PL218516B1 - Cząsteczka przeciwciała, związek zawierający cząsteczkę przeciwciała, sekwencja DNA, wektor do klonowania lub ekspresji, komórka gospodarza, sposób wytwarzania cząsteczki przeciwciała, kompozycja terapeutyczna lub diagnostyczna, zastosowanie cząsteczki przeciwciała albo związku - Google Patents

Cząsteczka przeciwciała, związek zawierający cząsteczkę przeciwciała, sekwencja DNA, wektor do klonowania lub ekspresji, komórka gospodarza, sposób wytwarzania cząsteczki przeciwciała, kompozycja terapeutyczna lub diagnostyczna, zastosowanie cząsteczki przeciwciała albo związku

Info

Publication number
PL218516B1
PL218516B1 PL399351A PL39935101A PL218516B1 PL 218516 B1 PL218516 B1 PL 218516B1 PL 399351 A PL399351 A PL 399351A PL 39935101 A PL39935101 A PL 39935101A PL 218516 B1 PL218516 B1 PL 218516B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
antibody molecule
seq
human
antibody
gly
Prior art date
Application number
PL399351A
Other languages
English (en)
Other versions
PL399351A1 (pl
Inventor
Diljeet Singh Athwal
Derek Thomas Brown
Andrew Neil Charles Weir
Andrew George Popplewell
Andrew Paul Chapman
David John King
Original Assignee
Ucb Pharma Sa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=9893121&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=PL218516(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Ucb Pharma Sa filed Critical Ucb Pharma Sa
Publication of PL399351A1 publication Critical patent/PL399351A1/pl
Publication of PL218516B1 publication Critical patent/PL218516B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/241—Tumor Necrosis Factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6845—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a cytokine, e.g. growth factors, VEGF, TNF, a lymphokine or an interferon
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6875—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody being a hybrid immunoglobulin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Compression Of Band Width Or Redundancy In Fax (AREA)

Description

Przedmiotem wynalazku jest cząsteczka przeciwciała, związek zawierający cząsteczkę przeciwciała, sekwencja DNA, wektor do klonowania lub ekspresji, komórka gospodarza, sposób wytwarzania cząsteczki przeciwciała, kompozycja terapeutyczna lub diagnostyczna, zastosowanie cząsteczki przeciwciała albo związku.
Obecny wynalazek dotyczy cząsteczki przeciwciała swoistej wobec determinant antygenowych ludzkiego czynnika martwicy nowotworów alfa (TNFa). W cząsteczce przeciwciała są dwa łańcuchy ciężkie i dwa łańcuchy lekkie. Każdy łańcuch ciężki i każdy łańcuch lekki ma na swoim końcu N domenę zmienną. Każda domena zmienna składa się z czterech regionów zrębowych (FR) występujących na przemian z regionami determinującymi dopasowanie (CDR). Reszty w domenach zmiennych są zwykle numerowane zgodnie z systemem opracowanym przez Kabat i wsp. System ten jest przedstawiony w Kabat i wsp., 1987, w Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, USA (tu dalej cytowany jako Kabat i wsp. (jak wyżej)). Ten system numeracji jest stosowany w niniejszym opisie, o ile nie zaznaczono inaczej.
Oznaczenie reszt według Kabata nie zawsze odpowiada bezpośrednio liniowej numeracji reszt aminokwasowych. Rzeczywista liniowa sekwencja aminokwasowa może zawierać mniej albo dodatkowe aminokwasy w stosunku do dokładnej numeracji Kabata, odpowiadające skróceniu albo wstawieniu do składnika strukturalnego, zrębowego lub CDR, do podstawowej struktury domeny zmiennej. Prawidłową numerację reszt według Kabat można ustalić dla danego przeciwciała przez dopasowanie reszt homologicznych w sekwencji przeciwciała i sekwencji o standardowej numeracji według Kabata.
CDR domeny zmiennej łańcucha ciężkiego są zlokalizowane w pozycjach reszt 31-35 (CDRH1), reszt 50-65 (CDRH2) i reszt 95-102 (CDRH3) według numeracji Kabata.
CDR domeny zmiennej łańcucha lekkiego są zlokalizowane w pozycjach reszt 24-34 (CDRL1), reszt 50-56 (CDRL2) i reszt 89-97 (CDRL3) według numeracji Kabata.
Konstrukcja przeciwciał z przeszczepionymi CDR jest opisana w europejskim zgłoszeniu patentowym EP-A-0239400, w którym ujawniono proces, w którym CDR z monoklonalnych przeciwciał mysich są przeszczepiane do regionów zrębowych domen zmiennych immunoglobuliny ludzkiej przez ukierunkowaną mutagenezę z zastosowaniem długich oligonukleotydów. CDR określają specyficzność wiązania antygenu i są stosunkowo krótkimi sekwencjami peptydowymi znajdującymi się w regionach zrębowych domen zmiennych.
Najwcześniejsze prace nad humanizowaniem monoklonalnych przeciwciał przez przeszczepienie CDR przeprowadzono na przeciwciałach monoklonalnych rozpoznających syntetyczne antygeny, takie jak NP. Jednakże przykłady, w których mysie monoklonalne przeciwciało rozpoznające lizozym i szczurze monoklonalne przeciwciało rozpoznające antygen na ludzkich komórkach T, były humanizowane przez przeszczepienie CDR, zostały opisane przez Verhoeyen i wsp. (Science, 239, 1534-1536, 1988) i Riechmann i wsp. (Nature, 332, 323-324, 1988), odpowiednio.
Riechmann i wsp. stwierdzili, że przeniesienie samych CDR (jak określone przez Kabat (Kabat i wsp. (jak wyżej) i Wu i wsp., J. Exp. Med., 132, 211-250, 1970)) nie wystarczyło dla dostarczenia zadawalającej aktywności wiązania antygenu przez produkt z przeszczepionym CDR. Stwierdzono, że liczba reszt zrębowych, musi być zmieniona tak, aby odpowiadały resztom w donorowym regionie zrębowym. Proponowane kryteria wyboru reszt zrębowych, które trzeba zmienić, są opisane w międzynarodowym zgłoszeniu patentowym WO 90/07861.
Wiele prac przeglądowych, omawiających przeciwciała z przeszczepionymi CDR, zostało opublikowanych, w tym Vaughan i wsp. (Nature Biotechnology, 16, 535-539, 1998).
TNF-α jest pro-zapalną cytokiną, która jest uwalniana przez komórki układu odpornościowego i z nimi oddziałuje.
Zatem TNFα jest uwalniany przez makrofagi, które zostały zaktywowane przez lipopolisacharydy (LPS) gram ujemnych bakterii. Jako taki TNFα wydaje się być wewnętrznym mediatorem o kluczowym znaczeniu, uczestniczącym w rozwoju i patogenezie szoku endotoksycznego związanego z posocznicą bakteryjną. Wykazano również, że poziom TNFα zwiększa się w wielu ludzkich chorobach, w tym chorobach przewlekłych, takich jak reumatoidalne zapalenie stawów, choroba Crohna, wrzodziejące zapalenie okrężnicy i stwardnienie rozsiane. Myszy transgeniczne pod względem ludzkiego TNFα wytwarzają wysokie poziomy TNFα konstytutywnie i rozwija się u nich spontaniczne, wyniszczające zapalenie wielostawowe przypominające reumatoidalne zapalenie stawów (Kaffer i wsp., EMBO J. 10, 4025-4031, 1991) . TNFα określa się zatem jako cytokinę prozapalną.
PL 218 516 B1
Przeciwciała monoklonalne przeciw TNFa zostały opisane w stanie techniki. Meager i wsp., (Hybridoma, 6:, 305-311, 1987) opisują mysie monoklonalne przeciwciała przeciw zrekombinowanemu TNF-α. Fendly i wsp., (Hybridoma, 6, 359-370, 1987) opisują zastosowanie mysich monoklonalnych przeciwciał przeciw zrekombinowanemu TNFα w określaniu neutralizujących epitopów na TNF. Shimamoto i wsp., (Immunology Letters, 17, 311-318, 1988) opisują zastosowanie mysich monoklonalnych przeciwciał przeciw TNFy i ich zastosowanie w zapobieganiu szokowi endotoksycznemu u myszy. Ponadto, w międzynarodowym zgłoszeniu patentowym WO 92/11383 ujawnione są zrekombinowane przeciwciała, w tym przeciwciała z przeszczepionymi CDR, specyficzne wobec TNFα. Rankin i wsp., (British J. Rheumatology, 34, 334-342, 1995) opisują zastosowanie takich przeciwciał z przeszczepionymi CDR w leczeniu reumatoidalnego zapalenia stawów. W US-A-5 919 452 ujawniono chimerowe przeciwciała anty-TNF i ich zastosowanie w leczeniu patologii związanych z obecnością TNF.
Zaproponowano przeciwciała wobec TNFα do profilaktyki i leczenia szoku endotoksycznego (Beutler i wsp., Science, 234, 470-474, 1985). Bodmer i wsp., (Critical Care Medicine, 21, S441-S446, 1993) oraz Wherry i wsp., (Critical Care Medicine, 21, S436S440, 1993) omawiają potencjał terapeutyczny przeciwciał anty-TNFα w leczeniu szoku posocznicowego. Zastosowanie przeciwciał anty-TNFα w leczeniu szoku posocznicowego jest również omawiane przez Kirschenbaum i wsp., (Critical Care Medicine, 26, 1625-1626, 1998).
Zapalenie stawów indukowane kolagenem można skutecznie leczyć stosując przeciwciała monoklonalne anty-TNFα (Williams i wsp. (PNAS-USA, 89, 9784-9788, 1992)).
Podwyższone poziomy TNF-α znajduje się zarówno w płynie maziówkowym, jak i krwi obwodowej pacjentów cierpiących na reumatoidalne zapalenie stawów. Czynniki blokujące TNFα podawane pacjentom cierpiącym na reumatoidalne zapalenie stawów zmniejszają zapalenie, łagodzą objawy i opóźniają uszkodzenie stawów (McKown i wsp. (Arthritis Rheum., 42, 1204-1208, 1999).
Zastosowanie przeciwciał anty-TNFα w leczeniu reumatoidalnego zapalenia stawów i choroby Crohna jest omawiane w Feldman i wsp., (Transplantation Proceedings, 30, 4126-4127, 1998), Adorini i wsp., (Trends in Immunology Today, 18, 209-211, 1997) oraz w Feldman i wsp., (Advances in Immunology, 64, 283-350, 1997). Przeciwciała wobec TNFα stosowane w takim leczeniu są na ogół przeciwciałami chimerowymi, takimi jak te opisane w US-A-5919452.
Obecnie dwa produkty blokujące TNFα zostały zatwierdzone do leczenia reumatoidalnego zapalenia stawów. Pierwszy o nazwie etanercept, jest sprzedawany przez Immunex Corporation jako Enbrel™. Jest to zrekombinowane białko fuzyjne zawierające dwie rozpuszczalne domeny p75 receptora TNF połączone z częścią Fc ludzkiej immunoglobuliny. Drugi, o nazwie infliksimab, jest sprzedawany przez Centocor Corporation jako Remicade™. Jest to chimerowe przeciwciało mające mysie domeny zmienne anty-TNFα i ludzkie domeny stałe IgG1.
Znane ze stanu techniki zrekombinowane cząsteczki przeciwciała anty-TNFα mają na ogół zmniejszone powinowactwo wobec TNFα w porównaniu z przeciwciałami, z których pochodzą regiony zmienne lub CDR, na ogół muszą być wytwarzane w komórkach ssaczych, a ich wytwarzanie jest kosztowne. Przeciwciała anty-TNFα ze stanu techniki są opisane w Stephens i wsp., (Immunology, 85; 668-674, 1995), GB-A-2 246 570 i GB-A-2 297 145.
Istnieje zapotrzebowanie na cząsteczkę przeciwciała do leczenia przewlekłych chorób zapalnych, która może być stosowana wielokrotnie i wytwarzana łatwo i wydajnie. Istnieje również zapotrzebowanie na cząsteczkę przeciwciała, które ma wysokie powinowactwo wobec TNFα i niską immunogenność u ludzi.
Niniejszy wynalazek dotyczy cząsteczki przeciwciała swoistej wobec ludzkiego TNFα, zawierającej:
a) łańcuch ciężki, w którym domena zmienna zawiera (i) sekwencję podaną w SEK NR ID:1 dla regionu CDRH1, (ii) sekwencję podaną w SEK NR ID:2 lub w SEK NR ID:7 dla CDRH2;
(iii) sekwencję podaną w SEK NR ID:3 dla CDRH3; i
b) łańcuch lekki, w którym domena zmienna zawiera:
(i) sekwencję podaną w SEK NR ID:4 dla CDRL1, (ii) sekwencję podaną w SEK NR ID:5 dla CDRL2, i (iii) sekwencję podaną w SEK NR ID:6 dla CDRL3.
Korzystnie cząsteczka przeciwciała zawiera sekwencję podaną w SEK NR ID: 2 dla CDRH2, bardziej korzystnie ma przeszczepiony CDR. Korzystnie w takiej cząsteczce domena zmienna zawiera ludzkie akceptorowe regiony zrębowe i inne niż ludzkie donorowe CDR-y.
Korzystnie ludzkie akceptorowe regiony zrębowe domeny zmiennej łańcucha ciężkiego są oparte na ludzkiej sekwencji najwyższej zgodności grupy 1 i zawierają inne niż ludzkie donorowe reszty
PL 218 516 B1 w pozycjach 28, 69 i 71 zgodnie z numeracją Kabata lub w pozycjach 28, 38, 46, 67, 69 i 71 zgodnie z numeracją Kabata, lub ludzkie akceptorowe regiony zrębowe domeny zmiennej łańcucha ciężkiego są oparte na ludzkiej sekwencji najwyższej zgodności grupy 3 i zawierają inne niż ludzkie donorowe reszty w pozycjach 27, 28, 30, 48, 49, 69, 71, 73, 76 i 78 zgodnie z numeracją Kabata.
Jeszcze korzystniej ludzkie akceptorowe regiony zrębowe domeny zmiennej łańcucha lekkiego są oparte na ludzkiej sekwencji najwyższej zgodności grupy 1 i zawierają inne niż ludzkie donorowe reszty w pozycjach 46 i 60 zgodnie z numeracją Kabata.
Cząsteczka przeciwciała według wynalazku korzystnie zawiera co najmniej jedną ludzką domenę stałą, która korzystnie jest IgG, a bardziej korzystnie IgG2 lub IgG4.
Korzystnie cząsteczka przeciwciała, która zawiera wskazany powyżej łańcuch lekki i ciężki jest fragmentem Fab, zmodyfikowanym Fab, Fab', F(ab')2 lub fragmentem Fv, monomerem lub dimerem łańcucha ciężkiego, przeciwciałem jednołańcuchowym lub fragmentem jednołańcuchowym Fv, bardziej korzystnie jest fragmentem Fab o jednym albo większej liczbie aminokwasów na C-końcu łańcucha ciężkiego, które umożliwiają przyłączenie cząsteczki efektorowej albo reporterowej.
Korzystnie dodatkowe aminokwasy w tym fragmencie Fab tworzą zmodyfikowany region zawiasowy zawierający jedną albo dwie reszty cysteinowe, do których cząsteczka efektorowa albo reporterowa może być przyłączona.
Korzystnie cząsteczka przeciwciała ma w tym zmodyfikowanym regionie zawiasowym kowalencyjnie związaną jedną grupę tiolową lub maleimidową, a bardziej korzystnie cząsteczka ma kowalencyjnie związaną lizynę z grupą maleimidową. Jeszcze korzystniej do każdej grupy aminowej lizyny ma przyłączony polimer o ciężarze cząsteczkowym 500 do 50 000 Da, którym jest korzystnie polimer metoksypoli(etylenoglikol) o ciężarze cząsteczkowym około 20 000 Da.
W zakres niniejszego wynalazku wchodzi również związek zawierający cząsteczkę przeciwciała określoną powyżej, która ma kowalencyjnie przyłączoną cząsteczkę efektorową albo reporterową do aminokwasu na końcu C albo po stronie końca C łańcucha ciężkiego.
Korzystnie związek zawiera cząsteczkę efektorową, która korzystnie stanowi jeden albo większą liczbę polimerów, a jeden lub większą liczbę polimerów stanowi ewentualnie podstawiony polimer polialkilenowy, polialkenylenowy lub polioksyalkilenowy o łańcuchu prostym albo rozgałęzionym albo polisacharyd o łańcuchu rozgałęzionym albo nierozgałęzionym.
Bardziej korzystnie jeden albo większą liczbę polimerów stanowi metoksypoli(glikol etylenowy).
Korzystnie związek ten ma grupę lizylomaleimidową przyłączoną do jednej z reszt cysteinowych na końcu C łańcucha ciężkiego, przy czym do każdej grupy aminowej reszty lizynowej jest kowalencyjnie związana reszta metoksypoli(glikolu etylenowego) o ciężarze cząsteczkowym około 20000 Da.
Korzystnie związek ma wzór:
CHaOtCHzĆfyO^CONK
I
w którym n wynosi około 420.
Cząsteczka przeciwciała według wynalazku o specyficzności wobec TNF-α, zawiera łańcuch ciężki, w którym domena zmienna zawiera CDR (jak określony przez Kabat i wsp., (jak wyżej) o sekwencji podanej jako H1 na Fig. 3 (SEK NR ID:1) dla CDRH1, jako H2' lub H2 na Fig. 3 (SEK NR ID: 2 lub SEK
PL 218 516 B1
NR ID: 7) dla CDRH2 albo jako H3 na Fig. 3 (SEK NR ID: 3) dla CDRH3 i łańcuch lekki, w którym domena zmienna zawiera CDR (jak określony przez Kabat i wsp., (powyżej) o sekwencji podanej jako L1 na Fig. 3 (SEK NR ID:4) dla CDRL1, jako L2 na Fig. 3 (SEK NR ID: 5) dla CDRL2 i jako L3 na Fig. 3 (SEK NR ID:6) dla CDRL3.
CDR podane w SEK NR ID:1 i 3 do 7 i na Fig. 3 dotyczącej powyższych CDR pochodzą z mysiego monoklonalnego przeciwciała hTNF40. Jednak SEK NR ID: 2 stanowi hybrydowy CDR. Hybrydowy CDR zawiera część łańcucha ciężkiego CDR2 z mysiego monoklonalnego przeciwciała hTNF40 (SEK NR ID:7) i część CDR2 łańcucha ciężkiego z sekwencji ludzkiego regionu V grupy 3 linii zarodkowej.
Pełne sekwencje domen zmiennych mysiego przeciwciała hTNF40 są pokazane na Fig. 6 (łańcuch lekki) (SEK NR ID:99) i Fig. 7 (łańcuch ciężki) (SEK NR ID:100). To mysie przeciwciało jest określane poniżej jako przeciwciało donorowe.
Wykonaniem niniejszego wynalazku jest mysie monoklonalne przeciwciało hTNF40 mające sekwencje domen zmiennych łańcucha lekkiego i ciężkiego pokazane na Fig. 6 (SEK NR ID:99) i Fig. 7 (SEK NR ID:100), odpowiednio. Regionem stałym łańcucha lekkiego hTNF40 jest kappa, a regionem stałym łańcucha ciężkiego jest IgG2a.
W innym wykonaniu niniejszego wynalazku innym przeciwciałem jest cząsteczka chimerowego mysiego/ludzkiego przeciwciała, określana tu jako cząsteczka chimerowego przeciwciała hTNF40. Cząsteczka chimerowego przeciwciała zawiera domeny zmienne mysiego monoklonalnego przeciwciała hTNF40 (SEK NR ID:99 i 100) i ludzkie domeny stałe. Korzystnie chimerowa cząsteczka przeciwciała hTNF40 zawiera ludzką domenę C kappa (Hieter i wsp., Cell, 22, 197-207, 1980; nr dostępu do Genebank J00241) w łańcuchu lekkim i ludzkie domeny gamma 4 (Flanagan i wsp., Nature, 200, 709-713, 1982) w łańcuchu ciężkim.
W innym wykonaniu przeciwciało według niniejszego wynalazku jest przeciwciałem z przeszczepionymi CDR. Stosowany tu termin cząsteczka przeciwciała z przeszczepionymi CDR dotyczy cząsteczki przeciwciała, w której łańcuch ciężki i/lub lekki zawierają jeden albo więcej CDR (w tym jeżeli trzeba hybrydowy CDR) z przeciwciała donorowego (np. mysiego przeciwciała monoklonalnego) wszczepione do zmiennego regionu zrębowego łańcucha ciężkiego i/lub lekkiego przeciwciała akceptorowego (np. przeciwciała ludzkiego).
Korzystnie, takie przeciwciało z przeszczepionym CDR ma domenę zmienną zawierającą ludzkie akceptorowe regiony zrębowe jak również jeden albo więcej opisanych powyżej donorowych CDR.
Przy przeszczepianiu CDR, można zastosować dowolną odpowiednią sekwencję akceptorowego zmiennego regionu zrębowego w odniesieniu do klasy/typu przeciwciała donorowego, z którego pochodzą CDR, w tym, regiony zrębowe mysie, naczelnych i ludzkie. Przykładami ludzkich regionów zrębowych, które można zastosować w niniejszym wynalazku są KOL, NEWM, REI, EU, TUR, TEI, LAY i POM (Kabat i wsp. (powyżej)). Na przykład, KOL i NEWM można zastosować do łańcucha ciężkiego, REI można zastosować do łańcucha lekkiego, a EU, LAY i POM można zastosować zarówno do łańcucha ciężkiego, jak i łańcucha lekkiego. Korzystnymi regionami zrębowymi dla łańcucha lekkiego są ludzkie regiony zrębowe grupy 1 pokazane na Fig. 1 (SEK NR ID: 83, 85, 87 i 89). Korzystnymi regionami zrębowymi dla łańcucha ciężkiego są ludzkie regiony zrębowe grupy 1 i 3 pokazane na Fig. 2 (SEK NR ID:91, 93, 95 i 97 oraz SEK NR ID: 106, 107, 108 i 109), odpowiednio.
W cząsteczce przeciwciała według wynalazku z przeszczepionymi CDR, korzystne jest zastosowanie takiego przeciwciała akceptorowego, które ma łańcuchy homologiczne z łańcuchami przeciwciała donorowego. Akceptorowe łańcuchy lekkie i ciężkie nie muszą koniecznie pochodzić z tego samego przeciwciała i mogą, w razie potrzeby, zawierać łańcuchy złożone, mające regiony zrębowe pochodzące z różnych łańcuchów.
Ponadto w cząsteczce przeciwciała z przeszczepionymi CDR, regiony zrębowe nie muszą mieć dokładnie takiej samej sekwencji, jak te w przeciwciałach akceptorowych. Na przykład, reszty zwykle nie występujące można zmienić na reszty występujące częściej w tej klasie albo typie łańcucha akceptorowego. Alternatywnie, można zmienić wybrane reszty w akceptorowych regionach zrębowych, tak aby odpowiadały resztom znajdowanym w tej samej pozycji w przeciwciele donorowym. Takie zmiany powinny być ograniczone do niezbędnego minimum koniecznego dla odzyskania powinowactwa przeciwciała donorowego. Protokół wyboru reszt w akceptorowych regionach zrębowych, które należałoby zmienić, jest przedstawiony w WO 91/09967.
Korzystnie, w cząsteczce przeciwciała według niniejszego wynalazku z przeszczepionymi CDR, jeżeli akceptorowy łańcuch ciężki ma ludzkie regiony zrębowe grupy 1 (pokazane na Fig. 2) (SEK NR ID:
PL 218 516 B1
91, 93, 95 i 97), to akceptorowe regiony zrębowe łańcucha ciężkiego zawierają oprócz jednego albo więcej donorowych CDR, donorowe reszty w pozycjach 28, 69 i 71 (według Kabat i wsp. (jak wyżej)).
Alternatywnie, jeżeli akceptorowy łańcuch ciężki ma regiony zrębowe grupy 1, wtedy akceptorowe regiony zrębowe łańcucha ciężkiego zawierają oprócz jednego albo więcej donorowych CDR, donorowe reszty w pozycjach 28, 38, 46, 67, 69 i 71 (według Kabat i wsp. (powyżej)).
