ES2353202T3 - Materiales y procedimientos relacionados con la agregacion de proteinas en la enfermedad neurodegenerativa. - Google Patents
Materiales y procedimientos relacionados con la agregacion de proteinas en la enfermedad neurodegenerativa. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2353202T3 ES2353202T3 ES02715498T ES02715498T ES2353202T3 ES 2353202 T3 ES2353202 T3 ES 2353202T3 ES 02715498 T ES02715498 T ES 02715498T ES 02715498 T ES02715498 T ES 02715498T ES 2353202 T3 ES2353202 T3 ES 2353202T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- tau
- fragment
- cell
- precursor protein
- protein
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 103
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 title claims description 7
- 230000004845 protein aggregation Effects 0.000 title description 5
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 title description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 title description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 185
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 154
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 138
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims abstract description 74
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 claims abstract description 73
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 claims abstract description 73
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 46
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 42
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 42
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 32
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 32
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 claims abstract description 28
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims abstract description 23
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 claims abstract description 19
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 claims abstract description 17
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims abstract description 14
- 230000008859 change Effects 0.000 claims abstract description 10
- 230000004044 response Effects 0.000 claims abstract description 8
- 108010026424 tau Proteins Proteins 0.000 claims description 265
- 102000013498 tau Proteins Human genes 0.000 claims description 262
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 194
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 40
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 36
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 35
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 31
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 25
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 claims description 22
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 20
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 17
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 17
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 14
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 12
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 claims description 11
- 108010064245 urinary gonadotropin fragment Proteins 0.000 claims description 11
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 10
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 10
- 206010012289 Dementia Diseases 0.000 claims description 8
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 8
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 8
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims description 5
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 claims description 4
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 claims description 3
- 208000034799 Tauopathies Diseases 0.000 claims description 3
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 claims description 3
- 231100001274 therapeutic index Toxicity 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 claims 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 81
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 52
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 48
- 239000000047 product Substances 0.000 description 25
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 24
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 24
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 24
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 23
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 23
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 23
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 23
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 20
- PVPBBTJXIKFICP-UHFFFAOYSA-N (7-aminophenothiazin-3-ylidene)azanium;chloride Chemical compound [Cl-].C1=CC(=[NH2+])C=C2SC3=CC(N)=CC=C3N=C21 PVPBBTJXIKFICP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 17
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 16
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 15
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 15
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 14
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 13
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 13
- RBTBFTRPCNLSDE-UHFFFAOYSA-N 3,7-bis(dimethylamino)phenothiazin-5-ium Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC2=[S+]C3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21 RBTBFTRPCNLSDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 11
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 11
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 11
- 229960000907 methylthioninium chloride Drugs 0.000 description 11
- 108010076830 Thionins Proteins 0.000 description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 10
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 10
- 230000037230 mobility Effects 0.000 description 10
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 10
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 10
- 101000979001 Homo sapiens Methionine aminopeptidase 2 Proteins 0.000 description 9
- 101000969087 Homo sapiens Microtubule-associated protein 2 Proteins 0.000 description 9
- 102100023174 Methionine aminopeptidase 2 Human genes 0.000 description 9
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 9
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 9
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 9
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 9
- KPYHKEZPEDJERZ-UHFFFAOYSA-N 10h-phenothiazine-1,2-diamine Chemical class C1=CC=C2NC3=C(N)C(N)=CC=C3SC2=C1 KPYHKEZPEDJERZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 102000029749 Microtubule Human genes 0.000 description 8
- 108091022875 Microtubule Proteins 0.000 description 8
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 8
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 8
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 8
- 210000004688 microtubule Anatomy 0.000 description 8
- 101000891579 Homo sapiens Microtubule-associated protein tau Proteins 0.000 description 7
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 7
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 7
- HNONEKILPDHFOL-UHFFFAOYSA-M tolonium chloride Chemical compound [Cl-].C1=C(C)C(N)=CC2=[S+]C3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21 HNONEKILPDHFOL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 229960001555 tolonium chloride Drugs 0.000 description 7
- 101710137189 Amyloid-beta A4 protein Proteins 0.000 description 6
- 101710151993 Amyloid-beta precursor protein Proteins 0.000 description 6
- 201000011240 Frontotemporal dementia Diseases 0.000 description 6
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 6
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 6
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 6
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 6
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- ZPEIMTDSQAKGNT-UHFFFAOYSA-N chlorpromazine Chemical compound C1=C(Cl)C=C2N(CCCN(C)C)C3=CC=CC=C3SC2=C1 ZPEIMTDSQAKGNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229960001076 chlorpromazine Drugs 0.000 description 6
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 6
- 230000006870 function Effects 0.000 description 6
- 102000057063 human MAPT Human genes 0.000 description 6
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 6
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 6
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 6
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 6
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 6
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 6
- 238000011160 research Methods 0.000 description 6
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 6
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 6
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 6
- 102100022704 Amyloid-beta precursor protein Human genes 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 102000009664 Microtubule-Associated Proteins Human genes 0.000 description 5
- 102000004243 Tubulin Human genes 0.000 description 5
- 108090000704 Tubulin Proteins 0.000 description 5
- 108010084455 Zeocin Proteins 0.000 description 5
- DZHSAHHDTRWUTF-SIQRNXPUSA-N amyloid-beta polypeptide 42 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)[C@@H](C)CC)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C(C)C)C(C)C)C1=CC=CC=C1 DZHSAHHDTRWUTF-SIQRNXPUSA-N 0.000 description 5
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 5
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 5
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 5
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 5
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 5
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 5
- CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N phleomycin D1 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC[C@@H](N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCCCNC(N)=N)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N 0.000 description 5
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 5
- YLJREFDVOIBQDA-UHFFFAOYSA-N tacrine Chemical compound C1=CC=C2C(N)=C(CCCC3)C3=NC2=C1 YLJREFDVOIBQDA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229960001685 tacrine Drugs 0.000 description 5
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 5
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 5
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 5
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 5
- 108010054278 Lac Repressors Proteins 0.000 description 4
- 108091077621 MAPRE family Proteins 0.000 description 4
- 241000829100 Macaca mulatta polyomavirus 1 Species 0.000 description 4
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 4
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 4
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N alprazolam Chemical compound C12=CC(Cl)=CC=C2N2C(C)=NN=C2CN=C1C1=CC=CC=C1 VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Natural products O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 description 4
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 4
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 4
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 108010090849 Amyloid beta-Peptides Proteins 0.000 description 3
- 102000013455 Amyloid beta-Peptides Human genes 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 102100024746 Dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 3
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 3
- 102000029797 Prion Human genes 0.000 description 3
- 108091000054 Prion Proteins 0.000 description 3
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 3
- 102000009661 Repressor Proteins Human genes 0.000 description 3
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 3
- 238000000423 cell based assay Methods 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 3
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 3
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 238000009795 derivation Methods 0.000 description 3
- 108020001096 dihydrofolate reductase Proteins 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 238000003365 immunocytochemistry Methods 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000006911 nucleation Effects 0.000 description 3
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 3
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 3
- 150000002990 phenothiazines Chemical class 0.000 description 3
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 3
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M thionine Chemical compound [Cl-].C1=CC(N)=CC2=[S+]C3=CC(N)=CC=C3N=C21 ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 3
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000001049 Amyloid Human genes 0.000 description 2
- 108010094108 Amyloid Proteins 0.000 description 2
- 208000037259 Amyloid Plaque Diseases 0.000 description 2
- 102000009091 Amyloidogenic Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010048112 Amyloidogenic Proteins Proteins 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 2
- 208000028698 Cognitive impairment Diseases 0.000 description 2
- 208000011990 Corticobasal Degeneration Diseases 0.000 description 2
- 241001274613 Corvus frugilegus Species 0.000 description 2
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 101001018100 Homo sapiens Lysozyme C Proteins 0.000 description 2
- 102000036770 Islet Amyloid Polypeptide Human genes 0.000 description 2
- 108010041872 Islet Amyloid Polypeptide Proteins 0.000 description 2
- 201000002832 Lewy body dementia Diseases 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 2
- 108010071690 Prealbumin Proteins 0.000 description 2
- AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N Riboflavin Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N 0.000 description 2
- 101150006914 TRP1 gene Proteins 0.000 description 2
- 229940122777 Tau aggregation inhibitor Drugs 0.000 description 2
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N Thiamine Natural products CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000009190 Transthyretin Human genes 0.000 description 2
- 244000000188 Vaccinium ovalifolium Species 0.000 description 2
- HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N [3-[hydroxy(2-hydroxyethoxy)phosphoryl]oxy-2-[(e)-octadec-9-enoyl]oxypropyl] (e)-octadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCCC\C=C\CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCCO)OC(=O)CCCCCCC\C=C\CCCCCCCC HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 230000004931 aggregating effect Effects 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 2
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 2
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 2
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 2
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 208000010877 cognitive disease Diseases 0.000 description 2
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 2
- IPZJQDSFZGZEOY-UHFFFAOYSA-N dimethylmethylene Chemical group C[C]C IPZJQDSFZGZEOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 238000013213 extrapolation Methods 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 125000000623 heterocyclic group Chemical class 0.000 description 2
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 2
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 2
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 2
- 230000007137 neurofibrillary pathology Effects 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 2
- VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N perchloric acid Chemical compound OCl(=O)(=O)=O VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 2
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 2
- 208000022256 primary systemic amyloidosis Diseases 0.000 description 2
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 2
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 2
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 210000002763 pyramidal cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 210000000225 synapse Anatomy 0.000 description 2
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 description 2
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 2
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 description 2
- 239000003104 tissue culture media Substances 0.000 description 2
- 231100000563 toxic property Toxicity 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 2
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 2
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 2
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 2
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 2
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- UOGZWWISWPADQM-SDVXZCCESA-N (1r,2r,3r,4s,6s)-2,3,6-trichloro-4,7-bis(dichloromethyl)-7-methylbicyclo[2.2.1]heptane Chemical compound Cl[C@H]1C[C@@]2(C(Cl)Cl)[C@@H](Cl)[C@H](Cl)[C@@H]1C2(C(Cl)Cl)C UOGZWWISWPADQM-SDVXZCCESA-N 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- WJFKNYWRSNBZNX-UHFFFAOYSA-N 10H-phenothiazine Chemical compound C1=CC=C2NC3=CC=CC=C3SC2=C1 WJFKNYWRSNBZNX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(dimethylamino)phenyl]-n,n-dimethylaniline Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1C1=CC=C(N(C)C)C=C1 YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000018282 ACys amyloidosis Diseases 0.000 description 1
- 208000036850 AGel amyloidosis Diseases 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 1
- HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N Ala-Gln Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 101800001288 Atrial natriuretic factor Proteins 0.000 description 1
- 102400001282 Atrial natriuretic peptide Human genes 0.000 description 1
- 101800001890 Atrial natriuretic peptide Proteins 0.000 description 1
- 238000012935 Averaging Methods 0.000 description 1
- 241000701822 Bovine papillomavirus Species 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229920008347 Cellulose acetate propionate Polymers 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 206010008096 Cerebral atrophy Diseases 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N D-Lyxoflavin Natural products OCC(O)C(O)C(O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N D-alanine Chemical compound C[C@@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N D-alpha-Ala Natural products CC([NH3+])C([O-])=O QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZZZCUOFIHGPKAK-UHFFFAOYSA-N D-erythro-ascorbic acid Natural products OCC1OC(=O)C(O)=C1O ZZZCUOFIHGPKAK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 208000031124 Dementia Alzheimer type Diseases 0.000 description 1
- 206010067889 Dementia with Lewy bodies Diseases 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 241000588921 Enterobacteriaceae Species 0.000 description 1
- 241001302584 Escherichia coli str. K-12 substr. W3110 Species 0.000 description 1
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 1
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 1
- 201000007888 Finnish type amyloidosis Diseases 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 102000004878 Gelsolin Human genes 0.000 description 1
- 108090001064 Gelsolin Proteins 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 1
- 208000032838 Hereditary amyloidosis with primary renal involvement Diseases 0.000 description 1
- 229920000209 Hexadimethrine bromide Polymers 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 241000701109 Human adenovirus 2 Species 0.000 description 1
- 101150017040 I gene Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 208000009829 Lewy Body Disease Diseases 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010020004 Microtubule-Associated Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100040243 Microtubule-associated protein tau Human genes 0.000 description 1
- 101100480715 Mus musculus Mapt gene Proteins 0.000 description 1
- 102100037591 Neuroserpin Human genes 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 229930012538 Paclitaxel Natural products 0.000 description 1
- 206010033799 Paralysis Diseases 0.000 description 1
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 description 1
- 208000027089 Parkinsonian disease Diseases 0.000 description 1
- 206010034010 Parkinsonism Diseases 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 208000000609 Pick Disease of the Brain Diseases 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 241001505332 Polyomavirus sp. Species 0.000 description 1
- 108010050254 Presenilins Proteins 0.000 description 1
- 102000015499 Presenilins Human genes 0.000 description 1
- 108010059712 Pronase Proteins 0.000 description 1
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000004879 Racemases and epimerases Human genes 0.000 description 1
- 108090001066 Racemases and epimerases Proteins 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 102000008847 Serpin Human genes 0.000 description 1
- 108050000761 Serpin Proteins 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 102000008221 Superoxide Dismutase-1 Human genes 0.000 description 1
- 108010021188 Superoxide Dismutase-1 Proteins 0.000 description 1
- 102000019355 Synuclein Human genes 0.000 description 1
- 108050006783 Synuclein Proteins 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- 108010001244 Tli polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700647 Variola virus Species 0.000 description 1
- 229930003268 Vitamin C Natural products 0.000 description 1
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 230000003941 amyloidogenesis Effects 0.000 description 1
- 206010002026 amyotrophic lateral sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 230000003466 anti-cipated effect Effects 0.000 description 1
- 229940072107 ascorbate Drugs 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 230000001746 atrial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003376 axonal effect Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 230000002051 biphasic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008499 blood brain barrier function Effects 0.000 description 1
- 210000001218 blood-brain barrier Anatomy 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 1
- 230000005792 cardiovascular activity Effects 0.000 description 1
- NSQLIUXCMFBZME-MPVJKSABSA-N carperitide Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(=O)N1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=CC=C1 NSQLIUXCMFBZME-MPVJKSABSA-N 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000006957 competitive inhibition Effects 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000009470 controlled atmosphere packaging Methods 0.000 description 1
- 230000003436 cytoskeletal effect Effects 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 238000000326 densiometry Methods 0.000 description 1
- 210000001947 dentate gyrus Anatomy 0.000 description 1
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000003255 drug test Methods 0.000 description 1
- 208000025688 early-onset autosomal dominant Alzheimer disease Diseases 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000001723 extracellular space Anatomy 0.000 description 1
- 208000015756 familial Alzheimer disease Diseases 0.000 description 1
- 208000019995 familial amyotrophic lateral sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 201000007891 familial visceral amyloidosis Diseases 0.000 description 1
- 230000035557 fibrillogenesis Effects 0.000 description 1
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 208000035474 group of disease Diseases 0.000 description 1
- 231100000304 hepatotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 210000004276 hyalin Anatomy 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 230000007326 intracellular aggregation Effects 0.000 description 1
- 210000001739 intranuclear inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 238000002843 lactate dehydrogenase assay Methods 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 231100001231 less toxic Toxicity 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 210000004558 lewy body Anatomy 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000012886 linear function Methods 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000005265 lung cell Anatomy 0.000 description 1
- 101150030901 mab-21 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000013178 mathematical model Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 208000023356 medullary thyroid gland carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 230000003562 morphometric effect Effects 0.000 description 1
- 238000013425 morphometry Methods 0.000 description 1
- 208000005264 motor neuron disease Diseases 0.000 description 1
- 230000010807 negative regulation of binding Effects 0.000 description 1
- 210000000478 neocortex Anatomy 0.000 description 1
- 231100000417 nephrotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 210000002241 neurite Anatomy 0.000 description 1
- 230000000626 neurodegenerative effect Effects 0.000 description 1
- 230000016273 neuron death Effects 0.000 description 1
- 230000007171 neuropathology Effects 0.000 description 1
- 108010080874 neuroserpin Proteins 0.000 description 1
- 230000036963 noncompetitive effect Effects 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 229960001592 paclitaxel Drugs 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000003950 pathogenic mechanism Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 239000008177 pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 229950000688 phenothiazine Drugs 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229920000915 polyvinyl chloride Polymers 0.000 description 1
- 239000004800 polyvinyl chloride Substances 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 229940124606 potential therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 238000002331 protein detection Methods 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 235000019192 riboflavin Nutrition 0.000 description 1
- 229960002477 riboflavin Drugs 0.000 description 1
- 239000002151 riboflavin Substances 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 238000005204 segregation Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000003001 serine protease inhibitor Substances 0.000 description 1
- 210000000717 sertoli cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 238000003153 stable transfection Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004434 sulfur atom Chemical group 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000002636 symptomatic treatment Methods 0.000 description 1
- 230000016978 synaptic transmission, cholinergic Effects 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N taxol Chemical compound O([C@@H]1[C@@]2(C[C@@H](C(C)=C(C2(C)C)[C@H](C([C@]2(C)[C@@H](O)C[C@H]3OC[C@]3([C@H]21)OC(C)=O)=O)OC(=O)C)OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)C=1C=CC=CC=1)C=1C=CC=CC=1)O)C(=O)C1=CC=CC=C1 RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000013819 transposition, DNA-mediated Effects 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 235000019154 vitamin C Nutrition 0.000 description 1
- 239000011718 vitamin C Substances 0.000 description 1
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
- G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
- A61K31/54—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one sulfur as the ring hetero atoms, e.g. sulthiame
- A61K31/5415—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one sulfur as the ring hetero atoms, e.g. sulthiame ortho- or peri-condensed with carbocyclic ring systems, e.g. phenothiazine, chlorpromazine, piroxicam
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
- A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Neurology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Psychology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Psychiatry (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Un procedimiento para convertir proteolíticamente una proteína precursora en un fragmento producto en una línea celular estable, dicha proteína precursora está asociada con un estado de enfermedad en el que la proteína precursora se agrega patológicamente, procedimiento que comprende: (a) proporcionar una línea celular estable transfectada con un ácido nucleico que codifica: (i) un fragmento de plantilla de la proteína precursora tal que el fragmento de plantilla se exprese constitutivamente en la célula a un nivel que no sea tóxico para la célula; y (ii) la proteína precursora, proteína que es expresada de forma inducible en la célula en respuesta a un estímulo, (b) someter la célula al estímulo tal que exprese de forma inducible la proteína precursora en la célula, por lo que la interacción del fragmento de plantilla con la proteína precursora causa un cambio conformacional en la proteína precursora de forma que causa una agregación y procesado proteolítico de la proteína precursora del fragmento producto.
Description
Campo técnico [0001] La presente invención se refiere a modelos basados en células y a otros sistemas de análisis para modelar la agregación de proteínas asociada con la enfermedad neurodegenerativa. Adicionalmente se refiere a compuestos capaces de modular dicha agregación.
Antecedentes de la técnica [0002] Los estados de demencia tales como la enfermedad de Alzheimer (AD) se caracterizan frecuentemente por una acumulación progresiva de depósitos intracelulares y/o extracelulares de estructuras proteicas tales como placas β-amiloides y marañas neurofibrilares en el cerebro de los pacientes afectados. El aspecto de estas lesiones se correlaciona en su mayor parte con una degeneración neurofibrilar patológica y una atrofia cerebral, así como con un deterioro cognitivo (Mukaetova-Ladinska, E. B. y col. (2000) Am. J. Pathol. Vol. 157, Nº 2, 623-636). [0003] Tanto las placas neuríticas como las marañas neurofibrilares contienen filamentos helicoidales apareados (PHF), de los que un constituyente principal es la proteína tau asociada a microtúbulos (Wischik y col. (1988) PNAS EE.UU. 85, 4506). Las placas también contienen fibrillas β-amiloides extracelulares derivadas de un procesado anormal de la proteína precursora amiloidea (APP; Kang y col. (1987) Nature 325, 733). Un artículo de Wischik y col. (en ’Neurobiology of Alzheimer’s Disease’, 2ª Edición (2000) Eds. Dawbarn, D. y Allen, S. J., The Molecular and Cellular Neurobiology Series, Bios Scientific Publishers, Oxford), discute con detalle el papel putativo de la proteína tau en la patogenia de las demencias neurodegenerativas. [0004] Los estudios de la enfermedad de Alzheimer indican que la pérdida de la forma normal de la tau (Mukaetova-Ladinska y col. (1993) Am. J. Pathol., 143, 565; Wischik y col. (1995a) Neurobiol. Ageing, 16: 409; Lai y col. (1995b) Neurobiol. Ageing, 16: 433), la acumulación de PHFs patológicos (Mukaetova-Ladinska y col. (1993), loc. cit.; Harrington y col. (1994a) Dementia, 5, 215; Harrington y col. (1994b) Am. J. Pathol., 145, 1472; Wischik y col., (1995a), loc. cit.) y la pérdida de sinapsis en la corteza mesofrontal (Terry y col. (1991) Ann. Neurol., 30, 572) se correlacionan con un deterioro cognitivo asociado. Adicionalmente, la pérdida de sinapsis (Terry y col., loc. cit.) y la pérdida de células piramidales (Bondareff y col. (1993) Arch. Gen. Psychiatry, 50: 350) se correlacionan ambas con medidas morfométricas de una patología neurofibrilar reactiva a tau, que es semejante, a un nivel molecular, a una
2
redistribución prácticamente total del conjunto de proteínas tau desde una forma soluble a una polimerizada (PHFs) en la enfermedad de Alzheimer (Mukaetova-Ladinska y col. (1993), loc. cit.; Lai y col. (1995), loc. cit.). [0005] La tau existe en isoformas de corte y empalme alternativo, que contienen tres o cuatro copias de una secuencia repetitiva correspondiente al dominio de unión a microtúbulos (Goedert, M., y col. (1989) EMBO J. 8, 393-399; Goedert, M., y col. (1989) Neuron 3, 519-526). La tau de los PHF se procesa proteolíticamente a un dominio de núcleo (Wischik, C. M., y col. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 85, 4884-4888; Wischik y col. PNAS EE.UU. 1988, 85: 4506-4510); Novak, M., y col. (1993) EMBO J. 12, 365-370) que está formado por la versión de fase alterna del dominio repetitivo; sólo hay tres repeticiones implicadas en la integración estable tautau (Jakes, R., y col. (1991) EMBO J. 10, 2725-2729). Una vez formados, los agregados de tau de tipo PHF actúan como semillas para la captura adicional y proporcionan un plantilla para el procesado de la proteína tau completa (Wischik y col. 1996 Proc Natl Acad Sci EE.UU. 93, 11213-11218). [0006] En el transcurso de su formación y acumulación, los filamentos helicoidales apareados (PHFs) se agrupan en primer lugar para formar agregados amorfos dentro del citoplasma, probablemente a partir de oligómeros tempranos de tau que quedan truncados antes o en el transcurso de la agrupación de los PHF (Mena, R., y col. (1995) Acta Neuropathol. 89, 50-56; Mena, R., y col. (1996) Acta Neuropathol. 91, 633-641). Estos filamentos continúan entonces para formar unas clásicas marañas neurofibrilares intracelulares. En este estado, los PHF están constituidos por un núcleo de tau truncada y una cubierta exterior y difusa que contiene la tau completa (Wischik.,
C. M., y col, (1996) loc. cit.). El proceso de agrupación es exponencial, consumiendo el conjunto celular de tau funcional normal e induciendo una nueva síntesis de tau para compensar el déficit (Lai, R. Y. K., y col., (1995), Neurobiology of Ageing, Vol. 16, Nº 3, 433-445). Finalmente, el deterioro funcional de la neurona progresa hasta el punto de la muerte celular, dejando atrás una maraña extracelular. La muerte celular se correlaciona en gran medida con el número de marañas extracelulares (Wischik y col. 2000, loc. cit). Dado que las marañas son empujadas hacia el espacio extracelular, hay una pérdida progresiva de la cubierta exterior difusa de la neurona-PHF con la correspondiente pérdida de la inmunorreactividad tau N-terminal, pero conservando la inmunorreactividad de la tau asociada con el núcleo de los PHF (Figura 1; también Bondareff, W. y col., (1994) J. Neuropath. Exper. Neurol., vol. 53, Nº 2, 158-164). [0007] El cambio de fase que se observa en el dominio repetitivo de la tau
3
incorporada en los PHF sugiere que el dominio repetitivo experimenta un cambio conformacional inducido durante la incorporación en el filamento. Al inicio de la enfermedad de Alzheimer, se contempla que este cambio conformacional podría iniciarse por la unión de la tau a un sustrato patológico, tal como proteínas de membrana dañadas o mutadas (véase la Figura 2 - también Wischik, C. M., y col. (1997) en "Microtubule-associated proteins: modifications in disease", eds. Avila, J., Brandt, R. y Kosik, K. S. (Harwood Academic Publishers, Amsterdam) págs. 185241). [0008] En el caso de la enfermedad de Alzheimer, las terapias farmacéuticas actuales se centran en el tratamiento sintomático de la pérdida de la transmisión colinérgica resultante de la neurodegeneración (Mayeux, R., y col. (1999) New Eng. J. Med. 341, 1670-1679). Sin embargo, aunque los tratamientos disponibles retrasan la progresión de la enfermedad en hasta 6 a 12 meses, no la previenen. El descubrimiento de fármacos que podrían impedir la agregación de la tau que da lugar a la neurodegeneración proporcionaría una estrategia más efectiva para la profilaxis o para la inhibición de la progresión de la enfermedad, que no requería un conocimiento inmediato de los diversos eventos que, cascada arriba, inician la agregación (véase la Figura 3).
