PT2280961E - Compostos de 1,5-difenil-pirrolidin-2-ona como ligandos de cb-1 - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO

"COMPOSTOS DE 1,5-DIFENIL-PIRROLIDIN-2-ONA COMO LIGANDOS DE CB-1" O recetor canabinoide CB-1 (CB-1) é encontrado principalmente nos sistemas nervosos central e periférico e, em menor extensão, em vários órgãos periféricos. 0 recetor canabinoide CB-2 (CB-2) encontra-se principalmente no sistema imunológico. A farmacologia e terapêutica potenciais para ligandos do recetor canabinoide foram revistas (Pacher et al., Pharmacol. Rev. 58 (2006) 389). Os antagonistas/agonistas inversos do recetor CB-1 foram mostrados serem eficazes para a redução de alimentação e da massa corporal em modelos animais de obesidade. Os antagonistas/agonistas inversos do CB-1 têm sido mostrados a potenciar ainda a atividade de agentes antipsicóticos em vários ensaios e podem ser eficazes no tratamento de ambos os sintomas negativos e cognitivos da esquizofrenia. Além disso, os efeitos na perda de peso de antagonistas/-agonistas inversos de CB-1 foram demonstrados em modelos animais de ganho de peso induzida por tratamento com antipsicóticos e por conseguinte também podem ser eficazes no controlo do ganho de peso e sindrome metabólica emergentes do tratamento vistos com as terapias antipsicó-ticas correntes. Além disso, os antagonistas/agonistas inversos do recetor CB-1 têm sido mostrados a reduzir o 2 ΡΕ2280961 consumo de álcool em modelos animais de ingestão de álcool e por conseguinte podem ser úteis no tratamento de alcoolismo e/ou abuso de substâncias.

Os compostos que atuam no recetor CB-2 podem ter efeitos sobre a função imunológica. Portanto, no desenvolvimento de agentes terapêuticos ativos no recetor CB-1, é desejável ter uma elevada seletividade para o recetor CB-1 versus recetor CB-2 a fim de evitar efeitos indesejáveis.

Numerosos antagonistas/agonistas inversos do recetor CB-1 de ação central foram estudados para o tratamento de obesidade e/ou outros distúrbios. Por exemplo, WO 2007/020502 revela certos compostos de pirrolidin-2-ona substituídos como antagonistas de CB-1. A administração oral é tipicamente a via preferida de administração para agentes para o tratamento de obesidade e/ou esquizofrenia. Para os compostos exibirem boa biodisponibilidade oral, eles tipicamente devem ter boa solubilidade aquosa e estabilidade metabólica suficiente para minimizar a degradação ao passar primeiro no fígado. Os ligandos de canabinoide endógenos e o sítio de complementaridade ao qual eles se ligam no recetor CB-1 são altamente lipofílicos. Consequentemente, os ligandos do recetor CB-1 conhecidos têm também tendência para ser lipofílicos, o que leva a uma fraca solubilidade. Também muitos ligandos do recetor CB-1 têm sido relativamente metabolicamente lábeis. Estas propriedades de solubilidade 3 ΡΕ2280961 e/ou metabolismo de muitos compostos CB-1 resultaram em limitada absorção e biodisponibilidade orais. 0 metabolismo oxidante de alguns compostos podem levar à formação de intermediários metabólicos eletrofí-licos reativos. Tais intermediários são propensos a reação com outros nucleófilos no corpo, tais como proteínas, glutationa, DNA, RNA, etc., os quais podem conduzir a efeitos tóxicos indesejáveis.

As propriedades farmacocinéticas dum agente terapêutico podem ser influenciadas pela coadministração de outros agentes. Estas assim chamadas interações medicamentosas podem levar a um aumento ou a uma diminuição na exposição no plasma do agente terapêutico, conduzindo a problemas com tolerabilidade e/ou eficácia do agente. Os compostos que são metabolicamente depurados através de mecanismos saturáveis, (por exemplo, CYP3A4, CYP2D6, CYP2C9, e CYP1A2) são particularmente propensos a sofrer de tais interações medicamentosas. Inversamente, os compostos que inibem estes mecanismos saturáveis são propensos a causar tais interações medicamentosas. Alguns antagonis-tas/agonistas inversos de CB-1 conhecidos apresentam tais tendências.

Continua a existir uma necessidade de antagonistas ou agonistas inversos do recetor CB-1 que tenha uma elevada seletividade sobre o recetor CB-2, tenham alta potência in vivo (baixa Kb nM) , tenham biodisponibilidade 4 ΡΕ2280961 aceitável, que não formem intermediários metabólicos reativos, e que tenham potencial diminuído para interações medicamentosas. Os compostos da presente invenção proporcionam algumas ou todas estas vantagens. A presente invenção proporciona compostos de Fórmula (I)

em que: R1 é selecionado de entre o grupo constituído por hidrogénio, cloro, ciano, trifluorometilo, difluorometoxi e trifluorometoxi; R2 é selecionado a partir do grupo constituído por hidrogénio, halo, ciano, alquilo C1-C3 substituído com de 1 a 5 grupos fluoro, e alcoxi C1-C3 substituído com de 1 a 5 grupos fluoro; R3 é selecionado a partir do grupo constituído por hidrogénio, fluoro e cloro; R4 é selecionado a partir do grupo constituído por trifluorometilo, ciano e ciclopropilo; com a condição de que, quando R1 é hidrogénio, cloro, ciano ou trifluorometilo, então R2 é alcoxi C1-C3 substituído com de 1 a 5 grupos fluoro; e seus sais farmaceuticamente aceitáveis. 5 ΡΕ2280961

Um perito vulgar na técnica irá reconhecer que os compostos da presente invenção podem existir em formas que têm diferentes pontos de ligação de átomos de hidrogénio particulares e são, por conseguinte, tautoméricos. Os tautómeros individuais, bem como as suas misturas, estão contempladas dentro do âmbito e alcance dos compostos de Fórmula (I), como se especificamente desenhados. Cada uma das formas do tautómero pode existir, interconverter-se e ser submetida a tautomerização sob as condições especificadas .

Um outro aspeto da presente invenção proporciona uma composição farmacêutica compreendendo um composto de acordo com a Fórmula (I), ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, e um agente de suporte, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

Uma incorporação deste aspeto da invenção proporciona uma composição farmacêutica compreendendo um composto de acordo com a Fórmula (I) , ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, e um agente de suporte, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável, em que a pureza ótica do estereoisómero individual do composto de Fórmula (I) ou um seu sal é maior do que 90%, preferivelmente superior a 95%, como por exemplo, superior a 99%.

Um outro aspeto da presente invenção proporciona um composto de acordo com a Fórmula (I) , ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, para uso em terapia. 6 PE2280961

Uma incorporação deste aspeto da presente invenção proporciona um composto de acordo com a Fórmula (I), ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, para uso no tratamento de um distúrbio alimentar associado com a ingestão de alimentos em excesso, ganho de peso, obesidade, esquizofrenia, perturbações cognitivas associados à esquizofrenia, sintomas negativos associados à esquizofrenia, abuso de substâncias, dependência do álcool, e/ou ganho de peso associado com tratamento com um antipsicótico, ou como uma ajuda para deixar de fumar.

Uma outra incorporação deste aspeto da invenção proporciona um composto de acordo com a Fórmula (I), ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, para utilização no tratamento de combinação simultânea, separada ou sequencial com um agente antipsicótico num tratamento para o ganho de peso, obesidade, esquizofrenia, enfraquecimento cognitivo associado com esquizofrenia, sintomas negativos associados com esquizofrenia, e/ou ganho de peso associado com tratamento com um antipsicótico.

Num outro aspeto da presente invenção, é proporcionado o uso de um composto de acordo com a Fórmula (I), ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, no fabrico de um medicamento para o tratamento de um distúrbio alimentar associado com a ingestão de alimentos em excesso, ganho de peso, obesidade, esquizofrenia, enfraquecimento cognitivo associado com a esquizofrenia, sintomas negativos 7 ΡΕ2280961 associados com esquizofrenia, abuso de substâncias, dependência de álcool e/ou ganho de peso associado ao tratamento com um antipsicótico, ou para uma ajuda para deixar de fumar.

Uma incorporação deste aspeto da invenção proporciona a utilização de um composto de acordo com a Fórmula (I), ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, no fabrico de um medicamento para uso em terapia de combinação para ganho de peso, obesidade, esquizofrenia, enfraquecimento cognitivo associado com esquizofrenia, sintomas negativos associados com esquizofrenia, e/ou ganho de peso associado com tratamento com um antipsicótico, em que o referido medicamento é para ser administrado em combinação simultânea, separada ou sequencial com um antipsicótico.

Num outro aspeto deste aspeto da invenção é revelado um método para o tratamento de um distúrbio alimentar associado com a ingestão de alimentos em excesso, ganho de peso, obesidade, esquizofrenia, enfraquecimento cognitivo associado com a esquizofrenia, sintomas negativos associados à esquizofrenia, abuso de substâncias, dependência de álcool e/ou ganho de peso associado com tratamento com um antipsicótico, ou para uma ajuda para deixar de fumar num mamífero, particularmente um humano, compreendendo a administração a um mamífero em necessidade de tal tratamento, de uma quantidade eficaz de um composto de acordo com a Fórmula (I) ou um seu sal farmaceuticamente aceitável. 8 ΡΕ2280961

Uma outra incorporação deste aspeto da invenção revela um método para o tratamento de ganho de peso, obesidade, esquizofrenia, enfraquecimento cognitivo associado com a esquizofrenia, sintomas negativos associados à esquizofrenia, e/ou ganho de peso associado com o tratamento com um antipsicótico num ser humano, compreendendo a administração a um humano com necessidade de tal tratamento, de uma quantidade eficaz de um composto de acordo com a Fórmula (I), ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, em combinação simultânea, separada ou sequencial com um antipsicótico.

Além disso, a presente invenção proporciona uma formulação farmacêutica adaptada para o tratamento de um distúrbio alimentar associado com a ingestão de alimentos em excesso, ganho de peso, obesidade, esquizofrenia, enfraquecimento cognitivo associado com a esquizofrenia, sintomas negativos associados à esquizofrenia, abuso de substâncias, dependência de álcool, e/ou ganho de peso associada com o tratamento com um antipsicótico, ou para uma ajuda para deixar de fumar, que compreende um composto de Fórmula (I), ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, em associação com um agente de suporte, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

Na utilização dos compostos da presente invenção no tratamento de combinação simultânea, separada ou sequencial com um antipsicótico, um antipsicótico atipico é 9 ΡΕ2280961 preferido, como por exemplo a olanzapina, clozapina e/ou risperidona.

Os compostos de Fórmula (I) são agonistas inversos ou antagonistas seletivos para o recetor CB-1. Os compostos são particularmente seletivos para o recetor CB-1 relativamente ao recetor CB-2. Como agonistas inversos (ou antagonistas) do recetor CB-1, os compostos são úteis para o tratamento e/ou prevenção de condições associadas com o recetor CB-1. Tais condições incluem, por exemplo, distúrbios alimentares associados com a ingestão de alimentos em excesso, obesidade, esquizofrenia, particularmente os sintomas negativos associados com esquizofrenia, como por exemplo enfraquecimento cognitivo associado com esquizofrenia, abuso de substâncias, dependência de álcool, cessação de fumar e ganho de peso associado com tratamento com um antipsicótico. Ver DSM-IV-TR., Diagnostic and Statistical Manual of Mental Dlsorders. Revlsed, 4a Ed., Text Revision (2000) . O perito na técnica irá reconhecer que existem nomenclaturas alternativas, nosologias e sistemas de classificação para condições psicológicas patológicas e que estes sistemas evoluem com o progresso cientifico médico.