Korzystnie, w cząsteczce przeciwciała według niniejszego wynalazku z przeszczepionym CDR, jeżeli akceptorowy łańcuch ciężki ma ludzkie regiony zrębowe grupy 3 (pokazane na Fig. 2) (SEK NR ID: 106, 107, 108 i 109), to akceptorowe regiony zrębowe łańcucha ciężkiego zawierają oprócz jednego albo więcej donorowych CDR, reszty donorowe w pozycjach 27, 28, 30, 48, 49, 69, 71, 73, 76 i 78 (według Kabat i wsp. (powyżej)).
Korzystnie, w cząsteczce przeciwciała według niniejszego wynalazku z przeszczepionymi CDR, jeżeli akceptorowy łańcuch lekki ma ludzkie regiony zrębowe grupy 1 (pokazane na Fig. 1) (SEK NR ID: 83, 85, 87 i 89), to akceptorowe regiony zrębowe łańcucha lekkiego zawierają reszty donorowe w pozycjach 46 i 60 (według Kabat i wsp. (jak wyżej)).
Resztami donorowymi są reszty z przeciwciała donorowego, tj. przeciwciała, z którego CDR wyjściowo pochodziły.
Cząsteczka przeciwciała według niniejszego wynalazku może obejmować: cząsteczkę całego przeciwciała, mającego łańcuchy ciężkie i lekkie pełnej długości; jego fragment, taki jak Fab, zmodyfikowany fragment Fab, Fab', F(ab')2 lub Fv; monomer albo dimer łańcucha lekkiego lub łańcucha ciężkiego, przeciwciało jednołańcuchowe, np. pojedynczy łańcuch Fv, w którym domeny zmienne łańcucha ciężkiego i lekkiego są połączone przez łącznik peptydowy. Podobnie, regiony zmienne łańcucha ciężkiego i lekkiego można łączyć, jeśli trzeba, z innymi domenami przeciwciała.
Korzystnie, cząsteczką przeciwciała według niniejszego wynalazku jest fragment Fab. Korzystnie, fragment Fab ma łańcuch ciężki o sekwencji podanej jako SEK NR ID:111, a łańcuch lekki o sekwencji podanej jako SEK NR ID: 113. Korzystnie, sekwencje aminokwasowe podane w SEK NR ID:111 i SEK NR ID:113 były kodowane przez sekwencje nukleotydowe podane w SEK NR ID:110 i SEK NR ID:112, odpowiednio.
Alternatywnie, korzystnie, cząsteczką przeciwciała według niniejszego wynalazku jest zmodyfikowany fragment Fab, gdzie modyfikacją jest dodanie na końcu C jego łańcucha ciężkiego jednego albo więcej aminokwasów dla umożliwienia przyłączenia cząsteczki efektorowej albo reporterowej. Korzystnie, dodatkowe aminokwasy tworzą zmodyfikowany region zawiasowy zawierający jedną albo więcej reszt cysteinowych, do których cząsteczka efektorowa albo reporterowa może być dołączona. Korzystnie, taki zmodyfikowany fragment Fab ma łańcuch ciężki o sekwencji podanej jako SEK NR ID:115 i łańcuch lekki o sekwencji podanej jako SEK NR ID:113. Korzystnie, sekwencja aminokwasowa podana w SEK NR ID:115 jest zakodowana przez sekwencję nukleotydową podaną w SEK NR ID:114.
Korzystną grupą efektorową jest cząsteczka polimeru, która może być przyłączona do zmodyfikowanego fragmentu Fab w celu zwiększenia jego okresu półtrwania in vivo.
Cząsteczką polimeru może być na ogół polimer syntetyczny albo polimer występujący naturalnie, na przykład, ewentualnie podstawiony polimer poliakilenowy, polialkenylenowy lub polioksyalkilenowy o łańcuchu prostym albo rozgałęzionym, lub homo- lub hetero-polisacharyd.
Konkretne ewentualne podstawniki, które mogą być obecne we wspomnianych powyżej polimerach syntetycznych, obejmują jedną albo więcej grup hydroksylowych, metylowych lub metoksylowych. Konkretne przykłady polimerów syntetycznych obejmują ewentualnie podstawiony poli(etylenoglikol), poli(propylenoglikol), poli(alkohol winylowy) o łańcuchu prostym albo rozgałęzionym albo ich pochodne, a zwłaszcza ewentualnie podstawiony poli(etylenoglikol), taki jak metoksypoli(etylenoglikol) lub jego pochodne. Konkretne, występujące naturalnie polimery obejmują laktozę, amylozę, dekstran, glikogen lub ich pochodne. Stosowany tu termin pochodne ma obejmować reaktywne pochodne, na przykład, grupy reaktywne wybiórczo reagujące z tiolem, takie jak maleimidy i temu podobne. Grupy reaktywne można łączyć bezpośrednio z polimerem albo przez odcinek łącznikowy. Jest to zrozumiałe, że reszty takiej grupy będą w niektórych przypadkach tworzyć część produktu jako grupy łącznikowe między fragmentem przeciwciała i polimerem.
Wielkość polimeru może być zróżnicowana zgodnie z potrzebami, ale na ogół polimer będzie miał średni ciężar cząsteczkowy w zakresie od 500 Da do 50000 Da, korzystnie od 5000 do 40000 Da, a najkorzystniej od 25000 do 40000 Da. W szczególności konkretną wielkość polimeru można wybrać na podstawie zamierzonego zastosowania produktu. Zatem, na przykład, gdy produkt jest przeznaczony do opuszczenia układu krwionośnego i przeniknięcia do tkanki, na przykład, do zastosowania w leczeniu
PL 218 516 B1 nowotworu, może być korzystne zastosowanie polimeru o małym ciężarze cząsteczkowym, na przykład, mającego ciężar cząsteczkowy około 5000 Da. Do zastosowań, w których produkt pozostaje w krwiobiegu, może być korzystne zastosowanie polimeru o wyższym ciężarze cząsteczkowym, na przykład mającego ciężar cząsteczkowy około 25000 Da do 40000 Da.
Szczególnie korzystne polimery obejmują polimer polialkilenowy, taki jak poli(etylenoglikol), a zwłaszcza metoksypoli(etylenoglikol) lub jego pochodne, a zwłaszcza o ciężarze cząsteczkowym w zakresie od około 25000 Da do około 40000 Da.
Każda cząsteczka polimeru przyłączona do zmodyfikowanego fragmentu przeciwciała może być związana kowalencyjnie z atomem siarki albo resztą cysteinową znajdującą się we fragmencie. Połączenie kowalencyjne będzie na ogół wiązaniem disulfidowym, albo, w szczególności, wiązaniem siarka-węgiel.
Tam, gdzie to wskazane, fragment przeciwciała może mieć przyłączoną jedną albo więcej cząsteczek efektorowych albo reporterowych. Cząsteczki efektorowe albo reporterowe mogą być przyłączone do fragmentu przeciwciała przez dowolny dostępny łańcuch boczny aminokwasu albo końcową grupę czynną aminokwasu umiejscowioną we fragmencie, na przykład wolną grupę aminową, iminową, hydroksylową lub karboksylową.
Jako materiał wyjściowy przy wytwarzaniu zmodyfikowanych polimerem fragmentów przeciwciała, jak opisane powyżej, można zastosować aktywowany polimer. Aktywowanym polimerem może być dowolny polimer zawierający reaktywną grupę wobec tiolu, taką jak kwas lub ester α-halogenokarboksylowy, np. jodoacetamid, imid, np. maleimid, grupa winylosulfonowa lub disulfid. Takie materiały wyjściowe można kupić (na przykład z Shearwater Polymers Inc., Huntsville, AL, USA) albo wytworzyć z handlowo dostępnych materiałów wyjściowych z zastosowaniem konwencjonalnych procedur chemicznych.
Jako publikacje dotyczące przyłączania reszt poli(etylenoglikolu) (PEG), powołuje się Poly(ethyleneglycol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications, 1992, J. Milton Harris (wyd.), Plenum Press, New York, Poly(ethyleneglycol) Chemistry and Biological Applications, 1997, J. Milton Harris i S. Zalipsky (wyd.), American Chemical Society; Washington DC and Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences, 1998, M. Aslam and A. Dent, Grove Publishers, New York.
Tam, gdzie jest to wskazane, w celu otrzymania fragmentu przeciwciała połączonego z cząsteczką efektorową albo reporterową, można wytworzyć takie połączenie z zastosowaniem standardowych procedur chemicznych albo rekombinowania DNA, w których fragment przeciwciała jest łączony bądź bezpośrednio, bądź za pośrednictwem czynnika łączącego z cząsteczką efektorową albo reporterową przed lub po reakcji z aktywowanym polimerem, odpowiednio. Konkretne procedury chemiczne obejmują, na przykład, te opisane w WO 93/62331, WO 92/22583, WO 90,195 i WO 89/1476. Alternatywnie, tam gdzie cząsteczką efektorową albo reporterową jest białko albo polipeptyd, połączenie można uzyskać stosując procedury rekombinowania DNA, na przykład, jak opisane w WO 86/01533 i EP-A 0392745.
Korzystnie, zmodyfikowany fragment Fab jest PEGylowany (tj. ma przyłączony kowalencyjnie PEG (poli(etylenoglikol) ) zgodnie z metodą ujawnioną w EP-A-0948544. Korzystnie, przeciwciało jest PEGylowanym zmodyfikowanym fragmentem Fab, jak pokazany na Fig. 13. Jak pokazano na Fig. 13, zmodyfikowany fragment Fab ma grupę maleimidową połączoną kowalencyjnie z pojedynczą grupą tiolową w zmodyfikowanym regionie zawiasowym. Reszta lizynowa jest połączona kowalencyjnie z grupą maleimidową. Do każdej grupy aminowej w reszcie lizynowej przyłączony jest polimer metoksypoli(etylenoglikol)owy o ciężarze cząsteczkowym około 20000 Da. Całkowity ciężar cząsteczkowy całej cząsteczki efektorowej wynosi zatem około 40000 Da.
Korzystnie, w związku pokazanym na Fig. 13 łańcuch ciężki części przeciwciała ma sekwencję podaną jako SEK NR ID:115, a łańcuch lekki ma sekwencję podaną w SEK NR ID:113. Związek ten określa się tu jako CDP870.
Domeny regionu stałego cząsteczki przeciwciała według niniejszego wynalazku, można wybrać biorąc pod uwagę proponowane funkcje cząsteczki przeciwciała, a w szczególności funkcje efektorowe, które mogą być wymagane. Na przykład, domenami regionu stałego mogą być ludzkie domeny IgA, IgD, IgB, IgG lub IgM. Konkretnie, można zastosować ludzkie domeny regionu stałego IgG, zwłaszcza izotopy IgG1 i IgG3, gdy cząsteczka przeciwciała jest przeznaczona do zastosowań terapeutycznych i wymagane są funkcje efektorowe przeciwciała. Alternatywnie, gdy cząsteczka przeciwciała jest przeznaczona do celów terapeutycznych, a funkcje efektorowe przeciwciała nie są wymagane, np. w celu prostego blokowania aktywności TNFα, można zastosować izotypy IgG2 i IgG4.
PL 218 516 B1
Ponadto, cząsteczka przeciwciała według niniejszego wynalazku może mieć przyłączoną jedną albo więcej cząsteczek efektorowych albo reporterowych. Na przykład, może mieć przyłączone przez kowalencyjną strukturę mostka: makrocykl w celu chelatowania atomu jonu metalu ciężkiego albo toksynę, taką jak rycyna. Alternatywnie można zastosować procedury technologii rekombinowania DNA w celu wytworzenia cząsteczki przeciwciała, w której fragment Fc (CH2, CH3 i domeny zawiasowe) oraz domeny CH2 i CH3 lub domena CH3 z kompletnej cząsteczki immunoglobuliny została(-y) zastąpiona(e) albo ma przyłączone do niej przez wiązanie peptydowe funkcjonalne białko nieimmunoglobulinowe, takie jak enzym albo cząsteczka toksyny.
Korzystnie, cząsteczka przeciwciała według niniejszego wynalazku ma powinowactwo wiązania
-10 -10 co najmniej 0,85 x 10-10 M, korzystniej co najmniej 0,75 x 10-10 M, a najkorzystniej co najmniej 0,5 x
10-10 M. (Warto zauważyć, że korzystna humanizowana cząsteczka przeciwciała według wynalazku, jak opisana poniżej, ma powinowactwo około 0,5 x 10-10M, które jest lepsze niż powinowactwo mysiego monoklonalnego przeciwciała z którego pochodzi. Mysie przeciwciało ma powinowactwo około
0,85 x 10-10 M).
Można uzyskać warianty cząsteczki przeciwciała według niniejszego wynalazku, które mają zwiększone powinowactwo wobec TNFα. Takie warianty można otrzymać przy zastosowaniu licznych protokołów dojrzewania powinowactwa, w tym mutowanie CDR (Yang i wsp., J. Mol. Biol. 254, 392403, 1995), zamianę łańcuchów (Marks i wsp., Biotechnology, 10, 779-783, 1992), zastosowanie szczepów mutatorowych E. coli (Low i wsp., J. Mol. Biol. 250, 359-368, 1996), zamianę DNA (Patten i wsp., Curr. Opin. Biotechnol., 8, 724-733, 1997), prezentowanie na fagach (Thompson i wsp., J. Mol. Biol. 256, 77-88, 1996) i płciowy PCR (Crarneri i wsp., Nature, 391, 288-291, 1998). Vaughan i wsp. (jak wyżej) omawiają te metody dojrzewania powinowactwa.
W zakres wynalazku wchodzi również sekwencja DNA kodującą ciężki i/lub lekki łańcuch cząsteczki przeciwciała według wynalazku.
Sekwencja DNA według niniejszego wynalazku może obejmować DNA syntetyczny, na przykład wytworzony przez obróbkę chemiczną, cDNA, DNA genomowy albo dowolną ich kombinację.
Niniejszy wynalazek dotyczy również wektora do klonowania lub ekspresji zawierającego sekwencję DNA według niniejszego wynalazku.
Korzystnie wektor do ekspresji jest wektorem ekspresyjnym E. coli.
Korzystnie wektor do klonowania lub ekspresji zawiera dwie sekwencje DNA, kodujące lekki i ciężki łańcuch cząsteczki przeciwciała według niniejszego wynalazku, odpowiednio.
Przykładowym wektorem do ekspresji jest pTTO(CDP870), jak pokazano schematycznie na Fig. 22.
Drugim przykładem wektora opisanym w wynalazku jest wektor pDNAbEng-G1, jak pokazano na Fig. 19.
Niniejszy wynalazek dotyczy również komórki gospodarza transformowanej wektorem według wynalazku.
Ogólne metody, z zastosowaniem, których można skonstruować wektory, sposoby transfekcji i metody hodowli są dobrze znane specjalistom w tej dziedzinie. W tym przypadku odnośnikiem jest Current Protocols in Molecular Biology, 1999, F. M. Ausubel (wyd.), Wiley Interscience, New York oraz Maniatis Manual wydany przez Cold Spring Harbor Publishing.
Sekwencje DNA, które kodują cząsteczkę przeciwciała według niniejszego wynalazku, można otrzymać metodami dobrze znanymi specjalistom w tej dziedzinie. Przykładowo, można zsyntetyzować żądane sekwencje DNA kodujące część albo całe ciężkie i lekkie łańcuchy przeciwciała z określonych sekwencji DNA albo na podstawie odpowiadających im sekwencji aminokwasowych.
DNA kodujące akceptorowe sekwencje zrębowe są szeroko dostępne dla specjalistów w tej dziedzinie i można je łatwo zsyntetyzować na podstawie znanych sekwencji aminokwasowych.
Do wytworzenia sekwencji DNA kodujących cząsteczkę przeciwciała według niniejszego wynalazku można zastosować standardowe techniki biologii molekularnej. Żądane sekwencje DNA można zsyntetyzować całkowicie albo częściowo przy zastosowaniu technik syntezy oligonukleotydów. Jeśli trzeba, można zastosować ukierunkowaną mutagenezę i techniki reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR).
Do ekspresji sekwencji DNA kodujących cząsteczkę przeciwciała według wynalazku można zastosować dowolny system komórka gospodarza/wektor. Do ekspresji fragmentów przeciwciał, takich jak fragmenty Fab i F(ab')2 a w szczególności fragmenty Fv i fragmenty przeciwciał jednołańcuchowych, na przykład, jednołańcuchowe Fv można zastosować systemy bakteryjne, na przykład E. coli lub inne mikroorganizmy. Do wytwarzania większych cząsteczek przeciwciała, w tym, kompletnej cząsteczki przeciwciała, można zastosować systemy ekspresji z eukariotyczną, np. ssaczą komórką
PL 218 516 B1 gospodarza. Odpowiednie ssacze komórki gospodarza obejmują komórki CHO, szpiczaka i/lub komórki hybrydoma.
Wynalazek dotyczy również sposobu wytwarzania cząsteczki przeciwciała według wynalazku, który obejmuje hodowanie komórki gospodarza według wynalazku i izolowanie cząsteczki przeciwciała.
Sposób wytwarzania cząsteczki przeciwciała zachodzi w warunkach odpowiednich do doprowadzenia do ekspresji białka z DNA kodującego cząsteczkę przeciwciała według niniejszego wynalazku i izolację cząsteczki przeciwciała.
Korzystnie komórką gospodarza jest E. coli.
Cząsteczka przeciwciała może być wydzielana z komórki albo kierowana do peryplazmy przez odpowiednie sekwencje sygnałowe.
Korzystnie cząsteczka przeciwciała jest kierowana do peryplazmy.
Alternatywnie, cząsteczki przeciwciała mogą akumulować się w cytoplazmie komórki. W zależności od wytwarzanej cząsteczki przeciwciała i zastosowanego sposobu, wskazane jest umożliwienie cząsteczce przeciwciała sfałdowania się i przyjęcia konformacji funkcjonalnej. Procedury umożliwienia sfałdowania cząsteczek przeciwciała są dobrze znane specjalistom w tej dziedzinie.
Cząsteczka przeciwciała może zawierać polipeptyd jedynie ciężkiego albo lekkiego łańcucha i wówczas do transfekowania komórek gospodarza należy użyć sekwencji kodujących jedynie polipeptyd łańcucha ciężkiego lub łańcucha lekkiego. Do wytwarzania produktów zawierających zarówno łańcuch ciężki, jak i lekki, linie komórkowe mogą być transfekowane dwoma wektorami, pierwszym wektorem kodującym polipeptyd łańcucha lekkiego i drugim wektorem kodującym polipeptyd łańcucha ciężkiego. Alternatywnie, można zastosować pojedynczy wektor, wektor zawierający sekwencje kodujące polipeptydy łańcucha lekkiego i łańcucha ciężkiego.
Niniejszy wynalazek dostarcza również kompozycji terapeutycznej albo diagnostycznej zawierającej cząsteczkę przeciwciała według niniejszego wynalazku albo związek według wynalazku. Taka kompozycja farmaceutyczna lub diagnostyczna zawiera ponadto farmaceutycznie dopuszczalną zaróbkę, rozcieńczalnik albo nośnik.
Cząsteczka przeciwciała może być jedynym składnikiem aktywnym w kompozycji terapeutycznej lub diagnostycznej albo mogą jej towarzyszyć inne składniki aktywne, w tym inne przeciwciała, na przykład, przeciwciała przeciwko komórce T, anty-IFNy lub anty-LPS albo składniki, które nie są przeciwciałem, takie jak ksantyny.
Korzystnie, kompozycje farmaceutyczne zawierają terapeutycznie skuteczną ilość przeciwciała według wynalazku. Stosowany tu termin terapeutyczne skuteczna ilość dotyczy ilości czynnika terapeutycznego niezbędnej do leczenia, łagodzenia albo zapobiegania docelowej chorobie lub stanowi albo do wykazania wykrywalnego efektu terapeutycznego lub zapobiegawczego. Dla dowolnego przeciwciała terapeutycznie skuteczną dawkę można określić wyjściowo bądź w testach hodowli komórkowej, bądź na modelach zwierzęcych, zazwyczaj u gryzoni, królików, psów, świń albo naczelnych. Model zwierzęcy można również zastosować do określenia odpowiedniego zakresu stężeń i drogi podawania. Takie informacje można następnie wykorzystać do określenia przydatnych dawek i dróg podawania ludziom.
Dokładna skuteczna dawka dla człowieka będzie zależała od ostrości stanu chorobowego, ogólnego zdrowia danej osoby, wieku, wagi i płci osobnika, diety, czasu i częstości podawania, kombinacji leków, wrażliwości i tolerancji/odpowiedzi na terapię. Ilość tę można określić przez rutynowe doświadczenia i jest to w zakresie możliwości oceny klinicysty. Na ogół, skuteczna dawka będzie wynosić od 0,01 mg/kg do 50 mg/kg, korzystnie 0,1 mg/kg do 20 mg/kg, korzystniej około 15 mg/kg. Jak pokazano w Przykładach poniżej, dawki 1, 5 i 20 mg/kg zastosowano do leczenia pacjentów cierpiących z powodu reumatoidalnego zapalenia stawów.
Kompozycje można podawać pacjentowi pojedynczo albo mogą być podawane w skojarzeniu z innymi czynnikami, lekami albo hormonami.
Dawka, w której cząsteczka przeciwciała według niniejszego wynalazku jest podawana, zależy od natury leczonego stanu chorobowego, stopnia w jakim podwyższony poziom TNFα powyżej żądanego poziomu ma być zneutralizowany lub w jakim oczekuje się, że będzie zneutralizowany i od tego czy cząsteczka przeciwciała jest stosowana profilaktycznie czy do leczenia istniejącego już stanu.
Zatem, na przykład, gdy produkt jest przeznaczony do leczenia lub profilaktyki przewlekłej choroby zapalnej, takiej jak reumatoidalne zapalenie stawów, odpowiednia dawka cząsteczki przeciwciała według niniejszego wynalazku mieści się w zakresie między 0,5 i 50 mg/kg, korzystniej między 1
PL 218 516 B1 i 20 mg/kg, a najkorzystniej wynosi około 15 mg/kg. Częstość podawania dawki będzie zależała od czasu półtrwania cząsteczki przeciwciała i czasu trwania jej działania.
Jeżeli cząsteczka przeciwciała ma krótki okres półtrwania (np. 2 do 10 godzin) może być konieczne podawanie jednej albo więcej dawek dziennie. Alternatywnie, jeżeli cząsteczka przeciwciała ma długi okres półtrwania (np. 2 do 15 dni), może być konieczne podawanie dawki raz dziennie, co tydzień albo nawet raz na 1 lub 2 miesiące.
Kompozycja farmaceutyczna może również zawierać farmaceutycznie dopuszczalny nośnik do podawania przeciwciała. Nośnik sam nie powinien indukować wytwarzania przeciwciał szkodliwych dla osobnika otrzymującego kompozycję i nie powinien być toksyczny. Odpowiednimi nośnikami mogą być duże, wolno metabolizowane makrocząsteczki, takie jak białka, polipeptydy, liposomy, polisacharydy, polikwasy (mlekowe), polikwasy (glikolowe), polimerowe aminokwasy, kopolimery aminokwasów i nieaktywne cząstki wirusowe.
Można zastosować farmaceutycznie dopuszczalne sole, na przykład, sole kwasów mineralnych, takie jak chlorowodorki, bromowodorki, fosforany i siarczany albo sole kwasów organicznych, takie jak octany, propioniany, jabłczany i benzoesany.
Farmaceutycznie dopuszczalne nośniki w kompozycjach farmaceutycznych mogą dodatkowo zawierać ciecze, takie jak woda, sól, glicerol i etanol. Dodatkowo w takich kompozycjach mogą być obecne substancje pomocnicze, takie jak czynniki zwilżające i emulgujące albo substancje buforujące pH. Takie nośniki umożliwiają uformowanie kompozycji farmaceutycznych w tabletki, pigułki, drażetki, kapsułki, płyny, żele, syropy, rzadkie zawiesiny i zawiesiny do połykania przez pacjenta.
Korzystne postacie do podawania obejmują formy odpowiednie do podawania pozajelitowego, np. przez iniekcję albo wlew, na przykład, w jednej iniekcji albo jako wlew ciągły. Gdy produkt jest przeznaczony do iniekcji albo wlewu, może on być w postaci zawiesiny, roztworu albo emulsji w nośniku olejowym albo wodnym i może zawierać formulator, taki jak czynnik zawieszający, konserwujący, stabilizujący i/lub dyspergujący. Alternatywnie, cząsteczka przeciwciała może być w postaci suchej do rekonstytuowania przy zastosowaniu odpowiedniej sterylnej cieczy.