Modelos y ensayos
[0009] El documento WO99/62548 (inventores Ghetti y col.) se refiere de forma general a procedimientos y composiciones considerados adecuados para el diagnóstico, modelado y tratamiento de patologías relacionadas con la tau. Se refiere particularmente a mutaciones en el gen de la tau consideradas conductoras a la formación de marañas neurofibrilares, y más específicamente con mutaciones génicas consideradas conductoras a alteraciones en las proporciones de las isoformas de la tau y a la formación de filamentos de tau anormales. [0010] El documento WO96/30766 describe un ensayo in vitro para la agregación de la tau en el que un fragmento de la tau correspondiente al dominio repetitivo del núcleo, que ha sido adsorbido sobre un sustrato en fase sólida, es capaz de capturar la tau soluble completa y unirse a la tau con una elevada afinidad (véase la Figura 4). Esta asociación confiere estabilidad frente a la digestión de las proteasas de las moléculas de tau en los dominios repetitivos de las moléculas de tau que se han agregado. Este proceso es autopropagante y puede ser bloqueado selectivamente mediante agentes farmacéuticos prototipo ((Wischik y col. 1996 Proc Natl Acad Sci EE.UU. 93, 11213-11218).
4
[0011] Aunque el ensayo in vitro descrito en el documento WO96/30766 facilita la identificación de inhibidores o moduladores de la asociación tau-tau, los presentes inventores también han reconocido que podrían ser útiles los modelos basados en células de la agregación de proteínas del tipo de la enfermedad de Alzheimer. Dichos modelos celulares podrían usarse tanto en el cribado primario de los candidatos moduladores de la agregación tau-tau, como en el cribado secundario de compuestos ya identificados en el ensayo in vitro del documento WO96/30766. Adicionalmente, la demostración de la agregación de la tau en células también podría ayudar en la identificación de los sustratos celulares normales que están implicados en el inicio de la agregación patológica de la tau, sustratos que por sí mismos podrían ser objetivos para una intervención farmacológica. [0012] Sin embargo, numerosos artículos que describen la expresión de diversos construcciones de tau en modelos de cultivo tisulares no han conseguido demostrar la agregación (véase, por ejemplo, Baum, L. y col., (1995) Mol. Brain Res. 34:1-17). Por ejemplo, los fibroblastos de ratón 3T3 no poseen proteína tau, y por lo tanto presentan un entorno celular en el que la tau recombinante puede expresarse independientemente de la tau endógena del ratón. Previamente se ha informado de la transfección de diversas líneas celulares (Kanai y col., 1989; Goedert y Jakes, 1990; Knops y col, 1991; Lee y Rook, 1992; Gallo y col., 1992; Lo y col., 1993; Montejo de Garcini y col., 1994; Fasulo y col., 1996). Sin embargo, no se consiguió la expresión estable a largo plazo de tau truncada en dichas líneas celulares. Por ejemplo, los construcciones de tau para los restos 164 ó 173 hasta 338 ó 352 no expresaban la proteína (Lee y Rook, 1992). [0013] Aunque Fasulo y col. (Alzheimer’s Research 1996, 2, 195-200) informaron sobre la expresión transitoria de tau truncada en células COS, los datos de la expresión estable a largo plazo de esta tau no se mostraban. Estos trabajadores concluyeron, a partir del uso del sistema de transfección transitoria, que la expresión de la tau truncada no era suficiente por sí misma para inducir la agregación de tau de una forma adecuada para el análisis de fármacos. [0014] Hasta la fecha sólo se ha conseguido la agregación de tau soluble in vitro en condiciones no fisiológicas y a elevadas concentraciones (revisado en Wischik (2000), loc. cit.). [0015] El documento WO96/30766 describe dos metodologías para estudiar la agregación de tau en un entorno celular. En la primera metodología se expresaron de forma estable en células tau completas o fragmentos de tau. En la segunda
5
metodología, la tau agregada se transfectó transitoriamente en células mediante el uso de lipofectina. [0016] Aunque estas dos metodologías son útiles para el estudio de la agregación tau-tau, tienen algunas limitaciones. La transfección de tau agregada en células usando una lipofección tiene una eficacia variable, ya que es la producción in vitro de la propia tau agregada. Además, el fragmento del núcleo de tau, que es la semilla más eficaz para la agregación de tau, resulta ser tóxico cuando se expresa de forma estable en células, conduciendo a unos bajos niveles de expresión. Por lo tanto, la expresión constitutiva del fragmento de tau truncada del núcleo de los PHF en células eucariotas es difícil de conseguir. Los sistemas de expresión transitoria permiten la optimización de la expresión de tau, pero la toxicidad inherente de los fragmentos hace que incluso estos sistemas sean poco fiables. Los fragmentos más largos de tau son menos tóxicos, pero no se agregan de forma fiable cuando se expresan en células. [0017] Por lo tanto, sería deseable desarrollar un sistema de modelo alternativo en el que la interacción entre, por ejemplo, moléculas de tau y similares, pudiera ser investigada en condiciones fisiológicas, en un entorno celular estable y controlable, y que pudiera usarse para cribar potenciales agentes diagnósticos, pronósticos o terapéuticos de dolencias tales como la enfermedad de Alzheimer.
Divulgación de la invención [0018] Los presentes inventores han ideado un sistema de análisis celular estable que puede usarse para modelar el procesado proteolítico guiado por plantilla de una proteína, cuya agregación está asociada con una enfermedad neurodegenerativa. En un sistema de análisis, ejemplificado con la proteína tau, se combinó un nivel muy bajo de expresión constitutiva de un fragmento de la proteína tau con una expresión inducible de la tau completa. La inducción de la tau condujo a su conversión proteolítica en un fragmento deseado, confirmando que se estaba produciendo "el procesado por plantilla" de la tau. El sistema permite fácilmente la demostración de los efectos de los inhibidores de la agregación de la tau a través de su inhibición de la producción del fragmento de 12 kD procesado a partir de la tau completa inducida. [0019] El que dicho sistema estable pueda conseguirse a pesar de las inherentes propiedades tóxicas del fragmento de 12 kD es particularmente sorprendente. Por ejemplo, según se demuestra en los Ejemplos, a continuación, aunque el truncamiento parcial en los extremos N o C de la tau completa da como resultado líneas celulares en las que puede mantenerse la expresión estable, estos construcciones más largos sólo muestran una débil propensión a agregarse, más que a unirse a la red microtubular. La
6
expresión estable de combinaciones de fragmentos de tau genera agregados dentro del citoplasma de las células, pero este sistema no puede ser mantenido reproduciblemente. Los sistemas basados en la expresión inducible del fragmento de 12 kD dan lugar a una toxicidad como resultado de la imprevisible agregación intracelular del fragmento. [0020] Por lo tanto, parecería existir una compensación en los sistemas celulares de expresión estable entre inducir la agregación, y por lo tanto la toxicidad, por un lado, que produce líneas celulares que o son variables o no son viables, y mantener líneas celulares viables en las que la tau tiene una baja propensión a agregarse. A pesar de todo esto, el sistema de expresión inducible de tau de la presente invención es estable y además capaz de proporcionar una agregación controlada de la proteína para su uso en cribados y similares. [0021] Adicionalmente, el uso del ensayo ha proporcionado pruebas de que el mecanismo de acción de ciertos inhibidores (por ejemplo, fenotiazinas) de la agregación de proteínas es principalmente de naturaleza estérica, más que esencialmente redox, según puede sospecharse sobre la base de la técnica anterior. Este descubrimiento tiene implicaciones inesperadas para la elección, valoración, formulación y uso de dichos compuestos en el contexto de las enfermedades discutidas en este documento. En particular, muestra que la valoración de los coeficientes de difusión puede proporcionar un cribado valorable para la identificación de inhibidores putativos, u optimizar la estructura o el estado de los conocidos, porque los parámetros valorados inherentemente midiendo el coeficiente de difusión pueden ser altamente aplicables a la potencia de los inhibidores. [0022] El ensayo muestra adicionalmente que el uso de fenotiazinas en su forma reducida puede ser ventajoso para mejorar sus propiedades inhibidoras. [0023] En general, la presente invención proporciona un procedimiento para convertir, a través del procesado proteolítico, una proteína precursora en un fragmento producto de la proteína precursora, en una línea celular estable, procedimiento que comprende las etapas de: (a) proporcionar una línea celular estable transfectada con un ácido nucleico que codifica para (i) un fragmento de plantilla de la proteína precursora tal que el fragmento de plantilla se expresa constitutivamente en la célula a un nivel que no es tóxico para la célula; y (ii) la proteína precursora, proteína que es expresada de forma inducible en la célula en respuesta a un estímulo, mediante lo que la interacción del fragmento de plantilla con la proteína precursora provoca un cambio conformacional en la proteína precursora tal que provoca la agregación y el procesado
7
proteolítico de la proteína precursora al fragmento producto. [0024] El procedimiento incluye someter la célula a un estímulo tal que la proteína precursora se exprese en la célula. Sin embargo, en las realizaciones en las que se usa un promotor inducible que provoca unos niveles bajos pero detectables de expresión e incluso en ausencia del estímulo, entonces puede omitirse la etapa del estímulo. [0025] Hablando de forma general, la proteína precursora será aquella que, in vivo, sea capaz de experimentar una interacción de polimerización conformacional inducida (de una forma autopropagante), que finalmente dé lugar a la formación de agregados formados por el fragmento producto, y asociados con el estado de enfermedad. El fragmento producto obtenido en el procedimiento proporcionado en este documento es una medida de la agregación patológica y el proceso de proteolisis que da lugar in vivo a la producción de uno o más productos tóxicos y al estado de enfermedad. El fragmento producto (o uno o más de los fragmentos) del presente procedimiento puede ser tóxico, o puede usarse simplemente como un indicador del proceso de agregación patológica. [0026] Las proteínas y las interacciones en las que se basa el procedimiento se discuten con más detalle a continuación. [0027] Los presentes inventores han demostrado que, inesperadamente, es posible expresar constitutivamente el fragmento de plantilla en una (primera) concentración que no sea tóxica para la línea celular, es decir, la línea celular es viable. Tampoco muestra anomalías celulares del tipo mostrado en, por ejemplo, el documento WO96/30766 en la Fig. 29. [0028] No obstante (por ejemplo, en un momento predeterminado mediante la adición de un estímulo), es posible sembrar el procesado de la proteína precursora a un fragmento producto (que puede ser el mismo, ampliamente equivalente o bastante diferente al fragmento de plantilla) que puede así acumularse a una (segunda, mayor) concentración que sea tóxica para la célula y que se corresponde con el estado de enfermedad. Esto a su vez proporciona procedimientos convenientes para modelar el estado de la enfermedad asociado con los efectos del fragmento producto, y evaluar el efecto de los moduladores sobre la generación del fragmento producto. [0029] En otras diversas formas distintas de realización, la invención proporciona los correspondientes procedimientos para cualquiera de iniciación, sembrado o control del procesado proteolítico, y opcionalmente la agregación, de la proteína precursora hacia el fragmento producto. [0030] En cada caso, el procedimiento puede implicar el seguimiento (directa o
8
indirectamente) del nivel de procesado proteolítico de la proteína precursora. [0031] En una realización de la presente invención, los fibroblastos (3T6) expresan la tau completa ("T40") bajo el control de un promotor inducible y bajos niveles constitutivos del fragmento de tau del núcleo de los PHF (fragmento de 12 kD). Cuando se induce la expresión de la T40 en este sistema, experimenta un truncamiento dependiente de la agregación dentro de la célula, N-terminalmente en el aa 295 y C-terminalmente en el aa 390, produciendo así mayores niveles del fragmento del dominio del núcleo de 12 kD de los PHF. La producción del fragmento de 12 kD puede bloquearse de una forma dependiente de la dosis mediante inhibidores de la agregación de la tau. De hecho, la cuantificación de la actividad inhibidora de los compuestos con respecto a la generación proteolítica del fragmento de 12 kD dentro de las células puede describirse completamente en términos de los mismos parámetros que describen la inhibición de la unión tau-tau in vitro. Esto es, la magnitud de la generación proteolítica del fragmento de 12 kD dentro de las células está determinada completamente por la magnitud de la unión tau-tau a través del dominio de repetición. La disponibilidad de las proteasas pertinentes dentro de la célula no es limitante.
Proteínas precursoras y enfermedades (incluyendo tauopatías)
[0032] Según se estableció anteriormente, la invención puede basarse en torno al uso de cualquier proteína que esté asociada con una enfermedad en la que la proteína experimenta una interacción de polimerización conformacional inducida, es decir, aquella en la que un cambio conformacional de la proteína, o en un fragmento de la misma, provoca la unión al plantilla y la agregación de moléculas de proteínas adicionales (precursoras) de una forma autopropagante. [0033] Una vez iniciada la nucleación, puede surgir una cascada de agregación que implica la polimerización conformacional inducida de moléculas de proteína adicionales, dando lugar a la formación de fragmentos de producto tóxicos en agregados que son sustancialmente resistentes a una proteolisis adicional. Se cree que los agregados de proteína así formados son una causa próxima de neurodegeneración, demencia clínica y otros síntomas patológicos de este grupo de enfermedades. [0034] Las realizaciones preferidas de la invención se basan en la proteína tau. Cuando se usa en este documento, el término "proteína tau" se refiere de forma general a cualquier proteína de la familia de las proteínas tau. Las proteínas tau se caracterizan por estar entre uno las familias más importantes de proteínas que se purifican simultáneamente con los microtúbulos durante ciclos repetidos de agrupación y desagrupación (Shelanski y col. (1973) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 70., 765-768), y
9
se conocen como proteínas asociadas a los microtúbulos (MAP). Los miembros de la familia tau comparten las características comunes de tener un segmento N-terminal característico, secuencias de aproximadamente 50 aminoácidos insertadas en el segmento N-terminal, que son reguladas desarrolladoramente en el cerebro, una característica región de repetición en tándem consistente en 3 ó 4 repeticiones en tándem de 31-32 aminoácidos, y una cola C-terminal. [0035] La MAP2 es la proteína asociada a microtúbulos predominante en el compartimento somatodendrítico (Matus, A., en "Microtubules" [Hyams y Lloyd, eds.] págs. 155-166, John Wiley and Sons, NY). Las isoformas de la MAP2 son prácticamente idénticas a la proteína tau en la región de repetición en tándem, pero difieren sustancialmente tanto en la secuencia como en la magnitud del dominio N-terminal (Kindler y Garner (1994) Mol. Brain Res. 26, 218-224). No obstante, la agregación en la región de repetición en tándem no es selectiva para el dominio de repetición de tau. Por lo tanto, se apreciará que cualquier discusión en este documento en relación con la proteína tau o la agregación tau-tau debería considerarse como relacionada también con la agregación tau-MAP2, la agregación MAP2-MAP2 y así sucesivamente. [0036] La Figura 5 muestra una Tabla que enumera otras diversas proteínas de agregación asociadas con enfermedades que pueden usarse en la presente invención. En cada caso, se enumeran también la enfermedad o enfermedades en las que pueden jugar un papel el inicio de la agregación y/o la mutación de la(s) proteína(s). Se enumeran el dominio o la mutación responsable de la actividad patológica, y al menos toda o parte de esta mínima porción de la proteína estarían preferiblemente englobadas por el fragmento de plantilla usado en la presente invención. [0037] Como puede observarse a partir de la tabla, los ejemplos de enfermedades que están caracterizadas por la agregación patológica de proteínas incluyen enfermedades de motoneuronas y enfermedades por cuerpos de Lewy. [0038] Notablemente, no es sólo en la enfermedad de Alzheimer en la que puede jugar un papel la proteína tau (y la función o el procesado aberrante de la misma). La patogenia de las alteraciones neurodegenerativas tales como la enfermedad de Pick y la parálisis supranuclear progresiva (PSP) parece correlacionarse con una acumulación de agregados patológicos de tau truncada en la circunvolución dentada y en las células piramidales estrelladas de la neocorteza, respectivamente. Otras demencias incluyen demencia frontotemporal (FTD); parkinsonismo relacionado con el cromosoma 17 (FTDP-17); complejo de desinhibición-demencia-parkinsonismo-amiotrofia
10
(DDPAC); degeneración pálido-ponto-nigral (PPND); síndrome de Guam-ALS; degeneración pálido-nigro-luisianal (PNLD); degeneración cortico-basal (CBD) y otras (véase Wischik y col. 2000, loc. cit., para una discusión detallada - especialmente la Tabla 5.1). Todas estas enfermedades, que están caracterizadas principal o parcialmente por una agregación anormal de tau, se denominan en este documento "tauopatías". [0039] Por lo tanto, a la luz de la anterior discusión, se apreciará (y excepto donde el contexto lo requiera de otro modo) que donde las realizaciones de la invención se describan con respecto a la proteína tau o proteínas de tipo tau (por ejemplo, MAP2), la descripción debería entenderse como que se aplica igualmente a las otras proteínas discutidas anteriormente (por ejemplo, β-amiloidea, sinucleína, prión, etc.) u otras proteínas que pueden iniciar o experimentar una agregación patológica similar en virtud del cambio conformacional en un dominio crítico para la propagación de la agregación, o que imparten estabilidad proteolítica al agregado así formado (artículo de Wischik y col. (en "Neurobiology of Alzheimer’s Disease", 2ª Edición (2000) Eds. Dawbarn, D. y Allen, S. J., The Molecular and Cellular Neurobiology Series, Bios Scientific Publishers, Oxford). Todas estas proteínas pueden denominarse en este documento "proteínas de enfermedad por agregación". [0040] Asimismo, cuando en este documento se hace mención a la "agregación tau-tau", o similar, esto también puede entenderse que se aplica a otra "agregación de proteínas de agregación", tales como la agregación de β-amiloidea, la agregación de priones y la agregación de sinucleína, etc. Igualmente para la "degradación proteolítica de tau" y así sucesivamente.
Fragmentos de plantilla
[0041] En las realizaciones preferidas de la presente invención, el fragmento de plantilla comprende, consiste esencialmente en, o está constituida por, un "fragmento de núcleo" de la proteína precursora, término que se refiere a aquella parte de la proteína que es capaz de unirse a la proteína precursora para iniciar o propagar la proteolisis y la agregación según se ha descrito anteriormente. [0042] En el caso de proteínas patológicas que se agregan, también es probable que dichos fragmentos de núcleo sean aquellos que contribuyen a la estabilidad proteolítica del agregado. [0043] Así, por ejemplo, un "fragmento de núcleo de tau" es un fragmento de tau que comprende una secuencia de la proteína tau truncada derivada de la región de repetición en tándem y que, en las condiciones apropiadas, es capaz de unirse a la
11
región de repetición en tándem de una proteína tau adicional o de una proteína MAP2 con alta afinidad. En el caso de la tau, el fragmento preferido es por tanto ejemplificado mediante, pero no limitado a, los fragmentos de la tau presentes en los PHF (y, finalmente, en las marañas neurofibrilares) de los cerebros con enfermedad de Alzheimer. [0044] Un fragmento de tau preferido puede ser, por tanto, desde aproximadamente (digamos) entre 295-297 que se extiende hasta aproximadamente 390-391 (véase ’dGAE’ en la Figura 6), aunque también pueden usarse variantes de dichos fragmentos, según se discute a continuación. [0045] En el caso de la APP (proteína precursora amiloidea), por ejemplo, puede preferirse la expresión de un fragmento de la APP que englobe el dominio AP de 1-40
o 1-42 aminoácidos como una proteína de fusión. [0046] Otros fragmentos del núcleo pueden estar basados, por ejemplo, en los dominios discutidos con respecto a la Figura 5. Los fragmentos de plantilla pueden incluir dominios de dos, o más de dos, de estas proteínas (por ejemplo, como fusiones). La longitud total del fragmento de plantilla puede ser cualquiera que sea apropiada para el ensayo y el fragmento del núcleo de la proteína de enfermedad por agregación que se está usando, pero generalmente será mayor o igual a aproximadamente alrededor de 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 aminoácidos de longitud. Sin embargo, en algunas realizaciones puede ser mayor de 100, 200 o incluso 500, si se desea.
