JP5160990B2 - 神経変性疾患におけるタンパク質凝集に関する材料および方法 - Google Patents
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Description
WO96/30766は、固相基質に吸収されているコア反復ドメインに対応するタウフラグメントが可溶性全長タウを捕捉し、高親和性でタウと結合できる、タウ凝集に関するインビトロアッセイについて記載している(図4参照)。この結合は、凝集したタウ分子の反復ドメインにおけるタンパク質分解性消化に対する安定性を付与する。過程は、自己伝播性であり、典型的な医薬品により選択的に遮断され得る(Wischikら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:11213〜11218(1996))。
WO96/30766は、また細胞環境におけるタウ凝集を研究するための二つの研究法をも記載している。第1の研究法では、全長タウまたはタウのフラグメントが、細胞において安定して発現された。第2の研究法では、リポフェクチンの使用により凝集したタウが一過的に細胞にトランスフェクトされた。
本発明者らは、その凝集が、神経変性疾患に伴うタンパク質の鋳型発動タンパク質分解性プロセシングをモデル化するために用いることができる安定した細胞試験系を考案した。タウタンパク質を実例に挙げた一つの試験系では、タウタンパク質のフラグメントの非常に低レベルの構成的発現を全長タウの誘導発現と組み合わせた。全長タウの誘導により、タンパク質分解性変換が導かれ、プロセシングされたフラグメントに至り、これによりタウの「鋳型によるタンパク質分解性プロセシング」が生じたことが確認される。誘導された全長タウからプロセシングされた12kDのフラグメントの産生の阻害によるタウ凝集インヒビターの影響の実証が、系により容易に可能になる。
本発明者らは、細胞系に対して有毒でない、すなわち細胞系が、生存可能である(第1の)濃度で鋳型フラグメントを構成的に発現することは、思いがけずに可能であることを実証した。例えば、WO96/30766の図29で示される種類の細胞異常をも示さない。
各々の場合、方法は、前駆体タンパク質のタンパク質分解性プロセシングのレベルを(直接的または間接的に)モニターすることを含んでよい。
前記したように、本発明は、タンパク質が誘導された立体配座重合相互作用を受ける、すなわちタンパク質またはそのフラグメントにおける立体配座変化が、自己伝播の様式で別の(前駆体)タンパク質分子の鋳型結合および凝集を生じる疾患に伴ういずれかのタンパク質の使用周辺を根拠としてもよい。
一度核形成が開始されると、立体配座変化が凝集物に、別のタンパク質分解に対するさらなる抵抗性を与え得る、別のタンパク質分子の立体配座重合の誘起に関与する凝集カスケードが続いて起こり、さらなるタンパク質分解に対して実質的に抵抗する凝集物における有毒産生物フラグメントの形成に至る。このように形成されたタンパク質凝集物は、神経変性、臨床痴呆およびこの群の疾患のその他の病理学的症状の最も近い原因であると考えられる。
表から見られるように、病理学的タンパク質凝集により特徴づけられる疾患の実例には運動ニューロン疾患およびレビ小体疾患が含まれる。
本発明の好ましい態様では、鋳型フラグメントが前駆体タンパク質の「コアフラグメント」を含む、実質的に「コアフラグメント」からなるか、または「コアフラグメント」からなり、この用語は、前駆体タンパク質に結合して前記したタンパク質分解および凝集を開始または伝播できるタンパク質のその部分を意味する。
凝集する疾患タンパク質の場合、かかるコアフラグメントは、また凝集のタンパク質分解安定性に寄与するものである可能性がある。
APP(アミロイド前駆体タンパク質)の場合、例えば融合タンパク質として1〜40または1〜42アミノ酸のAβドメインを含むAPPのフラグメントの発現が好ましい。
鋳型フラグメントの全長は、アッセイおよび用いられている凝集疾患タンパク質コアフラグメントに適しているいずれの長さでもよいが、一般に、約20、30、40、50、60、70、80、90個などのアミノ酸の長さ以上である。しかしながら、望ましい場合、100、200または更には500個以上でもよい態様もある。