Po przygotowaniu, kompozycję według wynalazku można podawać bezpośrednio osobnikowi. Osobnikiem, który ma być leczony, mogą być zwierzęta. Jednakże korzystnie kompozycje są przystosowane do podawania ludziom.
Kompozycje farmaceutyczne według wynalazku można podawać dowolną drogą, w tym między innymi, drogą doustną dożylną, domięśniową, dotętniczą, doszpikową, dooponową, dokomorową, przezskórną (patrz na przykład WO98/20734), podskórną, dootrzewnową, donosową, dojelitową, miejscową, podjęzykową, dopochwową lub doodbytniczą. Do podawania kompozycji farmaceutycznych według wynalazku można również zastosować rozpylacze podciśnieniowe. Typowo, kompozycje farmaceutyczne można przygotować jako możliwe do wstrzyknięcia, bądź jako wodne roztwory lub zawiesiny. Można również przygotować postacie stałe odpowiednie do rozpuszczania albo zawieszenia w nośnikach ciekłych przed wstrzyknięciem.
Dostarczanie bezpośrednie kompozycji będzie na ogół odbywać się przez iniekcje podskórne, dootrzewnowe, dożylne albo domięśniowe albo dostarczane do przestrzeni śródmiąższowej tkanki. Kompozycje można również podawać do uszkodzonego miejsca. Dawkowanie może być w postaci pojedynczej dawki albo wielu dawek.
Składnikiem aktywnym kompozycji jest cząsteczka przeciwciała. Jako taka, będzie ona podatna na rozkład w przewodzie żołądkowo-jelitowym. Zatem jeżeli kompozycja ma być podawana drogą wykorzystującą przewód żołądkowo-jelitowy, będzie musiała zawierać czynniki, które chronią przeciwciało przed rozkładem, ale które uwalniają przeciwciało po jego wchłonięciu z przewodu żołądkowojelitowego.
Szczegółowe omówienie tematu farmaceutycznie dopuszczalnych nośników jest dostępne w Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, N.J. 1991).
Bierze się również pod uwagę, że przeciwciało według niniejszego wynalazku będzie podawane przy stosowaniu terapii genowej. Aby to osiągnąć, sekwencje DNA kodujące lekki i ciężki łańcuch cząsteczki przeciwciała pod kontrolą odpowiednich składników DNA wprowadza się pacjentowi tak, aby łańcuchy przeciwciała były wyrażane z sekwencji DNA i składane razem in situ.
Niniejszy wynalazek obejmuje również cząsteczkę przeciwciała według niniejszego wynalazku lub związek według wynalazku do zastosowania w leczeniu ostrego lub przewlekłego zaburzenia immunologicznego lub immunoregulacyjnego, septycznego lub endotoksycznego wstrząsu sercowoPL 218 516 B1 naczyniowego, zaburzenia zapalnego, choroby neurodegeneracyjnej, choroby nowotworowej lub zapalenia wątroby wywołanego alkoholem.
Korzystnie cząsteczkę przeciwciała według wynalazku lub związek według wynalazku stosuje się w leczeniu choroby zapalnej lub autoimmunologicznej.
Ponadto niniejszy wynalazek dotyczy cząsteczki przeciwciała według wynalazku lub związku według wynalazku do zastosowania w leczeniu reumatoidalnego zapalenia stawów, zapalenia kości i stawów, choroby Cohna, zapalnych zaburzeń kości lub łuszczycy.
Cząsteczka przeciwciała według niniejszego wynalazku może być stosowana w dowolnej terapii, gdzie wskazane jest obniżenie poziomu aktywnego biologicznie TNFa obecnego w organizmie ludzkim albo zwierzęcym. TNFα może krążyć w organizmie albo może być obecny na niepożądanie wysokim poziomie zlokalizowanym w konkretnym miejscu organizmu.
W zakres wynalazku wchodzi również zastosowanie cząsteczki przeciwciała według wynalazku lub związku według wynalazku do wytwarzania leku do leczenia ostrego lub przewlekłego zaburzenia immunologicznego lub immunoregulatorowego, wstrząsu septycznego, endotoksycznego lub sercowo-naczyniowego, zaburzenia zapalnego, choroby neurodegeneracyjnej, choroby nowotworowej lub zapalenia wątroby wywołanego alkoholem.
Korzystnym zastosowaniem cząsteczki przeciwciała według wynalazku lub związku według wynalazku jest wytwarzanie leku do leczenia patologii, takiej jak zapalenie lub choroba autoimmunogenna, lub gdy patologią jest reumatoidalne zapalenie stawów, zapalenie kości i stawów, choroba Crohna, zapalne zaburzenie kości lub łuszczyca.
Szczegóły dotyczące wielu chorób związanych z podwyższonymi poziomami TNFα są przedstawione w US-A-5 919452. Choroby, które można leczyć cząsteczką przeciwciała według niniejszego wynalazku, mogą obejmować również posocznicę, zastoinową niewydolność serca, kacheksję, zespół ostrego wyczerpania oddechowego dorosłych, AIDS, alergię, łuszczycę, TB, choroby zapalne kości, zaburzenia związane z krzepnięciem krwi, oparzenia, odrzuty po transplantacji narządów i tkanek, i choroby autoimmunologiczne, takie jak zapalenie tarczycy i reumatoidalne zapalenie stawów oraz zapalenie kości i stawów.
Ponadto cząsteczkę przeciwciała albo kompozycję można zastosować do zmniejszenia efektów ubocznych związanych z wytwarzaniem TNFα w czasie terapii nowotworów; do eliminacji albo zmniejszania objawów szokowych związanych z leczeniem albo zapobieganiem odrzuceniu przeszczepu przez zastosowanie przeciwciała anty-limfocyty albo leczenia niewydolności wielonarządowej.
Cząsteczkę przeciwciała według niniejszego wynalazku można również zastosować do diagnozowania, na przykład, do diagnozowania in vivo i obrazowania stanów chorobowych z udziałem podwyższonych poziomów TNFα.
Cząsteczka przeciwciała może zawierać hybrydowy CDR zawierający skróconą donorową sekwencję CDR, w której brakująca część skróconego donorowego CDR jest zastąpiona przez różne sekwencje i tworzy funkcjonalny CDR. Stosowany tu termin hybrydowy oznacza CDR zawierający donorowy CDR, który został skrócony w jednej albo większej liczbie pozycji, na przykład na jednym albo obydwu końcach. Brakująca część skróconego donorowego CDR jest zastąpiona przez inną sekwencję i tworzy kompletny i funkcjonalny CDR. Hybrydowy CDR ma co najmniej jedną zmianę aminokwasową w porównaniu do kompletnego i funkcjonalnego donorowego CDR. Sekwencją zastępującą skróconą część CDR może być dowolna sekwencja. Korzystnie, niedonorowa część sekwencji CDR jest z przeciwciała, z którego pochodzą regiony zrębowe cząsteczki przeciwciała, takie jak sekwencje przeciwciała linii zarodkowej.
Stwierdzono, że cząsteczki przeciwciała zawierające hybrydowy CDR zachowują zasadniczo takie samo powinowactwo wiązania jak cząsteczka przeciwciała zawierająca kompletne donorowe CDR. Stosowany tu termin zasadniczo takie samo powinowactwo wiązania oznacza co najmniej 70%, korzystniej co najmniej 85%, a najkorzystniej co najmniej 95 powinowactwa wiązania odpowiedniej cząsteczki przeciwciała zawierającej kompletny donorowy CDR. Jak zaznaczono powyżej, w niektórych przypadkach, powinowactwo przeciwciała według wynalazku może być większe niż przeciwciała donorowego. Zastosowanie hybrydowych CDR dostarcza korzyści zmniejszenia ilości obcych (tj. donorowych) sekwencji obecnych w cząsteczce przeciwciała i może zwiększyć powinowactwo wiązania cząsteczki przeciwciała w porównaniu z odpowiadającą jej cząsteczką przeciwciała zawierającą kompletne donorowe CDR.
PL 218 516 B1
Dowolny spośród CDR-ów cząsteczki przeciwciała może być hybrydowy. Korzystnie, w cząsteczce przeciwciała hybrydowy jest CDR2 łańcucha ciężkiego.
Korzystnie, skrócenie donorowego CDR wynosi od 1 do 8 aminokwasów, korzystnej 4 do 6 aminokwasów. Ponadto korzystne jest, jeżeli skrócenie jest na końcu C CDR.
W zależności od sekwencji skróconej części CDR i innych sekwencji zastępujących brakującą część, można dokonać różnych zmian aminokwasowych. Korzystne są co najmniej 2 zmiany aminokwasowe, korzystniej co najmniej 3 zmiany aminokwasowe, a najkorzystniej co najmniej 4 zmiany aminokwasowe.
Konkretnym wykonaniem tego przeciwciała jest przeciwciało, które ma łańcuch ciężki jak przeciwciało według wynalazku, ale drugi CDR w łańcuchu ciężkim ma sekwencję podaną jako SEK NR ID: 2. Ma ono lepsze powinowactwo wobec antygenu niż przeciwciało donorowe, z którego pochodzi część CDR.
Niniejszy wynalazek jest dalej opisany jedynie drogą ilustracji w następujących przykładach, które odnoszą się do towarzyszących im Figur, w których:
Na Fig. 1 pokazano regiony zrębowe ludzkiego łańcucha lekkiego podgrupy 1 w porównaniu z regionami zrębowymi łańcucha lekkiego hTNF40 (SEK NR ID:83 do 90);
Na Fig. 2 pokazano regiony zrębowe ludzkiego łańcucha ciężkiego podgrupy 1 i podgrupy 3 w porównaniu z regionami zrębowymi łańcucha ciężkiego hTNF40 (SEK NR ID:91 do 98 i 106 do 109);
Na Fig. 3 pokazano sekwencję aminokwasową CDR hTNF40 (SEK NR ID: 1 to 7), w której CDR H2' jest hybrydowym CDR, w którym sześć C-końcowych aminokwasów jest z sekwencji H2 CDR ludzkiego przeciwciała podgrupy 3 linii zarodkowej, a zmiany aminokwasowe w sekwencji będące wynikiem otrzymania takiej hybrydy są podkreślone;
Na Fig. 4 pokazano wektor pMR15.1;
Na Fig. 5 pokazano wektor pMR14;
Na Fig. 6 pokazano sekwencję nukleotydową i przewidywaną aminokwasową mysiego hTNF40Vl (SEK NR ID: 99);
Na Fig. 7 pokazano sekwencję nukleotydową i przewidywaną aminokwasową mysiego hTNF40Vh (SEK NR ID:100);
Na Fig. 8 pokazano sekwencję nukleotydową i przewidywaną aminokwasową hTNF40-gL1 (SEK NR ID:8);
Na Fig. 9 pokazano sekwencję nukleotydową i przewidywaną aminokwasową hTNF40-gL2 (SEK NR ID: 9);
Na Fig. 10 pokazano sekwencję nukleotydową i przewidywaną aminokwasową gh1hTNF40.4 (SEK NR ID:10);
Na Fig. 11 pokazano sekwencję nukleotydową i przewidywaną aminokwasową gh3hTNF40.4 (SEK NR ID:11);
Na Fig. 12 pokazano wektor CTIL5-gL6;
Na Fig. 13 pokazano strukturę związku nazwanego CDP870 zawierającego zmodyfikowany fragment Fab pochodzący z przeciwciała hTNF40 kowalencyjnie połączony przez reszty cysteinowe z łącznikiem lizylomaleidowym, gdzie każda grupa reszty lizynowej ma dołączoną kowalencyjne resztę metoksy-PEG, przy czym n wynosi około 420;
Na Fig. 14 pokazano wektor pTTQ9;
Na Fig. 15 pokazano sekwencję adaptora oligonukleotydowego OmpA (SEK NR ID:101);
Na Fig. 16 pokazano wektor pACYC184;
Na Fig. 17 pokazano wektor pTTO-1;
Na Fig. 18 pokazano wektor pTTO-2;
Na Fig. 19 pokazano wektor pDNAbEng-G1;
Na Fig. 20 pokazano kasety oligonukleotydowe kodujące różne międzygenowe sekwencje do ekspresji zmodyfikowanych Fab w E. coli (SEK NR ID:102 do 105);
Na Fig. 21 pokazano akumulację w peryplazmie wariantów IGS zmodyfikowanego Fab;
Na Fig. 22 pokazano wektor pTTO(CDP870);
Na Fig. 23 pokazano wskaźnik aktywności choroby (ang. disease activity score, DAS) u pacjentów leczonych różnymi dawkami CDP870 i placebo. Zakresy mediany i IQ są przedstawione dla badanej populacji po dokonaniu ostatniej obserwacji. Małe kwadraty oznaczają placebo, romby oznaczają 1 mg/kg, trójkąty oznaczają 5 mg/kg, a duże kwadraty oznaczają 20 mg/kg;
PL 218 516 B1
Na Fig. 24 pokazano liczbę wrażliwych stawów, liczbę spuchniętych stawów, ocenę bólu, ogólną ocenę przez badającego aktywności choroby, zmodyfikowany kwestionariusz oceny zdrowia (ang. modified health assessment questionnaire, HAQ), białko C-reaktywne (CRP) i szybkość sedymentacji erytrocytów (ESR) u pacjentów leczonych różnymi dawkami CDP870 i placebo. Zakresy mediany i IQ są przedstawione dla badanej populacji po dokonaniu ostatniej obserwacji. Małe kwadraty oznaczają placebo, romby oznaczają 1 mg/kg, trójkąty oznaczają 5 mg/kg, a duże kwadraty oznaczają 20 mg/kg.
P r z y k ł a d y
Klonowanie genu i ekspresja cząsteczki chimerowego przeciwciała hTNF40
Wytwarzanie RNA z komórek hybrydoma hTNF40
Całkowity RNA otrzymano z 3 x 107 komórek hybrydoma hTNF40h jak opisano poniżej. Komórki przemywano solą fizjologiczną i rozpuszczano w RNAzolu (0,2 ml na 106 komórek). Dodawano chloroform (0,2 ml na 2 ml homogenatu), mieszaninę wytrząsano energicznie przez 15 sekund i pozostawiono w lodzie na 15 minut. Uzyskane fazy wodne i organiczne rozdzielano przez wirowanie przez minut w wirówce Eppendorf, a RNA wytrącano z fazy wodnej przez dodanie równej objętości izopropanolu. Po 15 minutach w lodzie, RNA osadzano przez wirowanie, przemyto 70% etanolem, wysuszono i rozpuszczono w sterylnej, wolnej od RNAzy wodzie. Wydajność RNA wynosiła 400 μg.
Klonowanie hTNF40 Vh i VI przez PCR
Sekwencje cDNA kodujące domeny zmienne łańcuchów lekkich i ciężkich hTNF40 zsyntetyzowano przy zastosowaniu odwrotnej transkryptazy w celu wytworzenia jednoniciowych kopii cDNA z mRNA obecnego w całkowitym RNA, a następnie reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) na cDNA ze specyficznymi starterami oligonukleotydowymi.
a) Synteza cDNA cDNA zsyntetyzowano w objętości 20 μl mieszaniny reakcyjnej zawierającej następujące reagenty: 50 mM Tris-HCl pH 8,3, 75 mM KCl, 10 mM ditiotreitol, 3 mM MgCl2, 0,5 mM każdego z trifosforanów deoksyrybonukleozydów, 20 jednostek RNAzyny, 75 ng losowego startera heksanukleotydowego, 2 μg hTNF40 RNA i 200 jednostek odwrotnej transkryptazy wirusa mysiej białaczki Moloneya. Po inkubacji w 42°C przez 60 minut, reakcję zatrzymywano przez ogrzewanie w 95°C przez 5 minut.
b) PCR
Próbki cDNA poddawano reakcji PCR stosując kombinacje starterów specyficznych dla łańcuchów lekkich i ciężkich. Sekwencje nukleotydowe starterów 5' dla łańcuchów lekkich i ciężkich są pokazane w Tabelach 1 i 2, odpowiednio. Wszystkie te sekwencje zawierają, kolejno, miejsce restrykcyjne zaczynające się 7 nukleotydów od ich końców 5', sekwencję GCCGCCACC (SEK NR ID:12), dla umożliwienia optymalnej translacji otrzymanych mRNA, kodon inicjacyjny i 20-30 nukleotydów w oparciu o sekwencje peptydów liderowych znanych mysich przeciwciał (Kabat i wsp., Sequences of proteins of immunological interest, Wydanie 5, 1991, U.S. Department of Health and Human Services, Public Health Service, National Institutes of Health).
Startery 3' są pokazane w Tabeli 3. Starter dla łańcucha lekkiego rozciąga się od złącza J-C przeciwciała i zawiera miejsce restrykcyjne dla enzymu Sp1I dla ułatwienia klonowania fragmentu PCR dla VI. Startery 3' dla łańcucha ciężkiego są mieszaniną zaprojektowaną tak, że obejmują miejsce złącza J-C. Starter 3' zawiera miejsce restrykcyjne dla enzymu Apal dla ułatwienia klonowania. Region 3' starterów zawiera mieszaną sekwencję w oparciu o te znalezione w znanych mysich przeciwciałach (Kabat i wsp., 1991, j ak wyżej).
Kombinacja opisanych powyżej starterów umożliwia bezpośrednie klonowanie produktów PCR dla Vh i VI w odpowiednim wektorze ekspresyjnym (patrz poniżej) w celu wytworzenia chimerowych (mysich-ludzkich) łańcuchów ciężkich i lekkich i ekspresji tych genów w komórkach ssaczych w celu wytworzenia chimerowych przeciwciał o żądanym izotypie.
Mieszaniny inkubacyjne (100 μθ do PCR sporządzono, jak następuje. Każda mieszanina reakcyjna zawierała 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 1,5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 0,01% wag./obj. żelatyny, 0,25 mM każdego z trifosforanów deoksyrybonukleozydów, 10 pmoli mieszaniny starterów 5' (Tabela 4), 10 pmoli startera 3' (CL12 (łańcuch lekki) lub R2155 (łańcuch ciężki) (Tabela 3)), 1 μl cDNA i 1 jednostkę polimerazy Taq. Mieszaniny reakcyjne inkubowano w 95°C przez 5 minut, a następnie przeprowadzono cykle: 94°C przez 1 minutę, 55°C przez 1 minutę i 72°C przez 1 minutę. Po 30 cyklach próbki z każdej mieszaniny reakcyjnej analizowano przez elektroforezę w żelu agarozowym. Mieszaniny reakcyjne dla łańcucha lekkiego zawierające mieszaninę starterów 5' z puli łańcuchów lekkich 1, 2 i 7 dawały prążki o wielkościach zgodnych z fragmentami VI pełnej długości, podczas gdy reakcje z puli 3 dla łańcucha ciężkiego dawały fragment o wielkości spodziewanej dla genu Vh. Prążek
PL 218 516 B1 wytwarzany przez startery z puli 1 dla łańcucha ciężkiego nie ulegał dalszej obróbce, ponieważ wcześniejsze wyniki pokazały, że prążek ten odpowiada pseudogenowi dla łańcucha lekkiego wytwarzanemu przez komórkę hybrydoma. Prążek wytwarzany w przypadku starterów dla puli 7 dla łańcucha lekkiego był słabszy niż prążek dla starterów dla puli 2, a zatem nie był dalej badany. Jedynie prążek z mieszaniny reakcyjnej dla puli 2 łańcucha lekkiego, który był najmocniejszym prążkiem, był poddany dalszej obróbce.
c) Klonowanie molekularne fragmentów PCR
Fragmenty DNA wytworzone w mieszaninie reakcyjnej dla puli 2 dla łańcucha lekkiego strawiono enzymami BstBI i SpII, zagęszczono przez wytrącenie etanolem, poddano elektroforezie w 1,4% żelu agarozowym i odzyskano prążki DNA w zakresie 400 par zasad. Sklonowano je przez ligację z wektorem pMR15.1 (Fig. 4), który strawiono enzymami restrykcyjnymi BstBI i SpII. Po ligacji, mieszaniny transformowano do E. coli LM 1035, a plazmidy z otrzymanych kolonii bakteryjnych przeszukiwano pod kątem wstawek przez trawienie BstBI i SpII. Przedstawicieli ze wstawkami z każdej ligacji analizowano dalej przez sekwencjnowanie nukleotydów.
W podobny sposób, fragmenty DNA wytworzone w puli reakcyjnej 3 dla łańcucha ciężkiego strawiono Hindlll i Apal i sklonowano w wektorze pMR14 (Fig. 5), który był strawiony Hindlll i Apal. Ponownie, reprezentatywne plazmidy zawierające wstawki analizowano dalej przez sekwencjonowanie nukleotydów.
d) Analiza sekwencji nukleotydowej
Plazmidowy DNA z kilku izolatów zawierających wstawki Vh zsekwencjonowano przy użyciu starterów R1053 (patrz Tabela 5) (które rozpoczynają syntezę w regionie 3' promotora HCMV w pMR14) i R720 (patrz Tabela 5) (które rozpoczynają syntezę w regionie 5' ludzkiego C-gamma 4 i umożliwiają sekwencjonowanie przez wstawkę DNA w pMR14). Stwierdzono, że sekwencje nukleotydowe wstawki Vh w pewnej ilości klonów były identyczne z wyjątkiem różnic w peptydzie sygnałowym i regionach J. Wskazuje to, że badane klony są niezależnymi izolatami powstałymi w wyniku zastosowania różnych starterów z mieszaniny oligonukleotydów podczas etapu PCR. Ustalona sekwencja nukleotydowa i przewidywana sekwencja aminokwasowa domeny zmiennej łańcucha ciężkiego przeciwciała hTNF40 (hTNF40Vh) są podane na Fig. 7 (SEK NR ID: 100).
W celu przeanalizowania klonów łańcucha lekkiego zbadano sekwencję pochodzącą z syntezy ze starterami R1053 (patrz Tabela 5) i R684 (SEK NR ID:62) (które rozpoczynają syntezę w regionie 5' ludzkiego C-kappa i umożliwiają sekwencjonowanie przez wstawkę DNA w pMR15.1). Sekwencja nukleotydowa i przewidywana sekwencja aminokwasowa genów VI powstających w mieszaninie reakcyjnej dla puli 2 była analizowana podobnie. Ponownie stwierdzono, że sekwencje nukleotydowe wstawki VI w pewnej ilości klonów były identyczne z wyjątkiem różnic w peptydzie sygnałowym i regionach J, co wskazuje, że badane klony są niezależnymi izolatami powstałymi w wyniku zastosowania różnych starterów z mieszaniny oligonukleotydów stosowanych podczas etapu PCR. Ustalona sekwencja nukleotydowa i przewidywana sekwencja aminokwasowa domeny zmiennej łańcucha ciężkiego przeciwciała hTNF40 (hTNF40Vl) są podane na Fig. 6 (SEK NR ID: 99).
PL 218 516 B1
Tabela 1
Startery oligonukleotydowe dla regionu 5' mysich łańcuchów ciężkich
CHI: 5'ATGAAATGCAGCTGGGTCAT(G,C)TTCTT3' (SEK NR ID:13)
CH2: 5'ATGGGATGGAGCT(A,G)TATCAT(C,G) (C,T)TCTT3' (SEK NR ID:14)
CH3: 5'ATGAAG(A,T)TGTGGTTAAACTGGGTTTT3' (SEK NR ID:15)
CH4: 5'ATG(G,A)ACTTTGGG(T,C)TCAGCTTG(G,A)T3'(SEK NR ID:16)
CHS: 5'ATGGACTCCAGGCTCAATTTAGTTTT3' (SEK NR ID:17)
CH6: 5'ATGGCTGTC(C,T)T(G,A)G(G,C)GCT(G,A)CTCTTCTG3'(SEK NR
ID:18)
CH7: 5'ATGG(G,A)ATGGAGC(G,T)GG(G, A)TCTTT (A, C) TCTT3'(SEK NR
ID:19)
CH8: 5'ATGAGAGTGCTGATTCTTTTGTG3'(SEK NR ID:20)
CHS: 5'ATGG(C,A)TTGGGTGTGGA(A,C)CTTGCTATT 3' (SEK NR ID:21)
CH10: 5'ATGGGCAGACTTACATTCTCATTCCT3'(SEK NR ID:22)
CH11: 5'ATGGATTTTGGGCTGATTTTTTTTATG3' (SEK NR ID:23)
CH12: 5' ATGATGGTGTTAAGTCTTCTGTACCT3' (SEK NR ID:24)
Każdy z powyższych starterów ma sekwencję
5'GCGCGCAAGCTTGCCGCCACC3' (SEK NR ID:25) dodaną do jego końca 5'.
