e NIE-115) foi expressa e esteve envolvida na montagem da rede de microtúbulos dentro das células.

Tau truncada

Inicialmente o ADNc para o fragmento de tau truncado do centro do PHF, correspondendo ao fragmento 297-391, foi transfectado para fibroblastos 3T3 não neuronais: esta tau truncada foi seleccionada uma vez que: (i) está presente no centro de PHF; (ii) é detectada como depósitos em tecido cerebral de DA durante os estádios iniciais da doença; (iii) é capaz de suportar a captura catalítica e propagação da captura de tau in vitro. Subsequentemente, foi efectuada uma série de transfecções na qual foi variada a extensão da truncagem num dos terminais N ou C, com base parcialmente nas propriedades imunoquímicas da molécula de tau. Foram criadas seis construções com truncagem no terminal N (186-441; 297- 441), nos terminais C e N (186-391; 297-391) e no terminal C (1-391). O padrão de imunorreactividade para as seis construções com um painel limitado de anticorpos foi capaz de discriminar todos os fragmentos de tau gerados deste modo.

As construções foram expressas em células eucarióticas transientemente (utilizando pSG5 como vector) e estavelmente (utilizando pIF2 e pZeo como vectores) . Os transfectantes estáveis são seleccionados com base na resistência aos antibióticos geneticina e zeocina para pIF2 e pZeo, respectivamente. A análise de epitopos foi efectuada em 62 ΕΡ 2 305 823/ΡΤ proteínas expressas em bactérias utilizando pRK172 como vector. A Figura 20 resume os resultados para vários fragmentos em células 3T3 e COS-7. Mais resultados mostraram que a expressão das duas formas de tau na mesma célula podem afectar o padrão de imunorreactividade. Por exemplo, a expressão estável de 1-391 e 295-391 resulta no surgimento de feixes anormais dentro das células. No entanto, provou-se que a manutenção de tais células num estado estável e reprodutível era difícil.

Tau mutada

Foi utilizada mutagénese de tau inteira para gerar mutações clínicas conhecidas. Estas foram subclonadas em pIF2 e transfectantes estáveis gerados em células 3T3 e NIE para várias mutações incluindo as que afectam propriedades da montagem dos microtúbulos de tau (G272V, V337M, P301 S, R406W) e S305N, que afecta o processamento alternativo do gene de tau in vivo. Em geral, as células expressando tau inteira possuindo mutações exibiram marcação da rede microtubular e foram indistinguíveis das células transfectadas com tau de tipo selvagem. As linhas celulares expressando certos fragmentos de tau truncados incluindo mutações provaram ser instáveis.

Conclusão

Em resumo, a expressão constitutiva de tau truncada dentro de células eucarióticas provou ser difícil de alcançar. Embora os sistemas de transfecção transiente permitissem a optimização da expressão de tau através da manipulação do consenso de Kozak rodeando o codão de iniciação para 297-tau, a expressão, p.ex. de 297-391, foi ainda modesta, sugerindo algumas propriedades tóxicas inerentes do fragmento. As transfecções reiteraram esta conclusão. Este último sistema demonstrou que a truncagem no terminal N ou C resultou numa propensão ligeiramente maior para que a tau se associe em depósitos amorfos em vez de numa rede microtubular. A expressão estável de combinações de fragmentos de tau gerou também agregados dentro do citoplasma das células, mas este sistema não foi facilmente reprodutível. 63 ΕΡ 2 305 823/ΡΤ

Exemplo 2 - Expressão indutível de tau truncada

Noutra tentativa para criar um sistema estável, reprodutível, sem a toxicidade associada à expressão constitutiva, foi tentada a expressão indutível do fragmento central de tau do PHF (i.e., 297-391 - que é de 12 kDa).

Foram tentados vários sistemas indutíveis para expressão de proteínas em células eucarióticas, embora o sistema preferido fosse o sistema "interruptor de lac". Neste sistema, dois vectores são incorporados nas células, tipicamente fibroblastos 3T3 ou 3T6 que não expressam qualquer proteína tau endógena. 0 primeiro, o vector p3'SS, codifica para expressão constitutiva do gene lacl, e os expressores são seleccionados com base na resistência à