Derivados
[0047] En todo los casos en los que en este documento se discute una proteína mencionada (por ejemplo, proteína precursora, de plantilla o de fragmento de núcleo),
o una secuencia de un ácido nucleico referida, puede usarse un derivado u otra variante de la correspondiente proteína de referencia (o ácido nucleico) según sea apropiado, siempre que conserve las características apropiadas de la secuencia de referencia. Dichos derivados también compartirán la identidad de secuencia con la secuencia de referencia. [0048] Por ejemplo, la proteína usada puede incluir un N- o C-terminal extendido, extensión que puede ser heteróloga con la secuencia de la proteína. Igualmente, el derivado será uno mediante la inserción, deleción o adición de aminoácidos en la secuencia de referencia. Por ejemplo, una proteína tau, o un fragmento de núcleo de tau, derivado comprenderá al menos una secuencia de aminoácidos parcial que se asemeje a la región de repetición en tándem de las proteínas tau, pero en la que uno o más de los aminoácidos de la tau natural o sus fragmentos han sido sustituidos o
12
deleccionados, o en la que se han insertado otros aminoácidos. [0049] Dichos cambios pueden realizarse para incrementar o eliminar la actividad de unión (siendo el último caso útil para los experimentos de control). Los controles pueden contener deleciones de secuencias o dominios para ver qué efecto pueden tener sobre la agregación. [0050] Los derivados preferidos pueden ser aquellos que incorporen mutaciones correspondientes a aquellos conocidos o sospechosos de estar asociados con el estado de enfermedad. Éstos pueden incluir cambios correspondientes a P301S dentro de la secuencia de tau (véase la Figura 7). Otras mutaciones incluyen G272V, G389R, P301L, N279K, S305N, V337M, G272V, K280Δ, R406W (véase también Wischik y col, 2000, supra). [0051] Otros derivados preferidos pueden incluir repeticiones en tándem de los fragmentos de núcleo y discutidos anteriormente, o dominios de unión dentro de esos fragmentos. [0052] Otros derivados adicionales pueden estar basados en productos quiméricos basados en múltiples proteínas patológicas relacionadas, en los que sus secuencias se mezclan o combinan. Por ejemplo, podrían ligarse fragmentos de la enzima de restricción de la tau junto con fragmentos de MAP2 o incluso de un gen no relacionado para generar derivados recombinantes. Una estrategia alternativa para modificar los fragmentos del núcleo emplearía una PCR según describen Ho y col., 1989, Gene 77, 51-59 o transposiciones de ADN (Crameri y col., 1998 Nature 391).
Uso de construcciones de ácidos nucleicos
[0053] Los ácidos nucleicos de, o para su uso en, la presente invención, pueden proporcionarse aislados y/o purificados a partir de su entorno natural, en una forma sustancialmente pura u homogénea, o exentos o sustancialmente exentos de otros ácidos nucleicos de la especie de origen. Cuando se usa en este documento, el término "aislado" engloba todas estas posibilidades. Los ácidos nucleicos que codifican, por ejemplo, para el fragmento de plantilla, serán al menos parcialmente sintéticos porque comprenderán secuencias de ácidos nucleicos que no se encuentran conjuntamente en la naturaleza (no son contiguas), sino que han sido ligadas o artificialmente combinadas de otro modo. [0054] El ácido nucleico según la presente invención puede estar en forma de, o derivar de, ADNc, ARN, ADN genómico y ácidos nucleicos modificados o análogos de ácidos nucleicos. Cuando se especifica una secuencia de ADN, por ejemplo, con referencia a una figura, salvo que el contexto lo requiera de otro modo, se engloba el
13
ARN equivalente, con el U sustituido por T cuando aparezca. [0055] Según se ha descrito anteriormente, los ácidos nucleicos pueden codificar para derivados u otras variantes que comparten homología con las secuencias de referencia en cuestión. Preferiblemente, el ácido nucleico y/o la secuencia de aminoácidos en cuestión compartirían aproximadamente el 50%, o el 60%, o el 70%, o el 80% de identidad, muy preferiblemente al menos aproximadamente el 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o el 99% de la secuencia en la que se basa la variante. La similitud u homología puede definirse y determinarse mediante el programa TBLASTN, de Altschul y col. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10, que es de uso estándar en la materia, o, y esto puede ser preferido, el programa estándar BestFit, que es parte del paquete Wisconsin, versión 8, septiembre de 1994, (Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, EE.UU., Wisconsin 53711) usando los parámetros por defecto. Una fórmula común para calcular las condiciones de rigurosidad requeridas para conseguir la hibridación entre moléculas de ácidos nucleicos con una de secuencia específica es: Tm = 81,5°C + 16,6Log [Na+] + 0,41 (% de G+C) - 0,63 (% de formamida) - 600/nº de pb del bicatenario. [0056] El experto en la materia puede preparar fácilmente las secuencias de ácidos nucleicos que codifican para las proteínas o polipéptidos apropiados usando la información y referencias contenidas en este documento y las técnicas conocidas en la materia (por ejemplo, véase Sambrook, Fritsch y Maniatis, "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, y Ausubel y col., Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, 1992). Estas técnicas incluyen (i) el uso de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar muestras del ácido nucleico pertinente, por ejemplo, a partir de fuentes genómicas, (ii) una síntesis química, o (iii) la preparación de secuencias de ADNc. [0057] Puede generarse un ADN que codifique, por ejemplo, fragmentos de núcleo de la tau y usarse de cualquier forma adecuada conocida por los expertos en la materia, incluyendo tomar el ADN codificante, identificar los sitios de reconocimiento de enzimas de restricción adecuados en cualquier lado de la porción que se va expresar, y cortar y extraer dicha porción del ADN. Pueden realizarse modificaciones en las secuencias que codifican para la proteína (por ejemplo, tau), por ejemplo, usando mutagénesis dirigida.
Construcciones
[0058] Por tanto, la invención también se refiere, en un aspecto adicional, a moléculas de ácido nucleico que codifican las apropiadas proteínas precursoras y de
14
fragmento de plantilla. Como se discute a continuación, éstas pueden estar presentes en construcciones iguales o diferentes constructos, y en el último caso, también se prevén composiciones que comprenden dos o más tipos de construcción. [0059] Las secuencias de ácidos nucleicos que permiten a un vector replicarse en una o más células hospedadoras seleccionadas son conocidas para varias bacterias, levaduras y virus. Por ejemplo, varios orígenes víricos (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) son útiles para clonar vectores en células de mamífero. Los vectores de expresión que comprenden un ácido nucleico según se describe en este documento pueden estar, por ejemplo, en forma de un plásmido, cósmido, partícula vírica, fago o cualquier otro vector o construcción adecuada que puedan ser captados por una célula y expresado apropiadamente. [0060] Los vectores de expresión contendrán un promotor que esté unido operativamente a la secuencia de interés de ácido nucleico que codifica para la proteína, de forma que dirija la síntesis de ARNm. Los promotores reconocidos por diversas células hospedadoras potenciales son bien conocidos. "Unido operativamente" significa conectado como parte de la misma molécula de ácido nucleico, posicionado adecuadamente y orientado para que el promotor inicie la transcripción. El ADN unido operativamente a un promotor está "bajo el control transcripcional" del promotor. La transcripción desde vectores en células hospedadoras de mamíferos es controlada, por ejemplo, por promotores obtenidos a partir de genomas de virus tales como poliomavirus, virus de la viruela aviar, adenovirus (tales como Adenovirus 2), virus del papiloma bovino, virus del sarcoma aviar, citomegalovirus, un retrovirus, virus de la hepatitis-B y el virus del simio 40 (SV40), a partir de promotores heterólogos de mamífero, por ejemplo, el promotor de la actina o un promotor de inmunoglobulina, y a partir de promotores de choque térmico, siempre que dichos promotores sean compatibles con los sistemas celulares hospedadores. Los vectores de expresión usados en células hospedadoras eucariotas (levaduras, hongos, insectos, plantas, animales, seres humanos o células nucleadas de otros organismos pluricelulares) contendrán también las secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para estabilizar el ARNm. [0061] El promotor usado para el fragmento de plantilla será "constitutivo". Este promotor puede ser lo suficientemente débil como para que el nivel del fragmento de plantilla expresado en la célula no sea detectable por sí mismo (directamente) usando técnicas convencionales, sino (indirectamente) por su efecto sobre la proteína precursora, dando lugar a la agregación y el procesado proteolítico de la misma (es
15
decir, efectivamente indetectable cuando se inhibe dicha agregación). Dichos promotores pueden ser seleccionados por los expertos en la materia a la luz de la presente divulgación sin una carga indebida tal como los enumerados anteriormente. [0062] En el caso de la proteína precursora, el promotor es "inducible" -lo que significa que, y como bien entienden los expertos en la materia, la expresión se "activa" o se incrementa en respuesta a un estímulo aplicado. La naturaleza del estímulo varía entre los promotores. Algunos promotores inducibles provocan unos niveles bajos o indetectables de expresión (o ninguna expresión) en ausencia del estímulo apropiado. Otros promotores inducibles provocan una expresión constitutiva detectable en ausencia del estímulo. Cualquiera que sea el nivel de expresión en ausencia del estímulo, la expresión desde cualquier promotor inducible se incrementa en presencia del estímulo correcto. En los siguientes experimentos se ha usado un promotor inducible Lac. [0063] Los vectores de expresión de la invención también pueden contener uno o más genes de selección. Los genes de selección típicos codifican para proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, (b) complementan deficiencias auxótrofas, o (c) aportan nutrientes críticos no disponibles en el medio complejo, por ejemplo, el gen que codifica para la D-alanina racemasa para bacilos. Un ejemplo de marcadores seleccionables adecuados para células de mamíferos son aquellos que permiten la identificación de células competentes para captar el ácido nucleico que codifica para la proteína deseada, tal como la DHFR o la timidina cinasa. Una célula hospedadora apropiada, cuando se emplea DHFR natural, es la línea celular CHO deficiente en actividad de DHFR, preparada y propagada según se describe en Urlaub y col., Proc. Natl. Acad Sci EE.UU. 77: 4216 (1980). Un gen de selección adecuado para uso en levaduras es el gen trp1 presente en el plásmido de levadura Rp7 [Stinchcomb y col., Nature, 282: 39 (1979); Kingsman y col., Gene, 7: 141 (1979); Tschemper y col., Gene, 10: 157 (1980)]. El gen trp1 proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carece de la capacidad de crecer en triptófano, por ejemplo, ATCC: nº 44076 o PEP4-1 [Jones, Genetics, 85: 12 (1977)]. [0064] Por lo tanto, un vector típico para uso en la presente invención puede incluir un origen de replicación, una o más secuencia(s) de proteína(s) unidas operativamente a un promotor constitutivo o inducible según sea apropiado, una secuencia de terminación de la transcripción, un elemento potenciador, un gen marcador. La construcción de vectores adecuados que contienen varios de estos
16
componentes emplea técnicas de ligación estándar que son conocidas por el experto en la materia.
Transformación
[0065] La presente invención también proporciona un procedimiento para producir una célula estable para uso en un procedimiento según se ha descrito anteriormente, procedimiento que comprende las etapas de: (a) introducir en una célula un ácido nucleico que codifica para (i) un fragmento de plantilla de la proteína precursora tal que el fragmento de plantilla se exprese constitutivamente en la célula a un nivel que no sea tóxico para la célula; y (ii) la proteína precursora tal que la proteína patológica sea expresada de forma inducible en la célula en respuesta a un estímulo. [0066] La introducción, que puede denominarse de forma general sin limitación como "transformación", puede emplear cualquier técnica disponible. Para células eucariotas, algunas técnicas adecuadas pueden incluir transfección con fosfato cálcico, DEAE-Dextrano, electroporación, transfección mediada por liposomas y transducción usando retrovirus u otros virus, por ejemplo, vacunas o, para células de insecto, baculovirus. El tratamiento con calcio que emplea cloruro cálcico, según se describe en Sambrook y col., supra, o la electroporación, se usan generalmente para procariotas u otras células que contienen barreras sustanciales de pared celular. La infección con Agrobacterium tumefaciens se usa para la transformación de ciertas células vegetales, según describen Shaw y col., Gene, 23: 315 (1983) y el documento WO89/05859 publicado el 29 de junio de 1989. [0067] Para células de mamífero sin dichas paredes celulares, puede emplearse el método de la precipitación con fosfato cálcico de Graham y van der Eb, Virology 52: 456-457 (1978). Los aspectos generales de las transformaciones en sistemas hospedadores celulares de mamífero se han descrito en la Patente de EE.UU. nº
4.399.216. Las transformaciones en levaduras se llevan a cabo típicamente según el método de Van Solingen y col., J. Bact., 130: 946 (1977) y Hsiao y col., Proc. Natl. Acad. Sci. (EE.UU.), 76: 3829 (1979). Sin embargo, también pueden usarse otros métodos para introducir ADN en células, tales como mediante microinyección nuclear, electroporación, fusión de protoplastos bacterianos con células intactas, o policationes, por ejemplo, polibreno, poliornitina. Para las diversas técnicas para transformar células de mamífero, véanse Keown y col., Methods in Enzymology, 185: 527 537 (1990) y Mansour y col., Nature 336: 348-352 (1988).
Células hospedadoras
[0068] Las células hospedadoras adecuadas para su uso en la invención pueden
17
incluir bacterias, células eucariotas tales como células de mamífero y de levadura, y sistemas de baculovirus. [0069] Las líneas celulares de mamífero disponibles en la materia para la expresión de un polipéptido heterólogo incluyen células de fibroblastos 3T6, células HeLa, células de riñón de cría de hámster, células COS, línea de riñón de mono CV1 trasformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651), células de ovario de hámster chino/-DHFR (CHO, Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 77: 4216 (1980)); células de sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980)); células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células de hígado humano (Hep G2, HB 8065); células tumorales mamarias de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51); y muchas otras. [0070] Algunos hospedadores procariotas adecuados incluyen, pero no se limitan a, eubacterias, tales como organismos gramnegativos o grampositivos, por ejemplo, Enterobacteriaceae tales como E. coli. Hay disponibles públicamente de varias cepas de E. coli, tales como la cepa de E. coli K12 MM294 (ATCC 31.446); E. coli X1776 (ATCC 31.537); la cepa de E. coli W3110 (ATCC 27.325) y K5 772 (ATCC 53.635). Algunos microbios eucariotas tales como hongos filamentosos o levaduras también son hospedadores de clonación o de expresión adecuados para vectores. Saccharomyces cerevisiae es un microorganismo hospedador procariota inferior usado habitualmente. La selección de la célula hospedadora apropiada se estima dentro de la experiencia en la materia. [0071] En un aspecto adicional, la presente invención proporciona una célula hospedadora que contiene un ácido nucleico heterólogo de la invención según se ha descrito anteriormente. El ácido nucleico de la invención puede estar integrado en el genoma (por ejemplo, cromosoma) de la célula hospedadora. La integración puede ser promovida por la inclusión de secuencias que promuevan la recombinación con el genoma, según técnicas estándar. Alternativamente, el ácido nucleico puede estar en un vector extracromosómico dentro de la célula, o por el contrario, identificablemente heterólogo o foráneo a la célula. [0072] La célula puede ser producida mediante un método descrito anteriormente (introducción de la construcción de ácido nucleico) o ser el ancestro de dicha célula. También se prevén las correspondientes líneas celulares. Las líneas celulares preferidas pueden basarse en la línea celular de fibroblastos, por ejemplo, 3T6. [0073] Las células hospedadoras transfectadas o trasformadas con los vectores de expresión o de clonación descritos en este documento pueden cultivarse en medios
18
nutrientes convencionales modificados según sea apropiado para inducir promotores, transformantes de selección, o amplificar los genes que codifican para las secuencias deseadas. Las condiciones de cultivo, tales como medio, temperatura, pH y similares, pueden ser seleccionadas por el experto en la materia sin una experimentación excesiva. En general, los principios, protocolos y técnicas prácticas para maximizar la productividad de los cultivos celulares pueden encontrarse en "Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach", M. Butler, ed. JRL Press, (1991) y Sambrook y col, supra. [0074] La expresión génica puede confirmarse de forma directa , por ejemplo, mediante transferencia Southern convencional, transferencia Northern para cuantificar la transcripción del ARNm [Thomas, Proc. Natl Acad Sci. EE.UU., 77: 5201-5205 (1980)], inmunotransferencia(análisis de ADN), o hibridación in situ, usando una sonda marcada apropiadamente, basada en la secuencia de la proteína patológica agregante. Alternativamente, pueden emplearse anticuerpos que puedan reconocer bicatenarios específicos, incluyendo bicatenarios de ADN, bicatenarios de ARN y bicatenarios híbridos ADN-ARN o bicatenarios de ADN-proteína. [0075] La expresión génica puede medirse alternativamente mediante métodos inmunológicos tales como la tinción inmunohistoquímica de células o secciones de tejido, y ensayos de cultivos celulares, para cuantificar directamente la expresión del producto génico. Los anticuerpos útiles para la tinción inmunohistoquímica y/o el ensayo de fluidos de muestra pueden ser monoclonales o policlonales, y pueden prepararse en cualquier mamífero. Convenientemente, los anticuerpos pueden prepararse contra una secuencia natural del polipéptido agregante patológico. [0076] Por lo tanto, un aspecto de la presente invención implica causar o permitir la expresión a partir de los ácidos nucleicos descritos en este documento, por ejemplo, mediante el cultivo de células hospedadoras en unas condiciones para la expresión del gen (presencia de estímulo) de forma que se produzca el fragmento producto. La presente invención también engloba un procedimiento para producir el fragmento producto, procedimiento que incluye su expresión a partir del ácido nucleico, según se ha descrito anteriormente. [0077] Otro aspecto de la presente invención es un kit que comprende una célula o una línea celular transformada según se describe en este documento, junto con al menos un componente adicional, por ejemplo, un agente para estimular la producción de la proteína precursora, o un agente para detectar la interacción de la proteína precursora con el fragmento de plantilla, según se describe en la sección siguiente.
19
Detección de la agregación y/o del procesado proteolítico y/o del fragmento tóxico
[0078] En varias realizaciones, el progreso del procesado proteolítico o la agregación (o la modulación de los mismos -véase a continuación) puede detectarse directa o indirectamente mediante el seguimiento de la concentración o el nivel de una cualquiera o más de las siguientes especies: la proteína precursora; el fragmento producto; cualquier fragmento subproducto formado durante el proceso; un agregado de cualquiera de estos (por ejemplo, basándonos en los coeficientes de sedimentación). [0079] Por lo tanto, como se ejemplifica con las proteínas y fragmentos de tau en particular (basados en el fragmento 297-351 y la T40), la agregación puede seguirse en base al incremento en los niveles de una especie procesada de 12 kDa, derivado primariamente de la proteína precursora. [0080] Algunos procedimientos para la detección de proteínas se discuten en relación con la expresión génica anterior. Cuando se usan anticuerpos o fragmentos de los mismos en las realizaciones del procedimiento de la presente invención, pueden producirse mediante técnicas convencionales. Los anticuerpos policlonales pueden crearse mediante, por ejemplo, por inyección del correspondiente antígeno de tau en un animal, preferiblemente un conejo, y recuperando el antisuero mediante purificación por inmunoafinidad, en la que el anticuerpo policlonal se hace pasar por una columna a la que está unido el antígeno y después se eluye de forma convencional. Preferiblemente, la invención usará anticuerpos monoclonales que sean selectivos para epítopos de tau que se, pueden preparar por el procedimiento de Kohler y Milstein. Los anticuerpos monoclonales adecuados como epítopos de tau pueden modificarse mediante procedimientos conocidos para proporcionar fragmentos Fab o fragmentos (Fab’)2, quiméricos, humanizados o realizaciones de anticuerpos de cadena única. [0081] Los anticuerpos según la presente invención pueden modificarse de varias formas. De hecho, el término "anticuerpo" debe interpretarse como que cubre cualquier sustancia de unión con un dominio de unión con la especificidad requerida. Por lo tanto, la invención cubre fragmentos de anticuerpos, derivados, equivalentes funcionales y homólogos de anticuerpos, incluyendo moléculas sintéticas y moléculas cuyas forma imita a la del anticuerpo, permitiendo que se una a un antígeno o epítopo. [0082] Hablando de forma general, cuando se emplean anticuerpos para la detección, el anticuerpo puede portar una molécula indicadora. Alternativamente, la detección de la unión puede realizarse mediante el uso de un segundo anticuerpo capaz de unirse a un primer anticuerpo no marcado específico de tau. En este caso, el segundo anticuerpo está unido a una molécula indicadora.
20
[0083] Pueden usarse anticuerpos en cualquier sistema de inmunoensayo conocido en la materia, incluyendo, pero no limitándose a: radioinmunoensayos, ensayos en "sándwich", ensayos de enzimoinmunoanálisis de adsorción ELISA); inmunoensayos fluorescentes, inmunoensayos de proteína A, etc. Típicamente se usa un método por inmunotransferencia. Preferiblemente, el inmunoensayo se realiza en fase sólida, como sabría bien el experto en la materia. Por ejemplo, puede adsorberse un anticuerpo a, por ejemplo, una columna de ensayo, y entonces la muestra celular puede lavarse a través de la columna en unas condiciones adecuadas para permitir la unión al anticuerpo en fase sólida de cualquier agregado de la proteína de interés, por ejemplo, un agregado tau-tau. El exceso de reactivos se elimina lavando, y la unión de la proteína agregada a la columna puede detectarse mediante cualquier medio adecuado, por ejemplo, según se ejemplificó anteriormente y a continuación. [0084] Los anticuerpos monoclonales preferidos son como sigue:
- -
- los que reconocen el extremo N o Cdel epítopo de tau permiten medir la unión entre especies truncadas y completas de tau. Son especialmente útiles los anticuerpos que reconocen epítopos específicos humanos. Uno de dichos anticuerpos monoclonales (denominado 27/499) reconoce un epítopo específico humano localizado en la región entre la Gly-16 y la Gln-26 de tau, y permite así la medida de la unión entre las especies de tau completas, siempre que una derive de una fuente no humana (Lai (1995); "The role of abnormal phosphorylation of tau protein in the development of neurofibrillary pathology in Alzheimer’s disease", PhD Thesis, Universidad de Cambridge).