指定したタンパク質(例えば前駆体タンパク質、鋳型またはコアフラグメント)または列挙した核酸配列について論じる本明細書の全例において、対応する参照タンパク質(または核酸)の誘導体またはその他の変種が、参照配列の適当な特性を保持する場合、必要に応じてそれを用いてよい。かかる誘導体は、また参照配列と配列同一性を共有する。
例えば用いたタンパク質には、N−またはC−末端伸長が含まれ、その伸長は、タンパク質配列に対して異種性でよい。同様に、誘導体は、参照配列のアミノ酸挿入、欠失または付加の方法によるものである。例えば、タウタンパク質またはタウコアフラグメント、誘導体は、少なくともタウタンパク質のタンデム反復領域に類似する部分アミノ酸配列を含むが、天然のタウもしくはそのフラグメントの一つ以上のアミノ酸が置換されているか、もしくは削除されているか、または別のアミノ酸が挿入されている。
好ましい誘導体は、病態に伴うことが解っているか、または推測されるものに対応する突然変異を組み込むものでよい。これらは、タウ配列内のP301Sに対応する変化を含有できる(図7参照)。別の突然変異には、G272V、G389R、P301L、N279K、S305N、V337M、G272V、K280Δ、R406W(Wischikら、前出(2000)をも参照)などがある。
更に別の誘導体は、配列が混合されているか、または組み合わされている複数の関連する疾患タンパク質に基づくキメラ産生物に基づくことができる。例えばタウの制限酵素フラグメントは、MAP2のフラグメントまたは関連性のない遺伝子のフラグメントとでさえライゲートして組換え誘導体を作製することができる。コアフラグメントを修飾するための代替の試験計画は、Hoら、Gene 77:51〜59(1989)に記載されるようなPCR、またはDNA混ぜ合わせ(Crameriら、Nature 391(1998))を用いる。
本発明の核酸、または本発明で使用するための核酸は、実質的に純粋もしくは均質な形態で、または元来の種の別の核酸を含まずに、もしくは実質的に含まずに、その天然の環境から単離および/または精製された形態で提供され得る。本明細書で用いる場合、「単離された」なる用語は、これらの可能性をすべて含む。例えば鋳型フラグメントをコードする核酸は、それが天然で一緒に見出されない(隣接して作動しない)が、人工的にライゲートされているかそうでなければ組み合わされている核酸配列を含むという点で、少なくとも部分的に合成性である。
したがって、別の側面では、本発明はまた適当な前駆体および鋳型フラグメントタンパク質をコードする核酸分子にも関する。以下で論じるように、これらは、同一のまたは異なる構築物に存在してよく、そして後者の場合、組成物は、二つまたは二つ以上の型の構築物を含む組成物もまた提供される。
前駆体タンパク質の場合、プロモーターは、当業者によりよく理解されている、いわゆる「誘導可能」でよく、発現は、適用された刺激に応答して「スイッチ・オン」または増加する。刺激の特性は、プロモーター間で変化する。ある誘導プロモーターは、適当な刺激の不在下では、わずか、または検出不能なレベルの発現(または発現しない)しか引き起こさない。また別の誘導プロモーターは、刺激の不在下で検出可能な構成的発現を引き起こす。刺激の不在下での発現のレベルにかかわらず、いずれかの誘導プロモーターからの発現は、正しい刺激の存在下で増加する。以下の実験では、Lac誘導プロモーターを使用している。
本発明は、また前記した方法において用いるための安定した細胞を産生する方法をも提供し、この方法は:(a)(i)鋳型フラグメントが、細胞に対して有毒でないレベルで細胞において構成的に発現されるような前駆体タンパク質の鋳型フラグメント;および(ii)刺激に応答して疾患の細胞においてタンパク質の発現が誘導されるような前駆体タンパク質をコードする核酸を細胞に導入すること、の工程を含む。
本発明に用いるのに適当な宿主細胞には、細菌、真核細胞、例えば哺乳動物および酵母細胞、並びにバキュロウイルス系などがある。
異種性ポリペプチドの発現のために技術分野で利用可能な哺乳動物細胞系には、繊維芽細胞3T6細胞、HeLa細胞、ベビー・ハムスター腎臓細胞、COS細胞、SV40により形質転換されたサル腎臓CV1系(COS−7、ATCC CRL1651)、チャイニーズハムスター卵巣細胞/−DHFR(CHO、UrlaubおよびChasin、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980));マウスセルトリ細胞(TM4、Mather、Biol.Reprod.23:243〜251(1980));ヒト肺細胞(W138、ATCC CCL 75);ヒト肝臓細胞(Hep G2、HB8065);マウス乳腺癌細胞(MMT 060562、ATCC CCL51);および多くのその他のものなどがある。