Os compostos de Fórmula (I) também podem ser usados para melhorar o ganho de peso, quer ou não o individuo de ganho de peso associado seja classificado como clinicamente obeso. 10 ΡΕ2280961

Um outro aspeto da presente invenção proporciona um método cosmético de induzir perda de peso, compreendendo a administração a um humano de um composto de fórmula (I).

Uma quantidade eficaz dos compostos de Fórmula (I) pode ser administrada a um paciente em necessidade de tal tratamento ou profilaxia de maneira a praticar os métodos de terapia presentes. A necessidade de uma administração profilática de acordo com os métodos da presente invenção é determinada por meio da utilização de fatores de risco bem conhecidos. A quantidade eficaz de um composto individual é determinada, em última análise, pelo médico responsável pelo tratamento, mas depende de fatores tais como a doença ou perturbação a ser tratada, a gravidade da doença e outras doenças ou condições presentes, a via de administração escolhida, outros fármacos e tratamentos de que o paciente pode concomitantemente necessitar, e outros fatores no julgamento do médico. A magnitude da dose terapêutica ou profilática de um composto de Fórmula (I) variará, claro, com o tamanho e idade do paciente, natureza e gravidade da condição a ser tratada, o composto particular utilizado, e a via de administração desej ada. A dose pode ser administrada numa dose diária única ou a dosagem diária total pode ser administrada em doses múltiplas divididas, como por exemplo duas, três ou quatro vezes por dia. Além disso, com base nas propriedades do composto individual selecionado para a administração 11 ΡΕ2280961 e/ou as caraterísticas da forma de dosagem (isto é, a libertação modificada), a dose pode ser administrada menos frequentemente, e.g., semanal, duas vezes por semana, mensalmente, etc. A dosagem unitária pode ser correspondentemente maior para a administração menos frequente. Quando administrada via transdérmica, ou por meio de uma solução intravenosa contínua, a administração da dosagem será, certamente, contínua em vez de intermitente ao longo do regime de dosagem.

Tal como utilizado acima, e em toda a descrição da invenção, os seguintes termos, a menos que indicado de maneira diferente, terão o seguinte significado:

Conforme aqui utilizado, o termo "alquilo C1-C3" refere-se a metilo, etilo, propilo e isopropilo. "Halo" refere-se a um flúor, cloro ou bromo. "Alcoxi C1-C3" refere-se a metoxi, etoxi, propoxi e isopropoxi. "Agonista(s) inverso(s)" refere-se àqueles compostos que possuem atividade intrínseca negativa, invertendo a atividade constitutiva do recetor. Os agonistas inversos atuam para inibir ou reverter a atividade dos agonistas. "Obesidade" refere-se à condição de ter uma 12 ΡΕ2280961 quantidade elevada de gordura corporal Uma pessoa é considerada obesa se ele ou ela tem um indice de massa corporal (IMC) de 30 kg/m2 ou mais. Uma pessoa com IMC = 27-30 é geralmente considerado com excesso de peso. Convencionalmente, as pessoas com peso normal têm um IMC de 19,9-26,9. A obesidade pode ser devida a qualquer causa, quer genética quer ambiental. Os exemplos de doenças que podem resultar em obesidade ou ser a causa da obesidade incluem comer em excesso, diminuição da atividade fisica e condições patológicas que mostram atividade metabólica reduzida. A invenção não é afetada pela definição exata de obesidade pelo padrão IMC e todas tais definições devem ser considerados como equivalentes. O termo "farmacêutico" ou "farmaceuticamente aceitável" quando aqui utilizado como adjetivo, significa substancialmente não-tóxico e substancialmente não deletério para o recetor.

Por "composição farmacêutica" pretende-se ainda significar que o agente de suporte, solvente, excipientes e/ou sal devem ser compatíveis com o ingrediente ativo da composição (e.g., um composto de Fórmula (I)). É entendido pelo perito vulgar nesta técnica que os termos "formulação farmacêutica" e "composição farmacêutica" são geralmente intermutáveis, e eles são assim utilizados para os fins deste pedido. Será também entendido que uma composição farmacêutica de acordo com a presente invenção terá um ou mais compostos de Fórmula (I) e pode também conter um ou 13 ΡΕ2280961 mais outros ingredientes ativos, conforme desejado para uma dada composição farmacêutica. "Prevenção" (de obesidade ou ganho de peso) refere-se à prevenção da obesidade ocorrer se o tratamento é administrado antes do inicio da condição obesa. Além disso, se o tratamento é iniciado num indivíduo já obeso, tal tratamento é esperado a prevenir, ou a prevenir a progressão de ganho de peso adicional. Um exemplo de tal prevenção é prevenir o ganho de peso adicional num humano sujeito a tratamento com um antipsicótico.

As abreviaturas aqui utilizadas são definidos como segue: "THF" significa tetra-hidrofurano. "MTBE" significa éter metil-terc-butilo. "HOAc" significa ácido acético. "Et20" significa éter dietílico. "BSA" significa albumina de soro bovino. "GDP" significa guanosina-difosfato. "GTP" significa guanosina-5'-trifosfato. "GTP-y35S" significa guanosina-5'(γ-tio)-trifosfato. "HEPES" significa ácido (4-(2-hidroxietil)-1-piperazi-noetanossulfónico). "HOAc" significa ácido acético. "i.v." ou "iv" significa intravenosa. "p.o." ou "po" significa por via oral. "THF" significa tetra-hidrofurano. "tr" significa tempo de retenção. 14 ΡΕ2280961

Embora todos os compostos da presente invenção sejam úteis como agonistas inversos (ou antagonistas) de CB-1, certas classes são preferidas, como por exemplo, compostos possuindo qualquer uma das seguintes seleções enumeradas de substituintes: 1) R1 é -OCF3, -OCHF2, -CF3 ou -CN. 2) R1 é -OCF3, -OCHF2 ou -CF3. 3) R1 é -OCF3 ou -OCHF2. 4) R1 é -OCF3 ou -CF3. 5) R2 é hidrogénio, flúor, cloro, ciano, trifluorometilo, 1,1-difluoroetilo, trifluorometoxi, difluorometoxi ou 1,1,2,2-tetrafluoroetoxi. 6) R2 trifluorometilo, 1,1-difluoroetilo, difluorometoxi, trifluorometoxi ou 1,1,2,2-tetrafluoroetoxi. 7) R2 trifluorometilo, 1,1-difluoroetilo, difluorometoxi, trifluorometoxi ou 1,1,2,2-tetrafluoroetoxi, e R3 é hidrogénio. 8) R2 é -OCF3 ou -CF3. 9) R2 é -OCF3 ou -CF3, e R3 é hidrogénio. 10) R2 é -OCF3, -OCHF2 ou 1,1,2,2-tetrafluoroetoxi. 11) R2 é -OCF3,-OCHF2 ou hidrogénio. 1, 1,2,2-tetrafluoroetoxi, e R3 é 12) R3 é hidrogénio. 13) R4 é -CF3. 14) R1 é -OCF3, -OCHF2 e R2 é hidrogénio, fluoro, cloro, ciano, trifluorometilo, 1,1-difluoroetilo, trifluoro-metoxi, difluorometoxi ou 1,1,2,2-tetrafluoroetoxi. 15) R1 é -OCF3, -OCHF2, e R2 é trif luorometilo, 1,1- ΡΕ2280961 -cíif luoroetilo, trifluorometoxi, dif luorometoxi ou 1,1,2,2-tetrafluoroetoxi, e R3 é hidrogénio. 16) R1 é -OCF3, -CF3 ou -CN; R2 é hidrogénio, -OCF3 ou -CF3, R3 é hidrogénio, e R4 é -CF3. 17) R1 é -OCF3 ou -CF3; R2 é hidrogénio, -OCF3 ou -CF3, R3 é hidrogénio, e R4 é -CF3. 18) R1 é -OCF3, -CF3 ou -CN; R2 é -OCF3 ou -CF3, R3 é hidrogénio, e R4 é -CF3. 19) R1 é -OCF3 ou -CF3, R2 é -OCF3 ou -CF3, R3 é hidrogénio, e R4 é -CF3.

Os compostos específicos preferidos da presente invenção são os descritos nos Exemplos aqui apresentados, incluindo as bases livres e os seus sais farmaceuticamente aceitáveis.

Esquemas Gerais

Os compostos da presente invenção podem ser preparados de acordo com os seguintes esquemas sintéticos, por métodos bem conhecidos e apreciados na técnica. As condições de reação adequadas para os passos destes esquemas são bem conhecidos na técnica e as substituições apropriadas de solventes e correagentes estão dentro da perícia na técnica. Da mesma forma, será apreciado pelos peritos na técnica que os intermediários sintéticos podem ser isolados e/ou purificados por várias técnicas bem conhecidas conforme necessário ou desejado e que, frequentemente, será possível utilizar vários intermediá- 16 ΡΕ2280961 rios diretamente em passos de síntese subsequentes com pouca ou nenhuma purificação. Além disso, o perito na técnica irá apreciar que, em algumas circunstâncias, a ordem em que as porções são introduzidas não é crítica. A ordem em particular dos passos necessários para produzir os compostos de Fórmula I depende do composto particular a ser sintetizado, do composto de partida, e da labilidade relativa das porções substituídas, como é bem apreciado pelo químico experiente. Todos os substituintes, a menos que indicado de maneira diferente, são conforme previamente definidos, e todos os reagentes são bem conhecidos e apreciados na técnica.

Esquema I

No Esquema I, um composto de Fórmula (II) pode ser preparado pelo método descrito por Andreichikov e colaboradores (Andreichikov et al., Zhurnal Organicheskoi Khimii, 22 (10), 2208-13 (1986)), no qual uma mistura de uma amina de Fórmula (1) e um aldeído de Fórmula (2) é tratada com um éster de ácido pirúvico (3) , onde Qi é um grupo alquilo C1-C3, num solvente adequado, tal como HOAc glacial. Os ésteres adequados de ácido pirúvico incluem piruvato de etilo. A reação pode processar-se a 17 ΡΕ2280961 temperaturas entre a temperatura ambiente e o ponto de ebulição do solvente. Em alguns casos, o produto (II) pode precipitar durante o decurso da reação ou após a adição de um solvente no qual o produto não é altamente solúvel. Estes solventes incluem álcool isopropilico e água e suas misturas. Se um precipitado é formado, o composto de Fórmula (II) pode ser isolado por filtração e secagem a vácuo ou por filtração e cromatografia. Alternativamente, o composto pode ser isolado por concentração da reação e cromatografia do residuo ou por manipulação aquosa e concentração e cromatografia dos extratos orgânicos.

Esquema II

No Esquema II, um composto de fórmula (III) pode ser preparado por tratamento de um composto de fórmula (II) com água, facultativamente na presença de um ácido. Esta reação também pode ser facultativamente realizada na presença de solventes adicionais tais como tetra-hidro-furano, ácido acético e etanol ou suas misturas. Um ácido adequado inclui ácido trifluoroacético e ácido clorídrico. É muitas vezes vantajoso realizar esta reação na presença de pelo menos um equivalente de 2,5-dimetoxitetra-hidro- 18 ΡΕ2280961 furano. Uma vez que o composto de fórmula (III) esteja formado, ele pode ser isolado por adição de água e arrefecimento para formar um precipitado e subsequente isolamento do precipitado por filtração ou por adição de uma mistura de solventes tais como tolueno e acetato de isopropilo e lavagem com água e solução aquosa saturada de bicarbonato de sódio. A camada orgânica pode ser seca sobre um dessecante, tal como sulfato de sódio e concentrada para proporcionar o produto na forma duma mistura crua. A camada orgânica também pode ser utilizada diretamente na reação seguinte sem demais concentração ou purificação.