PL 218 516 B1
Tabela 2
Startery oligonukleotydowe dla regionu 5' mysich łańcuchów lekkich
CLI; 5'ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCT3' (SEK NR ID:26)
CL2: 5'ATGGAG(T,A)CAGACACACTCCTG(T,C)TATGGGT3' (SEK NR ID:27)
CL3: 5'ATGAGTGTGCTCACTCAGGTCCT3' (SEK NR ID:28)
CL4: 5'ATGAGG(G,A)CCCCTGCTCAG(A,T)TT(C,T)TTGG3'(SEK NR ID;29) CL5: 5'ATGGATTT(T,A)CAGGTGCAGATT(T,A) TCAGCTT 3' (SEK NR ID;30)
CL5A: 5'ATGGATTT(T,A)CA(A,G)GTGCAGATT(T,A)TCAGCTT3'(SEK NR
ID:31)
CL6 :
5'ATGAGGT(T, G) C (T, C) (T, C) TG (T, C) T (G, C) AG (T, C) T (TC)CTG(A,
G)G3' (SEK NR ID:32)
CL7; 5'ATGGGC(T,A)TCAAGATGGAGTCACA3' (SEK NR ID:33)
CL8: 5'ATGTGGGGA(T,C)CT(G,T)TTT(T,C)C((A,C)(A,C)TTTTTCAAT3' (SEK NR ID:34)
CL9: 5' ATGGT(G,A)TCC(T,A)CA(G,C)CTCAGTTCCTT3'(SEK NR ID:35)
CLIO: 5'ATGTATATATGTTTGTTGTCTATTTC3' (SEK NR ID:36)
CLII: 5'ATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTT3' (SEK NR ID:37)
CL12A: 5'ATG(A,G)AGT(T,C)(A,T)CAGACCCAGGTCTT(T,C)(A,G)T3' (SEK NR ID:38)
CL12B: 5'ATGGAGACACATTCTCAGGTCTTTGT3' (SEK NR ID:39)
CL13: 5'ATGGATTCACAGGCCCAGGTTCTTAT3'(SEK NR ID:40)
CL14: 5'ATGATGAGTCCTGCCCAGTTCCTGTT3'(SEK NR ID:41)
CL15: 5'ATGAATTTGCCTGTTCATCTCTTGGTGCT3' (SEK NR ID:42)
CL16: 5'ATGGATTTTCAATTGGTCCTCATCTCCTT3'(SEK NR ID:43)
CL17A: 5'ATGAGGTGCCTA(A,G)CT(C,G)AGTTCCTG(A,G)G3' (SEKNR:44)
CL17B: 5'ATGAAGTACTCTGCTCAGTTTCTAGG3' (SEK NR ID:45)
CLI7C: 5'ATGAGGCATTCTCTTCAATTCTTGGG3' (SEK NR ID:46)
Każdy z powyższych starterów ma sekwencje
5'GGACTGTTCGAAGCCGCCACC3'(SEK NR ID:47) dodaną do jego końca 5',
PL 218 516 B1
Tabela 3
Startery oligonukleotydowe dla końców 3' mysich genów Vh ί VI Łańcuch lekki (CL12):
5'GGATACAGTTGGTGCAGCATCCGTACGTTT3'(SEK NR ID:48)
Łańcuch ciężki (R2155):
5'GCAGATGGGCCCTTCGTTGAGGCTG(A,C)(A,G)GAGAC(G,T,A)GTGA3' (SEK NR ID:49).
Tabela 4
a) Mieszaniny starterów 5' dla reakcji PCR dla łańcucha lekkiego pula 1: CL2 pula 2: CL7 pula 3: CL13 pula 4: CL6 pula 5: CL5A, CL9, CL17A. pula 6: CL8 pula 7: CL12A pula 8: CLI, CL3, CL4, CL5, CLIO, CLII, CL2B, CL14, CL15,
CL16, CL17B, CL17C
b) Mieszaniny starterów 5' dla reakcji PCR dla łańcucha ciężkiego
pula 1: CHI, CH2, CH3, CH4.
pula 2: CHS, CH6, CH7, CH8.
pula 3: CH9, CH10, CH11, CH12.
Tabela 5
Startery użyte w analizie sekwencji nukleotydowej R1053: 5'GCTGACAGACTAACAGACTGTTCC3' (SEK NR ID:50)
R720: 5'GCTCTCGGAGGTGCTCCT3' (SEK NR ID:51)
PL 218 516 B1
Ocena aktywności chimerowych genów
Aktywności chimerowych genów oceniano przez uzyskanie ich ekspresji w komórkach ssaczych i oczyszczenie i ocenę ilościową nowo zsyntetyzowanych przeciwciał. Metodologia jest opisana poniżej, a po niej następuje opis testów biochemicznych i testów opartych na komórkach zastosowanych do charakteryzowania biochemicznego przeciwciał.
a) Wytwarzanie chimerowej cząsteczki przeciwciała hTNF40
Chimerowe przeciwciało do oceny biologicznej wytworzono przez przejściową ekspresję odpowiednich części ciężkiego i lekkiego łańcucha po kotransfekcji do komórek jajnika chomika chińskiego (CHO) z zastosowaniem precypitacji fosforanem wapnia.
Dzień przed transfekcją, kolby z prawie konfluentnymi komórkami CHO-L761 trypsynizowano, komórki zliczono i w każdej z kolb T75 umieszczano 107 komórek.
Następnego dnia 3 godziny przed transfekcją zmieniano pożywkę hodowlaną. Do transfekcji osad fosforanu wapnia przygotowywano przez zmieszanie 1,25 ml 0,25 M CaCl2 zawierającego 50 μg każdego z wektorów ekspresyjnych dla łańcucha ciężkiego i lekkiego z 1,25 ml 2 x HBS (16,36 g NaCl, 11,0 g HEPES i 0,4 g Na2HPO4 w 1 litrze wody o pH doprowadzonym do 7,1 przy użyciu NaOH) i natychmiastowe dodanie do pożywki z komórkami. Po 3 godzinach w 37°C w inkubatorze CO2 pożywkę i precypitat usunięto, a komórki poddano szokowi przez dodanie 15 ml 15% glicerolu w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) przez 1 minutę. Glicerol usunięto, komórki przemyto raz PBS i inkubowano przez 48-96 godzin w 25 ml pożywki zawierającej 10 mM maślan sodowy. Przeciwciała można było oczyścić z pożywki hodowlanej przez wiązanie ze złożem Protein A-Sepharose i elucję.
b) ELISA
W celu przeprowadzenia ELISA, płytki Nunc ELISA opłaszczono przez noc w 4°C fragmentem
F(ab)2 poliklonalnych kozich anty-ludzkich przeciwciał specyficznych wobec fragmentu Fc (Jackson Immunoresearch, kod 109-006-098) w 5 μg/ml buforu do opłaszczania (15 mM węglan sodu, 35 mM wodorowęglan sodu, pH 6,9). Nieopłaszczone przeciwciało usunięto przez 5-krotne przemycie wodą destylowaną. Próbki i oczyszczone standardy do oznaczeń ilościowych rozcieńczono do około 1 μg/ml w buforze koniugacyjnym (0,1 M Tris-HCl, pH 7,0, 0,1 M NaCl, 0,2% obj./obj. Tween 20, 0,2% wag./obj. kazeina Hammersten). Próbki miareczkowano w studzienkach do mikromiareczkowania w dwukrotnych rozcieńczeniach, tak aby uzyskać końcową objętość 0,1 ml w każdej studzience i płytki inkubowano w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę z wytrząsaniem. Po pierwszym etapie inkubacji płytki przemyto 10-krotnie wodą destylowaną, a następnie inkubowano przez 1 godzinę jak wcześniej z 0,1 ml mysich monoklonalnych przeciwciał anty-ludzki łańcuch kappa (klon GD12) skoniugowanych z peroksydazą (The Binding Site, kod MP135) w rozcieńczeniu 1 do 700 w buforze koniugacyjnym. Płytki ponownie przemyto i do każdej studzienki dodawano roztwór substratu (0,1 ml). Roztwór substratu zawierał 150 μl N,N,N,N-tetrametylobenzydyny (10 mg/ml w DMSO), 150 μl nadtlenku wodoru (roztwór 30%) w 10 ml 0,1 M octanu sodu/cytrynianu sodu, pH 6,0. Płytki wywoływano przez
5-10 minut, aż do momentu gdy absorbancja przy 630 nm wynosiła około 1,0 dla górnego standardu. Absorbancję przy 630 nm zmierzono przy użyciu czytnika płytek, a stężenie próbki ustalono przez porównanie krzywych miareczkowania z korzystnymi dla standardu.
c) Określenie stałych powinowactwa przez analizę BiaCore Interakcje przy wiązaniu hTNF40 i ludzkiego TNF zbadano przy zastosowaniu technologii BIA. Oczyszczone przez powinowactwo kozie poliklonalne przeciwciało skierowane przeciw regionowi stałemu hTNF40, unieruchomiono na powierzchni dekstranowej polimerowej mikropłytki sensorowej z zastosowaniem standardowej reakcji chemicznej NHS/EDC.
Wyłapywano stosunkowo niskie poziomy hTNF40 (200-500 RU) dla zapewnienia zminimalizowania efektu transportu masy. Przez wyłapane hTNF40 przepuszczano ludzkie TNF w różnych stężeniach w celu umożliwienia pomiaru kinetyk łączenia. Po wstrzyknięciu ligandu, nad powierzchnią przepuszczono bufor, tak aby można było zmierzyć dysocjację. Obliczano stałe szybkości asocjacji i dysocjacji dla oddziaływania pomiędzy hTNF40 w fazie stałej i ludzkim TNF i wyprowadzano wartość KD.
P r z y k ł a d 1
Przeszczepienie CDR do hTNF40
Klonowanie molekularne genów dla regionów zmiennych ciężkich i lekkich łańcuchów przeciwciała hTNF40 i ich zastosowanie do wytwarzania chimerowych (mysie-ludzkie) przeciwciał hTNF40 opisano powyżej. Sekwencje nukleotydowe i aminokwasowe mysich VI i Vh hTNF40 są pokazane na Fig. 6 i 7 (SEK ID NR:99 i 100), odpowiednio. Przykład ten opisuje przeszczepienie CDR do przeciwciała hTNF40.
PL 218 516 B1
Przeszczepienie CDR do łańcucha lekkiego hTNF40
Dopasowanie regionów zrębowych łańcucha lekkiego hTNF40 z regionami pochodzącymi z czterech podgrup ludzkich łańcuchów lekkich (Kabat i wsp., 1991, jak wyżej) wykazało, że hTNF40 było najbardziej homologiczne z przeciwciałami z podgrupy 1 ludzkich łańcuchów lekkich. Konsekwentnie, w celu skonstruowania łańcucha lekkiego z przeszczepionym CDR, wybrane regiony zrębowe odpowiadały regionom ludzkich sekwencji najwyższej zgodności grupy 1.
Porównanie sekwencji aminokwasowych regionów zrębowych mysiego hTNF40 i sekwencji najwyższej zgodności ludzkich łańcuchów lekkich grupy 1 jest podane na Fig. 1 i wykazuje istnienie 22 różnic (podkreślonych) między tymi dwiema sekwencjami. Analiza wkładu, który może mieć każda z tych różnic w wiązaniu antygenu, zidentyfikowała 2 reszty do badania; znajdują się one w pozycjach 46 i 60. W oparciu o tę analizę skonstruowano dwie wersje łańcucha lekkiego z przeszczepionym CDR. W pierwszej z nich, hTNF40-gL1 (SEK NR ID:8), reszty 46 i 60 pochodziły z łańcucha lekkiego hTNF40, podczas gdy w drugiej hTNF40-gL2 (SEK NR ID:9) wszystkie reszty są resztami ludzkimi najwyższej zgodności z wyjątkiem reszty numer 60, która pochodzi z łańcucha lekkiego hTNF40.
Konstrukcja łańcucha lekkiego hTNF40-gL1 z przeszczepionymi CDR
Konstrukcja hTNF40-gL1 jest podana poniżej ze szczegółami. Następujące zachodzące na siebie oligonukleotydy (P7982-P7986) zastosowano w reakcjach łańcuchowych polimerazy (PCR) dla złożenia skróconego łańcucha lekkiego z przeszczepieniem. W złożonym fragmencie brakuje sekwencji liderowej przeciwciała i pierwszych 17 aminokwasów regionu zrębowego 1.
oligo 1 P7982:
5'GAATTCAGGGTCACCATCACTTGTAAAGCCAGTCAGAACGTAGGTAGTA
GCCTGGTATCAGCAAA3' (SEK NR ID:52) oligo 2 P7983:
5'ATAGAGGAAAGAGGCACTGTAGATGAGGGCTTTTGGGGCTTTACCTGGT
TTTTGCTGATACCAGGCTACGT 3' (SEK NR ID:53) oligo 3 P7984:
5’ TACAGTGCCTCTTTCCTCTATAGTGGTGTACCATACAGGTTCAGCGGAT
CCGGTAGTGGTACTGATTTCAC3' (SEK NR ID:54) oligo 4 P7985:
5'GACAGTAATAAGTGGCGAAATCTTCTGGCTGGAGGCTACTGATCGGTGA
GGGTGAAATCAGTACCACTACCG3' (SEK NR ID:55) oligo 5 P7986:
5'AT Τ TC GC CAC T TAT TAC TGT CAACAG TATAACATC TACCCAC TCACAT T
CGGTCAGGGTCTAAAGTAGAAATCAAACGTACGGAATTC3' (SEK NR ID:56)
Fwd P7981:
5'GAATTCAGGGTCACCATCACTTGTAAAGCC3' (SEK NR ID:57)
Bwd P7980
5'GAATTCCGTACGTTTGATTTCTACTTTAGT3' (SEK NR ID:58)
PL 218 516 B1
Sporządzono 100 μl mieszaniny reakcyjnej do PCR, zawierającej, 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 1,5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 0,01% wag./obj. żelatyny, 0,25 mM każdego z trifosforanów deoksyrybonukleozydów, 2 pmole P7982, P7983, P7984, P7985, P7986, 10 pmoli P7980, P7981 i 1 jednostkę polimerazy Taq. Mieszaniny reakcyjne poddano cyklom: 94°C przez 1 minutę, 55°C przez 1 minutę i 72°C przez 1 minutę. Po 30 cyklach próbki z każdej mieszaniny reakcyjnej analizowano przez elektroforezę w żelu agarozowym i fragmenty PCR wycięto z żelu i odzyskano przy użyciu Mermaid Kit. Odzyskany fragment strawiono enzymami restrykcyjnymi BstEII i SpII w odpowiednim buforze. Na koniec uzyskany produkt poddano elektroforezie w żelu agarozowym i fragment DNA o wielkości 270 par zasad DNA odzyskano z fragmentu żelu i poddano ligacji z wektorem CTIL5-gL6 (Fig. 12), który strawiono uprzednio tymi samymi enzymami. Powyższy wektor dostarcza brakującej sekwencji liderowej przeciwciała i pierwszych 17 aminokwasów regionu zrębowego 1.
Mieszaninę ligacyjną zastosowano do transformacji szczepu E. coli LM1035, a uzyskane kolonie przeanalizowano przez PCR, trawienie enzymami restrykcyjnymi i sekwencjonowanie nukleotydów. Sekwencja nukleotydową i aminokwasową regionu VI hTNF40-gL1 jest pokazana na Fig. 8 (SEK NR ID:8).
Konstrukcja łańcucha lekkiego hTNF40-gL2 z przeszczepionymi CDR hTNF40-gL2 (SEK NR ID:9) skonstruowano przy zastosowaniu PCR. Do wprowadzenia zmian aminokwasowych zastosowano następujące oligonukleotydy:
R1053: 5'GCTGACAGACTAACAGACTGTTCC3' (SEK NR ID:59)
R5350:
5'TCTAGATGGCACACCATCTGCTAAGTTTGATGCAGCATAGATCAGGAGCTT
AGGAGC3' (SEK NR ID:60)
R5349:
5'GCAGATGGTGTGCCATCTAGATTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACAGACTT
TACCCTAAC3' (SEK NR ID:61)
R684: 5' TTCAACTGC.TCATCAGAT3' (SEK NR ID:62)
Sporządzono dwie mieszaniny reakcyjne, każda po 20 pl, zawierające, 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 1,5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 0,01% wag./obj. żelatyny, 0,25 mM każdego z trifosforanów deoksyrybonukleozydów, 6 pmoli R1053/R5350 i R5349/R684 i 1 jednostkę polimerazy Taq. Mieszaniny reakcyjne poddano cyklom: 94°C przez 1 minutę, 55°C przez 1 minutę i 72°C przez 1 minutę. Po 30 cyklach próbki z każdej mieszaniny reakcyjnej przeanalizowano przez elektroforezę w żelu agarozowym, a fragmenty PCR wycięto z żelu i odzyskano przy użyciu zestawu Mermaid Kit.
Próbki z tych reakcji poddano następnie drugiej rundzie PCR. Mieszanina reakcyjna, 100 pl, zawierała 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 1,5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 0,01% wag./obj. żelatyny, i 1/5 każdego z fragmentów PCR z pierwszego zestawu reakcji, 30 pmoli R1053 i R684 i 2,5 jednostek polimerazy Taq. Temperatury reakcji były jak wyżej. Po reakcji PCR, mieszaninę ekstrahowano fenolem/chloroformem, a następnie chloroformem i wytrącano etanolem. Osad etanolowy odzyskano przez odwirowanie, rozpuszczono w odpowiednim buforze i strawiono enzymami restrykcyjnymi BstEII i SpII. Na koniec uzyskany produkt poddano ostatecznie elektroforezie w żelu agarozowym, a fragment DNA o wielkości 270 par zasad odzyskano z fragmentu żelu i poddano ligacji z wektorem pMR15.1 (Fig. 4), który strawiono uprzednio tymi samymi enzymami.
Mieszaninę ligacyjną zastosowano do transformacji szczepu E. coli LM1035, a uzyskane kolonie przeanalizowano przez PCR, trawienie enzymami restrykcyjnymi i sekwencjonowanie nukleotydów. Sekwencja nukleotydowa i aminokwasowa regionu VI hTNF40-gL2 jest pokazana na Fig. 9 (SEK NR ID:9).
Przeszczepienie CDR do łańcucha ciężkiego hTNF40
Przeszczepienie CDR do łańcucha ciężkiego hTNF40 przeprowadzono stosując tę samą strategię jak dla łańcucha lekkiego. Stwierdzono, że łańcuch ciężki hTNF40 jest najbardziej homologiczny z ludzkimi łańcuchami ciężkimi należącymi do podgrupy 1, a zatem sekwencję najwyższej zgodności ludzkiego regionu zrębowego podgrupy 1 wybrano do przyjęcia CDR-ów łańcucha ciężkiego hTNF40.
W celu zbadania wymagań dla działania homologicznego regionu zrębowego jako akceptorowego regionu zrębowego dla przeszczepienia CDR wybrano drugi region zrębowy dla ludzkiej grupy 3 w celu
PL 218 516 B1 humanizowania łańcucha ciężkiego hTNF40. Porównanie hTNF40 z dwoma różnymi regionami zrębowymi jest pokazane na Fig. 2, gdzie można zobaczyć, że hTNF40 różni się od ludzkich sekwencji najwyższej zgodności podgrupy 1 w 32 pozycjach (podkreślone) i różni się od ludzkich sekwencji najwyższej zgodności podgrupy 3 w 40 pozycjach (podkreślone). Po analizie udziału, który każda z nich może mieć w wiązaniu antygenu, reszty 28, 38, 46, 67, 69 i 71 pozostawiono jako reszty donorowe w łańcuchu ciężkim gh1hTNF40.1 z przeszczepionymi CDR, stosując region zrębowy grupy 1. Reszty 27, 28, 30, 48, 49, 69, 71, 73, 76 i 78 pozostawiono jako donorowe w łańcuchu ciężkim gh3hTNF40.4 z przeszczepionymi CDR, stosując region zrębowy grupy 3. Reszty 28, 69 i 71 pozostawiono jako donorowe w łańcuchu ciężkim gh1hTNF40.4 z przeszczepionymi CDR, stosując region zrębowy grupy 1.
Konstrukcja łańcucha ciężkiego gh1hTNF40.4 z przeszczepionymi CDR
Gh1hTNF40.4 (SEK NR ID: 10) złożono przez poddanie zachodzących na siebie oligonukleotydów reakcji PCR w obecności odpowiednich starterów. W reakcji PCR zastosowano następujące oligonukleotydy:
Przeszczepienie grupy 1 oligo 1 P7989:
5'GAAGCACCAGGCTTCTTAACCTCTGCTCCTGACTGGACCAGCTGCACCT
GAGAGTGCACGAATTC3' (SEK NR ID:63) oligo 2 P7990:
5'GGTTAAGAAGCCTGGTGCTTCCGTCAAAGTTTCGTGTAAGGCCTCAGGC
TACGTGTTCACAGACTATGGTA3' (SEK NR ID:64) oligo 3 P7991:
5'CCAACCCATCCATTTCAGGCCTTGTCCCGGGGCCTGCTTGACCCAATTC
ATACATAGTCGTGAACACGT3' (SEK NR ID:65) oligo 4 P7995:
5'GGCCTGAAATGGATGGGTTGGATTAATACTTACATTGGAGAGCCTATTT
ATGTTGACGACTTCAAGGGCAGATTCACGTTC3' (SEK NR ID:66) oligo 5 P7992:
5'CCATGTATGCAGTGCGTTGTGGAGGTGTCTAGAGTGAACGTGAATCTGC
CCTTGAA3' (SEK NR ID:67) oligo 5 P7993:
5'CCACAAGCACTGCATACATGGAGCTGTCATCTCTGAGATCCGAGGACAC
CGCAGTGTACTAT3' (SEK NR ID:68) oligo 7 P7994:
5,GAATTCGGTACCCTGGCCCCAGTAGTCCATGGCATAAGATCTGTATCCT
CTAGCACAATAGTACACTGCGGTGTCCTC3' (SEK NR ID:69)
Fwd: P7988:
5' GAATTCGTGCACTCTCAGGTGCAGCTGGTC3' (SEK NR ID:70)
Bwd P79S7:
5'GAATTCGGTACCCTGGCCCCAGTAGTCCAT3' (SEK NR ID:71)
PL 218 516 B1
Mieszanina reakcyjna do składania, 100 pi, zawierała 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 1,5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 0,01% wag./obj. żelatyny, 0,25 mM każdego z trifosforanów detoksyrybonukleozydów, po 2 pmole każdego spośród p7989, p7990, p7991, p7995, p7992, p7993 i p7994, po 10 pmoli każdego spośród p7988 i p7987 oraz 1 jednostkę polimerazy Taq. Mieszaniny reakcyjne poddano cyklom: 94°C przez 1 minutę, 55°C przez 1 minutę i 72°C przez 1 minutę. Po 30 cyklach, mieszaninę ekstrahowano fenol/chloroform (1/1), a następnie chloroformem i wytrącano etanolem. Po odwirowaniu, DNA rozpuszczono w odpowiednim buforze i strawiono enzymami restrykcyjnymi ApaLI i KpnI. Uzyskany fragment wyizolowano z żelu agarozowego i poddano ligacji z wektorem pMR14 (Fig. 5), który strawiono uprzednio tymi samymi enzymami. pMR14 zawiera ludzki region stały łańcucha ciężkiego gamma 4 i gdy pMR14 jest przecinany ApaLI i KpnI, przecięty wektor jest zdolny do przyjmowania strawionego DNA tak, aby koniec 3' strawionego DNA połączył się w ramce odczytu z końcem 5' sekwencji kodującej region stały gamma 4. Zatem, łańcuch ciężki wyrażony z tego wektora będzie miał izotyp gamma 4. Mieszaninę ligacyjną zastosowano do transformowania E. coli LMI035, a uzyskane w wyniku kolonie bakteryjne zbadano przez trawienie restrykcyjne i analizę sekwencji nukleotydowej. W ten sposób zidentyfikowano plazmid zawierający prawidłową sekwencję dla gh1hTNF40.4 (Fig. 10) (SEK NR ID:10).
