PT2230308E - Moléculas de anticorpo tendo especificidade para o factor de necrose tumoral alfa humano e uso das mesmas - Google Patents

Moléculas de anticorpo tendo especificidade para o factor de necrose tumoral alfa humano e uso das mesmas Download PDF

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Andrew Neil Charles Weir
Andrew George Popplewell
David John King
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Description

ΡΕ2230308 1 DESCRIÇÃO "MOLÉCULAS DE ANTICORPO TENDO ESPECIFICIDADE PARA O FACTOR DE NECROSE TUMORAL ALFA HUMANO E USO DAS MESMAS" O presente invento está relacionado com uma molécula de anticorpo tendo especificidade para determinantes antigénicos do factor de necrose tumoral humano alfa (TNFa). 0 presente invento também está relacionado com usos terapêuticos da molécula de anticorpo e métodos para a produção da molécula de anticorpo.
Este invento está relacionado com moléculas de anticorpo. Numa molécula de anticorpo existem duas cadeias pesadas e duas cadeias leves. Cada uma das cadeias pesadas e cada uma das cadeias leves possui no seu extremo N-terminal um dominio variável. Cada dominio variável é composto por quatro regiões estruturais (FRs) alternando com três regiões determinantes de complementaridade (CDRs). Os residuos nos dominios variáveis são convencionalmente numerados de acordo com um sistema estabelecido por Kabat et al., Este sistema está descrito em Kabat et al., 1987, em "Sequences of Proteins of Immunological Interest", US Department of Health and Human Services, NIH, USA (daqui em diante "Kabat et al. (supra)"). Este sistema de numeração é usado na presente especificação, excepto quando de outra forma indicado. 2 ΡΕ2230308
As designações Kabat dos resíduos nem sempre correspondem directamente à numeração linear dos resíduos de aminoácidos. A sequência de aminoácidos linear pode conter menos aminoácidos ou aminoácidos adicionais relativamente à estrita numeração Kabat, correspondendo a uma deleção ou inserção num componente estrutural, sequência estrutural ou CD, da estrutura básica do domínio variável. A numeração Kabat correcta dos resíduos pode ser determinada para um determinado anticorpo através do alinhamento de resíduos com homologia da sequência do anticorpo com uma sequência Kabat numerada "convencional".
As CDRs do domínio variável da cadeia pesada estão situadas nos resíduos 31-35 (CDRH1), resíduos 50-65 (CDRH2) e resíduos 95-102 (CDRH3) de acordo com a numeração Kabat.
As CDRs do domínio variável da cadeia leve estão situadas nos resíduos 24-34 (CDRL1), resíduos 50-56 (CDRL2) e resíduos 89-97 (CDRL3) de acordo com a numeração Kabat. A construção de anticorpos com enxertos de CDRs está descrita no Pedido de Patente Europeia EP-A-0239400, que descreve um processo em que as CDRs de um anticorpo monoclonal de murganho são enxertadas nas regiões estruturais dos domínios variáveis de uma imunoglobulina humana através de mutagénese dirigida usando oligonucleótidos longos. As CDRs determinaram a especificidade de ligação ao ΡΕ2230308 antigénio dos anticorpos e são sequências peptidicas relativamente curtas existentes nas regiões estruturais dos dominios variáveis.
Trabalhos anteriores sobre anticorpos monoclonais humanizados através do enxerto de CDR foram realizados com anticorpos monoclonais que reconhecem antigénios sintéticos, tais como NP. No entanto, exemplos em que um anticorpo monoclonal de murganho que reconhece lisozima e um anticorpo monoclonal de rato que reconhece um antigénio de células T foram humanizados por enxerto de CDRs foram descritos por Verhoeyen et al. (Science, 239, 1534-1536, 1988) e Riechmann et al. (Nature, 332, 323-324, 1988), respectivamente.
Riechmann et al., encontraram que a transferência das CDRs sozinhas (como definido por Kabat (Kabat et al. (supra) e Wu et al., J. Exp. Med., 132, 211-250, 1970)) não foi suficiente para proporcionar actividade satisfatória de ligação ao antigénio no produto enxertado com CDRs. Encontrou-se que alguns residuos estruturais têm de ser alterados de forma a corresponderem aos da região estrutural dadora. Os critérios propostos para a selecção de quais os residuos estruturais necessitam de ser alterados estão descritos no Pedido de Patente Internacional WO 90/07861.
Foi publicada uma série de revisões que discutem anticorpos com enxertos de CDR, incluindo Vaughan et al. (Nature Biotechnology, 16, 535-539, 1998). 4 ΡΕ2230308 TNFa é uma citocina pro-inf lamatória que é libertada e interage com células do sistema imune. Assim, TNFa é libertado por macrófagos que foram activados por lipopolissacáridos (LPS) de bactérias Gram-negativas. Como tal, TNFoí parece ser um mediador endógeno de importância central envolvido no desenvolvimento e patogénese de choque endotóxico associado a sépsis bacteriana. Também foi demonstrado que TNFa está regulado positivamente numa série de doenças humanas, incluindo doenças crónicas tais como artrite reumatóide, doença de Crohn, colite ulcerativa e esclerose múltipla. Murganhos transgénicos para TNFa produzem niveis elevados de TNFa constitutivamente e desenvolvem poliartrite espontânea destrutiva semelhante a artrite reumatóide (EMBO J., 10, 4025-4031, 1991). TNFa é assim referido como uma citocina pro-inflamatória.
Anticorpos monoclonais contra TNFa foram descritos em trabalhos anteriores. Meager et al., (Hybridoma, 6, 305-311, 1987) descrevem anticorpos monoclonais murinos contra TNFa recombinante. Fendly et al., (Hybridoma, 6, 359-370, 1987) descrevem a utilização de anticorpos monoclonais murinos contra TNFa recombinante na definição de epitopos neutralizantes em TNF. Shimamoto et al., (Immunology Letters, 17, 311-318, 1988) descrevem o uso de anticorpos monoclonais murinos contra TNFy e o seu uso na prevenção de choque endotóxico em murganhos. Ainda, no Pedido de Patente Internacional WO 92/11383 são descritos anticorpos recombinantes, incluindo anticorpos com enxertos 5 ΡΕ2230308 de CDRs, específicos para TNFa. Rankin et al., (British J. Rheumatology, 34, 334-342, 1995) descrevem o uso de tais anticorpos com CDR enxertadas no tratamento de artrite reumatóide. US-A-5 919452 descreve anticorpos quiméricos anti-TNF e a sua utilização no tratamento de patologias associadas à presença de TNF.
Os anticorpos contra TNF-α foram propostos para a profilaxia e tratamento de choque endotóxico (Beutler et al., Science, 234, 470-474, 1985). Bodmer et ai., (Criticai Care Medicine, 21, S441-S446, 1993) e Wherry et ai., (Criticai Care Medicine, 21, S436-S440, 1993) discutem o potencial terapêutico de anticorpos anti-TNFa no tratamento de choque. O uso de anticorpos anti-TNFa no tratamento de choque séptico é igualmente descrito por Kirschenbaum et al., (Criticai Care Medicine, 26, 1625-1626, 1998). A artrite induzida por colagénio pode ser eficazmente tratada usando um anticorpo monoclonal anti-TNFa (Williams et al. (PNAS-USA, 89, 9784-9788, 1992)).
Niveis aumentados de TNFa são encontrados no fluido sinovial e no sangue periférico de doentes que sofrem de artrite reumatóide. Quando os agentes bloqueadores de TNFa são administrados a doentes que sofrem de artrite reumatóide, eles reduzem a inflamação, melhoram os sintomas e retardam a destruição das articulações (McKown et al. (Arthritis Rheum., 42, 1204-1208, 1999). O uso de anticorpos anti-TNFa no tratamento de ΡΕ2230308 artrite reumatóide e da doença de Crohn está discutido em Feldman et ai., (Transplantation Proceedings, 30, 4126-4127, 1998), Adorini et al., (Trends in Immunology Today, 18, 209-211, 1997) e em Feldman et ai., (Advances in Immunology, 64, 283-350, 1997). Os anticorpos contra TNFa usados em tais tratamentos são, de um modo geral, anticorpos quiméricos, como os descritos em US-A-5919452.
Dois produtos bloqueadores de TNFa estão actualmente licenciados para o tratamento de artrite reumatóide. O primeiro, designado etanercept, é comercializado pela Immunex Corporation como Enbrel™. É uma proteina de fusão recombinante compreendendo dois dominios p75 solúveis do receptor de TNF ligados à porção Fc de uma imunoglobulina humana. O segundo, designado infliximab, é comercializado pela Centocor Corporation como Remicade™. É um anticorpo quimérico tendo dominios variáveis murinos anti-TNFa e dominios constantes de IgGl humana.
Moléculas de anticorpo anti-TNFa recombinantes anteriormente obtidas, de um modo geral, possuem uma afinidade reduzida para TNFa comparativamente com os anticorpos de onde derivam as regiões variáveis ou CDRs, geralmente têm de ser produzidas em células de mamifero e são dispendiosos de produzir. Em Stephens et al., (Immunology, 85; 668-674, 1995), GB-A-2 246 570 e GB-A-2 297 145 são descritos anticorpos anti-TNFa.
Stephens et al. (Immunology, 1995, 85(4), 668- 7 ΡΕ2230308 674) descrevem um anticorpo anti-TNFa humanizado (CDP571) derivado do anticorpo CB0010 murino, com uma semi-vida de aproximadamente 13 dias e imunogenicidade reduzida, que é adequado para terapia repetida.
Existe a necessidade de uma molécula de anticorpo para tratar doenças inflamatórias crónicas que tenha elevada afinidade para TNFoí e baixa imunogenicidade em seres humanos. A molécula de anticorpo do presente invento compreende uma cadeia pesada em que o domínio variável compreende uma CDR (como definido por Kabat et al. (supra)) tendo a sequência apresentada como Hl na Figura 3 (SEQ ID N0:1) para CDRH1, como H2? ou H2 na Figura 3 (SEQ ID N0:2 ou SEQ ID NO: 7) para CDRH2 e como H3 na Figura 3 (SEQ ID NO: 3) para CDRH3 e uma cadeia leve em que o domínio variável compreende uma CDR (como definido por Kabat et al., (supra)) tendo a sequência apresentada como LI na Figura 3 (SEQ ID NO:4) para CDRL1, como L2 na Figura 3 (SEQ ID NO: 5) para CDRL2 e L3 na Figura 3 (SEQ ID NO: 6) para CDRL3.
As CDRs apresentadas em SEQ ID NO:1 e 3 a 7 e na Figura 3 referidas atrás derivam de um anticorpo monoclonal de murganho hTNF-40. No entanto, SEQ ID NO:2 consiste numa CDR híbrida. A CDR híbrida compreende parte da cadeia pesada CDR2 do anticorpo monoclonal de murganho hTNF40 (SEQ ID NO:7) e parte da CDR2 da cadeia pesada de uma sequência da região germinal do grupo 3 humano. ΡΕ2230308
As sequências completas dos domínios variáveis do anticorpo hTNF40 estão apresentadas nas Figuras 6 (cadeia leve) (SEQ ID NO: 99) e Figura 7 (cadeia pesada) (SEQ ID NO:100). Este anticorpo de murganho é referido abaixo como "o anticorpo dador".
Uma realização do presente invento é o anticorpo monoclonal de murganho hTNF4 0 tendo as sequências do domínio variável da cadeia leve e da cadeia pesada mostradas na Figura 6 (SEQ ID NO:99) e na Figura 7 (SEQ ID N0:100), respectivamente. A região constante da cadeia leve de hTNF40 é kappa e a região constante da cadeia pesada é IgG2a.
Numa outra realização, o anticorpo de acordo com o presente invento é uma molécula de anticorpo quimérico murganho/humano, referida aqui como a molécula de anticorpo quimérico hTNF40. A molécula de anticorpo quimérico compreende os domínios variáveis do anticorpo monoclonal de murganho hTNF40 (SEQ ID NOS: 99 e 100) e os domínios constantes humanos. De preferência, a molécula de anticorpo quimérico hTNF40 compreende o domínio kappa C humano (Hieter et ai., Cell, 22, 197-207, 1980; Genebank número de acesso J00241) na cadeia leve e os domínios gama 4 humanos (Flanagan et al., Nature, 300 709-713, 1982) na cadeia pesada.
Numa outra realização, o anticorpo de acordo com 9 ΡΕ2230308 o presente invento é uma molécula de anticorpo com enxerto de CDR. 0 termo "molécula de anticorpo com enxerto de CDR" como aqui usado refere-se a uma molécula de anticorpo em que a cadeia pesada e/ou a cadeia leve possui uma ou mais CDRs (incluindo, caso se pretenda, uma CDR híbrida) do anticorpo dador (e.g. m anticorpo monoclonal murino) enxertada numa estrutura da região variável da cadeia pesada e/ou leve de um anticorpo aceitador (e.g. um anticorpo humano).
De preferência, tal anticorpo com enxerto de CDR possui um domínio variável compreendendo regiões estruturais aceitadoras humanas assim como uma ou mais das CDRs referidas atrás.
Quando as CDRs são enxertadas, pode ser usada qualquer sequência estrutural adequada da região variável aceitadora tendo em consideração a classe/tipo do anticorpo dador de onde as CDRs derivam, incluindo regiões estruturais de murganho, primata e humano. Exemplos de regiões estruturais humanas que podem ser usadas no presente invento são KOL, NEWM, REI, EU, TUR, TEI, LAY e POM (Kabat et al. (supra)) . Por examplo, KOL e NEWM podem ser usadas para a cadeia pesada, REI pode ser usada para a cadeia leve e EU, LAY e POM podem ser usadas para a cadeia pesada e para a cadeia leve. As regiões estruturais preferidas para a cadeia leve são as regiões estruturais humanas do grupo 1 mostradas na Figura 1 (SEQ ID NO:83, 85, 87 e 89) . As regiões estruturais preferidas para a cadeia 10 ΡΕ2230308 pesada são as regiões estruturais humanas do grupo 1 e do grupo 3 mostradas na Figura 2 (SEQ ID NOS: 91, 93, 95 e 97 e SEQ ID NOS: 106, 107, 108 e 109), respectivamente.
Num anticorpo com enxerto de CDR do presente invento, prefere-se usar como anticorpo aceitador um com cadeias que sejam homólogas das cadeias do anticorpo dador. As cadeias aceitadoras pesada e leve não necessitam necessariamente de derivar do mesmo anticorpo e podem, caso se pretenda, compreender cadeias compostas tendo regiões estruturais derivadas de cadeias diferentes.
Igualmente, num anticorpo com enxerto de CDR do presente invento, as regiões estruturais não necessitam de ter exactamente a mesma sequência do anticorpo aceitador. Por exemplo, residuos invulgares podem ser mudados para residuos mais frequentes para a classe ou tipo da cadeia aceitadora. Como alternativa, residuos seleccionados nas regiões estruturais aceitadoras podem ser alterados de forma a corresponderem ao resíduo encontrado na mesma posição do anticorpo dador. Tais alterações deverão ser mantidas no minimo necessário para recuperar a afinidade do anticorpo dador. Um protocolo para a selecção de resíduos das regiões estruturais aceitadoras que podem necessitar de ser mudadas está descrito e WO 91/09967.
De preferência, numa molécula de anticorpo com enxerto de CDR do presente invento, se a cadeia pesada aceitadora possuir regiões estruturais humanas do grupo 1 ΡΕ2230308 (mostrado na Figura 2) (SEQ ID NOS: 91, 93, 95 e 97), então as regiões estruturais aceitadoras da cadeia pesada compreendem, para além de uma ou mais CDRs dadoras, residuos dadores nas posições 28, 69 e 71 (de acordo com
Kabata et ai., (supra)).
Como alternativa, se a cadeia pesada aceitadora possuir regiões estruturais do grupo 1, então as regiões estruturais aceitadoras da cadeia pesada compreendem, para além de uma ou mais CDRs dadoras, residuos dadores nas posições 28, 38, 46, 67, 69 e 71 (de acordo com Kabat et al. (supra)).
De preferência, numa molécula de anticorpo com enxerto de CDR do presente invento, se a cadeia pesada aceitadora possuir regiões estruturais humanas do grupo 3 (mostrado na Figura 2) (SEQ ID NOS: 106, 107, 108 e 109), então as regiões estruturais aceitadoras da cadeia pesada compreendem, para além de uma ou mais CDRs, residuos dadores nas posições 27, 28, 30, 48, 49, 69, 71, 73, 76 e 78 (de acordo com Kabat et al. (supra)).
De preferência, numa molécula de anticorpo com enxerto de CDR de acordo com o presente invento, se a cadeia leve aceitadora possuir regiões estruturais humanas do grupo 1 (mostrado na Figura 1) (SEQ ID NOS:83, 85, 87 e 89) então as regiões estruturais aceitadoras da cadeia leve compreendem residuos dadores nas posições 46 e 60 (de acordo com Kabat et al. (supra)). ΡΕ2230308 12
Os dador, i.e. derivam. resíduos dadores são resíduos do anticorpo o anticorpo do qual as CDRs originalmente A molécula de anticorpo do presente invento pode compreender: uma molécula de anticorpo completa, tendo a totalidade das cadeias pesada e leve; um fragmento das mesmas, como seja o fragmento Fab, Fab modificada, Fab', F(ab')2 ou Fv; um anticorpo de cadeia simples, e.g., Fv de cadeia simples em que os domínios variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve estão ligados por um péptido de ligação. De forma semelhante, as regiões variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve podem ser combinadas com outros domínios de anticorpo conforme adequado.
De preferência, a molécula de anticorpo do presente invento é um fragmento Fab. De preferência o fragmento Fab possui uma cadeia pesada tendo a sequência apresentada como SEQ ID NO: 111 e uma cadeia leve tendo a sequência apresentada como SEQ ID N0113. As sequências de aminoácidos apresentadas em SEQ ID NO:111 e SEQ ID NO:113 são, de preferência, codificadas pelas sequências de nucleótidos apresentadas em SEQ ID NO:110 e SEQ ID NO:112, respectivamente.
Como alternativa, prefere-se que a molécula de anticorpo do presente invento seja um fragmento Fab modificado em que a modificação é a adição, ao extremo C- 13 ΡΕ2230308 terminal da sua cadeia pesada, de um ou mais aminoácidos para permitir a ligação de uma molécula efectora ou repórter. De preferência, os aminoácidos adicionais formam uma região de charneira modificada contendo um ou dois resíduos de cisteína aos quais a molécula efectora ou repórter pode ser ligada. Tal fragmento Fab modificado, de preferência, possui uma cadeia pesada tendo a sequência apresentada como SEQ ID NO: 115 e a cadeia leve tendo a sequência apresentada como SEQ ID NO:113. A sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO:115 é, de preferência, codificada pela sequência de nucleótidos apresentada em SEQ ID NO:114.