higromicina. O segundo, pOPRSVICAT, incorpora o ADN codificando para o fragmento da proteína tau sob o controlo de um forte promotor de RSV que contém sequências operadoras do operão Lac. As células que incorporam este vector são seleccionadas com base na resistência à neomicina. As células que incorporaram ambos os vectores têm a propriedade de a expressão constitutiva de lacl prevenir a expressão da proteína incorporada (i.e. tau) controlada através do operão Lac. Para além do açúcar, IPTG compete pela ligação de lacl ao operão Lac e permite assim a expressão da proteína tau. A expressão indutível do fragmento de 12 kDa foi realizada em duas linhas celulares. Estas não mostraram niveis apreciáveis de expressão da proteína tau até após 3 dias de tratamento com IPTG, estádio ao qual elevados níveis de 12 kDa surgiram repentinamente, formando agregados intracelulares que mataram prontamente a célula. O processo de agregação foi, tal como esperado, a progressão não linear de um baixo nível de expressão para súbita acumulação de agregados tóxicos sem qualquer gradação clara, tornando a agregação e a toxicidade impossíveis de controlar. Esta progressão não linear impediu um controlo correcto do sistema.

Exemplo 3 - Expressão de tau em linhas celulares estáveis

Tendo em vista os resultados de cima, foi utilizado outro sistema como se segue. A linha celular de cultura de 64 ΕΡ 2 305 823/ΡΤ tecidos DH 19.4.1.4 e clones desta foram baseados em células 3T6 (Fibroblastos de Embrião Albino de Ratinho Swiss ECACC No: 86120801) expressando tau humana inteira de quatro repetições sob o controlo de um promotor indutivel e tau humana truncada (295-391) sob o controlo de um promotor constitutivo.

As células expressando T40 sob o controlo de um promotor indutivel, T40.22.10, foram transfectadas (através de lipofecção) com o plasmideo pZeo295-391. As células positivas foram seleccionadas pela resistência à zeocina a 400 yg/ml. A expressão de tau truncada numa expressão indutivel de fundo da tau inteira foi confirmada através de análise Western blot com o Mab 7.51. A Figura 21 ilustra a expressão indutivel de tau humana inteira apenas em fibroblastos 3T6 nas duas linhas celulares. T40.22 mostra um baixo nivel de derrame de fundo de tau inteira no estado não induzido ("U"), e elevados níveis de expressão após adição de IPTG (i.e. induzido, "I"). T40.37 mostra o mesmo, mas níveis inferiores de expressão sem indução. A Figura 22 mostra os resultados de um sistema vector triplo. Um vector permitindo expressão constitutiva de nível muito baixo do fragmento de 12 kDa foi introduzido nas linhas celulares nas quais a expressão indutivel da tau inteira tinha já sido alcançada (T40.22 mostrado na Figura 21). A Figura 22 mostra o que acontece quando níveis baixos de IPTG são introduzidos para induzir expressão de tau inteira. A IPTG 0 μΜ, há um nível de expressão muito baixo da banda de 12 kDa, e baixa expressão de "derrame de fundo" de tau inteira. À medida que progressivamente mais tau inteira é induzida através da introdução de níveis mais elevados de IPTG, mais da tau inteira é convertida na espécie de 12 kDa e mais dos fragmentos intermédios de peso molecular mais elevado (descritos em mais detalhe nas Figs. 43 e 44) são produzidos. O exame da linha celular original indutivel de T40 (T40.22.10) que não continha o vector para expressão constitutiva do fragmento de 12 kDa mostra que a espécie de 12 kDa não é produzida como um subproduto de truncagem da indução de tau inteira. Maior expressão da banda de 12 kDa 65 ΕΡ 2 305 823/ΡΤ após indução de T40 foi observada apenas em células com baixo nível de expressão anterior do fragmento de 12 kDa (DH19.4.1.4.6). Isto é, a 12 kDa preexistente proporciona um molde para a produção de mais 12 kDa após a indução de tau inteira. Um dupleto adicional pode também surgir com uma mobilidade em gel aparente de »25/27 kDa quando as células estão no estado não induzido (p.ex. na linha celular designada DH 19.4.1.4A.B2). Após indução com IPTG, pode surgir outra série de dupletos, com mobilidades em gel de »30/32 kDa, »36/38 kDa e »42/44 kDa.

Estas espécies são mostradas na Figura 40 ambas sem indução ("U") e após indução ("I"). São também mostrados os padrões de imunorreactividade destes fragmentos observados com mAb 342 e um anticorpo policlonal C-terminal T46 que reconhece epitopos localizados entre os resíduos Ser422 e Leu441. A derivação dos fragmentos observados no estado não induzido (i.e. 12/14 kDa e 25/27 kDa) pode ser explicada com referência à Figura 41. A Figura 41 (a) mostra como o fragmento de 12 kDa surge através de processamento proteolítico induzido pelo molde de moléculas de tau inteiras nas posições aproximadas mostradas pelas pontas de seta.