Esquema III

No Esquema III, um composto de Fórmula (IV) pode ser preparado por tratamento de uma solução de um composto de Fórmula (III) com um composto de Fórmula (4) num solvente adequado tal como tolueno, metanol, acetato de isopropilo ou uma mistura dos solventes. Esta reação pode também ser realizada na presença de um catalisador tal como HOAc. 0 composto de Fórmula (IV) pode ser isolado, se desejado, por métodos conhecidos na técnica tal como por precipitação ou por cromatografia sobre gel de silica. ΡΕ2280961 19

Esquema IV

No Esquema IV, um composto de fórmula (Ia) pode ser formado por tratamento de um composto de fórmula (IV) sob condições de redução adequadas. As condições de redução adequadas incluem o tratamento com NaCNBH3 na presença de HOAc em um solvente tal como tetra-hidrofurano. 0 composto de Fórmula (Ia) pode ser isolado por meios tais como manipulação aquosa ou precipitação do produto. Uma purificação adicional pode ser realizada por utilização de técnicas tais como cromatografia sobre gel de silica.

Na sintese de um composto de Fórmula (Ia) qualquer dos intermediários de Fórmula (III) ou Fórmula (IV) pode ser utilizado diretamente em reações subsequentes sem purificação dos intermediários crus.

Os enantiómeros individuais de compostos de Fórmula (Ia) são geralmente preferidos relativamente aos racematos correspondentes. Estes enantiómeros podem ser preparados por resolução de um composto de Fórmula (Ia) usando técnicas tais como cromatografia preparativa empregando uma fase estacionária quiral. Os enantiómeros 20 ΡΕ2280961 podem também ser preparados por resolução, a qual compreende a formação de um sal da mistura racémica com um ácido oticamente ativo e purificação do sal diastereomérico desejado. 0 sal diastereomérico desejado pode ser purificado por cristalização. Alternativamente, qualquer dos intermediários de fórmula (II), (III), ou (IV) pode ser resolvido para proporcionar substancialmente um enantiómero individual que pode em seguida ser convertido utilizando os métodos descritos acima, para proporcionar um composto de Fórmula (Ia) na sua forma enantiomericamente purificada, tal como os compostos de Fórmula (I). Os intermediários de fórmula (II), (III) ou (IV) podem ser preparados por resolução de compostos do composto racémico correspondente utilizando técnicas tais como cromatografia preparativa empregando uma fase estacionária quiral.

Esquema V

Um método alternativo e muitas vezes preferido para a preparação de enantiómeros purificados de compostos 21 ΡΕ2280961 de fórmula (III) é delineado no Esquema V. Um composto racémico de fórmula (III) é feito reagir com um composto de fórmula (5) , em que Q2 é hidrogénio ou halo, para formar uma mistura diastereomérica de compostos de fórmula (Va) e (Vb) . Os compostos preferidos de fórmula (5) incluem R-a--metilbenzilamina ou S-a-metilbenzilamina. Esta condensação pode ser realizada tal como descrito anteriormente no Esquema III pela combinação de um composto de Fórmula (III) e o composto (5) num solvente inerte. Esta reação pode também ser realizada na presença de um catalisador tal como HOAc. Os diastereómeros de fórmula (Va) e (Vb) são em seguida separados usando técnicas tais como cromatografia sobre gel de silica ou cristalização a partir de solventes inertes tais como isopropanol ou metanol/KOH. 0 diastereó-mero desejado (designado (Va)) no Esquema V é em seguida hidrolisado para formar o enantiómero purificado com a fórmula (Illa). As condições de hidrólise adequadas incluem o tratamento de uma solução do diastereómero desejado em HOAc com ácido clorídrico aquoso ou ácido trifluoroacético e água e, facultativamente, 2,5-dimetoxitetra-hidrofurano. Em alguns casos, o produto cru (Illa) pode conter quantidades substanciais do dimero de fórmula (VI).

No Esquema V, o composto racémico de fórmula (III) pode ser o produto cru resultante do processo delineado no Esquema II. Além disso, o enantiómero purificado (contendo facultativamente (VI)) de fórmula (Illa) pode ser usado diretamente a partir da reação de hidrólise, sem purificação adicional, no processo delineado no Esquema III. 22 ΡΕ2280961

No Esquema V, o enantiómero R do composto (5) foi escolhido para exemplificar o processo. Um perito na técnica irá reconhecer que o enantiómero S do composto (5) pode também ser usado neste processo. A escolha de se utilizar o enantiómero R ou o S pode ser feita dependendo de qual irá produzir o diastereómero desejado que é mais facilmente isolado.

Esquema VI

No Esquema VI, o composto de fórmula (IVb) pode também ser formado por tratamento do composto de fórmula (VI) com o composto (4) sob as mesmas condições conforme descrito para a reação do composto (III) com (4) (Esquema III) .

Esquema VII R*Q /Si r H.C ch3 * (j Λ qh3c ch3 "** * N Hac ch3 m (10) (4)

No Esquema VII, o composto (4) é preparado por tratamento de um composto (9), no qual R10 é hidrogénio, 23 ΡΕ2280961 -CH3, -CH2CH3 ou -C(0)CH3 com acetonitrilo na presença de ácido para proporcionar um composto de Fórmula (10) . Os ácidos adequados incluem ácido sulfúrico ou um ácido de Lewis adequado, tal como eterato de trifluoreto de boro. Depois de combinar o anterior, a reação é aquecida, arrefecida para cerca da temperatura ambiente e extinta com hidróxido de sódio aquoso. 0 composto (10) é isolado por meios tradicionais, tais como extração com um solvente adequado tal como acetato de etilo e concentração da camada orgânica. O composto (10) é aquecido numa solução de ácido clorídrico aquoso até cerca de 100 °C. O composto é extraído com éter dietílico. A camada aquosa é tornada alcalina com hidróxido de sódio aquoso e extraída com éter dietílico. As camadas orgânicas são combinadas, secas sobre sulfato de sódio, filtradas e concentradas para darem o composto (4).

Preparações e Exemplos

Condições para Cromatografia Liquida de Alta Eficiência (HPLC). Métodos referido através das Preparações e

Exemplos: Método 1

Coluna LC: Phenomenex® Gemini® Cie 2,0x50 mm 3,0 μΜ Gradiente: acetonitrilo 5-100% m/ácido fórmico 0,1% em 7,0 min; em seguida mantido a 100% durante 1,0 min Temperatura da coluna: 50 °C +/- 10 °C Temperatura do autoamostrador: ambiente Velocidade de fluxo: 1,0 mL/min

Sinal detetado em comprimento de onda de 214 e 300 nm 24 ΡΕ2280961 Método 2

Coluna LC: Phenomenex® Gemini® Cis 2,0x50 mm 3,0 μιη Gradiente: acetonitrilo 5-100% m/kc ido fórmico 0,1% em 3,5 min; em seguida mantido a 100% durante 0,5 min Temperatura da coluna: 50 °C +/- 10 °C Temperatura do autoamostrador: ambiente Velocidade de fluxo: 1,0 mL/min

Sinal detetado em comprimento de onda de 214 e 300 nm Método 3

Coluna LC: Zorbax® RX-Cis 4, 6x250 mm 5 μιη

Gradiente: acetonitrilo 50-90% m/tampão fosfato 0,03 M (tampão fosfato = NaH2P04 5, 52 g e H3PO4 1,4 mL em Milli-Q H20 2 L) em 15 minutos Temperatura da coluna: 40 °C Temperatura do autoamostrador: ambiente Velocidade de fluxo: 1,5 mL/min Sinal detetado em comprimento de onda de 260 nm Método 4

Coluna LC: Zorbax® SB-phenyl 4,6x150 mm 5 μιη Isocrática: A 36% e B 64%, onde A = NH4OAC 0,05 M em água (pH 5,0) e B = acetonitrilo durante 10 minutos Temperatura da coluna: 35 °C Temperatura do autoamostrador: ambiente Velocidade de fluxo: 2,0 mL/min Sinal detetado em comprimento de onda de 206 nm 25 ΡΕ2280961

Preparação 1: (±)-5-(3-Trifluorometoxi-fenil)-1-(4-trifluorometil-fenil)--3-(4-trifluorometil-fenilamino)-1,5-di-hidro-pirrol-2-ona

Agitar 3-(trifluorometoxi)-benzaldeído (25,0 g, 132 inmol) e piruvato de etilo (15,3 g, 132 inmol) em ácido acético glacial (125 mL) à temperatura ambiente durante 10 minutos. Adicionar 4-(trifluorometil)anilina (46,7 g, 290 mmol) gota a gota, ao longo de 15 minutos com agitação continuada, aquecer a solução até 30 °C, e agitar durante cerca de 22 h. Arrefecer a solução até 26 °C, adicionar isopropanol (125 mL) e água (125 mL) . Agitar a solução à temperatura ambiente durante 15 minutos, filtrar o precipitado e lava-se com uma mistura 1:1 de álcool isopropilico-água (100 mL x 2) . Secar sob vácuo a 40 °C para se obter (±)-5-(3-trifluorometoxi-fenil)-1-(4-trifluorometil-fenil) -3-(4-trifluorometil-fenilamino)-1,5-di-hidro--pirrol-2-ona (60,46 g, 84%) na forma dum pó branco: LC-MS ESI m/z: 545, 1 (M-H)~, Rt = 10,9 min, Método 3. 1H-NMR (500 MHz, DMSO -d6) δ 8,76 (s, 1H) , 7,86 (d, 2H, J = = 8, Hz) , 7,70 (d, 2H, j = 8,5 Hz) , 7,56 (d, 2H, J = 9, 0 Hz) 7,47 (d, 2H, J = 8 ,5 Hz) , 7,44- 7,41 (m, 1H), 7,37 (s, 1H) 26 ΡΕ2280961 7,29 (d, 1 H, J = 8,0 Hz), 7,22 (d, 1 H, J = 8,0 Hz), 6,66 (d, 1 H, J = 3,0 Hz), 6,29 (d, 1 H, J = 2,5 Hz).

Preparação 2: (±)-5-Fenil-l-(4-trifluorometoxi-fenil)-3-(4--trifluorometoxi-fenilamino)-1,5-di-hidro-pirrol-2-ona

Adicionar 4-(trifluorometoxi)anilina (1,86 L, 13,75 mol) em porções a uma solução de benzaldeido (559 mL, 5,50 mol), e piruvato de etilo (605 mL, 5,50 mol) em ácido acético glacial (5,0 L) . Observar a exotermia a 43 °C. Agita-se à temperatura ambiente durante 18 horas. Filtrar o precipitado e lavar o bolo húmido com ácido acético glacial (500 mL) . Secar sob vácuo durante 3 horas para se obter (±)-5-fenil-l-(4-trifluorometoxi-fenil)-3-(4-trifluo-rometoxi-fenilamino)-1,5-di-hidro-pirrol-2-ona (1999 g, 74%) na forma dum sólido cristalino branco. 1H-NMR (400 MHz, DMSO-de) δ 8,43 (s, 1H), 7,74 (d, J = 12 Hz, 2H), 7,19- -7,38 (m, HH) , 6,42 (s, 1H) , 6,08 (s, 1H) . LC-MS ESI m/z: 495, 0 (M+l)\ 493,0 (M-l) ”, Tr = 6, 60 min, Método 1.