Um grupo efector preferido é uma molécula de polímero, a qual pode ser ligada ao fragmento Fab modificado para aumentar a sua semi-vida in vivo. A molécula de polímero pode, em geral, ser um polímero sintético ou natural, por exemplo um polímero de polialquileno, polialquenileno ou polioxi-alquileno de cadeia linear ou ramificada, facultativamente substituído, ou um polissacárido ramificado ou não ramificado, e.g. um homopolissacárido ou um heteropolissacárido.
Substituintes facultativos particulares que podem estar presentes nos polímeros sintéticos atrás mencionados incluem um ou mais grupos hidroxilo, metilo ou metoxilo. Exemplos particulares de polímeros sintéticos incluem polietilenoglicol, polipropielonoglicol, álcool poliviní- 14 ΡΕ2230308 lico de cadeia linear ou ramificada, facultativamente substituídos, ou seus derivados, especialmente polietile-noglicol facultativamente substituído, como seja metoxipo-lietilenoglicol ou seus derivados. Polímeros naturais particulares incluem lactose, amilose, dextrano, glicogénio ou seus derivados. "Derivados" como aqui usado destina-se a incluir derivados reactivos, por exemplo, grupos reactivos selectivos de tiol, tais como maleimidas e similares. 0 grupo reactivo pode estar ligado directamente ou através de um segmento de ligação ao polímero. Será apreciado que o resíduo de tal grupo, nalguns casos, fará parte do produto como grupo de ligação entre o fragmento de anticorpo e o polímero. 0 tamanho do polímero pode variar conforme pretendido, mas será de um modo geral numa massa molecular médio na gama de 500 Da a 50000 Da, de preferência entre 5000 e 40000 Da e, mais de preferência, entre 25000 e 40000 Da. O tamanho do polímero pode ser, em particular, seleccionado com base do uso pretendido do produto. Assim, por exemplo, quando se pretende que o produto se destine a deixar a circulação e a penetrar nos tecidos, por exemplo para usar no tratamento de um tumor, pode ser vantajoso usar um polímero de baixa massa molecular, por exemplo com uma massa molecular de aproximadamente 5000 Da. Para as aplicações em que o produto permanece em circulação, pode ser vantajoso usar um polímero de massa molecular mais elevada, por exemplo tendo uma massa molecular na gama de 25000 Da a 40000 Da. 15 ΡΕ2230308
Os polímeros particularmente preferidos incluem um polímero polialquileno, como seja um polietilenoglicol, ou especialmente um metoxipolietilenoglicol ou um derivado do mesmo e, especialmente, com uma massa molecular na gama entre cerca de 25000 Da e cerca de 40000 Da.
Cada molécula de polímero ligada ao fragmento de anticorpo modificado pode ser covalentemente ligada ao átomo de enxofre de um resíduo de cisteína localizado no fragmento. A ligação covalente será geralmente uma ligação dissulfureto ou, em particular, uma ligação de enxofre-carbono.
Sempre que pretendido, o fragmento de anticorpo pode ter ligadas uma ou mais moléculas efectoras ou repórteres. As moléculas efectoras ou repórteres podem ser ligadas ao fragmento de anticorpo através de qualquer grupo funcional das cadeias laterais de aminoácidos ou dos aminoácidos terminais localizados do fragmento, por exemplo qualquer grupo amino, imino, hidroxilo ou carboxilo.
Pode ser usado um polímero activado como material de partida na preparação de fragmentos de anticorpo modificados com polímeros como aqui descrito. O polímero activado pode ser qualquer polímero contendo um grupo reactivo tiol como seja um ácido ou éster a-halocarboxílico, e.g. iodoacetamida, uma imida, e.g. maleimida, uma vinilsulfona ou um dissulfito. Tais 16 ΡΕ2230308 materiais de partida podem ser obtidos comercialmente (por exemplo na Shearwater Polymers Inc., Huntsville, AL, USA) ou podem ser preparados a partir de materiais de partida comerciais usando procedimentos químicos convencionais.
Relativamente à ligação das porções de polietile-noglicol (PEG), é feita referência a "Poly(ethyleneglycol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications", 1992, J. Milton Harris (ed) , Plenum Press, New York, "Poly-(ethyleneglycol) Chemistry and Biological Applications", 1997, J. Milton Harris and S. Zalipsky (eds), American Chemical Society, Washington DC e "Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences", 1998, M. Aslam and A. Dent, Grove Publishers, New York.
Quando se pretende obter um fragmento de anticorpo ligado a uma molécula efectora ou repórter, esta pode ser preparada através de procedimentos de química convencional ou de DNA recombinante, em que o fragmento de anticorpo é ligado directamente ou via um agente de acoplagem à molécula efectora ou repórter, antes ou após a recção com o polímero activado conforme adequado. Procedimentos químicos particulares incluem, por exemplo, os descritos em WO 93/62331, WO 92/22583, WO 90195 e WO 89/1476. Como alternativa, sempre que a molécula efectora ou repórter seja uma proteína ou polipéptido a ligação pode ser conseguida usando procedimentos de DNA recombinante, por exemplo como descrito em WO 86/01533 e EP-A-0392745. 17 ΡΕ2230308
De preferência, o fragmento Fab modificado do presente invento é PEGuilado (i.e. possui PEG (polietile-noglicol) ligado covalentemente) de acordo com o método descrito em EP-A-0948544. De preferência, a molécula de anticorpo do presente invento é um fragmento Fab modificado PEGuilado como mostrado na Figura 13. Como se mostra na Figura 13, o fragmento Fab modificado possui um grupo maleimido ligado covalentemente a um único grupo tiol numa região de charneira modificada. Um resíduo lisina é ligado covalentemente ao grupo maleimida. A cada um dos grupos amina no resíduo de lisina é ligado um polímero meto-xipolietilenoglicol tendo uma massa molecular de aproxi-madamente 20000 Da. A massa molecular total de toda a molécula efectora é assim de aproximadamente 40000 Da.
De preferência, no composto mostrado na Figura 13, a cadeia pesada da parte de anticorpo tem a sequência de SEQ ID NO: 115 e a cadeia leve tem a sequência apresentada em SEQ ID NO: 113. Este composto é aqui referido como CDP870.
Os domínios da região constante da molécula de anticorpo do presente invento, se presentes, podem ser seleccionados tendo em conta a função proposta da molécula de anticorpo e, em particular, as funções efectoras que podem ser necessárias. Por exemplo, os domínios da região constante podem ser os domínios de IgA, IgD, IgE, IgG ou IgM. Em particular, podem ser usados os domínios da região constante de IgG humana, especialmente dos isotipos IgGl e 18 ΡΕ2230308
IgG3 quando a molécula de anticorpo se pretende para usos terapêuticos e são necessárias funções efectoras do anticorpo. Como alternativa, os isotipos IgG2 e IgG4 podem ser usados quando a molécula de anticorpo se destina a fins terapêuticos e as funções efectoras do anticorpo não são necessárias, e.g. para simplesmente bloquear a actividade de TNFa.
Igualmente, a molécula de anticorpo do presente invento pode ter uma molécula efectora ou repórter ligada. Por exemplo, pode ser um macrociclo, para quelatação de um átomo de metal pesado ou uma toxina, como seja ricino, ligado através de uma estrutura de ponte covalente. Como alternativa, os procedimentos da tecnologia de DNA recombinante podem ser usados para produzir uma molécula de anticorpo em que o fragmento Fc (dominios CH2, CH3 e de charneira) , os dominios CH2 e CH3 ou o domínio CH3 de uma molécula de imunoglobulina completa foram substituídos ou possuem ligada, através de uma ligação peptídica, uma proteína não imunoglobulina funcional, como seja uma enzima ou molécula de toxina. A molécula de anticorpo do presente invento, de preferência, possui uma afinidade de ligação de pelo menos 0,85 x 10~10 M, mais de preferência pelo menos 0,75 x 10“10 M e mais de preferência 0,5 x 10“10 M. (Deve-se notar que a molécula de anticorpo humanizado preferida do presente invento, como descrito abaixo, possui uma afinidade de aproximadamente 0,5 x 10~10 M, que é melhor que a afinidade 19 ΡΕ2230308 do anticorpo monoclonal murino de onde deriva. 0 anticorpo murino possui uma afinidade de aproximadamente 0,85 x 10~10 M) .
Também se obtém uma molécula de anticorpo compreendendo o domínio variável da cadeia leve hTNF40-gLl (SEQ ID NO:8) e o domínio variável da cadeia pesada gh3hTNF40.4 (SEQ ID NO:ll). As sequências dos domínios variáveis destas cadeias leves e pesadas estão apresentadas nas Figuras 8 e 11, respectivamente. São igualmente descritas variantes da molécula de anticorpo do presente invento, as quais possuem uma melhor afinidade para TNFa. Tais variantes podem ser obtidas através de uma série de protocolos de maturação de afinidade, incluindo mutação das CDRs (Yang et aí., J. Mol. Biol., 254, 392-403, 1995), pulverização de cadeias (Marks et al., Bio/Technology, 10, 779-783, 1992), uso de estirpes mutagenizantes de E. coli (Low et al., J. Mol. Biol., 250, 359-368, 1996), baralhamento de DNA ("DNA shuffling") (Patten et al., Curr. Opin. Biotechnol., 8, 724-733, 1997), apresentação fágica (Thompson et al., J. Mol. Biol., 256, 77-88,1996) e PCR sexual (Crameri et al., Nature, 391, 288-291, 1998). Vaughan et al. (supra) discutem estes métodos de maturação de afinidade. O presente invento também proporciona uma sequência de DNA codificadora das cadeias pesadas e/ou leves da molécula de anticorpo do presente invento. ΡΕ2230308
De preferência, a sequência de DNA codifica a cadeia pesada ou a cadeia leve da molécula de anticorpo do presente invento.
Numa realização preferida, a sequência de DNA codifica uma cadeia leve e compreende a sequência mostrada em SEQ ID NO:8 (hTNF40-gLl) ou SEQ ID NO:9 (h-TNF-40-gL2) , ou um seu equivalente degenerado.
Numa realização alternativa preferida, a sequência de DNA codifica uma cadeia pesada e compreende a sequência mostrada em SEQ ID NO:10 (ghlhTNF40.4) ou SEQ ID N0:11 (gh3hTNF40.4) ou um seu equivalente degenerado. A sequência de DNA do presente invento pode compreender DNA sintético, por exemplo produzido por processamento quimico, cDNA, DNA genómico ou qualquer combinação dos mesmos. O presente invento também está relacionado com um vector de clonagem ou de expressão compreendendo uma ou mais sequências de DNA do presente invento. De preferência, o vector de clonagem ou expressão compreende duas sequências de DNA, codificadoras da cadeia leve e da cadeia pesada da molécula de anticorpo do presente invento, respectivamente.
Numa realização preferida, o presente invento 21 ΡΕ2230308 proporciona um vector de expressão de E. coli compreendendo uma sequência de DNA do presente invento. 0 vector de expressão pode ser pTTO(CDP870) como se mostra esquematicamente na Figura 22. É igualmente descrito o vector pDNAbEng-Gl como se mostra na Figura 19. Métodos gerais através dos quais os vectores podem ser construídos, métodos de transfecção e métodos de cultura são conhecidos dos familiarizados com a área. Nesta perspectiva, é feita referência a "Current Protocols in Molecular Biology", 1999, F.M. Ausubel (ed), Wiley Interscience, New York e ao Manual Maniatis produzido por Cold Spring Harbor Publishing.
As sequências de DNA que codificam a molécula de anticorpo do presente invento podem ser obtidam por métodos bem conhecidos dos familiarizados com a matéria. Por exemplo, as sequências de DNA codificadoras de parte ou da totalidade das cadeias pesadas e leves dos anticorpos podem ser sintetizadas como pretendido a partir das sequências de DNA determinadas ou com base nas correspondentes sequências de aminoácidos. suas 0 DNA codificador das sequências estruturais aceitadoras está disponível aos familiarizados com a área e pode ser facilmente sintetizado com base nas sequências de aminoácidos conhecidas. 22 ΡΕ2230308 Técnicas convencionais de biologia molecular podem ser usadas para preparar sequências de DNA codificadoras da molécula de anticorpo do presente invento. As sequências de DNA pretendidas podem ser totalmente ou em parte produzidas usando técnicas de sintese de oligonu-cleótidos. As técnicas de mutagénese dirigida e de reacção em cadeia da polimerase (PCR) podem ser usadas conforme adequado.
Qualquer sistema célula hospedeira/vector pode ser usado para a expressão das sequências de DNA codificadoras da molécula de anticorpo do presente invento. Podem ser usadas bactérias, por exemplo E. coli, e outros sistemas microbianos, em parte para a expressão de fragmentos de anticorpos tais como fragmentos Fab e F(ab')2 e, especialmente, fragmentos Fv e fragmentos de anticorpos de cadeia simples, por exemplo, Fvs de cadeia simples. Sistemas de expressão de células hospedeiras eucarióticas, e.g. de mamífero, podem ser usados na produção de moléculas de anticorpos maiores, incluindo moléculas completas de anticorpo. Células hospedeiras adequadas de mamífero incluem células CHO, mieloma ou hibridoma.
0 presente invento também proporciona um processo para a produção de uma molécula de anticorpo de acordo com o presente invento compreendendo a cultura de uma célula hospedeira do presente invento em condições adequadas que conduzam à expressão de proteína a partir de DNA 23 ΡΕ2230308 codificador da molécula de anticorpo do presente invento e o isolamento da molécula de anticorpo.
De preferência, o processo para a produção da molécula de anticorpo do presente invento compreende a cultura de E. coli, compreendendo um vector de expressão para E. coli compreendendo a sequência de DNA do presente invento, em condições adequadas que conduzam à expressão de proteína a partir da sequência de DNA e isolamento da molécula de anticorpo. A molécula de anticorpo pode ser secretada a partir da célula ou dirigida para o periplasma através de sequências sinal adequadas. Como alternativa, as moléculas de anticorpo podem acumular-se dentro do citoplasma da célula. De preferência, a molécula de anticorpo é dirigida para o periplasma. Dependendo da molécula de anticorpo a ser produzida e do processo usado, é desejável permitir que as moléculas de anticorpo rena-turem e adoptam uma conformação funcional. Procedimentos que permitam às moléculas de anticorpo renaturarem são conhecidos dos familiarizados com a área. A molécula de anticorpo pode compreender apenas um polipéptido da cadeia pesada ou leve, neste caso apenas uma sequência codificadora do polipéptido da cadeia pesada ou leve necessita de ser usada para transfectar as células hospedeiras. Para a produção de produtos compreendendo ambas as cadeias pesada e leve, a linha celular pode ser transfectada com dois vectores, um primeiro vector codificador de um polipéptido da cadeia leve e um segundo 24 ΡΕ2230308 vector codificador do polipéptido da cadeia pesada. Como alternativa, pode ser usado um único vector incluindo sequências codificadora dos polipéptidos da cadeia leve e da cadeia pesada. 0 presente invento também proporciona uma composição terapêutica compreendendo uma molécula de anticorpo do presente invento em combinação com um excipiente, diluente ou veiculo farmaceuticamente aceitável. É igualmente descrito um processo para a preparação de uma composição terapêutica ou de diagnóstico compreendendo a mistura da molécula de anticorpo do presente invento com um excipiente, diluente ou veículo farmaceuticamente aceitável. A molécula de anticorpo pode ser o único ingrediente activo na composição terapêutica ou de diagnóstico ou pode ser acompanhado de outros ingredientes activos incluindo outros ingredientes do tipo anticorpos, por exemplo anticorpos anti-células T, anti-TNFY ou anti-LPS, ou ingredientes não anticorpos tais como xantinas.
As composições farmacêuticas deverão, preferencialmente, compreender uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo do invento. 0 termo "quantidade terapeuticamente eficaz" como aqui usado refere-se a uma quantidade de um agente terapêutico necessário para tratar, melhorar ou prevenir uma doença ou condição alvo, ou para 25 ΡΕ2230308 apresentar um efeito terapêutico ou preventivo detectável. Para qualquer anticorpo, a dose terapeuticamente eficaz pode ser estimada inicialmente nos ensaios de cultura celular ou em modelos animais, geralmente em roedores, coelhos, cães, porcos ou primatas. 0 modelo animal pode também ser usado para determinar a gama de concentrações adequadas e a via de administração. Tal informação pode ser então usada para determinar doses e vias de administração úteis para seres humanos. A quantidade eficaz necessária para um ser humano dependerá da gravidade do estado da doença, da saúde geral do indivíduo, da idade, do peso e do sexo do indivíduo, dieta, tempo e frequência de administração, combinações de fármacos, sensibilidades de reacção e tolerância/resposta à terapia. Esta quantidade pode ser determinada por experimentação de rotina e está dentro da avaliação do clínico. De um modo geral, uma dose eficaz será entre 0,01 mg/kg e 50 mg/kg, de preferência 0,1 mg/kg a 20 mg/kg, mais de preferência cerca de 15 mg/kg. Como se mostra nos Exemplos abaixo, doses de 1, 5 e 20 mg/kg foram usadas para tratar doentes com artrite reumatóide.
As composições podem ser administradas individualmente a um doente ou podem ser administradas em combinação com outros agentes, fármacos ou hormonas.
Uma dose à qual a molécula de anticorpo do presente invento é administrada depende da natureza da 26 ΡΕ2230308 condição a ser tratada, do nível acima do qual se pretende ou se espera neutralização de TNFa ou se a molécula de anticorpo é usada profilacticamente ou para tratar uma condição existente.
Assim, por exemplo, sempre que o produto seja para o tratamento ou profilaxia de um doença inflamatória crónica, como seja artrite reumatóide, doses adequadas da molécula de anticorpo do presente invento residem na gama entre 0,5 e 50 mg/kg, mais de preferência entre 1 e 20 mg/kg e mais de preferência cerca de 15 mg/kg. A frequência da dose dependerá da semi-vida da molécula de anticorpo e da duração do seu efeito.
Se a molécula de anticorpo possuir uma semi-vida curta (e.g. 2 a 10 horas) pode ser necessário dar uma ou mais doses por dia. Como alternativa, a molécula de anticorpo possui uma semi-vida longa (e.g. 2 a 15 dias) pode ser apenas necessário dar uma dosagem uma vez por dia, por semana ou mesmo uma vez em cada 1 ou 2 meses.
Uma composição farmacêutica pode igualmente conter um veículo farmaceuticamente aceitável para administração do anticorpo. O veículo não deverá em si próprio induzir a produção de anticorpos prejudiciais ao indivíduo que recebe a composição e não deverá ser tóxico. Veículos adequados podem ser macromoléculas grandes lentamente metabolizadas tais como proteínas, polipéptidos, liposso-mas, polissacáridos, ácidos poli-lácticos, ácidos poligli- 27 ΡΕ2230308 eólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de amino-ácidos e partículas virais inactivas.
Podem ser usados sais farmaceuticamente aceitáveis, por exemplo sais de ácidos minerais, tais como hidrocloreto, hidrobrometos, fosfatos e sulfatos, ou sais de ácidos orgânicos, tais como acetatos, propionatos, malonatos e benzoatos.