- -
- los que reconocen el fragmento de núcleo de tau truncado en la Glu-391. Un ejemplo es mAb 423 (Novak y col. (1993), loc. cit.). Este anticuerpo permite la detección de la unión de un fragmento de núcleo de tau truncada o que termina en la Glu-391 a un fragmento similar que termina en la Ala-390, que no es reconocido por mAb 423. Este truncamiento se produce de forma natural en el transcurso de la agrupación de los PHF en la enfermedad de Alzheimer (Mena y col. (1995), (1996), loc. cit.; Novak y col. (1993), loc. cit.; Mena y col. (1991), loc. cit.). Adicionalmente, cuando la tau se une a través del dominio de repetición in vitro, la digestión con una proteasa (por ejemplo, pronasa) genera un fragmento detectable mediante mAb 423 (véase Wischik y col, 1996, loc. cit.). En los aspectos preferidos de la presente invención, en lo que se refiere a la proteína tau, este anticuerpo puede usarse para distinguir la generación del fragmento producto escindido proteolíticamente (terminación Glu-391) a partir
21
de la expresión constitutiva del fragmento de plantilla (Ala-390).
- los que reconocen un epítopo genérico de tau en el dominio de repetición. Una realización preferida utiliza un anticuerpo (por ejemplo, MAb 7.51). Cuando va a detectarse una agregación tau-MAP2 o MAP2-MAP2, podría usarse un anticuerpo que detecte un epítopo genérico de MAP2. El anticuerpo 7.51 reconoce un epítopo genérico de tau ubicado en la antepenúltima repetición de tau (Novak y col. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 88, 5837-5841), que está ocluido cuando la tau está unida en una configuración inmunoquímica de tipo PHF, pero que puede ser expuesto tras un tratamiento con ácido fórmico (Harrington y col. (1990), (1991), loc. cit.; Wischik y col. (1995a), loc. cit.). La tau normal soluble, o la tau unida a microtúbulos, puede detectarse usando mAb
7.51 sin tratamiento con ácido fórmico (Harrington y col. (1991), loc. cit.; Wischik y col. (1995a), loc. cit.). La unión de la tau completa en el ensayo de unión tau-tau está asociada con la oclusión parcial del epítopo mAb 7.51.
[0085] El anticuerpo 27/342 reconoce un epítopo genérico de tau no específico de especie localizado entre la Ser-208 y la Ser-238 que está parcialmente ocluido en el transcurso de la interacción tau-tau (Lai, loc. cit.). [0086] Los sitios de unión de algunos anticuerpos monoclonales se muestran en la Figura 6.
Cribado de moduladores e inhibidores
[0087] Según se ha descrito anteriormente, la invención se refiere preferiblemente al uso de un sistema según se proporciona en este documento, en un procedimiento para modelar e identificar agentes terapéuticos para el tratamiento de las enfermedades discutidas en este documento. [0088] Un procedimiento típico para valorar la capacidad de un agente de modular la agregación y/o el procesado proteolítico de una proteína precursora en un producto en respuesta a una interacción con un fragmento de plantilla puede comprender:
- (a)
- proporcionar una célula o línea celular estable según se discutió anteriormente,
- (b)
- someter la célula al estímulo tal que la proteína precursora sea expresada en la célula y mediante lo que la interacción del fragmento de plantilla con la proteína precursora cause un cambio conformacional en la proteína tal que cause la agregación y el procesado proteolítico de la proteína precursora a un fragmento producto,
- (c)
- seguir la producción del fragmento producto en presencia del
22
agente,
(d) opcionalmente, comparar el valor obtenido en la etapa (c) con
un valor de referencia. [0089] El valor de referencia puede estar basado en la observación histórica, o puede basarse en los experimentos de control llevados a cabo paralelamente, por ejemplo, en los que un integrante del ensayo (fragmento de plantilla, proteína precursora, estímulo, agente) está modificado o ausente. [0090] Los diversos procedimientos descritos anteriormente pueden comprender la etapa adicional de correlacionar el resultado de la etapa (d) con la actividad moduladora del (los) agente(s). [0091] Por lo tanto, un procedimiento para identificar un modulador de la agregación de una proteína asociada con una enfermedad en el que la proteína experimenta una interacción conformacional inducida, puede comprender ejecutar un procedimiento para inducir la agregación, según se ha descrito anteriormente, en presencia de uno o más agentes sospechosos de ser capaces de modular (por ejemplo, inhibir o revertir) la agregación. El grado de agregación (y opcionalmente de procesado proteolítico) puede observarse en presencia o ausencia del agente, y correlacionarse los valores relativos con su actividad como modulador. [0092] Por ejemplo, puede añadirse una sustancia de prueba a un sistema celular según se ha descrito anteriormente, e incubarse las células durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la unión y para demostrar la inhibición de la unión. Entonces puede detectarse el complejo de tau unido, por ejemplo, usando un anticuerpo marcado adecuadamente, tal como MAb 7.51, en una inmunotransferencia del extracto celular total, o cualquier otro procedimiento detección adecuado. [0093] Cuando se emplea un procedimiento de cribado para este propósito, es decir, para la identificación de los compuestos moduladores/inhibidores, puede usarse un ensayo no competitivo o competitivo. Por ejemplo, en un ensayo competitivo de un tipo bien conocido en la materia, puede compararse el efecto de un inhibidor o modulador conocido en presencia o ausencia de sustancias de prueba o agentes adicionales, para determinar la capacidad de la sustancia de prueba de competir con el inhibidor/modulador conocido por unirse a la proteína de interés. Especificidad de inhibición [0094] Pueden usarse los procedimientos de cribado según este aspecto de la presente invención para cribar compuestos que demuestren las propiedades de inhibición competitiva selectiva de la agregación de proteínas relacionadas con
23
enfermedades (por ejemplo, tau-tau, tau-MAP2, u otra unión de proteínas), sin interferir en ninguna unión ’normal’ en la que participe la proteína precursora (por ejemplo, tau o MAP2 a tubulina, o por analogía, otras proteínas precursoras con sus compañeros de unión, en la medida en que éstos sean conocidos). [0095] Específicamente, en el caso de tau, un procedimiento para determinar cualquier posible interferencia de la unión de tau, MAP2 o un derivado de las mismas a tubulina por los potenciales inhibidores/moduladores, comprende poner en contacto una preparación de tubulina despolimerizada o microtúbulos de taxol estabilizados con el agente, seguido de la detección de la unión tau-tubulina o MAP2-tubulina. La unión tau-tubulina también podría demostrarse, por ejemplo, mediante una distribución citoesquelética normal, según se describe en, por ejemplo, el documento WO96/30766. Los procedimientos para la preparación de proteínas de tubulina o fragmentos de la misma, posiblemente en combinación con compañeros de unión, son conocidos en la materia y los describen, por ejemplo, Slobada y col. (1976, en: Cell Mobility (R. Goldman, T. Pollard y J. Rosenbaum, eds.), Cold Spring Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York, págs. 1171-1212). [0096] A los expertos en la materia se les ocurrirán procedimientos análogos para otras proteínas con funciones ’patológicas’ y ’normales’ a la luz de la presente divulgación.
Viabilidad celular
[0097] Cuando se desee, los procedimientos de la presente invención pueden incluir adicionalmente la etapa de ensayar la viabilidad de las células que expresan la proteína de plantilla y opcionalmente la proteína precursora, por ejemplo, mediante el uso de un kit de ensayo de lactato deshidrogenasa (Sigma). [0098] En el caso de que se esté investigando una agregación tau-tau, tau-MAP2 o MAP2-MAP2 (véase anteriormente, en ’especificidad’), esta etapa también puede proporcionar una indicación de cualquier interferencia del agente de prueba en la unión de la tau o la MAP2 a tubulina, dado que la inhibición o la interferencia de la unión tau-tubulina o MAP2-tubulina se correlaciona hasta cierto punto con una disminución en la capacidad de las células para dividirse, y por tanto, con una disminución en la viabilidad celular.
- [0099]
- Puede usarse la viabilidad celular para obtener un valor de la DL50 para el
- agente.
- [0100]
- Los inhibidores preferidos tendrán un índice terapéutico (DL50/B50
véase la discusión de la Figura 9) de al menos 2, 5, 10 ó 20.
24
Elección del agente de prueba
[0101] Los compuestos que se prueben pueden ser cualquiera del que se desee evaluar su actividad relevante. [0102] Los procedimientos pueden servir como un cribado primario, con objeto de identificar nuevos inhibidores/moduladores, o como cribado secundario con objeto de estudiar con más detalle inhibidores/o moduladores conocidos. [0103] Los agentes pueden ser compuestos químicos naturales o sintéticos. Los anticuerpos que reconocen un agregado de proteínas de tipo enfermedad de Alzheimer y/o que modulan la agregación de proteínas de tipo enfermedad de Alzheimer forman una clase de compuestos inhibidores o moduladores putativos con respecto al proceso de agregación. Más habitualmente, se probarán compuestos químicos relativamente pequeños, preferiblemente que sean capaces de atravesar la barrera hematoencefálica. Otras cualidades que pueden ser deseables para establecer junto con (antes, simultáneamente o después) del uso de la presente invención, incluyen: no tóxico para la médula ósea, mínimamente perjudicial de la actividad cardiovascular; mínima toxicidad hepática y renal; buena absorción oral; no metabolizado a una forma inactiva, y similares. Como serán conscientes los expertos en la materia, estas pruebas pueden realizarse sobre una base comercial mediante procedimientos bien establecidos para compuestos que se desean probar de esta forma. [0104] Para una sustancia de prueba típica y un modulador putativo, cuando sea posible, se determinará primero la solubilidad, por ejemplo, a partir del índice Merck. Cuando la sustancia sea soluble en disolución acuosa, puede prepararse una disolución madre concentrada, por ejemplo, a 5-20 µM en PBS. Inmediatamente antes de su uso, ésta puede diluirse con medio de cultivo tisular para dar una disolución madre de trabajo a, por ejemplo, 100 µM, e introducirse en células para dar una concentración final de entre 0-10 µM para la mayoría de los compuestos. Naturalmente, si se desea probar compuestos a una concentración mayor de 10 µM, la concentración de la disolución madre de trabajo se incrementará apropiadamente. [0105] Cuando la sustancia no sea soluble en disolución acuosa, las disoluciones madre pueden prepararse en un disolvente apropiado (determinado a partir del índice Merck o experimentalmente), por ejemplo, etanol a 5-29 nM. Esta puede diluirse de nuevo con medio de cultivo tisular e inmediatamente antes de su uso para dar una disolución de trabajo, por ejemplo, a una concentración de 100 µM, y añadirse a las células para rendir una concentración final de, por ejemplo, 0-10 µM para la mayoría de los compuestos de prueba. Como anteriormente, si los compuestos se van a probar a
25
una concentración mayor de 10 µM, la concentración de la disolución del trabajo se incrementará según sea apropiado. [0106] La persona experta apreciará que la cantidad de sustancia o compuesto de prueba que se añade en un ensayo de cribado según este aspecto de la invención, y de hecho la forma en que es introducida, puede ser determinada por los expertos en la materia, si fuera necesario mediante el uso de una serie de experimentos. Cuando el compuesto administrado y la línea celular tengan unas condiciones óptimas en conflicto (por ejemplo, en términos de pH, o de fuerza iónica, etc.) deberían ensayarse diversas condiciones para encontrar un nivel de compromiso óptimo. Las concentraciones iniciales pueden elegirse para que estén a un nivel que pueda usarse realmente en un contexto terapéutico, es decir, que no sean letales para un paciente (véanse los comentarios sobre las dosis, a continuación). A la luz de la presente divulgación, dicha metodología no presentará ninguna carga indebida para el experto en la materia.
Cribado de fenotiacinas
[0107] Según se describe en, por ejemplo, el documento WO96/30766, entre los agentes hallados capaces de inhibir la polimerización conformacional patológica inducida de proteínas tales como tau hay ciertas diaminofenotiacinas. Algunos ejemplos incluyen tales como tionina, azul de metileno (methylene blue, MB), cloruro de tolonio y azul de dimetilmetileno (dimethyl-methylene blue, DMMB), que son de particular interés como potenciales agentes terapéuticos para su uso en la prevención de la agregación tau-tau en enfermedades tales como la enfermedad de Alzheimer. [0108] Éste y otros aspectos adicionales de la invención se comprenderán mejor con referencia a las siguientes figuras y datos experimentales, aportados únicamente a modo de ejemplo.
Figuras
[0109]
Figura 1. Muestra una ilustración esquemática de la estructura de un filamento
helicoidal apareado (arriba) y la inmunoquímica de marañas neurofibrilares durante
la progresión de la enfermedad de Alzheimer (abajo).
Figura 2. Muestra un esquema conceptual en el que los factores de nucleación
críticos proporcionan una ’semilla’ que inicia la captura de tau, que se convierte
entonces en autocatalítica.
Figura 3. Muestra un modelo patógeno putativo de la enfermedad de Alzheimer.
La agregación de tau es un proceso próximo previo al fracaso en el transporte
26
axonal y la consiguiente muerte neuronal. La cascada de agregación de tau puede desencadenarse bien por un evento de sembrado/nucleación que surge de cambios cascada arriba, o bien a partir de mutaciones primarias en el gen de tau. Figura 4. Muestra cómo la inducción de la tau completa puede conducir a su conversión en el fragmento de 12 kD, siempre que haya algo de tau de 12 kD preexistente en la célula. Figuras 5a-b. Muestran una tabla que enumera proteínas que juegan un papel en enfermedades de agregación de proteínas. También se enumeran las propias enfermedades, el dominio de agregación y/o la mutación que se cree que está implicada, y el tamaño putativo (máximo) de la subunidad fibrilar. Se aportan una
o más referencias bibliográficas para cada proteína. Figura 6. Muestra una ilustración esquemática de los sitios de unión de varios anticuerpos monoclonales a diferentes formas de tau truncada en N y C. Figuras 7a-b. Muestran la secuencia de nucleótidos y la predicha de aminoácidos de una isoforma de proteína tau humana. La secuencia se dedujo a partir del ADNc del clon htau40. Figura 8. Muestra las estructuras de tionina, cloruro de tolonio, clorpromacina y tacrina. Figura 9. Aporta datos de ensayos celulares para diaminofenotiacinas, y una antroquinona relacionada estructuralmente, junto con los valores de la KI aparente, determinados según se describe en este documento. En las Figuras y Ejemplos de este documento se ha calculado un parámetro adicional, B50, para expresar la actividad de una forma relacionada directamente con las condiciones del ensayo basado en células, y proporcionar por lo tanto una indicación de la concentración tisular que se requeriría para conseguir la correspondiente actividad in vivo. El valor de B50 es la concentración del compuesto de prueba usado en el ensayo celular a la cual la producción relativa de la banda de 12 kD de la tau completa se redujo a un 50% de la observada en ausencia del compuesto. Hay una simple relación lineal entre el valor de la KI aparente y el valor de B50 como sigue:
B50 celular = 0,0217 x KI [0110] Con objeto de comparar la utilidad relativa de los compuestos como terapia, puede ser deseable calcular un valor de DL50. Cuando las propiedades inhibidoras son similares, los compuestos preferidos para su uso clínico pueden ser aquellos que tengan el mayor valor de DL50. Puede calcularse un índice terapéutico (RxIndx) para cada uno de los compuestos probados en los ensayos celulares como
27
sigue:
RxIndx = DL50 / B50 [0111] La toxicidad de los compuestos puede medirse mediante las cifras celulares después de 24 h de exposición al compuesto usando un kit ensayo de lactato deshidrogenasa TOX-7 (Sigma Biosciences), según las instrucciones del fabricante, después de lisar las células remanentes. Alternativamente puede usarse un kit de Promega UK (CytoTox 96), de nuevo según las instrucciones del fabricante. [0112] La Figura 10 muestra los resultados de usar tionina reducida en la presente invención, basándose en un conjunto de datos de 7 experimentos. Los datos celulares observados para la producción de la banda de 12 kD pueden ajustarse adecuadamente (es decir, coeficiente de relación observado frente al predicho > 0,9) a una función estándar que describe la inhibición de la unión tau-tau in vitro. Para obtener este ajuste deben realizarse dos suposiciones, que son coherentes con los resultados de otros estudios basados en células e in vitro:
1) la concentración intracelular de tau es de aproximadamente 500 nM;
2) la afinidad de unión tau-tau es de 22 nM. Usando estas suposiciones, la función para la actividad celular predicha a través de un modelo de inhibición estándar es:
Actividad = [tau] / ([tau] Kd * (1 + [tionina] / KI) Puede resolverse mediante procedimientos numéricos convencionales para derivar un valor de la KI aparente. Según se indica, el valor para la forma reducida de la tionina es 100 nM, que es esencialmente el mismo al observado para la unión tau-tau in vitro a una concentración de tau de 500 nM, cuando se sabe que el valor de la Kd para la unión tau-tau es de 22 nM. Por lo tanto, la actividad de la tionina, cuando la lectura es la producción del producto de truncamiento de 12 kD a partir de la tau completa, puede explicarse cuantitativamente sobre la base de la magnitud de la inhibición de la unión tau-tau que se produce a lo largo del dominio de repetición dentro de la célula. Esto confirma que la magnitud de la unión tau-tau determina la producción de una unidad tau del núcleo de los PHF proteolíticamente estable dentro de la célula. [0113] Todos los análisis celulares posteriores de las actividades de otros compuestos se comunican en el mismo formato estandarizado, con las mismas suposiciones relativas a la concentración intracelular de tau (500 nM) y a la afinidad de unión tau-tau (22 nM) a lo largo del dominio de repetición. [0114] La Figura 11 muestra los resultados para las condiciones en las que se han omitido los agentes reductores (es decir, tionina oxidada, cotéjese la Figura 10).
28
[0115] De nuevo, la actividad celular se predice a través de un modelo de inhibición estándar:
Actividad = [tau] / ([tau] Kd * (1 + [tionina oxid.] / KI) [0116] En este caso, la tionina tiene ahora un valor de KI aparente de 1.200 nM. Esto confirma que las diaminofenotiacinas requieren estar en la forma reducida para su actividad. Se extrajo una conclusión similar a partir del análisis de los datos de unión in vitro (resultados no mostrados). [0117] La Figura 12 muestra que usando unas condiciones reductoras o parcialmente reductoras, el azul de metileno parece ser mucho más activo en el ensayo basado en células que el predicho a partir de estudios in vitro en los que la duración del ensayo (1-2 horas) no había sido suficiente para conseguir la reducción. [0118] La actividad celular se predice de nuevo a través de un modelo de inhibición estándar:
Actividad = [tau] / ([tau] Kd * (1 + [MB] / KI) [0119] En el ensayo celular, el valor de la KI aparente para el azul de metileno es de 123 nM, que está en el mismo intervalo que la tionina y el cloruro de tolonio. Según se indica en la Figura 9, la correspondiente concentración de tejido cerebral (es decir, valor de B50) requerida para inhibir la agregación de tau sería de 2-3 µM. [0120] La Figura 13 muestra los correspondientes datos de actividad basados en células correspondientes al cloruro de tolonio reducido, indicando de nuevo que el valor predicho de KI derivado de los estudios in vitro puede usarse para describir la producción del fragmento de 12 kD a partir de la tau completa en células. [0121] La actividad celular se predice a través de un modelo de inhibición estándar:
Actividad = [tau] / ([tau] Kd * (1 + [TC] / KI) [0122] Esto proporciona una confirmación adicional de la validez del procedimiento de análisis matemático usado. [0123] La Figura 14 muestra que la DH12 (antroquinona), que está estructuralmente relacionada con las diaminofenotiacinas, es inactiva en las condiciones del ensayo. [0124] Las Figuras 15 y 16 muestran análisis similares a los aportados anteriormente en las Figuras 9-14, pero para la clorpromacina y la tacrina respectivamente. Usando las mismas suposiciones (concentración de tau de 415 nM, y Kd de la unión tau-tau de 22 nM), y la actividad celular predicha a través del modelo de inhibición estándar:
29
Actividad = [tau] / ([tau] Kd * (1 + [cpz] / KI) los valores de la KI aparente para clorpromacina y tacrina (2.117 nM y 802 nM, respectivamente) son mayores que los anticipados a partir de los estudios in vitro. [0125] La Figura 17 muestra la magnitud de la reducción de varios compuestos en presencia de DTT. [0126] La Figura 18 muestra el porcentaje de reducción del MB representado frente a la proporción de MB:Vitamina C. [0127] La Figura 19(a) muestra que, suponiendo una concentración tisular objetivo de 4 µM (es decir, 1,5 µg/g), es posible determinar, a partir de los datos de DiSanto y Wagner (1972), que se conseguirían concentraciones tisulares de este orden a una dosis IV de 0,11 mg/kg. [0128] La Figura 19(b) muestra un modelo para la distribución del MB tras una única dosis de 100 mg en un sujeto de 70 kg, suponiendo una absorción instantánea. [0129] La Figura 20 resume los resultados de la expresión transitoria de fragmentos de tau en células 3T3 y COS-7 basándose en los datos a partir de experimentos microscópicos y bioquímicos. [0130] La expresión de los fragmentos de tau recombinante en células eucariotas se realizó como sigue. Se examinaron ocho construcciones de tau, expresados transitoriamente en células 3T3 y en células COS-7 mediante inmunocitoquímica e inmunotransferencias. La magnitud de la expresión en cada tipo celular se expresó semicuantitativamente sobre la base de ambos conjuntos de resultados: -, no hay expresión detectable; ±, inmunorreactividad muy débil; de + a ++++, niveles crecientes de inmunorreactividad positiva. En todos los casos se usó mAb 7.51 con cada construcción para obtener los resultados. Además, se confirmó la especificidad para cada construcción usando un grupo de anticuerpos contra diferentes dominios de la proteína tau (mAbs 499, T14, Tau1, 342, 7.51, 423 y T46). Las secuencias de Kozak estaban ausentes en las primeras seis construcciones, pero estaban presentes en las construcciones de ADNc 7 y 8. [0131] La Figura 21 ilustra la expresión inducible de la tau humana completa en fibroblastos 3T6 en dos líneas celulares. La T40.22 muestra un bajo nivel de filtración de fondo de la tau completa en el estado no inducido ("U"), y altos niveles de expresión tras la adición de IPTG (es decir, inducida, "I"). La T40.37 muestra lo mismo, pero niveles de expresión menores sin inducción. [0132] La Figura 22 muestra un resultado de un sistema vector triple. Se introdujo un vector que permite un nivel de expresión constitutiva muy bajo del fragmento de 12
30
kD en las líneas celulares en las que ya se había conseguido la expresión inducible de la tau completa (de hecho, la línea celular T40.22 mostrada en la Figura 21, más arriba). Se introducen bajos niveles de IPTG para inducir la expresión de la tau completa. A 0 µM de IPTG, hay un nivel de expresión muy bajo de la banda de 12 kD, y una baja expresión de "filtración de fondo" de la tau completa. Como se induce progresivamente más tau completa introduciendo mayores niveles de IPTG, más tau completa es convertida a la especie de 12 kD. [0133] La Figura 23 muestra los efectos inhibidores de la tionina reducida. En cada conjunto de bandas, hay una producción inducible de la banda de 12 kD en presencia de concentraciones crecientes de niveles inductores de IPTG de la T40. Al aumentar la concentración de tionina, se suprime la producción de la banda de 12 kD a partir de T40. [0134] La Figura 24 muestra cuantitativamente los resultados de la Figura 23. En ausencia de tionina, la inducción de la T40 a unas concentraciones crecientes de IPTG conduce a un correspondiente incremento en la producción del fragmento de 12 kD. En presencia de tionina 2 µM, todavía hay inducción de la T40, pero no es convertida en el fragmento de 12 kD. [0135] La Figura 25 muestra los valores comparativos de la KI in vitro para diversos compuestos, en nM. Los valores de KI se refieren a las condiciones de ensayo en particular usadas (500:1 de DTT:compuesto, 120 minutos - véase en la Figura 17). [0136] Las Figuras 26 y 27 muestran el efecto inhibidor sobre la unión tau-tau de las fenotiacinas con 0, 2, 3 ó 0, 4, 6 grupos metilo, respectivamente. [0137] La Figura 28 muestra la derivación de dos parámetros útiles para medir la inhibición de la asociación tau-tau por los compuestos de prueba. STB es la unión estandarizada relativa a la observada en ausencia de compuesto, tomada como la media observada a 1 y 10 µg/ml. Según se describe en el documento WO96/30766, un valor de STB de 1,0 representa una unión equivalente a la observada en ausencia de compuesto, mientras que un valor de 0,2 indica que la unión se redujo a una media del 20% a las concentraciones del compuesto de prueba de 1 y 10 µg/ml. La LB50 es el log 10 de la proporción molar compuesto:tau que produce un 50% de la unión tau-tau en comparación con la observada en ausencia de compuesto (B50). [0138] La Figura 29 muestra la relación entre los parámetros STB y LB50. Puede demostrarse que STB es una función linear de LB50. [0139] STB es una función logarítmica de la proporción molar compuesto:tau a la que la unión tau-tau se reduce en un 50%.