Preparação 3: (±)-5-(3-Fluoro-fenil)-1-(4-trifluorometoxi-fenil)-3-(4--trifluorometoxi-fenilamino)-1,5-di-hidro-pirrol-2-ona 27 ΡΕ2280961

Misturar 3-fluorobenzaldeído (10,0 mL, 94,3 mmol), 4-(trifluorometoxi)-anilina (31,9 mL, 235,7 mmol) e piru-vato de etilo (10,4 mL, 94,3 mmol) em ácido acético glacial (150 mL) . Agitar à temperatura ambiente durante 18 horas. Filtrar o precipitado e lavar com hexanos para dar (±) -5-(3-fluoro-fenil)-1-(4-trifluorometoxi-fenil)-3-(4-trifluoro-metoxi-fenilamino)-1,5-di-hidro-pirrol-2-ona (23,4 g, 48%). LC-MS ESI m/z: 511 (M-l)", Tr = 5,45 min, Método 1.

Preparação 4: 1-(4-Trifluorometilfenil)-3-[(IR)-1-(4-clorofenil)-etilami-no]-5(R)-(3-trifluorometoxifenil)-1,5-di-hidropirrol-2-ona

Misturar etanol (120 mL) , ácido acético glacial (15 mL) , água (3,0 mL, 164,7 mmol), ácido trifluoroacético (6,2 mL, 82,4 mmol), (±)-5-(3-trifluorometoxi-fenil)-1-(4--trifluorometil-fenil)-3-(4-trifluorometil-fenilamino)-1,5- 28 ΡΕ2280961 -di-hidro-pirrol-2-ona (30,0 g, 54,9 mmol), e 2,5-dimetoxi--tetra-hidrofurano (10,7 mL, 82,4 mmol). Aquecer a solução até 50 °C e agitar a mistura reacional durante cerca de 18 horas. Interromper o aquecimento da solução, adicionar água (35 mL) e arrefecer a mistura de reação até -19 °C. Filtrar a pasta e lavar o sólido com uma mistura 1:4 de água- metanol (20 mL) . Transferir o filtrado para um funil de separação e lavar com água salgada a 6% (280 mL), adicionar água salgada a 6% (100 mL), metanol (40 mL) , éter dietilico (100 mL) e solução saturada de bicarbonato de sódio (43 mL) a fase orgânica. Separar as camadas, adicionar metanol (60 mL) à fase orgânica e concentrar a solução até aproximadamente 1 volume contendo (±)-5-(3-trifluorometoxi-fenil)-1-(4-trifluorometil-fenil)-pirrolidina-2,3-diona. Adicionar metanol (60 mL) e (R)-4-cloro-a-metilbenzilamina (7,8 mL, 55,0 mmol) e agitar à temperatura ambiente durante 24 horas. Monitorizar a reação por HPLC até ao completamento (Método 4), em seguida arrefecer a solução até -7 °C e continuar a agitar a esta temperatura durante 72 horas. Adicionar uma solução pré-misturada de hidróxido de potássio (0,69 g, 10,5 mmol) em metanol (11 mL) à mistura reacional, aquecer a solução até 10 °C e agitar durante um adicional de 4 horas. Arrefecer a solução até -7 °C, filtrar a pasta, e lavar o produto resultante com metanol (5 mL x 3). Secar o sólido sob vácuo para se obter 1- (4-trifluorometil-fenil)-3-[1(R)-(4--cloro-fenil) -etilamino]-5(R)-(3-trifluorometoxi-fenil)-1,5-di-hidro- 29 ΡΕ2280961 pirrol-2- ona (12,3 g, 47, 7%) na fo: rma dum sólido branco: LC-MS ESI m/z : 539 ,0 (Μ-ΗΓ, Tr = 4, 3 min, Método 4 . XH -NMR (500 MHz, DMSO-de) δ 7 ,76 (d, 2H, J = 8, 5 Hz) , 7, 62 (d, 2H, J = 9, 0 Hz) , 7,38 -7, 36 (m, 2H) , 1 , 30- 7, 27 (m, 3H) , 7,10 (dd, 1H, J = 8,5, 1,0 Hz) , 7 , 05 (d, 1H t J = 7,5 Hz) , 6, 95 (s, 1H) , 6,06 (d, 1H, . J = 8 , 0 H z) , 5, 96 (d, 1H , J = 3, 0 Hz) , 5,22 (d, 1H, J = 3, 0 Hz) , 4, 35- -4,32 (m, 1H) , r 1,43 (d, 3Η, J = 6,5 Hz) .

Preparação 5: 1-(4-Trifluorometoxi-fenil)-3-((R)-1-fenil-etilamino)-5(R)--fenil-1,5-di-hidro-pirrol-2-ona

Adicionar sequencialmente ácido acético (464 mL, 8,09 mol), 2,5-dimetoxitetra-hidrofurano (393 mL, 3,03 mol), água (2,27 L), e ácido trifluoroacético (153 mL, 2,02 mol) a uma solução de (±)-5-fenil-l-(4-trifluorome-toxi-fenil)-3-(4-trifluorometoxi-fenilamino)-1,5-di-hidro--pirrol-2-ona (1,000 g, 2,02 mol) em THF (8,43 L). Agitar a mistura reacional à temperatura ambiente durante 18 horas. Adicionar tolueno (4,0 L) e acetato de isopropilo (2,0 L). Lavar a mistura com água (8,0 L) e solução saturada de hidrogenocarbonato de sódio (6,0 L) . Desprezar a camada aquosa. À camada orgânica, adicionar (R)-(+)-a-metil- 30 ΡΕ2280961 benzilamina (390 mL, 3,03 mol) . Agitar a solução à temperatura ambiente durante 3 horas. Concentrar a mistura de reação para se obter uma mistura de 1-(4-trifluorometoxi-fenil)-3-((R)-1-fenil-etilamino)-(5)-(S)-fenil-1,5-di- hidro-pirrol-2-ona e 1-(4-trifluorometoxi-fenil)-3-((R)-1-fenil-etilamino)-(R)-5-fenil-l,5-di-hidro-pirrol-2-ona na forma de um óleo negro. Dissolver a mistura (888 g, 2,02 mol) em isopropanol (2,0 L) e arrefecer a 7 °C.

Filtrar o precipitado e lavar com isopropanol frio. Secar sob vácuo durante 12 horas para dar 1-(4-trifluorometoxi-fenil)-3-((R)-1-fenil-etilamino)-(R)-5-fenil-l,5-di-hidro-pirrol-2-ona (130 g, 29%) na forma dum sólido esbranqui çado. 1H-NMR (400 MHz , DMSO-de) δ 7, , 64 (d, J Hz, 2H) , 7,34 (d, J = 8 Hz, 2H), 7,24 (m, 4H) , 7, 11 (m, 4H) , 6, 98 (d, J = 4 Hz, 2H) , 5,78 (m, 2H) , 5, 13 (s, 1H) , 4,30 (m, 1H) , 1,44 (d, J = 4 Hz 3H). LC-MS ESI m/z: 43! (M+H)+, Tr = 6,30 min, Método 1.

Preparação 6: 1-(4-Trifluorometoxi-fenil)-3-((R)-1-fenil-etilamino)-5 (R) --(3-fluoro-fenil)-1,5-di-hidro-pirrol-2-ona

Adicionar água (46,8 mL, 2,6 mol), ácido acético 31 ΡΕ2280961 (10,5 mL, 182,7 mmol), ácido trifluoroacético (6,9 mL, 91,3 mol), e 2,5-dimetoxitetra-hidrofurano (6,5 mL, 50,2 mmol) a uma solução de (±)-5-(3 — fluoro-fenil)-1-(4-trifluorometoxi-fenil)-3-(4-trifluorometoxi-fenil)-1,5-di-hidro-pirrol-2-ona (23,4 g, 45,7 mmol) em THF(45 mL) . Agitar a mistura reacional a 30 °C durante 18 horas. Observar formação significativa de (R)-5-(3 — fluoro-fenil)-1-(4-trifluorometoxi-f enil)-pirrolidina-2, 3-diona (LC-MS ESI m/z: 352 (ΜΗ)-, Método 1) . Verter a mistura de reação em tolueno (200 mL) , acetato de isopropilo (50 mL) e água (100 mL) e agitar durante 5 min. Separar as camadas e lavar a camada orgânica com água (50 mL) e solução a 5% de hidrogeno-carbonato de sódio (50 mL) . À camada orgânica, adicionar (R)-(+)-a-metilbenzilamina (7,7 mL, 59,9 mmol). Agitar a solução à temperatura ambiente durante 18 horas. Adicionar (R)-(+)-a-metil-benzilamina (3,0 mL, 24,8 mmol) e aquecer a 30 °C durante 3 horas. Lavar a mistura de reação com água e água salgada. Concentrar a mistura de reação para se obter uma mistura de 1-(4-trifluorometoxi-fenil)-3-((R)-1-fenil-etilamino)-5(S)-(3 — fluoro-fenil)-1,5-di-hidro-pirrol-2-ona e 1-(4-trifluorometoxi-fenil)-3-((R)-1-fenil-etilamino)-5(R)-(3-fluoro-fenil)-1,5-di-hidro-pirrol-2-ona. Dissolver a mistura em isopropanol (70 mL) e agitar à temperatura ambiente durante 72 horas. Filtrar o precipitado e lavar com isopropanol para dar 1-(4-trifluorometoxi-fenil)-3-((R)-1-fenil-etilamino)-5(R)-(3-fluoro-fenil)-1,5-di-hidro-pirrol-2-ona (6,30 g, 30%) na forma dum sólido branco. LC-MS ESI m/z: 457 (M+H)+, Tr = 5,13 min, Método 1. ΡΕ2280961 32

Preparação 7 : 2-(2-Trifluorometil-pirimidin-4-il)-propan-2-ol

HO H3C ch3

Arrefecer uma solução de THF (200 mL) e brometo de metilmagnésio (3,0 M em éter dietílico, 81 mL, 243 mmol) a 0 °C. Adicionar uma solução de éster metilico do ácido trifluorometilpirimidina-4-carboxílico (16,7 g, 81 mmol) em THF (100 mL) ao longo de um período de 5 min. Agitar durante 30 min a 0 °C, em seguida verter lentamente em cloreto de amónio aquoso saturado. Extrair a camada aquosa com éter dietílico, combinar as camadas orgânicas, secar sobre sulfato de sódio, filtrar e concentrar sob pressão reduzida para dar 2-(2-trifluorometil-pirimidin-4-il)--propan-2-ol (16,7 g, 100%) na forma de um óleo límpido, incolor. MS (m/z): 207,2 (M+H)+.

Preparação 8: N-[1-Metil—1-(2-trifluorometil-pirimidina-4-il)etil]- -acetamida

Aquecer uma solução de acetonitrilo (300 mL) e 33 ΡΕ2280961 2-(2-trifluorometil-pirimidin-4-il)-propan-2-ol (16,5 g 80 mmol) a 90 °C. Num recipiente de reação separado, a acetonitrilo frio (70 mL) a 0 °C adicionar ácido sulfúrico (19,2 mL, 360 mmol) a uma velocidade tal que a temperatura não exceda 10 °C. Adicionar a solução de ácido sulfúrico arrefecida à solução aquecida de 2- (2-trifluorometil--pirimidin-4-il)-propan-2-ol e acetonitrilo e agitar a 90 °C durante 60 minutos. Arrefecer até à temperatura ambiente, concentrar até cerca de 1/3 do volume original, e adicionar NaOH aquoso 5 N (150 mL) . Repartir entre acetato de etilo e água salgada, e em seguida extrair a camada aquosa com acetato de etilo (3x) . Concentrar sob pressão reduzida as camadas orgânicas combinadas para se obter N-[1-metil-l-(2-trifluorometil-pirimidin-4-il)-etil] --acetamida (15,4 g, 78%) na forma dum sólido amarelo. MS (m/z) : 248,0 (M+H) + .