Veículos farmaceuticamente aceitáveis em composições terapêuticas podem ainda conter líquidos tais como água, soro fisiológico, glicerol e etanol. Ainda, substâncias auxiliares, tais como agentes molhantes e emulsionantes ou substâncias tamponantes do pH, podem estar presentes em tais composições. Tais veículos permitem que as composições farmacêuticas sejam formuladas como comprimidos, pílulas, drageias, cápsulas, líquidos, géis, xaropes, pastas e suspensões, para ingestão pelo doente.
Formas preferidas de administração incluem formas adequadas para administração parentérica, e.g., por injecção ou infusão, por exemplo através de injecção de bolus ou por infusão contínua. Sempre que o produto seja para injecção ou infusão, pode tomar a forma de uma suspensão, solução ou emulsão num veículo oleoso ou aquoso e pode conter agentes de formulação, tais como agentes de suspensão, preservativos, estabilizadores e/ou agentes dispersantes. Como alternativa, a molécula de anticorpo pode estar na forma seca, para reconstituição com um líquido estéril adequado antes de ser usada. 28 ΡΕ2230308
Uma vez formuladas, as composições do invento podem ser administradas directamente ao indivíduo. Os indivíduos a serem tratados podem ser animais. No entanto, prefere-se que as composições sejam adaptadas para administração a seres humanos.
As composições farmacêuticas deste invento podem ser administradas através de qualquer uma de várias vias incluindo mas não estando limitadas às vias oral, intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intramedular, intra-tecal, intraventricular, transdérmica, transcutânea (por exemplo, ver WO98/207434), subcutânea, intraperitoneal, in-tranasal, entérica, tópica, sublingual, intravaginal ou rectal. Podem também ser usados sprays hipodérmicos para administrar as composições farmacêuticas do invento. Tipicamente, as composições terapêuticas podem ser preparadas como injectáveis, como soluções ou suspensões líquidas. Podem ser igualmente preparadas formas sólidas adequadas para solução ou suspensão em veículos líquidos antes da inj ecção. A entrega directa das composições será de um modo geral conseguida por injecção, subcutânea, intraperitoneal, intravenosa ou intramuscular, ou entrega no espaço intersticial de um tecido. As composições podem ser igualmente administradas numa lesão. A dosagem do tratamento pode ser num esquema de dose única ou um esquema de dose múltipla. 29 ΡΕ2230308
Será apreciado que o ingrediente activo na composição será uma molécula de anticorpo. Como tal, será susceptivel à degradação no trato gastrointestinal. Assim, se a composição tiver de ser administrada através de uma via que usa o trato gastrointestinal, a composição necessitará de conter agentes que protegem o anticorpo da degradação mas que libertam o anticorpo uma vez que ele tenha sido absorvido pelo trato gastrointestinal.
Uma discussão exaustiva de veículos farmaceuti-camente aceitáveis está disponível em Remington's Pharma-ceutical Sciences (Mack Publishing Company, NJ. 1991) . É igualmente considerado que o anticorpo do presente invento será administrado através do uso de terapia génica. Para se conseguir isto, sequências de DNA codificadoras das cadeias pesada e leve da molécula de anticorpo sob o controlo de componentes de DNA adequados são introduzidas num doente, de forma que as cadeias de anticorpo sejam expressas a partir das sequências de DNA e montadas in situ.
Descreve-se a molécula de anticorpo do presente invento para usar no tratamento de uma doença mediada por TNFa. A molécula de anticorpo do presente invento pode ser utilizado em qualquer terapia em que seja desejável 30 ΡΕ2230308 reduzir o nível de TNFa biologicamente activo no corpo humano ou animal. O TNFa pode estar em circulação no corpo ou presente num nível indesejavelmente elevado num local particular do corpo.
Por exemplo, níveis elevados de TNFa estão implicados em distúrbios imunes e imuno-reguladores agudos e crónicos, infecções incluindo choque séptico, endotóxico e cardiovascular, distúrbios inflamatórios, doenças neurodegenerativas, doenças malignas e hepatite induzida por álcool. Os detalhes dos numerosos distúrbios associados a níveis elevados de TNFa estão descritos em US-A-5919452. A molécula de anticorpo do presente invento pode ser utilizada na terapia de doenças mediadas por TNFa. Doenças particularmente relevantes que podem ser tratadas pela molécula de anticorpo do presente invento incluem sépsis, falência cardíaca congestiva, choque séptico ou endotóxico, caquexia, síndrome da distrofia respiratória do adulto, SIDA, alergia, psoríase, TB, distúrbios inflamatórios dos ossos, distúrbios da coagulação do sangue, maus funcionamentos, episódios de rejeição pós-transplante de órgãos ou tecidos, doença de Crohn e doenças auto-imunes, tais como tiroidite e artrite reumatóide e osteoartrite.
Ainda, a molécula de anticorpo ou composição pode ser usada para reduzir os efeitos secundários associados com a geração de TNFa durante terapia neoplásica; para eliminar ou reduzir os sintomas relacionados com choque associados com o tratamento ou prevenção da rejeição de ΡΕ2230308 enxertos através do uso de um anticorpo anti-linfocitário; ou para o tratamento da falência de múltiplos órgãos. É igualmente descrito um método de tratamento de indivíduos humanos ou animais que sofram ou estejam em risco de um distúrbio mediado por TNFa. 0 método compreendendo a administração ao individuo de uma quantidade eficaz da molécula de anticorpo do presente invento. A molécula de anticorpo do presente invento pode igualmente ser usada em diagnóstico, por exemplo no diagnóstico in vivo e imagiologia de estados de doença envolvendo niveis elevados de TNFa.
Também é descrita uma molécula de anticorpo compreendendo uma CDR híbrida compreendo uma sequência CDR dadora truncada em que a porção que falta da CDR dadora truncada é substituída por uma sequência diferente e forma uma CDR funcional. 0 termo "CDR híbrida" como aqui usado significa uma CDR compreendendo uma CDR dadora que foi truncado numa ou mais posições, por exemplo num ou em ambos os extremos. A porção em falta da CDR dadora truncada é substituída por uma sequência diferente para formar uma CDR completa e funcional. A CDR híbrida tem pelo menos uma alteração de aminoácidos comparativamente com a CDR dadora completa. A sequência que substitui a porção truncada da CDR pode ser qualquer sequência. De preferência, a parte não dadora da sequência CDR é do anticorpo de onde derivam 32 ΡΕ2230308 as regiões estruturais da molécula de anticorpo, como seja uma sequência de anticorpo germinal.
Encontrou-se que as moléculas de anticorpo compreendendo uma CDR híbrida mantêm substancialmente a mesma afinidade de ligação de uma molécula de anticorpo compreendendo CDRs dadoras completas. 0 termo "substancialmente a mesma afinidade de ligação" como aqui usado significa pelo menos 70%, mais de preferência pelo menos 85% e mais de preferência pelo menos 95% da afinidade de ligação da molécula de anticorpo correspondente compreendendo CDRs dadoras completas. Como observado atrás, em determinados casos, a afinidade do anticorpo pode ser superior à do anticorpo dador. O uso de uma CDR híbrida proporciona as vantagens de reduzir a quantidade de sequência estranha (i.e. dadora) presente na molécula de anticorpo e pode aumentar a afinidade de ligação da molécula de anticorpo comparativamente à molécula de anticorpo correspondente compreendendo CDRs dadoras completas.
Qualquer uma das CDRs da molécula de anticorpo pode ser híbrida. De preferência a CDR32 da cadeia pesada é híbrida na molécula de anticorpo.
De preferência, a truncagem da CDR dadora é de 1 a 8 aminoácidos, mais de preferência entre 4 e 6 aminoácidos. É ainda preferido que a truncagem seja feita no extremo C da CDR. ΡΕ2230308
Dependendo da sequência da porção truncada da CDR e da sequência da sequência diferente que substitui a porção em falta, pode ser feita uma série de alterações de aminoácidos. De preferência, são feitas pelo menos 2 alterações de aminoácidos, mais de preferência são feitas pelo menos 3 alterações de aminoácidos e mais de preferência pelo menos são feitas 4 alterações de aminoácidos.
Uma realização particular do invento é um anticorpo em que a segunda CDR na cadeia pesada tem a sequência apresentada como SEQ ID NO: 2. Esta tem mais afinidade para o seu antigénio do que o anticorpo dador de onde deriva a parte da CDR. 0 presente invento também proporciona uma sequência de ácido nucleico que codifica a molécula de anticorpo compreendendo uma CDR híbrida do presente invento. 0 presente invento também proporciona um vector de expressão contendo a sequência de ácido nucleico codificadora da molécula de anticorpo compreendendo uma CDR híbrida do presente invento. 0 presente invento também proporciona uma célula hospedeira transformada com o vector do presente invento. 0 presente invento também proporciona um processo para a produção de uma molécula de anticorpo contendo uma CDR híbrida compreendendo a cultura de uma célula hospe- 34 ΡΕ2230308 deira do presente invento e isolamento da molécula de anticorpo. 0 presente invento é ainda descrito, apenas com fins ilustrativos, nos exemplos que se seguem que se referem às Figuras juntas, em que: A Figura 1 mostra as regiões estruturais da cadeia leve humana subgrupo 1 comparativamente com as regiões estruturais da cadeia leve de hTNF40 (SEQ ID NOS:83 a 90) ; A Figura 2 mostra as regiões estruturais da cadeia pesada humana subgrupo 1 e subgrupo 3 comparativamente com as regiões estruturais da cadeia pesada de hTNF40 (SEQ ID NOS:91 a 98 el06 a 109); A Figura 3 mostra a sequência de aminoácidos das CDRs de hTNF40 (SEQ ID NOS: 1 a 7), em que CDR H2' é uma CDR híbrida em que os seis aminoácidos C-terminais são da sequência CDR H2 de um anticorpo germinal humano subgrupo 3 e as alterações de aminoácidos da sequência resultantes desta hibridação estão sublinhadas;
Figura 4 mostra o vector pMR15.1;
Figura 5 mostra o vector pMR14;
Figura 6 mostra as sequências de nucleótidos e de aminoácidos previstas para hTNF40Vl (SEQ ID NO:99); 35 ΡΕ2230308 A Figura 7 mostra as sequências de nucleótidos e de aminoácidos previstas para hTNF40Vh (SEQ ID N0:100); A Figura 8 mostra as sequências de nucleótidos e de aminoácidos previstas para hTNF40-gLl (SEQ ID NO:8); A Figura 9 mostra as sequências de nucleótidos e de aminoácidos previstas para hTNF40-gL2 (SEQ ID NO:9); A Figura 10 mostra as sequências de nucleótidos e de aminoácidos previstas para ghlhTNF40.4 (SEQ ID NO:10); A Figura 11 mostra as sequências de nucleótidos e de aminoácidos previstas para gh3hTNF40.4 (SEQ ID NO:11); A Figura 12 mostra o vector CTIL5-gL6; A Figura 13 mostra a estrutura de um composto designado CDP870 compreendendo um fragmento Fab modificado derivado do anticorpo hTNF40 ligado covalentemente via um residuo de cisteina a um elemento de ligação lisil-maleimida em que cada grupo amino no resíduo lisilo tem covalentemente ligado um resíduo PEG metoxilo em que n é cerca de 420; A Figura 14 mostra o vector pTTQ9; A Figura 15 mostra a sequência do adaptador oligonucleotídico OmpA (SEQ ID NO: 101); 36 ΡΕ2230308 A Figura 16 mostra o vector pACYC184; A Figura 17 mostra o vector pTTO-1; A Figura 18 mostra o vector pTTO-2; A Figura 19 mostra o vector pDNAbEng-Gl; A Figura 20 mostra as cassetes de oligonucleótidos codificadoras de diferentes sequências intergénicas para a expressão de Fab modificado em E. coli (SEQ ID NO:102 a 105); A Figura 21 mostra a acumulação de Fab modificado no espaço periplásmico das variantes IGS; A Figura 22 mostra o vector pTTO(CDP870); A Figura 23 mostra a pontuação da actividade de doença (DAS) em doentes tratados com doses diferentes de CDP87 0 e placebo. As gamas de mediana e IQ estão apresentadas para a população tratada com a última observação levada a termo. Os quadrados pequenos indicam placebo, os losangos indicam 1 mg/kg, os triângulos indicam 5 mg/kg e os quadrados grandes indicam 20 mg/kg; A Figura 24 mostra a contagem das articulações com desconforto, a contagem das articulações inchadas, a ΡΕ2230308 pontuação de dor, a avaliação global do assistente da actividade de doença, o questionário modificado da avaliação de saúde (HAQ), a proteína C reactiva (CRP) e a velocidade de sedimentação de eritrócitos (ESR) em doentes tratados com doses diferentes de CDP870 e placebo. A gama de mediana e IQ estão apresentados para a população tratada com a última observação levada a termo. Os quadrados pequenos indicam placebo, os losangos indicam 1 mg/kg, os triângulos indicam 5 mg/kg e os quadrados grandes indicam 20 mg/kg.
EXEMPLOS
Clonagem de genes e expressão de uma molécula do anticorpo quimérico hTNF40
Preparação de RNA a partir de células de hibridoma hTNF40
Preparou-se RNA total a partir de 3 x 107 células de hibridoma hTNF40 como descrito abaixo. As células foram lavadas em soro fisiológico e dissolvidas em RNAzol (0,2 ml por 10s células). Adicionou-se clorofórmio (0,2 ml por 2 ml de homogenato), a mistura foi agitada fortemente durante 15 segundos e depois deixada em gelo durante 15 minutos. As fases aquosa e orgânica resultantes foram separadas por centrifugação durante 15 minutos numa centrífuga Eppendorf e o RNA foi precipitado da fase aquosa através da adição de um volume igual de isopropanol. Após 15 minutos em gelo, O 38 ΡΕ2230308 RNA foi sedimentado por centrifugação, lavado com etanol a 70%, seco e dissolvido em água estéril sem RNases. O rendimento do RNA foi de 400 yg.
Clonagem por PCR de hTNF40 Vh e VI
As sequências de cDNA codificadoras dos domínios variáveis das cadeias pesadas e leves de hTNF40 foram sintetizadas usando transcriptase reversa para produzir cópias de cDNA de cadeia simples do mRNA presente no RNA total, seguido de Reacção em Cadeia da Polimerase (PCR) com os cDNAs usando sequências iniciadoras oligonucleotídicas específicas.
a) Síntese de cDNA
Sintetizou-se cDNA num volume de reacção de 20 μΐ contendo os seguintes reagentes: Tris-HCl 50 mM pH 8,3, KC1 75 mM, ditiotreitol 10 mM, MgCl2 3 mM, trifosfatos de desoxirribonucleótidos 0,5 mM cada, 20 unidades de RNAsin, 75 ng de sequências iniciadoras de hexâmeros aleatórios, 2 yg de RNA de hTNF40 e 200 unidades de trancriptase reversa do Vírus da Leucemia Murina de Moloney. Após incubação a 42°C durante 60 minutos, a reacção foi terminada por aquecimento a 95°C durante 5 minutos.
b) PCR
Alíquotas de cDNA foram sujeitas a PCR com combinações de sequências iniciadoras específicas para as 39 ΡΕ2230308 cadeias pesada e leve. As sequências de nucleótidos possuem todas, por ordem, um local de restrição que começa a 7 nucleótidos dos seus extremos 5', a sequência GCCGCCACC (SEQ ID NO: 12) para permitir a tradução óptima dos mRNAs resultantes, um codão de iniciação e 20-30 nucleótidos baseados nas sequências do péptido lider de anticorpos conhecidos de murganho (Kabat et al., "Sequences of proteins of immunological interest", 5th Edition, 1991, U.S. Department of Health and Human Services, Public Health Service, National Institutes of Health).
As sequências iniciadoras 3' estão apresentadas na Tabela 3. A sequência iniciadora leve abrange a junção J-C do anticorpo e possui um local de restrição para a enzima Spll para facilitar a clonagem do fragmento de PCR VI. As sequências iniciadoras 3' da cadeia pesada são uma mistura desenhadas para abranger a junção J-C do anticorpo. A sequência iniciadora 3' inclui um local de restrição Apal para facilitar a clonagem. A região 3' das sequências iniciadoras possui uma sequência mista baseada nas encontradas em anticorpos conhecidos de murganho (Kabat et al., 1991, supra) .
As combinações de sequências iniciadoras descritas atrás permitem que os produtos de PCR de Vh e VI sejam clonados directamente num vector de expressão adequado (ver abaixo) para produzir cadeias pesadas e leves quiméricas (murganho-humano) e para estes genes serem expressos em células de mamifero para produzir anticorpos quiméricos do isotipo pretendido. ΡΕ2230308
As incubações (100 μΐ) para o PCR foram estabelecidas como se segue. Cada reacção continha Tris-HCl 10 mM pH 8,3, KC1 50 mM, 0,01% de gelatina, trifosfatos de desoxirribonucleótidos 0,25 mM cada, 10 pmoles de mistura de sequências iniciadoras 5' (Tabela 4), 10 pmoles de sequência iniciadora 3' (CL12 (cadeia leve) ou R2155 (cadeia pesada) (Tabela 3) ) , 1 μΐ de cDNA e 1 unidade de polimerase Taq. As reacções foram incubadas a 95°C durante 5 minutos e depois expostas a ciclos de 94°C durante 1 minuto, 55°C durante 1 minuto e 72°C durante 1 minuto. Após 30 ciclos, aliquotas de cada reacção foram analisadas por electroforese num gel de agarose. As reacções da cadeia leve contendo misturas das sequências iniciadoras 5' dos lotes de cadeias leves 1, 2 e 7 produziram bandas com tamanhos consistentes com os fragmentos VI de tamanho completo, enquanto o lote 3 da reacção da cadeia pesada produziu um fragmento com um tamanho esperado para um gene Vh. A banda produzida pelo lote 1 de sequências iniciadoras de cadeias leves não foi continuada uma vez que resultados anteriores demonstraram que esta banda corresponde a um pseudogene da cadeia leve produzido pela célula de hibridoma. A banda produzida pelo lote de sequências iniciadoras 7 da cadeia leve foi mais fraca do que a banda do lote 2 de sequências iniciadoras e assim foi descontinuado. Apenas a banda do lote 2 de reacções da cadeia leve, que tinha a banda mais forte, foi posteriormente processada. 41 ΡΕ2230308
c) Clonagem molecular dos fragmentos de PCR
Os fragmentos de DNA produzidos no lote 2 da reacção da cadeia leve foram digeridos com as enzimas BstBI e Spll, concentrados por precipitação com etanol, sujeitos a electroforese num gel de 1,4% de agarose e recuperadas as bandas de DNA na gama de 400 pares de bases. Estas foram clonadas por ligação no vector pMR15.1 (Figura 4) que tinham sido cortados com Bstl e Spll. Após ligação, as misturas foram usadas para transformar E. coli LM 1035 e os plasmídeos das colónias bacterianas resultantes testados relativamente à presença de insertos por digestão com BstBI e Spll. Representantes com insertos de cada ligação foram analisados ainda por sequenciação de nucleótidos.