No caso da espécie de 25/27 kDa, estes fragmentos não podem representar dímeros da espécie de 12/14 kDa, uma vez que estes fragmentos são imunorreactivos com T46. Portanto, um outro produto proteolítico da proteína tau inteira de agregação tem de surgir através de clivagens ocorrendo nas posições aproximadas mostradas pelas pontas de seta na Figura 41(b).

Após indução (Figura 40, I), é observada a outra série de dupletos. A derivação destes outros fragmentos pode ser melhor entendida com referência às Figuras 42-44. A Figura 42 mostra um gráfico das mobilidades em gel aparentes destes fragmentos e dos seus comprimentos em resíduos de aminoácidos, indicando que as mobilidades em gel 66 ΕΡ 2 305 823/ΡΤ aparentes podem ser entendidas em termos de um conjunto característico de comprimentos dos fragmentos.

Tal como ilustrado na Figura 43, todos estes fragmentos estão a intervalos de =«34 resíduos ou «17 resíduos que é o equivalente a uma única repetição de tau, ou metade desta. Todos os fragmentos gerados podem portanto ser entendidos como surgindo de um simples conjunto de clivagens proteolíticas ocorrendo nas posições indicadas pelas pontas de seta da Figura 43 a partir de um agregado heptamérico básico, formado tal como mostrado na Figura. Neste esquema os fragmentos surgem como o conjunto combinatório total das clivagens propostas ocorrendo nas 3 possíveis posições aproximadas mostradas pelas pontas de seta em ambas as extremidades do agregado. Os correspondentes padrões de imunorreactividade previstos com mAb 342 e T46 associados a estes fragmentos estão também tabelados. A Figura 44 mostra estes mesmos fragmentos por ordem decrescente de comprimento e crescente de mobilidade em gel. Embora o agregado heptamérico seja mostrado por conveniência como surgindo inteiramente a partir de moléculas de tau inteira, será notado que o fragmento de 12/14 kDa pode ser interposto dentro do agregado proposto, substituindo alguns dos parceiros de ligação, e que o padrão de inclusão preciso destes curtos fragmentos no agregado determinará quais os fragmentos exactos do conjunto inteiro que predominam num dado caso. Portanto, a produção desta família de fragmentos proteolíticos é melhor compreendida como um possível repertório que pode ser concretizado de vários modos dentro da célula.

Exemplo 4 - Efeitos inibidores de compostos na produção do fragmento proteolítico

Tendo alcançado um sistema celular estável no qual a produção do fragmento de 12 kDa (e outros) pode ser controlada, o modelo foi utilizado para testar os efeitos inibidores da tionina reduzida. Isto é mostrado na Figura 23. Em cada conjunto de pistas, há produção indutível da banda de 12 kDa na presença de concentrações crescentes de IPTG induzindo elevados níveis de T40. À medida que a concentração 67 ΕΡ 2 305 823/ΡΤ de tionina aumenta, a produção da banda de 12 kDa de T40 é suprimida. Isto é mostrado quantitativamente na Figura 24. Na ausência de tionina, a indução de T40 a concentrações crescentes de IPTG conduz a uma correspondente maior produção do fragmento de 12 kDa. Na presença de tionina 2 μΜ, há ainda indução de T40, mas não é convertida no fragmento de 12 kDa.

Uma vez que a tionina reduzida é ela própria tóxica, é necessário controlar a redução dos niveis de T40 induzidos através de doses correspondentes de IPTG a niveis mais elevados de tionina. Isto pode ser alcançado através da determinação da razão 12 kDa:T40, que permite calcular a média dos dados ao longo dos niveis de IPTG e mostra uma redução dependente da dose no nível de 12 kDa relativamente à tau inteira.

As actividades de vários compostos no ensaio de T40/12 kDa são mostradas nas Figuras 9 a 16.

Os resultados são expressos em termos da razão de 12 kDa:T40 após indução de tau inteira (T40) através de tratamento das células com IPTG (0, 10, 25, 50 μΜ) na presença de tionina ou cloreto de tolónio introduzidos nas concentrações mostradas na presença de agentes redutores (DTT 200 μΜ/ascorbato), ou clorpromazina ou tacrina introduzidas sem agentes redutores. Tal como se pode observar, a tionina e 0 cloreto de tolónio produzem uma inibição essencialmente idêntica, enquanto a clorpromazina e a tacrina são não inibidores no mesmo intervalo de concentrações. O efeito dos agentes redutores sozinhos foi testado em experiências de controlo que não mostraram diferenças significativa na razão 12 kDa:T40, na presença de agentes redutores sozinhos.

As propriedades da linha celular produtora dos produtos de degradação de peso molecular mais elevado foram também examinadas com MB e DMMB (azul de dimetilmetileno).

