ES2353202T3 - Materiales y procedimientos relacionados con la agregacion de proteinas en la enfermedad neurodegenerativa. - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para convertir proteolíticamente una proteína precursora en un fragmento producto en una línea celular estable, dicha proteína precursora está asociada con un estado de enfermedad en el que la proteína precursora se agrega patológicamente, procedimiento que comprende: (a) proporcionar una línea celular estable transfectada con un ácido nucleico que codifica: (i) un fragmento de plantilla de la proteína precursora tal que el fragmento de plantilla se exprese constitutivamente en la célula a un nivel que no sea tóxico para la célula; y (ii) la proteína precursora, proteína que es expresada de forma inducible en la célula en respuesta a un estímulo, (b) someter la célula al estímulo tal que exprese de forma inducible la proteína precursora en la célula, por lo que la interacción del fragmento de plantilla con la proteína precursora causa un cambio conformacional en la proteína precursora de forma que causa una agregación y procesado proteolítico de la proteína precursora del fragmento producto.

Description

Campo técnico [0001] La presente invención se refiere a modelos basados en células y a otros sistemas de análisis para modelar la agregación de proteínas asociada con la enfermedad neurodegenerativa. Adicionalmente se refiere a compuestos capaces de modular dicha agregación.

Antecedentes de la técnica [0002] Los estados de demencia tales como la enfermedad de Alzheimer (AD) se caracterizan frecuentemente por una acumulación progresiva de depósitos intracelulares y/o extracelulares de estructuras proteicas tales como placas β-amiloides y marañas neurofibrilares en el cerebro de los pacientes afectados. El aspecto de estas lesiones se correlaciona en su mayor parte con una degeneración neurofibrilar patológica y una atrofia cerebral, así como con un deterioro cognitivo (Mukaetova-Ladinska, E. B. y col. (2000) Am. J. Pathol. Vol. 157, Nº 2, 623-636). [0003] Tanto las placas neuríticas como las marañas neurofibrilares contienen filamentos helicoidales apareados (PHF), de los que un constituyente principal es la proteína tau asociada a microtúbulos (Wischik y col. (1988) PNAS EE.UU. 85, 4506). Las placas también contienen fibrillas β-amiloides extracelulares derivadas de un procesado anormal de la proteína precursora amiloidea (APP; Kang y col. (1987) Nature 325, 733). Un artículo de Wischik y col. (en ’Neurobiology of Alzheimer’s Disease’, 2ª Edición (2000) Eds. Dawbarn, D. y Allen, S. J., The Molecular and Cellular Neurobiology Series, Bios Scientific Publishers, Oxford), discute con detalle el papel putativo de la proteína tau en la patogenia de las demencias neurodegenerativas. [0004] Los estudios de la enfermedad de Alzheimer indican que la pérdida de la forma normal de la tau (Mukaetova-Ladinska y col. (1993) Am. J. Pathol., 143, 565; Wischik y col. (1995a) Neurobiol. Ageing, 16: 409; Lai y col. (1995b) Neurobiol. Ageing, 16: 433), la acumulación de PHFs patológicos (Mukaetova-Ladinska y col. (1993), loc. cit.; Harrington y col. (1994a) Dementia, 5, 215; Harrington y col. (1994b) Am. J. Pathol., 145, 1472; Wischik y col., (1995a), loc. cit.) y la pérdida de sinapsis en la corteza mesofrontal (Terry y col. (1991) Ann. Neurol., 30, 572) se correlacionan con un deterioro cognitivo asociado. Adicionalmente, la pérdida de sinapsis (Terry y col., loc. cit.) y la pérdida de células piramidales (Bondareff y col. (1993) Arch. Gen. Psychiatry, 50: 350) se correlacionan ambas con medidas morfométricas de una patología neurofibrilar reactiva a tau, que es semejante, a un nivel molecular, a una

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redistribución prácticamente total del conjunto de proteínas tau desde una forma soluble a una polimerizada (PHFs) en la enfermedad de Alzheimer (Mukaetova-Ladinska y col. (1993), loc. cit.; Lai y col. (1995), loc. cit.). [0005] La tau existe en isoformas de corte y empalme alternativo, que contienen tres o cuatro copias de una secuencia repetitiva correspondiente al dominio de unión a microtúbulos (Goedert, M., y col. (1989) EMBO J. 8, 393-399; Goedert, M., y col. (1989) Neuron 3, 519-526). La tau de los PHF se procesa proteolíticamente a un dominio de núcleo (Wischik, C. M., y col. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 85, 4884-4888; Wischik y col. PNAS EE.UU. 1988, 85: 4506-4510); Novak, M., y col. (1993) EMBO J. 12, 365-370) que está formado por la versión de fase alterna del dominio repetitivo; sólo hay tres repeticiones implicadas en la integración estable tautau (Jakes, R., y col. (1991) EMBO J. 10, 2725-2729). Una vez formados, los agregados de tau de tipo PHF actúan como semillas para la captura adicional y proporcionan un plantilla para el procesado de la proteína tau completa (Wischik y col. 1996 Proc Natl Acad Sci EE.UU. 93, 11213-11218). [0006] En el transcurso de su formación y acumulación, los filamentos helicoidales apareados (PHFs) se agrupan en primer lugar para formar agregados amorfos dentro del citoplasma, probablemente a partir de oligómeros tempranos de tau que quedan truncados antes o en el transcurso de la agrupación de los PHF (Mena, R., y col. (1995) Acta Neuropathol. 89, 50-56; Mena, R., y col. (1996) Acta Neuropathol. 91, 633-641). Estos filamentos continúan entonces para formar unas clásicas marañas neurofibrilares intracelulares. En este estado, los PHF están constituidos por un núcleo de tau truncada y una cubierta exterior y difusa que contiene la tau completa (Wischik.,

C. M., y col, (1996) loc. cit.). El proceso de agrupación es exponencial, consumiendo el conjunto celular de tau funcional normal e induciendo una nueva síntesis de tau para compensar el déficit (Lai, R. Y. K., y col., (1995), Neurobiology of Ageing, Vol. 16, Nº 3, 433-445). Finalmente, el deterioro funcional de la neurona progresa hasta el punto de la muerte celular, dejando atrás una maraña extracelular. La muerte celular se correlaciona en gran medida con el número de marañas extracelulares (Wischik y col. 2000, loc. cit). Dado que las marañas son empujadas hacia el espacio extracelular, hay una pérdida progresiva de la cubierta exterior difusa de la neurona-PHF con la correspondiente pérdida de la inmunorreactividad tau N-terminal, pero conservando la inmunorreactividad de la tau asociada con el núcleo de los PHF (Figura 1; también Bondareff, W. y col., (1994) J. Neuropath. Exper. Neurol., vol. 53, Nº 2, 158-164). [0007] El cambio de fase que se observa en el dominio repetitivo de la tau

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incorporada en los PHF sugiere que el dominio repetitivo experimenta un cambio conformacional inducido durante la incorporación en el filamento. Al inicio de la enfermedad de Alzheimer, se contempla que este cambio conformacional podría iniciarse por la unión de la tau a un sustrato patológico, tal como proteínas de membrana dañadas o mutadas (véase la Figura 2 - también Wischik, C. M., y col. (1997) en "Microtubule-associated proteins: modifications in disease", eds. Avila, J., Brandt, R. y Kosik, K. S. (Harwood Academic Publishers, Amsterdam) págs. 185241). [0008] En el caso de la enfermedad de Alzheimer, las terapias farmacéuticas actuales se centran en el tratamiento sintomático de la pérdida de la transmisión colinérgica resultante de la neurodegeneración (Mayeux, R., y col. (1999) New Eng. J. Med. 341, 1670-1679). Sin embargo, aunque los tratamientos disponibles retrasan la progresión de la enfermedad en hasta 6 a 12 meses, no la previenen. El descubrimiento de fármacos que podrían impedir la agregación de la tau que da lugar a la neurodegeneración proporcionaría una estrategia más efectiva para la profilaxis o para la inhibición de la progresión de la enfermedad, que no requería un conocimiento inmediato de los diversos eventos que, cascada arriba, inician la agregación (véase la Figura 3).

Modelos y ensayos

[0009] El documento WO99/62548 (inventores Ghetti y col.) se refiere de forma general a procedimientos y composiciones considerados adecuados para el diagnóstico, modelado y tratamiento de patologías relacionadas con la tau. Se refiere particularmente a mutaciones en el gen de la tau consideradas conductoras a la formación de marañas neurofibrilares, y más específicamente con mutaciones génicas consideradas conductoras a alteraciones en las proporciones de las isoformas de la tau y a la formación de filamentos de tau anormales. [0010] El documento WO96/30766 describe un ensayo in vitro para la agregación de la tau en el que un fragmento de la tau correspondiente al dominio repetitivo del núcleo, que ha sido adsorbido sobre un sustrato en fase sólida, es capaz de capturar la tau soluble completa y unirse a la tau con una elevada afinidad (véase la Figura 4). Esta asociación confiere estabilidad frente a la digestión de las proteasas de las moléculas de tau en los dominios repetitivos de las moléculas de tau que se han agregado. Este proceso es autopropagante y puede ser bloqueado selectivamente mediante agentes farmacéuticos prototipo ((Wischik y col. 1996 Proc Natl Acad Sci EE.UU. 93, 11213-11218).

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[0011] Aunque el ensayo in vitro descrito en el documento WO96/30766 facilita la identificación de inhibidores o moduladores de la asociación tau-tau, los presentes inventores también han reconocido que podrían ser útiles los modelos basados en células de la agregación de proteínas del tipo de la enfermedad de Alzheimer. Dichos modelos celulares podrían usarse tanto en el cribado primario de los candidatos moduladores de la agregación tau-tau, como en el cribado secundario de compuestos ya identificados en el ensayo in vitro del documento WO96/30766. Adicionalmente, la demostración de la agregación de la tau en células también podría ayudar en la identificación de los sustratos celulares normales que están implicados en el inicio de la agregación patológica de la tau, sustratos que por sí mismos podrían ser objetivos para una intervención farmacológica. [0012] Sin embargo, numerosos artículos que describen la expresión de diversos construcciones de tau en modelos de cultivo tisulares no han conseguido demostrar la agregación (véase, por ejemplo, Baum, L. y col., (1995) Mol. Brain Res. 34:1-17). Por ejemplo, los fibroblastos de ratón 3T3 no poseen proteína tau, y por lo tanto presentan un entorno celular en el que la tau recombinante puede expresarse independientemente de la tau endógena del ratón. Previamente se ha informado de la transfección de diversas líneas celulares (Kanai y col., 1989; Goedert y Jakes, 1990; Knops y col, 1991; Lee y Rook, 1992; Gallo y col., 1992; Lo y col., 1993; Montejo de Garcini y col., 1994; Fasulo y col., 1996). Sin embargo, no se consiguió la expresión estable a largo plazo de tau truncada en dichas líneas celulares. Por ejemplo, los construcciones de tau para los restos 164 ó 173 hasta 338 ó 352 no expresaban la proteína (Lee y Rook, 1992). [0013] Aunque Fasulo y col. (Alzheimer’s Research 1996, 2, 195-200) informaron sobre la expresión transitoria de tau truncada en células COS, los datos de la expresión estable a largo plazo de esta tau no se mostraban. Estos trabajadores concluyeron, a partir del uso del sistema de transfección transitoria, que la expresión de la tau truncada no era suficiente por sí misma para inducir la agregación de tau de una forma adecuada para el análisis de fármacos. [0014] Hasta la fecha sólo se ha conseguido la agregación de tau soluble in vitro en condiciones no fisiológicas y a elevadas concentraciones (revisado en Wischik (2000), loc. cit.). [0015] El documento WO96/30766 describe dos metodologías para estudiar la agregación de tau en un entorno celular. En la primera metodología se expresaron de forma estable en células tau completas o fragmentos de tau. En la segunda

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metodología, la tau agregada se transfectó transitoriamente en células mediante el uso de lipofectina. [0016] Aunque estas dos metodologías son útiles para el estudio de la agregación tau-tau, tienen algunas limitaciones. La transfección de tau agregada en células usando una lipofección tiene una eficacia variable, ya que es la producción in vitro de la propia tau agregada. Además, el fragmento del núcleo de tau, que es la semilla más eficaz para la agregación de tau, resulta ser tóxico cuando se expresa de forma estable en células, conduciendo a unos bajos niveles de expresión. Por lo tanto, la expresión constitutiva del fragmento de tau truncada del núcleo de los PHF en células eucariotas es difícil de conseguir. Los sistemas de expresión transitoria permiten la optimización de la expresión de tau, pero la toxicidad inherente de los fragmentos hace que incluso estos sistemas sean poco fiables. Los fragmentos más largos de tau son menos tóxicos, pero no se agregan de forma fiable cuando se expresan en células. [0017] Por lo tanto, sería deseable desarrollar un sistema de modelo alternativo en el que la interacción entre, por ejemplo, moléculas de tau y similares, pudiera ser investigada en condiciones fisiológicas, en un entorno celular estable y controlable, y que pudiera usarse para cribar potenciales agentes diagnósticos, pronósticos o terapéuticos de dolencias tales como la enfermedad de Alzheimer.