31
[0140] LB50 es el log de la proporción molar del compuesto con respecto a tau a la que la unión tau-tau es el 50% de la observada en ausencia de compuesto
LB50 = 0,05 + (2,65 x STB) r = 0,95 [0141] La determinación de B50 in vitro requiere que haya un cierto grado de inhibición de la unión tau-tau, y se obtiene un valor del 50% por extrapolación. La determinación de STB no requiere dicho procedimiento de extrapolación. [0142] La Figura 30 muestra compuestos para los que se han determinado los valores de STB y B50. Suponiendo que la concentración total de tau en las células es de aproximadamente 500 nM (es decir, la concentración de htau usada en el ensayo), los valores de B50 proporcionan una aproximación en el ensayo in vitro de la concentración (es decir [500 x B50] nM) a la cual podría esperarse actividad en los sistemas celulares. [0143] La Figura 31 muestra la relación formal entre el valor de LB50 in vitro y el valor del log KI para la serie de diaminofenotiacina. [0144] La Figura 32 muestra varias especies de fragmentos y dobletes de tau que están presentes sin inducción ("U") y después de la inducción ("I") en una línea celular de la presente invención. Estas incluyen especies con unas movilidades equivalentes a 12/14 kD, -25/27 kD, -30/32 kD, -36/38 kD y �42/44 kD (véase el Ejemplo 3). [0145] La Figura 33(a) muestra cómo surge el fragmento de 12 kD a través del procesado proteolítico inducido por la plantilla de las moléculas de tau completas en las posiciones aproximadas mostradas por las cabezas de flecha. [0146] La Figura 33(b) muestra cómo surge la especie de 25/27 kD a través del procesado proteolítico inducido por la plantilla de las moléculas de tau completas en las posiciones aproximadas mostradas por las cabezas de flecha. [0147] La Figura 34 muestra una representación de las movilidades en gel aparentes de las especies de las Figuras 32-33 y sus longitudes en restos de aminoácidos. [0148] La Figura 35 muestra que los fragmentos de las Figuras 32-34 están a intervalos de -34 restos o de -17 restos, lo que es el equivalente de una única a repetición de tau, o a la mitad de ella. Todos los fragmentos pueden generarse a partir de un agregado heptamérico básico como un simple conjunto de escisiones proteolíticas que se producen en las posiciones indicadas por las puntas de flecha. [0149] La Figura 36 muestra estos mismos fragmentos en orden descendiente de longitud y creciente de movilidad en gel. [0150] La Figura 37 muestra que el DMMB es sorprendentemente potente en el
32
modelo celular. Su actividad inhibidora podía observarse tanto en ausencia de inducción por IPTG como después de la inducción (véase el Ejemplo 4). [0151] La Figura 38 muestra la actividad del DMMB en la expresión inicial de las especies de 12/14 kD, usando el mismo conjunto de suposiciones relativas a la concentración intracelular de tau y a la afinidad de unión tau-tau in vitro usadas en las Figs. 10 - 16. [0152] La actividad celular se predice a través de un modelo de inhibición estándar:
actividad = [tau] / ([tau] Kd * (1 + [DMMB] / Ki) [0153] El DMMB tiene una KI aparente dentro de la célula de 4,4 nM, y el valor celular de B50 es �100 nM.
Ejemplos
Materiales y procedimientos generales
Producción de líneas celulares 3T6H
[0154] Las células 3T6 fueron ECACC nº: 86120801, fibroblastos de embrión albino de ratón suizo. [0155] Para el sistema inducible, los experimentos emplearon Lac SwitchTM de Stratagene, usando el vector p3’SS para expresar la proteína represora Lac, y pOPRSVICAT para expresar la tau completa bajo el control del represor Lac. La expresión es inducida mediante la adición de IPTG. [0156] Inicialmente se transfectaron células 3T6, mediante electroporación, con el plásmido p3’SS, y se seleccionaron las colonias por su resistencia a higromicina. Se escogieron 5 clones que estaban expresando niveles variables de la proteína represora Lac (determinados mediante inmunocitoquímica), y también se conservaron las células no clonadas para comparación.
Producción del vector pOPRSVT40
[0157] La inserción de la T40 para su clonación en el vector pOPRSVICAT se preparó mediante PCR con polimerasa Vent (NEB) usando cebadores (mostrados a continuación) que incluían un sitio Not I y un codón de inicio o de detención, según fuera apropiado. El producto de la PCR y el vector pOPRSVICAT se cortaron con Not I y se purificaron. El vector se desfosforiló para impedir una religación, y la inserción se ligó en el vector usando protocolos estándar. [0158] La mezcla de ligación resultante se transfectó en células competentes de E. coli, y las células se colocaron en placas con amp. Las colonias se escogieron y se cuadricularon en una nueva placa con amp. Las colonias transferidas se llevaron a una
33
membrana de nailon Hybond-N de 0,45 µm (Amersham), y los posibles positivos se seleccionaron mediante hibridación de colonias usando dGA marcado con (α32P)dCTP (Amersham) (usando un kit de oligomarcaje (Pharmacia Biotech) y purificado en una columna Nap-10 (Pharmacia Biotech)). La hibridación se lleva a cabo a 65°C durante la noche en tampón de Church, seguido por dos lavados de 20 min con disolución de lavado de Church. Las colonias positivas, marcadas con la sonda radiactiva, se detectaron exponiendo las transferencias a una película de rayos X durante la noche a -70°C. [0159] Las colonias positivas se seleccionaron y se hicieron crecer, y después se comprobaron mediante PCR y una digestión de restricción para confirmar la presencia de la inserción. El uso de un único sitio de restricción para la clonación significa que la T40 puede insertarse en el vector en cualquier orientación. La orientación de las inserciones se determinó de forma que se seleccionaran las colonias con el vector conteniendo a la T40 en la orientación correcta para su expresión.
Cebadores usados
5’-3’ T40-Not I
3’-5’ T40- Not I
[0162] La secuencia complementaria de la secuencia T40 se muestra en mayúsculas, estando marcados los codones de inicio y de detención. El sitio Not I que se va a añadir se muestra subrayado. La secuencia remanente mostrada en minúsculas es un saliente de 13 pares de bases para permitir que la enzima Not I corte eficientemente. Esta era complementaria de la secuencia en el vector del plásmido hTau40 para permitir una unión eficiente de los cebadores.
Determinación de la orientación de la inserción
[0163] La orientación se determina usando una enzima de restricción que corta la inserción una vez y el vector como mucho unas pocas veces, y que proporciona un patrón de digestión de restricción diferente para cada orientación. La Hind III se ajusta
34
a estos criterios para pOPRSVT40. Si la inserción está ausente, se producen dos bandas de restricción. Si la inserción está presente se producen tres bandas, y el tamaño de las bandas depende de la orientación de la inserción, según se muestra a continuación.
Orientación directa (correcta) 5385 pb 1030 pb 381 pb
Orientación inversa 6101 pb 381 pb 314 pb Producción de células que expresan la T40 bajo el control de un promotor inducible [0164] El plásmido pOPRSVT40 se produjo y se purifico mediante centrifugación en gradiente de CsCl. Se transfectó (mediante electroporación) en células 3T6H (que expresaban la proteína represora Lac) producidas según se ha descrito anteriormente. Las células positivas se seleccionaron por su resistencia a G418 (a 500 µg/ml). Las colonias resistentes se escogieron y se hicieron crecer. El nivel de expresión de la T40 completa con y sin la adición de IPTG se determinó con anticuerpos anti-tau tanto por inmunocitoquímica como por inmunotransferencia Western. Producción de pZeo295-391 [0165] El plásmido pZeo295-391 se diseñó para expresar la proteína correspondiente al fragmento truncado de tau (restos 295-391; véase a continuación). Se usó un sistema constitutivo (pcDNA3.1 de InVitrogen, Holanda) - el plásmido proporciona resistencia al antibiótico zeocina. El ADNc de esta región se amplificó mediante una reacción en cadena de la polimerasa (PCR), usando cebadores oligonucleotídicos específicos (sentido y antisentido; véase a continuación). El cebador sentido contenía un sitio EcoRI, y el antisentido un sitio BamHI. Los fragmentos se subclonaron en pcDNA3.1 (-)zeo (Invitrogen, Holanda) que había sido digerido con EcoRI y BamHI. El ADN insertado está secuencia en dirección 3’ de una secuencia promotora de citomegalovirus y en dirección 5’ de una señal de poliadenilación. El plásmido contiene la secuencia de ADN para la expresión de resistencia a ampicilina y zeocina para la selección en bacterias y células eucariotas, respectivamente. La autenticidad del ADN insertado fue confirmada mediante una secuenciación completa de ambas hebras. Secuencia de nucleótidos y de aminoácidos del fragmento de tau truncada 295-391 [0166]
35
295 cebador sentido
5 391 cebador antisentido
[0169] Los codones de inicio y de detención están en cursiva, y los sitios de restricción EcoRI y BamHI que se van a añadir están subrayados.
10 Cultivo tisular de células para ensayo [0170] El medio usado era DMEM (con Glutamax I, piruvato, 4,5 g/l de glucosa) de Life Technologies, Escocia. Éste fue complementado con FCS al 10% (Helena BioSciences), 50 U/ml de penicilina, 50 µg/ml de estreptomicina, más un antibiótico adicional apropiado para la selección y el mantenimiento del plásmido pertinente. Las
15 concentraciones de antibiótico eran 200 µg/ml de higromicina (selección y mantenimiento de p3’SS), 500 µg/ml de G418 (selección y mantenimiento de
36
pOPRSVT40), 400 ó 200 µg/ml de zeocina (selección o mantenimiento de pZeo295391). [0171] Las células se hacen crecer a 37°C, en una atmósfera humidificada con un 5% de CO2. Las células se mantienen en placas de 10 cm, y se separan cuando se aproximan a confluencia. El medio se retira, las células se lavan con PBS y las células liberadas mediante tripsinización con 1 ml de disolución de tripsina/EDTA/plato de 10 cm. Las células se resuspenden en medio nuevo a una dilución de 1:10, u opcionalmente en un intervalo de diluciones desde 1:5 hasta 1:20 (desde aproximadamente 5.000 hasta 20.000 células/cm2). [0172] Para la prueba de fármacos, las células se colocan en placas de 6 pocillos o de 24 pocillos a una densidad inicial que les permitirá crecer hasta una confluencia del 50-80% en 24 horas. Los fármacos se añaden al pocillo a diversas concentraciones, la expresión de la tau completa es inducida mediante la adición de IPTG a 0 - 50 µM. Las células se hacen crecer durante 24 horas adicionales y después se recogen para su análisis mediante SDS PAGE/transferencia Western.
Preparación de la proteína tau
[0173] Se prepararon tau recombinante (clon htau40) y tau soluble en ácido perclórico extraídas de cerebro humano y de rata, según se ha descrito previamente (Goedert, M. & Jakes, R. (1990) EMBO J. 9: 4225; Goedert, M. y col. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 90: 5066).
Electroforesis en gel e inmunotransferencia
[0174] Las células crecidas según se ha esquematizado anteriormente se lavan una vez con PBS y después se lisan con 50 µl (placas de 24 pocillos) o 100 µl (placas de 6 pocillos) de tampón laemli. Las muestras se almacenan a -20°C, se hierven durante 4 min antes de revelarlas en geles de acrilamida al 15% usando el sistema de mini gel BioRad miniProtean III. La proteína se transfiere a una membrana de PVDF mediante transferencia Western usando el sistema tamponante CAPs. Las membranas se incuban en tampón de bloqueo (5% de polvo de leche desnatada (Marvel), 0,1% de Tween 20 en PBS) durante 1 h hasta toda la noche. La proteína tau se detecta incubando las membranas con mAb 7.51 diluido a 1:5 con tampón de bloqueo durante 1-3 h o durante la noche, lavando bien con PBS/Tween20 al 0,1%, incubando con HRP antiratón a una dilución de 1:5.000 en tampón de bloqueo durante 1 h, y lavando bien con PBS/Tween20 al 0,1%. El anticuerpo unido se detecta mediante una reacción de ECL detectada sobre hiperfilm de ECL (Amersham). [0175] Las transferencias se escanean a un ordenador con un escáner de mesa
37
Hewlett Packard Scanjet 6100C a 600 dpi y se guardan como archivos tiff. La densitometría de las bandas de T40 y dGAE se realiza con el programa Scananalysis en un Apple Power Mac G3.
Preparación de los fármacos
[0176] Tiamina, azul de metileno, DMMB y cloruro de tolonio se prepararon todos como una disolución madre 1 mM en ddH2O. Antes de su uso, se prepara una disolución madre diluida 100 µM en HBSS que se añade directamente al medio sobre las células. [0177] Para el fármaco oxidado, éste se prepara simplemente diluyendo la disolución madre 1 mM en HBSS y realizando una filtración esterilizante. [0178] Para el fármaco reducido, la disolución 1 mM se trata con ácido ascórbico y DTT para rendir el fármaco 0,5 mM, ácido ascórbico 50 mM y DTT 50 mM, esto se deja reposar durante 15 min (cambia de azul a incoloro) antes de preparar la disolución madre diluida. Esto se diluye en HBSS para rendir el fármaco 100 µM, ácido ascórbico 10 mM, DTT 10 mM y se realiza una filtración esterilizante. Las células se tratan con el fármaco a diversas concentraciones, pero para el fármaco reducido se mantienen las concentraciones de ácido ascórbico y DTT a 400 µM de principio a fin usando las cantidades apropiadas de disolución madre reducida 100 µM, disolución madre oxidada 100 µM y disolución madre de ácido ascórbico/DTT 10 mM.
Electroforesis en gel-SDS e inmunotransferencia
[0179] Los procedimientos estándar de electroforesis e inmunotransferencia se usaron según se ha descrito previamente (Wischik, C. M. y col. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 85: 4506; Novak, M., y col. (1993) EMBO J. 12: 365; Jakes, R. y col. (1991) EMBO J. 10: 2725). Las inmunotransferencias se revelaron con el kit ABC (Vector Laboratories). Los anticuerpos monoclonales (mAbs) 7.51, 21.D10, 499 y 342 se usaron como fluido del sobrenadante del cultivo de hibridoma sin diluir. Se usó mAb AT8 (Innogenetics, Bélgica) a una dilución de 1/1.000. mAbs anti-tau 7.51 (que reconoce un epítopo en la última repetición; véase Novak, M. y col. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 88: 5837), 423 (que reconoce una tau truncada C-terminalmente en el residuo Glu-391; véase Wischik, C. M. y col. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU.
85: 4506; Novak, M. y col. (1993) EMBO J. 12: 365), 499 (que reconoce un segmento de tau específico humano entre los restos Gly-14 y Gln-26; véase Wischik, C. M. y col.(1996) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 93: 11213), y 342 (que reconoce un segmento entre los restos Ser-208 y Pro-251). El mAb 21.D10 se enfrentó al extracto cerebral A68-tau (Lee, V. M.-Y. y col. (1991) Science 251: 675).
38
Ensayo de unión de tau
[0180] Esto se llevó a cabo básicamente según se describe en Wischik, C. M., y col. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 93: 11213. La tau en fase sólida (0-20 µg/ml) se recubrió en placas de microvaloración de 96 pocillos de cloruro de polivinilo con un tampón de carbonato 50 mM a 37°C durante 1 h. La placa se lavó dos veces con Tween 20 al 0,05%, y después se bloqueó con Marvel al 2% en PBST durante 1 h a 37°C. Después de lavar de nuevo, la placa se incubó durante 1 h a 37°C con tau en fase acuosa (0 - 300 µg/ml en PBST que contiene gelatina al 1%). En la presente solicitud también se añadió DTT 1 mM. [0181] La placa se lavó dos veces y se incubó durante 1 h a 37°C con los mAb 499 ó 342, se diluyó con un volumen igual de Marvel al 2% en PBST. Después de lavar, se incubó anticuerpo de cabra dirigido contra IgG de ratón conjugada con peroxidasa de rábano picante (1/1.000 en PBST) durante 1 h a 37°C. La placa se lavó y se incubó con disolución de sustrato que contenía tetrametilbencidina y H2O2 y se midió el índice de cambio en la absorbancia medida usando una lector de placas Vmax (Molecular Diagnostics, California) según se ha descrito previamente (Harrington, C.
R. y col. (1990) J. Immunol. Meth. 134: 261). Cada experimento se realizó por triplicado e incluyó controles en los que estaban ausentes la tau en fase sólida y en fase acuosa, y también con una de las dos ausentes.
Análisis de datos [0182] Esto se realizó según se describe en Wischik y col. (supra), y las curvas se ajustaron según la ecuación de Langmuir con los programas Kaleidagraph (Synergy, Filadelfia) o Systat (SPSS Inc., Chicago) usando una aproximación cuasi-newtoniana. Los coeficientes de correlación del ajuste de las curvas se proporcionan en las Figuras. Ejemplo 1 - expresión constitutiva de la tau completa, truncada y mutada [0183] Se postuló que la expresión de la tau en líneas celulares eucariotas generaba un modelo celular de agregación de tau en condiciones fisiológicas que no adolecía de las limitaciones de las metodologías basadas en la lipofectina. Esto implica la expresión de tau completa y fragmentos de tau truncada tanto para tau normal como para tau portadora de mutaciones patógenas.
Tau completa
[0184] Cuando se transfectó tau completa normal (T40) en células (3T3 y NIE115), se expresó y se implicó en la agrupación de la red de microtúbulos dentro de las células.
Tau truncada
39
[0185] Inicialmente se transfectó el ADNc del fragmento de tau truncada del núcleo de los PHF, correspondiente al fragmento 297-391, en fibroblastos 3T3 no neuronales: fue seleccionada esta tau truncada dado que: (i) está presente en el núcleo de los PHF; (ii) se detecta en forma de depósitos en tejido cerebral de la AD durante las etapas tempranas de la enfermedad; (iii) es capaz de soportar la captura catalítica y la propagación de la captura de la tau in vitro. Subsiguientemente se realizó una serie de transfecciones en las que se varió la magnitud del truncamiento en los extremos N o C, basada parcialmente en las propiedades inmunoquímicas de la molécula de tau. Se crearon seis construcciones con truncamientos en los N-terminales (186-441; 297441), en los C y N-terminales (186-391; 297-391) y en el C-terminal (1-391). El patrón de inmunorreactividad de las seis construcciones con un grupo limitado de anticuerpos fue capaz de discriminar todos los fragmentos de tau generados de este modo. [0186] Las construcciones se expresaron en células eucariotas transitoriamente (usando pSG5 como vector) y establemente (usando pIF2 y pZeo como vectores). Los transfectantes estables se seleccionan sobre la base de resistencia a los antibióticos geneticina y zeocina para pIF2 y pZeo, respectivamente. El análisis de los epítopos se realizó sobre proteínas expresadas bacterialmente usando pRK172 como vector. La Figura 20 resume los resultados para diversos fragmentos en células 3T3 y COS-7. Los resultados adicionales mostraron que la expresión de las dos formas de la tau en la misma célula puede afectar al patrón de inmunorreactividad. Por ejemplo, la expresión estable de 1-391 y 295-391 da como resultado la aparición de manojos anormales dentro de la célula. Sin embargo, mantener dichas células en un estado estable y reproducible fue difícil.
Tau mutada
[0187] Se usó una mutagénesis de la tau completa para generar mutaciones clínicas conocidas. Estas fueron subclonadas en pIF2 y se generaron transfectantes estables en células 3T3 y NIE para varias de las mutaciones, incluyendo aquellas que afectaban a las propiedades de agrupación en microtúbulos de tau (G272V, V337M, P301 S, R406W) y S305N, lo que afecta al empalme alternativo del gen de la tau in vivo. En general, las células que expresaban la tau completa portaban mutaciones que mostraban el marcaje de la red de microtúbulos, y eran indistinguibles de las células transfectadas con la tau natural. Las líneas celulares que expresaban ciertos fragmentos de tau truncada incluían mutaciones que mostraron ser inestables.