Preparação 9: 1-Metil-l-(2-trifluorometil-pirimidin-4-il)-etilamina

'3

Aquecer uma solução de N-[1-metil-l-(2-trifluoro-metil-pirimidin-4-il)-etil]-acetamida (15,4 g, 62 mmol) e solução aquosa 5 N de HC1 (150 mL) a 100 °C durante 20 horas, depois arrefecer até à temperatura ambiente. Extrair a reação com éter dietilico (2x), em seguida tornar a 34 ΡΕ2280961 camada aquosa alcalina com uma solução aquosa 5 N de NaOH. Extrair a camada aquosa com éter dietílico (3x), secar as camadas orgânicas combinadas sobre sulfato de sódio, filtrar e concentrar sob pressão reduzida para dar 1-metil-1-(2-trifluorometil-pirimidin-4-il)-etilamina (7,2 g, 56%) na forma de um óleo castanho. 1H-NMR (400 MHz, CDCI3) : δ 8,80 (d, J = 5,3 Hz, 1H) , 7,68 (d, J = 5,3 Hz, 1H) , 1,76 (br s, 2H) , 1,49 (s, 6H) .

Preparação 10: Éster de etilo do ácido (E)—4—etoxi—2—oxo—but—3—enóico

O Η^ο'^γ0—CH*

O

Referência: G. Dujardin, S. Rossignol, E. Brown, Synthesis, (1998) 763-770. Adicionar clorooxoacetato de etilo (67 mL, 600 mmol) a uma solução de acetato de paládio (1,35 g, 6 mmol), éter etilico e vinilico (315 mL, 3,3 mol) e trietilamina (125 mL, 900 mmol) à temperatura ambiente. Aquecer até 55 °C durante 24 horas, arrefecer até à temperatura ambiente e em seguida repartir a mistura reacional entre éter dietilico e água. Concentrar sob pressão reduzida a camada orgânica para se obter éster de etilo do ácido (E)-4-etoxi-2-oxo-but-3-enóico (72 g, 70%) na forma de um óleo castanho. 1H-NMR (400 MHz, CDCI3) : δ 7,84 (d, J= 13,2 Hz, 1H) , 6,15 (d, J= 13,2 Hz, 1H) , 4,29 (q, J= 7,6 Hz, 2H) , 4,03 (q, J= 6,8 Hz, 2H), 1,34 (m, 6H) . ΡΕ2280961 35

Preparação 11: Éster de etilo do ácido 2-ciclopropil-pirimidina-4- carboxilico

O

Referência: T. A. Riley, W. J. Hennen, N. K.

Dalley, B. E. Wilson, J. Heterocyclic Chem., 24 (1987) 955--964. Aquecer uma mistura de hidrocloreto de ciclopropril-carbamidina (2,05 g, 17 mmol), éster de etilo do ácido (E)--4-etoxi-2-oxo-but-3-enóico (4,39 g, 25,5 mmol), etanol (12 mL) e etóxido de sódio (1,16 g, 17 mmol) num forno de micro-ondas a 140 °C durante 20 min. Concentrar a mistura de reação sob pressão reduzida e repartir o resíduo entre acetato de etilo e água salgada. Separar a camada orgânica e concentrar sob pressão reduzida. Purificar o resíduo por cromatografia sobre gel de sílica (acetato de etilo 10--30%/hexano) para dar éster de etilo do ácido 2-ciclopro-pil-pirimidina-4-carboxílico (1,5 g, 46%) na forma de um óleo amarelo claro. MS (m/z): 193,0 (M+H)+.

Preparação 12: 2-(2-Ciclopropril-pirimidin-4-il)-propan-2-ol

ΡΕ2280961

Arrefecer uma solução de THF(150 mL) e brometo de metilmagnésio (3,0 M em éter dietílico, 52 mL, 243 mmol) a 0 °C. Adicionar uma solução de éster de etilo do ácido 2-ciclopropil-pirimidina-4-carboxílico (9,9 g, 52 mmol) em THF(50 mL) ao longo de um periodo de 5 min. Agitar durante 45 min a 0 °C, em seguida, verter lentamente em cloreto de amónio aquoso saturado. Extrair a camada aquosa com éter dietilico, secar as camadas orgânicas combinadas sobre sulfato de sódio, filtrar e concentrar sob pressão reduzida para dar 2-(2-ciclopropil-pirimidin-4-il)-propan-2-ol (9,15 g, 100%) na forma dum sólido cor de laranja. MS (m/z) : 179,0 (M+H) + .

Preparação 13: N-[1-(2-Ciclopropril-pirimidin-4-il)-1-metil-etil]— -acetamida

OH.C

Aquecer uma solução de acetonitrilo (150 mL) e 2-(2-ciclopropil-pirimidin-4-il)-propan-2-ol (8,85 g, 50 mmol) a 90 °C. Num vaso de reação separado, arrefecer acetonitrilo (50 mL) a 0 °C e adicionar ácido sulfúrico (11,9 mL, 223 mmol) a uma velocidade tal que a temperatura não exceda 10 °C. Adicionar a solução de ácido sulfúrico arrefecida à solução aquecida de 2- (2-ciclopropil- 37 ΡΕ2280961 -pirimidin-4-il)-propan-2-ol e acetonitrilo e agitar a 95 °C durante 4 dias. Arrefecer até à temperatura ambiente e adicionar NaOH aquoso 5 N (100 mL) . Extrair a camada aquosa com acetato de etilo (3x) . Concentrar sob pressão reduzida as camadas orgânicas combinadas para se obter N-[1-(2-ciclopropil-pirimidin-4-il)-1-metil-etil]-acetamida (4,5 g, 41%) na forma de um óleo amarelo. MS (m/z) : 220,0 (M+H)+.

Preparação 14: 1-(2-Ciclopropril-pirimidin-4-il)-1-metil-etilamina

Aquecer uma solução de N-[ 1-(2-ciclopropil--pirimidin-4-il)-1-metil-etil]-acetamida (4,5 g, 20,5 mmol) e solução aquosa 5 N de HC1 (125 mL) a 100 °C durante 18 horas. Arrefecer a mistura até à temperatura ambiente. Extrair a reação com éter dietílico (2x) e em seguida tornar a camada aquosa alcalina com uma solução aquosa 5 N de NaOH. Extrair a camada aquosa com éter dietilico (3x), secar as camadas orgânicas combinadas sobre sulfato de sódio, filtrar e concentrar sob pressão reduzida para dar 1-(2-ciclopropil-pirimidin-4-il)-1-metil-etilamina (1,3 g, 36%) na forma de um óleo amarelo escuro. 1H-NMR (400 MHz, CDC13 ) : δ 8,45 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 7,12 (d, J = 5,6 Hz, 1H) , 2,30 (m, 1H), 1,76 (br s, 2H), 1,41 (s, 6H) , 1,09 (m, 2H) , 1,02 (m, 2H). ΡΕ2280961

Preparação 15 : (R)-3-[1-Metil-l-(2-trifluorometil-pirimidina-4-il)--etilamino]-1-(4-trifluorometil-fenil)-5-(3--trifluorometoxi-fenil)-1,5-di-hidro-pirrol-2-ona

Adicionar ácido trifluoroacético (7,56 mL, 100 mmol) a uma solução de 1-(4-trifluorometil-fenil)-3[(R)-1-(4-cloro-fenil)-etilamino]-5(R)-(3-trifluorometil-fenil)-1,5-di-hidro-pirrol-2-ona (10,8 g, 20,0 mmol) em ácido acético (100 mL) e água (5 mL). Agitar à temperatura ambiente durante 60 min. Observar formação significativa de (R)-5-(3-trifluorometoxi-fenil)-1-(4-trifluorometil-fenil)-pirrolidina-2,3-diona (LC-MS ESI m/z: 426 (M+Na)+, Tr = 2,76 min, Método 2). Diluir a reação com tolueno (200 mL) e água (150 mL) . Lavar a camada orgânica com água e solução aquosa saturada de bicarbonato de sódio. Filtrar a camada orgânica através de sulfato de sódio. Adicionar ácido acético (9,17 mL, 160 mmol) e 1-metil-l-(2-trifluorometil-pirimidin-4-il)-etilamina (4,51 g, 22 mmol) a esta solução de tolueno contendo (R)-5-(3-trifluorometoxi-fenil)-1-(4-trifluorometil-fenil )-pirrolidina-2,3-diona. Aquecer até 55 °C durante 18 horas. Concentrar a mistura de reação sob 39 ΡΕ2280961 pressão reduzida para dar um óleo púrpura escura. Purificar o resíduo por cromatografia sobre gel de sílica (acetato de etilo 25%-hexano) para se obter (R)-3-[1-metil-l-(2-tri-fluorometil-pirimidin-4-il)-etilamino]-1-(4-trifluorometil-fenil)-5-(3-trifluorometoxi-fenil)-1,5-di-hidro-pirrol-2-ona (7,70 g, 65%) na forma duma espuma púrpura. LC-MS ESI m/z: 613 (M+Na)+, Tr = 3,35 min, Método 2.

Preparação 16: (R)-3-[1-(2-Ciclopropril-pirimidin-4-il)-1-metil--etilamino]-5-(3-trifluorometoxi-fenil)-1-(4--trifluorometil-fenil)-1,5-di-hidro-pirrol-2-ona

Preparar o composto mencionado em título essencialmente conforme descrito no método da Preparação 15 usando 1-(2-ciclopropil-pirimidin-4-il)-1-metil-etilamina. Rendimento 38%, LC-MS ESI m/z: 563 (M+H)+, Tr = 3,46 min, Método 2.