Tal como se pode observar na Figura 45, DMMB provou ser surpreendentemente potente no modelo celular. A sua actividade inibidora pôde ser observada tanto na ausência de indução por IPTG como após a indução. O tratamento com DMMB 1 μΜ aboliu eficazmente todos os produtos de degradação 68 ΕΡ 2 305 823/ΡΤ dentro da célula. Mais experiências com MB e DMMB mostraram que mesmo uma produção aparentemente limiar da espécie de 12/14 kDa é grandemente determinada pela agregação. Isto é, a produção constitutiva do fragmento 295-391 está ela própria abaixo do nível de detecção através de immunoblot ou então é estabelecida através de agregação espontânea de modo a alcançar níveis dentro da célula que podem ser detectados através de immunoblot. Alternativamente, os níveis limiares aparentes do fragmento de 12/14 kDa observados sem indução por IPTG e na ausência de tratamento com um inibidor da agregação de tau podem eles próprios ser modelados por produção dependente de agregação com molde a partir dos níveis de derrame de T40 produzidos na ausência de indução. Seja qual for a combinação de factores que determina os níveis do fragmento de 12/14 kDa na condição limiar, a sua expressão aparente pode ser essencialmente eliminada, juntamente com produtos de agregação de peso molecular mais elevado, através de um potente inibidor de agregação tal como DMMB. Estes resultados confirmam ainda que a produção dos fragmentos proteolíticos de peso molecular mais elevado (i.e., 30/32, 36/38, 42/44 kDa) é também dependente de interacções de ligação tau-tau críticas ocorrendo ao longo do domínio de repetição, tal como mostrado nas Figuras 41, 43 e 44. A Figura 46 mostra a actividade de DMMB na expressão limiar da espécie de 12/14 kDa, utilizando o mesmo conjunto de assunções em relação à concentração intracelular de tau e à afinidade de ligação tau-tau in vitro utilizada nas Figs. 10-16. Neste caso verifica-se que DMMB tem uma Kl aparente dentro da célula de 4,4 nM, e o valor de B50 celular é *100 nM. Isto indica que DMMB é altamente potente dentro do meio celular.

Exemplo 5 - Comparação dos efeitos inibidores de compostos reduzidos e oxidados O modelo matemático utilizado para os dados in vitro foi utilizado para analisar os efeitos de substâncias de teste no ensaio celular T40:12 kDa. Utilizando os valores conhecidos para kDa e Kl a partir dos dados in vitro, a expressão 69 ΕΡ 2 305 823/ΡΤ indicada foi utilizada para resolver a concentração intracelular da tau inteira (ver p.ex. a Figura 10).

Esta verificou-se ser de cerca de 500 nM, que está no intervalo esperado a partir dos estudos de tau no cérebro e nos sistemas celulares. Foi obtido um bom ajuste aos dados experimentais implicando que para alguns compostos a inibição da produção de tau truncada dentro da célula pode ser prevista a partir dos valores aproximados de kDa e Kl determinados experimentalmente in vitro.

Exemplo 6 - Exame das propriedades inibidoras das diaminofenotiazinas

Em estudos in vitro, os inibidores mais activos da ligação tau-tau identificados acima foram as formas reduzidas das diaminofenotiazinas possuindo 0, 2 ou 3 grupos metilo. A Figura 25 mostra as formas reduzidas de tais compostos. As correspondentes curvas de ligação tau-tau são mostradas como função da razão molar em relação a tau nas Figuras 26 e 27. Tal como mostrado, os compostos da "série desmetilo" (0, 2 ou 3 grupos metilo) produzem uma inibição de aproximadamente 50% da ligação tau-tau (mostrado no eixo vertical) a razões molares de 3:1 - 4:1 de composto:tau ("AMR" mostrada em escala logarítmica no eixo horizontal). A razão molar média para 50% de inibição da ligação tau-tau para este grupo de composto é de 4:1.

Diaminofenotiazinas possuindo 4 ou 6 grupos metilo (o "grupo metilado") têm uma acção bifásica, com aumento da ligação tau-tau a uma concentração inferior, e inibição da ligação tau-tau a concentrações elevadas (Figura 27). Estes compostos requerem assim razões molares mais elevadas para efectuarem uma inibição de 50% da ligação tau-tau. O exame de outras caracteristicas do composto diaminofenotiazina foi também efectuado. Verificou-se que a substituição de átomos de azoto ou de enxofre heterocíclicos interfere gravemente com a potência inibidora dos compostos. Igualmente, verificou-se que a remoção dos grupos diamino era prejudicial à actividade inibidora. Parecia assim que as 70 ΕΡ 2 305 823/ΡΤ estruturas NB e S diamino heterocíclicas são importantes para a actividade das moléculas na inibição da ligação tau-tau.