Numa forma semelhante, os fragmentos de DNA produzidos no lote 3 da reacção da cadeia pesada foram digeridos com HindIII e Apal e clonados no vector pMRl 4 (Figura 5) que tinha sido cortado com HindIII e Apal. Novamente, plasmídeos representativos contendo insertos foram analisados por sequenciação de nucleótidos. d) Análise da sequência nucleotídica DNA de plasmídeo de uma série de isolados contendo insertos Vh foi sequenciado usando as sequências 42 ΡΕ2230308 iniciadoras R1053 (ver Tabela 5) (o qual serve para iniciação na região 3' do promotor de HCMV em pMRl4) e R720 (ver Tabela 5) (o qual serve para iniciação da região 5' de gama 4 C humana e permite a sequenciação através do inserto de DNA em pMR14). Encontrou-se que as sequências nucleo-tídicas do inserto Vh numa série de clones eram idênticos, excepto relativamente a diferenças nas regiões do péptido sinal e J. Isto indicou que os clones examinados são isolados independentes que surgem do uso de diferentes sequências iniciadoras da mistura de oligonucleótidos durante a fase de PCR. A sequência de nucleótidos determinada e a sequência de aminoácidos prevista do domínio variável da cadeia pesada do anticorpo hTNF40 (hTNF40Vh) estão apresentadas na Figura 7 (SEQ ID NO:100).
Para analisar os clones das cadeias leves, foram analisadas as sequências derivadas da iniciação com R1053 (ver Tabela 5) e com R684 (SEQ ID NO: 62) (que inicia na região 5' de kappa C humana e permite a sequenciação ao longo do inserto de DNA em pMR15.1. A sequência de nucleótidos e a sequência de aminoácidos prevista dos genes VI, que surgem das reacções do lote 2 ,foram analisadas de forma idêntica. Novamente, encontrou-se que as sequências nucleotídicas do inserto VI numa série de clones eram idênticas, excepto para diferenças no péptido sinal e em regiões J, indicando que os clones analisados eram isolados independentes que surgem do uso de sequências iniciadoras diferentes da mistura de oligonucleótidos usados durante a 43 ΡΕ2230308 fase de PCR. A sequência de nucleótidos determinada e a sequência de aminoácidos prevista do dominio variável da cadeia leve do anticorpo hTNF40 (hTNF40Vl) estão apresentados na Figura 6 (SEQ ID NO:99). TABELA 1
Sequências iniciadoras oligonucleotidicas para a região 5' de cadeias pesadas de murganho. CH1: 5ΆΤGAAATGCAGCTGGGTCAT(G,C)TTCTT3' (SEQ ID NO:13) CH2: 5'ATGGGATGGAGCT(A,G)TATCAT(C,G)(C,T)TCTT3' (SEQ ID NO:14) CH3: 5ΆΤGAAG(A,T)TGTGGTTAAACTGGGTTTT3' (SEQ ID NO: 15) CH4: 5'ATG(G,A)ACTTTGGG(T,C)TCAGCTTG(G,A)T3' (SEQ ID NO:16) CH5: 5ΆΤGGACTCCAGGCTCAATTTAGTTTT3' (SEQ ID NO:17) CH6: 5'ATGGCTGTC(C,T)T(G,A)G(G,C)GCT(G,A)CTCTTCTG3' (SEQ ID NO:18) CH7: 5'ATGG(G,A)ATGGAGC(G,T)GG(G,A)TCTTT(A,C)TCTT3' (SEQ ID NO:19) CH8: 5ΆΤGAGAGTGCTGATTCTTTTGTG3' (SEQ ID NO:20) CH9: 5'ATGG(C,A)TTGGGTGTGGA(A,C)CTTGCTATT3' (SEQ ID NO:21) CH10: 5ΆΤGGGCAGACTTACATTCTCATTCCT3'(SEQ ID NO:22) CH11: 5ΆΤGGATTTTGGGCTGATTTTTTTTATTG3' (SEQ ID NO:23) CH12: 5'AT GAT GGT GTT AAGT CTT CT GT ACCT3' (SEQ ID NO:24) Cada uma das sequências iniciadoras atrás descritas tem a sequência 5'GCGCGCAAGCTTGCCGCCACC3' (SEQ ID NO:25) adicionada ao seu extremo 5'. 44 ΡΕ2230308 TABELA 2
Sequências iniciadoras oligonucleotidicas para a região 5 de cadeias pesadas de murganho. CL1: 5'ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCT3' (SEQ ID NO:26) CL2: 5'ATGGAG(T,A)CAGACACACTCCTG(T,C)TATGGGT3' (SEQ ID NO:27) CL3: 5'ATGAGTGTGCTCACTCAGGTCCT3' (SEQ ID NO:28) CL4: 5'ATGAGG(G,A)CCCCTGCTCAG(A,T)TT(C,T)TTGG3' (SEQ ID NO:29) CL5: 5ΆΤGGAT1T(T,A)CAGGTGCAGATT(T,A)TCAGCTT3' (SEQ ID NO:30) CL5A: 5'ATGGATTT(T,A)CA(A,G)GTGCAGATT(T,A)TCAGCTT3' (SEQ ID NO:31) CL6: 5'ATGAGGT(T,G)C(T,C)(T,C)TG(T,C)T(G,C)AG(T,C)T(T,C)CTG(A,G)G3'(SEQ ID NO:32) CL7: 5'ATGGGC(T,A)TCAAGATGGAGTCACA3' (SEQ ID NO:33) CL8: 5'ATGTGGGGA(T,C)CT(G,T)TTT(T,C)C(A,C)(A,C)TTTTTCAAT3'(SEQ ID NO:34) CL9: 5ΆΤGGT(G,A)TCC(T,A)CA(G,C)CTCAGTTCCTT3' (SEQ ID NO:35) CL10: 5ΆΤ GT AT AT AT GTTT GTT GT CT ATTT C3' (SEQ ID NO:36) CL11: 5'ATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTT3'(SEQ ID NO:37) CL12A: 5'ATG(A,G)AGT(T,C)(A,T)CAGACCCAGGTCTT(T,C)(A,G)T3' (SEQ ID NO:38) CL12B: 5'ATGGAGACACATTCTCAGGTCTTTGT3' (SEQ ID NO:39) CL13: 5'ATGGATTCACAGGCCCAGGTTCTTAT3' (SEQ ID NO:40) CL14: 5ΆΤGATGAGTCCTGCCCAGTTCCTGTT3' (SEQ ID NO:41) CL15: 5'AT GAATITGCCT GTT CAT CT CTT GGTGCT3' (SEQ ID NO:42) CL16: 5'ATGGATTTT CAATT GGT CCT CAT CT CCTT3' (SEQ ID NO:43) CL17A: 5ΆΤGAGGTGCCTA(A,G)CT(C,G)AGTTCCTG(A,G)G3' (SEQ ID NO:44) CL17B: 5ΆΤGAAGTACTCTGCTCAGTTTCTAGG3' (SEQ ID NO:45) CL17C: 5ΆΤ GAGGCATT CT CTT CAATT CTT GGG3' (SEQ ID NO:46) Cada uma das sequências iniciadoras atrás descritas tem a sequência 5'GGACTGTTCGAAGCCGCCACC3' (SEQ ID NO:47) adicionada ao seu extremo 5'. ΡΕ2230308 45 TABELA 3
Sequências iniciadoras oligonucleotidicas para os extremos 3' dos genes Vh e VI de murganho.
Cadeia leve (CL12): 5'GGATACAGTTGGTGCAGCATCCGTACGTTT3' (SEQ ID NO:48)
Cadeia pesada (R2155):5'GCAGATGGGCCCTTCGTTGAGGCTG(A,C)(A,G)GAGAC(G,T,A)GTGA3' (SEQ ID NO:49) TABELA 4 a) Misturas de sequências iniciadoras 5' para as reacções de PCR da cadeia leve
lotei 1: CL2 . lote 2 : CL7 . lote 3: CL13 . lote 4 : CL6. lote 5: CL5A, CL9, CL17A. lote 6: CL8 . lote 7 : CL12A. lote 8 : CL1, CL3, CL4, CL5, CL16, CL17B, CL17C CL10, CL11, CL2B, CL14, CL15, b) Misturas de sequências iniciadoras 5' para as reacções de PCR da cadeia leve lotei CHI, CH2, CH3, CH4; lote 2: CH5, CH6, CH7, CH8. lote 3: CH9, CHIO, CH11, CH12 46 ΡΕ2230308 TABELA 5
Sequências iniciadoras usadas na análise de sequências núcleotídicas RI053: 5'GCTGACAGACTAACAGACTGTTCC3' (SEQ ID NO:50) R720: 5'GCTCTCGGAGGTGCTCCT3' (SEQ ID NO:51)
Avaliação das actividades dos genes quiméricos
As actividades dos genes quiméricos foram avaliadas através da sua expressão em células de mamifero e purificação e quantificação dos novos anticorpos sintetizados. A metodologia para isto está descrita abaixo, seguido de uma descrição dos ensaios bioquímicos e baseados em células usados para a caracterização biológica dos anticorpos . a) Produção de molécula de anticorpo quimérico hTNF40 O anticorpo quimérico para avaliação biológica foi produzido através da expressão transitória dos pares de cadeia pesada e leve adequados após cotransfecção de células de Ovário de Hamster Chinês (CHO) usando precipitação com fosfato de cálcio.
No dia antes da transfecção, frascos semi-con-fluentes de células CHO-L761 foram tripsinizados, as células contadas e frascos T75 semeados com 107 células cada. 47 ΡΕ2230308
No dia seguinte, o meio de cultura foi trocado 3 horas antes da transfecção. Para a transfecção, o precipitado de fosfato de cálcio foi preparado através da mistura de 1,25 ml de CaCl2 0,25M contendo 50 yg de cada um dos vectores de expressão da cadeia leve e da cadeia pesada com 1,25 ml de HBS 2x (16,36 g NaCl, 11,0 g HEPES e 0,4 g de Na2HP04 em 1 litro de água com o pH ajustado a 7,1 com NaOH) e adição imediata ao meio das células. Após 3 horas a 37°C numa câmara de CO2, o meio e o precipitado foram removidos e as células sujeitas a um choque pela adição de 15 ml de 15% glicerol em soro fisiológico tamponado com fosfatos (PBS) durante 1 minuto. O glicerol foi removido, as células lavadas uma vez com PBS e incubadas durante 48-96 horas em 25 ml de meio contendo butirato de sódio 10 mM. O anticorpo pode ser purificado do meio de cultura através da ligação e eluição de proteína A-Sepharose.
b) ELISA
Para a ELISA, placas de ELISA Nunc foram revestidas durante a noite, a 4°C, com um fragmento F(ab)2 de um anticorpo policlonal de cabra específico anti-fragmento Fc humano (Jackson Immunoresearch, código 109-006-098) a 5 yg/ml em tampão de revestimento (carbonato de sódio 15 mm, hidrogeno-carbonato de sódio 35 mM, pH 6,9). O anticorpo que não se ligou à placa foi removido por lavagem 5 vezes com água destilada. As amostras e os padrões purificados para serem quantificados foram diluídos para 48 ΡΕ2230308 aproximadamente 1 yg/ml em tampão de conjugado (Tris-HCl 0,1M, pH 7,0, NaCl 0,1M, 0,2% v/v Tween 20, 0,2% p/v de caseína Hammersten). As amostras foram tituladas nos alvéolos de microtitulação em diluições de 2 vezes para dar um volume final de 0,1 ml em cada alvéolo e as placas foram incubadas à temperatura ambiente durante 1 hora como anteriormente com 0,1 ml de um anticorpo monoclonal de murganho anti -kappa humana (clone GD12) conjugado com peroxidase (The Binding Site, Código MP135) numa diluição de 1 em 700 em tampão conjugado. A placa foi novamente lavada e a solução de substrato (0,1 ml) adicionada a cada alvéolo. A solução de substrato continha 150 μΐ de Ν,Ν,Ν,Ν-tetrametilbenzidina (10 mg/ml em DMSO), 150 μΐ de peróxido de hidrogénio (solução a 30%) em q0 ml de acetato de sódio Ο,ΙΜ/citrato de sódio, pH 6,0. A placa foi revelada durante 5-10 minutos até a absorvância a 630 nm ser de aproximadamente 1,0 para o padrão máximo. A absorvância a 630 nm foi medida usando um leitor de placas e a concentração da amostra determinada por comparação das curvas de titulação com as do padrão. c) Determinação das constantes de afinidade por análise BiaCore.
A interacção de ligação entre hTNF40 e TNF humano foi investigada usando tecnologia BIA. Um anticorpo policlonal de cabra purificado, dirigido contra a região constante de hTNF40, foi imobilizado na superfície do chip sensor de polímero de dextrano usando química NHS/EDC 49 ΡΕ2230308 convencional. Níveis relativamente baixos (200-500 RU) de hTNF40 foram capturados para assegurar que eram minimizados os efeitos de transporte de massa. TNF humano em diferentes concentrações foi passado sobre hTNF40 capturado para permitir a avaliação da cinética de associação. Após a injecção do ligando, o tampão foi passado sobre a superfície de forma que a dissociação pudesse ser medida. As constantes de velocidade de associação e dissociação para a interacção entre hTNF40 na fase sólida e TNF humano foram calculadas e obtido o valor de KD. EXEMPLO 1
Enxerto de CDRs em hTNF40 A clonagem molecular de genes das regiões variáveis das cadeias pesada e leve do anticorpo hTNF40 e o seu uso para produzir anticorpos hTNF40 quiméricos (murganho-humano) foi descrito acima. As sequências de nucleótidos e de aminoácidos de hTNF40 VI e Vh murinos estão apresentadas nas Figuras 6 e 7 (SEQ ID NOS:99 e 100), respectivamente. Este exemplo descreve o enxerto de CDRs no anticorpo hTNF40.
Enxerto de CDRs na cadeia leve de hTNF40 AO alinhamento das regiões estruturais da cadeia leve de hTNF40 com as de quatro subgrupos de cadeias leves humanas (Kabat et al., 1991, supra) revelou que hTNF40 era mais homólogo de anticorpos do subgrupo 1 de cadeias leves 50 ΡΕ2230308 humanas. Consequentemente, para a construção da cadeia leve enxertada com CDR, as regiões estruturais escolhidas correspondiam às da sequência de consenso do grupo 1 humano.
Uma comparação das sequências de aminoácidos das regiões estruturais de hTNF40 murino e das cadeias leves de consenso do grupo 1 humano está apresentado na Figura 1 e mostra que existem 22 diferenças (sublinhadas) entre as duas sequências. A análise da contribuição que qualquer uma destas diferenças possa ter na ligação ao antigénio identificou 2 resíduos para investigação; estes estão nas posições 46 e 60. Com base nesta análise, foram construídas duas versões da cadeia leve enxertada com CDR. Na primeira destas, hTNF40-gLl (SEQ ID NO:8), resíduos 46 e 60 foram derivados da cadeia leve de hTNF40 enquanto no segundo, hTNF40-gL2 (SEQ ID NO:9), todos os resíduos são do consenso humano excepto o resíduo número 60 que é da cadeia leve de hTNF4 0.
Construção da cadeia leve com enxertos de CDR hTNF40-gL-l. A construção de hTNF40-gLl está apresentada abaixo detalhadamente. Os oligonucleótidos sobreponíveis que se seguem (P7982-P7986) foram usados nas Reacções em Cadeia da Polimerase (PCR) para montar uma cadeia leve enxertada truncada. O fragmento montado não possui a sequência líder dos anticorpos e os 17 primeiros aminoácidos da região estrutural 1. 51 ΡΕ2230308 oligo 1 P7982: 5’ G A ATTC AGGGTC ACC ATCACTTGTA A AGCCAGTCAG A ACGTAGGT ACT A AC GTAGCCTGGTATCAGCAAA3’ (SEQ JD NO:52) oligo 2 P7983: 5’ ATAGAGGAAAGAGGCACTGTAGATGAGGGCTTTTGGGGCTTTACCTGGTTT TTGCTGATACCAGGCTACGT3 ’ (SEQ ID NO:53) oligo 3 P7984 5 ’ TACAGTGCCTCTTTCCTCTATAGTGGTGTACCATACAGGTTCAGCGGATCCG GTAGTGGTACTGATTTCAC3’ (SEQ ID NO:54) oligo 4 P7985 5’GACAGTAATAAGTGGCGAAATCTTCTGGCTGGAGGCTACTGATCGTGAGGGT GAAATCAGTACCACTACCG3’ (SEQ ID NO:55) oligo 5 P7986 5 ’ ATTTCGCCACTT ATT ACTGTCA ACAGT AT A ACATCT ACCC ACTC AC ATTCGGT C AGGGT ACTA A AGT AG A A ATCAA ACGTACGG A ATTC3 ’ (SEQ ID NO:56)
Fwd P7981: 5'GAATTCAGGGTCACCATCACTTGTAAAGCC3' (SEQ ID NO:57) Bwd P7980 5'GAATTCCGTACGTTTGATTTCTACTTTAGT3' (SEQ IDNO:58),
Foi montada uma reacção de PCR, 100 μΐ, contendo ΡΕ2230308
Tris-HCl 10 mM pH 8,3, MgCl2 1,5 mM, KC1 50 mM, 0,01% de gelatina, trifosfatos de desoxirribonucleótidos 0,25 mM cada, 2 pmoles das sequências iniciadoras P7982, P7983, P7984, P7985, P7986, 10 pmoles de P7980, P7981 e 1 unidade de polimerase Taq. As reacções foram expostas a ciclos de 94°C durante 1 minuto, 55°C durante 1 minuto e 72°C durante 1 minuto. Após 30 ciclos, cada uma das reacções foi analisada por electroforese num de agarose e o fragmento de PCR removido do gel e recuperado usando o kit Mermaid. O fragmento recuperado foi cortado com as enzimas BstEII e Spll no tampão apropriado. O produto resultante foi finalmente sujeito a electroforese num gel de agarose e o fragmento de DNA de 27 0 pares de bases recuperado de uma fatia de gel e ligado ao vector CTIL5-gL6 (Figura 12) que tinha sido previamente digerido com as mesmas enzimas. O vector acima proporciona a sequência lider dos anticorpos em falta e os primeiros 17 aminoácidos da região estrutural 1. A mistura de ligação foi usada para transformar E. coli estirpe LM1035 e as colónias resultantes analisadas por PCR, digestão com enzimas de restrição e sequenciação nucleotidica. As sequências nucleotidica e de aminoácidos da região VI de hTNF40-gLl estão apresentadas na Figura 8 (SEQ ID NO:8).