Konstrukcja łańcucha ciężkiego gh3hTNF40.4 z przeszczepionymi CDR gh3hTNF40.4 (SEK NR ID: 11) złożono przez poddanie zachodzących na siebie oligonukleotydów reakcji PCR w obecności odpowiednich starterów. W reakcji PCR zastosowano następujące oligonukleotydy:
Przeszczepienie grupy 3 oligo 1 P7999:
5'GATCCGCCAGGCTGCACGAGACCGCCTCCTGACTCGACCAGCTGAACCT
CAG AGTGCACGAATTC3' (SEK NR ID:72) oligo 2 PSOOO:
5'TCTCGTGCAGCCTGGCGGATCGCTGAGATTGICCTGTGCTGCATCTGGT
TACG TCTTCACAGACTATGGAA3' (SEK NR ID: 73) oligo 3 P8001
5' ccaacccatccatttcaggccctttcccggggcctgcttaacgcaattc
ATTC CATAGTCTGTGAAGACGT3' (SEK NR ID:74) oligo 4 P7995:
5' GGCCTGAAATGGATGGGTTGGATTAATACTTACATTGGAGAGCCTATTT
ATGT TGACGACTTCAAGGGCAGATTCACGTTC3' (SEK NR ID:66) oligo 5 P7997:
5' GGAGGTATGCTGTTGACTTGGATGTGTCTAGAGAGAACGTGAATCTGCC
CTTGAA3' (SEK NR ID:75) oligo 6 P7998:
5' CCAAGTCAACAGCATACCTCCAAATGAATAGCCTGAGAGCAGAGGACAC
C
AGTGTACTAT3' (SEK NR ID:76) oligo 7 P7993:
5' GAATTCGGTACCCTGGCCCCAGTAGTCCATGGCATAAGATCTGTATCCT
CT CACAATAGTACACTGCGGTGTCCTC3' (SEK NR ID:77)
5Fwd P7996:
5'GAATTCGTGCACTCTGAGGTTCAGCTGGTC3' (SEK NR ID:78)
Bwd P7987:
5'GAATTCGGTACCCTGGCCCCAGTAGTCCAT3' (SEK NR ID:71)
PL 218 516 B1
Mieszanina reakcyjna do składania, 100 pi, zawierała 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 1,5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 0,01% wag./obj. żelatyny, 0,25 mM każdego z trifosforanów deoksyrybonukleozydów, po 2 pmole każdego spośród p7999, p8000, p8001, p7995, p7997, p7998 i p7993, po 10 pmoli p7996 i p7987 oraz 1 jednostkę polimerazy Taq. Mieszaniny reakcyjne poddano cyklom: 94°C przez 1 minutę, 55°C przez 1 minutę i 72°C przez 1 minutę. Po 30 cyklach mieszaninę poddano ekstrakcji fenol/chloroform(1/1), a następnie chloroformem i wytrącono etanolem. Po odwirowaniu, DNA rozpuszczono w odpowiednim buforze i strawiono enzymami restrykcyjnymi ApaLI i KpnI. Uzyskany fragment wyizolowano z żelu agarozowego i poddano ligacji z wektorem pMR14 (Fig. 5), który strawiono uprzednio tymi samymi enzymami. pMR14 zawiera ludzki region stały łańcucha ciężkiego gamma 4. Gdy pMR14 jest przecinany ApaLI i KpnI, przecięty wektor ma zdolność pobrania strawionego DNA tak, aby koniec 3' strawionego DNA połączył się w ramce odczytu z końcem 5' sekwencji kodującej region stały gamma 4. Zatem, łańcuch ciężki wyrażony z tego wektora będzie miał izotyp gamma 4. Mieszaninę ligacyjną zastosowano do transformowania E. coli LMI035, a uzyskane kolonie bakteryjne zbadano przez trawienie restrykcyjne i analizę sekwencji nukleotydowej. W ten sposób zidentyfikowano plazmid zawierający prawidłową sekwencję dla gh3hTNF40.4 (SEK NR ID:11) (Fig. 11).
Wytwarzanie zmodyfikowanego fragmentu Fab z przeszczepionymi CDR
Zmodyfikowany fragment Fab z przeszczepionymi CDR w oparciu o przeciwciało hTNF40 skonstruowano przy użyciu wektora E. coli pTTO-1. Regiony zmienne przeciwciała hTNF40 subklonowano w tym wektorze i międzygenową sekwencję optymalizowano w celu wytworzenia pTTO(CDP870). Wektor ekspresyjny pTTO jest zaprojektowany tak, aby dawał rozpuszczalną, peryplazmatyczną akumulację zrekombinowanych białek w E. coli. Główne cechy tego plazmidu to:
(i) marker oporności na tetracyklinę - antybiotyk nie jest inaktywowany przez produkt genu oporności, a zatem selekcja na komórki niosące plazmid jest utrzymywana;
(ii) niska liczba kopii - miejsce początku replikacji pochodziło z plazmidu p15A, który jest całkowicie zgodny z plazmidami zawierającymi replikony pochodzące od colE1;
(iii) silny, indukowalny promotor tac do transkrypcji sklonowanego genu(ów);
(iv) gen laclq - daje konstytutywną ekspresję białka represorowego lac, utrzymując promotor tac w stanie represji aż do czasu indukcji przez IPTG/allolaktozę;
(v) sekwencja sygnałowa OmpA - daje peryplazmatyczną sekrecję sklonowanego genu(ów); i (vi) połączenie translacyjne sekwencji sygnałowej OmpA z krótkim peptydem lacZ z uzyskaniem wydajnej inicjacji translacji.
Wektor opracowano do ekspresji zmodyfikowanych fragmentów Fab z dwucistronowych mRNA przez zaprojektowanie sposobu doświadczalnej selekcji optymalnej międzygenowej sekwencji z serii czterech wbudowanych w tym celu kaset. Zastosowanie tego konstruktu pTTO(CDP870) jest opisane.
Materiały i Metody
Techniki DNA
W protokołach zastosowano standardowe procedury obejmujące trawienie DNA enzymami restrykcyjnymi, elektroforezę w żelu agarozowym, ligację i transformację. Enzymy restrykcyjne i enzymy do modyfikacji DNA otrzymano z New England Biolabs lub Boehringer Mannheim i zastosowano zgodnie z zaleceniami producentów. Fragmenty DNA oczyszczano z agarozy stosując protokół GeneClean (BIO 101).
Oligonukleotydy były dostarczone przez Oswel Oligonucleotide Service i syntetyzowane na skalę 40 nm. Plazmidowy DNA wyizolowano przy użyciu zestawów Plasmid DNA Mini/Midi kits z Qiagen. PCR przeprowadzono stosując Perkin Elmer' Amplitaq' jak zalecano. Sekwencjonowanie DNA przeprowadzono przy użyciu zestawu do sekwencjonowania Applied Biosystems Taq cycle sequencing kit.
Indukcja w kolbach z wytrząsaniem
Hodowle E. coli W311 prowadzono w bulionie L uzupełnionym tetracykliną (75 pg/ml). W celu indukcji, świeże nocne hodowle (hodowane w 30°C ) rozcieńczono do OD600 0,1 w 200 ml bulionu L w 2 l kolbach z przegrodami i hodowano w 30°C na wytrząsarce orbitalnej. Przy OD600 0,5 dodano IPTG do 200 pM. Próbki (znormalizowane na OD) pobierano w pewnych odstępach czasu.
Ekstrakcja peryplazmatyczna
Próbki hodowli schładzano w lodzie (5 minut), a następnie komórki zbierano przez odwirowanie. Po ponownym zawieszeniu w buforze do ekstrakcji (100 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, pH 7,4) próbki inkubowano przez noc w 30°C, a następnie klarowano przez odwirowanie.
Test składania
Stężenia zmodyfikowanych Fab określono przez ELISA. Płytki opłaszczano przez noc w 4°C anty-ludzkimi Fd 6045 (2 pg/ml w buforze do opłaszczania, sól fizjologiczna, 100 pl na studzienkę).
PL 218 516 B1
Po przemyciu, nałożono 100 pl próbki na studzienkę; oczyszczoną A5B7 gamma-1 Fab', początkowo w stężeniu 2 pg/ml, zastosowano jako standard. Wykonano seryjne dwukrotne rozcieńczenie próbek na płytce w buforze koniugacyjnym (na litr: 6,05 g trisaminometanu; 2,92 g NaCl; 0,1 ml Tween-20; 1 ml kazeiny (0,2%)); płytki inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem. Płytki przemyto, wysuszono, a następnie dodano 100 pl przeciwciał anty-ludzki C kappa (GD12)peroksydaza (rozcieńczone w buforze koniugacyjnym próbki). Inkubację prowadzono przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem. Płytki przemyto, wysuszono, a następnie dodano 100 pl roztworu substratu (10 ml octan sodu/cytrynian sodu (0,1 M pH 6,0); 100 pl roztworu H2O2; 100 pl roztworu tetrametylobenzydyny (10 mg/ml w dimetylosulfotlenku). Absorbancję przy 630 nm odczytywano 4-6 minut po dodaniu substratu.
Konstrukcja plazmidu pTTO-1 (a) Wymiana polilinkera pTTQ9
Plazmid pTTQ9 otrzymano z Amersham i pokazano na Fig. 14. Próbkę (2 pg) strawiono enzymami restrykcyjnymi SalI i EcoRI, produkt trawienia rozdzielono w 1% żelu agarozowym i oczyszczono duży fragment DNA (4520 bp). Zsyntetyzowano dwa oligonukleotydy, które po połączeniu się ze sobą kodują region polilinkera OmpA pokazany na Fig. 15. Sekwencja ta ma lepkie końce, które pasują do końców wytwarzanych przez Sall i EcoRI przy trawieniu pTTQ9. Przy klonowaniu tej „kasety oligonukleotydowej w wektorze pTTQ9 miejsce Sall nie odtwarza się, a miejsce EcoRI jest utrzymywane. Kaseta koduje pierwszych 13 aminokwasów sekwencji sygnałowej białka zewnętrznej błony komórkowej Omp-A E. coli poprzedzonych przez miejsce wiązania rybosomu Shine Dalgarno genu OmpA. Ponadto obecne są miejsca dla enzymów restrykcyjnych Xbal, MunI, Styl i SplI. Miejsca Munl i Styl są w obrębie regionu kodującego sekwencję sygnałową OmpA i są przeznaczone jako miejsca do klonowania 5' dla wstawienia genów. Dwa oligonukleotydy, które tworzą tę kasetę, łączy się razem przez zmieszanie przy stężeniu 5 pmoli/pl i ogrzewanie w łaźni wodnej do 95°C przez 3 minuty, a następnie powolne schłodzenie do temperatury pokojowej. Połączone sekwencje poddaje się ligacji z pTTQ9 przeciętym Sall/EcoRI. Otrzymany w rezultacie plazmid pośredni, nazwany, pTQOmp, sprawdzono przez sekwencjonowanie DNA.
(b) Otrzymywanie i ligacja fragmentu
Plazmid pTTO-1 skonstruowano przez ligację jednego fragmentu DNA z plazmidu pACYCT84 z dwoma fragmentami wytworzonymi z pTQOmp. Plazmid pACYC184 otrzymano z New England Biolabs, a jego mapa restrykcyjna jest pokazana na Fig. 16. Próbki (2 pg) strawiono całkowicie enzymem restrykcyjnym Styl, a następnie traktowano nukleazą Mung Bean; traktowanie takie doprowadza do tępych końców przez odcięcie wystających końców 5'. Po ekstrakcji fenolem i wytrąceniu etanolem, DNA strawiono enzymem PvuII, wytwarzając fragmenty 2348, 1081, 412 i 403 bp. Fragment 2348 bp oczyszczono przez elektroforezę w żelu agarozowym. Fragment ten koduje marker oporności na tetracyklinę i początek replikacji p15A. Fragment traktowano następnie alkaliczną fosfatazą z jelita cielęcego w celu usunięcia 5'-końcowych fosforanów, zapobiegając w ten sposób ligacji cząsteczki samej ze sobą.
Próbkę (2 pg) plazmidu pTQOmp strawiono enzymami Sspl i EcoRI i fragment 2350 bp odczyszczono od niepożądanych fragmentów 2040 bp i 170 bp po elektroforezie w żelu agarozowym. Fragment ten koduje region terminacji transkrypcji i gen laclq. Inną próbkę (2 pg) pTQOmp strawiono EcoRI i XmnI, wytwarzając fragmenty 2289, 1670, 350 i 250 bp. Fragment 350 bp, kodujący promotor tac, sekwencję sygnałową OmpA i miejsce wielokrotnego klonowania, oczyszczono z żelu. Trzy fragmenty poddano następnie ligacji, przy użyciu w przybliżeniu równomolowej ilości każdego z fragmentów, w celu wytworzenia plazmidu pTTO-1. Wszystkie miejsca połączenia przy klonowaniu zweryfikowano przez sekwencjonowanie DNA. Mapa restrykcyjna tego plazmidu jest pokazana na Fig. 17. Plazmid pTTO-2 utworzono następnie przez wstawienie DNA domeny stałej łańcucha lekkiego kappa ludzkiej Ig. Został on otrzymany jako fragment restrykcyjny SplI-EcoRI z plazmidu pHC132 i wstawiony w odpowiednich miejscach plazmidu pTTO-1. Plazmid pTTO-2 jest pokazany na Fig. 18.
Wstawienie regionów zmiennych humanizowanego hTNF40 do pTTO-2
Region zmienny łańcucha lekkiego hTNF40gLl (SEK NR ID:8) otrzymano przez odzysk w reakcji PCR z odpowiedniego wektora do ekspresji w komórkach ssaczych pMR10.1. Sekwencja liderowa OmpA zastępuje natywny lider Ig. Sekwencja starterów do PCR jest pokazana poniżej:
PL 218 516 B1 starter 5':
CGCGCGGCAATTGCAGTGGCCTTGGCTGGTTTCGCTACCGTAGCGCAAGCT
GACATTCAAA TGACCCAGAGCCC (SEK NR ID:79) starter 3':
TTCAACTGCTCATCAGATGG (SEK NR ID:80)
Po reakcji PCR w warunkach standardowych, produkt oczyszczono, strawiono enzymami MunI i SplI, a następnie oczyszczono w żelu. Oczyszczony fragment został następnie wstawiony w miejsca Munl i SplI pTTO-2 w celu wytworzenia plazmidu przejściowego dla łańcucha lekkiego TTO(hTNF40L).
Region zmienny łańcucha lekkiego gh3hTNF40.4 otrzymano w ten sam sposób z wektora pGamma-4.
Sekwencja starterów do PCR jest pokazana poniżej:
starter 5':
GCTATCGCAATTGCAGTGGCGCTAGCTGGTTTCGCCACCGTGGCGCAAGCT
GAGGTTCAGC TGGTCGAGTCAGGAGGC (SEK NR ID:81) starter 3':
GCCTGAGTTCCACGACAC (SEK NR ID:82)
Po reakcji PCR produkt oczyszczono, strawiono enzymami Nhel i Apal, a następnie subklonowano do wektora pDNAbEng-G1 (Fig. 19). Po weryfikacji przez sekwencjonowanie DNA, łańcuch ciężki strawiono enzymem EcoRI i subklonowano w miejscu EcoRI pTTO(hTNF40L) z wytworzeniem plazmidu do ekspresji w E. coli pTTO(hTNF40).
Optymalizacja sekwencji międzygenowej dla ekspresji zmodyfikowanego Fab
Ekspresja zmodyfikowanego Fab w wektorze pTTO następuje z dwucistronowego mRNA kodującego najpierw łańcuch lekki, a następnie łańcuch ciężki. Sekwencja DNA między dwoma genami (sekwencja międzygenowa, ang. intergenic sequence, IGS) może wpływać na poziom ekspresji łańcucha ciężkiego przez wpływanie na szybkość inicjacji translacji. Na przykład, krótka sekwencja międzygenowa może doprowadzać do powiązania translacyjnego między łańcuchami lekkim i ciężkim, ponieważ przeprowadzający translację rybosom może nie w pełni oddysocjować od mRNA po zakończeniu syntezy łańcucha lekkiego przed rozpoczęciem syntezy łańcucha ciężkiego. Siła miejsca wiązania rybosomu Shine Dalgarno (SD) (homologia do 16S rRNA) może mieć również wpływ, podobnie jak odległość i skład sekwencji między SD i kodonem startowym ATG. Potencjalna struktura drugorzędowa mRNA wokół ATG jest innym ważnym czynnikiem; ATG powinien być w pętli, a nie uwięziony w obrębie trzonka, podczas gdy odwrotnie jest w przypadku SD. Zatem przez modyfikowanie składu i długości IGS możliwe jest modyfikowanie siły inicjacji translacji, a zatem poziomu wytwarzania łańcucha ciężkiego. Jest prawdopodobne, że optymalna szybkość inicjacji translacji musi być osiągnięta, aby uzyskać maksymalną ekspresję łańcucha ciężkiego danego zmodyfikowanego Fab. Na przykład, dla jednego zmodyfikowanego Fab, może być tolerowany wysoki poziom ekspresji, ale dla innego zmodyfikowanego Fab z inną sekwencją aminokwasową, wysoki poziom ekspresji może okazać się toksyczny, prawdopodobnie z powodu różnic w wydajności wydzielenia i fałdowania. Z tego powodu zaprojektowano serie czterech sekwencji międzygenowych (Fig. 20), umożliwiających określenie empiryczne optimum IGS dla zmodyfikowanych Fab opartych na hTNF40. IGS1 i IGS2 mają bardzo krótkie sekwencje międzygenowe (-1 i +1, odpowiednio) i można się spodziewać, że będą dawały ściśle powiązaną translację; sekwencje SD (podkreślone) różnią się niewiele. Te dwie sekwencje najprawdopodobniej nie będą dawały wysokich poziomów inicjacji translacji. IGS3 i IGS4 mają większą odległość między kodonami start i stop (+13) i różnią się składem sekwencji; IGS3 ma mocniejszą sekwencję SD. Wszystkie sekwencje przebadano pod kątem struktury drugorzędowej (z zastosowaniem programu m/fold) i optymalizowano w możliwym zakresie jak to tylko możliwe; jednakże przy ścisłym powiązaniu translacji dwóch łańcuchów brak dysocjacji rybosomów oznacza, że mRNA może nie być nagi, co zapobiega tworzeniu struktury drugorzędowej.
PL 218 516 B1
Klonowanie wariantów IGS
Kaseta IGS pokazana na Fig. 20 jest oflankowana miejscami do klonowania SacI i MunI. Zostały one wbudowane przez połączenie komplementarnych par oligonukleotydów. Fragment wektora otrzymano przez trawienie pTTO(hTNF40) SacI i Notl, a fragment łańcucha ciężkiego otrzymano przez strawienie pDNAbEngG1 (hTNF40H) Munl i Notl. Przeprowadzono potrójną ligację, używając równomolarnych ilości dwóch fragmentów restrykcyjnych i około 0,05 pmoli każdej z kaset połączonych oligonukleotydów. Powstają w ten sposób cztery plazmidy ekspresyjne pTTO(hTNF40 IGS-I), pTTO(hTNF40 IGS-2), pTTO(hTNF40 IGS-3), pTTO(hTNF40 IGS-4).
Analiza ekspresji w kolbach z wytrząsaniem
Cztery plazmidy transformowano do szczepu E. coli W3110 razem z oryginalnym konstruktem ekspresyjnym, a następnie analizowano pod kątem ekspresji w kolbach z wytrząsaniem jak opisano. Wyniki typowego doświadczenia są pokazane na Fig. 21. Różne sekwencje międzygenowe nadają różne profile ekspresji. IGS1 i IGS2 akumulują szybko peryplazmatycznie zmodyfikowany Fab z pikiem po około 1 godzinie po indukcji, po czym uzyskiwany poziom spada. Pik jest większy i spadek ostrzejszy dla IGS1. Wyniki te są zgodne z wysokim poziomem syntezy, co jest spodziewane dla ścisłego powiązania translacyjnego dla tych konstruktów. IGS1 wydaje się nadawać wyższy poziom ekspresji łańcucha ciężkiego niż IGS2. W tym przypadku, wydaje się, że wysoki poziom ekspresji jest słabo tolerowany, ponieważ poziom ekspresji peryplazmatycznej spada po osiągnięciu piku po 1 godzinie. Jest to widoczne dla profilu wzrostu hodowli IGS1 (nie pokazane), który osiąga pik po 1 godzinie po indukcji przed spadkiem, sugerując śmierć i lizę komórek. IGS3 akumuluje zmodyfikowany Fab wolniej, ale osiąga pik po 32 godzinach po indukcji z wyższą wartością piku (325 ng/ml/OD) przed spadkiem. Wzrost tej hodowli był kontynuowany do 3 godzin po indukcji i osiągnął wyższy pik biomasy (nie pokazane). Pozostaje to w zgodzie z niższym poziomem syntezy łańcucha ciężkiego. IGS4 akumuluje materiał z mniejszą szybkością i nie osiąga piku produktywności 3 innych konstruktów. Wszystkie warianty znacząco przewyższają oryginalny wektor. Hipoteza, że różne sekwencje IGS nadają różne szybkości inicjacji translacji, jest poparta tymi wynikami eksperymentalnymi. Dla zmodyfikowanego Fab opartego na hTNF40 wydaje się, że wyższe tempo inicjacji translacji łańcucha ciężkiego jest słabo tolerowane, a zatem nie jest optymalne. Niższe tempo, takie jak nadane przez IGS3, prowadzi do lepszej charakterystyki wzrostu i w konsekwencji wyższej wydajności akumulacji w czasie.
Po porównaniu wydajności wytwarzania w fermentorze, konstrukt IGS3 został wybrany jako dający najwyższą wydajność i nazwany pTTO(CDP870), patrz Fig. 22. Łańcuch ciężki kodowany przez plazmid pTTO(CDP870) ma sekwencję podaną w SEK NR ID: 115, a łańcuch lekki ma sekwencję podaną w SEK NR ID: 113.
PEGylowanie zmodyfikowanego Fab z przeszczepionymi CDR opartego na hTNF40
Oczyszczone zmodyfikowane Fab połączono miejscowo specyficznie z rozgałęzioną cząsteczką PEG. Uzyskano to, przez aktywację pojedynczej reszty cysteinowej w skróconym regionie zawiasowym zmodyfikowanego Fab, a następnie reakcję z (PEG)-lizylomaleimidem, jak wcześniej opisano (A.P. Chapman i wsp., Nature Biotechnology 17,780-783; 1999). PEGylowana cząsteczka jest pokazana na Fig. 13 i jest nazwana związkiem CDP870.
Skuteczność PEGylowanego zmodyfikowanego Fab z przeszczepionymi CDR opartego na hTNF40(CDP870) w leczeniu reumatoidalnego zapalenia stawów
CDP870 ma długi okres półtrwania wynoszący około 11 dni. Ocenialiśmy bezpieczeństwo i skuteczność podawanego dożylnie CDP870 w randomizowanych testach z podwójnym placebo i kontrolowanym zwiększaniem dawki u pacjentów z RA.
Metody
Pacjenci w wieku między 18 a 75 lat i którzy spełnili zrewidowane w 1987 r przez American College of Rheumatology (ACR) kryteria dla reumatoidalnego zapalenia stawów (RA) (Arnett i wsp., Arthritis Rheum. 31, 315-324, 1988) rekrutowali się z pacjentów ambulatoryjnych klinik reumatologicznych w Londynie, Cambridge, Norfolk i Norwich (Wielka Brytania). Wymogiem było, aby pacjenci mieli aktywną klinicznie chorobę, co było zdefiniowane na podstawie 3 następujących kryteriów: >6 bolesnych albo czułych stawów; >45 minut sztywności porannej i szybkość sedymentacji erytrocytów (ESR) >28 mm/godz. Musieli wykazywać brak odpowiedzi na co najmniej jeden lek przeciwreumatyczny modyfikujący przebieg choroby (DRARD) i mieć odstawione leczenie przez co najmniej 4 tygodnie. Kortykosteroidy były dopuszczone, jeżeli dawka wynosiła >7,5 mg/dzień prednizolonu. Kobiety w ciąży, kobiety karmiące, kobiety, które potencjalnie mogły mieć dziecko nie używając skutecznych metod antykoncepcji były wykluczone. Wykluczono również pacjentów jeżeli wcześniej mieli nowotwór, jednoczesne
PL 218 516 B1 poważne niekontrolowane stany chorobowe, wcześniejsze niepowodzenie terapii neutralizującej TNFa, lub alergię na glikol polietylenowy. Przed zarejestrowaniem chorego na listę badań od każdego z nich otrzymano po poinformowaniu pisaną zgodę. Badanie były zatwierdzone przez lokalne komitety etyczne.