Conclusión
[0188] En resumen, la expresión constitutiva de tau truncada en células eucariotas
40
demostró ser difícil de conseguir. Aunque los sistemas de transfección transitoria permitían la optimización de la expresión de tau mediante la manipulación de los consensos de Kozak que rodean al codón de iniciación de 297-tau, la expresión de, por ejemplo, 297-391, todavía era modesta, sugiriendo algunas propiedades tóxicas inherentes del fragmento. Las transfecciones estables reiteraban esta conclusión. Este último sistema demostró que el truncamiento en los N o C-terminales dio como resultado una propensión ligeramente mayor de la tau para agruparse en depósitos amorfos en lugar de en una red microtubular. La expresión estable de combinaciones de fragmentos de tau también genera agregados dentro del citoplasma de las células, pero este sistema no era fácilmente reproducible. Ejemplo 2 - expresión inducible de tau truncada [0189] En un intento adicional de crear un sistema estable y reproducible sin la toxicidad asociada a la expresión constitutiva, se intentó una expresión inducible del fragmento de la tau del núcleo de los PHF (es decir, 297-391 - que es de 12 kD). [0190] Se intentaron varios sistemas inducibles para la expresión de proteínas en células eucariotas, aunque el sistema preferido fue el sistema "lac switch". En este sistema se incorporan dos vectores en las células, típicamente fibroblastos 3T3 o 3T6 que no expresan ninguna proteína tau endógena. El primero, el vector p3’SS, codifica para la expresión constitutiva del gen lac I, y los expresores se seleccionan sobre la base de resistencia a higromicina. El segundo, pOPRSVICAT, incorpora el ADN que codifica el fragmento de la proteína tau bajo el control de un fuerte promotor RSV que contiene las secuencias de operador del operón Lac. Las células que incorporan este vector se seleccionan sobre la base de resistencia a neomicina. Las células que han incorporado ambos vectores tienen la propiedad de que la expresión constitutiva de lac I impide la expresión de la proteína incorporada (es decir, la tau) controlada por el operón Lac. La adición del azúcar IPTG compite por la unión del lac I al operón Lac, y por lo tanto permite la expresión de la proteína tau. [0191] Se llevó a cabo la expresión inducible del fragmento de 12 kD en dos líneas celulares. Éstas no mostraron unos niveles apreciables de expresión de proteína tau hasta después de 3 días de tratamiento con IPTG, etapa en la que aparecieron de repente altos niveles de 12 kD, formándose agregados intracelulares que rápidamente destruyeron la célula. El proceso de agregación fue, como se esperaba, una progresión no lineal desde un bajo nivel de expresión hasta una acumulación repentina de agregados tóxicos sin ninguna gradación clara, haciendo que la agregación y la toxicidad fueran imposibles de controlar. Esta progresión no lineal impidió un control
41
apropiado del sistema. Ejemplo 3 - expresión de tau en líneas celulares estables según la invención [0192] A la vista de los resultados anteriores, se usó un sistema adicional como sigue. La línea celular de cultivo tisular DH 19.4.1.4 y los clones de la misma se basaron en células 3T6 (ECACC nº 86120801 fibroblastos de embrión albino de ratón suizo) que expresaban cuatro repeticiones de la tau humana completa bajo el control de un promotor inducible, y una tau humana truncada (295-391) bajo el control de un promotor constitutivo. [0193] Las células que expresan la T40 bajo el control de un promotor inducible, T40.22.10, fueron transfectadas (mediante lipofección) con el plásmido pZeo295-391. Las células positivas fueron seleccionadas por su resistencia a zeocina a 400 µg/ml. La expresión de la tau truncada sobre un trasfondo de expresión inducible de la tau completa fue confirmada mediante un análisis por inmunotransferencia Western con Mab 7.51. [0194] La Figura 21 ilustra la expresión inducible de la tau humana completa sólo en fibroblastos 3T6 en dos líneas celulares. T40.22 muestra un bajo nivel de filtración de fondo de la tau completa en el estado no inducido ("U"), y altos niveles de expresión tras la adición de IPTG (es decir, inducido, "I"). T40.37 muestra lo mismo, pero menores niveles de expresión sin inducción. La Figura 22 muestra los resultados de un sistema vector triple. Se introdujo un vector que permite un nivel de expresión constitutiva muy bajo del fragmento de 12 kD en las líneas celulares en las que ya se había conseguido la expresión inducible de la tau completa (T40.22 mostrada en la Figura 21). La Figura 22 muestra lo que sucede cuando se introducen bajos niveles de IPTG para inducir la expresión de la tau completa. Con 0 µM de IPTG hay un nivel de expresión muy bajo de la banda 12 kD, y una baja expresión de "filtración de fondo" de la tau completa. Como se induce progresivamente más tau completa introduciendo unos niveles mayores de IPTG, más tau completa es convertida en la especie de 12 kD, y se producen más fragmentos intermedios de mayor peso molecular (descritos con más detalle en las Figs. 35 y 36). [0195] El examen de la línea celular inducible T40 original (T40.22.10), que no contenía el vector de la expresión constitutiva del fragmento de 12 kD, muestra que la especie de 12 kD no es producida como un subproducto del truncamiento de la inducción de la tau completa. El incremento en la expresión de la banda de 12 kD tras la inducción de la T40 sólo se observó en las células con un bajo nivel de expresión previa del fragmento de 12 kD (DH19.4.1.4.6). Esto es, el 12 kD preexistente
42
proporciona un plantilla para la producción de más 12 kD tras la inducción de la tau completa. También puede aparecer un doblete adicional con una movilidad aparente en gel de -25/27 kD cuando las células están en un estado no inducido (por ejemplo, en la línea celular denominada DH 19.4.1.4A.B2). Después de la inducción con IPTG, puede parecer una serie adicional de dobletes, con unas movilidades en gel de -30/32 kD, -36/38 kD y �42/44 kD. [0196] Estas especies se muestran en la Figura 32 tanto sin inducción ("U") como después de la inducción ("I"). También se muestran los patrones de inmunorreactividad de estos fragmentos observados con mAb 342 y un anticuerpo policlonal C-terminal T46 que reconoce epítopos localizados entre los restos Ser422 y Leu441. [0197] La derivación de los fragmentos observados en el estado no inducido (es decir, 12/14 kD y 25/27 kD) puede explicarse mediante referencia a la Figura 33. [0198] La Figura 33(a) muestra cómo surge el fragmento de 12 kD a través del procesado proteolítico inducido por la plantilla de las moléculas de tau completas en las posiciones aproximadas mostradas por las cabezas de flecha. [0199] En el caso de las especies de 25/27 kD, estos fragmentos no pueden representar dímeros de las especies de 12/14 kD, ya que estos fragmentos son inmunorreactivos con la T46. Por lo tanto, debe surgir un producto proteolítico adicional de la proteína tau agregante completa a través de las escisiones que se producen en las posiciones aproximadas mostradas por las cabezas de flecha de la Figura 33(b). [0200] Después de la inducción (Figura 32, I), se observan las series de dobletes adicionales. La derivación de estos fragmentos adicionales puede comprenderse mejor con referencia a las Figuras 34-36. [0201] La Figura 34 muestra una representación de las movilidades aparentes en gel de estos fragmentos y sus longitudes en restos de aminoácidos, indicando que las movilidades aparentes en gel pueden entenderse en términos de un conjunto característico de longitudes de fragmento. [0202] Según se ilustra en la Figura 35, todos estos fragmentos son, a intervalos, restos de -34 o restos de -17, lo que es equivalente a una única repetición de tau, o a la mitad de ella. Todos los fragmentos generados pueden entenderse por tanto que todos los restos surgen de un simple conjunto de escisiones proteolíticas que se producen en las posiciones indicadas por las cabezas de flecha de la Figura 35 a partir de un agregado heptamérico básico, formado según se muestra en la Figura. En este
43
diagrama, los fragmentos surgen como el conjunto combinatorio completo de las escisiones propuestas que se producen en las 3 posiciones aproximadas posibles mostradas por las cabezas de flecha en cualquier extremo del agregado. También están tabulados los correspondientes patrones de inmunorreactividad predichos observados con mAb 342 y T46 asociados con estos fragmentos. [0203] La Figura 36 muestra estos mismos fragmentos en orden descendiente de longitud y creciente de movilidad en gel. Aunque el agregado heptamérico se muestra por conveniencia como surgido completamente a partir de las moléculas de tau completas, se apreciará que el fragmento de 12/14 kD podría estar interpuesto dentro del agregado propuesto, sustituyendo a algunos de los compañeros de unión, y que el patrón preciso de inclusión de estos fragmentos cortos en el agregado determinará qué fragmentos precisos del conjunto completo predominan en un caso dado. Por lo tanto, la producción de esta familia de fragmentos proteolíticos se entiende mejor como un posible repertorio que puede representarse de diversas formas dentro de la célula. Ejemplo 4 - efectos inhibidores de los compuestos sobre la producción del fragmento proteolítico [0204] Habiendo conseguido un sistema celular estable en el que poder controlar la producción del fragmento de 12 kD (y otros), se usó este modelo para probar los efectos inhibidores de la tiamina reducida. Esto se muestra en la Figura 23. En cada conjunto de bandas hay una producción inducible de la banda de 12 kD en presencia de concentraciones crecientes de IPTG que induce mayores niveles de T40. Al aumentar la concentración de tionina, se suprime la producción de la banda de 12 kD a partir de la T40. Esto se muestra cuantitativamente en la Figura 24. En ausencia de tionina, la inducción de T40 a concentraciones crecientes de IPTG conduce a un correspondiente incremento en la producción del fragmento de 12 kD. En presencia de tionina 2 µM, todavía hay inducción de la T40, pero no se convierte en el fragmento de 12 kD. [0205] Como la propia tionina reducida es tóxica, es necesario un control para reducir los niveles de la T40 inducida por la correspondientes dosis de IPTG a mayores niveles de tionina. Esto puede conseguirse determinando la proporción de 12 kD:T40, lo que permite promediar los datos a lo largo de todos los niveles de IPTG y muestra una reducción dependiente de la dosis en el nivel de 12 kD relativa a la tau completa. [0206] En las Figuras 9 a 16 se muestran las actividades de varios compuestos en el ensayo de T40/12 kD. [0207] Los resultados se expresan en términos de la proporción de 12 kD:T40 tras la inducción de la tau completa (T40) mediante el tratamiento de las células con IPTG
44
(0, 10, 25, 50 µM) en presencia de tionina o cloruro de tolonio introducidos a las concentraciones mostradas, en presencia de agentes reductores (DTT/ascorbato 200 µM), o clorpromacina o tacrina introducidas sin agentes reductores. Como puede observarse, la tionina y el cloruro de tolonio producen esencialmente una inhibición idéntica, mientras que la clorpromacina o la tacrina no son inhibidoras en el mismo intervalo de concentración. En experimentos de control se probó el efecto de los agentes reductores solos, que no mostraron una diferencia significativa observada en la proporción 12 kD:T40, en presencia sólo de agentes reductores. [0208] También se examinaron las propiedades de la línea celular que produce los productos de degradación de mayor peso molecular con MB y DMMB (azul de dimetilmetileno). [0209] Como puede observarse en la Figura 37, el DMMB demostró ser sorprendentemente potente en el modelo celular. Su actividad inhibidora pudo observarse tanto en ausencia de la inducción por IPTG como tras la inducción. El tratamiento con DMMB 1 µM suprimió efectivamente todos los productos de degradación dentro de la célula. Una experiencia adicional con MB y DMMB ha demostrado que incluso la producción basal aparente para las especies de 12/14 kD está ampliamente determinada por la agregación. Esto es, la producción constitutiva del fragmento de 295-391 está por sí misma bien por debajo del nivel de detección mediante inmunotransferencia, o bien está estabilizada por una agregación espontánea, de forma que alcanza niveles dentro de la célula que pueden ser detectados por inmunotransferencia. Alternativamente, los niveles basales aparentes del fragmento de 12/14 kD observados sin inducción por IPTG y en ausencia del tratamiento con un inhibidor de la agregación de la tau pueden por sí mismos ser dominados por la producción dependiente de la agregación por plantilla a partir de niveles de filtración de la T40 producida en ausencia de inducción. Cualquiera que sea la combinación de factores que determine los niveles del fragmento de 12/14 kD en la condición inicial, su expresión aparente puede eliminarse esencialmente, junto con los productos de agregación de mayor peso molecular, mediante un potente inhibidor de la agregación tal como DMMB. Estos resultados confirman adicionalmente que la producción de los fragmentos proteolíticos de mayor peso molecular (es decir, 30/32, 36/38, 42/44 kD) también depende de las interacciones de unión críticas tau-tau que se producen a lo largo del dominio de repetición, según se muestra en las Figuras 33, 35 y 36. [0210] La Figura 46 muestra la actividad del DMMB sobre la expresión basal de las especies de 12/14 kD, usando el mismo conjunto de suposiciones relativas a la
45
concentración intracelular de tau y a la afinidad de unión tau-tau in vitro usado en las Figs. 10 - 16. En este caso se encuentra que el DMMB tiene una KI aparente dentro de la célula de 4,4 nM, y el valor celular de B50 es de �100 nM. Esto indica que el DMMB es altamente potente dentro del ambiente celular. Ejemplo 5 - comparación de los efectos inhibidores de los compuestos producidos y oxidados [0211] Se usó el modelo matemático usado para los datos in vitro para analizar los efectos de las sustancias de prueba en el ensayo celular T40:12kD. Usando los valores conocidos para las Kd y KI a partir de los datos in vitro, se usó la expresión indicada para encontrar solución a la concentración intracelular de la tau completa (véase, por ejemplo, la Figura 10). [0212] Se encontró que ésta era de aproximadamente 500 nM, que está en el intervalo esperado a partir de los estudios de la tau en cerebro y sistemas celulares. Se obtuvo un buen ajuste con los datos experimentales, lo que implicaba que para alguno de los compuestos, la inhibición de la producción de la tau truncada dentro de la célula podía ser predicha a partir de los valores aproximados de las Kd y KI determinados experimentalmente in vitro. Ejemplo 6 - examen de las propiedades inhibidoras de las diaminofenotiacinas [0213] En estudios in vitro, los inhibidores más activos de la unión tau-tau identificados eran las formas reducidas de las diaminofenotiacinas con 0, 2 ó 3 grupos metilo. La Figura 25 muestra las formas reducidas de dichos compuestos. Las correspondientes curvas de unión tau-tau se muestran en función de la proporción molar con respecto a tau en las Figuras 26 y 27. Según se muestra, los compuestos de las "series desmetiladas" (0, 2 ó 3 grupos metilo) producen una inhibición de aproximadamente 50% de la unión of tau-tau (mostrada en el eje vertical) a unas proporciones molares de 3:1 - 4:1 de compuesto:tau ’AMR’ mostradas en una escala logarítmica en el eje horizontal). La principal proporción molar para la inhibición del 50% de la unión tau-tau para este grupo de compuestos es de 4:1. [0214] Las diaminofenotiacinas con 4 ó 6 grupos metilo (el "grupo metilado") tienen una acción bifásica, con una mejora de la unión tau-tau a una concentración menor, y una inhibición de la unión tau-tau a concentraciones mayores (Figura 27). Estos compuestos requieren por tanto unas proporciones molares mucho mayores para efectuar la inhibición del 50% de la unión tau-tau. [0215] También se llevó a cabo el examen de otras características del compuesto diaminofenotiacina. Se encontró que la sustitución del nitrógeno heterocíclico o de los
46
átomos de azufre interfería gravemente con la potencia inhibidora de los compuestos. Asimismo, se encontró que la eliminación de los grupos diamino era perjudicial para la actividad inhibidora. Parecía por tanto que las estructuras diamino y heterocíclica de NB y S son importantes para la actividad de las moléculas en la inhibición de la unión tau-tau. [0216] Para comparar, se usaron dos procedimientos para determinar la actividad inhibidora en el ensayo tau-tau: STB es la media de unión tau-tau observada a 1 y 10 pg/ml de compuesto a unas concentraciones estándar de tau de 488 nM; LB50 es el log10 de la proporción molar de compuesto:tau que produce un 50% de inhibición de la unión tau-tau (Figura 28). Según se muestra en la Figura 29, hay una fuerte correlación entre los valores STB y LB50 para un intervalo de compuestos, siendo la clorpromacina y la riboflavina dos casos atípicos (véanse también las Figuras 30 y 31). Referencias
Abrahamson, M., Jonsdottir, S., Olafsson, I. & Grubb, A. (1992) Hereditary cystatin C amyloid angiopathy identification of the disease-causing mutation and specific diagnosis by polymerase chain reaction based analysis. Human Genetics 89, 377-380.
Booth, D. R., Sunde, M., Bellotti, V., Robinson, C. V., Hutchinson, W. L., Fraser, P. E., Hawkins, P. N., Dobson, C. M., Radford, S. E., Blake, C. C. F. & Pepys, M. B. (1997) Instability, unfolding and aggregation of human lysozyme variants underlying amyloid fibrillogenesis. Nature 385, 787-793.
Carrell, R. W. & Gooptu, B. (1998) Conformational changes and disease - serpins, prions and Alzheimer’s. Current Opinion in Structural Biology 8, 799-809.
Chiti, F., Webster, P., Taddei, N., Clark, A., Stafani, M., Ramponi, G. & Dobson, C. (1999) Designing conditions for in vitro formation of amyloid protofilaments and fibrils. Proceedings of the National Academy of Sciences, EE.UU. 96, 3590-3594.
Czech, C., Tremp, G. & Pradier, L. (2000) Presenilins and Alzheimer’s disease: biological functions and pathogenic mechanisms. Progress in Neurobiology 60, 363
384.
47
Davis, R. L., Shrimpton, A. E., Holohan, P. D., Bradshaw, C., Feiglin, D., Collins, G.
H., Sonderegger, P., Kinter, J., Becker, L. M., Lacbawan, F., Krasnewich, D., Muenke,
M., Lawrence, D. A., Yerby, M. S., Shaw, C. -M., Gooptu, B., Elliott, P. R., Finch, J.
T., Carrell, R. W. & Lomas, D. A. (1999) Familial dementia caused by polymerization
of mutant neuroserpin. Nature 401, 376-379.
DiFiglia, M., Sapp, E., Chase, K. O., Davies, S. W., Bates, G. P., Vonsattel, J. P. &
Aronin, N. (1997) Aggregation of huntingtin in neuronal intranuclear inclusions and
dystrophic neurites in brain. Science 277, 1990-1993.
Dische, F. E., Wernstedt, C., Westermark, G. T., Westermark, P., Pepys, M. B.,
Rennie, J. A., Gilbey, S. G. & Watkins, P. J. (1988) Insulin as an amyloid-fibril protein
at sites of repeated insulin injections in a diabetic patient. Diabetologia 31, 158-161.
Gasset, M., Bladwin, M. A., Lloyd, D. H., abriel, J. -M., Holtzman, D. M., Cohen, F.
E., Fletterick, R. & Prusiner, S. B. (1992) Predicted a-helical region of the prion
protein when synthesized as peptides form amyloid. Proceedings of the National
Academy of Sciences, EE.UU. 89, 10940-10944.
Glenner, G. G. & Wong, C. W. (1984) Alzheimer’s disease: initial report of the
purification and characterisation of a novel cerebrovascular amyloid protein.
Biochemical and Biophysical Research Communications 120, 885-890.
Goate, A., Chartier-Harlin, M. -C., Mullan, M., Brown, J., Crawford, F., Fidani, L.,
Giuffra, L., Haynes, A., Irving, N., James, L., Mant, R., Newton, P., Rooke, K.,
Roques, P., Talbot, C., Pericak-Vance, M., Roses, A., Williamson, R., Rossor, M.,
Owen, M. & Hardy, J. (1991) Segregation of a missense mutation in the amyloid
precursor protein gene
with familial Alzheimer’s disease. Nature 349, 704-706.
Gorevic, P. D., Casey, T. T., Stone, W. J., DiRaimondo, C. R., Prelli, F. C. &
Frangione, B. (1985) b-2 Microglobulin is an amyloidogenic protein in man. Journal of
Clinical Investigation 76, 2425-2429.
Gustavsson, A., Engstrom, U. & Westermark, P. (1991) Normal transthyretin and
48
synthetic transthyretin fragments form amyloid-like fibrils in vitro. Biochemical and Biophysical Research Communications 175, 1159-1164.
Hutton, M., Lendon, C., Rizzu, P., Baker, M., Froelich, S., Houlden, H., Pickering- Brown, S., Chakraverty, S., Isaacs, A., Grover, A., Hackett, J., Adamson, J., Lincoln, S., Dickson, D., Davies, P., Petersen, R.C., Stevens, M., de Graaf, E., Wauters, E., van Baren, J., Hillebrand, M., Joosse, M., Kwon, J. M., Nowotny, P., Che, L. K., Norton, J., Morris, J. C., Reed, L. A., Trojanowski, J. Q., Basun, H., Lannfelt, L., Neystat, M., Fahn, S., Dark, F., Tannenberg, T., Dodd, P. R., Hayward, N., Kwok, J. B. J., Schofield, P. R., Andreadis, A., Snowden, J., Craufurd, D., Neary, D., Owen, F., Oostra, B.A., Hardy, J., Goate, A., van Swieten, J., Mann, D., Lynch, T. & Heutink, P. (1998) Association of missense and 5’-splice-site mutations in tau with the inherited dementia FTDP-17. Nature 393, 702-705.
Johansson, B., Wernstedt, C. & Westermark, P. (1987) Atrial natriuretic peptide deposited as atrial amyloid fibrils. Biochemical and Biophysical Research Communications 148, 1087-1092.
Lomas, D. A., Evans, D. L., Finch, J. T. & Carrell, R. W. (1992) The mechanism of Z a1-antitrypsin accumulation in the liver. Nature 357, 605-607.
Maury, C. P. & Baumann, M. (1990) Isolation and characterization of cardiac amyloid in familial amyloid polyneu ropathy type IV (Finnish): relation of the amyloid protein to variant gelsolin. Biochimica et Biophysica Acta 1096, 84-86.
Paulson, H. L. (1999) Human genetics ’99: trinucleotide repeats. American Journal of Human Genetics 64, 339-345.
Pepys, M. B., Hawkins, P. N., Booth, D. R., Vigushin, D. M., Tennent, G. A., Soutar,
A. K., Totty, N., Nguyen, O., Blake, C. C. F., Terry, C. J., Feest, T. G., Zalin, A. M. & Hsuan, J. J. (1993) Human lysozyme gene mutations cause hereditary systemic amyloidosis. Nature 362, 553-557.
Polymeropoulos, M. H., Lavedan, C., Leroy, E., Ide, S. E., Dehejia, A., Dutra, A., Pike, B., Root, H., Rubenstein, J., Boyer, R., Stenroos, E. S., Chandrasekharappa, S.,
49
Athanassiadou, A., Papaetropoulos, T., Johnson, W. G., Lazzarini, A. M., Duvoisin, R. C., Di Iorio, G., Golbe, L. I. & Nussbaum, R. L. (1997) Mutation in the a-synuclein gene identified in families with Parkinson’s disease. Science 276, 2045-2047.