Construção da cadeia leve com enxertos de CDR hTNF40-gL2. hTNF40-gL2 (SEQ ID NO:9) foi construído usando 53 ΡΕ2230308 PCR. Os oligonucleótidos que se seguem foram usados para introduzir as alterações de aminoácidos: R1053: 5'GCTGACAGACTAACAGACTGTTCC3' (SEQ ID NO:59) R5350: 5 ’ TCT AG ATGGC AC ACCATCTGCT A AGTTTG ATGCAGC AT AG AT CAGGAGCTTAGGAGC3’ (SEQ ID NO:60) R5349: 5’GCAGATGGTGTGCCATCTAGATTCAGTGGCAGTGGATCA GGCACAGACTTTACCCTAAC3’ (SEQ ID NO:61) R684 : 5'TTCAACTGCTCATCAGAT3' (SEQ ID NO:62)
Duas reacções, cada uma de 20 μΐ, contendo Tris-HC1 10 mM pH 8,3, MgCl2 1,5 mM, KC1 50 mM, 0,01% de gelatina, trifosfatos de desoxirribonucleótidos 0,25 mM cada, 0,1 yg de hTNF40-gLl, 6 pmoles de R1053/R5350 ou R5349/R684 e 0,25 unidades de polimerase Taq. As reacções foram sujeitas a ciclos de 94°C durante 1 minuto, 55°C durante 1 minuto e 72°C durante 1 minuto. Após 30 ciclos, cada uma das reacções foi analisada por electroforese num gel de agarose e os fragmentos de PCR removidos do gel e recuperados usando um kit Mermaid. 54 ΡΕ2230308
Alíquotas destes foram então sujeitas a um segundo ciclo de PCR. A reacção, 100 μΐ, continha Tris-HCl 10 mM pH 8,3, MgCl2 1,5 mM, KC1 50 mM, 0,01% de gelatina, 1/5 de cada um dos fragmentos de PCR da primeira série de reacções, 30 pmoles de R1053 e R684 e 2,5 unidades de polimerase Taq. As temperaturas de reacção foram como acima. Após o PCR, a mistura foi extraída com fenol/clo-rofórmio e precipitada com etanol. O precipitado de etanol foi recuperado por centrifugação, dissolvido no tampão adequado e cortado com as enzimas de restrição BstEII e SplI. O produto resultante foi finalmente sujeito a electroforese num gel de agarose e o fragmento de DNA de 270 pares de bases recuperado a partir de uma fatia de gel e ligado ao vector pMR15.1 (Figura 4) que tinha sido previamente digerida com as mesmas enzimas. A mistura de ligação foi usada para transformar E. coli LM1035 e as colónias resultantes analisadas por PCR, digeridas com enzimas de restrição e sequenciação nucleotídica. As sequências nucleotídicas e de aminoácidos da região VI de hTNF40-glL2 está apresentada na Figura 9 (SEQ ID NO:9).
Enxertos de CDR na cadeia pesada de hTNF40
Os enxertos de CDRs na cadeia pesada de hTNF40 foram conseguidos usando a mesma estratégia descrita para a cadeia leve. Encontrou-se que a cadeia pesada de hTNF40 é a mais homóloga das cadeias pesadas humanas pertencentes ao 55 ΡΕ2230308 subgrupo I e assim a sequência de consenso das regiões estruturais humanas do subgrupo I foi escolhida para aceitar as CDRs da cadeia pesada de hTNF40.
Para investigar a necessidade de uma região estrutural humana homóloga para actuar como uma região estrutural aceitadora do enxerto de CDR, uma segunda região estrutural, grupo 3 humano, foi seleccionada para humanizar a cadeia pesada de hTNF40.
Uma comparação de hTNF40 com as duas regiões estruturais diferentes está apresentada na Figura 2 onde se pode observar que hTNF40 difere do consenso humano subgrupo I em 32 posições (sublinhado) e difere do consenso humano subgrupo 3 em 40 posições (sublinhado) . Após análise da contribuição que qualquer uma destas possa ter para a ligação ao antigénio, os residuos 28, 38, 46, 67 e 71 foram mantidos como dadores na cadeia pesada com enxertos de CDRs ghlhTNF40.1, usando as regiões estruturais do grupo 1. Os residuos 27, 28, 30, 48, 49, 69, 71, 73, 76 e 78 foram mantidos como dadores na cadeia pesada com enxertos de CDRs, gh3hTNF40.4 usando as regiões estruturais do grupo 3. Os residuos 28, 69 e 71 foram mantidos como dadores na cadeia pesada com enxertos de CDRs, ghlhTNF40.4 usando as regiões estruturais do grupo 1.
Construção da cadeia pesada com enxertos de CDRs ghlhTNF40.4 ghlhTNF40.4 (SEQ ID NO:10) foi montada submetendo ΡΕ2230308 oligonucleótidos sobreponíveis a PCR na presença das sequências iniciadoras adequadas. Os oligonucleótidos que se seguem foram usados no PCR:
Enxerto do grupo I
Oligo 1 P7989: 5’GAAGCACCAGGCTTCTTAACCTCTGCTCCTGACTGGACCAGCTGCACCTGAG AGTGCACGAATTC3 ’ (SEQ DD NO:63)
Oligo 2 P7990: 5 ’ GGTTA AG A AGCCTGGTGCTTCCGTCAA AGTTTCGTGTA AGGCCTC AGGCTAC GTGTTCACAGACTATGGTA3’ (SEQ Π> NO:64)
Oligo 3 P7991: 5’CCAACCCATCCATTTCAGGCCTTGTCCCGGGGCCTGCnTGACCCAATTCATAC CATAGTCTGTGAACACGT3’ (SEQ ID NO:65)
Oligo 4 P7995: SOGCCTGAAATGGATGGGTTGGATTAATACTTACATTGGAGAGCCTATTTATGT TGACGACTTCAAGGGCAGATTCACGTTC3’ (SEQ ID NO:66)
Oligo 5 P7992: s^catgtatgcagtgcgttgtggaggtgtctagagtgaacgtgaatctgccctt GAA3* (SEQ ID NO:67) 57 ΡΕ2230308 oligo 6 P7993: 5’CCACAAGCACTGCATACATGGAGCTGTCATCTCTGAGATCCGAGGACACCGC AGTGTACTAT3’ (SEQ 1D NO:68) oligo 7 P7994: 5’GAATTCGGTACCCTGGCCCCAGTAGTCCATGGCATAAGATCTGTATCCTCTAG CACAATAGTACACTGCGGTGTCCTC3’ (SEQ ID NO:69)
Fwd: P7988: 5'GAATTCGTGCACTCTCAGGTGCAGCTGGTC3' (SEQ ID NO:70)
Bwd P7987: 5'GAATTCGGTACCCTGGCCCCAGTAGTCCAT3' (SEQ ID NO:71) A reacção de montagem, 100 μΐ, continha Tris-HCl 10 mM pH 8,3, MgCl2 1,5 mM, KC1 50 mM, 0,001% de gelatina, trifosfatos de desoxirribonucleótidos 0,25 mM cada, 2 pmoles das sequências iniciadoras P7989, P7990, P7991, P7992, P7993 e p7994, 10 pmoles de P7988 e P7987 e 1 unidade de polimerase Taq. As reacções foram expostas a ciclos de 94°C durante 1 minuto, 55°C durante 1 minuto e 72°C durante 1 minuto. Após 30 ciclos, a reacção foi extraída com fenol/clorofórmio (1/1), depois com clorofórmio e precipitada com etanol. Após centrifugação, o DNA foi dissolvido no tampão de restrição adequado e digerido com ApaLI e Kpnl. O fragmento resultante foi isolado num gel de 58 ΡΕ2230308 agarose e ligado a pMR14 (Figura 5) que tinha sido previamente digerido com as mesmas enzimas. pMR14 contém a região constante da cadeia pesada gama humana 4 quando pMR14 é cortado com ApaLI e Kpnl, o vector clivado é capaz de receber o DNA digerido de forma que o extremo 3' do DNA digerido liga-se em grelha ao extremo 5' da sequência codificadora da região constante gama 4. Assim, a cadeia pesada expressa a partir deste vector será do isotipo gama 4. A mistura de ligação foi usada para transformar E. coli ML1035 e as colónias bacterianas resultantes testadas por digestão com enzimas de restrição e análise da sequência nucleotidica. Desta forma, foi identificado um plasmideo contendo a sequência correcta de ghlhTNF40.4 (Figura 10) (SEQ ID NO:10) .
Construção da cadeia pesada com enxertos de CDRs gh3hTNF40.4 gh3hTNF40.4 (SEQ ID NO:11) foi montada submetendo oligonucleótidos sobreponíveis a PCR na presença das sequências iniciadoras adequadas. Os oligonucleótidos que se seguem foram usados no PCR:
Enxerto do grupo 3
Oligo 1 P7999: 5’GATCCGCCAGGCTGCACGAGACCGCCTCCTGACTCGACCAGCTGAACCTCAG AGTGCACGAATTC3’ (SEQ ID NO:72) 59 ΡΕ2230308
Oligo 2 P8000: 5’TCTCGTGCAGCCTGGCGGATCGCTGAGATTGTCCTGTGCTGCATCrGGTTACG TCTTCACAGACTATGGAA3 * (SEQID NO:73)
Oligo 3 P8001 5’CCAACCCATCCATTTCAGGCCCTTTCCCGGGGCCTGCTTAACCCAATTCATTC C AT AGTCTGTG A AG ACGT3 ’ (SEQ ID NO:74)
Oligo 4 P7995: 5 ’ GGCCTG A AATGG ATGGGTTGG ATTAATACTTACATTGG AG AGCCTATTTATGT TGACGACTTCAAGGGCAGATTCACGTTC3’ (SEQ ID NO:66)
Oligo 5 P7997: 5’GGAGGTATGCTGTTGACTTGGATGTGTCTAGAGAGAACGTGAATCTGCCCTT GAA3’ (SEQ ID NO:75)
Oligo 6 P7998: 5’CCAAGTCAACAGCATACCTCCAAATGAATAGCCTGAGAGCAGAGGACACCGC AGTGTACTAT3’ (SEQ Π> NO:76)
Oligo 7 P7993: 5 ’G A ATTCGGT ACCCTGGCCCCAGT AGTCCATGGCAT A AG ATCTGT ATCCTCT AG CACAATAGTACACTGCGGTGTCCTC3, (SEQ ID NO:77) 60 ΡΕ2230308
Fwd P7996: 5'GAATTCGTGCACTCTGAGGTTCAGCTGGTC3' (SEQ ID NO:78)
Bwd P7987: 5'GAATTCGGTACCCTGGCCCCAGTAGTCCAT3' (SEQ ID NO:71) A reacção de montagem, 100 μΐ, continha Tris-HCl 10 mM pH 8,3, MgCl2 1,5 mM, KC1 50 mM, 0,001% de gelatina, trifosfatos de desoxirribonucleótidos 0,25 mM cada, 2 pmoles das seguências iniciadoras P7999, P8000, P8001, P7995, P7997, p7998 e p7993, 10 pmoles de P7996 e P7987 e 1 unidade de polimerase Taq. As reacções foram expostas a ciclos de 94°C durante 1 minuto, 55°C durante 1 minuto e 72°C durante 1 minuto. Após 30 ciclos, a reacção foi extraída com fenol/clorofórmio (1/1), depois com clorofórmio e precipitada com etanol. Após centrifugação, o DNA foi dissolvido no tampão de restrição adequado e digerido com ApaLI e Kpnl. O fragmento resultante foi isolado num gel de agarose e ligado a pMR14 (Figura 5) que tinha sido previamente digerido com as mesmas enzimas. pMR14 contém a região constante da cadeia pesada gama humana 4. Quando pMRl4 é cortado com ApaLI e Kpnl, o vector clivado é capaz de receber o DNA digerido de forma que o extremo 3' do DNA digerido liga-se em grelha ao extremo 5' da sequência codificadora da região constante gama 4. Assim, a cadeia pesada expressa a partir deste vector será do isotipo gama 4. A mistura de ligação foi usada para transformar E. coli 61 ΡΕ2230308 ML1035 e as colónias bacterianas resultantes testadas por digestão com enzimas de restrição e análise da sequência nucleotidica. Desta forma, foi identificado um plasmídeo contendo a sequência correcta de gh3hTNF40.4 (SEQ ID NO:11) (Figura 11).
Produção do fragmento Fab modificado com enxertos de CDRs
Um fragmento Fab modificado com enxertos de CDRs, baseado no anticorpo hTNF40, foi construído usando o vector de E. coli pTTO-1. As regiões variáveis do anticorpo hTNF40 foram subclonadas neste vector e a sequência intergénica optimizada para criar pTTO(CD870). 0 vector de expressão pTTO foi projectado para dar origem à acumulação no espaço periplásmico de proteínas recombinantes solúveis em E. coli. As principais características deste plasmídeo são: (i) marcador de resistência à tetraciclina antibiótico não inactivado pelo produto do gene de resistência, assim a selecção das células contendo plasmídeo é mentida; (ii) baixo número de cópias - origem de repli-cação derivada do plasmídeo pl5A, a qual é compatível com plasmídeos contendo replicões derivados de colEl; (iii) promotor tac induzível forte para transcrição de genes clonados: 62 ΡΕ2230308 (iv) gene laqlq - dá expressão constitutiva da proteína repressora lac, mantendo o promotor tac no estado reprimido até à indução com IPTG/alolactose; (v) sequência sinal OmpA - dá secreção peri-plásmica dos genes clonados; e (vi) tradução que acopla a sequência sinal OmpA a a um pequeno péptido lacZ, dando iniciação eficiente da tradução. 0 vector foi desenvolvido para a expressão de fragmentos Fab modificados a partir de uma mensageiro dicistrónico pelo desenho de um método para seleccionar empiricamente a sequência intergénica óptima a partir de uma série de quatro cassetes construídas para esse fim. Descreve-se a aplicação destas na construção de pTTO(CDP870).
Materiais e métodos
Técnicas de DNA
Procedimentos convencionais foram usados para protocolos incluindo restrição do DNA, electroforese em gel de agarose, ligação e transformação. As enzimas de restrição e as enzimas de modificação do DNA foram adquiridas à New England Biolabs ou à Boehringer Mannheim e 63 ΡΕ2230308 foram usados de acordo com as recomendações do fabricante. Os fragmentos de DNA foram purificados a partir de agarose usando o protocolo GeneClean (BIO 101). Os oligonucleótidos foram fornecidos por Oswell Oligonucleotides Service e foram sintetizados à escala de 40 nm. O DNA de plasmideo foi isolado usando kits Mini/Midi para DNA de plasmideo da Qiagen. O PCR foi realizado usando Amplitaq Perkin Elmer conforme recomendado. A sequenciação de DNA foi realizada usando o kit de sequenciação "Applied Biosystems Taq cycle sequencing".
Indução em frascos de agitação
Culturas de E. coli foram crescidas em meio liquido L suplementado com tetraciclina (7,5 yg/ml). Para induções, culturas crescidas durante a noite (crescidas a 30°C) foram diluídas para D0600 de 0,1 em 200 ml de caldo L num frasco de 2 L com anti-vortex e foram crescidas a 30°C numa incubadora orbital. A uma D0600 de 0,5, adicionou-se IPTG para 200 μΜ. Removeram-se amostras (normalizadas para a DO) em intervalos.
Extracção periplásmica
As amostras de cultura foram arrefecidas em gelo (5 minutos) depois as células foram colhidas por centrifugação. Após ressuspensão em tampão de extracção (Tris-HCl 100 mM, EDTA 10 mM, pH 7,4) as amostras foram incubadas durante a noite a 30°C, depois clarificadas por centrifugação . ΡΕ2230308 64
Ensaio de Montagem
As concentrações de Fab modificado foram determinadas por ELISA. As placas foram revestidas a 4°C, durante a noite, com anticorpo anti-humano Fd6045 (2 yg/ml em tampão de revestimento, soro fisiológico, 100 μΐ por alvéolo). Após lavagem. 100 μΐ da amostra foram aplicados por alvéolo; como padrão foi usado inicialmente a 2 pg/ml. As amostras foram diluidas sucessivamente 2 vezes ao longo da placa em tampão de amostra conjugado (por litro: 6,05 g de trisaminometano; 2,92 g de NaCl; 0,1 ml de Tween-20; 1 ml de caseína (0,2%); as placas foram incubadas durante 1 hora à temperatura ambiente, com agitação. As placas foram lavadas e secas, depois adicionou-se 100 μΐ de anti-kappa C humano (GD12)-peroxidase (diluído em tampão de amostra conjugado). A incubação decorreu à temperatura ambiente durante 1 hora com agitação. As placas foram lavadas e secas, depois adicionou-se 100 μΐ de solução de substrato (10 ml de solução de acetato de sódio/citrato (0,1M pH 6,0); 100 μΐ de solução de H2O2; 100 μΐ de solução de tetrametilbenzidina (10 mg/ml em dimetilsulfóxido). A absorvância a 630 nm foi lida 4-6 minutos após adição do substrato.
Construção do plasmídeo pTTO-1 (a) Substituição do poli-adaptador pTT09 O plasmídeo pTTQ9 foi adquirido à Amersham e está 65 ΡΕ2230308 apresentado na Figura 14. Uma aliquota (2 yg) foi digerida com as enzimas de restrição Sall e EcoRI, o produto da digestão foi corrido num gel de 1% de agarose e o fragmento de DNA grande (4520 pb) foi purificado. Dois oligonu-cleótidos foram sintetizados os quais, quando emparelhados um com o outro, codificam a região do poli-adaptador OmpA mostrado na Figura 15. Esta sequência possui extremos coesivos que são compatíveis com os extremos Sall e EcoRI gerados pela restrição de pTTQ9. Através da clonagem desta "cassete" oligonucleotídica no vector pTTQ9, o local Sall não é regenerado mas o local EcoRI é mantido. A cassete possui os 13 primeiros aminoácidos da sequência sinal da proteina Omp-A da membrana externa de E. coli, precedida de um local Shine Dalgarno de ligação ao ribossoma. Ainda, estão presentes os locais de restrição para as enzimas Xbal, Muni, Sty I e SpII. Os locais Muni e styl estão dentro da região codificadora da sequência sinal OmpA e destinam-se a ser locais de clonagem 5' para a inserção de genes. Os dois oligonucleótidos que constituem esta cassete foram emparelhados um com o outro misturando numa concentração de 5 pmoles/μΐ e aquecendo num banho -maria a 95°C durante 3 minutos, depois arrefecendo lentamente à temperatura ambiente. A sequência emparelhada foi então ligada a pTTQ9 cortado com SalI/EcoRI. O plasmídeo intermediário resultante, designado pTTQmp, foi verificado por sequenciação de DNA. (b) Preparação e ligação do fragmento O plasmideo pTTO-1 foi construído através da 66 ΡΕ2230308 ligação de um fragmento de DNA do plasmídeo pACYC184 a dois fragmentos gerados a partir de pTQOmp. 0 plasmídeo pACYC184 foi obtido à New England Biolabs e um mapa de enzimas de restrição está apresentado na Figura 16. Uma alíquota (2 yg) foi digerida totalmente com a enzima de restrição Styl, depois tratada com Nuclease Mung Bean; este tratamento cria extremos cegos através do corte de extremos com bases salientes 5'. Após extracção com fenol e precipitação com etanol, o DNA foi cortado com a enzima PvuII, dando origem a fragmentos de 2348, 1081, 412 e 403 pb. O fragmento de 2348 pb foi purificado por electroforese em gel de agarose. Este fragmento codifica a marca de resistência à tetraciclina e a origem de replicação de pl5A. O fragmento foi então tratado com fosfatase alcalina de intestino de vitela para remover fosfatos terminais 5', evitando assim a auto-ligação desta molécula.