種々の態様では、以下の種のいずれか一つまたはそれ以上の濃度またはレベルをモニターすることにより、タンパク質分解性プロセシングまたは凝集の進行(またはその調整;以下を参照)を直接または間接的に検出することができる:前駆体タンパク質;産生物フラグメント;過程中に形成された副産物フラグメント;これらのいずれかの凝集(例えば沈降係数に基づいて)。
したがって、特定のタウタンパク質およびフラグメント(297〜351フラグメントおよびT40に基づく)で実例を示すように、主に前駆体タンパク質から誘導される12kDのプロセシングされた種のレベル増加に基づいて凝集をモニターできる。
・断端されたタウ種および全長のタウ種間の結合の測定を可能にするタウエピトープのN−末端またはC−末端を認識するもの。とりわけ有用なものは、ヒト特異的エピトープを認識する抗体である。かかるモノクローナル抗体の一つ(27/499と称する)は、タウのGly−16およびGln−26間の領域に位置するヒト特異的エピトープを認識し、そしてヒト以外の供給源から誘導される場合、それにより全長のタウ種間の結合の測定が可能になる(「アルツハイマー病の神経原繊維病理の進行におけるタウタンパク質のリン酸化異常の役割」PhD Thesis、ケンブリッジ大学)。
いくつかのモノクローナル抗体の結合部位を図6に示す。
前記したように、本発明は、好ましくは、モデル化および、本明細書にて論じた疾患の処置のための治療用物質を同定する方法における、本明細書で提供されるようなシステムの使用に関する。
(a)前記で論じた安定した細胞または細胞系を提供することと、
(b)細胞を刺激に供し、前駆体タンパク質が、細胞において発現されるようにし、そしてそれにより、鋳型フラグメントと前駆体タンパク質との相互作用がタンパク質における立体配座変化を引き起こし、例えば凝集および前駆体タンパク質の産生物フラグメントへのタンパク質分解性プロセシングを引き起こすことと、
(c)作用物質の存在下、産生物フラグメントの産生をモニターすることと、
(d)場合によって工程(c)で得られた値を参考値と比較することと、
を含む。
前記した種々の方法は、更に工程(d)の結果を作用物質の調整活性と相関させる工程を含むことができる。
前記したモジュレーター(例えばインヒビター)を精製する方法もまた提供されるが、これは、更にこの同定されたモジュレーターを産生する工程を含む。
本発明のこの側面によるスクリーニング法を用いて、疾患関連タンパク質凝集(例えばタウ−タウ、タウ−MAP2またはその他のタンパク質結合)の選択的競合阻害の特性を実証する化合物に関して、前駆体タンパク質が関わるいずれかの「正常な」(例えばタウまたはMAP2のチューブリンへの、または相似による、その他の前駆体タンパク質と解っている限りのその結合パートナーとの)結合と干渉することなく、スクリーニングすることができる。
「疾患」および「正常な」機能を有する別のタンパク質のための類似の方法は、本発明の開示に鑑みて当業者に想定されよう。
所望する場合、本発明の方法は、更に、例えば乳酸デヒドロゲナーゼアッセイキット(シグマ)を用いることによる、鋳型タンパク質および場合によっては前駆体タンパク質を発現する細胞の生存性を試験する工程を含むことができる。
タウ−タウ、タウ−MAP2またはMAP2−MAP2凝集が、研究される場合(前記の「特異性」の項目を参照)、タウ−チューブリンまたはMAP2−チューブリン結合の阻害または干渉が、細胞が分割する能力の低下、そしてしたがって細胞生存性の低下とある程度相関するので、この工程は、タウまたはMAP2のチューブリンへの結合の、被検物質によるいずれかの干渉の指数をも提供できる。
細胞生存性は、作用物質のLD50値を得るために使用されてもよい。
好ましい阻害は、少なくとも2、5、10または20の治療指数を有する(LD50/B50、図9の論考を参照)。
試験される化合物は、適切な活性に関して評価するのが望ましいいずれかのものでよい。