Divulgación de la invención [0018] Los presentes inventores han ideado un sistema de análisis celular estable que puede usarse para modelar el procesado proteolítico guiado por plantilla de una proteína, cuya agregación está asociada con una enfermedad neurodegenerativa. En un sistema de análisis, ejemplificado con la proteína tau, se combinó un nivel muy bajo de expresión constitutiva de un fragmento de la proteína tau con una expresión inducible de la tau completa. La inducción de la tau condujo a su conversión proteolítica en un fragmento deseado, confirmando que se estaba produciendo "el procesado por plantilla" de la tau. El sistema permite fácilmente la demostración de los efectos de los inhibidores de la agregación de la tau a través de su inhibición de la producción del fragmento de 12 kD procesado a partir de la tau completa inducida. [0019] El que dicho sistema estable pueda conseguirse a pesar de las inherentes propiedades tóxicas del fragmento de 12 kD es particularmente sorprendente. Por ejemplo, según se demuestra en los Ejemplos, a continuación, aunque el truncamiento parcial en los extremos N o C de la tau completa da como resultado líneas celulares en las que puede mantenerse la expresión estable, estos construcciones más largos sólo muestran una débil propensión a agregarse, más que a unirse a la red microtubular. La

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expresión estable de combinaciones de fragmentos de tau genera agregados dentro del citoplasma de las células, pero este sistema no puede ser mantenido reproduciblemente. Los sistemas basados en la expresión inducible del fragmento de 12 kD dan lugar a una toxicidad como resultado de la imprevisible agregación intracelular del fragmento. [0020] Por lo tanto, parecería existir una compensación en los sistemas celulares de expresión estable entre inducir la agregación, y por lo tanto la toxicidad, por un lado, que produce líneas celulares que o son variables o no son viables, y mantener líneas celulares viables en las que la tau tiene una baja propensión a agregarse. A pesar de todo esto, el sistema de expresión inducible de tau de la presente invención es estable y además capaz de proporcionar una agregación controlada de la proteína para su uso en cribados y similares. [0021] Adicionalmente, el uso del ensayo ha proporcionado pruebas de que el mecanismo de acción de ciertos inhibidores (por ejemplo, fenotiazinas) de la agregación de proteínas es principalmente de naturaleza estérica, más que esencialmente redox, según puede sospecharse sobre la base de la técnica anterior. Este descubrimiento tiene implicaciones inesperadas para la elección, valoración, formulación y uso de dichos compuestos en el contexto de las enfermedades discutidas en este documento. En particular, muestra que la valoración de los coeficientes de difusión puede proporcionar un cribado valorable para la identificación de inhibidores putativos, u optimizar la estructura o el estado de los conocidos, porque los parámetros valorados inherentemente midiendo el coeficiente de difusión pueden ser altamente aplicables a la potencia de los inhibidores. [0022] El ensayo muestra adicionalmente que el uso de fenotiazinas en su forma reducida puede ser ventajoso para mejorar sus propiedades inhibidoras. [0023] En general, la presente invención proporciona un procedimiento para convertir, a través del procesado proteolítico, una proteína precursora en un fragmento producto de la proteína precursora, en una línea celular estable, procedimiento que comprende las etapas de: (a) proporcionar una línea celular estable transfectada con un ácido nucleico que codifica para (i) un fragmento de plantilla de la proteína precursora tal que el fragmento de plantilla se expresa constitutivamente en la célula a un nivel que no es tóxico para la célula; y (ii) la proteína precursora, proteína que es expresada de forma inducible en la célula en respuesta a un estímulo, mediante lo que la interacción del fragmento de plantilla con la proteína precursora provoca un cambio conformacional en la proteína precursora tal que provoca la agregación y el procesado

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proteolítico de la proteína precursora al fragmento producto. [0024] El procedimiento incluye someter la célula a un estímulo tal que la proteína precursora se exprese en la célula. Sin embargo, en las realizaciones en las que se usa un promotor inducible que provoca unos niveles bajos pero detectables de expresión e incluso en ausencia del estímulo, entonces puede omitirse la etapa del estímulo. [0025] Hablando de forma general, la proteína precursora será aquella que, in vivo, sea capaz de experimentar una interacción de polimerización conformacional inducida (de una forma autopropagante), que finalmente dé lugar a la formación de agregados formados por el fragmento producto, y asociados con el estado de enfermedad. El fragmento producto obtenido en el procedimiento proporcionado en este documento es una medida de la agregación patológica y el proceso de proteolisis que da lugar in vivo a la producción de uno o más productos tóxicos y al estado de enfermedad. El fragmento producto (o uno o más de los fragmentos) del presente procedimiento puede ser tóxico, o puede usarse simplemente como un indicador del proceso de agregación patológica. [0026] Las proteínas y las interacciones en las que se basa el procedimiento se discuten con más detalle a continuación. [0027] Los presentes inventores han demostrado que, inesperadamente, es posible expresar constitutivamente el fragmento de plantilla en una (primera) concentración que no sea tóxica para la línea celular, es decir, la línea celular es viable. Tampoco muestra anomalías celulares del tipo mostrado en, por ejemplo, el documento WO96/30766 en la Fig. 29. [0028] No obstante (por ejemplo, en un momento predeterminado mediante la adición de un estímulo), es posible sembrar el procesado de la proteína precursora a un fragmento producto (que puede ser el mismo, ampliamente equivalente o bastante diferente al fragmento de plantilla) que puede así acumularse a una (segunda, mayor) concentración que sea tóxica para la célula y que se corresponde con el estado de enfermedad. Esto a su vez proporciona procedimientos convenientes para modelar el estado de la enfermedad asociado con los efectos del fragmento producto, y evaluar el efecto de los moduladores sobre la generación del fragmento producto. [0029] En otras diversas formas distintas de realización, la invención proporciona los correspondientes procedimientos para cualquiera de iniciación, sembrado o control del procesado proteolítico, y opcionalmente la agregación, de la proteína precursora hacia el fragmento producto. [0030] En cada caso, el procedimiento puede implicar el seguimiento (directa o

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indirectamente) del nivel de procesado proteolítico de la proteína precursora. [0031] En una realización de la presente invención, los fibroblastos (3T6) expresan la tau completa ("T40") bajo el control de un promotor inducible y bajos niveles constitutivos del fragmento de tau del núcleo de los PHF (fragmento de 12 kD). Cuando se induce la expresión de la T40 en este sistema, experimenta un truncamiento dependiente de la agregación dentro de la célula, N-terminalmente en el aa 295 y C-terminalmente en el aa 390, produciendo así mayores niveles del fragmento del dominio del núcleo de 12 kD de los PHF. La producción del fragmento de 12 kD puede bloquearse de una forma dependiente de la dosis mediante inhibidores de la agregación de la tau. De hecho, la cuantificación de la actividad inhibidora de los compuestos con respecto a la generación proteolítica del fragmento de 12 kD dentro de las células puede describirse completamente en términos de los mismos parámetros que describen la inhibición de la unión tau-tau in vitro. Esto es, la magnitud de la generación proteolítica del fragmento de 12 kD dentro de las células está determinada completamente por la magnitud de la unión tau-tau a través del dominio de repetición. La disponibilidad de las proteasas pertinentes dentro de la célula no es limitante.

Proteínas precursoras y enfermedades (incluyendo tauopatías)

[0032] Según se estableció anteriormente, la invención puede basarse en torno al uso de cualquier proteína que esté asociada con una enfermedad en la que la proteína experimenta una interacción de polimerización conformacional inducida, es decir, aquella en la que un cambio conformacional de la proteína, o en un fragmento de la misma, provoca la unión al plantilla y la agregación de moléculas de proteínas adicionales (precursoras) de una forma autopropagante. [0033] Una vez iniciada la nucleación, puede surgir una cascada de agregación que implica la polimerización conformacional inducida de moléculas de proteína adicionales, dando lugar a la formación de fragmentos de producto tóxicos en agregados que son sustancialmente resistentes a una proteolisis adicional. Se cree que los agregados de proteína así formados son una causa próxima de neurodegeneración, demencia clínica y otros síntomas patológicos de este grupo de enfermedades. [0034] Las realizaciones preferidas de la invención se basan en la proteína tau. Cuando se usa en este documento, el término "proteína tau" se refiere de forma general a cualquier proteína de la familia de las proteínas tau. Las proteínas tau se caracterizan por estar entre uno las familias más importantes de proteínas que se purifican simultáneamente con los microtúbulos durante ciclos repetidos de agrupación y desagrupación (Shelanski y col. (1973) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 70., 765-768), y

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se conocen como proteínas asociadas a los microtúbulos (MAP). Los miembros de la familia tau comparten las características comunes de tener un segmento N-terminal característico, secuencias de aproximadamente 50 aminoácidos insertadas en el segmento N-terminal, que son reguladas desarrolladoramente en el cerebro, una característica región de repetición en tándem consistente en 3 ó 4 repeticiones en tándem de 31-32 aminoácidos, y una cola C-terminal. [0035] La MAP2 es la proteína asociada a microtúbulos predominante en el compartimento somatodendrítico (Matus, A., en "Microtubules" [Hyams y Lloyd, eds.] págs. 155-166, John Wiley and Sons, NY). Las isoformas de la MAP2 son prácticamente idénticas a la proteína tau en la región de repetición en tándem, pero difieren sustancialmente tanto en la secuencia como en la magnitud del dominio N-terminal (Kindler y Garner (1994) Mol. Brain Res. 26, 218-224). No obstante, la agregación en la región de repetición en tándem no es selectiva para el dominio de repetición de tau. Por lo tanto, se apreciará que cualquier discusión en este documento en relación con la proteína tau o la agregación tau-tau debería considerarse como relacionada también con la agregación tau-MAP2, la agregación MAP2-MAP2 y así sucesivamente. [0036] La Figura 5 muestra una Tabla que enumera otras diversas proteínas de agregación asociadas con enfermedades que pueden usarse en la presente invención. En cada caso, se enumeran también la enfermedad o enfermedades en las que pueden jugar un papel el inicio de la agregación y/o la mutación de la(s) proteína(s). Se enumeran el dominio o la mutación responsable de la actividad patológica, y al menos toda o parte de esta mínima porción de la proteína estarían preferiblemente englobadas por el fragmento de plantilla usado en la presente invención. [0037] Como puede observarse a partir de la tabla, los ejemplos de enfermedades que están caracterizadas por la agregación patológica de proteínas incluyen enfermedades de motoneuronas y enfermedades por cuerpos de Lewy. [0038] Notablemente, no es sólo en la enfermedad de Alzheimer en la que puede jugar un papel la proteína tau (y la función o el procesado aberrante de la misma). La patogenia de las alteraciones neurodegenerativas tales como la enfermedad de Pick y la parálisis supranuclear progresiva (PSP) parece correlacionarse con una acumulación de agregados patológicos de tau truncada en la circunvolución dentada y en las células piramidales estrelladas de la neocorteza, respectivamente. Otras demencias incluyen demencia frontotemporal (FTD); parkinsonismo relacionado con el cromosoma 17 (FTDP-17); complejo de desinhibición-demencia-parkinsonismo-amiotrofia

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(DDPAC); degeneración pálido-ponto-nigral (PPND); síndrome de Guam-ALS; degeneración pálido-nigro-luisianal (PNLD); degeneración cortico-basal (CBD) y otras (véase Wischik y col. 2000, loc. cit., para una discusión detallada - especialmente la Tabla 5.1). Todas estas enfermedades, que están caracterizadas principal o parcialmente por una agregación anormal de tau, se denominan en este documento "tauopatías". [0039] Por lo tanto, a la luz de la anterior discusión, se apreciará (y excepto donde el contexto lo requiera de otro modo) que donde las realizaciones de la invención se describan con respecto a la proteína tau o proteínas de tipo tau (por ejemplo, MAP2), la descripción debería entenderse como que se aplica igualmente a las otras proteínas discutidas anteriormente (por ejemplo, β-amiloidea, sinucleína, prión, etc.) u otras proteínas que pueden iniciar o experimentar una agregación patológica similar en virtud del cambio conformacional en un dominio crítico para la propagación de la agregación, o que imparten estabilidad proteolítica al agregado así formado (artículo de Wischik y col. (en "Neurobiology of Alzheimer’s Disease", 2ª Edición (2000) Eds. Dawbarn, D. y Allen, S. J., The Molecular and Cellular Neurobiology Series, Bios Scientific Publishers, Oxford). Todas estas proteínas pueden denominarse en este documento "proteínas de enfermedad por agregación". [0040] Asimismo, cuando en este documento se hace mención a la "agregación tau-tau", o similar, esto también puede entenderse que se aplica a otra "agregación de proteínas de agregación", tales como la agregación de β-amiloidea, la agregación de priones y la agregación de sinucleína, etc. Igualmente para la "degradación proteolítica de tau" y así sucesivamente.

Fragmentos de plantilla

[0041] En las realizaciones preferidas de la presente invención, el fragmento de plantilla comprende, consiste esencialmente en, o está constituida por, un "fragmento de núcleo" de la proteína precursora, término que se refiere a aquella parte de la proteína que es capaz de unirse a la proteína precursora para iniciar o propagar la proteolisis y la agregación según se ha descrito anteriormente. [0042] En el caso de proteínas patológicas que se agregan, también es probable que dichos fragmentos de núcleo sean aquellos que contribuyen a la estabilidad proteolítica del agregado. [0043] Así, por ejemplo, un "fragmento de núcleo de tau" es un fragmento de tau que comprende una secuencia de la proteína tau truncada derivada de la región de repetición en tándem y que, en las condiciones apropiadas, es capaz de unirse a la

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región de repetición en tándem de una proteína tau adicional o de una proteína MAP2 con alta afinidad. En el caso de la tau, el fragmento preferido es por tanto ejemplificado mediante, pero no limitado a, los fragmentos de la tau presentes en los PHF (y, finalmente, en las marañas neurofibrilares) de los cerebros con enfermedad de Alzheimer. [0044] Un fragmento de tau preferido puede ser, por tanto, desde aproximadamente (digamos) entre 295-297 que se extiende hasta aproximadamente 390-391 (véase ’dGAE’ en la Figura 6), aunque también pueden usarse variantes de dichos fragmentos, según se discute a continuación. [0045] En el caso de la APP (proteína precursora amiloidea), por ejemplo, puede preferirse la expresión de un fragmento de la APP que englobe el dominio AP de 1-40

o 1-42 aminoácidos como una proteína de fusión. [0046] Otros fragmentos del núcleo pueden estar basados, por ejemplo, en los dominios discutidos con respecto a la Figura 5. Los fragmentos de plantilla pueden incluir dominios de dos, o más de dos, de estas proteínas (por ejemplo, como fusiones). La longitud total del fragmento de plantilla puede ser cualquiera que sea apropiada para el ensayo y el fragmento del núcleo de la proteína de enfermedad por agregación que se está usando, pero generalmente será mayor o igual a aproximadamente alrededor de 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 aminoácidos de longitud. Sin embargo, en algunas realizaciones puede ser mayor de 100, 200 o incluso 500, si se desea.

Derivados

[0047] En todo los casos en los que en este documento se discute una proteína mencionada (por ejemplo, proteína precursora, de plantilla o de fragmento de núcleo),

o una secuencia de un ácido nucleico referida, puede usarse un derivado u otra variante de la correspondiente proteína de referencia (o ácido nucleico) según sea apropiado, siempre que conserve las características apropiadas de la secuencia de referencia. Dichos derivados también compartirán la identidad de secuencia con la secuencia de referencia. [0048] Por ejemplo, la proteína usada puede incluir un N- o C-terminal extendido, extensión que puede ser heteróloga con la secuencia de la proteína. Igualmente, el derivado será uno mediante la inserción, deleción o adición de aminoácidos en la secuencia de referencia. Por ejemplo, una proteína tau, o un fragmento de núcleo de tau, derivado comprenderá al menos una secuencia de aminoácidos parcial que se asemeje a la región de repetición en tándem de las proteínas tau, pero en la que uno o más de los aminoácidos de la tau natural o sus fragmentos han sido sustituidos o

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deleccionados, o en la que se han insertado otros aminoácidos. [0049] Dichos cambios pueden realizarse para incrementar o eliminar la actividad de unión (siendo el último caso útil para los experimentos de control). Los controles pueden contener deleciones de secuencias o dominios para ver qué efecto pueden tener sobre la agregación. [0050] Los derivados preferidos pueden ser aquellos que incorporen mutaciones correspondientes a aquellos conocidos o sospechosos de estar asociados con el estado de enfermedad. Éstos pueden incluir cambios correspondientes a P301S dentro de la secuencia de tau (véase la Figura 7). Otras mutaciones incluyen G272V, G389R, P301L, N279K, S305N, V337M, G272V, K280Δ, R406W (véase también Wischik y col, 2000, supra). [0051] Otros derivados preferidos pueden incluir repeticiones en tándem de los fragmentos de núcleo y discutidos anteriormente, o dominios de unión dentro de esos fragmentos. [0052] Otros derivados adicionales pueden estar basados en productos quiméricos basados en múltiples proteínas patológicas relacionadas, en los que sus secuencias se mezclan o combinan. Por ejemplo, podrían ligarse fragmentos de la enzima de restricción de la tau junto con fragmentos de MAP2 o incluso de un gen no relacionado para generar derivados recombinantes. Una estrategia alternativa para modificar los fragmentos del núcleo emplearía una PCR según describen Ho y col., 1989, Gene 77, 51-59 o transposiciones de ADN (Crameri y col., 1998 Nature 391).