Exemplo 1: (3R,5R)-3-[1-Metil-l-(2-trifluorometil-pirimidin-4-il)--etilamino]-5-(3-trifluorometoxi-fenil)-1-(4--trifluorometil-fenil)-pirrolidin-2-ona 40 ΡΕ2280961

Arrefecer uma solução de (R)-3-[1-metil-l-(2-tri-fluorometil-pirimidin-4-il)-etilamino]-1-(4-trifluorometil--fenil)-5-(3-trifluorometoxi-fenil)-1,5-di-hidro-pirrol-2--ona (7,5 g, 12,7 inmol) em ácido acético (60 mL) e THF (15 mL) a 0 °C e adicionar tetra-hidretocianoborato de sódio (1,60 g, 25,4 mmol). Remover o banho de arrefecimento após 5 minutos e agitar 60 minutos à temperatura ambiente. Diluir a mistura reacional com acetato de etilo e verter lentamente em solução aquosa saturada de bicarbonato de sódio. Separar a camada orgânica e concentrar sob pressão reduzida. Purificar o resíduo por cromatografia sobre gel de sílica (acetato de etilo 15-40%-hexano) para se obter (3R,5R)-3-[1-metil-l-(2-trifluorometil-pirimidin-4-il)--etilamino]-5-(3-trifluorometoxi-fenil)-1-(4-trifluorometil--fenil)-pirrolidin-2-ona (5,20 g, 69%) na forma duma espuma púrpura. Para remover a cor púrpura, dissolver (3R,5R)-3--[1-metil-l-(2-trifluorometil-pirimidin-4-il)-etilamino]-5--(3-trifluorometoxi-fenil)-1-(4-trifluorometil-fenil)--pirrolidin-2-ona em metanol (150 mL) e adicionar carvão ativado. Agitar à temperatura ambiente durante 20 min, filtrar e concentrar sob pressão reduzida para dar uma espuma branca (4,6 g, 88%). 1H-NMR (400 MHz, CDCI3) : δ 8,79 (d, J= 5,3 Hz, 1H) , 7,90 (d, J= 5,3 Hz, 1H) , 7,46 (d, J = 41 ΡΕ2280961 8,4 Hz, 2H) , 7,36 (d, J= 8,8 Hz, 2H) , 7,27 (t, J= 7,9 Hz, 1H) , 7,08 (d, J = 7,9 Hz, 1H) , 7,04 (d, J = 8,4 Hz, 1H) , 6,98 (s, 1H) , 5,04 (dd, J= 6,2, 9,7 Hz, 1H) , 3,51-3,45 (m, 1H) , 2,90-2,81 (m, 1H) , 1,89-1,81 (m, 1H) , 1,56 (s, 3H) , 1,50 (s, 3H) . LC-MS ESI m/z: 593 (M+H)+, Tr = 3,07 min, Método 2.

Exemplo 2: (3R,5R)-3-[1-(2-Ciclopropil-pirimidin-4-il)-1-metil--etilamino]-5-(3-trifluorometoxi-fenil)-1-(4— trifluorometil-fenil)-pirrolidin-2-ona

Preparar o composto mencionado em título essencialmente conforme descrito para o método do Exemplo 1, mantendo a reação a -10 °C e usando 1 eq de tetra-hidreto-cianoborato de sódio. Rendimento 42%. 1H-NMR (400 MHz, CDC13) δ 8,46 (d, J = 4,8 Hz, 1H) , 7,44 (d, J = 8,4 Hz, 2H) , 7,36 (d, J= 8,8 Hz, 2H) , 7,28-7,24 (m, 2H) , 7,08 (d, J = 7,5 Hz, 1H) , 7,03 (d, J = 7,9 Hz, 1H) , 6,98 (s, 1H) , 5,00 (dd, J = 6,2, 10,1 Hz, 1H) , 3,36 (dd, J = 7,9, 10,6 Hz, 1H) , 3, 30-3,25 (br s, 1H), 2,84-2,77 (m, 1H), 2,23-2,16 (m, 1H) , 1,91-1,82 (m, 1H) , 1,47 (s, 3H) , 1,42 (s, 3H) , 1,18-1,08 (m, 2H) , 1,05-0, 97 (m, 2H) . LC-MS ESI m/z: 565 (M+H)+, Tr = 2,49 min, Método 2. ΡΕ2280961

Exemplo 3 : (3R,5R)-3-[1-Metil-l-(2-trifluorometil-pirimidin-4-il)--etilamino]-5-(3-fluoro-fenil)-1-(4-trifluorometoxi-fenil)- -pirrolidin-2-ona

F

Agitar uma mistura de 1-(4-trifluorometoxi-fe- nil)-3-((R)-1-fenil-etilamino)-5(R)-(3-fluoro-fenil)-1,5-di-hidro-pirrol-2-ona (685 mg, 1,5 mmol) , THF(4 mL) , água (1 mL) , 2,5-dimetoxitetra-hidrofurano (0,23 mL, 1,8 mmol),

ácido acético (0,34 mL, 6,0 mmol), e ácido trifluoroacético (0,23 mL, 3,0 mmol) a 35 °C durante 18 horas. Observar a formação significativa de (R)-5-(3-fluoro-fenil)-1-(4-trifluorometoxi-fenil)-pirrolidina-2,3-diona (LC-MS ESI m/z: 354 (M+H)+, Tr = 2,65 min., Método 2). Verter a reação em solução aquosa saturada de bicarbonato de sódio e diluir com 10 mL de tolueno:acetato de isopropilo 1:1. Separar a camada orgânica e filtrar através de sulfato de sódio. Adicionar ácido acético (0,69 mL, 12,0 mmol) e 1-metil-l-(2-trifluorometil-pirimidin-4-il)-etilamina (339 mg, 1,65 mmol) a esta solução contendo (R)-5-(3-fluoro-fenil)-1- (4-trifluorometoxi-fenil)-pirrolidina-2,3-diona. Aquecer até 55 °C durante 24 horas. Concentrar a mistura de reação para dar um óleo púrpura escuro. Observar a formação ΡΕ2280961 significativa de 3-[ 1-metil-l-(2-trifluorometil-pirimidin-4-il)-etilamino]-1-(4-trifluorometoxifenil)-5(R)-(3-fluoro-fenil)-1,5-di-hidro-pirrol-2-ona (LC-MS ESI m/z: 541 (M+H)+, Tr = 3,32 min, Método 2). Dissolver a 3-[1-metil-l-(2-trifluorometil-pirimidin-4-il) -etilamino] -1- (4-trifluoro-metoxifenil)-5(R)-(3-fluoro-fenil)-1,5-di-hidro-pirrol-2-ona crua em ácido acético (6 mL) e THF (1,5 mL), arrefecer até 0 °C, e adicionar tetra-hidretocianoborato de sódio (189 mg, 3,0 mmol). Remover o banho de arrefecimento após 5 minutos e agitar 30 minutos à temperatura ambiente. Diluir a reação com acetato de etilo e lentamente vertê-la em solução aquosa saturada de bicarbonato de sódio. Concentrar a camada orgânica sob pressão reduzida e purificar o residuo por cromatografia sobre gel de silica (acetato de etilo 10-35%-hexano) para se obter (3R, 5R)-3-[1-metil-l-(2-trifluorometil-pirimidin-4-il)-etilamino]-5- (3-fluoro- fe ini 1 \—1 1 1-1 (4 -1] cif 1 uorometoxi- f enil )-pirrolidi n-2- ona (340 mg, 41%) na forma duma espuma. 1H-NMR ( 400 MHz, DC13) : δ 8, 79 (d , J - = 5, 3 Hz, 1H), 7, 92 (d, J = 5,3 Hz, 1H), 7 ,29- 7, 26 (m, 2H) , 7,22-7,18 (m, 1H) , 7,05 (d, J = 8 , 8 Hz, 2H) , 6, 93 (d, J = 7,5 Hz, 1H), 6 ,90-6, 83 (m, 2H), - 4, 96 (dd, J = 6, 2, 9,7 Hz, 1H) , 3,45 (dd, J = OO O \—1 V \—1 V 00 Hz, 1H) , 2 ,84- 2, 77 (m, 1H) , 1, 88-1,80 (m , 1H) , 1,56 (s, 3H) , 1,49 (s, 3H) . LC-MS ESI m/z: 543 (M+H) + Φ : f ± r = 2, 97 min, Método 2.

Exemplo 4: (3R,5R)-3-[1-Metil-l-(6-trifluorometil-piridin-2-il)-etil--amino]-5-fenil-l-(4-trifluorometoxi-fenil)-pirrolidin-2-ona 44 ΡΕ2280961

Preparar o composto mencionado em título essencialmente conforme descrito no método do Exemplo 3.

Rendimento 47%. 1H-NMR (400 MHz, CDC13) : δ 8,77 (d, J = 5,3

Hz, 1H) , 7,93 (d, J = 5,3 Hz, 1H) , 7,28 (d, J = 8,8 Hz, 2H) , 7,25-7,17 (m, 2H), 7,16-7,13 (m, 3H), 7,02 (d, J= 8,8

Hz, 2H) , 4,96 (dd, J= 6,2, 9,7 Hz, 1H) , 3,46 (dd, J= 7,9, 10,6 Hz, 1H) , 2,83-2,76 (m, 1H) , 1,91-1,83 (m, 1H) , 1,56 (s, 3H) , 1,49 (s, 3H) . LC-MS ESI m/z: 525 (M+H)+, Tr = 2,92 min, Método 2.

Exemplo 5:

Tosilato de (3R, 5R)-3-[1-metil-l-(2-trifluorometi.l--pirimidin-4-il)-etilamino]-5-(3-trifluorometoxi-fenil)-1--(4-trifluorometil-fenil)-pirrolidin-2-ona

Dissolver (3R,5R)-3-[1-metil-l-(2-trifluorometil--pirimidin-4-il)-etilamino]-5-(3-trifluorometoxi-fenil)-1-- (4-trifluorometil-fenil)-pirrolidin-2-ona (4,57 g, 7,71 mmol) em isopropanol (10 mL) . Adicionar mono-hidrato de ΡΕ2280961 ácido p-toluenossulfónico (1,49 g, 7,71 mmol) e aquecer a 45 °C, até a solução estar homogénea. Arrefecer até à temperatura ambiente e adicionar cristais de semente. Deixar repousar à temperatura ambiente durante 64 horas. Filtrar o precipitado e lavar com heptano. Secar sob vácuo durante 4 horas para dar o tosilato de (3R,5R)-3-[1-metil--1- (2-trifluorometil-pirimidin-4-il)-etilamino]-5-(3-tri-fluorometoxi-fenil)-1-(4-trifluorometil-fenil)-pirrolidin--2-ona (5,06 g, 86%) na forma de um pó branco. LC-MS ESI m/z: 593 (M+H)+, Tr = 4,92 min, Método 1.

Formação de cristal de semente

Dissolver (3R,5R)-3-[1-meti1-1-(2-trifluorometil--piridin-4-il)-etilamino]-5-(3-trifluorometoxi-fenil)-1-(4--trifluorometil-fenil)-pirrolidin-2-ona (61,4 mg, 104 ymol) em isopropanol (1 mL) . Adicionar mono-hidrato de ácido p-toluenossulfónico (20,0 mg, 104 ymol) para dar uma solução homogénea. Adicionar tosilato de (3R,5R)-3-[1--metil-1-(6-trifluorometil-piridin-3-il)-etilamino]-5-(3--trifluorometoxi-fenil)-1-(4-trifluorometil-fenil)-pirro-lidin-2-ona (<1 mg) para iniciar a cristalização. Expor a solução à atmosfera e deixar evaporar até à secura ao longo de 18 horas para dar o tosilato de (3R,5R)-3-[1-metil-l-(2--trifluorometil-piridin-4-il)-etilamino]-5-(3-trifluorometoxi-fenil) -1-(4-trifluorometil-fenil)-pirrolidin-2-ona (77 mg, 97%) na forma dum sólido esbranquiçado. 46 ΡΕ2280961

Exemplo 6:

Adipato de (3R,5R)-3-[1-metil-l-(2-trifluorometil--pirimidin-4-il)-etilamino]-5-(3-trifluorometoxi-fenil)-1--(4-trifluorometil-fenil)-pirrolidin-2-ona

O

Dissolver (3R,5R)-3-[1-metil-l-(2-trifluorometil--pirimidin-4-il)-etilamino]-5-(3-trifluorometoxi-fenil)-1--(4-trifluorometil-fenil)-pirrolidin-2-ona (105 mg, 0,177 mmol) em metanol (0,8 mL) e acetato de etilo (2 mL). Adicionar ácido adípico (30 mg, 0,20 mmol) e evaporar à temperatura ambiente durante a noite para dar um balanço de massa quantitativo de adipato de (3R,5R)-3-[1-metil-l-(2--trifluorometil-pirimidin-4-il)-etilamino]-5-(3-trifluorometoxi-f enil ) -1- (4-trifluorometil-fenil)-pirrolidin-2-ona (129 mg, 100%) na forma de um sólido cristalizado: ES/MS m/z: 593,0 [M+H]+.