Uma alíquota (2 yg) de plasmídeo pTQOmp foi digerido com as enzimas SspI e EcoRI e o fragmento de 2350 pb foi purificado de fragmentos indesejáveis de 2040 pb e 170 pb após electroforese em gel de agarose; este fragmento codifica a região terminadora da transcrição e o gene laclq. Uma outra alíquota (2 yg) de pTQOmp foi digerida com EcoRI e Xmnl, dando origem a fragmentos de 2289, 1670, 350 e 250 pb. O fragmento de 350 pb, codificador do promotor Tac, a sequência sinal OmpA e o local de clonagem múltipla foram purificados em gel.
Os três fragmentos foram então ligados, usando ΡΕ2230308 quantidades aproximadamente equimolares de cada fragmento, para gerar o plasmídeo pTTO-1. Todas as junções de clonagem foram verificadas por sequenciação de DNA. 0 mapa de restrição deste plasmídeo está apresentado na Figura 17. 0 plasmideo pTTO-2 foi então criado através da inserção de DNA codificador do dominio constante da cadeia leve kappa humana. Este foi obtido como um fragmento de restrição Spl-EcoRI a partir do plasmideo pHCl32 e inserido nos locais correspondentes em pTTO-1. 0 plasmideo pTTO-2 está apresentado na Figura 18.
Inserção das regiões variáveis de hTNF40 humanizadas em pTTO-2 A região variável da cadeia leve hTNF40gLl (SEQ ID NO:8) foi obtida por "recuperação" por PCR a partir do vector correspondente pMRlO.l para a expressão em células de mamífero. A sequência líder OmpA substitui o líder nativo de Ig. A sequência das sequências iniciadoras para PCR está apresentada abaixo: sequência iniciadora 5 ' CGCGCGGC A ATTGCAGTGGCCTTGGCTGGTTTCGCT ACCGT AGCGC AAG CTGACATTCAAATGACCCAGAGCCC (SEQ ID NO:79) sequência iniciadora 3' TTCAACTGCTCATCAGATGG (SEQ ID NO:80) 68 ΡΕ2230308
Após PCR em condições convencionais, o produto foi purificado, digerido com as enzimas Muni e Spil e depois purificado em gel. 0 fragmento purificado foi então inserido nos locais Munl/SpII de pTTO-2 para criar o intermediário da cadeia leve pTTO (hTNF4OL) . A região variável da cadeia pesada de gh3hTNF40.4 foi obtida da mesma forma a partir do vector pGamma-4. A sequência das sequências iniciadoras de PCR está apresentada abaixo: sequência iniciadora 5': GCTATCGCAATTGCAGTGGCGCTAGCTGGTTTCGCCACCGTGGCGCAAG CTGAGGTTCAGCTGGTCGAGTCAGGAGGC (SEQID NO:81) sequência iniciadora 3 ' : GCCTGAGTTCCACGACAC (SEQ ID NO:82)
Após PCR o produto foi purificado, digerido com as enzimas Nhel e Apal depois subclonado no vector pDNAbEng-Gl (Figura 19) . Após verificação por sequenciação de DNA, a cadeia pesada foi cortada com a enzima de restrição EcoRI e subclonada no local EcoRI de pTTO(hTNF40L) para criar o plasmídeo pTTO(hTNF40) de expressão em E. coli. 69 ΡΕ2230308
Optimização da sequência intergénica para a expressão de Fab modificado
No vector pTTO, a expressão de Fab modificado ocorre a partir de um mensageiro dicistrónico codificador primeiro da cadeia leve e depois da cadeia pesada. A sequência de DNA entre os dois genes (sequência intergénica, IGS) pode influenciar o nivel de expressão da cadeia pesada ao afectar a velocidade de iniciação da tradução. Por exemplo, uma sequência intergénica curta pode resultar na tradução acoplada entre as cadeias leve e pesada, uma vez que o ribossoma poder não se dissociar totalmente do mRNA após completada a síntese da cadeia leve antes de iniciar a síntese da cadeia pesada. A "força" de qualquer local Shine Dalgarno (SD) de ligação ao ribossoma (homologia com rRNA 16S) pode também ter um efeito, tal como a distância e composição da sequência entre SD e o codão de iniciação ATG. A potencial estrutura secundária do mRNA à volta do ATG é um outro factor importante, o ATG deverá estar numa "ansa" e não constringido num "pé", enquanto o contrário se aplica a SD. Assim, através da modificação da composição e força da IGS é possível modificar a força da iniciação da tradução e assim o nível da produção da cadeia pesada. É provável que uma velocidade óptima de iniciação da tradução necessite de ser conseguida para tornar máxima a expressão da cadeia pesada de um determinado Fab modificado. Por exemplo, com um Fab modificado pode ser tolerado um nível elevado de expressão, 70 ΡΕ2230308 mas para um Fab modificado com uma sequência de aminoácidos diferente, um nivel de expressão elevado pode mostrar-se tóxico, talvez devido a diferenças de eficiência da secreção ou enrolamento. Por este motivo, foi desenhada uma série de quatro sequências intergénicas (Figura 20), permitindo a determinação empírica da IGS óptima para Fab modificado baseado em hTNF40. IGS1 e IGS2 possuem sequências intergénicas muito curtas (-1 e +1, respectivamente) e espera-se que originem tradução estreitamente acoplada; as sequências SD (sublinhadas) são pouco diferentes. Estas duas sequências conferirão provavelmente um nível elevado de iniciação da tradução. IGS3 e IGS4 possuem uma distância maior entre os codões de iniciação e de paragem (+13) e diferem na sua composição da sequência; IGS3 possui uma sequência SD "mais forte". Todas as sequências foram estudadas relativamente à sua estrutura secundária (usando o programa m/fold) e "optimizadas" tanto quanto possível; no entanto, com a acoplagem estreita da tradução das duas cadeias a ausência de dissociação do ribossoma significa que o mRNA pode não estar "nu", evitando a formação de estruturas secundárias.
Clonagem de variantes de IGS
As cassetes IGS mostradas na Figura 20 possuem locais de clonagem Saci e Muni. Foram construídas através do emparelhamento de pares de oligonucleótidos complementares. Um fragmento vector foi preparado através da digestão de pTTO(hTNF40) com Saci e Notl, e um fragmento da 71 ΡΕ2230308 cadeia pesada foi preparado através da digestão de pDNAbEngG 1 (hTNF40H) com Muni e NotI. Foram realizadas ligações de três elementos, usando quantidades equimolares dos dois fragmentos de restrição e aproximadamente 0,05 pmoles de cada uma das cassetes de oligonucleótidos emparelhados. Isto criou os quatro plasmideos de expressão pTTO(hTNF40 IGS-1), pTTO(hTNF40 IGS-2), pTTO (hTNF40 IGS-3), pTTO(hTNF 4 0 IGS-4).
Análise da expressão em frascos de agitação
Os quatro plasmideos foram usados para transformar E. coli estirpe W3110, juntamente com a construção de expressão original e depois analisados relativamente à expressão em frascos de agitação como descrito. Os resultados de uma experiência típica estão apresentados na Figura 21. As diferentes sequências intergénicas conferem diferentes perfis de expressão. IGS1 e IGS2 acumulam Fab modificado no espaço periplásmico rapidamente com um pico 1 hora após indução, após o que o nível recuperado cai. O pico é maior e a queda mais acentuada para IGS1. Estes resultados são consistentes com elevados níveis de sintese, como esperado para a estreita acoplagem da tradução para estas construções. IGS1 aparentemente confere um nível mais elevado de expressão da cadeia pesada do que IGS2. Neste caso, parece que este nível elevado de expressão é mal tolerado, uma vez que os níveis de expressão no espaço periplásmico caem após o pico à 1 hora. Isto observou-se no perfil de crescimento da cultura IGS I (não apresentado), a 72 ΡΕ2230308 qual forma um pico 1 hora após indução antes de cair, sugerindo morte e lise celular. IGS3 acumula Fab modificado mais lentamente mas forma um pico às 2 horas pós-indução com um valor de pico mais alto (325 ng/ml/DO) , antes dos niveis cairem. 0 crescimento desta cultura continuou até às 3 horas pós indução e atingiu uma maior biomassa no pico (não apresentado) . Isto é consistente com um nivel mais baixo de síntese da cadeia pesada. IGS4 acumula material a uma velocidade ainda mais baixa e não chega a atingir o pico elevado de produtividade das outras 3 construções. Todas as variantes de IGS ultrapassam o vector original significativamente. A hipótese de as diferentes sequências IGS conferirem diferentes velocidades de iniciação da tradução é apoiada por estes resultados experimentais. Para Fab modificado baseado em hTNF40 parece que uma elevada taxa de iniciação da tradução da cadeia pesada é mal tolerado e é portanto não óptimo. Uma velocidade mais baixa, conforme conferido por IGS3, resulta em melhores características de crescimento e consequentemente um melhor rendimento se acumula ao longo do tempo.
Após comparação da produtividade no fermentador, a construção IGS3 foi seleccionada como a que dá rendimento mais elevado e foi designada pTTO(CDP870) - ver Figura 22. A cadeia pesada codificada pelos plasmídeos pTTO(CDP870) tem a sequência apresentada em SEQ ID NO:115 e a cadeia leve tem a sequência apresentada em SEQ ID NO:113. ΡΕ2230308
Peguilação de Fab modificado com enxertos de CDRs baseado em hTNF40.
Fab modificado purificado foi conjugado especi-ficamente com uma molécula de PEG ramificada. Isto foi conseguido através da activação de um único resíduo de cisterna numa região de charneira truncada do Fab modificado, seguido de reacção com (PEG)-lisil-maleimida como anteriormente descrito ((A.P. Chapman et al., Nature Biote-chnology 17, 780-783, 1999). A molécula peguilhada está apresentada na Figura 13 e é designada composto CDP870.
Eficácia de Fab modificado, baseado em hTNF40, com enxertos de CDRs e peguilhado CDP870 possui uma semi-vida grande de aproxi-madamente 11 dias.
Avaliámos a segurança e eficácia de CDP870 intravenoso num ensaio randomizado, duplo cego controlado com placebo de dose progressiva em doentes com RA. Métodos
Doentes:
Doentes com idades ente 18 e 75 anos e que satisfaziam os critérios de diagnóstico do American College of Rheumatology (ACR) revistos em 1987 para a artrite 74 ΡΕ2230308 reumatóide (RA) ((Arnett et al., Arthritis Rheum., 31, 315-324, 1988)foram recrutados entre doentes externos de clínicas de reumatologia de Londres, Cambridge, Norfolk e Norwich (Reino Unido). Era necessário que os doentes tivessem doença clinicamente activa conforme definido por terem pelo menos 3 dos seguintes critérios: > 6 articulações com dores ou com desconforto; >45 minutos de rigidez matinal; e velocidade de sedimentação dos eritrócitos (ESR) >28 mm/hr. Devem ter falhado a resposta a pelo menos um anti-reumático modificador de doença (DRARD) e que estiveram sem tratamento durante pelo menos 4 semanas. Os corticosteróides eram permitidos se a dose fosse > 7,5 mg/dia de prednisolona. As mulheres grávidas, a amamentar e as mulheres com potencial de engravidarem sem estarem a usar um método eficaz de contracepção foram excluídas. Foram igualmente excluídos doentes com uma história anterior de cancro, condições médicas graves não controladas concomitantes, falência prévia da terapia de neutralização de TNFa ou alergia ao polietilenoglicol. 0 consentimento informado escrito foi obtido de cada doente antes da inclusão. 0 estudo foi aprovado pelas comissões locais de ética para a investigação.
Protocolo de tratamento: 36 doentes RA foram divididos em 3 grupos, cada um recebeu uma dose crescente do fármaco do ensaio (1,5 ou 20 mg/kg). Cada grupo de 12 foi dividido, aleatoriamente, em 8 que receberam CDP870 e 4 que receberam placebo. CDP870 75 ΡΕ2230308 foi administrado como uma única infusão intravenosa (100 ml no total) durante 60 minutos. O placebo (tampão acetato de sódio) foi dado de forma semelhante como uma única infusão intravenosa de 100 ml ao longo de 60 minutos. O tratamento foi dado em ambulatório. Após 8 semanas, todos dos doentes tiveram oportunidade de receber uma infusão de 5 ou 20 mg/kg de CDP870 de forma aberta.
Avaliação clinica: A actividade de doença RA foi avaliada com base nas séries de dados de base da World Health Organization e da International League of Associations for Rheumatology (Boers et al., J. Rheumatol - Supplement, 41, 86-89, 1994) and European League Against Rheumatism (EULAR) (Scott et al., Clin. Exp. Rheumatol., 10, 521-525, 1992). As avaliações foram realizadas antes do tratamento e às 1, 2, 4, 6 e 8 semanas após terapia. Os doentes foram igualmente avaliados relativamente a segurança e tolerância do fármaco em estudo. A hematologia, bioquímica, anticorpos anti-CDP870 e eventos adversos foram avaliados em cada visita.
Concentração de CDP870 no plasma e anticorpos anti-CDP870: CDP870 foi medido pelo ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA). Diluições seriadas de plasma do doente foram incubadas em placas de microtitulação (Nunc) revestidas com TNFa humano recombinante (Strathmann Biotech 76 ΡΕ2230308
GmbH, Hannover). CDP870 capturado foi revelado com anticorpos de cabra anti-cadeia leve kappa humana conjugados com peroxidase de rábano silvestre (Cappel, ICN) seguido do substrato tetrametilbenzidina (TMB).
Os anticorpos contra CDP870 foram testados (numa diluição do plasma de 1/10 usando um ELISA de sanduíche com duplo antigénio com CDP870 biotinilado como segunda camada. Os anticorpos ligados foram revelados usando HRP-estreptavidina e o substrato TMB. O ensaio foi calibrado usando um padrão de IgG de coelho hiperimune. Uma unidade de actividade é equivalente a 1 yg do padrão de coelho.
Análise estatística O estudo foi exploratório na natureza e o tamanho da amostra foi baseado na experiência anterior com agentes semelhantes. A eficácia de CDP870 foi analisada através do cálculo das pontuações de actividade de doença (DAS) e das respostas ACR20/50 relativamente à intenção de tratamento e tratados usando um procedimento fechado de teste. A actividade de doença foi calculada como se segue: DAS = 0,555 x pé quadrado de (28 articulações sinoviais) + 0,284 x pé quadrado (28 articulações inchadas) + 0,7 x ln(ESR) + 0,0142 x (avaliação global do doente). Primeiro, os grupos activos em conjunto foram comparados com o placebo. Se esta comparação for significativa num nivel de 5%, cada grupo de dosagem foi comparado com placebo. Todas as comparações foram de duas vias com um nível de significância de 5%. Todos os valores de P foram derivados da análise 77 ΡΕ2230308 exploratória e não deverá ser usado para interpretação inferencial.
Resultados
Demografia:
Foram recrutados 36 doentes com RA. Os seus detalhes demográficos estão apresentados na Tabela 6. A idade média foi de 56 anos e 30 doentes eram do sexo feminino. A duração média de RA foi de 13 anos e 21 doentes eram positivos para factor reumatóide. Os doentes nos diferentes grupos tinham caracteristicas demográficas semelhantes. No periodo cego de dosagem, 6/12 doentes tratados com placebo sairam do estudo devido a RA deteriorante h4 semanas após a dosagem. 2/24 doentes tratados com CDP870 sairam, ambos do grupo de 1 mg/kg, devido a RA dete-riorante/perda de seguimento >4 semanas após dosagem. A diferença foi estatisticamente significativa (p=0,009, teste exacto de Fisher).
Tabela 6: Detalhes demográficos (média ± desvio padrão) Número Sexo (M:F) Idade Placebo 12 1.11 51+8 1 mg/kg 8 1:7 59+7 5m g/kg 8 2:6 54+13 20 mg/kg 8 2.6 61+11
Duração da Factor Número de doença Reumatóide DMARDs anteriores 12+8 8(67%) 5+1 12+7 4(50%) 4+1 13+5 5(63%) 5+2 14+13 4+2 4(50%) 78 ΡΕ2230308
Eficácia clínica:
A proporção de doentes com melhoria de ACR20 para a população tratada com a última observação a termo foi de 16,7, 50, 87,5 e 62,5 % relativamente ao placebo, 1, 5 e 20 mg/kg CDP870 (efeito do tratamento combinado p=0,012) às 4 semanas e 16, 7, 25, 75 e 75% (p=0,032) às 8 semanas. A redução das pontuações DAS (mediana) para a população per-protocolo com a última observação realizada sendo 0,15, 1,14, 1,91 e 1,95 após o placebo, 1, 5 e 20 mg/kg CDP870 (efeito do tratamento combinado p = 0,001) às 4 semanas e 0,31, 0,09, 2,09 e 1,76 (p=0,008) às 8 semanas (Figura 23). As alterações nos componentes individuais da série de dados nucleares da Organização Mundial de Saúde e Liga Internacional das Associações de Reumatologia na Figura 24.
Após a dose de marca aberta de CDP87 0, foram conseguidos efeitos benéficos. Dos 36 doentes recrutados no estudo, 32 receberam uma segunda infusão de CDP870. A proporção de doentes com melhoria de ACR20 da pré-primeira infusão foi de 72,2 e 55,6% após 5 e 20 mg/kg de CDP870 às 4 semanas e 55,6% e 66,7% às 8 semanas.
Eventos adversos O tratamento foi bem tolerado sem reacção relacionada com infusão. Não foram descritos reacções alérgicas ou erupção cutânea. Na fase de duplo cego, houve 79 ΡΕ2230308 19, 38, 8 e 14 eventos adversos nos grupos placebo, 1, 5 e 2 0 mg/kg, respectivamente. O mais comum foi dor de cabeça com 9 episódios em 5 doentes (1 placebo, 3 a 1 mg/kg, 1 a 2 0 mg/kg) . Um doente que recebeu placebo e 3 doentes que receberam CDP870 (1 a 5 mg/kg e 2 a 20 mg/kg) desenvolveram infecções do sistema respiratório inferior. Estas foram descritas como suaves ou moderadas. Foram tratadas com antibióticos orais e resolvidas num periodo de 1-2 semanas. Três doentes, cada um deles nos grupos de 1 e 5 mg/kg e um no grupo de 20 mg/kg, desenvolveram infecção das vias urinárias 1-2 meses após tratamento com CDP870. Um evento adverso que foi descrito como grave consistiu num episódio de dor no pescoço que surgiu 3 dias após infusão com 1 mg/kg. O aumento do anticorpo anti-nuclear foi observado em 4 doentes: 1 no grupo placebo (negativo até 1/40), 2 no grupo de 1 mg/kg (negativo a 1/40, negativo a 1/80) e 1 no grupo de 20 mg/kg (negativo até 1/40) . Não foi encontrada alteração nos anticorpos anti-DNA ou anti-cardiolipina.