Uso de construcciones de ácidos nucleicos

[0053] Los ácidos nucleicos de, o para su uso en, la presente invención, pueden proporcionarse aislados y/o purificados a partir de su entorno natural, en una forma sustancialmente pura u homogénea, o exentos o sustancialmente exentos de otros ácidos nucleicos de la especie de origen. Cuando se usa en este documento, el término "aislado" engloba todas estas posibilidades. Los ácidos nucleicos que codifican, por ejemplo, para el fragmento de plantilla, serán al menos parcialmente sintéticos porque comprenderán secuencias de ácidos nucleicos que no se encuentran conjuntamente en la naturaleza (no son contiguas), sino que han sido ligadas o artificialmente combinadas de otro modo. [0054] El ácido nucleico según la presente invención puede estar en forma de, o derivar de, ADNc, ARN, ADN genómico y ácidos nucleicos modificados o análogos de ácidos nucleicos. Cuando se especifica una secuencia de ADN, por ejemplo, con referencia a una figura, salvo que el contexto lo requiera de otro modo, se engloba el

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ARN equivalente, con el U sustituido por T cuando aparezca. [0055] Según se ha descrito anteriormente, los ácidos nucleicos pueden codificar para derivados u otras variantes que comparten homología con las secuencias de referencia en cuestión. Preferiblemente, el ácido nucleico y/o la secuencia de aminoácidos en cuestión compartirían aproximadamente el 50%, o el 60%, o el 70%, o el 80% de identidad, muy preferiblemente al menos aproximadamente el 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o el 99% de la secuencia en la que se basa la variante. La similitud u homología puede definirse y determinarse mediante el programa TBLASTN, de Altschul y col. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10, que es de uso estándar en la materia, o, y esto puede ser preferido, el programa estándar BestFit, que es parte del paquete Wisconsin, versión 8, septiembre de 1994, (Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, EE.UU., Wisconsin 53711) usando los parámetros por defecto. Una fórmula común para calcular las condiciones de rigurosidad requeridas para conseguir la hibridación entre moléculas de ácidos nucleicos con una de secuencia específica es: Tm = 81,5°C + 16,6Log [Na+] + 0,41 (% de G+C) - 0,63 (% de formamida) - 600/nº de pb del bicatenario. [0056] El experto en la materia puede preparar fácilmente las secuencias de ácidos nucleicos que codifican para las proteínas o polipéptidos apropiados usando la información y referencias contenidas en este documento y las técnicas conocidas en la materia (por ejemplo, véase Sambrook, Fritsch y Maniatis, "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, y Ausubel y col., Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, 1992). Estas técnicas incluyen (i) el uso de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar muestras del ácido nucleico pertinente, por ejemplo, a partir de fuentes genómicas, (ii) una síntesis química, o (iii) la preparación de secuencias de ADNc. [0057] Puede generarse un ADN que codifique, por ejemplo, fragmentos de núcleo de la tau y usarse de cualquier forma adecuada conocida por los expertos en la materia, incluyendo tomar el ADN codificante, identificar los sitios de reconocimiento de enzimas de restricción adecuados en cualquier lado de la porción que se va expresar, y cortar y extraer dicha porción del ADN. Pueden realizarse modificaciones en las secuencias que codifican para la proteína (por ejemplo, tau), por ejemplo, usando mutagénesis dirigida.

Construcciones

[0058] Por tanto, la invención también se refiere, en un aspecto adicional, a moléculas de ácido nucleico que codifican las apropiadas proteínas precursoras y de

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fragmento de plantilla. Como se discute a continuación, éstas pueden estar presentes en construcciones iguales o diferentes constructos, y en el último caso, también se prevén composiciones que comprenden dos o más tipos de construcción. [0059] Las secuencias de ácidos nucleicos que permiten a un vector replicarse en una o más células hospedadoras seleccionadas son conocidas para varias bacterias, levaduras y virus. Por ejemplo, varios orígenes víricos (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) son útiles para clonar vectores en células de mamífero. Los vectores de expresión que comprenden un ácido nucleico según se describe en este documento pueden estar, por ejemplo, en forma de un plásmido, cósmido, partícula vírica, fago o cualquier otro vector o construcción adecuada que puedan ser captados por una célula y expresado apropiadamente. [0060] Los vectores de expresión contendrán un promotor que esté unido operativamente a la secuencia de interés de ácido nucleico que codifica para la proteína, de forma que dirija la síntesis de ARNm. Los promotores reconocidos por diversas células hospedadoras potenciales son bien conocidos. "Unido operativamente" significa conectado como parte de la misma molécula de ácido nucleico, posicionado adecuadamente y orientado para que el promotor inicie la transcripción. El ADN unido operativamente a un promotor está "bajo el control transcripcional" del promotor. La transcripción desde vectores en células hospedadoras de mamíferos es controlada, por ejemplo, por promotores obtenidos a partir de genomas de virus tales como poliomavirus, virus de la viruela aviar, adenovirus (tales como Adenovirus 2), virus del papiloma bovino, virus del sarcoma aviar, citomegalovirus, un retrovirus, virus de la hepatitis-B y el virus del simio 40 (SV40), a partir de promotores heterólogos de mamífero, por ejemplo, el promotor de la actina o un promotor de inmunoglobulina, y a partir de promotores de choque térmico, siempre que dichos promotores sean compatibles con los sistemas celulares hospedadores. Los vectores de expresión usados en células hospedadoras eucariotas (levaduras, hongos, insectos, plantas, animales, seres humanos o células nucleadas de otros organismos pluricelulares) contendrán también las secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para estabilizar el ARNm. [0061] El promotor usado para el fragmento de plantilla será "constitutivo". Este promotor puede ser lo suficientemente débil como para que el nivel del fragmento de plantilla expresado en la célula no sea detectable por sí mismo (directamente) usando técnicas convencionales, sino (indirectamente) por su efecto sobre la proteína precursora, dando lugar a la agregación y el procesado proteolítico de la misma (es

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decir, efectivamente indetectable cuando se inhibe dicha agregación). Dichos promotores pueden ser seleccionados por los expertos en la materia a la luz de la presente divulgación sin una carga indebida tal como los enumerados anteriormente. [0062] En el caso de la proteína precursora, el promotor es "inducible" -lo que significa que, y como bien entienden los expertos en la materia, la expresión se "activa" o se incrementa en respuesta a un estímulo aplicado. La naturaleza del estímulo varía entre los promotores. Algunos promotores inducibles provocan unos niveles bajos o indetectables de expresión (o ninguna expresión) en ausencia del estímulo apropiado. Otros promotores inducibles provocan una expresión constitutiva detectable en ausencia del estímulo. Cualquiera que sea el nivel de expresión en ausencia del estímulo, la expresión desde cualquier promotor inducible se incrementa en presencia del estímulo correcto. En los siguientes experimentos se ha usado un promotor inducible Lac. [0063] Los vectores de expresión de la invención también pueden contener uno o más genes de selección. Los genes de selección típicos codifican para proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, (b) complementan deficiencias auxótrofas, o (c) aportan nutrientes críticos no disponibles en el medio complejo, por ejemplo, el gen que codifica para la D-alanina racemasa para bacilos. Un ejemplo de marcadores seleccionables adecuados para células de mamíferos son aquellos que permiten la identificación de células competentes para captar el ácido nucleico que codifica para la proteína deseada, tal como la DHFR o la timidina cinasa. Una célula hospedadora apropiada, cuando se emplea DHFR natural, es la línea celular CHO deficiente en actividad de DHFR, preparada y propagada según se describe en Urlaub y col., Proc. Natl. Acad Sci EE.UU. 77: 4216 (1980). Un gen de selección adecuado para uso en levaduras es el gen trp1 presente en el plásmido de levadura Rp7 [Stinchcomb y col., Nature, 282: 39 (1979); Kingsman y col., Gene, 7: 141 (1979); Tschemper y col., Gene, 10: 157 (1980)]. El gen trp1 proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carece de la capacidad de crecer en triptófano, por ejemplo, ATCC: nº 44076 o PEP4-1 [Jones, Genetics, 85: 12 (1977)]. [0064] Por lo tanto, un vector típico para uso en la presente invención puede incluir un origen de replicación, una o más secuencia(s) de proteína(s) unidas operativamente a un promotor constitutivo o inducible según sea apropiado, una secuencia de terminación de la transcripción, un elemento potenciador, un gen marcador. La construcción de vectores adecuados que contienen varios de estos

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componentes emplea técnicas de ligación estándar que son conocidas por el experto en la materia.

Transformación

[0065] La presente invención también proporciona un procedimiento para producir una célula estable para uso en un procedimiento según se ha descrito anteriormente, procedimiento que comprende las etapas de: (a) introducir en una célula un ácido nucleico que codifica para (i) un fragmento de plantilla de la proteína precursora tal que el fragmento de plantilla se exprese constitutivamente en la célula a un nivel que no sea tóxico para la célula; y (ii) la proteína precursora tal que la proteína patológica sea expresada de forma inducible en la célula en respuesta a un estímulo. [0066] La introducción, que puede denominarse de forma general sin limitación como "transformación", puede emplear cualquier técnica disponible. Para células eucariotas, algunas técnicas adecuadas pueden incluir transfección con fosfato cálcico, DEAE-Dextrano, electroporación, transfección mediada por liposomas y transducción usando retrovirus u otros virus, por ejemplo, vacunas o, para células de insecto, baculovirus. El tratamiento con calcio que emplea cloruro cálcico, según se describe en Sambrook y col., supra, o la electroporación, se usan generalmente para procariotas u otras células que contienen barreras sustanciales de pared celular. La infección con Agrobacterium tumefaciens se usa para la transformación de ciertas células vegetales, según describen Shaw y col., Gene, 23: 315 (1983) y el documento WO89/05859 publicado el 29 de junio de 1989. [0067] Para células de mamífero sin dichas paredes celulares, puede emplearse el método de la precipitación con fosfato cálcico de Graham y van der Eb, Virology 52: 456-457 (1978). Los aspectos generales de las transformaciones en sistemas hospedadores celulares de mamífero se han descrito en la Patente de EE.UU. nº

4.399.216. Las transformaciones en levaduras se llevan a cabo típicamente según el método de Van Solingen y col., J. Bact., 130: 946 (1977) y Hsiao y col., Proc. Natl. Acad. Sci. (EE.UU.), 76: 3829 (1979). Sin embargo, también pueden usarse otros métodos para introducir ADN en células, tales como mediante microinyección nuclear, electroporación, fusión de protoplastos bacterianos con células intactas, o policationes, por ejemplo, polibreno, poliornitina. Para las diversas técnicas para transformar células de mamífero, véanse Keown y col., Methods in Enzymology, 185: 527 537 (1990) y Mansour y col., Nature 336: 348-352 (1988).

Células hospedadoras

[0068] Las células hospedadoras adecuadas para su uso en la invención pueden

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incluir bacterias, células eucariotas tales como células de mamífero y de levadura, y sistemas de baculovirus. [0069] Las líneas celulares de mamífero disponibles en la materia para la expresión de un polipéptido heterólogo incluyen células de fibroblastos 3T6, células HeLa, células de riñón de cría de hámster, células COS, línea de riñón de mono CV1 trasformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651), células de ovario de hámster chino/-DHFR (CHO, Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 77: 4216 (1980)); células de sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980)); células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células de hígado humano (Hep G2, HB 8065); células tumorales mamarias de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51); y muchas otras. [0070] Algunos hospedadores procariotas adecuados incluyen, pero no se limitan a, eubacterias, tales como organismos gramnegativos o grampositivos, por ejemplo, Enterobacteriaceae tales como E. coli. Hay disponibles públicamente de varias cepas de E. coli, tales como la cepa de E. coli K12 MM294 (ATCC 31.446); E. coli X1776 (ATCC 31.537); la cepa de E. coli W3110 (ATCC 27.325) y K5 772 (ATCC 53.635). Algunos microbios eucariotas tales como hongos filamentosos o levaduras también son hospedadores de clonación o de expresión adecuados para vectores. Saccharomyces cerevisiae es un microorganismo hospedador procariota inferior usado habitualmente. La selección de la célula hospedadora apropiada se estima dentro de la experiencia en la materia. [0071] En un aspecto adicional, la presente invención proporciona una célula hospedadora que contiene un ácido nucleico heterólogo de la invención según se ha descrito anteriormente. El ácido nucleico de la invención puede estar integrado en el genoma (por ejemplo, cromosoma) de la célula hospedadora. La integración puede ser promovida por la inclusión de secuencias que promuevan la recombinación con el genoma, según técnicas estándar. Alternativamente, el ácido nucleico puede estar en un vector extracromosómico dentro de la célula, o por el contrario, identificablemente heterólogo o foráneo a la célula. [0072] La célula puede ser producida mediante un método descrito anteriormente (introducción de la construcción de ácido nucleico) o ser el ancestro de dicha célula. También se prevén las correspondientes líneas celulares. Las líneas celulares preferidas pueden basarse en la línea celular de fibroblastos, por ejemplo, 3T6. [0073] Las células hospedadoras transfectadas o trasformadas con los vectores de expresión o de clonación descritos en este documento pueden cultivarse en medios

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nutrientes convencionales modificados según sea apropiado para inducir promotores, transformantes de selección, o amplificar los genes que codifican para las secuencias deseadas. Las condiciones de cultivo, tales como medio, temperatura, pH y similares, pueden ser seleccionadas por el experto en la materia sin una experimentación excesiva. En general, los principios, protocolos y técnicas prácticas para maximizar la productividad de los cultivos celulares pueden encontrarse en "Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach", M. Butler, ed. JRL Press, (1991) y Sambrook y col, supra. [0074] La expresión génica puede confirmarse de forma directa , por ejemplo, mediante transferencia Southern convencional, transferencia Northern para cuantificar la transcripción del ARNm [Thomas, Proc. Natl Acad Sci. EE.UU., 77: 5201-5205 (1980)], inmunotransferencia(análisis de ADN), o hibridación in situ, usando una sonda marcada apropiadamente, basada en la secuencia de la proteína patológica agregante. Alternativamente, pueden emplearse anticuerpos que puedan reconocer bicatenarios específicos, incluyendo bicatenarios de ADN, bicatenarios de ARN y bicatenarios híbridos ADN-ARN o bicatenarios de ADN-proteína. [0075] La expresión génica puede medirse alternativamente mediante métodos inmunológicos tales como la tinción inmunohistoquímica de células o secciones de tejido, y ensayos de cultivos celulares, para cuantificar directamente la expresión del producto génico. Los anticuerpos útiles para la tinción inmunohistoquímica y/o el ensayo de fluidos de muestra pueden ser monoclonales o policlonales, y pueden prepararse en cualquier mamífero. Convenientemente, los anticuerpos pueden prepararse contra una secuencia natural del polipéptido agregante patológico. [0076] Por lo tanto, un aspecto de la presente invención implica causar o permitir la expresión a partir de los ácidos nucleicos descritos en este documento, por ejemplo, mediante el cultivo de células hospedadoras en unas condiciones para la expresión del gen (presencia de estímulo) de forma que se produzca el fragmento producto. La presente invención también engloba un procedimiento para producir el fragmento producto, procedimiento que incluye su expresión a partir del ácido nucleico, según se ha descrito anteriormente. [0077] Otro aspecto de la presente invención es un kit que comprende una célula o una línea celular transformada según se describe en este documento, junto con al menos un componente adicional, por ejemplo, un agente para estimular la producción de la proteína precursora, o un agente para detectar la interacción de la proteína precursora con el fragmento de plantilla, según se describe en la sección siguiente.