Como mencionado, os compostos da presente invenção são agonistas inversos ou antagonistas seletivos e altamente potentes do recetor CB-1 e são por conseguinte úteis no tratamento de várias desordens em virtude desta farmacologia. Os ensaios que se seguem podem ser utilizados para demonstrar a atividade do recetor CB-1 dos compostos ΡΕ2280961 reivindicados, a sua seletividade para o recetor CB-1, e a sua atividade em modelos animais de várias desordens acreditadas como sendo tratáveis por agonismo inverso ou antagonismo do recetor CB-1. É de notar que, por definição, um antagonista puro inibe a ativação mediada por ligando de um recetor (isto é, bloqueia a estimulação do recetor dependente de agonista). Alguns recetores, incluindo o recetor CB-1, produzem a transdução de sinal mesmo na ausência de agonistas (endógeno/exógeno) , o que é referido como a atividade basal do recetor ou da atividade constitutiva. Com tais recetores, os agonistas inversos não só inibem a estimulação do recetor dependente de agonista, mas também reduzem/inibem a atividade basal do recetor. Visto que os recetores CB-1 têm atividade de sinalização basal, os agonistas inversos são preferidos aos antagonistas puros como agentes terapêuticos para distúrbios mediados por CB-1. Os compostos da presente invenção são agonistas inversos ou antagonistas seletivos do recetor CB-1.

Ensaios funcionais ±n vitro de CB-1 e CB-2

Os compostos da presente invenção podem ser testados quanto à atividade funcional nos recetores CB-1 e CB-2 em ambos os modos agonista e antagonista usando ensaios de ligação a GTP-y-35S à base do SPA (Ensaio de Cintilação por Proximidade). Todos os componentes de ensaio são preparados em tampão de ensaio (HEPES 20 mM, NaCl 48 ΡΕ2280961 100 mM, MgCl2 5 mM, pH 7,4) à temperatura ambiente. Diluições semi-log de composto de teste são preparadas em tampão de ensaio contendo BSA (conc. final 0,125%) para os ensaios em modo agonista. Para os ensaios de modo antagonista, os compostos de teste são preparados da mesma maneira, mas também incluem uma dose 80% eficaz de um agonista total (metanandamida) . A ligação a GTP-y~35S para o ensaio do antagonista pode ser medida num formato de 96 cavidades utilizando uma modificação de uma técnica de captura de anticorpos descrita anteriormente. (N. W. DeLapp

et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 289 (1999) 946-955). A atividade agonista do recetor CB-2 pode ser medida utilizando um método semelhante usando membranas hCB2-Sf9. A atividade agonista do recetor CB-1 pode ser medida utilizando uma técnica de captura de membrana completa utilizando membranas hCBl-CHO. Todas as incubações são feitas à temperatura ambiente.

Ensaios de Modo Antagonista

Ensaios de antagonistas hCBl-CHO e rCBl-CHO:

Membranas hCBl-CHO ou rCBl-CHO (Applied Cell Sciences, Rockville, MD) e GDP (1 μΜ final) são adicionadas a tampão de ensaio arrefecido em gelo e homogeneizadas. Os compostos diluídos, GTP-y-35S (conc. final 500 nM) e as membranas são adicionados às cavidades de uma placa de ensaio e incubados durante 30 min à temperatura ambiente. Em seguida, uma mistura contendo detergente Nonidet P40 (conc. final 0,2%), anticorpo IgG Ga.i-3 policlonal de 49 ΡΕ2280961 coelho (fornecido por Covance, Princeton, NJ), e 1,25 mg de pérolas de ensaio de cintilação por proximidade de anticorpos anticoelho (GE Healthcare, Piscataway, NJ) são adicionados. As placas são selados, turbilhonadas e incubadas durante um adicional de 2 horas. As placas são em seguida centrifugadas a 700 x g durante 10 min e a radioatividade contada.

Ensaios de antagonistas hCBl-Sf9 e hCB2-Sf9:

Membranas hCBl-Sf9 e hCB2-Sf9 (Perkin Elmer, Boston, MA) são preparadas essencialmente como acima com GDP 1 μΜ (conc. final) para hCBl-Sf9 e GDP 0,05 μΜ (conc. final) para hCB2-Sf9. O ensaio é corrido essencialmente conforme descrito para as membranas CHO acima. Membranas diluídas são pré-incubadas com composto de teste durante 15 min, o que é seguido por adição de GTP-y~35S e uns 35 min mais de incubação. Nonidet P40 e anticorpo anti-Gi são adicionados sequencialmente com uma incubação de 15 min após cada adição. As pérolas de SPA são em seguida adicionadas, as placas são seladas e turbilhonadas e em seguida incubadas à temperatura ambiente durante 1 hora.

Ensaios de Modo Agonista

Ensaio de agonista hCBl-CHO:

Membrana hCBl-CHO, GDP (conc. final de 1 μΜ) , e saponina (10 μρ/πΛ de conc. final, Sigma, St Louis, MO) são combinadas e preparadas em gelo como para os ensaios de ΡΕ2280961 antagonistas, acima. Os compostos de teste diluídos, GTP-γ-35S (conc. final 500 nM) e as membranas são combinados na placa de ensaio e incubados durante 30 min. Em seguida, pérolas de SPA de aglutinina de germe de trigo (GE Healthcare, Piscataway, NJ) são adicionadas a 1 mg/cavidade, as placas são selados e turbilhonadas e incubadas durante 1 h antes da rotação e contagem da mesma maneira que para os ensaios de antagonista, acima.

Ensaio de agonista hCB2-Sf9: O ensaio de hCB2-Sf9 é corrido essencialmente como para os ensaios de antagonistas hCBl-Sf9 e hCB2-Sf9 acima, sem agonista de desafio adicionado. GDP 1 μΜ (conc. final) é adicionado à solução de membrana e Nonidet P40, anticorpo anti-G±, e pérolas de SPA são adicionados em conjunto num coquetel.

Os dados são analisados como segue: O fundo é subtraído de todos as cavidades. A eficácia do agonista em percentagem é determinada normalizando os dados de resposta à dose de agonista/agonista inverso para a resposta obtida para um agonista total (metanandamida). A inibição de antagonista em percentagem é calculada normalizando primeiro os dados para o sinal gerado por uma concentração saturante do agonista total (metanandamida). Em seguida os dados são analisados utilizando um ajustamento reduzido logístico de 4 parâmetros (Activity Base™ e XLFit3™ de 51 ΡΕ2280961 IDBS, Emeryville, CA) . Os valores Kb são determinados utilizando uma modificação da relação de Cheng-Prusoff: Kb = CI50/(1 + [agonista]/CE50) , onde "CI50" é determinada a partir de um ajuste de quatro parâmetros de curvas de deslocamento, "[agonista]" é a concentração (nM) do desafio de agonista, e "CE5o" é determinada a partir de um ajuste de quatro parâmetros de uma curva de resposta à concentração de agonista completo (Cheng e Prusoff, 1973). Os valores de Kb média são calculados como uma média de pelo menos três determinações independentes ± o erro padrão da média (SEM) . (Y. C. Cheng e W. H. Prusoff, Biochem.

Pharmacol., 22 (1973) 3099-3108). Os compostos exemplifi cados são encontrados como sendo agonistas inversos CB-1 potentes (Kb ^ 10 nM, tipicamente < 2 nM) e como sendo seletivos sobre o recetor CB-2 (Kb CB-2/Kb Cb-i > 500, tipicamente > 1000) .

As Tabelas 6 e 7 sumariam as propriedades antagonistas/agonistas inversos de certos compostos da presente invenção. Os dados indicam que os compostos de teste são agonistas inversos de CB-1 potentes, em ambos os recetores de rato e humano e são seletivos sobre os recetores CB-2 humanos. A eficácia do agonista sendo inferior a zero indica que os compostos de atividade basal (constitutiva) diminuída do recetor CB-1 in vitro, o que carateriza os compostos como agonistas inversos no recetor CB-1. 52 ΡΕ2280961

Tabela 6

Exemplo N° Antagonista da Membrana rCB-1 SPA GTPyS CHO Antagonista da Membrana hCB-1 SPA GTPyS CHO Antagonista da Membrana hCB-2 SPA GTPyS Sf9 1 0,177 0,895 >8710 2 0, 644 >10800 3 0,195 0, 916 397 4 0,176 0,83 288

Todos os valores são: Kb nM

Tabela 7

Exemplo N° Agonista da Me SPA GTPi mbrana hCB-1 (S CHO Agonista da Membrana hCB-2 SPA GTPyS Sf9 CE5o Relativa inversa (nM) % de Eficácia Relativa CE50 Relativa (nM) 1 0,558 -99,3 >8710 2 2,39 -108 >10800 3 1, 11 -107 379 4 2,52 -105 288

Teste de Natação Forçada (TNF ou FST) 0 teste de natação forçada é um modelo animal bem estabelecido para depressão, ansiedade e perda da volição (falta de motivação) (Porsolt et al., Nature 266 (1977) 730) (J. M. Witkin et al., Trends Pharmacol. Sei., 26 (2005) 609-17). Também pode ser utilizado como um modelo para o tratamento de sintomas negativos da esquizofrenia.

Ratinhos machos NIH Swiss (Harlan Sprague-Dawley) são alojados a 12 ratinhos/gaiola durante 7-10 dias antes do teste. No dia do teste, os ratos pesando 25-30 g, são trazidos para a sala de teste pelo menos 1 hora antes da ΡΕ2280961 administração da dose. Os ratinhos são doseados (p.o.) com intervalos de 6-8 min com veiculo (CMC 1%/SLS 0,5%/povidona 0,08%/antiespumante 0,05% para agonistas inversos de CB1) ou composto de teste e colocados numa gaiola limpa (4 ratos/gaiola).

Para testar, os ratinhos são colocados individualmente em cilindros de plástico transparente (cerca de 10 cm de diâmetro x 25 cm de altura) cheio até 6 cm com água a 22-25 °C durante seis minutos. A duração da imobilidade durante os últimos 4 min é registada. Um rato é considerado imóvel quando flutua sem movimento ou fazendo apenas os movimentos necessários para manter a sua cabeça acima da água. O tempo de imobilidade (em segundos) é analisado por ANOVA utilizando o teste de Dunnett. A dose minima eficaz (DME) é considerada como sendo a dose mais baixa de composto de teste na qual uma diminuição estatisticamente significativa no tempo de imobilidade é observada versus o veículo de controlo.

Biodisponibilidade Métodos para avaliar a biodisponibilidade são bem apreciados na técnica. Uma tal referência é Medicinal Research Reviews, 21(5) (2001) 382-396. A biodisponibilidade de compostos pode ser estimada essencialmente como segue.

Grupos de três ou quatro ratos machos Sprague-Dawley de 250-450 gramas ou cães bigles (machos ou fêmeas) 54 ΡΕ2280961 de aproximadamente 10 kg são utilizados. Os animais não precisam de estar em jejum durante a porção i.v. do estudo. Os cães são administrados i.v. pela veia cefálica canulada e as colheitas de sangue são pela veia jugular. Os animais são doseados primeiro a 0,25 mg/kg i.v. e as amostras de sangue (0,2 mL) são então recolhidas utilizando EDTA como anticoagulante às 0,0830, 0,25, 0,50, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 48, 72, 96 e 120 horas. Em seguida, após pelo menos dois dias e depois de 18-24 horas de jejum, os animais são doseados a 1,0 mg/kg por sondagem oral. Durante o curso de um estudo, o total de sangue (mL) recolhido não deve exceder 1% da massa corporal total em gramas. Caso volumes maiores de sangue sejam necessários, o volume de sangue amostrado é substituído por sangue completo heparinizado de um animal dador. Quando se utiliza um desenho do estudo cruzado, os ratos recebem um volume de sangue completo heparinizado após a amostra final de cada dia de estudo, aproximadamente igual ao removido durante o estudo.