方法を新規インヒビター/モジュレーターを同定するための1次スクリーニングとして、または公知のインヒビター/モジュレーターを更に詳細に研究するための2次スクリーニングとして提供することができる。
本発明は別の側面で、本明細書にて提供されるスクリーニング法により同定される化合物にまで広げられ、そしてタンパク質の立体配座重合化の誘起のかかるインヒビター/モジュレーターを含む組成物にまで広げられる。
したがって本発明者らの研究は、作用のメカニズムが天然の本来の立体構造であることを実証することで、本明細書にて論じる疾患の側面においてかかる化合物の選択、評価、処方および使用のための予想外の意味を有している。
(I)
R5は、水素、ヒドロキシ、カルボキシ、置換されたまたは置換されていないアルキル、ハロアルキルまたはアルコキシから選択され;並びにR10およびR11は、独立して水素、ヒドロキシ、カルボキシ、置換されたまたは置換されていないアルキル、ハロアルキルまたはアルコキシから選択される)
の還元(「ロイコ」)フェノチアジンまたは医薬的に許容されるその塩の、本明細書で開示された疾患の処置における使用が開示される。
R10およびR11は、独立して水素、−CH3、−C2H5または−C3H7から選択され;そして
R5は、水素、−CH3、−C2H5または−C3H7から選択される。
好ましくは、化合物はメチレンブルー、塩化トロニウム、チオニン、アズールA、アズールBまたは1,9−ジメチルメチレンブルーから選択される。
これらの化合物を直接投与する代わりに、これらを前駆体の形態で投与して、処置される細胞で産生されるかまたはその細胞に標的化される活性化物質により活性化形態に変換することができる。例えばメチレンブルーを前駆体の形態で投与できるか、またはそれ自体を化合物アズールAの前駆体として提供できる。
目的のこれらの化合物のいくつかは、還元形態で優先的に体内を循環することが知られている。例えばMBの薬物動態の論考に関しては、例えばDiSanto,A.ら、Journal Pharm.Sci.61(7):1086(1972)およびDiSanto,A.ら、Journal Pharm.Sci.61(7):1090(1972)を参照のこと。第3に、化合物例えばMBの還元形態のみが、血液脳関門を通過することが見出されている(Chapman,D.M.、Tissue and Cell 14(3):475(1982);Muller,T.、Acta Anat.144:39(1992);Muller,T.、J.Anat.184:419(1994);Becker,H.ら、Zeitschrift fur Naturforschung 7:493(1952);Muller,T.、It.J.Anat.Embryol.100(3):179(1995);Muller,T.、Histol.Histopathol.13:1019(1998))。
したがって好ましい形態では、本発明のフェノチアジン物質は、場合によっては安定化剤の存在下、例えば凍結乾燥製剤で前還元化合物として提供される。
したがって、本発明の側面は更に前記した疾患の処置または予防に用いるための医薬品の調製方法を含み、この方法は化合物を還元し(これが少なくともおよそ50、60、70、好ましくは80、90、95、または99%還元されるように)、そして同一物を必要とする患者に適当な用量を投与する前に、還元形態で凍結乾燥された組成物においてそれを安定化する工程を含む。
「予防的に有効な量」または「治療的に有効な量」で投与するのが好ましく(場合によっては、予防が治療であると考えられることもある)、これは、個体に利益を示すのに十分である。実際に投与された量および投与の割合および時間経過は、処置すべき疾患の特性および重篤度に依存する。処置の指示書、例えば投与量の決定等は、一般的な開業医およびその他の医師の責任範囲内であり、そして典型的には処置される障害、個々の患者の症状、分配部位、投与方法および開業医に公知のその他の因子を考慮に入れる。
図19は、MB対IV用量の組織レベルの変化を示す。
適当な化合物、例えば前記で示した式を有するもの、またはその薬学的に許容される塩を、更に有毒に関して試験した後、本発明のこの側面の組成物に組み込むことができる。組成物には、前記の構成成分に加えて、薬学的に許容される賦形剤、担体、バッファー、安定剤または当業者に公知のその他の材料を含むことができる。かかる材料は、無有毒であり、そして活性成分の有効性に干渉しないものでなければならない。担体またはその他の材料の正確な特性は、投与経路に依存し得る。