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Detección de la agregación y/o del procesado proteolítico y/o del fragmento tóxico

[0078] En varias realizaciones, el progreso del procesado proteolítico o la agregación (o la modulación de los mismos -véase a continuación) puede detectarse directa o indirectamente mediante el seguimiento de la concentración o el nivel de una cualquiera o más de las siguientes especies: la proteína precursora; el fragmento producto; cualquier fragmento subproducto formado durante el proceso; un agregado de cualquiera de estos (por ejemplo, basándonos en los coeficientes de sedimentación). [0079] Por lo tanto, como se ejemplifica con las proteínas y fragmentos de tau en particular (basados en el fragmento 297-351 y la T40), la agregación puede seguirse en base al incremento en los niveles de una especie procesada de 12 kDa, derivado primariamente de la proteína precursora. [0080] Algunos procedimientos para la detección de proteínas se discuten en relación con la expresión génica anterior. Cuando se usan anticuerpos o fragmentos de los mismos en las realizaciones del procedimiento de la presente invención, pueden producirse mediante técnicas convencionales. Los anticuerpos policlonales pueden crearse mediante, por ejemplo, por inyección del correspondiente antígeno de tau en un animal, preferiblemente un conejo, y recuperando el antisuero mediante purificación por inmunoafinidad, en la que el anticuerpo policlonal se hace pasar por una columna a la que está unido el antígeno y después se eluye de forma convencional. Preferiblemente, la invención usará anticuerpos monoclonales que sean selectivos para epítopos de tau que se, pueden preparar por el procedimiento de Kohler y Milstein. Los anticuerpos monoclonales adecuados como epítopos de tau pueden modificarse mediante procedimientos conocidos para proporcionar fragmentos Fab o fragmentos (Fab’)2, quiméricos, humanizados o realizaciones de anticuerpos de cadena única. [0081] Los anticuerpos según la presente invención pueden modificarse de varias formas. De hecho, el término "anticuerpo" debe interpretarse como que cubre cualquier sustancia de unión con un dominio de unión con la especificidad requerida. Por lo tanto, la invención cubre fragmentos de anticuerpos, derivados, equivalentes funcionales y homólogos de anticuerpos, incluyendo moléculas sintéticas y moléculas cuyas forma imita a la del anticuerpo, permitiendo que se una a un antígeno o epítopo. [0082] Hablando de forma general, cuando se emplean anticuerpos para la detección, el anticuerpo puede portar una molécula indicadora. Alternativamente, la detección de la unión puede realizarse mediante el uso de un segundo anticuerpo capaz de unirse a un primer anticuerpo no marcado específico de tau. En este caso, el segundo anticuerpo está unido a una molécula indicadora.

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[0083] Pueden usarse anticuerpos en cualquier sistema de inmunoensayo conocido en la materia, incluyendo, pero no limitándose a: radioinmunoensayos, ensayos en "sándwich", ensayos de enzimoinmunoanálisis de adsorción ELISA); inmunoensayos fluorescentes, inmunoensayos de proteína A, etc. Típicamente se usa un método por inmunotransferencia. Preferiblemente, el inmunoensayo se realiza en fase sólida, como sabría bien el experto en la materia. Por ejemplo, puede adsorberse un anticuerpo a, por ejemplo, una columna de ensayo, y entonces la muestra celular puede lavarse a través de la columna en unas condiciones adecuadas para permitir la unión al anticuerpo en fase sólida de cualquier agregado de la proteína de interés, por ejemplo, un agregado tau-tau. El exceso de reactivos se elimina lavando, y la unión de la proteína agregada a la columna puede detectarse mediante cualquier medio adecuado, por ejemplo, según se ejemplificó anteriormente y a continuación. [0084] Los anticuerpos monoclonales preferidos son como sigue:

-

los que reconocen el extremo N o Cdel epítopo de tau permiten medir la unión entre especies truncadas y completas de tau. Son especialmente útiles los anticuerpos que reconocen epítopos específicos humanos. Uno de dichos anticuerpos monoclonales (denominado 27/499) reconoce un epítopo específico humano localizado en la región entre la Gly-16 y la Gln-26 de tau, y permite así la medida de la unión entre las especies de tau completas, siempre que una derive de una fuente no humana (Lai (1995); "The role of abnormal phosphorylation of tau protein in the development of neurofibrillary pathology in Alzheimer’s disease", PhD Thesis, Universidad de Cambridge).

-

los que reconocen el fragmento de núcleo de tau truncado en la Glu-391. Un ejemplo es mAb 423 (Novak y col. (1993), loc. cit.). Este anticuerpo permite la detección de la unión de un fragmento de núcleo de tau truncada o que termina en la Glu-391 a un fragmento similar que termina en la Ala-390, que no es reconocido por mAb 423. Este truncamiento se produce de forma natural en el transcurso de la agrupación de los PHF en la enfermedad de Alzheimer (Mena y col. (1995), (1996), loc. cit.; Novak y col. (1993), loc. cit.; Mena y col. (1991), loc. cit.). Adicionalmente, cuando la tau se une a través del dominio de repetición in vitro, la digestión con una proteasa (por ejemplo, pronasa) genera un fragmento detectable mediante mAb 423 (véase Wischik y col, 1996, loc. cit.). En los aspectos preferidos de la presente invención, en lo que se refiere a la proteína tau, este anticuerpo puede usarse para distinguir la generación del fragmento producto escindido proteolíticamente (terminación Glu-391) a partir

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de la expresión constitutiva del fragmento de plantilla (Ala-390).

- los que reconocen un epítopo genérico de tau en el dominio de repetición. Una realización preferida utiliza un anticuerpo (por ejemplo, MAb 7.51). Cuando va a detectarse una agregación tau-MAP2 o MAP2-MAP2, podría usarse un anticuerpo que detecte un epítopo genérico de MAP2. El anticuerpo 7.51 reconoce un epítopo genérico de tau ubicado en la antepenúltima repetición de tau (Novak y col. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 88, 5837-5841), que está ocluido cuando la tau está unida en una configuración inmunoquímica de tipo PHF, pero que puede ser expuesto tras un tratamiento con ácido fórmico (Harrington y col. (1990), (1991), loc. cit.; Wischik y col. (1995a), loc. cit.). La tau normal soluble, o la tau unida a microtúbulos, puede detectarse usando mAb

7.51 sin tratamiento con ácido fórmico (Harrington y col. (1991), loc. cit.; Wischik y col. (1995a), loc. cit.). La unión de la tau completa en el ensayo de unión tau-tau está asociada con la oclusión parcial del epítopo mAb 7.51.

[0085] El anticuerpo 27/342 reconoce un epítopo genérico de tau no específico de especie localizado entre la Ser-208 y la Ser-238 que está parcialmente ocluido en el transcurso de la interacción tau-tau (Lai, loc. cit.). [0086] Los sitios de unión de algunos anticuerpos monoclonales se muestran en la Figura 6.

Cribado de moduladores e inhibidores

[0087] Según se ha descrito anteriormente, la invención se refiere preferiblemente al uso de un sistema según se proporciona en este documento, en un procedimiento para modelar e identificar agentes terapéuticos para el tratamiento de las enfermedades discutidas en este documento. [0088] Un procedimiento típico para valorar la capacidad de un agente de modular la agregación y/o el procesado proteolítico de una proteína precursora en un producto en respuesta a una interacción con un fragmento de plantilla puede comprender:

(a)

proporcionar una célula o línea celular estable según se discutió anteriormente,

(b)

someter la célula al estímulo tal que la proteína precursora sea expresada en la célula y mediante lo que la interacción del fragmento de plantilla con la proteína precursora cause un cambio conformacional en la proteína tal que cause la agregación y el procesado proteolítico de la proteína precursora a un fragmento producto,

(c)

seguir la producción del fragmento producto en presencia del

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agente,

(d) opcionalmente, comparar el valor obtenido en la etapa (c) con

un valor de referencia. [0089] El valor de referencia puede estar basado en la observación histórica, o puede basarse en los experimentos de control llevados a cabo paralelamente, por ejemplo, en los que un integrante del ensayo (fragmento de plantilla, proteína precursora, estímulo, agente) está modificado o ausente. [0090] Los diversos procedimientos descritos anteriormente pueden comprender la etapa adicional de correlacionar el resultado de la etapa (d) con la actividad moduladora del (los) agente(s). [0091] Por lo tanto, un procedimiento para identificar un modulador de la agregación de una proteína asociada con una enfermedad en el que la proteína experimenta una interacción conformacional inducida, puede comprender ejecutar un procedimiento para inducir la agregación, según se ha descrito anteriormente, en presencia de uno o más agentes sospechosos de ser capaces de modular (por ejemplo, inhibir o revertir) la agregación. El grado de agregación (y opcionalmente de procesado proteolítico) puede observarse en presencia o ausencia del agente, y correlacionarse los valores relativos con su actividad como modulador. [0092] Por ejemplo, puede añadirse una sustancia de prueba a un sistema celular según se ha descrito anteriormente, e incubarse las células durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la unión y para demostrar la inhibición de la unión. Entonces puede detectarse el complejo de tau unido, por ejemplo, usando un anticuerpo marcado adecuadamente, tal como MAb 7.51, en una inmunotransferencia del extracto celular total, o cualquier otro procedimiento detección adecuado. [0093] Cuando se emplea un procedimiento de cribado para este propósito, es decir, para la identificación de los compuestos moduladores/inhibidores, puede usarse un ensayo no competitivo o competitivo. Por ejemplo, en un ensayo competitivo de un tipo bien conocido en la materia, puede compararse el efecto de un inhibidor o modulador conocido en presencia o ausencia de sustancias de prueba o agentes adicionales, para determinar la capacidad de la sustancia de prueba de competir con el inhibidor/modulador conocido por unirse a la proteína de interés. Especificidad de inhibición [0094] Pueden usarse los procedimientos de cribado según este aspecto de la presente invención para cribar compuestos que demuestren las propiedades de inhibición competitiva selectiva de la agregación de proteínas relacionadas con

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enfermedades (por ejemplo, tau-tau, tau-MAP2, u otra unión de proteínas), sin interferir en ninguna unión ’normal’ en la que participe la proteína precursora (por ejemplo, tau o MAP2 a tubulina, o por analogía, otras proteínas precursoras con sus compañeros de unión, en la medida en que éstos sean conocidos). [0095] Específicamente, en el caso de tau, un procedimiento para determinar cualquier posible interferencia de la unión de tau, MAP2 o un derivado de las mismas a tubulina por los potenciales inhibidores/moduladores, comprende poner en contacto una preparación de tubulina despolimerizada o microtúbulos de taxol estabilizados con el agente, seguido de la detección de la unión tau-tubulina o MAP2-tubulina. La unión tau-tubulina también podría demostrarse, por ejemplo, mediante una distribución citoesquelética normal, según se describe en, por ejemplo, el documento WO96/30766. Los procedimientos para la preparación de proteínas de tubulina o fragmentos de la misma, posiblemente en combinación con compañeros de unión, son conocidos en la materia y los describen, por ejemplo, Slobada y col. (1976, en: Cell Mobility (R. Goldman, T. Pollard y J. Rosenbaum, eds.), Cold Spring Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York, págs. 1171-1212). [0096] A los expertos en la materia se les ocurrirán procedimientos análogos para otras proteínas con funciones ’patológicas’ y ’normales’ a la luz de la presente divulgación.

Viabilidad celular

[0097] Cuando se desee, los procedimientos de la presente invención pueden incluir adicionalmente la etapa de ensayar la viabilidad de las células que expresan la proteína de plantilla y opcionalmente la proteína precursora, por ejemplo, mediante el uso de un kit de ensayo de lactato deshidrogenasa (Sigma). [0098] En el caso de que se esté investigando una agregación tau-tau, tau-MAP2 o MAP2-MAP2 (véase anteriormente, en ’especificidad’), esta etapa también puede proporcionar una indicación de cualquier interferencia del agente de prueba en la unión de la tau o la MAP2 a tubulina, dado que la inhibición o la interferencia de la unión tau-tubulina o MAP2-tubulina se correlaciona hasta cierto punto con una disminución en la capacidad de las células para dividirse, y por tanto, con una disminución en la viabilidad celular.

[0099]

Puede usarse la viabilidad celular para obtener un valor de la DL50 para el

agente.

[0100]

Los inhibidores preferidos tendrán un índice terapéutico (DL50/B50

véase la discusión de la Figura 9) de al menos 2, 5, 10 ó 20.

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Elección del agente de prueba

[0101] Los compuestos que se prueben pueden ser cualquiera del que se desee evaluar su actividad relevante. [0102] Los procedimientos pueden servir como un cribado primario, con objeto de identificar nuevos inhibidores/moduladores, o como cribado secundario con objeto de estudiar con más detalle inhibidores/o moduladores conocidos. [0103] Los agentes pueden ser compuestos químicos naturales o sintéticos. Los anticuerpos que reconocen un agregado de proteínas de tipo enfermedad de Alzheimer y/o que modulan la agregación de proteínas de tipo enfermedad de Alzheimer forman una clase de compuestos inhibidores o moduladores putativos con respecto al proceso de agregación. Más habitualmente, se probarán compuestos químicos relativamente pequeños, preferiblemente que sean capaces de atravesar la barrera hematoencefálica. Otras cualidades que pueden ser deseables para establecer junto con (antes, simultáneamente o después) del uso de la presente invención, incluyen: no tóxico para la médula ósea, mínimamente perjudicial de la actividad cardiovascular; mínima toxicidad hepática y renal; buena absorción oral; no metabolizado a una forma inactiva, y similares. Como serán conscientes los expertos en la materia, estas pruebas pueden realizarse sobre una base comercial mediante procedimientos bien establecidos para compuestos que se desean probar de esta forma. [0104] Para una sustancia de prueba típica y un modulador putativo, cuando sea posible, se determinará primero la solubilidad, por ejemplo, a partir del índice Merck. Cuando la sustancia sea soluble en disolución acuosa, puede prepararse una disolución madre concentrada, por ejemplo, a 5-20 µM en PBS. Inmediatamente antes de su uso, ésta puede diluirse con medio de cultivo tisular para dar una disolución madre de trabajo a, por ejemplo, 100 µM, e introducirse en células para dar una concentración final de entre 0-10 µM para la mayoría de los compuestos. Naturalmente, si se desea probar compuestos a una concentración mayor de 10 µM, la concentración de la disolución madre de trabajo se incrementará apropiadamente. [0105] Cuando la sustancia no sea soluble en disolución acuosa, las disoluciones madre pueden prepararse en un disolvente apropiado (determinado a partir del índice Merck o experimentalmente), por ejemplo, etanol a 5-29 nM. Esta puede diluirse de nuevo con medio de cultivo tisular e inmediatamente antes de su uso para dar una disolución de trabajo, por ejemplo, a una concentración de 100 µM, y añadirse a las células para rendir una concentración final de, por ejemplo, 0-10 µM para la mayoría de los compuestos de prueba. Como anteriormente, si los compuestos se van a probar a

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una concentración mayor de 10 µM, la concentración de la disolución del trabajo se incrementará según sea apropiado. [0106] La persona experta apreciará que la cantidad de sustancia o compuesto de prueba que se añade en un ensayo de cribado según este aspecto de la invención, y de hecho la forma en que es introducida, puede ser determinada por los expertos en la materia, si fuera necesario mediante el uso de una serie de experimentos. Cuando el compuesto administrado y la línea celular tengan unas condiciones óptimas en conflicto (por ejemplo, en términos de pH, o de fuerza iónica, etc.) deberían ensayarse diversas condiciones para encontrar un nivel de compromiso óptimo. Las concentraciones iniciales pueden elegirse para que estén a un nivel que pueda usarse realmente en un contexto terapéutico, es decir, que no sean letales para un paciente (véanse los comentarios sobre las dosis, a continuación). A la luz de la presente divulgación, dicha metodología no presentará ninguna carga indebida para el experto en la materia.