Prusiner, S. B., Scott, M. R., DeArmond, S. J. & Cohen, F. E. (1998) Prion protein biology. Cell 93, 337-348.
Shibata, N., Hirano, A., Kobayashi, M., Siddique, T., Deng, H. X., Hung, W. Y., Kato,
T. & Asayama, K. (1996) Intense superoxide dismutase-1 immunoreactivity in intracytoplasmic hyaline inclusions of familial amyotrophic lateral sclerosis with posterior column involvement. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology 55, 481-490.
Sletten, K., Westermark, P. & Natvig, J. B. (1976) Characterization of amyloid fibril proteins from medullary carcinoma of the thyroid. Journal of Experimental Medicine 143, 993-998.
Spillantini, M. G., Crowther, R. A., Jakes, R., Hasegawa, M. & Goedert, M. (1998) a-Synuclein in filamentous inclusions of Lewy bodies from Parkinson’s disease and dementia with Lewy bodies. Proceedings of the National Academy of Sciences, EE.UU. 95, 6469-6473.
Uemichi, T., Liuepnicks, J. j. & Benson, M. D. (1994) Hereditary renal amyloidosis with a novel variant fibrinogen. Journal of Clinical Investigation 93, 731-736.
Westermark, P., Engstrom, U., Johnson, K. H., Westermark, G. T. & Betsholtz, C. (1990) Islet amyloid polypeptide: pinpointing amino acid residues linked to amyloid fibril formation. Proceedings of the National Academy of Sciences, EE.UU. 87, 50365040.
Westermark, P., Johnson, K. H., O’Brien, T. D. & Betsholtz, C. (1992) Islet amyloid polypeptide - a novel controversy in diabetes research. Diabetologia 35, 297-303.
Westermark, P., Johnson, K. H. & Pitkanen, P. (1985) Systemic amyloidosis: A review with emphasis on pathogenesis. Applied Physiology 3, 55-68.
50
Wischik, C. M., Novak, M., Thøgersen, H. C., Edwards, P. C., Runswick, M. J., Jakes, R., Walker, J. E., Milstein, C., M., R. & Klug, A. (1988) Isolation of a fragment of tau derived from the core of the paired helical filament of Alzheimer’s disease.
5 Proceedings of the National Academy of Sciences, EE.UU. 85, 4506-4510.
Esta lista de referencias citadas por el solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad al respecto.
- •
- WO 9962548 A [0009]
- •
- WO 9630766 A [0010] [0011] [0015] [0027] [0095] [0107] [0137]
- •
- WO 8905859 A [0066]
- •
- US 4399216 A [0067]
- •
- Mukaetova-Ladinska, E.B. et al. Am. J. Pathol., 2000, vol. 157 (2), 623-636 [0002]
- •
- Wischik et al. PNAS USA, 1988, vol. 85, 4506 [0003]
- •
- Kang et al. Nature, 1987, vol. 325, 733 [0003]
- •
- Neurobiology of Alzheimer’s Disease. Wischik et al. The Molecular and Cellular Neurobiology Series. Bios Scientific Publishers, 2000 [0003] [0039]
- •
- Mukaetova-Ladinska et al. Am. J. Pathol., 1993, vol. 143, 565 [0004]
- •
- Wischik et al. Neurobiol. Ageing, 1995, vol. 16, 409 [0004]
- •
- Lai et al. Neurobiol. Ageing, 1995, vol. 16, 433 [0004]
- •
- Harrington et al. Dementia, 1994, vol. 5, 215 [0004]
- •
- Harrington et al. Am. J. Pathol., 1994, vol. 145, 1472 [0004]
- •
- Terry et al. Ann. Neurol., 1991, vol. 30, 572 [0004]
- •
- Bondareff et al. Arch. Gen. Psychiatry, 1993, vol. 50, 350 [0004]
- •
- Goedert, M. et al. EMBO J., 1989, vol. 8, 393-399 [0005]
- •
- Goedert, M. et al. Neuron, 1989, vol. 3, 519-526 [0005]
- •
- Wischik, C.M. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988, vol. 85, 4884-4888 [0005]
- •
- Wischik et al. PNAS USA, 1988, vol. 85, 4506-4510 [0005]
- •
- Novak, M. et al. EMBO J., 1993, vol. 12, 365-370 [0005]
- •
- Jakes, R. et al. EMBO J., 1991, vol. 10, 2725-2729 [0005]
- •
- Wischik et al. Proc Natl Acad Sci USA, 1996, vol. 93, 11213-11218 [0005] [0010]
- •
- Mena, R. et al. Acta Neuropathol, 1995, vol. 89, 50-56 [0006]
- •
- Mena, R. et al. Acta Neuropathol, 1996, vol. 91, 633-641 [0006]
- •
- Lai, R. Y. K. et al. Neurobiology of Ageing, 1995, vol. 16 (3), 433-445 [0006]
- •
- Bondareff, W. et al. J. Neuropath. Exper. Neurol., 1994, vol. 53 (2), 158-164 [0006]
- •
- Wischik, C.M. et al. Microtubule-associated proteins: modifications in disease. Harwood Academic Publishers, 1997, 185-241 [0007]
- •
- Mayeux, R. et al. New Eng. J. Med., 1999, vol. 341, 1670-1679 [0008]
- •
- Baum, L. et al. Mol. Brain Res., 1995, vol. 34, 1-17 [0012]
- •
- Fasulo et al. Alzheimer’s Research, 1996, vol. 2, 195-200 [0013]
- •
- Shelanski et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1973, vol. 70, 765-768 [0034]
- •
- Matus, A. Microtubules. John Wiley and Sons, 155-166 [0035]
- •
- Kindler ; Garner. Mol. Brain Res., 1994, vol. 26, 218-224 [0035]
- •
- Ho et al. Gene, 1989, vol. 77, 51-59 [0052]
- •
- Crameri et al. Nature, 1998, 391 [0052]
- •
- Altschul et al. J. Mol. Biol, 1990, vol. 215, 403-10 [0055]
- •
- Sambrook ; Fritsch ; Maniatis. Molecular Cloning, A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 [0056]
- •
- Ausubel et al. Short Protocols in Molecular Biology. John Wiley and Sons, 1992 [0056]
- •
- Urlaub et al. Proc. Natl. Acad Sci USA, 1980, vol. 77, 4216 [0063]
- •
- Stinchcomb et al. Nature, 1979, vol. 282, 39 [0063]
- •
- Kingsman et al. Gene, 1979, vol. 7, 141 [0063]
- •
- Tschemper et al. Gene, 1980, vol. 10, 157 [0063]
- •
- Jones. Genetics, 1977, vol. 85, 12 [0063]
- •
- Shaw et al. Gene, 1983, vol. 23, 315 [0066]
- •
- Graham; van der Eb. Virology, 1978, vol. 52, 456-457 [0067]
- •
- Van Solingen et al. J. Bact., 1977, vol. 130, 946 [0067]
- •
- Hsiao et al. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 1979, vol. 76, 3829 [0067]
- •
- Keown et al. Methods in Enzymology, 1990, vol. 185, 527 537 [0067]
- •
- Mansour et al. Nature, 1988, vol. 336, 348-352 [0067]
- •
- Urlaub; Chasin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1980, vol. 77, 4216 [0069]
- •
- Mather. Biol. Reprod., 1980, vol. 23, 243-251 [0069]
- •
- Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach. JRL Press, 1991 [0073]
- •
- Thomas. Proc. Natl Acad Sci. USA, 1980, vol. 77, 5201-5205 [0074]
- •
- Lai. The role of abnormal phosphorylation of tau protein in the development of neurofibrillary pathology in Alzheimer’s disease. PhD Thesis, 1995 [0084]
- •
- Novak et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991, vol. 88, 5837-5841 [0084]
- •
- Slobada et al. Cell Mobility. Cold Spring Laboratory, 1976, 1171-1212 [0095]
- •
- Goedert, M. ; Jakes, R. EMBO J., 1990, vol. 9, 4225 [0173]
- •
- Goedert, M. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, vol. 90, 5066 [0173]
- •
- Wischik, C. M. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988, vol. 85, 4506 [0179]
- •
- Novak, M. et al. EMBO J., 1993, vol. 12, 365 [0179]
- •
- Jakes, R. et al. EMBO J., 1991, vol. 10, 2725 [0179]
- •
- Novak, M et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991, vol. 88, 5837 [0179]
- •
- Wischik, C. M. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, vol. 93, 11213 [0179] [0180]
- •
- Lee, V. M.-Y. et al. Science, 1991, vol. 251, 675 [0179]
- •
- Harrington, C. R. et al. J. Immunol. Meth., 1990, vol. 134, 261 [0181]
- •
- Abrahamson, M. ; Jonsdottir, S. ; Olafsson, I. ; Grubb, A. Hereditary cystatin C amyloid angiopathy identification of the disease-causing mutation and specific diagnosis by polymerase chain reaction based analysis. Human Genetics, 1992, vol. 89, 377-380 [0217]
- •
- Booth, D.R. ; Sunde, M. ; Bellotti, V. ; Robinson, C.V. ; Hutchinson, W.L. ; Fraser,
99
P.E. ; Hawkins, P.N. ; Dobson, C.M. ; Radford, S.E. ; Blake, C.C.F. Instability,
100
unfolding and aggregation of human lysozyme variants underlying amyloid fibrillogenesis. Nature, 1997, vol. 385, 787-793 [0217]
- •
- Carrell, R.W. ; Gooptu, B. Conformational changes and disease - serpins, prions and Alzheimer’s. Current Opinion in Structural Biology, 1998, vol. 8, 799-809 [0217]
- •
- Chiti, F. ; Webster, P. ; Taddei, N. ; Clark, A. ; Stafani, M. ; Ramponi, G. ; Dobson,
- C.
- Designing conditions for in vitro formation of amyloid protofilaments and fibrils. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 1999, vol. 96, 3590-3594 [0217]
- •
- Czech, C. ; Tremp, G. ; Pradier, L. Presenilins and Alzheimer’s disease: biological functions and pathogenic mechanisms. Progress in Neurobiology, 2000, vol. 60, 363384 [0217]
- •
- Davis, R.L. ; Shrimpton, A.E. ; Holohan, P.D. ; Bradshaw, C. ; Feiglin, D. ; Collins,
G.H. ; Sonderegger, P. ; Kinter, J. ; Becker, L.M. ; Lacbawan, F. Familial dementia caused by polymerization of mutant neuroserpin. Nature, 1999, vol. 401, 376-379 [0217]
- •
- DiFiglia, M. ; Sapp, E. ; Chase, K.O. ; Davies, S.W. ; Bates, G.P. ; Vonsattel, J.P. ; Aronin, N. Aggregation of huntingtin in neuronal intranuclear inclusions and dystrophic neurites in brain. Science, 1997, vol. 277, 1990-1993 [0217]
- •
- Dische, F.E. ; Wernstedt, C. ; Westermark, G.T. ; Westermark, P. ; Pepys, M.B. ; Rennie, J.A. ; Gilbey, S.G. ; Watkins, P.J. Insulin as an amyloid-fibril protein at sites of repeated insulin injections in a diabetic patient. Diabetologia, 1988, vol. 31, 158161 [0217]
- •
- Gasset, M. ; Bladwin, M.A. ; Lloyd, D.H. ; abriel, J.-M. ; Holtzman, D.M. ; Cohen,
F.E. ; Fletterick, R. ; Prusiner, S.B. Predicted a-helical region of the prion protein when synthesized as peptides form amyloid. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 1992, vol. 89, 10940-10944 [0217]
- •
- Glenner, G.G. ; Wong, C.W. Alzheimer’s disease: initial report of the purification and characterisation of a novel cerebrovascular amyloid protein. Biochemical and Biophysical Research Communications, 1984, vol. 120, 885-890 [0217]
- •
- Goate, A. ; Chartier-Harlin, M.-C. ; Mullan, M. ; Brown, J. ; Crawford, F. ; Fidani, L. ; Giuffra, L. ; Haynes, A. ; Irving, N. ; James, L. Segregation of a missense mutation in the amyloid precursor protein gene with familial Alzheimer’s disease. Nature, 1991, vol. 349, 704-706 [0217]
- •
- Gorevic, P.D. ; Casey, T.T. ; Stone, W.J. ; DiRaimondo, C.R. ; Prelli, F.C. ; Frangione, B. b-2 Microglobulin is an amyloidogenic protein in man. Journal of Clinical Investigation, 1985, vol. 76, 2425-2429 [0217]
- •
- Gustavsson, A. ; Engström, U. ; Westermark, P. Normal transthyretin and synthetic transthyretin fragments form amyloid-like fibrils in vitro. Biochemical and Biophysical Research Communications, 1991, vol. 175, 1159-1164 [0217]
- •
- Hutton, M. ; Lendon, C. ; Rizzu, P. ; Baker, M. ; Froelich, S. ; Houlden, H. ; Pickering-Brown, S. ; Chakraverty, S. ; Isaacs, A. ; Grover, A. Association of missense and 5’-splice-site mutations in tau with the inherited dementia FTDP-17. Nature, 1998, vol. 393, 702-705 [0217]
- •
- Johansson, B. ; Wernstedt, C. ; Westermark, P. Atrial natriuretic peptide deposited as atrial amyloid fibrils. Biochemical and Biophysical Research Communications, 1987, vol. 148, 1087-1092 [0217]
- •
- Lomas, D.A. ; Evans, D.L. ; Finch, J.T. ; Carrell, R.W. The mechanism of Z a1antitrypsin accumulation in the liver. Nature, 1992, vol. 357, 605-607 [0217]
- •
- Maury, C.P. ; Baumann, M. Isolation and characterization of cardiac amyloid in familial amyloid polyneuropathy type IV (Finnish): relation of the amyloid protein to variant gelsolin. Biochimica et Biophysica Acta, 1990, vol. 1096, 84-86 [0217]
- •
- Paulson, H.L. Human genetics ’99: trinucleotide repeats. American Journal of Human Genetics, 1999, vol. 64, 339-345 [0217]
- •
- Pepys, M.B. ; Hawkins, P.N. ; Booth, D.R. ; Vigushin, D.M. ; Tennent, G.A. ; Soutar,
101
A.K. ; Totty, N. ; Nguyen, O. ; Blake, C.C.F. ; Terry, C.J. Human lysozyme gene mutations cause hereditary systemic amyloidosis. Nature, 1993, vol. 362, 553-557 [0217]
- •
- Polymeropoulos, M.H. ; Lavedan, C. ; Leroy, E. ; Ide, S.E. ; Dehejia, A. ; Dutra, A. ; Pike, B. ; Root, H. ; Rubenstein, J. ; Boyer, R. Mutation in the a-synuclein gene identified in families with Parkinson’s disease. Science, 1997, vol. 276, 2045-2047 [0217]
- •
- Prusiner, S.B. ; Scott, M.R. ; DeArmond, S.J. ; Cohen, F.E. Prion protein biology. Cell, 1998, vol. 93, 337-348 [0217]
- •
- Shibata, N. ; Hirano, A. ; Kobayashi, M. ; Siddique, T. ; Deng, H.X. ; Hung, W.Y. ; Kato, T. ; Asayama, K. Intense superoxide dismutase-1 immunoreactivity in intracytoplasmic hyaline inclusions of familial amyotrophic lateral sclerosis with posterior column involvement. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology, 1996, vol. 55, 481-490 [0217]
- •
- Sletten, K. ; Westermark, P. ; Natvig, J.B. Characterization of amyloid fibril proteins from medullary carcinoma of the thyroid. Journal of Experimental Medicine, 1976, vol. 143, 993-998 [0217]
- •
- Spillantini, M.G. ; Crowther, R.A. ; Jakes, R. ; Hasegawa, M. ; Goedert, M. a-Synuclein in filamentous inclusions of Lewy bodies from Parkinson’s disease and dementia with Lewy bodies. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 1998, vol. 95, 6469-6473 [0217]
- •
- Uemichi, T. ; Liuepnicks, J.j. ; Benson, M.D. Hereditary renal amyloidosis with a novel variant fibrinogen. Journal of Clinical Investigation, 1994, vol. 93, 731-736 [0217]
- •
- Westermark, P. ; Engstrom, U. ; Johnson, K.H. ; Westermark, G.T. ; Betsholtz, C. Islet amyloid polypeptide: pinpointing amino acid residues linked to amyloid fibril formation. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 1990, vol. 87, 5036-5040 [0217]
- •
- Westermark, P. ; Johnson, K.H. ; O’Brien, T.D. ; Betsholtz, C. Islet amyloid polypeptide - a novel controversy in diabetes research. Diabetologia, 1992, vol. 35, 297-303 [0217]
- •
- Westermark, P. ; Johnson, K.H. ; Pitkanen, P. Systemic amyloidosis: A review with emphasis on pathogenesis. Applied Physiology, 1985, vol. 3, 55-68 [0217]
- •
- Wischik, C.M. ; Novak, M. ; Thøgersen, H.C. ; Edwards, P.C. ; Runswick, M.J. ; Jakes, R. ; Walker, J.E. ; Milstein, C., M., R. ; Klug, A. Isolation of a fragment of tau derived from the core of the paired helical filament of Alzheimer’s disease. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 1988, vol. 85, 4506-4510
102
5 [0217]
Claims (35)
1. Un procedimiento para convertir proteolíticamente una proteína precursora en un fragmento producto en una línea celular estable, dicha proteína precursora está asociada con un estado de enfermedad en el que la proteína precursora se agrega patológicamente, procedimiento que comprende:
- (a)
- proporcionar una línea celular estable transfectada con un ácido nucleico que codifica:
- (i)
- un fragmento de plantilla de la proteína precursora tal que el fragmento de plantilla se exprese constitutivamente en la célula a un nivel que no sea tóxico para la célula; y
- (ii)
- la proteína precursora, proteína que es expresada de forma inducible en la célula en respuesta a un estímulo,
- (b)
- someter la célula al estímulo tal que exprese de forma inducible la proteína precursora en la célula, por lo que la interacción del fragmento de plantilla con la proteína precursora causa un cambio conformacional en la proteína precursora de forma que causa una agregación y procesado proteolítico de la proteína precursora del fragmento producto.
- 2.
- Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que la agregación patológica in vivo conduce a un procesado proteolítico de la proteína precursora en un estado de enfermedad asociado con la neurodegeneración y/o la demencia clínica.
- 3.
- Un procedimiento según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que la agregación patológica de la proteína precursora en el estado de enfermedad conduce al procesado proteolítico de un fragmento de dominio del núcleo, y el fragmento de plantilla comprende al menos el fragmento de núcleo de la proteína de plantilla.
- 4.
- Un procedimiento según se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en el que se produce una pluralidad de diferentes fragmentos producto.
- 5.
- Un procedimiento según se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que se sigue la producción de al menos un fragmento producto.
- 6.
- Un procedimiento para identificar un modulador de la agregación y/o el procesado proteolítico de la proteína precursora asociada con el estado de enfermedad, procedimiento que comprende:
52
- (a)
- proporcionar un agente sospechoso de ser capaz de modular la agregación,
- (b)
- realizar un procedimiento según la reivindicación 5 en presencia del agente,
- (c)
- correlacionar la producción del o de cada fragmento producto seguido con la actividad moduladora del agente.
7. Un procedimiento según la reivindicación 6, en el que la etapa (b) se realiza:
(a) cultivando las células en una o más placas,
(b) incubando las células con el agente durante un periodo de tiempo suficiente para que el agente entre en las células.
- 8.
- Un procedimiento según la reivindicación 6 o la reivindicación 7 en el que la producción del o de cada fragmento producto seguido se compara con un valor de referencia, en el que el valor de referencia se obtiene al realizar el procedimiento en ausencia del agente.
- 9.
- Un procedimiento según la reivindicación 4 en el que la proteína precursora es una proteína tau.
- 10.
- Un procedimiento según la reivindicación 9 en el que el fragmento de plantilla comprende un fragmento de tau que se extiende entre los aminoácidos 186297 a 390-441 de la proteína tau completa mostrada en la Fig. 7.
- 11.
- Un procedimiento según la reivindicación 10 en el que el fragmento de plantilla consiste en un fragmento de tau que se extiende desde los aminoácidos 295, 296 ó 297 hasta los restos de aminoácidos 390 ó 391 de la proteína tau completa mostrada en la Fig. 7.
- 12.
- Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11 en el
53
que se sigue la producción de un fragmento producto de tau de aproximadamente 12, 14, 25, 27, 30, 32, 36, 38, 42 ó 44 kDa.
- 13.
- Un procedimiento según la reivindicación 12 en el que se sigue la producción de un fragmento producto de tau de aproximadamente 12 kDa.
- 14.
- Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13 en el que se sigue la producción del o de cada fragmento producto tóxico en SDS PAGE.
- 15.
- Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14 en el que se sigue la producción del o de cada fragmento producto tóxico inmunológicamente.
- 16.
- Un procedimiento según la reivindicación 15 en el que el seguimiento emplea un anticuerpo seleccionado a partir de un anticuerpo monoclonal que (i) es específico para un epítopo específico humano localizado en la región entre la Gly-16 y la Gln-26 de la tau; (ii) es específico para el fragmento de núcleo de tau truncado en la Glu-391; (iii) es específico para un epítopo genérico de tau en el dominio de repetición; o (iv) es específico para un epítopo genérico de tau no específico de especie localizado entre la Ser-208 y la Ser-238.
- 17.
- Un procedimiento para el cribado de un medicamento para uso como agente terapéutico o pronóstico para el tratamiento de una tauopatía, procedimiento que comprende
(a) realizar un procedimiento según se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 16,
(b) seleccionar moduladores con un índice terapéutico de más de 2.
18. Un procedimiento para producir una célula estable para su uso en un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en el que una proteína precursora puede convertirse proteolíticamente en un fragmento producto cuando dicha línea celular se somete a un estímulo, dicha proteína precursora está asociada con un estado de enfermedad en el que la proteína precursora se agrega patológicamente, dicho procedimiento comprende las etapas de introducir en una célula un ácido
54
nucleico que codifica para (i) un fragmento de plantilla de la proteína precursora tal que el fragmento de plantilla se expresa constitutivamente en la célula a un nivel que no es tóxico para la célula; y (ii) la proteína precursora tal que la proteína patológica sea expresada de forma inducible en la célula en respuesta al estímulo.
- 19.
- Un procedimiento según la reivindicación 18 en el que el ácido nucleico que codifica la proteína precursora está unido operativamente a un promotor inducible lac y en el que el ácido nucleico que codifica para el fragmento de plantilla está unido operativamente a una secuencia promotora de un citomegalovirus.
- 20.