As concentrações plasmáticas de compostos são medidos por ensaios LC/MS/MS. Os dados são em seguida analisados utilizando análise farmacocinética não compartimentai padrão. A biodisponibilidade oral é calculada como: (AUCo-ínfinito, oral/AUCo-infinito, i.v.) X (Dose, i.v./dose, oral) X 100% O composto do Exemplo 5 é testado e verificou-se ter biodisponibilidade oral no rato como segue:

Ratos machos SD, em jejum 55 ΡΕ2280961 i.v.: 0,25 mg/kg, formulação: MEOP 20% v/v/água purificada 80% v/v p.o.: 1 mg/kg, formulação: NaCMC 1%/SLS 0,5%/anti- espumante 0,05% em água purificada A biodisponibilidade oral é de 51 ± 19% (DP médio, n = 3 ratos) e baseia-se na AUC0-24 h·

Impressão digital do CYP Humano A impressão digital do CYP é uma técnica bem estabelecida e é usada como uma indicação de risco potencial de interações medicamentosas nas ciências farmacêuticas. Os compostos da presente invenção podem ser avaliados por métodos bem conhecidos, essencialmente como se segue: Os compostos são incubadas a 37 °C a uma concentração final de 4 μΜ com microssomas de figado humano, combinados, de géneros misturados, e NADPH 1 mM (forma reduzida de dinucleótido fosfatado de nicotinamida e adenina) (conc. final) durante 0 e 30 min sem qualquer inibidor de CYP e com cada inibidor de CYP em incubações separadas durante 30 min. Cada inibidor é especifico para um citocromo P450 individual. Os inibidores específicos utilizados para CYPs 2C9, 2D6 e 3A foram sulfafenazole, quinidina e cetoconazol, respetivamente. Cetoconazol (CYP3A) é feito a 25 mM em DMSO e em seguida diluido em tampão até uma concentração final de 10 μΜ. Quinidina (CYP2D6) é feita a 5 mM em acetonitrilo/água 50/50 e em seguida diluida em tampão até uma concentração final de 10 μΜ. Sulfafenazole (CYP2C9) é feito a 100 mM em DMSO e em ΡΕ2280961 seguida diluído em tampão até uma concentração final de 5 μΜ. As amostras são analisadas por LC-MS em modo de electrospray positivo ou negativo usando um Waters Acquity Ultra Performance LC acoplado a um espectrómetro de massa MicroMass Q-Tof-2.

Os dados são analisados usando MetaboLynx™ versão 4.1. Com inibidor presente, uma redução na área do pico do metabolito de menos de 30% (em relação à incubação de controle não inibido) recebe uma designação de baixo risco de interação medicamentosa ou interação fármaco-fármaco [Drug Drug Interaction (DDI)], uma redução na área de pico entre 30% e 7 0% recebe um risco moderado de DDI e uma redução de mais de 70% recebe um risco elevado de DDI.

Os compostos exemplificados são testados essencialmente conforme descrito e verificou -se terem impressões digitais de CYP como se segue:

Tabela 6

Risco de Interação Medicamentosa (DDI)

Ex. N° CYP3A CYP2D6 CYP2C9 1 baixo baixo baixo 2 baixo baixo baixo 3 baixo baixo baixo 4 baixo baixo baixo 5 baixo baixo 6 baixo baixo 57 ΡΕ2280961

Eficácia In Vivo em Modelos de Alimentação A capacidade dos compostos da presente invenção para reduzir o peso do corpo pode ser testada num modelo de alimentação de rato, essencialmente como se segue. Estabelecer ratos Long-Evans machos obesos induzidos por dieta (OID) pela alimentação ad lib de recém-desmamados numa dieta constituida por cerca de 40% de gordura, cerca de 39% de hidratos de carbono e cerca de 21% de conteúdo calórico de proteina durante pelo menos 12 semanas. Administrar o composto de teste ou veiculo aos grupos de ratos (p.o., uma vez por dia ) durante duas semanas.

Determinar a potência composto como a dose necessária para produzir uma diferença de 17 gramas em comparação com o grupo de veiculo após o tratamento durante duas semanas (potência T17). Isto representa uma redução minimamente biologicamente relevante de 3-4% da massa corporal, em comparação com o tratamento de veiculo após 2 semanas.

Modelo de Ganho de Peso com Antipsicótico: A capacidade dos compostos da presente invenção para manter/reduzir a massa corporal durante o tratamento com antipsicóticos pode ser testada num modelo de alimentação de ratos essencialmente como se segue. Manter ratazanas Sprague-Dawley fêmeas adultas magras com comida para roedores normal Purina LabDiet 5001 (12,3% de gordura) e água ad libitum. Tratar um grupo (n~7) com veiculo (ácido lático 1%) nos dias 1-14, enquanto se trata o resto com olanzapina (2 mg/kg, p.o.). A seguir à ingestão de ΡΕ2280961 alimentos, monitorizar a massa corporal e a alteração na massa de gordura ao longo de um tratamento de duas semanas. Após 14 dias de entrega de fármaco, dividir os animais tratados com olanzapina (n~8 por grupo) e tratar um grupo com 0,3 mg/kg de composto de teste mais olanzapina, tratar um segundo grupo com 1 mg/kg de composto de teste mais olanzapina e tratar o grupo final com veiculo mais olanzapina durante os dias 15-28.

Lisboa, 4 de Setembro de 2012

Claims (6)

1. PE2280961 1 REIVINDICAÇÕES 1. Um composto da fórmula

   R1 é selecionado de entre o grupo constituído por hidrogénio, cloro, ciano, trifluorometilo, difluorometoxi e trifluorometoxi; R1 é selecionado a partir do grupo constituido por hidrogénio, halo, ciano, alquilo C1-C3 substituído com de 1 a 5 grupos fluoro, e alcoxi C1-C3 substituído com de 1 a 5 grupos fluoro; R2 é selecionado a partir do grupo constituído por hidrogénio, fluoro e cloro; R4 é selecionado a partir do grupo constituído por trifluorometilo, ciano e ciclopropilo; com a condição de que, quando R1 é hidrogénio, cloro, ciano ou trifluorometilo, então R1 é alcoxi C1-C3 substituído com de 1 a 5 grupos fluoro; ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis. 1 O composto de acordo com a reivindicação 1 2 em que R1 é selecionado a partir do grupo constituído por 2 ΡΕ2280961 hidrogénio, fluoro, cloro, ciano, trifluorometilo, 1,1--difluoroetilo, trifluorometoxi, difluorometoxi e 1,1,2,2--tetrafluoroetoxi, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável. 3. 0 composto de acordo com a reivindicação 2, em que R2 é selecionado a partir do grupo constituído por trifluorometilo, 1,1-difluoroetilo, difluorometoxi, tri-fluorometoxi e 1,1,2,2-tetrafluoroetoxi e R3 é hidrogénio, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável. 4. 0 composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 em que R1 é dif luorometoxi ou trifluorometoxi, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável. 5. 0 composto de acordo com a reivindicação 1 em que R2 é alcoxi C1-C3 substituído com de 1 a 5 grupos fluoro, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável. 6. 0 composto de acordo com a reivindicação 5, em que R3 é hidrogénio, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável. 7. 0 composto de acordo com a reivindicação 1, o qual é (3R,5R)-3-[1-metil-l-(2-trifluorometil-pirimidin--4-il)-etilamino]-5-(3-trifluorometoxi-fenil)-1-(4-trifluoro-metil-fenil)-pirrolidin-2-ona, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável. 3 ΡΕ2280961 8. 0 composto de acordo com a reivindicação 1, o qual é (3R, 5R)-3-[1-(2-ciclopropil-pirimidin-4-il)-1--metil-etilamino]-5-(3-trifluorometoxi-fenil)-1-(4-trifluoro-metil-fenil)-pirrolidin-2-ona, ou um seu sal farmaceutica-mente aceitável. 9. 0 composto de acordo com a reivindicação 1, o qual é (3R, 5R)-3-[1-metil-l-(2-trifluorometil-pirimidin--4-il)-etilamino]-5-(3 — fluoro-fenil)-1-(4-trifluorometoxi--fenil)-pirrolidin-2-ona, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.
2. 10. O composto de acordo com a reivindicação 1, o qual é (3R,5R)-3-[1-metil-l-(β-trifluorometil-piridin-2--il)-etilamino]-5-fenil-l-(4-trifluorometoxi-fenil)-pirro-lidin-2-ona, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.
3. 11. Uma composição farmacêutica compreendendo um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, e um aqente de suporte, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
4. 12. Um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, para uso em terapia.
5. 13. Um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, ou um seu sal farmaceuticamente 4 ΡΕ2280961 aceitável, para uso no tratamento de uma desordem selecionada de entre: um distúrbio alimentar associado com a ingestão de alimentos em excesso, obesidade, esquizofrenia, enfraquecimento cognitivo associado com a esquizofrenia, sintomas negativos associados com a esquizofrenia, abuso de substâncias, dependência de álcool, e ganho de peso associado com o tratamento com um antipsicótico, ou num tratamento para deixar de fumar.
6. 14. Um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, ou um sal farmaceuticamente aceitável, para utilização em combinação simultânea, separada ou sequencial com um agente antipsicótico no tratamento de uma desordem selecionada de entre: esquizofrenia, enfraquecimento cognitivo associado com a esquizofrenia, sintomas negativos associados com a esquizofrenia, e ganho de peso associado com o tratamento com um antipsicótico. Lisboa, 4 de Setembro de 2012 1 ΡΕ2280961 REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO Esta lista de referências citadas pelo requerente é apenas para conveniência do leitor. A mesma não faz parte do documento da patente Europeia. Ainda que tenha sido tomado o devido cuidado ao compilar as referências, podem não estar excluídos erros ou omissões e o IEP declina quaisquer responsabilidades a esse respeito. Documentos de patentes citadas na Descrição * «ÍO2007020582 A Literatura que não é de patentes citada na Descrição * Pastar eí st Phemtsooí Rm\, WQB, voí. 58, 380 * DtBgrx>stfeí -and S&a$s£csag Manual of Mstaá Otsor- àsrs, 2000 * AiMtaistrâto'? et ai Miítmi CPgmcft&sím f&êml 1S68. ¥:>i. 22 051,2208-1:3 » mm, TA.:: Hsmwtv, W J,; Data?» mL; WSaon, B.E. J Hetevcydic 0»m.> 1537, vol. 24, §55-364 * DaLapPi f4Vf¥ et ai, JPhamasettxp Her, 1 §§§, vol. 2§§, 34S-SS5 * Clteng TC; ftiwiff HM. Phamaoel., 1973, vst 22,3099-3108 * Porsoit eí sl m&fe. ÍB77, vot 2S6, 730 * 4.81, «Mtai et ai.. Trtsxfe Plmmrnsst Ssí, 20Θ5, wat, 26, «39-17 * Mè/Masi Resmrsh ftevtom? 2901, sei 21 ξδ), 282-306