坐剤に適した賦形剤は、例えば天然または硬化油、ワックス、脂肪、半固体または液体ポリオール等である。
本発明に従って、本明細書で提供される処方を、アルツハイマー病、運動ニューロン疾患、レビ小体疾患、ピック病または進行性核上麻痺、またはタンパク質の立体配座重合の誘起が関係するいずれかその他の症状もしくは疾患の予防または処置に用いることができる(図5参照)。とりわけ、以下に詳細に記載するように、処方を、病理学的タウ−タウ会合の遮断、調整および阻害に用いることができる。
前記した技術およびプロトコルの実例は、「Remington’s Pharmaceutical Sciences」第16版、Osol,A.(編)(1980)において見出すことができる。
前記するように、化合物をその還元形態に変換すること、および/またはその還元形態を安定化することにより、化合物の阻害可能性を最適化することができる。
しかしながら、本明細書後記の実施例にてより詳細に記載するように、驚くべきことに、化合物の酸化還元能力は、タンパク質の立体配座重合の誘起に関するその阻害活性を直接決定せず、そして、したがって酸化モデルも触媒還元モデルもタウ−タウ凝集インヒビターとしての化合物の活性の理解に関連しない。
拡散係数は、陰極での放電した分子のスタッキングの量により決定される。実験的には、還元電位で酸化還元セルでの電流を測定することによりこれを評価することができる。拡散係数は、陰極で形成するヘルムホルツ層内の放電した(すなわち還元)種の凝集の程度と逆相関する。これらの凝集は、フェノール環系を通ってパイ結合したスタッキング相互作用により形成される。
(a)タウタンパク質またはタウコアフラグメントを含有するその誘導体を;
(b)タウ−タウ凝集を遮断、調整または阻害するその能力に関して試験すべき物質;並びに
(c)工程(a)のタウタンパク質に結合できる標識されたタウタンパク質もしくは標識されたその誘導体、または工程(a)のタウタンパク質から区別され、そして工程(a)のタウタンパク質に結合することもできるタウタンパク質もしくはその誘導体;
と接触させる工程を含む。
一般的な材料および方法
3T6H細胞系の産生
3T6細胞は、ECACC番号:86120801マウススイスアルビノ胚繊維芽細胞であった。
NotI部位および必要に応じて出発または停止コドンを含むプライマー(以下に示す)を用いてベントポリメラーゼ(NEB)でPCRにより、pOPRSVICATベクターへのクローニングのためのT40インサートを調製した。PCR産生物およびpOPRSVICATベクターをNotIで切断し、精製した。ベクターを脱リン酸化して再ライゲーションを防御し、そしてインサートを標準的なプロトコルを用いてベクターにライゲートした。
インサートを一回およびベクターを最大で数回切断し、そして各々の配向で異なる制限消化パターンが得られる制限酵素を用いて配向を決定した。HindIIIは、pOPRSVT40のためのこれらの基準に適合する。インサートが存在しない場合、二つの制限バンドが産生される。インサートが存在する場合、三つのバンドが産生され、そしてバンドの大きさは、以下に示すようなインサートの配向に依存する。
正(正しい)配向 5385bp 1030bp 381bp
逆配向 6101bp 381bp 314bp
pOPRSVT40プラスミドを産生し、CsClグラジエント遠心により精製した。これを前記のように産生した3T6H細胞(Lacレプレッサータンパク質を発現する)にトランスフェクトした(エレクトロポレーションによる)。陽性細胞をG418に対する抵抗性(500μg/mlで)により選択した。抵抗性コロニーを取り、成長させた。IPTGの添加を伴うおよび伴わないT40全長の発現レベルを免疫細胞化学およびウェスタンブロットの双方により抗タウ抗体で決定した。