Para comparação, foram utilizados dois métodos para determinar a actividade inibidora no ensaio tau-tau: STB é a ligação tau-tau média observada a 1 e 10 pg/ml de composto a concentrações de tau padrão de 488 nM; LB50 é o loglO da razão molar composto:tau produzindo uma inibição de 50% da ligação tau-tau (Figura 28). Tal como mostrado na Figura 29, existe uma forte correlação entre os valores de STB e LB50 para uma variedade de compostos, sendo clorpromazina e riboflavina dois valores extremos (ver também as Figuras 30 e 31) .

Exemplo 7 - Actividade inibidora e potencial de difusão A Figura 32 indica gue existe uma correlação entre o número de grupos metilo (NMETH) num composto de teste e tanto o potencial de redução (E) como o coeficiente de difusão (DIF) . Em todas as comparações, utilizou-se a correlação de ordens de Spearman. Como mostrado na Figura 32, pode-se observar uma forte relação inversa entre o número de grupos metilo (NMETH) e o potencial de redução apenas se for excluido o azul de metileno (tipo normal: valores de correlação incluindo azul de metileno; tipo itálico: valores de correlação excluindo o azul de metileno).

Isto indica que o azul de metileno possui um potencial de redução desproporcionadamente elevado relativamente ao número de grupos metilo (NMETH) nesta série. Existe também uma forte correlação positiva entre o número de grupos metilo e o coeficiente de difusão (DIF, Figura 32).

Tal como não era observada uma correlação entre o número de grupos metilo e o potencial de redução (Figura 33), foi surpreendentemente verificado que não se observa uma correlação entre o potencial de redução e o potencial inibidor (Figura 34b), embora a extensão da redução das diaminofenotiazinas nas condições do ensaio estivesse altamente correlacionada com o potencial de redução (Figura 33). E de facto, não existe correlação entre a extensão da redução destes compostos e a potência inibidora 71 ΕΡ 2 305 823/ΡΤ (Figura 34a) . Por outro lado, existe uma forte correlação inversa entre a potência inibidora de um composto e o seu coeficiente de difusão, e é possível prever valores estimados de LB50 e STB como funções lineares do coeficiente de redução e o coeficiente de difusão quando é dado maior peso ao coeficiente de difusão (Figuras 35, 36 e 37). Verifica-se que tanto os valores de LB50 como de STB são uniformemente baixos para valores de NMETH até, e incluindo, 3, mas para valores de NMETH superiores (em particular azul de metileno, NMETH=4) há uma potência inibidora desproporcionadamente baixa relativamente ao número de grupos metilo. Isto pode estar relacionado com a disposição simétrica dos grupos metilo que interfere com a capacidade de empilhamento das moléculas, como medido pelo coeficiente de difusão. Isto pode ser observado, por exemplo, na estrutura cristalina do azul de metileno (veja-se a Figura 38). A molécula de diaminofenotiazina é essencialmente plana e forma grupos de empilhamento. A presença de carga na molécula, como na forma oxidada, impede a formação destes grupos de empilhamento, e parece ser a propensidade da forma reduzida deste composto para formar estas relações de empilhamento que determina a potência inibidora da série.

As experiências realizadas pelos presentes inventores examinaram a ligação de tau de comprimento completo na fase aquosa ao fragmento do domínio repetido truncado de tau na fase sólida, como descrito com mais detalhes em WO96/30766. A ligação foi detectada com mAb 342 ou com mAb 499. Como mostrado na Figura 39, existe uma ligação tau-tau dependente da concentração de tau típica na presença de um grande excesso do agente redutor padrão ditiotreitol (DTT, 1 mM) . Contudo, a actividade inibidora das fenotiazinas é também demonstrada na presença de DTT (1 mM) na configuração padrão do ensaio descrito acima (i.e. os resultados para STB e LB50). Os presentes inventores concluem assim que a actividade inibidora não pode ser atribuída ao DTT per se, mas sim à presença das fenotiazinas na sua forma reduzida, devido a um excesso de DTT.

Em resumo, os presentes inventores proporcionam aqui um sistema potencial, significativamente melhorado, para o tratamento e profilaxia de doenças tais como a Doença de 72 ΕΡ 2 305 823/ΡΤ

Alzheimer em que proteínas sofrem polimerização conformacional induzida, p.ex. como ilustrado no caso da doença de Alzheimer por ligação patológica tau-tau. Os importantes ensinamentos do presente pedido de patente, viz que o coeficiente de difusão de um composto pode ser importante na determinação da sua potência inibidora em relação a esta polimerização conformacional induzida da proteína, têm potencialmente grande benefício no avanço do nosso entendimento, e capacidade para proporcionar terapia, de doenças como a Doença de Alzheimer. Finalmente, através da combinação das verificações da preferência da forma reduzida de MB, e da demonstração da sua actividade no ensaio à base de células em concentrações substancialmente abaixo das previstas somente com base nos resultados in vitro, os inventores mostraram que este composto, e outros semelhantes, podem ser utilizados numa formulação de redução apropriada para a profilaxia ou tratamento da DA e perturbações relacionadas.