- Un procedimiento según la reivindicación 18 o la reivindicación 19 en el que el ácido nucleico que codifica el fragmento de plantilla se introduce como un vector de plantilla, y el ácido nucleico que codifica la proteína precursora se introduce como un vector de proteína precursora por separado.
- 21.
- Un procedimiento según la reivindicación 20 en el que el vector de la proteína precursora deriva del vector pOPRSVICAT en el que se clona el ácido nucleico que codifica la proteína precursora, y el vector del fragmento de plantilla deriva del vector del plásmido pZeo295-391 en el que se clona el ácido nucleico que codifica la proteína precursora.
- 22.
- Un procedimiento según se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 21 en el que la proteína precursora es tau.
- 23.
- Un procedimiento según la reivindicación 22 en el que el ácido nucleico que codifica el fragmento de plantilla codifica un fragmento de núcleo de tau.
- 24.
- Un procedimiento según la reivindicación 23 en el que el ácido nucleico que codifica el fragmento de plantilla codifica un fragmento de tau que se extiende desde los aminoácidos 186-297 hasta los 390-441 de la proteína completa.
- 25.
- Un procedimiento según la reivindicación 24 en el que el ácido nucleico que codifica el fragmento de plantilla codifica un fragmento de tau que se extiende desde los aminoácidos 295, 296 ó 297 hasta los restos de aminoácidos 390 ó 391 de la proteína tau completa mostrada en la Fig. 7.
- 26.
- Un procedimiento según la reivindicación 25 en el que el ácido nucleico que codifica el fragmento de plantilla codifica un fragmento de tau que se extiende entre los restos de aminoácidos 295 a 391 según se muestra en la Fig. 7.
- 27.
- Una célula hospedadora de mamífero en la que una proteína precursora puede convertirse proteolíticamente en un fragmento producto cuando dicha línea celular se somete a un estímulo, Dicha proteína precursora está asociada con un estado de enfermedad en el que la proteína precursora se agrega patológicamente, en el que dicha célula hospedadora de mamífero se transforma con un ácido nucleico que codifica:
55
- (i)
- un fragmento de plantilla de una proteína precursora, en el que el fragmento de plantilla se expresa constitutivamente a un nivel que no es tóxico para la célula; y
- (ii)
- la proteína precursora tal que la proteína patológica se expresa de forma inducible en respuesta a un estímulo.
28. Una célula según la reivindicación 27 que es de una línea celular neuronal
o una línea celular de fibroblastos, seleccionada opcionalmente a partir de las siguientes líneas celulares: 3T3; NIE-115; 3T6; N2A; SY5Y; COS-7.
- 29.
- Una célula según la reivindicación 27 o la reivindicación 28 en la que la proteína precursora es tau.
- 30.
- Una célula según la reivindicación 29 en la que el ácido nucleico que codifica el fragmento de plantilla codifica un fragmento de núcleo de tau.
- 31.
- Una célula según la reivindicación 30 en la que el ácido nucleico que codifica el fragmento de plantilla codifica un fragmento de tau que se extiende desde entre los aminoácidos 186-297 hasta 390-441 de la proteína completa.
- 32.
- Una célula según la reivindicación 31 en la que el ácido nucleico que codifica el fragmento de plantilla codifica un fragmento de tau que se extiende desde
56
los aminoácidos 295, 296 ó 297 hasta los restos de aminoácidos 390 ó 391 de la proteína tau completa mostrada en la Fig. 7.
33. Una célula según la reivindicación 32 en la que el ácido nucleico que
5 codifica el fragmento de plantilla codifica un fragmento de tau que se extiende los restos de aminoácidos 295 a 391 según se muestra en la Fig. 7.
34. Un kit que comprende una célula hospedadora según se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 27 a 33 junto a al menos un componente adicional
10 seleccionado entre: un agente para estimular la producción de la proteína precursora o un agente para detectar la interacción de la proteína precursora con el fragmento de plantilla.
35. Un kit según la reivindicación 34 en el que el agente de detección es un 15 anticuerpo.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GBGB0101049.5A GB0101049D0 (en) | 2001-01-15 | 2001-01-15 | Materials and methods relating to protein aggregation in neurodegenerative disease |
GB0101049 | 2001-01-15 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
ES2353202T3 true ES2353202T3 (es) | 2011-02-28 |
Family
ID=9906862
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES10007601T Expired - Lifetime ES2407204T3 (es) | 2001-01-15 | 2002-01-15 | Materiales y procedimientos relacionados con la agregación de proteínas en la enfermedad neurodegenerativa |
ES02715498T Expired - Lifetime ES2353202T3 (es) | 2001-01-15 | 2002-01-15 | Materiales y procedimientos relacionados con la agregacion de proteinas en la enfermedad neurodegenerativa. |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES10007601T Expired - Lifetime ES2407204T3 (es) | 2001-01-15 | 2002-01-15 | Materiales y procedimientos relacionados con la agregación de proteínas en la enfermedad neurodegenerativa |
Country Status (14)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US7335505B2 (es) |
EP (2) | EP2305823B1 (es) |
JP (2) | JP4422407B2 (es) |
CN (1) | CN1496404B (es) |
AT (1) | ATE483814T1 (es) |
AU (1) | AU2002225147B2 (es) |
CA (2) | CA2697520C (es) |
DE (1) | DE60237874D1 (es) |
DK (2) | DK2305823T3 (es) |
ES (2) | ES2407204T3 (es) |
GB (1) | GB0101049D0 (es) |
HK (2) | HK1055605A1 (es) |
PT (2) | PT2305823E (es) |
WO (1) | WO2002055720A2 (es) |
Families Citing this family (48)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB9506197D0 (en) | 1995-03-27 | 1995-05-17 | Hoffmann La Roche | Inhibition of tau-tau association. |
GB0100119D0 (en) | 2001-01-03 | 2001-02-14 | Univ Aberdeen | Materials and methods relating to protein aggregation in neurodegenerative disease |
GB0106953D0 (en) | 2001-03-20 | 2001-05-09 | Univ Aberdeen | Neufofibrillary labels |
GB0117326D0 (en) | 2001-07-16 | 2001-09-05 | Univ Aberdeen | Napthoquinone-type inhibitors of protein aggregation |
CN100577803C (zh) * | 2002-07-12 | 2010-01-06 | 阿克松神经科学研究和发展股份有限公司 | 表达阿耳茨海默氏tau蛋白的转基因动物 |
ES2736160T3 (es) | 2004-09-23 | 2019-12-26 | Wista Lab Ltd | Procedimientos de síntesis química y purificación de compuestos de diaminofenotiazinio que incluyen cloruro de metiltioninio (CMT) |
CN101084204B (zh) | 2004-09-23 | 2012-12-05 | 卫思道制药有限公司 | 包括亚甲蓝(mtc)在内的二氨基吩噻嗪鎓化合物的化学合成和纯化方法 |
AU2013200732B2 (en) * | 2006-03-29 | 2015-04-09 | Wista Laboratories Ltd. | 3,7-diamino-10H-phenothiazine salts and their use |
US8263589B2 (en) * | 2006-03-29 | 2012-09-11 | Wista Laboratories Ltd. | Inhibitors of protein aggregation |
ES2349322T7 (es) * | 2006-03-29 | 2019-10-17 | Wista Lab Ltd | Sales de 3,7-diamino-10H-fenotiazina y su utilización |
WO2007110630A1 (en) | 2006-03-29 | 2007-10-04 | Wista Laboratories Ltd. | Thioninium compounds and their use |
PL2057136T3 (pl) | 2006-07-11 | 2013-10-31 | Wista Lab Ltd | Sposoby syntezy i/lub oczyszczania związków diaminofenotiazynowych |
PT2167095T (pt) * | 2007-06-19 | 2019-08-06 | Wista Lab Ltd | Compostos de fenotiazina para o tratamento de comprometimento cognitivo leve |
HUE025199T2 (en) | 2007-10-03 | 2016-01-28 | Wista Lab Ltd | Therapeutic use of diaminophenothiazines |
WO2010021755A2 (en) * | 2008-08-20 | 2010-02-25 | Oligomerix, Inc. | Tau protease compositions and methods |
WO2010034982A1 (en) | 2008-09-23 | 2010-04-01 | Wista Laboratories Ltd. | Ligands for aggregated tau molecules |
PL3112358T3 (pl) | 2008-12-10 | 2020-11-16 | Wista Laboratories Ltd. | 3,6-Dipodstawione sole ksantyliowe |
ES2457227T3 (es) | 2009-05-12 | 2014-04-25 | Wista Laboratories Ltd. | Procedimientos de síntesis química de compuestos de diaminofenotiazinio que implican el uso de oxidantes de persulfato |
US10266585B2 (en) | 2009-08-28 | 2019-04-23 | The Board Of Regents Of The Univerity Of Texas System | Methods of treating brain injury |
JP6124591B2 (ja) | 2009-08-28 | 2017-05-10 | ザ ボード オブ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティー オブ テキサス システム | タウオリゴマーに結合する抗体 |
US9125846B2 (en) | 2010-10-15 | 2015-09-08 | The Board Of Regents Of The University Of Texas System | Antibodies that bind amyloid oligomers |
PL3378856T3 (pl) | 2009-09-24 | 2021-05-31 | Wista Laboratories Ltd. | Krystaliczne hydraty chlorku metylotioniny |
SG185094A1 (en) | 2010-04-30 | 2012-12-28 | Prostetta Antiviral Inc | Antiviral compounds |
US8828986B2 (en) | 2011-04-20 | 2014-09-09 | Prosetta Antiviral Inc. | Antiviral compounds |
CN103379901B (zh) | 2010-11-30 | 2018-04-03 | 维斯塔实验室有限公司 | 含有氯化甲基息奥宁的配方 |
US20120244174A1 (en) | 2011-01-31 | 2012-09-27 | Intellect Neurosciences Inc. | Treatment of tauopathies |
KR101888713B1 (ko) | 2011-02-11 | 2018-08-14 | 위스타 레보레이토리스 리미티드 | 페노티아진 디아미늄 염 및 이의 용도 |
HUE048780T2 (hu) | 2012-08-16 | 2020-09-28 | Ipierian Inc | Tauopátia kezelésére szolgáló módszerek |
US8980270B2 (en) | 2013-01-18 | 2015-03-17 | Ipierian, Inc. | Methods of treating a tauopathy |
CN105026417A (zh) * | 2013-02-06 | 2015-11-04 | 新加坡科技研究局 | 用于降低蛋白质制剂中的聚集物含量的方法 |
GB201317702D0 (en) | 2013-10-07 | 2013-11-20 | Wista Lab Ltd | Methods of chemical synthesis of diaminophenothiazinium compounds including methylthioninium chloride (MTC) |
US10765755B1 (en) | 2013-11-20 | 2020-09-08 | University Of South Florida | Preparation and characterization of methylene blue nanoparticles for Alzheimer's disease and other tauopathies |
EP3080611B1 (en) * | 2013-12-13 | 2018-11-14 | The General Hospital Corporation | Soluble high molecular weight (hmw) tau species and applications thereof |
CN105939722A (zh) | 2014-02-14 | 2016-09-14 | 伊皮埃里安股份有限公司 | Tau肽,抗Tau抗体,及其使用方法 |
CN103864717B (zh) * | 2014-04-04 | 2015-11-11 | 山东理工大学 | 一种针状亚甲基白晶体的制备方法 |
GB201512678D0 (en) | 2015-07-20 | 2015-08-26 | Wista Lab Ltd | Methods of chemical synthesis |
SI3487505T1 (sl) | 2016-07-25 | 2023-10-30 | Wista Laboratories Ltd., | Dajanje in odmerek diaminofenotiazinov |
GB201614834D0 (en) | 2016-09-01 | 2016-10-19 | Wista Lab Ltd | Treatment of dementia |
GB201621817D0 (en) | 2016-12-21 | 2017-02-01 | Wista Lab Ltd | Methods of chemical synthesis |
CA3107352A1 (en) | 2018-07-23 | 2020-01-30 | Enclear Therapies, Inc. | Methods of treating neurological disorders |
JP2022510573A (ja) * | 2018-07-23 | 2022-01-27 | エンクリアー セラピーズ, インク. | 神経障害の治療方法 |
KR20210038586A (ko) | 2018-07-26 | 2021-04-07 | 위스타 레보레이토리스 리미티드 | 집단에서 디아미노페노티아진(diaminophenothiazines)의 최적 투여량 |
CN113874078A (zh) | 2019-04-05 | 2021-12-31 | Tauc3生物制品有限公司 | 抗tauc3抗体及其应用 |
WO2020210634A1 (en) | 2019-04-11 | 2020-10-15 | Enclear Therapies, Inc. | Methods of amelioration of cerebrospinal fluid and devices and systems therefor |
GB201909393D0 (en) | 2019-06-28 | 2019-08-14 | Gen2 Neuroscience Ltd | Tau epitope and binding molecules |
GB202010620D0 (en) | 2020-07-10 | 2020-08-26 | Wista Lab Ltd | System |
WO2023232764A1 (en) | 2022-05-31 | 2023-12-07 | Wista Laboratories Ltd. | Treatment of neurodegenerative disorders utilising methylthioninium (mt)-containing compounds |
WO2024063700A1 (en) | 2022-09-21 | 2024-03-28 | Yin Sze Loh | Oral formulation of diaminophenothiazines and methods of making and using the same in the treatment and/or prevention of diseases |
Family Cites Families (27)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
BE569430A (es) * | 1957-07-17 | |||
US4399216A (en) | 1980-02-25 | 1983-08-16 | The Trustees Of Columbia University | Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials |
GB8724412D0 (en) | 1987-10-19 | 1987-11-25 | Medical Res Council | Protein |
EP0397687B1 (en) | 1987-12-21 | 1994-05-11 | The University Of Toledo | Agrobacterium mediated transformation of germinating plant seeds |
US5571666A (en) | 1988-10-28 | 1996-11-05 | Oklahoma Medical Research Foundation | Thiazine dyes used to inactivate HIV in biological fluids |
JPH0725786A (ja) | 1990-05-16 | 1995-01-27 | Univ Rockefeller | アルツハイマー病を伴うアミロイドーシスの治療 |
CA2110488A1 (en) | 1991-07-10 | 1993-01-21 | Franceska Fieuws | Fluorochemical water- and oil-repellent treating compositions |
AU2414092A (en) | 1991-08-01 | 1993-03-02 | Paul H. Voorheis | Diagnostic method for alzheimer's disease |
WO1993003177A1 (en) | 1991-08-09 | 1993-02-18 | Massachusetts Institute Of Technology | Novel tau/neurofilament protein kinases |
ATE438716T1 (de) | 1991-12-06 | 2009-08-15 | Max Planck Gesellschaft | Verwendung von protein-kinasen zur diagnose und behandlung der alzheimer-krankheit |
GB9316727D0 (en) | 1993-08-12 | 1993-09-29 | Inst Of Psychiatry | Models of alzheimers's disease |
GB9317193D0 (en) | 1993-08-18 | 1993-10-06 | Zeneca Ltd | Method |
AU708682B2 (en) | 1994-08-08 | 1999-08-12 | Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University | Methods for treating and/or preventing Alzheimer's disease using phenothiazines and/or thioxanthenes |
DE4430091A1 (de) | 1994-08-25 | 1996-02-29 | Bayer Ag | Verwendung von N-substituierten Phenothiazinen |
GB9506197D0 (en) | 1995-03-27 | 1995-05-17 | Hoffmann La Roche | Inhibition of tau-tau association. |
US5804601A (en) | 1995-04-10 | 1998-09-08 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Aromatic hydroxamic acid compounds, their production and use |
US5693638A (en) * | 1996-02-23 | 1997-12-02 | Myers; Daniel | Method of treating a migraine headache |
WO1999062548A1 (en) * | 1998-06-01 | 1999-12-09 | Advanced Research And Technology Institute | Methods and compositions for diagnosing tauopathies |
FR2788436A1 (fr) | 1999-01-14 | 2000-07-21 | Pf Medicament | Composition d'un derive de phenothiazine |
WO2001053340A2 (en) | 2000-01-21 | 2001-07-26 | Pharmacia & Upjohn Company | Transgenic mouse model of human neurodegenerative disease |
GB0017060D0 (en) * | 2000-07-11 | 2000-08-30 | Hunter Fleming Ltd | Production, stabilisation and use of reduced forms of pharmaceutical compounds |
GB0100119D0 (en) | 2001-01-03 | 2001-02-14 | Univ Aberdeen | Materials and methods relating to protein aggregation in neurodegenerative disease |
GB0106953D0 (en) | 2001-03-20 | 2001-05-09 | Univ Aberdeen | Neufofibrillary labels |
GB0117326D0 (en) | 2001-07-16 | 2001-09-05 | Univ Aberdeen | Napthoquinone-type inhibitors of protein aggregation |
US6953974B2 (en) * | 2003-08-26 | 2005-10-11 | Texas Instruments Incorporated | EEPROM device and method for providing lower programming voltage |
GB0322756D0 (en) | 2003-09-29 | 2003-10-29 | Univ Aberdeen | Methods of chemical synthesis |
ES2736160T3 (es) | 2004-09-23 | 2019-12-26 | Wista Lab Ltd | Procedimientos de síntesis química y purificación de compuestos de diaminofenotiazinio que incluyen cloruro de metiltioninio (CMT) |
-
2001
- 2001-01-15 GB GBGB0101049.5A patent/GB0101049D0/en not_active Ceased
-
2002
- 2002-01-15 PT PT100076017T patent/PT2305823E/pt unknown
- 2002-01-15 ES ES10007601T patent/ES2407204T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-01-15 ES ES02715498T patent/ES2353202T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-01-15 WO PCT/GB2002/000153 patent/WO2002055720A2/en active Application Filing
- 2002-01-15 EP EP10007601A patent/EP2305823B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-01-15 JP JP2002556766A patent/JP4422407B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2002-01-15 PT PT02715498T patent/PT1352077E/pt unknown
- 2002-01-15 DK DK10007601.7T patent/DK2305823T3/da active
- 2002-01-15 CA CA2697520A patent/CA2697520C/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-01-15 CA CA2434067A patent/CA2434067C/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-01-15 AU AU2002225147A patent/AU2002225147B2/en not_active Expired
- 2002-01-15 DE DE60237874T patent/DE60237874D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-01-15 CN CN028063015A patent/CN1496404B/zh not_active Expired - Lifetime
- 2002-01-15 US US10/451,782 patent/US7335505B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-01-15 AT AT02715498T patent/ATE483814T1/de active
- 2002-01-15 EP EP02715498A patent/EP1352077B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-01-15 DK DK02715498.8T patent/DK1352077T3/da active
-
2003
- 2003-10-30 HK HK03107838.8A patent/HK1055605A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2008
- 2008-01-28 US US12/010,649 patent/US7893054B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2008-07-22 JP JP2008188134A patent/JP5160990B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2011
- 2011-04-14 HK HK11103782.3A patent/HK1149588A1/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
HK1149588A1 (en) | 2011-10-07 |
US20090075984A1 (en) | 2009-03-19 |
DE60237874D1 (de) | 2010-11-18 |
US7335505B2 (en) | 2008-02-26 |
EP1352077A2 (en) | 2003-10-15 |
PT2305823E (pt) | 2013-07-08 |
DK2305823T3 (da) | 2013-06-24 |
ATE483814T1 (de) | 2010-10-15 |
JP4422407B2 (ja) | 2010-02-24 |
PT1352077E (pt) | 2011-01-12 |
CA2434067C (en) | 2010-06-22 |
US7893054B2 (en) | 2011-02-22 |
CN1496404B (zh) | 2011-10-19 |
US20040110250A1 (en) | 2004-06-10 |
HK1055605A1 (en) | 2004-01-16 |
DK1352077T3 (da) | 2011-01-10 |
WO2002055720A3 (en) | 2002-11-21 |
JP5160990B2 (ja) | 2013-03-13 |
JP2004524831A (ja) | 2004-08-19 |
GB0101049D0 (en) | 2001-02-28 |
EP2305823A1 (en) | 2011-04-06 |
EP1352077B1 (en) | 2010-10-06 |
CA2434067A1 (en) | 2002-07-18 |
CA2697520C (en) | 2014-02-04 |
WO2002055720A2 (en) | 2002-07-18 |
JP2009035549A (ja) | 2009-02-19 |
CA2697520A1 (en) | 2002-07-18 |
CN1496404A (zh) | 2004-05-12 |
EP2305823B1 (en) | 2013-03-27 |
WO2002055720A9 (en) | 2002-12-27 |
AU2002225147B2 (en) | 2006-12-07 |
ES2407204T3 (es) | 2013-06-12 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
ES2353202T3 (es) | Materiales y procedimientos relacionados con la agregacion de proteinas en la enfermedad neurodegenerativa. | |
AU2002225147A1 (en) | Materials and methods relating to protein aggregation in neurodegenerative disease | |
Wijesekara et al. | Amyloid‐β and islet amyloid pathologies link Alzheimer’s disease and type 2 diabetes in a transgenic model | |
ES2382457T3 (es) | Materiales y procedimientos relacionados con la agregación de proteínas en enfermedades neurodegenerativas | |
Roberts et al. | α-Synuclein increases β-amyloid secretion by promoting β-/γ-secretase processing of APP | |
US20060223812A1 (en) | Treating neurodegenerative conditions | |
WO2006007864A1 (en) | Treating neurodegenerative conditions | |
AU2002217310A1 (en) | Materials and methods relating to protein aggregation in neurodegenerative disease | |
Mably et al. | Tau immunization: a cautionary tale? | |
Devi et al. | Cognitive benefits of memantine in Alzheimer's 5XFAD model mice decline during advanced disease stages | |
Jamerlan et al. | The influence of Aβ-dependent and independent pathways on TDP-43 proteinopathy in Alzheimer’s disease: A possible connection to LATE-NC | |
AU2007200212B2 (en) | Materials and methods relating to protein aggregation in neurodegenerative disease | |
Vassar | β-Secretase inhibition | |
Tetlow | Evaluation of Aging and Genetic Mutation Variants on Tauopathy | |
Fang | SSH1 Impedes p62/SQSTM1 Flux and Tau Clearance Independent of Cofilin Activation | |
Chanrda | Aspirin Induces Lysosomal Biogenesis via Peroxisome Proliferator Activated Receptor α | |
Gulisano | A renewed vision for Amyloid beta and tau in Alzheimer s disease pathophysiology | |
Bjorkli et al. | Using intracerebral microdialysis to probe the efficacy of repurposed drugs in Alzheimer’s disease pathology | |
Decourt et al. | BACE1 Inhibitors: Attractive Therapeutics for Alzheimer’s Disease | |
Yavin et al. | Abeta1-40-Dependent Signaling Kinase Cascades Are Accelerated by Divalent Iron in Primary Neuronal Cells |