プラスミドpZeo295〜391をタウの断端されたフラグメント(295〜391残基、以下参照)に対応するタンパク質を発現するように設計した。構成系(インビトローゲン、オランダのpcDNA3.1)を使用した(プラスミドは、抗生物質ゼオシンに対する抵抗性を付与する)。この領域に対するcDNAを特異的オリゴヌクレオチドプライマー(センスおよびアンチセンス;以下参照)を用いてポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により増幅した。センスプライマーは、EcoRI部位およびアンチセンス、BamHI部位を含有した。フラグメントをEcoRIおよびBamHIで消化したpcDNA3.1(−)ゼオ(インビトローゲン、オランダ)にサブクローニングした。挿入したDNAは、サイトメガロウイルスプロモーター配列から下流で、そしてポリアデニル化シグナルの上流である。プラスミドは、細菌および真核細胞の各々で選択するためのアンピシリンおよびゼオシン抵抗産生を発現するためのDNA配列を含有する。挿入されたDNAの確実性を、双方の鎖の全長シークエンシングにより確認した。
使用した培地は、ライフ・テクノロジーズ、スコットランドのDEM(グルタマックスI、ピルビンサン塩、グルコース4.5g/lを伴う)であった。FCS10%(ヘレナ・バイオサイエンシズ)、ペニシリン50U/ml、ストレプトマイシン50μg/ml、および関連するプラスミドの選択および維持に適当な別の抗生物質でこれを補充した。抗生物質濃度は、ヒグロマイシン200μg/ml(p3’SS選択および維持)、G418 500μg/ml(pOPRSVT40選択および維持)、ゼオシン400または200μg/ml(pZeo295〜391選択および維持)であった。
組換えタウ(クローンhtau40)並びに、ラットおよびヒトから抽出した過塩素酸可溶性タウを以前に記載されたように調製した(Goedert,M.およびJakes,R.、EMBO J.9:4225;Goedert,M.ら、Proc.Natl.Adad.Sci. USA 90:5066)。
前記で概要を示すように成長させた細胞をPBSで一回洗浄し、次いでラエムリバッファー50μl(24ウェルプレート)または100μl(6ウェルプレート)で溶解する。サンプルを−20℃で貯蔵し、4分間煮沸してからバイオラッド・ミニプロティーンIIIミニゲル系を用いてアクリルアミドゲル15%上を走らせる。CAPバッファー系を用いてウェスタンブロッティングによりタンパク質をPVDF膜に移す。膜を遮断バッファー(PBS中脱脂粉乳5%(マーベル)、トゥイーン20 0.1%)中1時間から一晩インキュベートする。遮断バッファーで1:5に希釈したmAb7.51で膜をインキュベートすることによりタウタンパク質を検出し、ウェルをPBS/0.1% トゥイーン20で洗浄し、遮断バッファーで1:5000希釈した抗マウスHRPと共に1時間インキュベートし、そしてウェルをPBS/0.1% トゥイーン20で洗浄する。ECLハイパーフィルムに検出されるECL反応により結合抗体を検出する(アマシャム)。
チオニン、メチレンブルー、DMMB、および塩化トロニウムをすべてddH2O中のストック1mMとして調製する。使用前に希釈ストック100μMをHBSSで調製し、これを細胞の培地に直接添加する。
酸化薬物に関しては、ストック1mMをHBSSで希釈することにより、これを簡単に調製し、そして滅菌濾過する。
標準的な電気泳動およびイムノブロッティング手順を以前に記載されたように用いた(Wischik,C.M.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:4506(1988);Novak,M.ら、EMBO J.12:365(1993);Jakes,R.ら、EMBO J.10:2725(1991))。イムノブロットをABCキットで展開した(ベクター・ラボラトリーズ)。モノクローナル抗体(mAb)7.51、21.D10、499および342を希釈していないハイブリドーマ培養上澄液として用いた。mAb AT8(イノジェネティクス、ベルギー)を1/1000希釈で用いた。抗タウmAb7.51(これは、最後の反復のエピトープを認識する;Novak,M.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:5837(1991)参照)、423(これは、残基Glu−391で断端されたタウC−末端を認識する;Wischik,C.M.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:4506(1988);Novak,M.ら、EMBO J.12:365(1993)参照)、499(これは、残基Gly−14およびGln−26の間のヒト特異的タウセグメントを認識する;Wischik,C.M.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:11213(1996)参照)、および342(これは、残基Ser−208およびPro−251の間のセグメントを認識する)。mAb21.D10は、A68−タウ脳抽出物に対して上昇した(Lee,V.M.−Y.ら、Science 251:675(1991))。