Cribado de fenotiacinas

[0107] Según se describe en, por ejemplo, el documento WO96/30766, entre los agentes hallados capaces de inhibir la polimerización conformacional patológica inducida de proteínas tales como tau hay ciertas diaminofenotiacinas. Algunos ejemplos incluyen tales como tionina, azul de metileno (methylene blue, MB), cloruro de tolonio y azul de dimetilmetileno (dimethyl-methylene blue, DMMB), que son de particular interés como potenciales agentes terapéuticos para su uso en la prevención de la agregación tau-tau en enfermedades tales como la enfermedad de Alzheimer. [0108] Éste y otros aspectos adicionales de la invención se comprenderán mejor con referencia a las siguientes figuras y datos experimentales, aportados únicamente a modo de ejemplo.

Figuras

[0109]

Figura 1. Muestra una ilustración esquemática de la estructura de un filamento

helicoidal apareado (arriba) y la inmunoquímica de marañas neurofibrilares durante

la progresión de la enfermedad de Alzheimer (abajo).

Figura 2. Muestra un esquema conceptual en el que los factores de nucleación

críticos proporcionan una ’semilla’ que inicia la captura de tau, que se convierte

entonces en autocatalítica.

Figura 3. Muestra un modelo patógeno putativo de la enfermedad de Alzheimer.

La agregación de tau es un proceso próximo previo al fracaso en el transporte

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axonal y la consiguiente muerte neuronal. La cascada de agregación de tau puede desencadenarse bien por un evento de sembrado/nucleación que surge de cambios cascada arriba, o bien a partir de mutaciones primarias en el gen de tau. Figura 4. Muestra cómo la inducción de la tau completa puede conducir a su conversión en el fragmento de 12 kD, siempre que haya algo de tau de 12 kD preexistente en la célula. Figuras 5a-b. Muestran una tabla que enumera proteínas que juegan un papel en enfermedades de agregación de proteínas. También se enumeran las propias enfermedades, el dominio de agregación y/o la mutación que se cree que está implicada, y el tamaño putativo (máximo) de la subunidad fibrilar. Se aportan una

o más referencias bibliográficas para cada proteína. Figura 6. Muestra una ilustración esquemática de los sitios de unión de varios anticuerpos monoclonales a diferentes formas de tau truncada en N y C. Figuras 7a-b. Muestran la secuencia de nucleótidos y la predicha de aminoácidos de una isoforma de proteína tau humana. La secuencia se dedujo a partir del ADNc del clon htau40. Figura 8. Muestra las estructuras de tionina, cloruro de tolonio, clorpromacina y tacrina. Figura 9. Aporta datos de ensayos celulares para diaminofenotiacinas, y una antroquinona relacionada estructuralmente, junto con los valores de la KI aparente, determinados según se describe en este documento. En las Figuras y Ejemplos de este documento se ha calculado un parámetro adicional, B50, para expresar la actividad de una forma relacionada directamente con las condiciones del ensayo basado en células, y proporcionar por lo tanto una indicación de la concentración tisular que se requeriría para conseguir la correspondiente actividad in vivo. El valor de B50 es la concentración del compuesto de prueba usado en el ensayo celular a la cual la producción relativa de la banda de 12 kD de la tau completa se redujo a un 50% de la observada en ausencia del compuesto. Hay una simple relación lineal entre el valor de la KI aparente y el valor de B50 como sigue:

B50 celular = 0,0217 x KI [0110] Con objeto de comparar la utilidad relativa de los compuestos como terapia, puede ser deseable calcular un valor de DL50. Cuando las propiedades inhibidoras son similares, los compuestos preferidos para su uso clínico pueden ser aquellos que tengan el mayor valor de DL50. Puede calcularse un índice terapéutico (RxIndx) para cada uno de los compuestos probados en los ensayos celulares como

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sigue:

RxIndx = DL50 / B50 [0111] La toxicidad de los compuestos puede medirse mediante las cifras celulares después de 24 h de exposición al compuesto usando un kit ensayo de lactato deshidrogenasa TOX-7 (Sigma Biosciences), según las instrucciones del fabricante, después de lisar las células remanentes. Alternativamente puede usarse un kit de Promega UK (CytoTox 96), de nuevo según las instrucciones del fabricante. [0112] La Figura 10 muestra los resultados de usar tionina reducida en la presente invención, basándose en un conjunto de datos de 7 experimentos. Los datos celulares observados para la producción de la banda de 12 kD pueden ajustarse adecuadamente (es decir, coeficiente de relación observado frente al predicho > 0,9) a una función estándar que describe la inhibición de la unión tau-tau in vitro. Para obtener este ajuste deben realizarse dos suposiciones, que son coherentes con los resultados de otros estudios basados en células e in vitro:

1) la concentración intracelular de tau es de aproximadamente 500 nM;

2) la afinidad de unión tau-tau es de 22 nM. Usando estas suposiciones, la función para la actividad celular predicha a través de un modelo de inhibición estándar es:

Actividad = [tau] / ([tau] Kd * (1 + [tionina] / KI) Puede resolverse mediante procedimientos numéricos convencionales para derivar un valor de la KI aparente. Según se indica, el valor para la forma reducida de la tionina es 100 nM, que es esencialmente el mismo al observado para la unión tau-tau in vitro a una concentración de tau de 500 nM, cuando se sabe que el valor de la Kd para la unión tau-tau es de 22 nM. Por lo tanto, la actividad de la tionina, cuando la lectura es la producción del producto de truncamiento de 12 kD a partir de la tau completa, puede explicarse cuantitativamente sobre la base de la magnitud de la inhibición de la unión tau-tau que se produce a lo largo del dominio de repetición dentro de la célula. Esto confirma que la magnitud de la unión tau-tau determina la producción de una unidad tau del núcleo de los PHF proteolíticamente estable dentro de la célula. [0113] Todos los análisis celulares posteriores de las actividades de otros compuestos se comunican en el mismo formato estandarizado, con las mismas suposiciones relativas a la concentración intracelular de tau (500 nM) y a la afinidad de unión tau-tau (22 nM) a lo largo del dominio de repetición. [0114] La Figura 11 muestra los resultados para las condiciones en las que se han omitido los agentes reductores (es decir, tionina oxidada, cotéjese la Figura 10).

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[0115] De nuevo, la actividad celular se predice a través de un modelo de inhibición estándar:

Actividad = [tau] / ([tau] Kd * (1 + [tionina oxid.] / KI) [0116] En este caso, la tionina tiene ahora un valor de KI aparente de 1.200 nM. Esto confirma que las diaminofenotiacinas requieren estar en la forma reducida para su actividad. Se extrajo una conclusión similar a partir del análisis de los datos de unión in vitro (resultados no mostrados). [0117] La Figura 12 muestra que usando unas condiciones reductoras o parcialmente reductoras, el azul de metileno parece ser mucho más activo en el ensayo basado en células que el predicho a partir de estudios in vitro en los que la duración del ensayo (1-2 horas) no había sido suficiente para conseguir la reducción. [0118] La actividad celular se predice de nuevo a través de un modelo de inhibición estándar:

Actividad = [tau] / ([tau] Kd * (1 + [MB] / KI) [0119] En el ensayo celular, el valor de la KI aparente para el azul de metileno es de 123 nM, que está en el mismo intervalo que la tionina y el cloruro de tolonio. Según se indica en la Figura 9, la correspondiente concentración de tejido cerebral (es decir, valor de B50) requerida para inhibir la agregación de tau sería de 2-3 µM. [0120] La Figura 13 muestra los correspondientes datos de actividad basados en células correspondientes al cloruro de tolonio reducido, indicando de nuevo que el valor predicho de KI derivado de los estudios in vitro puede usarse para describir la producción del fragmento de 12 kD a partir de la tau completa en células. [0121] La actividad celular se predice a través de un modelo de inhibición estándar:

Actividad = [tau] / ([tau] Kd * (1 + [TC] / KI) [0122] Esto proporciona una confirmación adicional de la validez del procedimiento de análisis matemático usado. [0123] La Figura 14 muestra que la DH12 (antroquinona), que está estructuralmente relacionada con las diaminofenotiacinas, es inactiva en las condiciones del ensayo. [0124] Las Figuras 15 y 16 muestran análisis similares a los aportados anteriormente en las Figuras 9-14, pero para la clorpromacina y la tacrina respectivamente. Usando las mismas suposiciones (concentración de tau de 415 nM, y Kd de la unión tau-tau de 22 nM), y la actividad celular predicha a través del modelo de inhibición estándar:

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Actividad = [tau] / ([tau] Kd * (1 + [cpz] / KI) los valores de la KI aparente para clorpromacina y tacrina (2.117 nM y 802 nM, respectivamente) son mayores que los anticipados a partir de los estudios in vitro. [0125] La Figura 17 muestra la magnitud de la reducción de varios compuestos en presencia de DTT. [0126] La Figura 18 muestra el porcentaje de reducción del MB representado frente a la proporción de MB:Vitamina C. [0127] La Figura 19(a) muestra que, suponiendo una concentración tisular objetivo de 4 µM (es decir, 1,5 µg/g), es posible determinar, a partir de los datos de DiSanto y Wagner (1972), que se conseguirían concentraciones tisulares de este orden a una dosis IV de 0,11 mg/kg. [0128] La Figura 19(b) muestra un modelo para la distribución del MB tras una única dosis de 100 mg en un sujeto de 70 kg, suponiendo una absorción instantánea. [0129] La Figura 20 resume los resultados de la expresión transitoria de fragmentos de tau en células 3T3 y COS-7 basándose en los datos a partir de experimentos microscópicos y bioquímicos. [0130] La expresión de los fragmentos de tau recombinante en células eucariotas se realizó como sigue. Se examinaron ocho construcciones de tau, expresados transitoriamente en células 3T3 y en células COS-7 mediante inmunocitoquímica e inmunotransferencias. La magnitud de la expresión en cada tipo celular se expresó semicuantitativamente sobre la base de ambos conjuntos de resultados: -, no hay expresión detectable; ±, inmunorreactividad muy débil; de + a ++++, niveles crecientes de inmunorreactividad positiva. En todos los casos se usó mAb 7.51 con cada construcción para obtener los resultados. Además, se confirmó la especificidad para cada construcción usando un grupo de anticuerpos contra diferentes dominios de la proteína tau (mAbs 499, T14, Tau1, 342, 7.51, 423 y T46). Las secuencias de Kozak estaban ausentes en las primeras seis construcciones, pero estaban presentes en las construcciones de ADNc 7 y 8. [0131] La Figura 21 ilustra la expresión inducible de la tau humana completa en fibroblastos 3T6 en dos líneas celulares. La T40.22 muestra un bajo nivel de filtración de fondo de la tau completa en el estado no inducido ("U"), y altos niveles de expresión tras la adición de IPTG (es decir, inducida, "I"). La T40.37 muestra lo mismo, pero niveles de expresión menores sin inducción. [0132] La Figura 22 muestra un resultado de un sistema vector triple. Se introdujo un vector que permite un nivel de expresión constitutiva muy bajo del fragmento de 12

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kD en las líneas celulares en las que ya se había conseguido la expresión inducible de la tau completa (de hecho, la línea celular T40.22 mostrada en la Figura 21, más arriba). Se introducen bajos niveles de IPTG para inducir la expresión de la tau completa. A 0 µM de IPTG, hay un nivel de expresión muy bajo de la banda de 12 kD, y una baja expresión de "filtración de fondo" de la tau completa. Como se induce progresivamente más tau completa introduciendo mayores niveles de IPTG, más tau completa es convertida a la especie de 12 kD. [0133] La Figura 23 muestra los efectos inhibidores de la tionina reducida. En cada conjunto de bandas, hay una producción inducible de la banda de 12 kD en presencia de concentraciones crecientes de niveles inductores de IPTG de la T40. Al aumentar la concentración de tionina, se suprime la producción de la banda de 12 kD a partir de T40. [0134] La Figura 24 muestra cuantitativamente los resultados de la Figura 23. En ausencia de tionina, la inducción de la T40 a unas concentraciones crecientes de IPTG conduce a un correspondiente incremento en la producción del fragmento de 12 kD. En presencia de tionina 2 µM, todavía hay inducción de la T40, pero no es convertida en el fragmento de 12 kD. [0135] La Figura 25 muestra los valores comparativos de la KI in vitro para diversos compuestos, en nM. Los valores de KI se refieren a las condiciones de ensayo en particular usadas (500:1 de DTT:compuesto, 120 minutos - véase en la Figura 17). [0136] Las Figuras 26 y 27 muestran el efecto inhibidor sobre la unión tau-tau de las fenotiacinas con 0, 2, 3 ó 0, 4, 6 grupos metilo, respectivamente. [0137] La Figura 28 muestra la derivación de dos parámetros útiles para medir la inhibición de la asociación tau-tau por los compuestos de prueba. STB es la unión estandarizada relativa a la observada en ausencia de compuesto, tomada como la media observada a 1 y 10 µg/ml. Según se describe en el documento WO96/30766, un valor de STB de 1,0 representa una unión equivalente a la observada en ausencia de compuesto, mientras que un valor de 0,2 indica que la unión se redujo a una media del 20% a las concentraciones del compuesto de prueba de 1 y 10 µg/ml. La LB50 es el log 10 de la proporción molar compuesto:tau que produce un 50% de la unión tau-tau en comparación con la observada en ausencia de compuesto (B50). [0138] La Figura 29 muestra la relación entre los parámetros STB y LB50. Puede demostrarse que STB es una función linear de LB50. [0139] STB es una función logarítmica de la proporción molar compuesto:tau a la que la unión tau-tau se reduce en un 50%.