REFERÊNCIAS

Abrahamson, M., Jonsdottir, S., Olafsson, I. & Grubb, A. (1992) "Hereditary cystatin C amyloid angiopathy Identification of the disease-causing mutation and specific diagnosis by polymerase chain reaction based analysis". Human Genetics 89: 377-380.

Booth, D.R., Sunde, M., Bellotti, V., Robinson, C.V., Hutchinson, W.L., Fraser, P.E., Hawkins, P.N., Dobson, C.M., Radford, S.E., Blake, C.C.F. & Pepys, M.B. (1997) "Instability, unfolding and aggregation of human lysozyme variants underlying amyloid fibrillogenesis". Nature 385: 787-793.

Carrell, R.W. & Gooptu, B. (1998) "Conformational changes and disease - serpins, prions and Alzheimer's". Current Opinion in Structural Biology 8: 799-809.

Chiti, F., Webster, P., Taddei, N., Clark, A., Stafani, M., Ramponi, G. & Dobson, C. (1999) "Designing conditions for in vitro formation of amyloid protofilaments and fibrils". 73 ΕΡ 2 305 823/ΡΤ

Proceedings of the National Academy of Sciences USA 96: 3590-3594 .

Czech, C., Tremp, G. & Pradier, L. (2000) "Presenilins and Alzheimer's disease: biological functions and pathogenic mechanisms". Progress in Neurobiology 60: 363-384.

Davis, R.L., Shrimpton, A.E., Holohan, P.D., Bradshaw, C., Feiglin, D., Collins, G.H., Sonderegger, P., Kinter, J., Becker, L.M., Lacbawan, F., Krasnewich, D., Muenke, M., Lawrence, D.A., Yerby, M.S., Shaw, C.-M., Gooptu, B., Elliott, P.R., Finch, J.T., Carrell, R.W. & Lomas, D.A. (1999) "Familial dementia caused by polymerization of mutant neuroserpin". Nature 401: 376-379.

DiFiglia, M., Sapp, E., Chase, K.O., Davies, S.W., Bates, G.P., Vonsattel, J.P. & Aronin, N. (1997) "Aggregation of huntingtin in neuronal intranuclear inclusions and dystrophic neurites in brain". Science 277: 1990-1993.

Dische, F.E., Wernstedt, C., Westermark, G.T., Westermark, P., Pepys, M.B., Rennie, J.A., Gilbey, S.G. & Watkins, P.J. (1988) "Insulin as an amyloid-fibril protein at sites of repeated insulin injections in a diabetic patient". Diabetologia 31: 158-161.

Gasset, M., Bladwin, M.A., Lloyd, D.H., abriel, J.-M., Holtzman, D.M., Cohen, F.E., Fletterick, R. & Prusiner, S.B. (1992) "Predicted a-helical region of the prion protein when synthesized as peptides form amyloid". Proceedings of the National Academy of Sciences USA 89: 10940-10944.

Glenner, G.G. & Wong, C.W. (1984) "Alzheimer's disease: initial report of the purification and characterisation of a novel cerebrovascular amyloid protein". Biochemical and Biophysical Research Communications 120: 885-890.

Goate, A., Chartier-Harlin, M.-C., Mullan, M., Brown, J., Crawford, F., Fidani, L., Giuffra, L., Haynes, A., Irving, N., James, L., Mant, R., Newton, P., Rooke, K., Roques, P., Talbot, C., Pericak-Vance, M., Roses, A., Williamson, R., Rossor, M., Owen, M. & Hardy, J. (1991) 74 ΕΡ 2 305 823/ΡΤ "Segregation of a missense mutation in the amyloid precursor protein gene with familial Alzheimer's disease". Nature 349: 704-706.

Gorevic, P.D., Casey, T.T., Stone, W.J., DiRaimondo, C.R., Prelli, F.C. & Frangione, B. (1985) "b-2 Microglobulin is an amyloidogenic protein in man". Journal of Clinicai Investigation 76: 2425-2429.

Gustavsson, A., Engstrõm, U. & Westermark, P. (1991) "Normal transthyretin and synthetic transthyretin fragments form amyloid-like fibrils in vitro". Biochemical and Biophysical Research Communications 175: 1159-1164.