これは基本的にWischik,C.M.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:11213(1996)に記載されるように実施した。炭酸塩バッファー50mM中37℃で1時間、96ウェルポリ(塩化ビニル)マイクロタイタープレート上で固相タウ(0〜20μg/ml)を被覆した。プレートをトゥイーン20 0.05%で二回洗浄し、次いでPBST中マルベル2%で37℃で1時間遮断した。再度洗浄した後、プレートを水相タウ(ゼラチン1%を含有するPBST中0〜300μg/ml)と共に37℃で1時間インキュベートした。本出願では、DTT1mMをも添加した。
これは、Wischikら、(前出)に記載されたように実施し、そしてクアシ−ニュートン近似値を用いてカレイダグラフ(シナージー、フィラデルフィア)またはシスタット(SPSS Inc.、シカゴ)プログラムでラングムイア等式曲線に従って曲線が適合された。曲線適合相関係数を図に示す。
全長、断端されたおよび突然変異タウの構成発現
真核細胞系におけるタウの発現は、リポフェクチンベースの研究法の制限を受けない生理学的条件下でタウ凝集の細胞モデルを作製することが求められていた。これには、正常なタウおよび病原性突然変異を担持するタウの双方に関する全長タウおよび断端されたタウフラグメントの発現が関係する。
正常な全長タウ(T40)は、細胞(3T3およびNIE−115)にトランスフェクトされた場合、発現され、そして細胞内の微小管ネットワークの集合に関係した。
最初に、フラグメント297〜391に対応するPHFのコアからの断端されたタウフラグメントのcDNAを非ニューロン性3T3繊維芽細胞にトランスフェクトした:この断端されたタウは:(i)PHF−コアに存在する;(ii)疾患の初期段階でAD脳組織における沈着として検出される;(iii)触媒性捕捉およびインビトロでのタウ捕捉の伝播を支持することができる;ので、これを選択した。続いて、タウ分子の免疫化学特性に部分的に依存した、N−またはC−末端のいずれかでのトランケーションの程度が変化した一連のトランスフェクションを実施した。N−末端で(186〜441;297〜441)、C−およびN−末端で(186〜391;297〜391)およびC−末端(1〜391)でのトランケーションを伴う6つの構築物を作製した。限定された抗体のパネルを伴う6つの構築物に関する免疫反応性のパターンにより、このように作製されたタウフラグメントのすべてを識別することができた。
全長タウの突然変異誘発を用いて臨床的に公知である突然変異を作製した。これらをpIF2にサブクローニングし、そしてタウの微小管集合特性に影響するもの(G272V、V337M、P301S、R406W)、およびタウ遺伝子のインビボ選択的スプライシングに影響するS305Nを含む多くの突然変異体に関して安定したトランスフェクト体を3T3およびNIE細胞において作製した。概して、突然変異を担持する全長タウを発現する細胞は、微小管ネットワークの標識化を呈し、野生型タウでトランスフェクトした細胞から区別できなかった。突然変異を含む、特定の断端されたタウフラグメントを発現する細胞系は、安定でないことが判明した。
要約すると、真核細胞内での断端されたタウの構成的発現は、達成するのが困難であると判明した。297−タウの開始コドンを取り囲むコザックコンセンサスを操作することにより、一過性のトランスフェクション系によるタウの発現の最適化が可能になったが、例えば297〜391の発現は、依然わずかであり、これは、フラグメントのいくつかの固有の有毒特性を示唆している。安定したトランスフェクションによりこの結論が繰り返された。この後者の系は、N−またはC−末端のいずれかでのトランケーションにより、タウが微小管ネットワークにおいてよりもむしろ無晶形沈着において集合する傾向がわずかに大きくなることを実証した。またタウフラグメントの組み合わせの安定した発現により細胞の細胞質内での凝集をも生じたが、この系は、容易に再現されなかった。