Protokół leczenia:
pacjentów z RA podzielono na 3 grupy, każda z nich miała otrzymać wzrastające dawki testowanego leku (1, 5 lub 20 mg/kg). Każdą grupę liczącą 12 osób podzielono losowo na 8 otrzymujących CDP870 i 4 otrzymujące placebo. CDP870 podawano jako pojedynczy dożylny wlew (ogółem 100 ml) w czasie 60 minut. Placebo (octan sodu) podawano podobnie jako pojedynczy dożylny wlew 100 ml w czasie 60 minut. Leczenie podawano ambulatoryjnie. Po 8 tygodniach wszyscy pacjenci mieli okazję otrzymać wlew 5 lub 20 mg/kg CDP870 w sposób jawny.
Ocena kliniczna
Aktywność choroby RA oceniano opierając się na podstawowym zestawie danych dla 28 stawów według World Health Organization and International League of Associations for Rheumatology (Boers i wsp., J. Rheumatol Supplement, 41, 86-89, 1994) i European League Against Rheumatism (EULAR) (Scott i wsp., Clin. Exp. Rheumatol., 10, 521-525, 1992). Zmiany w aktywności choroby oceniano wskaźnikiem aktywności choroby, ang. Disease Activity Score (Prevoo i wsp., Arthritis Rheum. 38, 44-48, 1995) i kryteriami odpowiedzi ACR (Felson i wsp., Arthritis Rheum. 38, 727-735, 1995). Oceny przeprowadzono przed leczeniem i po 1, 2, 4, 6 i 8 tygodniach po leczeniu. Pacjenci byli również badani pod kątem bezpieczeństwa i tolerancji badanego leku. Hematologia, biochemia, przeciwciała anty-CDP870 i skutki uboczne były badane przy każdej wizycie.
Stężenie CDP870 w osoczu i przeciwciała anty-CDP870
CDP870 oznaczano w enzymatycznym teście immunosorpcyjnym (ELISA). Seryjne rozcieńczenia osocza pacjentów inkubowano w płytce do mikromiareczkowania (Nunc) opłaszczonej zrekombinowanym ludzkim TNFa (Strathmann Biotech GmbH, Hannover). Wyłapane CDP870 ujawniano skoniugowanymi z peroksydazą przeciwciałami anty-ludzki łańcuch lekki kappa (Cappel, ICN), a następnie substratem tetrametylobenzydyny (TMB).
Przeciwciał wobec CDP870 poszukiwano (przy rozcieńczeniu osocza 1/10) przy zastosowaniu kanapkowego testu ELISA z dwoma antygenami i biotynylowanym CDP870 jako drugą warstwą. Związane przeciwciała ujawniano z zastosowaniem HRP-streptawidyna i substratu TMB. Test wykalibrowano stosując jako standard hiperaktywną w reakcji immunologicznej króliczą IgG. Jednostka aktywności odpowiada 1 pg standardu króliczego.
Analiza statystyczna
Badanie miało charakter poznawczy i wielkość próbki opierała się na wcześniejszych doświadczeniach z podobnymi czynnikami. Skuteczność CDP870 analizowano przez obliczenie wskaźnika aktywności choroby (DAS) i odpowiedzi ACR20/50 po wyrażeniu chęci leczenia i w trakcie przeprowadzania protokołu przy użyciu tajnych procedur testowych. Wskaźnik aktywności choroby wyliczono jak następuje: DAS = 0,555 x pierwiastek kwadratowy (28 wrażliwych stawów) + 0,284 x pierwiastek kwadratowy (28 opuchniętych stawów) + 0,7 x In(ESR) + 0,0142 x (ogólna ocena pacjenta). Najpierw spulowane grupy aktywne porównano z placebo. Jeżeli porównanie było na poziomie 5% istotności, każdą grupę dawkowania porównywano z placebo. Wszystkie te porównania prowadzono dwukierunkowo przy poziomie istotności 5%.
Wszystkie wartości P pochodziły z analizy badawczej i nie powinny być stosowane do konkluzywnej interpretacji.
Wyniki
Demografia:
Wytypowano 36 pacjentów z RA. Szczegóły demograficzne są podane w tabeli 6. Średnia wieku wynosiła 56 lat, a 30 pacjentów to kobiety. Średnia trwania RA wynosiła 13 lat, a 21 pacjentów było reumatologicznie dodatnich. Pacjenci w różnych grupach mieli podobną charakterystykę demograficzną. W okresie dawkowania próby ślepej, 6/12 pacjentów traktowanych placebo wycofało się z badań z powodu pogarszającego się RA >4, po tygodniach dawkowania. 2/24 pacjentów leczonych CDP870 wycofało się, w obydwu przypadkach w grupie 1 mg/kg, z powodu pogorszenia RA/utraty możliwości monitorowano >4 tygodni po dawkowaniu. Różnica była statystycznie istotna (p=0,009, test dokładności Fishera).
PL 218 516 B1
T a b e l a 6: Szczegóły demograficzne (średnia ± odchylenie standardowe)
Liczba Płeć (M:F) Wiek Czas trwania choroby Wskaźnik reumatologiczny Liczba wcześniejszych DMARD
Placebo 12 1:11 51±8 12±8 8(67%) 5±1
1 mg/kg 8 1:7 59±7 12±7 4(50%) 4±1
5 mg/kg 8 2:6 54±13 13±5 5(63%) 5±2
20 mg/kg 8 2:6 61±11 14±13 4(50%) 4±2
Skuteczność kliniczna:
Udział pacjentów z polepszeniem ACR20 dla populacji poddanej badaniu po przeprowadzeniu ostatniej obserwacji wynosiła 16,7, 50, 87,5 i 62,5% po podaniu placebo, 1, 5 i 20 mg/kg CDP870 (wynik skojarzonego leczenia p=0,012) po 4 tygodniach i 16,7, 25, 75 i 75% (p=0,032) po 8 tygodniach. Zmniejszenie wskaźników DAS (mediana) dla populacji poddanej badaniu po ostatniej przeprowadzonej obserwacji wynosiło 0,15, 1,14, 1,91 i 1,95 po placebo, 1, 5 i 20 mg/kg CDP870 (wynik skojarzonego leczenia p=0,001) po 4 tygodniach i 0,31, 0,09, 2,09 i 1,76 (p=0,008) po 8 tygodniach (Fig. 23). Zmiany w poszczególnych składnikach z zestawu wskaźników według World Health Organization and International League of Associations for Rheumatology są pokazane na Fig. 24.
Po jawnym dawkowaniu CDP870, uzyskano podobne korzystne wyniki. Spośród 36 pacjentów wytypowanych do badania, 32 otrzymało drugi wlew CDP870. Udział pacjentów z polepszeniem ACR20 w stosunku do pierwszego wlewu wynosił 72,2 i 55,6% po 5 i 20 mg/kg CDP870 po 4 tygodniach i 55,6 oraz 66,7% po 8 tygodniach.
Skutki uboczne
Leczenie było dobrze tolerowane bez reakcji związanej z wlewem. Nie zanotowano żadnych reakcji alergicznych ani zmian skórnych. W fazie podwójnej ślepej próby, wystąpiło 19, 38, 8 i 14 skutków ubocznych w placebo, 1, 5 i 20 mg/kg grupy, odpowiednio. Najczęściej był to ból głowy, z 9 epizodami u 5 pacjentów (1 placebo, 3 przy 1 mg/kg, 1 przy 20 mg/kg). U jednego pacjenta, który otrzymywał placebo i 3 pacjentów, którzy otrzymywali CDP870 (1 przy 5 mg/kg i 2 przy 20 mg/kg) rozwinęły się infekcje dolnych dróg oddechowych. Zostały one odnotowane jako łagodne albo umiarkowane. Były leczone antybiotykami doustnymi i ustąpiły po okresie 1-2 tygodni. U trzech pacjentów, po jednym w grupach 1 i 5 mg/kg i u jednego w grupie 20 mg/kg rozwinęła się infekcja przewodu moczowego 1-2 miesięcy po leczeniu CDP870. Jednym skutkiem ubocznym opisanym jako poważny był epizod bólu szyi mający miejsce 3 dni po wlewie 1 mg/kg. Zwiększenie poziomu przeciwciał anty-jądrowych obserwowano u 4 pacjentów: 1 w grupie placebo (ujemny do 1/40), 2 w grupie 1 mg/kg (ujemny do 1/40, ujemny do 1/80) i 1 w grupie 20 mg/kg (ujemny do 1/40) . Żadnej zmiany nie stwierdzono dla przeciwciał antyDNA lub antykardiolipina.
Stężenie CDP870 w osoczu i poziomy Anty-CDP870
Jak się spodziewano, dla wszystkich dawek CDP870, pik stężenia w osoczu występował na zakończenie wlewu i był proporcjonalny do dawki z następującym później powolnym spadkiem stężenia w osoczu. Profil stężenia CDP870 w osoczu wydawał się być bardzo podobny do obserwowanego uprzednio u ochotników, gdzie okres półtrwania obliczono na około 14 dni. Przy ponownym dawkowaniu, zaobserwowano podobny profil jak przy wlewie pojedynczej dawki.
Po jednym dożylnym wlewie poziomy przeciwciał anty-CDP870 były niskie albo niewykrywalne.
Dyskusja
Neutralizacja TNFα jest skuteczną strategią leczenia w RA. Obecnie wymaga to stosowania czynników biologicznych, takich jak chimerowe mAb albo rozpuszczalne ludzkie białko fuzyjne receptor/ludzki Fc, których wytwarzanie jest kosztowne. Terapeutyczny czynnik neutralizujący TNFα pow inien wiązać się z TNFα z wysokim powinowactwem i mieć długi okres półtrwania w osoczu, niską antygenowość i wysoki poziom tolerancji i bezpieczeństwa. Powinien on być również dostępny dla wszystkich pacjentów z RA, którzy odnieśliby korzyść z blokowania TNFα. Jedna z technologii, którą można osiągnąć te cele, jest skoniugowanie fragmentu przeciwciała wiążącego TNFα wytwarzanego w E. coli
PL 218 516 B1 z glikolem polietylenowym. W tym wstępnym badaniu stwierdziliśmy, że CDP870, PEGylowany, antyTNFa, zmodyfikowany Fab jest skuteczny i dobrze tolerowany przez pacjentów z RA.
Badania in vitro pokazały, że CDP870 ma podobną aktywność neutralizującą TNFa do mysiego przeciwciała rodzicielskiego anty-TNFa. Badanie to potwierdza, że CDP870 zmniejsza zapalenie i łagodzi objawy RA. Polepszenie stanu klinicznego mierzone na podstawie kryteriów odpowiedzi ACR20 w grupach 5 i 20 mg/kg (75%, 75%) było porównywalne do entraceptu (60%) (Moreland i wsp., Annals Int. Med., 130, 478-486, 1999) i intliksimabu (50%) (Maini i wsp., Lancet, 354, 1932-1939, 1999). Przy średnim i wysokim poziomie testowanych dawek, działanie terapeutyczne trwało 8 tygodni, co jest porównywalne z innymi wcześniejszymi mAbs (Elliott i wsp., Lancet, 344, 1105-1110, 1994 i Rankin i wsp., Br. J. Rheumatol. 34, 334-342, 1995). Poprzednie badania pokazały, że działanie terapeutyczne przeciwciała anty-TNF-a jest związane z jego okresem półtrwania w osoczu i wytwarzaniem krążących przeciwciał (Maini i wsp., Arthritis Rheum. 38 (Supplement): S186 1995 (Abstract)). Nasze badania pokazały, że CDP870 ma okres półtrwania w osoczu wynoszący 14 dni, co jest odpowiednikiem dla okresu całego przeciwciała (Rankin i wsp., (jak wyżej)) i jest znacznie dłuższy niż w przypadku okresu półtrwania nieskoniugowanych fragmentów Fab'. Ponadto, CDP870 wytwarza jedynie bardzo niskie poziomy odpowiedzi w postaci przeciwciał.
Jednym z ważnych celów tego badania jest sprawdzenie tolerancji i bezpieczeństwa podawania tego PEGylowanego Fab'. W naszych badaniach CDP870 okazał się być dobrze tolerowany. Jednakże dalsze badania będą wymagane do przetestowania toksyczności długoterminowej, a w szczegó lności ryzyka choroby demielizacyjnej, infekcji i zmian skórnych, które były notowane w przypadku etanercept i infliximab.
Podsumowując, CDP870 jest skuteczny terapeutycznie i był dobrze tolerowany w tych krótkoterminowych badaniach.
PL 218 516 B1
Lista sekwencji <110> CELLTECH CHIROSCIENCE LIMITED <120>
BIOLOGICAL PRODUCTS <13D>
PO21741WO <140>
<141>
<160 115 <170 Patentln wersja 2.1 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220 <223> opis sekwencji sztucznej: hTNF40 CDRH1 <400 l
Asp Tyr Gly Met Asn 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: hTNF40/ludzkie hybrydowe CDRH2 <400> 2
Trp Ile Asn Thr Tyr Ile Gly Glu Pro Ile Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15
Gly <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>
Opis sekwencji sztucznej: hTNF40 CDRH3 <400 3
Gly Tyr Arg Ser Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5
PL 218 516 B1 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: hTNF40 CDRL1 <400> 4
Lys Ala Ser Gin Asn Val Gly Thr Asn Val Ala 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> se]ęWencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: hTNF40 CDRL2 <4O0> 5
Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: hTNF40 CDRL3 <400> 6
Gin Gin Tyr Asn Ile Tyr Pro Leu Thr 1 5 <210> 7 <211> 17 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> opis sekwencji sztucznej: hTNF40 CDRH2 <400> 7
Trp Ile Asn Thr Tyr He Gly Glu Pro Ile Tyr Val Asp Asp Phe Lys 1 5 10 Η
Gly <210> 8
PL 218 516 B1 <211> 321 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <22 0> <221> CDS <222> (1) .
(321) <220> , <223> opis sekwencji sztucznej hTNP40-gLl <400> 8 gac aft caa atg acc cag agc cca tcc agc ctg agc gca tct gta gga
Asp Ile Sin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
5 10 15 gac cgg gtc acc atc act tgt aaa gcc agt cag aac gta ggt act aac
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asn Val Gly Thr Asn
25 30 gta gcc tgg tat cag caa aaa cca ggt aaa gcc cca aaa gcc ctc atc Val Ali'Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ala Leu Ile
40 45
144
tac agt gcc tct ttc ctc tat ag# ggt gta cca tac agg ttc agc gga 192
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly
50 55 60
tcc ggt agt ggt act gat ttc acc ctc acg atc agt agc ctc cag cca 240
Ser Gly Ser eiy Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro
65, 70 75 80
gaa gat ttc gcc act tat tac tgt caa cag tat aac atc tac cca etc 28B
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Asn Ile Tyr Pro Leu
8-5 90 9-5
aca ttc ggt cag ggt act aaa gta gaa atc aaa 321
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 9 <211> 321 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<221> CDS <222> (1)..(321] <223> opis sekwencji sztucznej: hTNF40-gL2 <400> 9 . .
gac afct caa atg acc cag agc cca tcc agc ctg agc gca tct gta gga
Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly <220>
PL 218 516 B1
1 5 10 15
gac cgg gtc acc atc act tgt aaa gcc agt cag aac gta ggt act aac 96
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asn Val Gly Thr Asn
20 25 30
gta gcc tgg tat cag caa aaa cca ggt aaa gcc cca aaa ctc ctc atc 144
Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
tac agt gcc tct ttc ctc tat agt ggt gta cca tac agg ttc agc gga 192
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly
50 55 60
tcc ggt agt ggt act gat ttc acc ctc acg atc agt agc ctc cag cca 240
Ser Gly Ser G-ly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro
65 70 75 80
gaa gat ttc gcc act tat tac tgt caa cag tat aac atc tac cca ctc 288
Glu Asp Phe Ala Thr. Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Asn Ile Tyr Pro Leu
85 90 95
aca ttc ggt cag ggt act aaa gta gaa atc aaa 321
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 10 <211> 354 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna
<220>
<221> CDS
<222> (1) ..(354)
<22 0>
<223> Opis sekwencji sztucznej: ghlhTNF40.4 (Fig. 10)
<400> 10
cag gtg cag ctg gtc cag tca gga gca gag gtt aag aag cct ggt gct 48
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
tcc gtc aaa gtt tcg tgt aag gcc tca ggc tac gtg ttc aca gac tat 96
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys' Ala Ser Gly Tyr Val Phe Thr Asp Tyr
20 25 30 ’
ggt atg aat tgg gtc aga cag gcc ccg gga caa ggc ctg gaa tgg atg 144
Gly Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met
~ 35 40 45 *
ggt tgg att aat act tac att gga gag cct att tat gct caa aag ttc 192
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Ile Gly Glu Pro Ile Tyr Ala Gin Lys Phe
55 eo
PL 218 516 B1 cag ggc aga gtc acg ttc act eta gac acc tcc aca age act gca tac 240
Gin Gly Arg Val Thr Phe Thr Leu Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
70 75 80 atg gag ctg tca tefc ctg aga tcc gag gac acc gca gtg tac tat tgt 288
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys ’ 85 90 95 get aga gga tac aga tet tat gee atg gac tac tgg gge cag ggt acc 336
Al-a Arg Gly Tyr Arg Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110 eta gtc aca gtc tcc tca Leu Val Thr Val Ser Ser
115
354 <210> 11 <211> 354 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<221> CDS <222> (1) .. (354) <220>
<223> 0 pis sek wem cji szt ucz nej : gh3hT 'NF40.4 (Fi g. ii)
<40( )> i: L
gag gtt cag ctg gtc gag tca gga ggc ggt ctc gtg cag cct ggc gga
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly leu Val Gin Pro Gly Gly
1 5 10 15
tca ctg aga ttg tcc tgt get gca tet ggt tac gtc ttc aca gac tat
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Val Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
gga atg aat Asn 35 tgg Trp gtt Val aga cag gee ccg gga aag ggc ctg gaa tgg atg Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 144
Gly Met Arg Gin
40 45
ggt tgg att aat act tac att gga gag cct att tat get gac age gtc 192
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Ile Gly Glu Pro Ile Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
aag ggc aga ttc acg ttc tet eta gac aca tcc aag tca aca gca tac 240
Lys Gly Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr
70 75 Θ0
ctc Leu caa Gin atg Met aat age ctg aga gca gag gac acc gca gtg tac tat tgt 288
Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 95 Cys
65 90
get aga gga tac aga tet tat gee atg gac tac tgg ggc cag ggt acc 336
PL 218 516 B1
354
Ala Arg Gly Tyr Arg Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110 eta gtc aca gtc tcc tca Leu Val Thr Val Ser Ser
115 <210> 12 <211> 9 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej <400> 12 gccgccacc część sekwencji startera <210> 13 <211> 25 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: starter CHI <400> 13 atgaaatgca gctgggtcat sttett <210> 14 <211> 26 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: starter CH2 <400> 14 atgggatgga getrtateat sytett <210> 15 <211> 26 . <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> opis sekwencji sztucznej: starter CH3 <400> 15 atgaagwtgt ggttaaactg ggtttt
PL 218 516 B1 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: starter CH4 <400> 16 atgractttg ggytcagctt grt <210> 17 <211> 26 <212> DNA <213> sekwencja sztuczna t , PUC <223> Opis sekwencji sztuczne]: starter cno <4 00> 17 atggactcca ggctcaattt agtttt <210> 18 <211> 26 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223>.. Opis sekwencji sztucznej: starter CH6 <400> 18 atggctgtcy trgsgctrct cttctg 26 <210> 19 <211> 25 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: starter CH7 <400> 19 atggratgga gckggrtctt tmtctt <210> 20 <211> 23 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: starter CH8 <400> 20
PL 218 516 B1 stgagagtgc tgattctttt gtg <210> 21 <211> 26 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: starter CH9 <400> 21 atggmttggg tgtggamctt gctatt <210> 22 <211> 26 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna .
<220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: starter CH10 <400> 22 atgggcagac ttacattctc attcct <210> 23 <211> 28 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220> . ,, <223> OP1S sekwencji sztucznej; starter CH11 <400> 23 atggattttg ggctgatttt ttttattg <210 24 <211> 26 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220> , , , <223> Opis sekwencji sztucznej: starter CH12 <400> 24 atgatggtgt taagtcttct gtacct <210> 25 <211> 21 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220> __ <223> Opis sekwencji sztucznej: starter końca 5' <400> 25
PL 218 516 B1 gcgcgcaagc ttgccgccac c <210> 26 <211> 29 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<22 > Opis sekwencji sztucznej: starter CLI <400 26 atgaagttgc ctgttaggct gttggtgct <210> 27 <211> 29 <212> DNA <2i3> gekwencja sztuczna <220> , . , nTo <223> Opis sekwencji sztucznej: starter luz <400> 27 atggagwcag aeaeactcct gytatgggt <210 28 <211> 23 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220 <223> Opis sekwencji sztucznej: starter CL3 <400> 28 atgagtgtgc tcactcaggt cct <210> 29 <211> 26 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220 , <223> Opis sekwencji sztucznej: starter CL4 <400> 29 atgaggrccc ctgctcagwt tyttgg <210> 30 <211> 29 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <223> Opis sekwencji sztucznej: starter CL5 <400> 30 atggatttwc aggtgcagat twtcagctt
PL 218 516 B1 <210> 31 <211> 29 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <223> °Pis sekwencji sztucznej: starter CL5A <400> 31 atggatttwc argtgcagat twtcagctt <210> 32 <211> 26 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> opis sekwencji sztucznej: starter CL6 <400> 32 atgaggtkcy ytgytsagyt yctgrg <210> 33 <211> 23 <212> DNA <213> sekwencja sztuczna <223> Opis sekwencji sztucznej: starter CL 7 <400> 33 atgggcwtca agatggagtc aca <210> 34 <211> 29 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <223> Opis sekwencji sztucznej: starter CL8 <400> 34 atgtggggay ctktttycmm tttttcaat <210> 35 <211> 24 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna .<220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: starter CL9 <400> 35 atggtrtccw casctcagtt cctt <210> 36 <211> 26
PL 218 516 B1 <212> DNA <213> Sekwencj a sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: starter CLIO <400> 36 atgtatatat gtttgttgtc tatttc <210> 37 <211> 26 <212> DNA <213> Artificija sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: starter CLII <400> 37 atggaagccc cagctcagct tctctt <210> 36 <211> 26 <212> -DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: starter CL12A <400> 38 atgragtywc agacccaggt cttyrt <210> 39 <211> 26 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220> , <223> Opis sekwencji sztucznej: starter CL123 <400> 39 atggagacac attctcaggt ctttgt <210> 40 <211> 26 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220> . <223> Opis sekwencji sztucznej: <400> 40 atggattcac aggcccaggt tcttat starter CL13 <210> 41 <211> 26 <212> DNA
PL 218 516 B1 <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> opis sekwencji sztucznej: starter CL14 <400> 41 atgatgagtc ctgcccagtt cctgtt <210> 42 <211> 29 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: starter CL15 <400> 42 atgaatttgc ctgttcatct cttggtgct <210> 43 <211> 29 <212> DNA <2J-3> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: starter CL16 <400> 43 atggattttc aattggtcct catctcctt <210> 44 <211> 26 <212> DNA <213> se]<wencja sztuczna .
<220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: starter CL17A <400> 44 atgaggtgcc tarctsagtt cctgrg <210> 45 <211> 26 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: starter CL17B <400> 45 atgaagtact ctgctcagtt tctagg <210> 46 <211> 26 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna
PL 218 516 B1 <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: starter CL17C <400> 46 atgaggcatt ctcttcaatt cttggg <210> 47 <211> 21 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: starter końca 5' <400> 47 ggactgttcg aagccgccac c <210> 48 <211> 30 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: starter CL12 <400> 48 ggatacagtt ggtgcagcat ccgtacgttt <210> 49 <211> 37 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: starter R2155 <400> 49 gcagatgggc ccttcgttga ggctgmrgag acdgtga <210> 50 <211> 24 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: starter R1053 <400> 50 gctgacagac taacagactg ttcc <210> 51 <211> 18 .