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[0140] LB50 es el log de la proporción molar del compuesto con respecto a tau a la que la unión tau-tau es el 50% de la observada en ausencia de compuesto

LB50 = 0,05 + (2,65 x STB) r = 0,95 [0141] La determinación de B50 in vitro requiere que haya un cierto grado de inhibición de la unión tau-tau, y se obtiene un valor del 50% por extrapolación. La determinación de STB no requiere dicho procedimiento de extrapolación. [0142] La Figura 30 muestra compuestos para los que se han determinado los valores de STB y B50. Suponiendo que la concentración total de tau en las células es de aproximadamente 500 nM (es decir, la concentración de htau usada en el ensayo), los valores de B50 proporcionan una aproximación en el ensayo in vitro de la concentración (es decir [500 x B50] nM) a la cual podría esperarse actividad en los sistemas celulares. [0143] La Figura 31 muestra la relación formal entre el valor de LB50 in vitro y el valor del log KI para la serie de diaminofenotiacina. [0144] La Figura 32 muestra varias especies de fragmentos y dobletes de tau que están presentes sin inducción ("U") y después de la inducción ("I") en una línea celular de la presente invención. Estas incluyen especies con unas movilidades equivalentes a 12/14 kD, -25/27 kD, -30/32 kD, -36/38 kD y �42/44 kD (véase el Ejemplo 3). [0145] La Figura 33(a) muestra cómo surge el fragmento de 12 kD a través del procesado proteolítico inducido por la plantilla de las moléculas de tau completas en las posiciones aproximadas mostradas por las cabezas de flecha. [0146] La Figura 33(b) muestra cómo surge la especie de 25/27 kD a través del procesado proteolítico inducido por la plantilla de las moléculas de tau completas en las posiciones aproximadas mostradas por las cabezas de flecha. [0147] La Figura 34 muestra una representación de las movilidades en gel aparentes de las especies de las Figuras 32-33 y sus longitudes en restos de aminoácidos. [0148] La Figura 35 muestra que los fragmentos de las Figuras 32-34 están a intervalos de -34 restos o de -17 restos, lo que es el equivalente de una única a repetición de tau, o a la mitad de ella. Todos los fragmentos pueden generarse a partir de un agregado heptamérico básico como un simple conjunto de escisiones proteolíticas que se producen en las posiciones indicadas por las puntas de flecha. [0149] La Figura 36 muestra estos mismos fragmentos en orden descendiente de longitud y creciente de movilidad en gel. [0150] La Figura 37 muestra que el DMMB es sorprendentemente potente en el

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modelo celular. Su actividad inhibidora podía observarse tanto en ausencia de inducción por IPTG como después de la inducción (véase el Ejemplo 4). [0151] La Figura 38 muestra la actividad del DMMB en la expresión inicial de las especies de 12/14 kD, usando el mismo conjunto de suposiciones relativas a la concentración intracelular de tau y a la afinidad de unión tau-tau in vitro usadas en las Figs. 10 - 16. [0152] La actividad celular se predice a través de un modelo de inhibición estándar:

actividad = [tau] / ([tau] Kd * (1 + [DMMB] / Ki) [0153] El DMMB tiene una KI aparente dentro de la célula de 4,4 nM, y el valor celular de B50 es �100 nM.

Ejemplos

Materiales y procedimientos generales

Producción de líneas celulares 3T6H

[0154] Las células 3T6 fueron ECACC nº: 86120801, fibroblastos de embrión albino de ratón suizo. [0155] Para el sistema inducible, los experimentos emplearon Lac SwitchTM de Stratagene, usando el vector p3’SS para expresar la proteína represora Lac, y pOPRSVICAT para expresar la tau completa bajo el control del represor Lac. La expresión es inducida mediante la adición de IPTG. [0156] Inicialmente se transfectaron células 3T6, mediante electroporación, con el plásmido p3’SS, y se seleccionaron las colonias por su resistencia a higromicina. Se escogieron 5 clones que estaban expresando niveles variables de la proteína represora Lac (determinados mediante inmunocitoquímica), y también se conservaron las células no clonadas para comparación.

Producción del vector pOPRSVT40

[0157] La inserción de la T40 para su clonación en el vector pOPRSVICAT se preparó mediante PCR con polimerasa Vent (NEB) usando cebadores (mostrados a continuación) que incluían un sitio Not I y un codón de inicio o de detención, según fuera apropiado. El producto de la PCR y el vector pOPRSVICAT se cortaron con Not I y se purificaron. El vector se desfosforiló para impedir una religación, y la inserción se ligó en el vector usando protocolos estándar. [0158] La mezcla de ligación resultante se transfectó en células competentes de E. coli, y las células se colocaron en placas con amp. Las colonias se escogieron y se cuadricularon en una nueva placa con amp. Las colonias transferidas se llevaron a una

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membrana de nailon Hybond-N de 0,45 µm (Amersham), y los posibles positivos se seleccionaron mediante hibridación de colonias usando dGA marcado con (α32P)dCTP (Amersham) (usando un kit de oligomarcaje (Pharmacia Biotech) y purificado en una columna Nap-10 (Pharmacia Biotech)). La hibridación se lleva a cabo a 65°C durante la noche en tampón de Church, seguido por dos lavados de 20 min con disolución de lavado de Church. Las colonias positivas, marcadas con la sonda radiactiva, se detectaron exponiendo las transferencias a una película de rayos X durante la noche a -70°C. [0159] Las colonias positivas se seleccionaron y se hicieron crecer, y después se comprobaron mediante PCR y una digestión de restricción para confirmar la presencia de la inserción. El uso de un único sitio de restricción para la clonación significa que la T40 puede insertarse en el vector en cualquier orientación. La orientación de las inserciones se determinó de forma que se seleccionaran las colonias con el vector conteniendo a la T40 en la orientación correcta para su expresión.

Cebadores usados

5’-3’ T40-Not I

[0160] inicio

imagen1

3’-5’ T40- Not I

[0161] detención

imagen1

[0162] La secuencia complementaria de la secuencia T40 se muestra en mayúsculas, estando marcados los codones de inicio y de detención. El sitio Not I que se va a añadir se muestra subrayado. La secuencia remanente mostrada en minúsculas es un saliente de 13 pares de bases para permitir que la enzima Not I corte eficientemente. Esta era complementaria de la secuencia en el vector del plásmido hTau40 para permitir una unión eficiente de los cebadores.

Determinación de la orientación de la inserción

[0163] La orientación se determina usando una enzima de restricción que corta la inserción una vez y el vector como mucho unas pocas veces, y que proporciona un patrón de digestión de restricción diferente para cada orientación. La Hind III se ajusta

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a estos criterios para pOPRSVT40. Si la inserción está ausente, se producen dos bandas de restricción. Si la inserción está presente se producen tres bandas, y el tamaño de las bandas depende de la orientación de la inserción, según se muestra a continuación.

Orientación directa (correcta) 5385 pb 1030 pb 381 pb

Orientación inversa 6101 pb 381 pb 314 pb Producción de células que expresan la T40 bajo el control de un promotor inducible [0164] El plásmido pOPRSVT40 se produjo y se purifico mediante centrifugación en gradiente de CsCl. Se transfectó (mediante electroporación) en células 3T6H (que expresaban la proteína represora Lac) producidas según se ha descrito anteriormente. Las células positivas se seleccionaron por su resistencia a G418 (a 500 µg/ml). Las colonias resistentes se escogieron y se hicieron crecer. El nivel de expresión de la T40 completa con y sin la adición de IPTG se determinó con anticuerpos anti-tau tanto por inmunocitoquímica como por inmunotransferencia Western. Producción de pZeo295-391 [0165] El plásmido pZeo295-391 se diseñó para expresar la proteína correspondiente al fragmento truncado de tau (restos 295-391; véase a continuación). Se usó un sistema constitutivo (pcDNA3.1 de InVitrogen, Holanda) - el plásmido proporciona resistencia al antibiótico zeocina. El ADNc de esta región se amplificó mediante una reacción en cadena de la polimerasa (PCR), usando cebadores oligonucleotídicos específicos (sentido y antisentido; véase a continuación). El cebador sentido contenía un sitio EcoRI, y el antisentido un sitio BamHI. Los fragmentos se subclonaron en pcDNA3.1 (-)zeo (Invitrogen, Holanda) que había sido digerido con EcoRI y BamHI. El ADN insertado está secuencia en dirección 3’ de una secuencia promotora de citomegalovirus y en dirección 5’ de una señal de poliadenilación. El plásmido contiene la secuencia de ADN para la expresión de resistencia a ampicilina y zeocina para la selección en bacterias y células eucariotas, respectivamente. La autenticidad del ADN insertado fue confirmada mediante una secuenciación completa de ambas hebras. Secuencia de nucleótidos y de aminoácidos del fragmento de tau truncada 295-391 [0166]

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imagen1

295 cebador sentido

[0167]

imagen1

5 391 cebador antisentido

[0168]

imagen1

[0169] Los codones de inicio y de detención están en cursiva, y los sitios de restricción EcoRI y BamHI que se van a añadir están subrayados.

10 Cultivo tisular de células para ensayo [0170] El medio usado era DMEM (con Glutamax I, piruvato, 4,5 g/l de glucosa) de Life Technologies, Escocia. Éste fue complementado con FCS al 10% (Helena BioSciences), 50 U/ml de penicilina, 50 µg/ml de estreptomicina, más un antibiótico adicional apropiado para la selección y el mantenimiento del plásmido pertinente. Las

15 concentraciones de antibiótico eran 200 µg/ml de higromicina (selección y mantenimiento de p3’SS), 500 µg/ml de G418 (selección y mantenimiento de

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pOPRSVT40), 400 ó 200 µg/ml de zeocina (selección o mantenimiento de pZeo295391). [0171] Las células se hacen crecer a 37°C, en una atmósfera humidificada con un 5% de CO2. Las células se mantienen en placas de 10 cm, y se separan cuando se aproximan a confluencia. El medio se retira, las células se lavan con PBS y las células liberadas mediante tripsinización con 1 ml de disolución de tripsina/EDTA/plato de 10 cm. Las células se resuspenden en medio nuevo a una dilución de 1:10, u opcionalmente en un intervalo de diluciones desde 1:5 hasta 1:20 (desde aproximadamente 5.000 hasta 20.000 células/cm2). [0172] Para la prueba de fármacos, las células se colocan en placas de 6 pocillos o de 24 pocillos a una densidad inicial que les permitirá crecer hasta una confluencia del 50-80% en 24 horas. Los fármacos se añaden al pocillo a diversas concentraciones, la expresión de la tau completa es inducida mediante la adición de IPTG a 0 - 50 µM. Las células se hacen crecer durante 24 horas adicionales y después se recogen para su análisis mediante SDS PAGE/transferencia Western.

Preparación de la proteína tau

[0173] Se prepararon tau recombinante (clon htau40) y tau soluble en ácido perclórico extraídas de cerebro humano y de rata, según se ha descrito previamente (Goedert, M. & Jakes, R. (1990) EMBO J. 9: 4225; Goedert, M. y col. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 90: 5066).

Electroforesis en gel e inmunotransferencia

[0174] Las células crecidas según se ha esquematizado anteriormente se lavan una vez con PBS y después se lisan con 50 µl (placas de 24 pocillos) o 100 µl (placas de 6 pocillos) de tampón laemli. Las muestras se almacenan a -20°C, se hierven durante 4 min antes de revelarlas en geles de acrilamida al 15% usando el sistema de mini gel BioRad miniProtean III. La proteína se transfiere a una membrana de PVDF mediante transferencia Western usando el sistema tamponante CAPs. Las membranas se incuban en tampón de bloqueo (5% de polvo de leche desnatada (Marvel), 0,1% de Tween 20 en PBS) durante 1 h hasta toda la noche. La proteína tau se detecta incubando las membranas con mAb 7.51 diluido a 1:5 con tampón de bloqueo durante 1-3 h o durante la noche, lavando bien con PBS/Tween20 al 0,1%, incubando con HRP antiratón a una dilución de 1:5.000 en tampón de bloqueo durante 1 h, y lavando bien con PBS/Tween20 al 0,1%. El anticuerpo unido se detecta mediante una reacción de ECL detectada sobre hiperfilm de ECL (Amersham). [0175] Las transferencias se escanean a un ordenador con un escáner de mesa

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Hewlett Packard Scanjet 6100C a 600 dpi y se guardan como archivos tiff. La densitometría de las bandas de T40 y dGAE se realiza con el programa Scananalysis en un Apple Power Mac G3.

Preparación de los fármacos

[0176] Tiamina, azul de metileno, DMMB y cloruro de tolonio se prepararon todos como una disolución madre 1 mM en ddH2O. Antes de su uso, se prepara una disolución madre diluida 100 µM en HBSS que se añade directamente al medio sobre las células. [0177] Para el fármaco oxidado, éste se prepara simplemente diluyendo la disolución madre 1 mM en HBSS y realizando una filtración esterilizante. [0178] Para el fármaco reducido, la disolución 1 mM se trata con ácido ascórbico y DTT para rendir el fármaco 0,5 mM, ácido ascórbico 50 mM y DTT 50 mM, esto se deja reposar durante 15 min (cambia de azul a incoloro) antes de preparar la disolución madre diluida. Esto se diluye en HBSS para rendir el fármaco 100 µM, ácido ascórbico 10 mM, DTT 10 mM y se realiza una filtración esterilizante. Las células se tratan con el fármaco a diversas concentraciones, pero para el fármaco reducido se mantienen las concentraciones de ácido ascórbico y DTT a 400 µM de principio a fin usando las cantidades apropiadas de disolución madre reducida 100 µM, disolución madre oxidada 100 µM y disolución madre de ácido ascórbico/DTT 10 mM.

Electroforesis en gel-SDS e inmunotransferencia

[0179] Los procedimientos estándar de electroforesis e inmunotransferencia se usaron según se ha descrito previamente (Wischik, C. M. y col. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 85: 4506; Novak, M., y col. (1993) EMBO J. 12: 365; Jakes, R. y col. (1991) EMBO J. 10: 2725). Las inmunotransferencias se revelaron con el kit ABC (Vector Laboratories). Los anticuerpos monoclonales (mAbs) 7.51, 21.D10, 499 y 342 se usaron como fluido del sobrenadante del cultivo de hibridoma sin diluir. Se usó mAb AT8 (Innogenetics, Bélgica) a una dilución de 1/1.000. mAbs anti-tau 7.51 (que reconoce un epítopo en la última repetición; véase Novak, M. y col. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 88: 5837), 423 (que reconoce una tau truncada C-terminalmente en el residuo Glu-391; véase Wischik, C. M. y col. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU.

85: 4506; Novak, M. y col. (1993) EMBO J. 12: 365), 499 (que reconoce un segmento de tau específico humano entre los restos Gly-14 y Gln-26; véase Wischik, C. M. y col.(1996) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 93: 11213), y 342 (que reconoce un segmento entre los restos Ser-208 y Pro-251). El mAb 21.D10 se enfrentó al extracto cerebral A68-tau (Lee, V. M.-Y. y col. (1991) Science 251: 675).