Concentração de CDP870 no plasma e níveis de anti-CDP870
Conforme esperado, para todos os niveis de dosagem de CDP870, a concentração do pico no plasma ocorreu no final da infusão e foi proporcional à dose a concentração no plasma declinando depois lentamente. O perfil de concentração no plasma de CDP870 pareceu muito semelhante ao anteriormente observado em voluntários onde a semi-vida foi calculada como sendo de aproximadamente 14 dias. Quando 80 ΡΕ2230308 de nova dosagem, foi observado um perfil semelhante para a infusão de dose única.
Após uma única infusão intravenosa, os niveis de anti-CDP870 foram baixos ou indetectáveis.
Discussão A neutralização de TNFa é uma estratégia de tratamento eficaz em RA. Actualmente, esta requer o uso de agentes biológicos, tais como mAb quimérico ou um rece-ptor/proteína de fusão Fc humana solúvel, cuja manufactura é dispendiosa. Um agente terapêutico neutralizante de TNFa necessita de se ligar a TNFa com elevada afinidade e de ter uma longa semi-vida no plasma, baixa antigenicidade e elevada tolerabilidade e segurança. Necessita também de estar acessível a todos os doentes com RA que beneficiem do bloqueio de TNFa. Uma tecnologia que possa atingir estes objectivos é a conjugação com polietilenoglicol de um fragmento de anticorpo de ligação a TNFa produzido em E. coli. Neste estudo preliminar, encontrámos que CDP870, um Fab modificado anti-TNFa, pequilhado, é eficaz e bem tolerado pelos doentes com RA.
Os estudos in vitro demonstraram que CDP870 reduziu a inflamação e melhorou os sintomas em RA. A melhoria clínica, conforme medida pelos critérios de resposta ACR20 nos grupos de 5 e 20 mg/kg (75%, 75%) foi comparável a etanercept (60%) (Moreland et al., Annals Int. 81 ΡΕ2230308
Med., 130, 478-486, 1999) e infliximab (50%) (Maini et al., Lancet, 354, 1932-1939, 1999). Nos níveis de dosagem testados médio e elevado, o efeito terapêutico durou 8 semanas que é comparável a outros mAbs anteriores (Elliott et al., Lancet, 344, 1105-1110, 1994 and Rankin et al., Br. J. Rheumatol., 34, 334-342, 1995). Um estudo anterior demonstrou que o efeito terapêutico do anticorpo anti-TNFa está relacionado com a sua semi-vida no plasma e a geração de anticorpos circulantes (Maini et al., Arthritis Rheum.38, (Supplement): S186 1995 (Abstract)). O nosso estudo mostrou que CDO870 tem uma semi-vida no plasma de 14 dias, o que é equivalente à do anticorpo completo (Rankin et al., (supra)) e muito mais longa que a semi-vida dos fragmentos Fab' não conjugado. Ainda, CDP870 gerou apenas níveis muito baixos de resposta de anticorpos.
Um dos objectivos importantes deste estudo é examinar a tolerabilidade e segurança da administração deste Fab' Pequilado. No nosso estudo, CDP870 parece ser bem tolerado. Ainda que sejam necessários mais estudos para avaliar toxicidade a longo prazo, especialmente o risco de doença desmielinizante, infecção e erupção da pele que foram descritos com etanercept e infliximab.
Resumindo, CDP870 é terapeuticamente eficaz em RA e foi bem tolerado neste estudo a curto prazo.
Deverá ser entendido que os exemplos atrás descritos são meramente exemplificativos e não limitam o 82 ΡΕ2230308 âmbito do presente invento como definido nas reivindicações que se seguem.
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
<110> CELLTECH CHIROSCIENCE LIMITED
<120> PRODUTOS BIOLÓGICOS
<130> P021741GB <140> <141> <160> 115 <170> Patentln Ver. 2.1
<210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: hTNF40 CDRH1 <400> 1
Asp Tyr Gly Met Asn 1 5
<210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: hTNF40/CDRH2 humana híbrida <400> 2
Trp Ile Asn Thr Tyr Ile Gly Glu Pro Ile Tyr Ala Asp Ser Vai Lys 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: hTNF40 CDRH3 <400> 3 Gly Tyr Arg Ser Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 <210> 4 ΡΕ2230308 <211> 11 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência <400> 4 Lys Ala Ser Gin Asn Vai Gly Thr 1 5 <210> 5 <211> 5 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência <400> 5 Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência <400> 6 Gin Gin Tyr Asn Ile Tyr Pro Leu 1 5 <210> 7 <211> 17 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência <400> 7 Trp Ile Asn Thr Tyr Ile Gly Glu 1 5 Gly <210> 8 <211> 321 <212> DNA <213> Sequência artificial artificial: hTNF40 CDRL1
Asn Vai Ala 10 artificial:hTNF40 CDRL2 artificial:hTNF40 CDRL3 Thr artificial:hTNF40 CDRH2
Pr o Ile Tyr Vai Asp Asp Phe Lys 10 15 <22 0> <221> CDS <222> (1)..(321) 84 ΡΕ2230308 <220> <223> Descrição da sequência arti <400> 8 gac att caa atg acc cag age cca tcc
Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser 1 5 gac cgg gtc acc ate acc tgt aaa gee
Asp Arg Vai Thr lie Thr Cys Lys Ala 20 25 gta gee tgg tat cag caa aaa cca ggt
Vai Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly 35 40 tac agt gee tet etc etc tat agt ggt Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly 50 55 tcc ggt agt ggt act gat ttc acc etc Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu 65 70 . gaa gat ttc gee act tat tac tgt caa Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Θ5 aca ttc ggt cag ggt act aaa gta gaa Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Vai Glu 100 105
<210> 9 <211> 321 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <221> CDS <222> (1)..(321) ficial: hTNF40-gLl age ctg age gea tet gta gga 48 Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly 10 15 agt cag aac gta ggt act aac 96 Ser Gin Asn Vai Gly Thr Asn 30 aaa gee cca aaa gee etc ate 144 Lys Ala Pro Lys Ala Leu Ile 45 gta cca tac agg ttc age gga 192 Vai Pro Tyr Arg Phe Ser Gly 60 acg ate agt age etc cag cca 240 Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro 75 80 cag tat aac ate tac cca etc 288 Gin Tyr Asn Ile Tyr Pro Leu 90 95 ate aaa 321
Ile Lys <22 0> <223> Descrição da sequência arti ficial: hTNF90-gL2 <400> 9 gac att caa atg acc cag age cca tcc Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser 1 5 gac cgg gtc acc ate act tgt aaa gee Asp Arg vai Thr Ile Thr Cys Lys Ala 20 25 gta gee tgg tac cag caa aaa cca ggt Vai Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly 35 40 tac agt gee tet ttc etc tat agt ggt Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly age Ser 10 ctg Leu age Ser gea Ala tet Ser gta gga Vai Gly 15 agt Ser cag Gin aac Asn gta Vai ggt act Gly Thr 30 aac Asn aaa Lys gee Ala cca Pro aaa Lys 45 etc Leu etc Leu ate Ile gta Vai cca Pro tac Tyr agg Arg ttc Phe age Ser gga Gly 192 85 ΡΕ2230308 50 55 60 CCC ggt agt ggt acc gat ttc acc ctc acg ate agt age ctc cag cca 240 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80 gaa gat ttc gcc act tat tac tgt caa cag tat aac ate tac cca ctc 288 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Asn Ile Tyr Pro Leu 85 90 95 aca ttc ggt cag ggt act aaa gta gaa ate aaa 321 Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Vai Glu Ile Lys 100 105
<210> 10 <211> 354 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <221> CDS <222> (1) .. (354) <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: < ghlhTNF40.4 (Figura 10) <400> 10 cag gtg cag ctg gtc cag tea gga gea gag gtt aag aag cct ggt gct 48 Gin Vai Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 tcc gtc aaa gtt teg tgt aag gcc tea ggc tac gtg ttc aca gac tat 96 Ser Vai Lys Vai Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Val Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 ggt atg aat tgg gtc aga cag gcc ccg gga caa ggc ctg gaa tgg atg 144 Gly Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 ggt tgg att aat act tac att gga gag cct att tat gct caa aag ttc 192 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Ile Gly Glu Pro Ile Tyr Ala Gin Lys Phe 50 55 60 cag ggc aga gtc acg ttc act cca gac acc tcc aca age act gea tac 240 Gin Gly Arg Vai Thr Phe Thr Leu Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 atg gag ctg tea tet ctg aga tcc gag gac acc gea gtg tac tat tgt 288 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gct aga gga tac aga tet tat gcc atg gac tac tgg ggc cag ggt acc 336 Ala Arg Gly Tyr Arg Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110 cta gtc aca gtc tcc tea 354 Leu Vai Thr Vai Ser Ser 115 86 ΡΕ2230308
<210> 11 <211> 354 <212> DNA <213> Sequência artificial <22 0> <221> CDS <222> (1) . . (354) <220> <223> Descrição da sequência artificial: gh3hTNF40.4 (Figura 11) <400> 11 gag gtt cag ctg gtc gag tca gga ggc ggt etc gtg cag cct ggc gga 48
Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15 tca ctg aga ttg tcc tgt gct gea tet ggt tac gtc ttc aca gac tat 96
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Vai Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 gga atg aat tgg gtt aga cag gee ccg gga aag ggc ctg gaa tgg atg 144
Gly Met Asn Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 ggt tgg att aat act tac att gga gag cct att tat gct gac age gtc 192
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Ile Gly Glu Pro Ile Tyr Ala Asp Ser Vai 50 55 60 aag ggc aga ttc acg ttc tet cta gac aca tcc aag tca aca gea tac 240
Lys Gly Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 ctc caa atg aat age ctg aga gea gag gac acc gea gtg tac tat tgt 288
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95 gct aga gga tac aga tet tat gee atg gac tac tgg ggc cag ggt acc 336
Ala Arg Gly Tyr Arg Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 HO cta gtc aca gtc tcc tca 354
Leu Vai Thr Vai Ser Ser 115
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<400> 12 gccgccacc 9 <210> 13 <211> 26 <212> DNA 87 ΡΕ2230308 <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: sequência iniciadora CHI <400> 13 atgaaatgca gctgggtcat sttctt 26 <210> <211> <212> <213> 14 26 DNA Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: sequência iniciadora CH2 <400> 14 atgggatgga gctrtatcat sytctt 26 <210> <211> <212> <213> 15 26 DNA Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: sequência iniciadora CH3 <400> 15 atgaagwtgt ggttaaactg ggtttt 26 <210> <211> <212> <213> 16 23 DNA Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: sequência iniciadora CH4 <400> 16 atgractttg ggytcagctt grt 23 <210> <211> 17 26 <212> <213> DNA Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: sequência iniciadora CH5 <400> 17 atggactcca ggctcaattt agtttt 26
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<210> 25 <211> 21 <212> DNA <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: sequência iniciadora do extremo 5' <400> 25 gcgcgcaagc ttgccgccac c 21
<210> 26 <211> 29 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: sequência iniciadora CL1 <400> 26 atgaagttgc ctgttaggct gttggtgct 29
<210> 27 <211> 29 <212> DNA <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: sequência iniciadora CL2 <400> 27 atggagwcag acacactcct gytatgggt 29 <210> 28 <211> 23 90 ΡΕ2230308
<212> DNA <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: sequência iniciadora CL3 <400> 28 atgagtgtgc tcactcaggt cct 23
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<210> 33 <211> 23 <212> DNA ΡΕ2230308 <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: sequência iniciadora CL7 <400> 33 atgggcwtca agatggagtc aca 23 <210> <211> <212> <213> 34 29 DNA Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: sequência iniciadora CL8 <400> 34 atgtggggay ctktttycmm tttttcaat 29 <210> <211> <212> <213> 35 24 DNA Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: sequência iniciadora CL8 <400> 35 atggtrtccw casctcagtt cctt 24 <210> <211> <212> <213> 36 26 DNA Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: sequência iniciadora CL9 <400> 36 atgtatatat gtttgttgtc tatttc 26 <210> <211> <212> <213> 37 26 DNA Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: sequência inicial CL10 <400> 37 atggaagccc cagctcagct tctctt 26
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<210> 43 <211> 29 <212> DNA 93 ΡΕ2230308 <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: sequência iniciadora CL16 <400> 43 atggattttc aattggtcct catctcctt 29 <210> 44 <211> 26
<212> DNA <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: sequência iniciadora CL17A <400> 44 atgaggtgcc tarctsagtt cctgrg 26
<210> 45 <211> 26 <212> DNA <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: sequência iniciadora CL17B <400> 45 atgaagtact ctgctcagtt tctagg 26
<210> 46 <211> 26 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial:sequência iniciadora 17C <400> 46 atgaggcatt ctcttcaatt cttggg 26
<210> 47 <211> 21 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: sequência iniciadora do extremo 5' <400> 47 ggactgttcg aagccgccac c 21 <210> 48 <211> 30 ΡΕ2230308 <212> <213> DNA Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial:sequência iniciadora CL12 <400> 48 ggatacagtt ggtgcagcat ccgtacgttt 30 <210> <211> 49 37 <212> <213> DNA Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: sequência iniciadora R2155 <400> 49 gcagatgggc ccttcgttga ggctgmrgag acdgtga 37 <210> <211> 50 24 <212> <213> DNA Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: sequência iniciadora R1053 <400> 50 gctgacagac taacagactg ttcc 24 <210> <211> 51 18 <212> <213> DNA Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: sequência iniciadora R720 <400> 51 gctctcggag gtgctcct 18 <210> <211> 52 70 <212> <213> DNA Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: oligonucleótido P7982 <400> 52 gaatfcesçsrg tcace®tese sfccrtaaagcc agfccagsacg tsggeacta» sgtagcc&gg Sfi £a£essG&aa 7® <210> 53 <211> 71 95 ΡΕ2230308
<212> DNA <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: oligonucleótido P7982 <400> 53 atagaggaaa gaggcactgt agatgagggc ttttggggct ctacctggtt tttgctgata 60 ccaggctacg t 71
<210> 54 <211> 71 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: oligonucleótido P7984 <400> 54 tacagtgcct ctttcctcta tagtggtgta ccatacaggt tcagcggatc cggtagtggt 60 actgatttca c 71
<210> 55 <211> 71 <212> DNA <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: oligonucleótido P7985 <400> 55
gacagsíím* agtggcfaa® zctzctgget ggaggctact gatcgtgagg gtgseatcsg W íavk&gíííçc g 71
<210> 56 <211> 89 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: oligonucleótido P7986 <400> 56 attfccgccac ttafctaccst ceacagcata acatctaccc acrteacattc ggtcôgggta 60 etaaagtaga aatcaa&egt acgfaacte 8¾
<210> 57 <211> 30 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: oligonucleótido P7981 <400> 57 gaattcaggg tcaccatcac ttgtaaagcc 30 ΡΕ2230308 <210> <211> <212> <213> 58 30 DNA Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: oliqonucleótido P7980 <400> 58 gaattccgta cgtttgattt ctactttagt 30 <210> <211> 59 24 <212> <213> DNA Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: oliqonucleótido R1053 <400> 59 gctgacagac taacagactg ttcc 24 <210> <211> 60 57 <212> <213> DNA Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: oligonucleótido R5350 <400> 60 tctagatggc acaccatctg ctaagtttga tgcagcatag atcaggagct taggagc 57 <210> <211> <212> <213> 61 59 DNA Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: oligonucleótido R5349 <400> 61 gcagatggtg tgccatctag attcagtggc agtggatcag gcacagactt taccctaac <210> <211> <212> <213> 62 18 DNA Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: oligonucleótido R684 <400> 62 ttcaactgct catcagat 18 97 ΡΕ2230308
<210> 63 <211> 65 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: sequência iniciadora P7989 <400> 63 esaigeccct «faeèggaee» gefcgcaeetg age^êgeaegi «o «atee e§
<210> 64 <211> 71 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: sequência iniciadora P7990 <400> 64 ggfcfc««g»ia9 cctggtáfCtt *étfc€«*á#fc fctcgtQtàas çKS<ifc<ai«$et àé^tgttcàc ¢0 agseEafcggt a 71 <210> 65
<211> 71 <212> DNA <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: sequência iniciadora P7991 <400> 65 ec**cc£3£â Çôtstcsats cttçftcessg gfççtgsStg sc<ccaastç& 4ΰ egtgaaeacg t Ti
<210> 66 <211> 81 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: sequência iniciadora P7995 <400> 66 esceteaaat #a «*«««« t téca6«§g*§ «@eet*«ftfce tgttgaeg&e C9 ttcaagf$ca s*ftt«eet«t « :®i
<210> 67 <211> 56 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: sequência iniciadora P7992 98 ΡΕ2230308 <400> 67 ccatgtatgc agtgcgttgt ggaggtgtct agagtgaacg tgaatctgcc cttgaa 56
<210> 68 <211> 62 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: sequência iniciadora P7993 <400> 68 s$eae twttacttor gagetgfceat efccEgstga&e e«a<j»ae*ee eeaftgttust 10 »£ 52
<210> 69 <211> 78 <212> DNA <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: oligonucleótido P7994 <400> 69 Í9 gaatfccggta ecctg®ec«e agfcagreeat ggeafcaagat eftgtafcccte tageeeaata 50
<210> 70 <211> 30 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: sequência iniciadora P7988 <400> 70 gaattcgtgc actctcaggt gcagctggtc 30
<210> 71 <211> 30 <212> DNA <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: sequência iniciadora P7987 <400> 71 gaattcggta ccctggcccc agtagtccat 30
<210> 72 <211> 65 <212> DNA <213> Sequência artificial 99 ΡΕ2230308 <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: sequência iniciadora P7999 <400> 72
gctfcacgíifg aeegeeteet ae-etee»ce* gctgea.ecfce assstgeeeg ifl asttc SS
<210> 73 <211> 71 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: sequência iniciadora P8000 <400> 73 tcCcgtsÊag cCtggeiggat sgctgr&gatt gteetgtgct gçatçfcggtí: açgtçfctcac £& agactAcgga a <210> 74
<211> 71 <212> DNA <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: sequência iniciadora P8001 <400> 74
<ce*ac««:*tç cãeç6«aí}0*? «efcfcfteeegflf *ee«a»e*»* tfeecHfcagsfce M tgtgâ&g&cg t
<210> 75 <211> 55 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: sequência iniciadora P7997 <400> 75 ggaggtatgc tgttgacttg gatgtgtcta gagagaacgt gaatctgccc ttgaa 55
<210> 76 <211> 62 <212> DNA <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: sequência iniciadora P7998 <400> 76 eeáagteaae ageat*«ct« e#**ce**i8 gccÈgassgc eg*§g«c*ee gevgtgtacc. «k ** <210> 77 100 ΡΕ2230308 <211> <212> <213> 78 DNA Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: sequência iniciadora P7993 <400> 77 e?aattsg#ta ccetggcçcc agtsgtccât g®csuagst ctitatccte tageacââta. éõ gtacsctfcf gtgtecee '71 <210> <211> <212> <213> 78 30 DNA Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: sequência iniciadora P7996 <400> 78 gaattcgtgc actctgaggt tcagctggtc 30 <210> <211> <212> <213> 79 74 DNA Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: sequência iniciadora 5' <400> 79 οφβ&βφφαη &έφ£»#κ$β£ tLttmtaam fcaeissfcÉaMc tisseaitueas 60 8ttgsceeia03 gsee 74 <210> <211> <212> <213> 80 30 DNA Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: sequência iniciadora 3' <400> 80 ttcaactgct catcagatgg 20 <210> <211> <212> <213> 81 78 DNA Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: sequência iniciadora 5' <400> 81 getAtegçaa tcgcagfcggc gctagetggç tecgccaceg tsgçíjcaagc tgaggttcag Sô ctggtcgagt cãggãggc ?§ 101 ΡΕ2230308
<210> 82 <211> 18 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: sequência iniciadora 3' <400> 82 gcctgagttc cacgacac 18
<210> 83 <211> 23 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: sequência de consenso
estrutural humana grupo 1 LI <400> 83 JMp 11® βΐη &*£ Star Φλη Ser Fre Ser Se* tea Ser Ata Ser V®1 I 5 10 15
Asp Ay® V®1 Thr ti® 1?hr Cyis 20 <210> 84
<211> 23 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0>
<223> Descrição da sequência artificial: sequência estrutural hTNF40 LI <400> 84
Aap 11« Val sec T&r f*ln Ser Gi» Lys Phe M$t Ser Thx Ser V*1 Gly 1 $ 10 15
Asp Arg Vai smt vai THr cyst m
<210> 85 <211> 15 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: sequência de consenso estrutural humana grupo 1 L2 <400> 85 **» IVr 61« SIíí Ly® Fro Gly tys Ala S*c byá leu. tea He syr z $ 10 is 102 ΡΕ2230308
<210> 86 <211> 15 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: sequência estrutural hTNF40 L2 <400> 86
Trp tyr siss ai» Lys *r© ciy ai» «wr *r© fila l*a« lie *yr i ' S 10 15
<210> 87 <211> 32 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: sequência de consenso estrutural humana grupo 1 L3 <400> 87
Oiy Vai pr© Se* Arg Phe Ser <21 y Ser Giy Ser Gly Thr Asp Pite Thr 1 5 1© 15 ©eu Thr 2!« Sm Ser ©·«« Sln Fro Giu As© PA* Ala. Ttr Tys Tyr Cys 20 25 30
<210> 88 <211> 32 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: sequência humana hTNF40 L3 <400> 88
Gly Vai Pre fyr Are *3©«· aiy Sar 01 y Ser Gly -thr fisp Phe Thr 15 20 B
íie Ser Ite vai «1» Ser Sla As© Ma hM t?iy Tyr SM 2© 25 30
<210> 89 <211> 11 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: sequência de consenso estrutural humana grupo 1 L4 <400> 89 PM -Gly 01«. Gly fhr &ys Vai Clu ti© ty» Ar© 2 S 1© <210> 90 103 ΡΕ2230308
<211> 11 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: sequência estrutural hTNF40 L4 <400> 90
Pks Çly Λλ« ©ly thx Ly* .Leu ©1« leu tyss Ars 1 ~ 5 10
<210> 91 <211> 30 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: sequência de consenso estrutural humana grupo 1 Hl <400> 91 vai Gin leu Vaí <51« Ser Giy Ala OÍ» Vai Lys Lys Ora Oly Λΐ® "l $ 10 15 .