Hutton, M., Lendon, C., Rizzu, P., Baker, M., Froelich, 5., Houlden, H., Pickering-Brown, S., Chakraverty, S., Isaacs, A., Grover, A., Hackett, J., Adamson, J., Lincoln, 5., Dickson, D., Davies, P., Petersen, R.C., Stevens, M., de Graaf, E., Wauters, E., van Baren, J., Hillebrand, M., Joosse, M., Kwon, J.M., Nowotny, P., Che, L.K., Norton, J., Morris, J.C., Reed, L.A., Trojanowski, J.Q., Basun, H., Lannfelt, L., Neystat, M., Fahn, S., Dark, F., Tannenberg, T., Dodd, P.R., Hayward, N., Kwok, J.B.J., Schofield, P.R., Andreadis, A., Snowden, J., Craufurd, D., Neary, D., Owen, F., Oostra, B.A., Hardy, J., Goate, A., van Swieten, J., Mann, D., Lynch, T. & Heutink, P. (1998) "Association of missense and 51-splice-site mutations in tau with the inherited dementia FTDP-17". Nature 393: 702-705.

Johansson, B., Wernstedt, C. & Westermark, P. (1987) "Atrial natriuretic peptide deposited as atrial amyloid fibrils". Biochemical and Biophysical Research Communications 148: 1087-1092.

Lomas, D.A., Evans, D.L., Finch, J.T. & Carrell, R.W. (1992) "The mechanism of Z al-antitrypsin accumulation in the liver". Nature 357: 605-607.

Maury, C.P. & Baumann, M. (1990) "Isolation and characterization of cardiac amyloid in familial amyloid polyneuropathy type IV (Finnish): relation of the amyloid 75 ΕΡ 2 305 823/ΡΤ protein to variant gelsolin". Biochimica et Biophysica Acta 1096: 84-86.

Paulson, H.L. (1999) "Human genetics '99: trinucleotide repeats". American Journal of Human Genetics 64: 339-345.

Pepys, M.B., Hawkins, P.N., Booth, D.R., Vigushin, D.M., Tennent, G.A., Soutar, A.K., Totty, N., Nguyen, 0., Blake, C.C.F., Terry, C.J., Feest, T.G., Zalin, A.M. & Hsuan, J.J. (1993) "Human lysozyme gene mutations cause hereditary systemic amyloidosis". Nature 362: 553-557.

Polymeropoulos, M.H., Lavedan, C., Leroy, E., Ide, S.E., Dehejia, A., Dutra, A., Pike, B., Root, H., Rubenstein, J., Boyer, R., Stenroos, E.S., Chandrasekharappa, S., Athanassiadou, A., Papaetropoulos, T., Johnson, W.G.,

Lazzarini, A.M., Duvoisin, R.C., Di Iorio, G., Golbe, L.I. & Nussbaum, R.L. (1997) "Mutation in the a-synuclein gene identified in families with Parkinson's disease". Science 276: 2045-2047.

Prusiner, S.B., Scott, M.R., DeArmond, S.J. & Cohen, F.E. (1998) "Prion protein biology". Cell 93: 337-348.

Shibata, N., Hirano, A., Kobayashi, M., Siddique, T., Deng, H.X., Hung, W.Y., Kato, T. & Asayama, K. (1996) "Intense superoxide dismutase-1 immunoreactivity in intracytoplasmic hyaline inclusions of familial amyotrophic lateral sclerosis with posterior column involvement". Journal of Neuropathology and Experimental Neurology 55: 481-490.

Sletten, K., Westermark, P. & Natvig, J.B. (1976) "Characterization of amyloid fibril proteins from medullary carcinoma of the thyroid". Journal of Experimental Medicine 143: 993-998.

Spillantini, M.G., Crowther, R.A., Jakes, R., Hasegawa, M. & Goedert, M. (1998) "a-Synuclein in filamentous inclusions of Lewy bodies from Parkinson's disease and dementia with Lewy bodies". Proceedings of the National Academy of Sciences USA 95: 6469-6473. 76 ΕΡ 2 305 823/ΡΤ

Uemichi, Τ., Liuepnicks, J.J. & Benson, M.D. (1994) "Hereditary renal amyloidosis with a novel variant fibrinogen". Journal of Clinicai Investigation 93: 731-736.

Westermark, P., Engstrom, U., Johnson, K.H., Westermark, G.T. & Betsholtz, C. (1990) "Islet amyloid polypeptide: pinpointing amino acid residues linked to amyloid fibril formation". Proceedings of the National Academy of Sciences USA 87: 5036-5040.