<212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: starter R720
PL 218 516 B1 <400> 51 gctctcggag gtgctcct <210> 52 <211> 70 <212> DNA <213> sekwencja sztuczna <220>
<223> opis sekwencji sztucznej: oligonukleotyd P7982 <400> 52 gaattcaggg tcaccatcac ttgtaaagcc agtcagaacg taggtactaa tatcagcaaa cgtagcctgg 60 70 <210 53 <211> 71 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
P7983 <223> Opis sekwencji sztucznej: oligonukleotyd <400> 53 atagaggaaa gaggcactgt agatgagggc ttttggggct ttacctggtt ccaggctacg t <210 54 <211> 71 <212> DNA <213> sekwencja sztuczna <220> . .
<223> Opis sekwencji sztucznej: oligonukleotyd P7984 tttgctgata 60 71 <400> 54 tacagtgcct ctttcctcta tagtggtgta ccatacaggt tcagcggatc actgatttca c <210> 55 <211> 71 <212> DNA <213> sekwencja sztuczna <220 <223> Opis sekwencji sztucznej: oligonukleotyd <400 55 gacagtaata agtggcgaaa tcttctggct ggaggctact gatcgtgagg taccactacc g cggtagtggt 60 71
P7985 gtgaaatcag 60 ~ 71 <210> 56 <211> 89 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna
PL 218 516 B1 <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: oligonukleotyd P7986 <400> 56 atttcgccac ttattactgt caacagtata acatctaccc actcacattc ggtcagggta 60 ctaaagtaga aatcaaacgt acggaattc 89 <210> 57 <211> .30 <212> DNA <213>
Sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: oligonukleotyd P7981 <400> 57 gaattcaggg tcaccatcac ttgtaaagcc <210> 58 <211> 30 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: oligonukleotyd P7980 <400> 58 gaattccgta cgtttgattt ctactttagt <210> 59 <211> 24 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: oligonukleotyd R1053 <400> 59 gctgacagac taacagactg ttcc <210> 60 <211> 57 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220> , . , .
<223> OP1S sekwencji sztucznej: oligonukleotyd R5350 <400> 60 tctagatggc acaccatctg ctaagtttga tgcagcatag atcaggagct taggagc <210> 61 <211> 59 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna
PL 218 516 B1 <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: oligonukleotyd R5349 <400> 61 gcagatggtg tgccatctag attcagtggc agtggatcag gcacagactt taccctaac 59 <210> 62 <211> 18 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencj i sztucznej: oligonukleotyd R684 <400> 62 ttcaactgct catcagat 18 <210> 63 <211> 65 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <223> opis sekwencji sztucznej: starter P7989 <400> 63 gaagcaccag gcttcttaac ctctgctcct gactggacca gctgcacctg agagtgcacg 60 aattc 65 <210> 64 ,<211> 71 <212> DNA <213> sekwencja sztuczna <220> , , .
<223> Opis sekwencji sztucznej: startej P7990 <400> 64 ggttaagaag cctggtgctt ccgtcaaagt ttcgtgtaag gcctcaggct acgtgttcac 60 agactatggt a 71 <210> 65 <211> 71 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: starter R7991 <400> 65 ccaacccatc catttcaggc cttgtcccgg ggcctgcttg acccaattca taccatagtc 60 tgtgaacacg t 71 <210> 66 <211> 81 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna
PL 218 516 B1
<210> 71 <211> 30 <212> DNA
PL 218 516 B1 <213> Sekwencja sztuczna <223> θΡί5 sekwencji sztucznej: starter P7987 <400> 71 gaattcggta ccctggcccc agtagtccat 30 <210> 72 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: starter P7999 <400> 72 .
gatccgccag gctgcacgag accgcctcct gactcgacca gctgaacctc agagtgcacg 60 aattc 65 <210> 73 <211> 71 <212> DNA <213> sekwencja sztuczna <22 0>
<223> Opis sekwencji sztucznej: starter P8000 <400> 73 tctcgtgcag cctggcggat cgctgagatt gtcctgtgct gcatctggtt acgtcttcac 60 agactatgga a 71 <210> 74 <211> 71 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <223> Opis sekwencji sztucznej: starter P8001 <400> 74 ccaacccatc catttcaggc cctttcccgg ggcctgctta acccaattca ttccatagtc 60 tgtgaagacg t 71 <210> 75 <211> 55 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223: Opis sekwencji sztucznej: starter P7997 <4O0> 75 ggaggtatgc tgttgacttg gatgtgtcta gagagaacgt gaatctgccc ttgaa 55 <210> 76 <211> 62
PL 218 516 B1 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220 <223> Opis sekwencji sztucznej: starter P7998 <400 76 ccaagtcaac agcatacctc caaatgaata gcctgagagc agaggacacc gcagtgtact 60 at 62 <210> 77 <211> 73 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220 <223> Opis sekwencji sztucznej: starter P7993 <400> 77 gaattcggta ccctggcccc agtagtccat ggcataagat ctgtatcctc tagcacaata 60 gtacactgcg gtgtcctc gg <210 78 <211> 30 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: starter P7996 <400> 78 gaattcgtgc actctgaggt tcagctggtc 30 <210> 79 <211> 74 <212> DNA <213> sekwencja sztuczna <220 <223> Opis sekwencji sztucznej: starter 5' <400 79 cgcgcggcaa ttgcagtggc cttggctggt ttcgctaccg tagcgcaagc tgacattcaa 60 atgacccaga gccc 74 <210> 80 <211> 20 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220 <223> Opis sekwencji sztucznej: starter 3' <4 00 80 ttcaactgct catcagatgg 20
PL 218 516 B1 <210> 81 <211> 78 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220> .
<223> Opis sekwencji sztucznej: starter 5' <400 81 gctatcgcaa ttgcagtggc gctagctggt ttcgccaccg tggcgcaagc tgaggttcag SO ctggtcgagt caggaggc 78 <210> 82 <211> 18 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <22 0>
<223> Opis sekwencji sztucznej: starter 3' <400 82 gcctgagttc cacgacac 18 <210> 83 <211> 23 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: region zrębowe LI ludzkiej grupy 1 o najwyższej zgodności <400> 83
Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys 20 <210> 84 <211> 23 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: region zrębowe LI hTNF40 <400> 84
Asp Ile Val Met Thr Gin Ser Gin Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Val Thr Cys ‘ 20
PL 218 516 B1 <210> 65 <211> 15 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <22 Ο >
<223; Opis sekwencji sztucznej: region zrębowe L2 ludzkiej grupy 1 o najwyższej zgodności <400> 85
Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 06 <211> 15 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <22O>
<223> Opis sekwencji sztucznej: region zrębowe L2 hTNF40 <400> 86
Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gl-y Gin Ser Pro Lys- Ala Len Ile-Tyr 1 5 10 15 <210> 87 <211> 32 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220> . , . , , . . . <223> Opis sekwencji sztucznej: re9ion zrębowe L3 ludzkiej grupy 1 o najwyższej zgodności <400> 87
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 88 <211> 32 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: region zrębowe L3 hTNF40 <400> 88
Gly Val Pro Tyr Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15
PL 218 516 B1
Leu Thr Ile Ser Thr Val Gin Ser Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys 20 25 30 <210 69 <21ł> 11 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: region zrębowe L4 ludzkiej grupy 1 o najwyższej zgodności <400 89
Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 1 5 10 <210 90 <211> 11 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220 <223> Opis sekwencji sztucznej: region zrębowe L4 hTNF40 <400> 90
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg 1 5 10 <210> 91 <211> 30 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220 , , , . . Ί <223> Opis sekwencji sztucznej: region zrębowe Hl ludzkiej grupy l o najwyższej zgodności
<400> 91
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
20 25 30
<210> 92 <211> 30 <212> PRT <2l3> Sekwencja sztuczna <220 <223> Opis sekwencji sztucznej: region zrębowe Hl HTNF40
PL 218 516 B1 <400 92
Gin Ile Gin Leu Val Gin Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys lys Ala Ser Gly Tyr Val Phe Thr * 20 25 30 <210 93 <211> 14 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: region zrębowe H2 ludzkiej grupy 1 o najwyższej zgodności <400> 93
Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met Gly 1 S 10 * ‘ <210> 94 <211> 14 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <223> Opis sekwencji sztucznej: region zrębowe H2 hTNF40 <400> 94
Trp Val Lys Gin Ala Pro Gly Lys Ala Phe Lys Trp Met Gly 1 5 10 <210 95 <211> 32 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220> ... _ <223> Opis sztuczne}: region zrębowe H3 ludzkiej grupy 1 o najwyższej zgodności <400> 95
Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu 1 5 10 15
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 <210 96
PL 218 516 B1 <211> 32 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <223> Opis sekwencji sztucznej: region zrębowe H3 hTNF40 <400> 96
Arg 1 Phe Ala Phe Ser 5 Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Phe Leu Gin
10 15
Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 97 <211> 11 <212> PRT <213> sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: region zrębowe H4 ludzkiej grupy 1 o najwyższej zgodności <400> 97
Trp Gly Gin. Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 98 <211> 11 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: region zrębowe H4 hTNF40 <400> 98
Trp Gly Gin Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 99 <211> 324 <212> DNA <213> mysi <•22 0>
<221> CDS <222> (1)..(324) <223> domena zmienna łańcucha lekkiego mysiego hTNF40 <400> 99
PL 218 516 B1 gac att gtg atg acc cag tct caa
Asp Ile Val Met Thr Gin Ser Gin
5 gac agg gtc agc gtc acc tgc aag
Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys ' ‘ 20 aaa ttc atg tcc aca tca gta gga 48
Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
15 gcc agt cag aat gtg ggt act aat 96
Ala Ser Gin Asn Val Gly Thr Asn
30
gta Val gcc Ala tgg tat caa Trp Tyr Gin 35 cag aaa cca Pro 40
Gin Lys
tac tcg gca tcc ttc eta tat agt
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser
50 55
agt gga tct ggg aca gat ttc act
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
65 70
gaa gac ttg gca gag tat ttc tgt
Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys
gga caa tct cct aaa gca ctg att 144
Gly Gin Ser Pro Lys 45 Ala Leu Ile
gga gtc cct tat ege ttc aca ggc 192
Gly Val Pro Tyr 60 Arg Phe Thr Gly
ctc acc atc agc act gtg cag tct 240
Leu Thr Ile Ser Thr Val Gin Ser
60 acg ttc ggt gct ggg acc aag ctg gag Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu
100 105
caa tat aac atc tat Ile Tyr cct Pro 95 ctc Leu 288
Gin 90 Tyr Asn
ctg aaa cgt 324
Leu Lys Arg
<210> 100 <211> 354 <212> DNA <213> mysi <220>
<221> CDS <222> (1)..(354) <223> domena zmienna łańcucha <
<400> 100 cag atc cag ttg gtg cag tct gga cct
Gin Ile Gin Leu Val Gin Ser Gly Pro
5 aca gtc aag atc tcc tgc aag gct tct
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser ~ 20 25 gga atg aat tgg gtg aag cag gct cca
Gly Met Asn Trp Val Lys Gin Ala Pro ' 35 40 ggc tgg ata aac acc tac att gga gag
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Ile Gly Glu
55 iężkiego mysiego hTNF40
gag ctg aag aag cct gga gag 48
Glu 10 Leu Lys Lys Pro Gly 15 Glu
gga tat gtt ttc aca gac tat 96
Gly Tyr Val Phe Thr 30 Asp Tyr
gga aag gct ttc aag tgg atg 14 4
Gly Lys Ala Phe 45 Lys Trp Met
cca ata tat gtt gat gac ttc 192
Pro Ile Tyr 60 Val Asp Asp Phe
PL 218 516 B1
aag Lys 65 gga Gly ega ttt gcc ttc tet Phe Ser 70 ttg Leu gaa acc tet gcc agc act gcc ttt 24 0
Arg Phe Ala Glu Thr Ser 75 Ala Ser Thr Ala Phe 80
ttg cag atc aac aac ctc aaa aat gag gac acg gct aca tat ttc tgt 288
Leu Gin Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
gca aga ggt tac cgg tcc tat gct atg gac tac tgg ggt caa gga acc 336
Ala Arg Gly Tyr Arg Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
tca g.tc acc gtc tet tca 354
Ser Val Thr Val Ser Ser
115 <210> 101 <211> 84 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<221> CDS <222> (29)-.(67) <223> °Pis sekwencji sztucznej: adaptor oligonukleotydowy OmpA <400> 101 tcgagttcta gataacgagg cgtaaaaa atg aaa aag aca gct atc gca att 52
Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile
5 gca gtg gcc ttg gct ctgaegtaeg agtcagg 84
Ala Val Ala Leu Ala <210> 102 <211> 67 <212> DNA <213: Sekwencja sztuczna <220>
<221> CDS <222> (2).. (40) <220>
<221> CDS <222> (43). . (66) <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: IGS kaseta-1 <400> 102 g agc tca cca gta aca aaa agt ttt aat aga gga gag tgt ta atg aag 48
PL 218 516 B1
PL 218 516 B1 <210> 105 <211> 81 <2Ι2> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220?
<221? CDS <222? (2)..(43) <220>
<221> CDS <222? (57) . . (80) <220?
<223? Opis sekwencji sztucznej: IGS kaseta-a <400? 105 g agc tca cca gta acs aaa'agt ttt aat aga gga gag tgt tga S=r Pro Val Thr Lys Ssr Phe Asn Arg Gly Glu Cys
5 10 cgaggattat ata atg aag aaa act gct ata ges att g Mat lys Lys Thr Ais Ile Ala ile
20
SI <210> 10S <211> 30 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220? . _ . . <223> Opis sekwencji sztucznej: region zrębowy Hl ludzkiej grupy 3 o najwyzs j zgodności <400? 106
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 3. 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 20 25 30 <210? 107 <211> 13 <212? PRT <213? Sekwencja sztuczna <220> _ ... <223> Opis sekwencji sztucznej: region zrębowy H2 ludzkiej grupy 3 o najwyższej zgodności <400? 107
PL 218 516 B1
Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser 1 5 10 <210> 108 <211> 32 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: region zrębowy H3 ludzkiej grupy 3 o najwyższej zgodności <400> 100
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin 1 5 10 15
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 <210> 109 <211> 11 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220> , <223> Opis sekwencji sztucznej: region zrębowy Ή4 ludzkiej grupy 3 o najwyższej zgodności <400> 109
Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 110 <211> 648 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Przeszczepiony łańcuch ciężki dla Fab <400> 110 gaggttcagc tggtcgagtc aggaggcggt ctcgtgcagc ctggcggatc actgagattg 60 tcctgtgctg catctggtta cgtcttcaca gactatggaa tgaattgggt tagacaggcc 120 ccgggaaagg goctggaatg gatgggttgg attaatactt acattggaga gcctatttat 180 gctgacagcg tcaagggcag attcacgttc tctctagaca catccaagtc aacagcatac 240 ctccaaatga atagcctgag agcagaggac accgcagtgt actattgtgc tagaggatac 300 agatcttatg ccatggacta ctggggccag ggtaccctag tcacagtctc ctcagcttcc 360 accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaea 420 gcggccetgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 480 tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 540 tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc 600
PL 218 516 B1 tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtcgaca agaaagtt 648 <210> 111 <211> 216 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <22 Qx* <223> Przeszczepiony łańcuch ciężki dla Fab <400> 111
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Val Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Gly Ket Asn Trp i Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Ile Gly Glu Pro Ile Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Tyr Arg Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val 210 215 <210> 112 <211> 642 <212> DNA cżlS:» Sekwencja sztuczna
PL 218 516 B1 <223> Przeszczepiony Łańcuch lekki dla Fab i modyfikowanego Fab <400> 112 gacattcaaa tgacccagag cccatccagc ctgagcgcat ctgtaggaga ccgggtcacc 60 atcacttgta aagccagtca gaacgtaggt actaacgtag cctggtatca gcaaaaacca 120 ggtaaagccc caaaagccct catctacagt gcctctttcc Łctatagtgg tgtaccatac 180 aggttcagcg gatccggtag tggtactgat ttcaccctca cgatcagtag cctccagcca 240 gaagatttcg ccacttatta ctgtcaacag tataacatct acccactcac attcggtcag 300 ggtactaaag tagaaatcaa acgtacggta gcggccccat ctgtcttcat cttcccgcca 360 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600 ctgagctcac cagtaacaaa aagctttaat agaggagagt gt 642 <210> 113 <211> 214 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Przeszczepiony łańcuch lekki dla Fab i modyfikowanego Fab
<400> 113 Gin Met Thr Gin Ser 5 Ero Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
Asp 1 Ile
10 15
Asp Arg Val Thr 20 Ile Thr Cys Lys Ala Ser ’ 25 Gin Asn Val Gly Thr 30 Asn
Val Ala Trp Tyr 35 Gin Gin Lys Pro Gly Lys 40 Ala Pro Lys Ala Leu 45 Ile
Tyr Ser 50 Ala Ser Phe Leu Tyr 55 Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser 60 Gly
Ser 65 Gly Ser Gly Thr Asp Phe 70 Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin 75 Pro 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr 85 Cys Gin Gin ’ SO Tyr Asn Ile Tyr Pro ' 95 Leu
Thr Phe Gly Gin 100 Gly Thr Lys Val Glu Ile 105 Lys Arg Thr Val Ala ~ ' 110 Ala
Pro Ser Val Phe 115 Ile Phe Pro Pro Ser Asp 120 Glu Gin Leu Lys Ser 125 Gly
Thr Ala 130 Ser Val Val Cys Leu 135 Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 140 Ala
Lys 145 Val Gin Trp Lys Val Asp ’ 150 Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser 155 Gin 160
Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
PL 218 516 B1
165 I~C 175 £sr Thr Leu Ti” Leu Ser Lys .Ais .Asp Tyr Glu Lvs His Lys vai Tvr ISO 135 ‘ 153
Ale Cys Glu Vai Thr Eis Gin Gly Leu Ser Ser Pro V=1 Thr Lys Sar 155 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210
<210> 114
<211> 637
<212> DNA.
<213> Sekwencja sztuczna
<220>
<223> Przeszczepiony łańcuch ciężki dla modyfikowanego Fab
<400> 114
gaggttcagc tggtcgagtc aggaggeggt etegtgcagc etggcggatc actgagattg 60 tcctgcgctg catctggtta cgtcttcaca gaetacggaa tgaatcgggt tagaeaggcc 120 cegggaaagg gcctggaatg gatgggttgg attaatactt acattggaga gcctatttat 180 gctgacagcg tcaagggcag attcacgttc tctctagaca catccaagtc ascageatac 240 ctccaaatga atagcctgag agcagaggac aeegcagtgt actattgtgc tagaggaeac 200 agatcttatg ccatggacta ctggggccag ggtaccctag tcacagtete ctcagcttcc 360 aecasgggcc catcggtctt ccccctggca cectectcca agagcaeetc tgggggcaca 420 gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 430 ccaggcgccc cgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg ecctacagtc ctcaggactc 540 tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc 600 cgcaacgtga atcacaagce cagcaacacc aaggtcgaca agaaagttga gcccaaatct 660 tgtgacaaaa ctcacacatg cgccgcg 6B7
<21O> 115
<211> 225
<212> PRT
<213> Sekwencja szbuczna
<220>
<223> Przeszczepiony Łańcuch ciężki dla modyfikowanego Fab
<400> 115
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15
Ser Leu Arę Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Vel Phe Thr Asp Tyr 20 25 30
Gly Met .Asn Trp Val Arg Gin Ale Pro Giy Lys Gly Leu Glu Trp Met 35. 40 45
Gly Trp Ile 50 Asn Thr Tyr Ile 55 Gly Glu Pro Ile Tyr SO Ala Aso -Ser Val
Lys 55 Gly Arg Phe Thr Phe 70 Ser Leu Asp Thr Ser 75 Lys Ser Thr Ala Tyr 30
PL 218 516 B1
Leu Gin Met Asn Ser 85 Leu Arg Ala Glu Asp 90 Thr Ala Val Tyr Tyr 95 Cys
Ala Arg Gly Tyr 100 Arg Ser Tyr Ala Met 105 Asp Tyr Trp Gly Gin 110 Gly Thr
Leu Val Thr 115 Val Ser Ser Ala Ser 120 Thr Lys Gly Pro Ser 125 Val Phe Pro
Leu Ala 130 Pro Ser Ser Lys Ser 135 Thr Ser Gly Gly Thr 140 Ala Ala Leu Gly
Cys 145 Leu Val Lys Asp Tyr 150 Phe Pro Glu Pro Val 155 Thr Val Ser Trp Asn 160
Ser Gly Ala Leu Thr 165 Ser Gly Val His Thr 170 Phe Pro Ala Val Leu 175 Gin
Ser Ser Gly Leu 180 Tyr Ser Leu Ser Ser 185 Val Val Thr Val Pro 190 Ser Ser
Ser Leu Gly 195 Thr Gin Thr Tyr Ile 200 Cys Asn Val Asn His 205 Lys Pro Ser
Asn Thr Lys Yal Asp Lys Lys Yal Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Ala Ala 225
PL 218 516 B1

Claims (39)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Cząsteczka przeciwciała swoista wobec ludzkiego TNFa, zawierająca:
    a) łańcuch ciężki, w którym domena zmienna zawiera (i) sekwencję podaną w SEK NR ID:1 dla regionu CDRH1, (ii) sekwencję podaną w SEK NR ID:2 lub w SEK NR ID:7 dla CDRH2;
    (iii) sekwencję podaną w SEK NR ID:3 dla CDRH3;i
    b) łańcuch lekki, w którym domena zmienna zawiera:
    (i) sekwencję podaną w SEK NR ID:4 dla CDRL1, (ii) sekwencję podaną w SEK NR ID:5 dla CDRL2, i (iii) sekwencję podaną w SEK NR ID:6 dla CDRL3.
  2. 2. Cząsteczka przeciwciała według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera sekwencję podaną w SEK NR ID:2 dla CDRH2.
  3. 3. Cząsteczka przeciwciała według zastrz. 1 lub 2, znamienna tym, że jest cząsteczką przeciwciała z przeszczepionym-CDR.
  4. 4. Cząsteczka przeciwciała według zastrz. 3, znamienna tym, że domena zmienna zawiera ludzkie akceptorowe regiony zrębowe i inne niż ludzkie donorowe CDR-y.
  5. 5. Cząsteczka przeciwciała według zastrz. 4, znamienna tym, że ludzkie akceptorowe regiony zrębowe domeny zmiennej łańcucha ciężkiego są oparte na ludzkiej sekwencji najwyższej zgodności grupy 1 i zawierają inne niż ludzkie donorowe reszty w pozycjach 28, 69 i 71 zgodnie z numeracją Kabata.
  6. 6. Cząsteczka przeciwciała według zastrz. 4, znamienna tym, że ludzkie akceptorowe regiony zrębowe domeny zmiennej łańcucha ciężkiego są oparte na ludzkiej sekwencji najwyższej zgodności grupy 1 i zawierają inne niż ludzkie donorowe reszty w pozycjach 28, 38, 46, 67, 69 i 71 zgodnie z numeracją Kabata.
  7. 7. Cząsteczka przeciwciała według zastrz. 4, znamienna tym, że ludzkie akceptorowe regiony zrębowe domeny zmiennej łańcucha ciężkiego są oparte na ludzkiej sekwencji najwyższej zgodności grupy 3 i zawierają inne niż ludzkie donorowe reszty w pozycjach 27, 28, 30, 48, 49, 69, 71, 73, 76 i 78 zgodnie z numeracją Kabata.
  8. 8. Cząsteczka przeciwciała według zastrz. od 4 do 7, znamienna tym, że ludzkie akceptorowe regiony zrębowe domeny zmiennej łańcucha lekkiego są oparte na ludzkiej sekwencji najwyższej zgodności grupy 1 i zawierają inne niż ludzkie donorowe reszty w pozycjach 46 i 60 zgodnie z numeracją Kabata.
  9. 9. Cząsteczka przeciwciała według zastrz. 1 do 8, znamienna tym, że zawiera co najmniej jedną ludzką domenę stałą.
  10. 10. Cząsteczka przeciwciała według zastrz. 9, znamienna tym, że ludzką domeną stałą jest IgG.
  11. 11. Cząsteczka przeciwciała według zastrz. 10, znamienna tym, że ludzką domeną stałą jest IgG2 lub IgG4.
  12. 12. Cząsteczka przeciwciała według zastrz. 1 do 11, znamienna tym, że jest fragmentem Fab, modyfikowanym Fab, Fab', F(ab')2 lub fragmentem Fv, monomerem lub dimerem łańcucha ciężkiego, przeciwciałem jednołańcuchowym lub jednołańcuchowym fragmentem Fv.