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Ensayo de unión de tau

[0180] Esto se llevó a cabo básicamente según se describe en Wischik, C. M., y col. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 93: 11213. La tau en fase sólida (0-20 µg/ml) se recubrió en placas de microvaloración de 96 pocillos de cloruro de polivinilo con un tampón de carbonato 50 mM a 37°C durante 1 h. La placa se lavó dos veces con Tween 20 al 0,05%, y después se bloqueó con Marvel al 2% en PBST durante 1 h a 37°C. Después de lavar de nuevo, la placa se incubó durante 1 h a 37°C con tau en fase acuosa (0 - 300 µg/ml en PBST que contiene gelatina al 1%). En la presente solicitud también se añadió DTT 1 mM. [0181] La placa se lavó dos veces y se incubó durante 1 h a 37°C con los mAb 499 ó 342, se diluyó con un volumen igual de Marvel al 2% en PBST. Después de lavar, se incubó anticuerpo de cabra dirigido contra IgG de ratón conjugada con peroxidasa de rábano picante (1/1.000 en PBST) durante 1 h a 37°C. La placa se lavó y se incubó con disolución de sustrato que contenía tetrametilbencidina y H2O2 y se midió el índice de cambio en la absorbancia medida usando una lector de placas Vmax (Molecular Diagnostics, California) según se ha descrito previamente (Harrington, C.

R. y col. (1990) J. Immunol. Meth. 134: 261). Cada experimento se realizó por triplicado e incluyó controles en los que estaban ausentes la tau en fase sólida y en fase acuosa, y también con una de las dos ausentes.

Análisis de datos [0182] Esto se realizó según se describe en Wischik y col. (supra), y las curvas se ajustaron según la ecuación de Langmuir con los programas Kaleidagraph (Synergy, Filadelfia) o Systat (SPSS Inc., Chicago) usando una aproximación cuasi-newtoniana. Los coeficientes de correlación del ajuste de las curvas se proporcionan en las Figuras. Ejemplo 1 - expresión constitutiva de la tau completa, truncada y mutada [0183] Se postuló que la expresión de la tau en líneas celulares eucariotas generaba un modelo celular de agregación de tau en condiciones fisiológicas que no adolecía de las limitaciones de las metodologías basadas en la lipofectina. Esto implica la expresión de tau completa y fragmentos de tau truncada tanto para tau normal como para tau portadora de mutaciones patógenas.

Tau completa

[0184] Cuando se transfectó tau completa normal (T40) en células (3T3 y NIE115), se expresó y se implicó en la agrupación de la red de microtúbulos dentro de las células.

Tau truncada

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[0185] Inicialmente se transfectó el ADNc del fragmento de tau truncada del núcleo de los PHF, correspondiente al fragmento 297-391, en fibroblastos 3T3 no neuronales: fue seleccionada esta tau truncada dado que: (i) está presente en el núcleo de los PHF; (ii) se detecta en forma de depósitos en tejido cerebral de la AD durante las etapas tempranas de la enfermedad; (iii) es capaz de soportar la captura catalítica y la propagación de la captura de la tau in vitro. Subsiguientemente se realizó una serie de transfecciones en las que se varió la magnitud del truncamiento en los extremos N o C, basada parcialmente en las propiedades inmunoquímicas de la molécula de tau. Se crearon seis construcciones con truncamientos en los N-terminales (186-441; 297441), en los C y N-terminales (186-391; 297-391) y en el C-terminal (1-391). El patrón de inmunorreactividad de las seis construcciones con un grupo limitado de anticuerpos fue capaz de discriminar todos los fragmentos de tau generados de este modo. [0186] Las construcciones se expresaron en células eucariotas transitoriamente (usando pSG5 como vector) y establemente (usando pIF2 y pZeo como vectores). Los transfectantes estables se seleccionan sobre la base de resistencia a los antibióticos geneticina y zeocina para pIF2 y pZeo, respectivamente. El análisis de los epítopos se realizó sobre proteínas expresadas bacterialmente usando pRK172 como vector. La Figura 20 resume los resultados para diversos fragmentos en células 3T3 y COS-7. Los resultados adicionales mostraron que la expresión de las dos formas de la tau en la misma célula puede afectar al patrón de inmunorreactividad. Por ejemplo, la expresión estable de 1-391 y 295-391 da como resultado la aparición de manojos anormales dentro de la célula. Sin embargo, mantener dichas células en un estado estable y reproducible fue difícil.

Tau mutada

[0187] Se usó una mutagénesis de la tau completa para generar mutaciones clínicas conocidas. Estas fueron subclonadas en pIF2 y se generaron transfectantes estables en células 3T3 y NIE para varias de las mutaciones, incluyendo aquellas que afectaban a las propiedades de agrupación en microtúbulos de tau (G272V, V337M, P301 S, R406W) y S305N, lo que afecta al empalme alternativo del gen de la tau in vivo. En general, las células que expresaban la tau completa portaban mutaciones que mostraban el marcaje de la red de microtúbulos, y eran indistinguibles de las células transfectadas con la tau natural. Las líneas celulares que expresaban ciertos fragmentos de tau truncada incluían mutaciones que mostraron ser inestables.

Conclusión

[0188] En resumen, la expresión constitutiva de tau truncada en células eucariotas

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demostró ser difícil de conseguir. Aunque los sistemas de transfección transitoria permitían la optimización de la expresión de tau mediante la manipulación de los consensos de Kozak que rodean al codón de iniciación de 297-tau, la expresión de, por ejemplo, 297-391, todavía era modesta, sugiriendo algunas propiedades tóxicas inherentes del fragmento. Las transfecciones estables reiteraban esta conclusión. Este último sistema demostró que el truncamiento en los N o C-terminales dio como resultado una propensión ligeramente mayor de la tau para agruparse en depósitos amorfos en lugar de en una red microtubular. La expresión estable de combinaciones de fragmentos de tau también genera agregados dentro del citoplasma de las células, pero este sistema no era fácilmente reproducible. Ejemplo 2 - expresión inducible de tau truncada [0189] En un intento adicional de crear un sistema estable y reproducible sin la toxicidad asociada a la expresión constitutiva, se intentó una expresión inducible del fragmento de la tau del núcleo de los PHF (es decir, 297-391 - que es de 12 kD). [0190] Se intentaron varios sistemas inducibles para la expresión de proteínas en células eucariotas, aunque el sistema preferido fue el sistema "lac switch". En este sistema se incorporan dos vectores en las células, típicamente fibroblastos 3T3 o 3T6 que no expresan ninguna proteína tau endógena. El primero, el vector p3’SS, codifica para la expresión constitutiva del gen lac I, y los expresores se seleccionan sobre la base de resistencia a higromicina. El segundo, pOPRSVICAT, incorpora el ADN que codifica el fragmento de la proteína tau bajo el control de un fuerte promotor RSV que contiene las secuencias de operador del operón Lac. Las células que incorporan este vector se seleccionan sobre la base de resistencia a neomicina. Las células que han incorporado ambos vectores tienen la propiedad de que la expresión constitutiva de lac I impide la expresión de la proteína incorporada (es decir, la tau) controlada por el operón Lac. La adición del azúcar IPTG compite por la unión del lac I al operón Lac, y por lo tanto permite la expresión de la proteína tau. [0191] Se llevó a cabo la expresión inducible del fragmento de 12 kD en dos líneas celulares. Éstas no mostraron unos niveles apreciables de expresión de proteína tau hasta después de 3 días de tratamiento con IPTG, etapa en la que aparecieron de repente altos niveles de 12 kD, formándose agregados intracelulares que rápidamente destruyeron la célula. El proceso de agregación fue, como se esperaba, una progresión no lineal desde un bajo nivel de expresión hasta una acumulación repentina de agregados tóxicos sin ninguna gradación clara, haciendo que la agregación y la toxicidad fueran imposibles de controlar. Esta progresión no lineal impidió un control

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apropiado del sistema. Ejemplo 3 - expresión de tau en líneas celulares estables según la invención [0192] A la vista de los resultados anteriores, se usó un sistema adicional como sigue. La línea celular de cultivo tisular DH 19.4.1.4 y los clones de la misma se basaron en células 3T6 (ECACC nº 86120801 fibroblastos de embrión albino de ratón suizo) que expresaban cuatro repeticiones de la tau humana completa bajo el control de un promotor inducible, y una tau humana truncada (295-391) bajo el control de un promotor constitutivo. [0193] Las células que expresan la T40 bajo el control de un promotor inducible, T40.22.10, fueron transfectadas (mediante lipofección) con el plásmido pZeo295-391. Las células positivas fueron seleccionadas por su resistencia a zeocina a 400 µg/ml. La expresión de la tau truncada sobre un trasfondo de expresión inducible de la tau completa fue confirmada mediante un análisis por inmunotransferencia Western con Mab 7.51. [0194] La Figura 21 ilustra la expresión inducible de la tau humana completa sólo en fibroblastos 3T6 en dos líneas celulares. T40.22 muestra un bajo nivel de filtración de fondo de la tau completa en el estado no inducido ("U"), y altos niveles de expresión tras la adición de IPTG (es decir, inducido, "I"). T40.37 muestra lo mismo, pero menores niveles de expresión sin inducción. La Figura 22 muestra los resultados de un sistema vector triple. Se introdujo un vector que permite un nivel de expresión constitutiva muy bajo del fragmento de 12 kD en las líneas celulares en las que ya se había conseguido la expresión inducible de la tau completa (T40.22 mostrada en la Figura 21). La Figura 22 muestra lo que sucede cuando se introducen bajos niveles de IPTG para inducir la expresión de la tau completa. Con 0 µM de IPTG hay un nivel de expresión muy bajo de la banda 12 kD, y una baja expresión de "filtración de fondo" de la tau completa. Como se induce progresivamente más tau completa introduciendo unos niveles mayores de IPTG, más tau completa es convertida en la especie de 12 kD, y se producen más fragmentos intermedios de mayor peso molecular (descritos con más detalle en las Figs. 35 y 36). [0195] El examen de la línea celular inducible T40 original (T40.22.10), que no contenía el vector de la expresión constitutiva del fragmento de 12 kD, muestra que la especie de 12 kD no es producida como un subproducto del truncamiento de la inducción de la tau completa. El incremento en la expresión de la banda de 12 kD tras la inducción de la T40 sólo se observó en las células con un bajo nivel de expresión previa del fragmento de 12 kD (DH19.4.1.4.6). Esto es, el 12 kD preexistente

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proporciona un plantilla para la producción de más 12 kD tras la inducción de la tau completa. También puede aparecer un doblete adicional con una movilidad aparente en gel de -25/27 kD cuando las células están en un estado no inducido (por ejemplo, en la línea celular denominada DH 19.4.1.4A.B2). Después de la inducción con IPTG, puede parecer una serie adicional de dobletes, con unas movilidades en gel de -30/32 kD, -36/38 kD y �42/44 kD. [0196] Estas especies se muestran en la Figura 32 tanto sin inducción ("U") como después de la inducción ("I"). También se muestran los patrones de inmunorreactividad de estos fragmentos observados con mAb 342 y un anticuerpo policlonal C-terminal T46 que reconoce epítopos localizados entre los restos Ser422 y Leu441. [0197] La derivación de los fragmentos observados en el estado no inducido (es decir, 12/14 kD y 25/27 kD) puede explicarse mediante referencia a la Figura 33. [0198] La Figura 33(a) muestra cómo surge el fragmento de 12 kD a través del procesado proteolítico inducido por la plantilla de las moléculas de tau completas en las posiciones aproximadas mostradas por las cabezas de flecha. [0199] En el caso de las especies de 25/27 kD, estos fragmentos no pueden representar dímeros de las especies de 12/14 kD, ya que estos fragmentos son inmunorreactivos con la T46. Por lo tanto, debe surgir un producto proteolítico adicional de la proteína tau agregante completa a través de las escisiones que se producen en las posiciones aproximadas mostradas por las cabezas de flecha de la Figura 33(b). [0200] Después de la inducción (Figura 32, I), se observan las series de dobletes adicionales. La derivación de estos fragmentos adicionales puede comprenderse mejor con referencia a las Figuras 34-36. [0201] La Figura 34 muestra una representación de las movilidades aparentes en gel de estos fragmentos y sus longitudes en restos de aminoácidos, indicando que las movilidades aparentes en gel pueden entenderse en términos de un conjunto característico de longitudes de fragmento. [0202] Según se ilustra en la Figura 35, todos estos fragmentos son, a intervalos, restos de -34 o restos de -17, lo que es equivalente a una única repetición de tau, o a la mitad de ella. Todos los fragmentos generados pueden entenderse por tanto que todos los restos surgen de un simple conjunto de escisiones proteolíticas que se producen en las posiciones indicadas por las cabezas de flecha de la Figura 35 a partir de un agregado heptamérico básico, formado según se muestra en la Figura. En este

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diagrama, los fragmentos surgen como el conjunto combinatorio completo de las escisiones propuestas que se producen en las 3 posiciones aproximadas posibles mostradas por las cabezas de flecha en cualquier extremo del agregado. También están tabulados los correspondientes patrones de inmunorreactividad predichos observados con mAb 342 y T46 asociados con estos fragmentos. [0203] La Figura 36 muestra estos mismos fragmentos en orden descendiente de longitud y creciente de movilidad en gel. Aunque el agregado heptamérico se muestra por conveniencia como surgido completamente a partir de las moléculas de tau completas, se apreciará que el fragmento de 12/14 kD podría estar interpuesto dentro del agregado propuesto, sustituyendo a algunos de los compañeros de unión, y que el patrón preciso de inclusión de estos fragmentos cortos en el agregado determinará qué fragmentos precisos del conjunto completo predominan en un caso dado. Por lo tanto, la producción de esta familia de fragmentos proteolíticos se entiende mejor como un posible repertorio que puede representarse de diversas formas dentro de la célula. Ejemplo 4 - efectos inhibidores de los compuestos sobre la producción del fragmento proteolítico [0204] Habiendo conseguido un sistema celular estable en el que poder controlar la producción del fragmento de 12 kD (y otros), se usó este modelo para probar los efectos inhibidores de la tiamina reducida. Esto se muestra en la Figura 23. En cada conjunto de bandas hay una producción inducible de la banda de 12 kD en presencia de concentraciones crecientes de IPTG que induce mayores niveles de T40. Al aumentar la concentración de tionina, se suprime la producción de la banda de 12 kD a partir de la T40. Esto se muestra cuantitativamente en la Figura 24. En ausencia de tionina, la inducción de T40 a concentraciones crecientes de IPTG conduce a un correspondiente incremento en la producción del fragmento de 12 kD. En presencia de tionina 2 µM, todavía hay inducción de la T40, pero no se convierte en el fragmento de 12 kD. [0205] Como la propia tionina reducida es tóxica, es necesario un control para reducir los niveles de la T40 inducida por la correspondientes dosis de IPTG a mayores niveles de tionina. Esto puede conseguirse determinando la proporción de 12 kD:T40, lo que permite promediar los datos a lo largo de todos los niveles de IPTG y muestra una reducción dependiente de la dosis en el nivel de 12 kD relativa a la tau completa. [0206] En las Figuras 9 a 16 se muestran las actividades de varios compuestos en el ensayo de T40/12 kD. [0207] Los resultados se expresan en términos de la proporción de 12 kD:T40 tras la inducción de la tau completa (T40) mediante el tratamiento de las células con IPTG