Ser vai ty* ml Ser <Sy» &**'*!* 8w? 8Iy tft tlar Pise fhr 20 55 30
<210> 92 <211> 30 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: sequência estrutural hTNF40 Hl <400> 92 ei*i li* âlm Leu Vãl 5èr Ôly Pr© <Siu tés* Lys Ly« Sr© <Gly Glu "i I XÔ 11
Thr ¥al Ly* 11® Sar Cy« Lys Ala Ser Gly Tfrr Vai f*he «*r 20 7% 30
<210> 93 <211> 13 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: sequência de consenso estrutural humana grupo 1 H2 <400> 93 “np v«l a*® «1» Ai* vre «ly ei» «iy tm ól« trp mt ©Xy I s 16 <210> 94 104 ΡΕ2230308
<211> 14 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: sequência estrutural hTNF 4 0 L2 <400> 94 t»p Vai Ly* «lí* Ala Piú Gly Lys Alá fhs Lys Τερ mt Gly
<210> 95 <211> 32 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: sequência de consenso estrutural humana grupo 1 H3 <400> 95
Ar® Vai fhr 11® T&* Aí® TM' Sê* Tbr SéT *TM Mã Tyr Kefe 61» 1 $ 10 15 S®r S««r Um Ax? Ô«r Gtu A*p ΤΪ» Ata Vai Tyr Vyt Cjy* Ala Ar® 2:0 25 30
<210> 96 <211> 32 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: sequência estrutural hTNF 4 0 H3 <400> 96
Ara Phe Ma fh* Sm £*«« Gl» Thr Asr Ala Sm Thr Ala s-h® leu 1 5 10 15 11« Asa As« M*a tyfê as« βι*ι **p TM Ala ífe* Tys :ph* çy*· ai* Aipi m " as a»
<210> 97 <211> 11 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: sequência de consenso estrutural humana grupo 1 H4 <400> 97
Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 15 10 <210> 98 105 ΡΕ2230308
<211> 11 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: sequência estrutural hTNF40 H4 <400> 98 ψζρ eiy <*1« «3ty !&* ffcr ffcar vai Ser Ser Ϊ s iô <210> 99 <211> 324 <212> DNA <213> murino <22 0> <221> CDS <222> (1) . . (324) <223> domínio variável da cadeia leve hTNF40 de murganho <400> 99 atr jfc® atg acc esg eet saa eaa ttg atg tcc eea %.«* gt« «0* m ASp il* val icee «toe «1» S&r Glíí. tys Met Ser Thr Ser Vai t 5 10 15 gae acmi «to *«e acc **8 soo agt cag ost gtf sst aet aat ss ãsp Are Vél Ser Vai Thr Cya tya Ala s«r Oln, As» Vai Giy Thr· Asa so 25 30 st» tgrg t er «aa csg aaa eea caa eee cct aaa gca etg afct 14« Vai Ala Trp tyr «51» 01« ty» Pro Giy «1« Ser Pr« tys Ala teu 11« ss m 45 tae tcs sea tcc ots cta tat ego «9Λ gte eco tafc age e«c a ca 919© 19¾ Tyr ser Âla Ser S&8 í.ê« fy* S*r eiy val Pr© Tyr Arg Phe Thr Gly 50 55 50 «9* gge tet aca gat ttcr act «te ece ate age act gtg eag ter 240 Ser Oly Ser ôly Thr Asp- Phe Thr teu Thr n« Ser TSsr Vai Gin •Ser SS 70 ts 50 §aa 9«e etg «e& S«g t*t fcte fcgt «SO eaa tac AA.Ç ®t« eat eefe rte 28¾ Glw Asp teu Ala Ói«i Tyr Phe Cys ©Itt ©1» Tyr Asn lie V/r ΡϊΟ Lfití SS n ss :tt*s get ggg are *ag etg «t @ ase egt 334 Thr ffliy Ma «ly Tfcsr tys qiu Leu tys Árs .100 105 <210> 100 <211> 354 <212> DNA <213> murino <22 0> <221> CDS <222> (1) . . (354) <223> domínio variável da cadeia pesada hTNF40 de murganho 106 ΡΕ2230308 m m 244 152 240 288 33$ 3S4 <400> 100 caf ale «*» ftf 91$ «tag te* $$« «et $a$ e*9 «*$ aag e«t ggs 9*f filit. Ile Gin .Ií«w Uai Gin Saí Gly Pr® 01» «»ys Ly$ Pr© 61y «la l % i® i5 aca gte a»g ate t.cc tge aag get tes ggta ε»ε g«t tte acs gac «st fhff Vai iys lie Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyt VSi Fhe Tíir Agp Tyr 20 25 I® gg* aég «»« fegg gtg a&g ©ag gct cee gga a®g pcfc tte *sg tgg afcg
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<210> 101 <211> 84 <212> DNA <213> Sequência artificial <22 0> <221> CDS <222> (29)..(67) <223> Descrição da sequência artificial: OmpA oligonucleótido
adaptador OmpA <400> 101 tçgsfttsts gatssegsfS' cgcAssoâ st$ ea* ia$ aca gct ste gea stt S3
Set tys &y* *pi»r Ala ila À.la lio 1 S gea gtg gee ttg gct etgscgçseg agtcagg $4
Ala Vãl Ala i«u Ala 1®
<210> 102 <211> 67 <212> DNA <213> Sequência artificial <220>
<221> CDS 107 ΡΕ2230308 <222> (2)..(40) <221> CDS <222> (43)..(66) <223> Descrição da sequência artificial: IGS cassete-1 <400> 102
g age fcca eca gts ®e® s*® ttt safe aga gga g®g tgt ta atg aag 41 Sfc* Vai. StMt kys S*tf Âs« IMfl ©1® X»ã> X#* |.yg 1 5 10 'iS a»g «ct, gcfc ata gca att g $0 kys Thr Ai& He Ala lia £0
<210> 103 <211> 69 <212> DNA <213> Sequência artificial <22 0> <221> CDS <222> (2)..(43) <22 0> <221> CDS <222> (45)..(68) <22 0> <223> Descrição da sequência Artificial: IGS cassete-2 <400> 103 £ «gc tea çça gfca aca agt, ttt «afc s$« ggg gag tgfc ta* a atg 4? £e* Set Vaí Sfcwr tye Set í%e Asm Átgt <Siy «1» Cy® ¥S«fe 1 S Ϊ0 13 **β s*gi set gct st* gea att g Ç$ &ys t>ys liíw Ai* <M* Si« 2# <210> 104 <211> 81 <212> DNA <213> Sequência artificial <22 0> <221> CDS <222> (2) . , . (43) <22 0> <221> CDS <222> (57) , ..(80) <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: IGS cassete-3 <400> 104 108 ΡΕ2230308 »§ε tc* cc* «6« «a® e#e ttt est aga 99* gag sgt tga 43 s«r Ser ftro V*l fhr Lys Ser Use Asn fttg #iy gi© ôy® 1 5 10 eseffSWMMA «a» **9 **f *«# wt se* «cs $e« a** s gi «ec, hys Ay» ?fcr *1« II® Ala 11« is as
<210> 105 <211> 81 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <221> CDS <222> (2)..(43) <220> <221> CDS <222> (57)..(80) <220> <223> Descrição da sequência artificial: IGS cassete-4 <4 00> 105 « *«c tc» OC* St* #e# *** *yt tfet *«t *g* ggs gag tgt tga 43
Ser Ser Pite Sal *h* Oy® Ser fit Mn Mç èiy Clw Cy.» 1 s 10 cgeggeteaç at» at* *»* «·» aet ge* ata gca att g íi »*t tya fcy* tilar Mã II® Ala 11« is ao
<210> 106 <211> 30 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> consenso <223> Descrição da sequência artificial: sequência de estrutural humana grupo 3 Hl <400> 106 61« vai 61» Leu Vaí 61« Ser &ly Çly Sly Mn Vsl Cl» frí <?ly Sly 1 5 16 15
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Lisboa, 22 de abril de 2013

Claims (28)

  1. ΡΕ2230308 1 REIVINDICAÇÕES 1. Uma molécula de anticorpo com especificidade para TNFa humano, caracterizado por compreender a) uma cadeia pesada em que o domínio variável compreende (i) uma CDRH1 com a sequência apresentada em SEQ ID N0:1 (Hl na Fiqura 3), (ii) uma CDRH2 com a sequência apresentada em SEQ ID NO:2 (H2' na Fiqura 3) ou como SEQ ID NO:7 (H2 na Figura 3) e (iii) uma CDRH3 com a sequência apresentada em SEQ ID NO:3 (H3 na Figura 3) e b) uma cadeia leve em que o domínio variável compreende (i) uma CDRL1 com a sequência apresentada em SEQ ID N0:4 (Hl na Figura 3), (ii) uma CDRL2 com a sequência apresentada em SEQ ID NO:5 (L2 na Figura 3) (iii) uma CDRL3 com a sequência apresentada em SEQ ID NO:6 (L3 na Figura 3).
  2. 2. A molécula de anticorpo da reivindicação 1, a qual compreende uma CDRH2 com a sequência apresentada como SEQ ID NO:2. 2 ΡΕ2230308
  3. 3. A molécula de anticorpo da reivindicação 1 ou 2, a qual é uma molécula de anticorpo com enxerto de CDR.
  4. 4. A molécula de anticorpo da reivindicação 3, em que o domínio variável compreende regiões estruturais humanas aceitadoras e CDRs dadoras não humanas.
  5. 5. A molécula de anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 a 4 tendo uma cadeia leve compreendendo a sequência apresentada em SEQ ID NO:113 e uma cadeia pesada compreendendo a sequência descrita em SEQ ID NO:115.
  6. 6. A molécula de anticorpo da reivindicação 1 que é um anticorpo monoclonal murino anti-TNFa hTNF40 tendo a sequência da cadeia leve apresentada em SEQ ID NO:99 e a sequência da cadeia pesada descrita em SEQ ID NO:100.
  7. 7. A molécula de anticorpo da reivindicação 1, que é uma molécula de anticorpo quimérico contendo os domínios variáveis da cadeia leve e da cadeia pesada do anticorpo monoclonal da reivindicação 6.
  8. 8. A molécula de anticorpo da reivindicação 4, em que as regiões estruturais humanas aceitadoras do domínio variável da cadeia pesada são baseadas em 3 ΡΕ2230308 a) uma sequência de consenso humana do grupo 1 e contendo resíduos dadores não humanos (i) nas posições 28, 69 e 71 de acordo com a numeração de Kabat ou (ii) nas posições 28, 38, 46, 67, 69 e 71 de acordo com a numeração de Kabat, ou b) uma sequência de consenso humana do grupo 3 e contendo residuos dadores não humanos nas posições 27, 28, 30, 48, 49, 69, 71, 73, 76 e 78 de acordo com a numeração de Kabat.
  9. 9. A molécula de anticorpo da reivindicação 4 ou 8, em que as regiões estruturais humanas aceitadoras do dominio variável da cadeia leve são baseadas na sequência de consenso humana do grupo 1 e compreendem residuos não humanos dadores nas posições 4 6 e 60 de acordo com a numeração de Kabat.
  10. 10. A molécula de anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 a 9 que é um fragmento Fab, Fab', F(ab')2, Fv ou Fv de cadeia simples.
  11. 11. A molécula de anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 a 9, que é um fragmento Fab modificado tendo no extremo c-terminal da sua cadeia pesada um ou mais aminoácidos para permitir a ligação de uma molécula efectora ou repórter. 4 ΡΕ2230308
  12. 12. A molécula de anticorpo da reivindicação 11, em que os aminoácidos adicionais formam uma região de charneira modificada contendo um ou dois resíduos de cisterna aos quais pode estar ligada a molécula efectora ou repórter.
  13. 13. A molécula de anticorpo da reivindicação 12, em que um grupo maleimida está covalentemente ligado a um único grupo tiol na região de charneira modificada.
  14. 14. A molécula de anticorpo da reivindicação 13, em que uma lisina está ligada covalentemente ao grupo maleimida.
  15. 15. A molécula de anticorpo da reivindicação 14, em que um polímero de metoxipoli(etilenoglicol) tendo um peso molecular de aproximadamente 20000 Da está ligado a cada um dos grupos amina da lisina.
  16. 16. Um composto caracterizado por compreender a molécula de anticorpo da reivindicação 11 ou 12 tendo ligado covalentemente a um aminoácido ou C-terminal ou perto dele da sua molécula efectora ou repórter da cadeia pesada.
  17. 17. O composto da reivindicação 16, o qual compreende uma molécula efectora, a molécula efectora facultativamente compreendendo um ou mais polímeros. 5 ΡΕ2230308 18. 0 composto da reivindicação 17, em que um ou mais polímeros é/são facultativamente polialquileno substituído de cadeia linear ou ramificada, polímero de polialcenileno ou polioxialquileno ou um polissacárido ramificado ou não ramificado. 19. 0 composto da reivindicação 18, em que um ou mais polímeros é/são um metoxipoli(etilenoglicol).
  18. 20. O composto de acordo com a reivindicação 19 tendo ligado o grupo lisil-maleimida a um dos resíduos de cisteína no extremo C-terminal da cadeia pesada, em que cada grupo amina do resíduo lisilo possui ligado covalentemente um resíduo metoxipoli(etilenoglicol) com uma massa molecular de aproximadamente 20000 Da.
  19. 21. O composto de acordo com a reivindicação 17, tendo ligado um ou mais polímeros sintéticos ou naturais ao um dos resíduos de cisteína no extremo C-terminal da cadeia pesada.
  20. 22. Um DNA que codifica a cadeia pesada e/ou a cadeia leve da molécula de anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 a 12.
  21. 23. O DNA da reivindicação 22 compreendendo a sequência mostrada em SEQ ID NO:8, 9, 10, 11, 112 ou 114. ΡΕ2230308
  22. 24. Um vector de clonagem ou de expressão contendo o DNA da reivindicação 22 ou 23, o vector de expressão sendo facultativamente um vector de expressão de E. coli.
  23. 25. Uma célula hospedeira transformada com o vector da reivindicação 24.
  24. 26. Um processo para a produção da molécula de anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 a 12, compreendendo a cultura da célula hospedeira da reivindicação 25 e isolamento da molécula de anticorpo. 27. um processo para a produção da molécula de anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 a 12, compreendendo a cultura de E. coli contendo um vector de expressão de E. coli compreendendo o DNA da reivindicação 23 e isolamento da molécula de anticorpo, a molécula de anticorpo sendo facultativamente dirigida para o periplasma.
  25. 28. Uma composição terapêutica compreendendo a molécula de anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 a 12 ou um composto de qualquer uma das reivindicações 13 a 21.
  26. 29. A molécula de anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 ou 12, tendo especificidade para TNFa humano ou o composto de qualquer uma das reivindicações 13 7 ΡΕ2230308 21, para usar no tratamento de um distúrbio imune ou imuno-regulador, agudos ou crónicos, uma infecção, uma doença neurodegenerativa ou uma doença maligna.
  27. 30. A molécula de anticorpos ou composto da reivindicação 29, para usar no tratamento de um distúrbio inflamatório ou auto-imune.
  28. 31. A molécula de anticorpo ou composto da reivindicação 30, para usar no tratamento de artrite reumatóide, osteoartrite, doença de Crohn ou psoriase. Lisboa, 22 de abril de 2013
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