Westermark, P., Johnson, K.H., 0'Brien, T.D. & Betsholtz, C. (1992) "Islet amyloid polypeptide - a novel controversy in diabetes research". Diabetologia 35: 297-303.

Westermark, P., Johnson, K.H. & Pitkanen, P. (1985) "Systemic amyloidosis: A review with emphasis on pathogenesis". Applied Physiology 3: 55-68.

Wischik, C.M., Novak, M., Thogersen, H.C., Edwards, P.C., Runswick, M.J., Jakes, R., Walker, J.E., Milstein, C., M., R. & Klug, A. (1988) "Isolation of a fragment of tau derived from the core of the paired helical filament of Alzheimer's disease". Proceedings of the National Academy of Sciences USA 85: 4506-4510.

Lisboa, 2013-06-26

Claims

ΕΡ 2 305 823/ΡΤ 1/3 REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de uma diaminofenotiazina na preparação de uma composição medicamentosa para utilização no tratamento ou profilaxia de uma tauopatia, em que a preparação compreende o passo de pré-redução da diaminofenotiazina de modo a que esteja presente pelo menos 80, 90, 95 ou 99% na forma reduzida (leuco-), e em que a diaminofenotiazina é pré-reduzida por adição de um agente redutor exógeno, e em que a forma reduzida é liofilizada, e em que a diaminofenotiazina pré-reduzida (leuco-) possui a fórmula: (D

em que Rl, R3, R4, R6, R7 e R9 são independentemente seleccionados entre hidrogénio, halogéneo, hidroxi, carboxi, alquilo, haloalquilo ou alcoxi substituídos ou não substituídos; R5 é hidrogénio; e cada um de RIO e Rll é independentemente seleccionado entre hidrogénio, hidroxi, carboxi, alquilo, haloalquilo ou alcoxi substituídos ou não substituídos; ou é um seu sal farmaceuticamente aceitável.
2. Utilização como reivindicada na reivindicação 1 em que a forma reduzida é estabilizada no estado reduzido por adição de um agente estabilizante. ΕΡ 2 305 823/ΡΤ 2/3
3. Utilização como reivindicada na reivindicação 2 em que a forma reduzida é liofilizada com o agente de estabilização.
4. Utilização como reivindicada em qualquer uma das reivindicações 1 a 3 em que a composição medicamentosa compreende adicionalmente um ou mais dos seguintes: excipientes, transportadores ou tampões farmaceuticamente aceitáveis.
5. Utilização como reivindicada na reivindicação 4 em que a composição medicamentosa é uma formulação de libertação lenta.
6. Utilização como reivindicada em qualquer uma das reivindicações 1 a 5 em que Rl, R3, R4, R6, R7 e R9 são independentemente seleccionados entre -hidrogénio, -CH3, -C2H5 ou -C3H7; cada um de RIO e Rll é independentemente seleccionado entre hidrogénio, -CH3, -C2H5 ou -C3H7; e R5 é hidrogénio, -CH3, -C2H5 ou -C3H7.
7. Utilização como reivindicada em qualquer uma das reivindicações 1 a 6 em que a diaminofenotiazina possui 0, 2, 3 ou 4 grupos metilo em torno do núcleo de diaminofenotiazina.
8. Utilização como reivindicada em qualquer uma das reivindicações 1 a 7 em que a diaminofenotiazina está assimetricamente metilada.
9. Utilização como reivindicada na reivindicação 8 em que a diaminofenotiazina é cloreto de tolónio, Azure A, Azure B ou tionina.
10. Utilização como reivindicada em qualquer uma das reivindicações 1 a 9 em que a diaminofenotiazina é seleccionada entre Azul de metileno, Azul de Toluidina O, ou Azul de 1,9-dimetilmetileno.
11. Utilização como reivindicada em qualquer uma das reivindicações 1 a 10 em que o tratamento ou profilaxia ΕΡ 2 305 823/ΡΤ 3/3 compreende administrar uma quantidade profilacticamente eficaz ou uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição medicamentosa a um paciente disso necessitado.
12. Utilização como reivindicada na reivindicação 9 em que o tratamento ou a profilaxia compreendem administrar a um paciente uma diaminofenotiazina que é tionina e esta é administrada ao paciente numa dosagem diária entre 1 e 1000 mg, opcionalmente dividida em 1 a 8 doses unitárias.
13. Utilização como reivindicada na reivindicação 10 em que o tratamento ou a profilaxia compreendem administrar a um paciente uma diaminofenotiazina que é azul de metileno, e a dosagem diária é de aproximadamente 3,2-3,5 mg/kg. Lisboa, 2013-06-26