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(0, 10, 25, 50 µM) en presencia de tionina o cloruro de tolonio introducidos a las concentraciones mostradas, en presencia de agentes reductores (DTT/ascorbato 200 µM), o clorpromacina o tacrina introducidas sin agentes reductores. Como puede observarse, la tionina y el cloruro de tolonio producen esencialmente una inhibición idéntica, mientras que la clorpromacina o la tacrina no son inhibidoras en el mismo intervalo de concentración. En experimentos de control se probó el efecto de los agentes reductores solos, que no mostraron una diferencia significativa observada en la proporción 12 kD:T40, en presencia sólo de agentes reductores. [0208] También se examinaron las propiedades de la línea celular que produce los productos de degradación de mayor peso molecular con MB y DMMB (azul de dimetilmetileno). [0209] Como puede observarse en la Figura 37, el DMMB demostró ser sorprendentemente potente en el modelo celular. Su actividad inhibidora pudo observarse tanto en ausencia de la inducción por IPTG como tras la inducción. El tratamiento con DMMB 1 µM suprimió efectivamente todos los productos de degradación dentro de la célula. Una experiencia adicional con MB y DMMB ha demostrado que incluso la producción basal aparente para las especies de 12/14 kD está ampliamente determinada por la agregación. Esto es, la producción constitutiva del fragmento de 295-391 está por sí misma bien por debajo del nivel de detección mediante inmunotransferencia, o bien está estabilizada por una agregación espontánea, de forma que alcanza niveles dentro de la célula que pueden ser detectados por inmunotransferencia. Alternativamente, los niveles basales aparentes del fragmento de 12/14 kD observados sin inducción por IPTG y en ausencia del tratamiento con un inhibidor de la agregación de la tau pueden por sí mismos ser dominados por la producción dependiente de la agregación por plantilla a partir de niveles de filtración de la T40 producida en ausencia de inducción. Cualquiera que sea la combinación de factores que determine los niveles del fragmento de 12/14 kD en la condición inicial, su expresión aparente puede eliminarse esencialmente, junto con los productos de agregación de mayor peso molecular, mediante un potente inhibidor de la agregación tal como DMMB. Estos resultados confirman adicionalmente que la producción de los fragmentos proteolíticos de mayor peso molecular (es decir, 30/32, 36/38, 42/44 kD) también depende de las interacciones de unión críticas tau-tau que se producen a lo largo del dominio de repetición, según se muestra en las Figuras 33, 35 y 36. [0210] La Figura 46 muestra la actividad del DMMB sobre la expresión basal de las especies de 12/14 kD, usando el mismo conjunto de suposiciones relativas a la

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concentración intracelular de tau y a la afinidad de unión tau-tau in vitro usado en las Figs. 10 - 16. En este caso se encuentra que el DMMB tiene una KI aparente dentro de la célula de 4,4 nM, y el valor celular de B50 es de �100 nM. Esto indica que el DMMB es altamente potente dentro del ambiente celular. Ejemplo 5 - comparación de los efectos inhibidores de los compuestos producidos y oxidados [0211] Se usó el modelo matemático usado para los datos in vitro para analizar los efectos de las sustancias de prueba en el ensayo celular T40:12kD. Usando los valores conocidos para las Kd y KI a partir de los datos in vitro, se usó la expresión indicada para encontrar solución a la concentración intracelular de la tau completa (véase, por ejemplo, la Figura 10). [0212] Se encontró que ésta era de aproximadamente 500 nM, que está en el intervalo esperado a partir de los estudios de la tau en cerebro y sistemas celulares. Se obtuvo un buen ajuste con los datos experimentales, lo que implicaba que para alguno de los compuestos, la inhibición de la producción de la tau truncada dentro de la célula podía ser predicha a partir de los valores aproximados de las Kd y KI determinados experimentalmente in vitro. Ejemplo 6 - examen de las propiedades inhibidoras de las diaminofenotiacinas [0213] En estudios in vitro, los inhibidores más activos de la unión tau-tau identificados eran las formas reducidas de las diaminofenotiacinas con 0, 2 ó 3 grupos metilo. La Figura 25 muestra las formas reducidas de dichos compuestos. Las correspondientes curvas de unión tau-tau se muestran en función de la proporción molar con respecto a tau en las Figuras 26 y 27. Según se muestra, los compuestos de las "series desmetiladas" (0, 2 ó 3 grupos metilo) producen una inhibición de aproximadamente 50% de la unión of tau-tau (mostrada en el eje vertical) a unas proporciones molares de 3:1 - 4:1 de compuesto:tau ’AMR’ mostradas en una escala logarítmica en el eje horizontal). La principal proporción molar para la inhibición del 50% de la unión tau-tau para este grupo de compuestos es de 4:1. [0214] Las diaminofenotiacinas con 4 ó 6 grupos metilo (el "grupo metilado") tienen una acción bifásica, con una mejora de la unión tau-tau a una concentración menor, y una inhibición de la unión tau-tau a concentraciones mayores (Figura 27). Estos compuestos requieren por tanto unas proporciones molares mucho mayores para efectuar la inhibición del 50% de la unión tau-tau. [0215] También se llevó a cabo el examen de otras características del compuesto diaminofenotiacina. Se encontró que la sustitución del nitrógeno heterocíclico o de los

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átomos de azufre interfería gravemente con la potencia inhibidora de los compuestos. Asimismo, se encontró que la eliminación de los grupos diamino era perjudicial para la actividad inhibidora. Parecía por tanto que las estructuras diamino y heterocíclica de NB y S son importantes para la actividad de las moléculas en la inhibición de la unión tau-tau. [0216] Para comparar, se usaron dos procedimientos para determinar la actividad inhibidora en el ensayo tau-tau: STB es la media de unión tau-tau observada a 1 y 10 pg/ml de compuesto a unas concentraciones estándar de tau de 488 nM; LB50 es el log10 de la proporción molar de compuesto:tau que produce un 50% de inhibición de la unión tau-tau (Figura 28). Según se muestra en la Figura 29, hay una fuerte correlación entre los valores STB y LB50 para un intervalo de compuestos, siendo la clorpromacina y la riboflavina dos casos atípicos (véanse también las Figuras 30 y 31). Referencias

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REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN

Esta lista de referencias citadas por el solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad al respecto.

Documentos de patente citados en la descripción

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WO 9962548 A [0009]

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WO 9630766 A [0010] [0011] [0015] [0027] [0095] [0107] [0137]

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Documentos no procedentes de patentes citados en la descripción

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102

5 [0217]

Claims (35)

1. Un procedimiento para convertir proteolíticamente una proteína precursora en un fragmento producto en una línea celular estable, dicha proteína precursora está asociada con un estado de enfermedad en el que la proteína precursora se agrega patológicamente, procedimiento que comprende:

(a)

proporcionar una línea celular estable transfectada con un ácido nucleico que codifica:

(i)

un fragmento de plantilla de la proteína precursora tal que el fragmento de plantilla se exprese constitutivamente en la célula a un nivel que no sea tóxico para la célula; y

(ii)

la proteína precursora, proteína que es expresada de forma inducible en la célula en respuesta a un estímulo,

(b)

someter la célula al estímulo tal que exprese de forma inducible la proteína precursora en la célula, por lo que la interacción del fragmento de plantilla con la proteína precursora causa un cambio conformacional en la proteína precursora de forma que causa una agregación y procesado proteolítico de la proteína precursora del fragmento producto.

2.

Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que la agregación patológica in vivo conduce a un procesado proteolítico de la proteína precursora en un estado de enfermedad asociado con la neurodegeneración y/o la demencia clínica.

3.

Un procedimiento según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que la agregación patológica de la proteína precursora en el estado de enfermedad conduce al procesado proteolítico de un fragmento de dominio del núcleo, y el fragmento de plantilla comprende al menos el fragmento de núcleo de la proteína de plantilla.

4.

Un procedimiento según se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en el que se produce una pluralidad de diferentes fragmentos producto.

5.

Un procedimiento según se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que se sigue la producción de al menos un fragmento producto.

6.

Un procedimiento para identificar un modulador de la agregación y/o el procesado proteolítico de la proteína precursora asociada con el estado de enfermedad, procedimiento que comprende:

52

(a)

proporcionar un agente sospechoso de ser capaz de modular la agregación,

(b)

realizar un procedimiento según la reivindicación 5 en presencia del agente,

(c)

correlacionar la producción del o de cada fragmento producto seguido con la actividad moduladora del agente.

7. Un procedimiento según la reivindicación 6, en el que la etapa (b) se realiza:

(a) cultivando las células en una o más placas,

(b) incubando las células con el agente durante un periodo de tiempo suficiente para que el agente entre en las células.

8.

Un procedimiento según la reivindicación 6 o la reivindicación 7 en el que la producción del o de cada fragmento producto seguido se compara con un valor de referencia, en el que el valor de referencia se obtiene al realizar el procedimiento en ausencia del agente.

9.

Un procedimiento según la reivindicación 4 en el que la proteína precursora es una proteína tau.

10.

Un procedimiento según la reivindicación 9 en el que el fragmento de plantilla comprende un fragmento de tau que se extiende entre los aminoácidos 186297 a 390-441 de la proteína tau completa mostrada en la Fig. 7.

11.

Un procedimiento según la reivindicación 10 en el que el fragmento de plantilla consiste en un fragmento de tau que se extiende desde los aminoácidos 295, 296 ó 297 hasta los restos de aminoácidos 390 ó 391 de la proteína tau completa mostrada en la Fig. 7.

12.

Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11 en el

53

que se sigue la producción de un fragmento producto de tau de aproximadamente 12, 14, 25, 27, 30, 32, 36, 38, 42 ó 44 kDa.

13.

Un procedimiento según la reivindicación 12 en el que se sigue la producción de un fragmento producto de tau de aproximadamente 12 kDa.

14.

Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13 en el que se sigue la producción del o de cada fragmento producto tóxico en SDS PAGE.

15.

Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14 en el que se sigue la producción del o de cada fragmento producto tóxico inmunológicamente.

16.

Un procedimiento según la reivindicación 15 en el que el seguimiento emplea un anticuerpo seleccionado a partir de un anticuerpo monoclonal que (i) es específico para un epítopo específico humano localizado en la región entre la Gly-16 y la Gln-26 de la tau; (ii) es específico para el fragmento de núcleo de tau truncado en la Glu-391; (iii) es específico para un epítopo genérico de tau en el dominio de repetición; o (iv) es específico para un epítopo genérico de tau no específico de especie localizado entre la Ser-208 y la Ser-238.

17.

Un procedimiento para el cribado de un medicamento para uso como agente terapéutico o pronóstico para el tratamiento de una tauopatía, procedimiento que comprende

(a) realizar un procedimiento según se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 16,

(b) seleccionar moduladores con un índice terapéutico de más de 2.

18. Un procedimiento para producir una célula estable para su uso en un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en el que una proteína precursora puede convertirse proteolíticamente en un fragmento producto cuando dicha línea celular se somete a un estímulo, dicha proteína precursora está asociada con un estado de enfermedad en el que la proteína precursora se agrega patológicamente, dicho procedimiento comprende las etapas de introducir en una célula un ácido

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nucleico que codifica para (i) un fragmento de plantilla de la proteína precursora tal que el fragmento de plantilla se expresa constitutivamente en la célula a un nivel que no es tóxico para la célula; y (ii) la proteína precursora tal que la proteína patológica sea expresada de forma inducible en la célula en respuesta al estímulo.

19.

Un procedimiento según la reivindicación 18 en el que el ácido nucleico que codifica la proteína precursora está unido operativamente a un promotor inducible lac y en el que el ácido nucleico que codifica para el fragmento de plantilla está unido operativamente a una secuencia promotora de un citomegalovirus.

20.

Un procedimiento según la reivindicación 18 o la reivindicación 19 en el que el ácido nucleico que codifica el fragmento de plantilla se introduce como un vector de plantilla, y el ácido nucleico que codifica la proteína precursora se introduce como un vector de proteína precursora por separado.

21.

Un procedimiento según la reivindicación 20 en el que el vector de la proteína precursora deriva del vector pOPRSVICAT en el que se clona el ácido nucleico que codifica la proteína precursora, y el vector del fragmento de plantilla deriva del vector del plásmido pZeo295-391 en el que se clona el ácido nucleico que codifica la proteína precursora.

22.

Un procedimiento según se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 21 en el que la proteína precursora es tau.

23.

Un procedimiento según la reivindicación 22 en el que el ácido nucleico que codifica el fragmento de plantilla codifica un fragmento de núcleo de tau.

24.

Un procedimiento según la reivindicación 23 en el que el ácido nucleico que codifica el fragmento de plantilla codifica un fragmento de tau que se extiende desde los aminoácidos 186-297 hasta los 390-441 de la proteína completa.

25.

Un procedimiento según la reivindicación 24 en el que el ácido nucleico que codifica el fragmento de plantilla codifica un fragmento de tau que se extiende desde los aminoácidos 295, 296 ó 297 hasta los restos de aminoácidos 390 ó 391 de la proteína tau completa mostrada en la Fig. 7.

26.

Un procedimiento según la reivindicación 25 en el que el ácido nucleico que codifica el fragmento de plantilla codifica un fragmento de tau que se extiende entre los restos de aminoácidos 295 a 391 según se muestra en la Fig. 7.

27.

Una célula hospedadora de mamífero en la que una proteína precursora puede convertirse proteolíticamente en un fragmento producto cuando dicha línea celular se somete a un estímulo, Dicha proteína precursora está asociada con un estado de enfermedad en el que la proteína precursora se agrega patológicamente, en el que dicha célula hospedadora de mamífero se transforma con un ácido nucleico que codifica:

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(i)

un fragmento de plantilla de una proteína precursora, en el que el fragmento de plantilla se expresa constitutivamente a un nivel que no es tóxico para la célula; y

(ii)

la proteína precursora tal que la proteína patológica se expresa de forma inducible en respuesta a un estímulo.

28. Una célula según la reivindicación 27 que es de una línea celular neuronal

o una línea celular de fibroblastos, seleccionada opcionalmente a partir de las siguientes líneas celulares: 3T3; NIE-115; 3T6; N2A; SY5Y; COS-7.

29.

Una célula según la reivindicación 27 o la reivindicación 28 en la que la proteína precursora es tau.

30.

Una célula según la reivindicación 29 en la que el ácido nucleico que codifica el fragmento de plantilla codifica un fragmento de núcleo de tau.

31.

Una célula según la reivindicación 30 en la que el ácido nucleico que codifica el fragmento de plantilla codifica un fragmento de tau que se extiende desde entre los aminoácidos 186-297 hasta 390-441 de la proteína completa.

32.

Una célula según la reivindicación 31 en la que el ácido nucleico que codifica el fragmento de plantilla codifica un fragmento de tau que se extiende desde

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los aminoácidos 295, 296 ó 297 hasta los restos de aminoácidos 390 ó 391 de la proteína tau completa mostrada en la Fig. 7.

33. Una célula según la reivindicación 32 en la que el ácido nucleico que

5 codifica el fragmento de plantilla codifica un fragmento de tau que se extiende los restos de aminoácidos 295 a 391 según se muestra en la Fig. 7.

34. Un kit que comprende una célula hospedadora según se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 27 a 33 junto a al menos un componente adicional

10 seleccionado entre: un agente para estimular la producción de la proteína precursora o un agente para detectar la interacción de la proteína precursora con el fragmento de plantilla.

35. Un kit según la reivindicación 34 en el que el agente de detección es un 15 anticuerpo.