断端されたタウの誘導発現
構成的発現に伴う有毒を伴わない、安定した、再現性のある系を作製する別の試みでは、PHFのコアタウフラグメントの誘導発現(すなわち12kDの297〜391)を試みた。
発明による安定した細胞系におけるタウの発現
前記の結果に鑑みて、以下のような別の系を用いた。組織培養細胞系DH19.4.1.4.およびそのクローンは、全長タウ、誘導プロモーターの制御下の四つの反復ヒトタウおよび構成プロモーターの制御下の断端されたヒトタウ(295〜391)を発現する3T6細胞(ECACC番号:86120801 スイス・アルビノマウス胚繊維芽細胞)に基にした。
図41(a)は、矢頭で示されるおおよその位置で全長タウ分子の鋳型誘起タンパク質溶解性プロセシングによりどのように12kDフラグメントを生じるかを示している。
図42は、これらのフラグメントの見かけのゲル可動性のプロットおよびアミノ酸残基におけるその長さを示し、これは、フラグメントの長さの特徴的なセットから見かけのゲル可動性を理解できることを示している。
タンパク質分解性フラグメントの産生における化合物の阻害効果
12kDのフラグメント(およびその他のもの)の産生が制御され得る安定した細胞系を達成したので、モデルを用いて低減されたチオニンの阻害効果を試験した。これを図23に示す。レーンの各セットでは、より高レベルのT40を誘導する漸増濃度のIPTGの存在下で12kDのバンドの産生が誘導される。チオニン濃度が増加するので、T40からの12kDバンドの産生が、抑制される。これを図24で定量的に示す。チオニンの不在下では、漸増濃度のIPTGでのT40の誘導により、対応する12kDフラグメントの産生の増加が導かれる。チオニン2μMの存在下では、T40は、依然誘導されるが、12kDフラグメントに変換されない。
T40/12kDアッセイにおける種々化合物の作用を図9〜16に示す。
還元および酸化化合物の阻害効果の比較
インビトロデータに関して使用するための数学的モデルを用いて、T40:12kD細胞アッセイにおける被験物質の効果を分析した。インビトロデータからのKdおよびKIに関する公知の値を用いて、示された発現を用いて全長タウの細胞内濃度を解釈した(例えば図10参照)。
ジアミノフェノチアジンの阻害特性の試験
インビトロ研究では、同定された最も活性なタウ−タウ結合インヒビターは、0、2、または3個のメチル基を有するジアミノフェノチアジンの還元形態であった。図25は、かかる化合物の還元形態を示す。図26および27で対応するタウ−タウ結合曲線は、タウに関するモル比の関数として示される。示したように、「脱メチルシリーズ」(0、2または3個のメチル基)化合物は、化合物:タウ「AMR」の3:1〜4:1のモル比(横軸で対数目盛りで示す)でタウ−タウ結合(縦軸で示す)のおよそ50%阻害を生み出す。この群の化合物に関するタウ−タウ結合の50%阻害の平均モル比は、4:1である。
阻害活性および拡散能力
図32は、被験化合物におけるメチル基の数(NMETH)並びに還元電位(E)および拡散係数(DIF)の双方の間に相関性があることを示している。全比較でスピアマンの順位相関を用いた。図32に示すように、メチレンブルーを排除する場合のみ、メチル基の数(NMETH)および還元電位の間に強力な逆関係が認められる(標準体:メチレンブルーを含む相関値;イタリック体:メチレンブルーを排除した相関値)
Claims (5)
- 医薬用組成物が、更に下記:
医薬上許容される賦形剤、担体またはバッファーの1つ以上を含む、請求項1または2のいずれか一項記載の使用。 - 医薬用組成物が、徐放性処方として調製される、請求項3記載の使用。
- タウオパチーが、アルツハイマー病;ピック病;進行性核上性麻痺(PSP);前頭側頭性痴呆(FTD);染色体17に関連したパーキンソン症候群(FTDP−17);脱抑制パーキンソン痴呆筋萎縮症候群(DDPAC);淡蒼球・橋・黒質変性(PPND);グアム−ALS症候群;淡蒼球・黒質・ルイジアン変性(PNLD)および皮質基底変性(CBD)から選択される、請求項1〜4のいずれか一項記載の使用。
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