  13. 13. Cząsteczka przeciwciała według zastrz. 12, znamienna tym, że jest fragmentem Fab mającym jeden lub większą liczbę aminokwasów przy C-końcu łańcucha ciężkiego, które umożliwiają przyłączenie cząsteczki efektorowej lub reporterowej.
  14. 14. Cząsteczka przeciwciała według zastrz. 13, znamienna tym, że dodatkowe aminokwasy tworzą modyfikowany region zawiasowy zawierający jedną lub dwie reszty cysteinowe, do których może być przyłączona cząsteczka efektorowa lub reporterowa.
  15. 15. Cząsteczka przeciwciała według zastrz. 14, znamienna tym, że ma w zmodyfikowanym regionie zawiasowym kowalencyjnie związaną jedną grupę tiolową lub maleimidową.
  16. 16. Cząsteczka przeciwciała według zastrz.15, znamienna tym, że ma kowalencyjnie związaną lizynę z grupą maleimidową.
  17. 17. Cząsteczka przeciwciała według zastrz. 16, znamienna tym, że do każdej grupy aminowej lizyny ma przyłączony polimer o ciężarze cząsteczkowym 500 do 50 000 Da.
  18. 18. Cząsteczka przeciwciała według zastrz. 17, znamienna tym, że do każdej grupy aminowej lizyny ma przyłączony polimer metoksypoli(etylenoglikol) o ciężarze cząsteczkowym około 20 000 Da.
    PL 218 516 B1
  19. 19. Związek, znamienny tym, że zawiera cząsteczkę przeciwciała określoną w zastrz. 13 mającą kowalencyjnie przyłączoną cząsteczkę efektorową albo reporterową do aminokwasu na końcu C albo po stronie końca C łańcucha ciężkiego.
  20. 20. Związek według zastrz. 19, znamienny tym, że zawiera cząsteczkę efektorową.
  21. 21. Związek według zastrz. 20, znamienny tym, że cząsteczka efektorowa stanowi jeden albo większą liczbę polimerów.
  22. 22. Związek według zastrz. 21, znamienny tym, że jeden lub większą liczbę polimerów stanowi ewentualnie podstawiony polimer polialkilenowy, polialkenylenowy lub polioksyalkilenowy o łańcuchu prostym albo rozgałęzionym albo polisacharyd o łańcuchu rozgałęzionym albo nierozgałęzionym.
  23. 23. Związek według zastrz. 22, znamienny tym, że jeden albo większą liczbą polimerów stanowi metoksypoli(etylenoglikol).
  24. 24. Związek według zastrz. 23, znamienny tym, że do jednej z reszt cysteinowych na C końcu łańcucha ciężkiego ma przyłączoną grupę lizylomaleimidową, w której z każdą grupą aminową reszty lizylowej jest kowalencyjnie związana reszta metoksypoli(glikolu etylenowego) o ciężarze cząsteczkowym około 20000 Da.
  25. 25. Związek według zastrz. 24, znamienny tym, że ma wzór:
    ο w którym n wynosi około 420.
  26. 26. Sekwencja DNA, która koduje łańcuch ciężki i/lub lekki cząsteczki przeciwciała określonej w zastrz. 1-14.
  27. 27. Wektor do klonowania lub ekspresji zawierający sekwencję DNA określoną w zastrz. 26.
  28. 28. Wektor ekspresyjny według zastrz. 27, znamienny tym, że jest wektorem ekspresyjnym E. coli.
  29. 29. Komórka gospodarza transformowana wektorem określonym w zastrz. 27 lub 28.
  30. 30. Sposób wytwarzania cząsteczki przeciwciała określonej w zastrz. 1 do 14, znamienny tym, że obejmuje hodowanie komórki gospodarza określonej w zastrz. 29 i izolowanie cząsteczki przeciwciała.
  31. 31. Sposób według zastrz. 30, znamienny tym, że komórką gospodarza jest E. coli.
  32. 32. Sposób według zastrz. 31, znamienny tym, że cząsteczka przeciwciała jest kierowana do peryplazmy.
  33. 33. Kompozycja terapeutyczna lub diagnostyczna, znamienna tym, że zawiera cząsteczkę przeciwciała określoną w zastrz. 1 do 14 albo związek określony w zastrz. 19 do 25.
  34. 34. Cząsteczka przeciwciała określona w zastrz. 1 do 14 lub związek określony w zastrz. 19 do 25 do zastosowania w leczeniu ostrego lub przewlekłego zaburzenia immunologicznego lub immunoregulatorowego, wstrząsu septycznego, endotoksycznego lub sercowo-naczyniowego, zaburzenia zapalnego, choroby neurodegeneracyjnej, choroby nowotworowej lub zapalenia wątroby wywołanego alkoholem.
  35. 35. Cząsteczka przeciwciała lub związek według zastrz. 34 do zastosowania w leczeniu choroby zapalnej lub choroby autoimmunologicznej.
  36. 36. Cząsteczka przeciwciała lub związek według zastrz. 35 do zastosowania w leczeniu reumatoidalnego zapalenia stawów, zapalenia kości i stawów, choroby Crohna, zapalnych zaburzeń kości lub łuszczycy.
  37. 37. Zastosowanie cząsteczki przeciwciała określonej w zastrz. 1 do 14 albo związku określonego w zastrz. 19 do 25 do wytwarzania leku do leczenia ostrego lub przewlekłego zaburzenia immunologicznego lub immunoregulacyjnego, septycznego lub endotoksycznego wstrząsu sercowoPL 218 516 B1 naczyniowego, zaburzenia zapalnego, choroby neurodegeneracyjnej, choroby nowotworowej lub zapalenia wątroby wywołanego alkoholem.
  38. 38. Zastosowanie według zastrz. 37, znamienne tym, że patologią jest choroba zapalna lub choroba autoimmunologiczna.
  39. 39. Zastosowanie według zastrz. 38, znamienne tym, że patologią jest reumatoidalne zapalenie stawów, zapalenie kości i stawów, choroba Crohna, zapalne zaburzenia kości lub łuszczyca.
    Rysunki
    Fig. i
    Porównanie regionów zrębowych łańcucha lekkiego przeciwciała hTNF40 i sekwencji największej zgodności ludzkiej grupy 1
PL399351A 2000-06-06 2001-06-05 Cząsteczka przeciwciała, związek zawierający cząsteczkę przeciwciała, sekwencja DNA, wektor do klonowania lub ekspresji, komórka gospodarza, sposób wytwarzania cząsteczki przeciwciała, kompozycja terapeutyczna lub diagnostyczna, zastosowanie cząsteczki przeciwciała albo związku PL218516B1 (pl)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB0013810.7A GB0013810D0 (en) 2000-06-06 2000-06-06 Biological products

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL399351A1 PL399351A1 (pl) 2012-12-17
PL218516B1 true PL218516B1 (pl) 2014-12-31

Family

ID=9893121

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL353960A PL212738B1 (pl) 2000-06-06 2001-06-05 Czasteczka przeciwciala, zwiazek, sekwencja DNA, wektor do klonowania lub ekspresji, komórka gospodarza, sposób wytwarzania czasteczki przeciwciala, kompozycja terapeutyczna lub diagnostyczna, zastosowanie czasteczki przeciwciala albo zwiazku
PL399351A PL218516B1 (pl) 2000-06-06 2001-06-05 Cząsteczka przeciwciała, związek zawierający cząsteczkę przeciwciała, sekwencja DNA, wektor do klonowania lub ekspresji, komórka gospodarza, sposób wytwarzania cząsteczki przeciwciała, kompozycja terapeutyczna lub diagnostyczna, zastosowanie cząsteczki przeciwciała albo związku

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL353960A PL212738B1 (pl) 2000-06-06 2001-06-05 Czasteczka przeciwciala, zwiazek, sekwencja DNA, wektor do klonowania lub ekspresji, komórka gospodarza, sposób wytwarzania czasteczki przeciwciala, kompozycja terapeutyczna lub diagnostyczna, zastosowanie czasteczki przeciwciala albo zwiazku

Country Status (42)

Country Link
US (4) US7012135B2 (pl)
EP (4) EP2308975B1 (pl)
JP (3) JP4064812B2 (pl)
KR (1) KR20020047097A (pl)
CN (1) CN1289671C (pl)
AP (1) AP2092A (pl)
AR (1) AR033978A1 (pl)
AT (1) ATE451460T1 (pl)
AU (1) AU783756B2 (pl)
BE (1) BE2010C019I2 (pl)
BG (1) BG66072B1 (pl)
BR (2) BR0106682A (pl)
CA (2) CA2707766C (pl)
CY (6) CY1109889T1 (pl)
CZ (1) CZ300737B6 (pl)
DE (3) DE122010000027I1 (pl)
DK (4) DK3059314T3 (pl)
EC (1) ECSP024210A (pl)
ES (5) ES2403217T3 (pl)
FR (1) FR10C0015I2 (pl)
GB (2) GB0013810D0 (pl)
HU (4) HU230561B1 (pl)
IL (3) IL147992A0 (pl)
IS (2) IS2808B (pl)
LT (1) LT2308975T (pl)
LU (1) LU91674I2 (pl)
MX (1) MXPA01013440A (pl)
MY (1) MY136603A (pl)
NL (1) NL300982I9 (pl)
NO (4) NO334808B1 (pl)
NZ (1) NZ516596A (pl)
OA (1) OA12282A (pl)
PE (1) PE20020292A1 (pl)
PL (2) PL212738B1 (pl)
PT (4) PT3059314T (pl)
RU (1) RU2303604C2 (pl)
SI (3) SI2230308T1 (pl)
SK (1) SK288343B6 (pl)
TR (1) TR201900227T4 (pl)
TW (2) TWI316088B (pl)
WO (1) WO2001094585A1 (pl)
ZA (1) ZA200200097B (pl)

Families Citing this family (111)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB0013810D0 (en) 2000-06-06 2000-07-26 Celltech Chiroscience Ltd Biological products
CA2385745C (en) 2001-06-08 2015-02-17 Abbott Laboratories (Bermuda) Ltd. Methods of administering anti-tnf.alpha. antibodies
US20060073141A1 (en) * 2001-06-28 2006-04-06 Domantis Limited Compositions and methods for treating inflammatory disorders
GB0129105D0 (en) * 2001-12-05 2002-01-23 Celltech R&D Ltd Expression control using variable intergenic sequences
US20060171940A1 (en) * 2002-03-20 2006-08-03 Celltech R&D Limited Antibody disulfide isomers, use thereof, and methods of analyzing same
US20040009172A1 (en) * 2002-04-26 2004-01-15 Steven Fischkoff Use of anti-TNFalpha antibodies and another drug
PL224001B1 (pl) * 2002-05-02 2016-11-30 Wyeth Corp Sposób wytwarzania stabilnej liofilizowanej kompozycji obejmującej monomeryczne koniugaty pochodna kalicheamycyny/przeciwciało anty-CD22, kompozycja otrzymana tym sposobem oraz jej zastosowanie
GB0210121D0 (en) 2002-05-02 2002-06-12 Celltech R&D Ltd Biological products
WO2003099226A2 (en) * 2002-05-28 2003-12-04 Celltech R & D Limited Antibody peg positional isomers, compositions comprising same, and use thereof
US9321832B2 (en) 2002-06-28 2016-04-26 Domantis Limited Ligand
MY151032A (en) * 2002-07-19 2014-03-31 Abbott Lab S A Treatment of tnf? related disorders
AU2003276844A1 (en) * 2002-08-28 2004-03-19 Pharmacia Corporation Formulations of modified antibodies and methods of making the same
WO2004019861A2 (en) * 2002-08-28 2004-03-11 Pharmacia Corporation Stable ph optimized formulation of a modified antibody
US20040105858A1 (en) * 2002-08-29 2004-06-03 Kim Joanne Young Hee Kwak Diagnosis and treatment of infertility
MY150740A (en) 2002-10-24 2014-02-28 Abbvie Biotechnology Ltd Low dose methods for treating disorders in which tnf? activity is detrimental
EP2311867A1 (en) 2002-10-29 2011-04-20 Anaphore, Inc. Trimeric binding proteins for trimeric cytokines
CA2508375C (en) 2002-12-02 2014-05-27 Abgenix, Inc. Antibodies directed to tumor necrosis factor and uses thereof
US7101978B2 (en) 2003-01-08 2006-09-05 Applied Molecular Evolution TNF-α binding molecules
US7575893B2 (en) * 2003-01-23 2009-08-18 Genentech, Inc. Methods for producing humanized antibodies and improving yield of antibodies or antigen binding fragments in cell culture
GB0303337D0 (en) * 2003-02-13 2003-03-19 Celltech R&D Ltd Biological products
EP1597299A2 (en) * 2003-02-19 2005-11-23 Pharmacia Corporation Carbonate esters of polyethylene glycol activated by means of oxalate esters
WO2004098578A2 (en) * 2003-05-12 2004-11-18 Altana Pharma Ag Composition comprising a pde4 inhibitor and a tnf-alfa antagonist selected from infliximab, adalimumab, cdp870 and cdp517
CA2529819A1 (en) * 2003-06-30 2004-09-23 Domantis Limited Pegylated single domain antibodies
WO2005014649A2 (en) * 2003-08-08 2005-02-17 Pharmacia Corporation Method for the preparation of molecules having antibody activity
US20060173167A1 (en) * 2003-08-13 2006-08-03 Gunter Stempfer Process for the purification of recombinant polypeptides
EP1656452B1 (en) * 2003-08-13 2007-02-14 Sandoz AG Expression vectors, transformed host cells and fermentation process for the production of recombinant polypeptides
GB0319601D0 (en) * 2003-08-20 2003-09-24 Sandoz Ag Production process
KR100570422B1 (ko) * 2003-10-16 2006-04-11 한미약품 주식회사 대장균 분비서열을 이용하여 항체 단편을 분비·생산하는 발현벡터 및 이를 이용하여 항체 단편을 대량 생산하는 방법
CN100393748C (zh) * 2003-11-06 2008-06-11 上海中信国健药业有限公司 全人源肿瘤坏死因子抗体，其制备方法以及药物组合物
KR100772800B1 (ko) * 2003-11-17 2007-11-01 주식회사유한양행 인간 종양괴사인자 α를 인식하는 단일클론항체의가변영역 및 이를 코딩하는 유전자
US7435799B2 (en) 2004-01-08 2008-10-14 Applied Molecular Evolution TNF-α binding molecules
CN100427504C (zh) * 2004-06-02 2008-10-22 北京天广实生物技术有限公司 TNFα高亲和力嵌合抗体及其用途
JP2008504356A (ja) * 2004-06-30 2008-02-14 ドマンティス リミテッド 炎症性疾患を治療するための組成物及び方法
GB0425972D0 (en) * 2004-11-25 2004-12-29 Celltech R&D Ltd Biological products
US8022040B2 (en) * 2004-11-29 2011-09-20 The Regents Of The University Of California Hydroxyapatite-binding peptides for bone growth and inhibition
EP1831257B9 (en) * 2004-12-29 2011-05-04 Yuhan Corporation Humanized antibody specific for tumor necrosis factor-alpha
KR20150055116A (ko) 2005-05-16 2015-05-20 애브비 바이오테크놀로지 리미티드 미란성 다발관절염의 치료를 위한 ｔｎｆ 억제제의 용도
US7964707B2 (en) * 2005-06-01 2011-06-21 Micromet Ag Anti-IL2 antibodies
RS52861B (sr) * 2005-06-07 2013-12-31 Esbatech - A Novartis Company Llc Stabilna i rastvorljiva antitela koja inhibiraju tnf (alfa)
GB0520169D0 (en) * 2005-10-04 2005-11-09 Celltech R&D Ltd Biological products
US9101670B2 (en) 2006-04-07 2015-08-11 Nektar Therapeutics Conjugates of an anti-TNF-α antibody
EP2666472A3 (en) * 2006-04-10 2014-04-02 Abbott Biotechnology Ltd Uses and compositions for treatment of psoriatic arthritis
WO2007120656A2 (en) 2006-04-10 2007-10-25 Abbott Biotechnology Ltd. Uses and compositions for treatment of rheumatoid arthritis
US9605064B2 (en) 2006-04-10 2017-03-28 Abbvie Biotechnology Ltd Methods and compositions for treatment of skin disorders
US20080131374A1 (en) * 2006-04-19 2008-06-05 Medich John R Uses and compositions for treatment of rheumatoid arthritis
WO2008005429A2 (en) 2006-07-03 2008-01-10 Charles David Adair Composition for modulating the expression of cell adhesion molecules
EP1914242A1 (en) * 2006-10-19 2008-04-23 Sanofi-Aventis Novel anti-CD38 antibodies for the treatment of cancer
JP5452236B2 (ja) * 2007-03-02 2014-03-26 ファーナム・カンパニーズ・インコーポレーテッド ロウ様物質を用いた徐放性組成物
CA2690858A1 (en) * 2007-06-07 2008-12-18 Surmodics Pharmaceuticals, Inc. Reduced-mass, long-acting dosage forms
WO2008154543A2 (en) 2007-06-11 2008-12-18 Abbott Biotechnology Ltd. Methods for treating juvenile idiopathic arthritis
US8865875B2 (en) 2007-08-22 2014-10-21 Medarex, L.L.C. Site-specific attachment of drugs or other agents to engineered antibodies with C-terminal extensions
BRPI0907485A2 (pt) * 2008-02-05 2015-08-04 Delenex Therapeutics Ag Polipeptídeos de ligação a antígeno contra degeneração de cartilagem
BRPI0912570B8 (pt) * 2008-05-07 2021-05-25 Argos Therapeutics Inc anticorpo anti-ifn-alfa humanizado, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, composição terapêutica e seus usos
MX2011000052A (es) 2008-06-25 2011-07-29 Esbatech Alcon Biomed Res Unit Humanizacion de anticuerpos de conejos usando una estructura de anticuerpos universal.
CN110372792A (zh) 2008-06-25 2019-10-25 艾斯巴技术-诺华有限责任公司 抑制vegf的稳定和可溶的抗体
BRPI0914663A2 (pt) 2008-06-25 2015-10-20 Esbatech Alcon Biomed Res Unit humanização de anticorpos de coelho usando uma estrutura de anticorpo universal
LT3444274T (lt) 2008-06-25 2021-03-25 Novartis Ag Stabilūs ir tirpūs antikūnai, slopinantys tnf
CN101684156B (zh) * 2008-09-27 2011-12-28 苏州工业园区晨健抗体组药物开发有限公司 人TNFα单克隆抗体、其PEG化纳米颗粒及其应用
US20110165063A1 (en) * 2009-01-29 2011-07-07 Abbott Laboratories Il-1 binding proteins
BRPI1007371A2 (pt) * 2009-01-29 2018-03-27 Abbott Lab proteínas de ligação a il-1
US9150640B2 (en) 2009-07-10 2015-10-06 Ablynx N.V. Method for the production of variable domains
SMT201800549T1 (it) 2009-09-24 2018-11-09 Ucb Biopharma Sprl Ceppo batterico per espressione di proteina ricombinante, avente attivita' di chaperone a conservazione di degp carente di proteasi, e geni tsp e ptr con knockout
CA3031851C (en) 2009-10-23 2020-07-07 Amgen British Columbia Anti-gcc antibody molecules and related compositions and methods
GB201000587D0 (en) 2010-01-14 2010-03-03 Ucb Pharma Sa Bacterial hoist strain
GB201000591D0 (en) 2010-01-14 2010-03-03 Ucb Pharma Sa Bacterial hoist strain
GB201000588D0 (en) 2010-01-14 2010-03-03 Ucb Pharma Sa Bacterial host strain
GB201000590D0 (en) 2010-01-14 2010-03-03 Ucb Pharma Sa Bacterial host strain
GB201001791D0 (en) 2010-02-03 2010-03-24 Ucb Pharma Sa Process for obtaining antibodies
US9616120B2 (en) 2010-03-04 2017-04-11 Vet Therapeutics, Inc. Monoclonal antibodies directed to CD20
WO2011109662A1 (en) 2010-03-04 2011-09-09 Vet Therapeutics, Inc. Monoclonal antibodies directed to cd52
KR20130010123A (ko) 2010-04-07 2013-01-25 아비에 인코포레이티드 ＴＮＦ-α 결합 단백질
GB201012603D0 (en) 2010-07-27 2010-09-08 Ucb Pharma Sa Protein purification
GB201012599D0 (en) * 2010-07-27 2010-09-08 Ucb Pharma Sa Process for purifying proteins
GB201012784D0 (en) * 2010-07-29 2010-09-15 Ucb Pharma Sa Method
TWI538918B (zh) 2010-10-20 2016-06-21 財團法人工業技術研究院 人源化之單株抗體、其核苷酸序列與其用途
AR083495A1 (es) 2010-10-22 2013-02-27 Esbatech Alcon Biomed Res Unit Anticuerpos estables y solubles
JP6175428B2 (ja) 2011-06-01 2017-08-02 イントレクソン・アクトバイオテイクス・エヌブイＩｎｔｒｅｘｏｎ Ａｃｔｏｂｉｏｔｉｃｓ ＮＶ 細菌のポリシストロン性発現系
EP2546267A1 (en) 2011-07-13 2013-01-16 UCB Pharma S.A. Bacterial host strain expressing recombinant DsbC
MX348738B (es) 2011-07-13 2017-06-27 Ucb Pharma Sa Cepa huesped bacteriana que expresa dsbc recombinante.
DK2758513T3 (en) 2011-09-23 2018-07-23 Intrexon Actobiotics Nv MODIFIED GRAM POSITIVE BACTERIES AND APPLICATIONS THEREOF
HUE038830T2 (hu) 2011-09-23 2018-11-28 Intrexon Actobiotics Nv Módosított gram-pozitív baktériumok és alkalmazásaik
US20140359902A1 (en) 2011-12-16 2014-12-04 Synthon Biopharmaceuticals B.V. EXPRESSION OF SECRETORY IgA ANTIBODIES IN DUCKWEED
US9156915B2 (en) 2012-04-26 2015-10-13 Thomas Jefferson University Anti-GCC antibody molecules
GB201208367D0 (en) 2012-05-14 2012-06-27 Ucb Pharma Sa Biological product
MX357675B (es) 2012-08-13 2018-07-18 Genentech Inc Anticuerpos anti-jagged y métodos de uso.
EP3134439B1 (en) 2014-04-21 2018-12-26 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Anti-psyk antibody molecules and use of same for syk-targeted therapy
US9616109B2 (en) 2014-10-22 2017-04-11 Extend Biosciences, Inc. Insulin vitamin D conjugates
WO2016065042A1 (en) 2014-10-22 2016-04-28 Extend Biosciences, Inc. Therapeutic vitamin d conjugates
PT3237433T (pt) 2014-12-22 2025-10-21 Ucb Biopharma Sprl Método de fabrico de proteína
WO2017035430A2 (en) * 2015-08-27 2017-03-02 Kolltan Pharmaceuticals, Inc. Anti-alk antibodies and methods for use thereof
GB201522394D0 (en) 2015-12-18 2016-02-03 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
RU2760997C2 (ru) 2016-01-14 2021-12-02 Интрексон Актобиотикс Н.В. Композиции и способы для лечения диабета 1 типа
RU2680011C2 (ru) * 2016-04-29 2019-02-14 Закрытое Акционерное Общество "Биокад" Триспецифические антитела против il-17a, il-17f и другой провоспалительной молекулы
LT3464318T (lt) 2016-06-02 2021-06-25 Abbvie Inc. Gliukokortikoidų receptorių agonistas ir jo imunokonjugatai
EP3558363A1 (en) 2016-12-21 2019-10-30 Amgen Inc. Anti-tnf alpha antibody formulations
PE20201286A1 (es) 2017-12-01 2020-11-24 Abbvie Inc Agonista del receptor de glucocorticoides e inmunoconjugados de este
CN113631574B (zh) 2019-01-31 2025-03-04 努玛治疗有限公司 对TNFα和IL-17A具有特异性的多特异性抗体、靶向IL-17A的抗体及其使用方法
KR102323342B1 (ko) 2019-04-26 2021-11-08 주식회사 와이바이오로직스 IL-17A 및 TNF-α에 특이적으로 결합하는 이중표적 항체
CN111909268B (zh) * 2019-05-07 2022-04-19 北京天成新脉生物技术有限公司 低免疫原性低ADCC/CDC功能抗TNF-α人源化单克隆抗体TCX060及其应用
TW202237639A (zh) 2020-12-09 2022-10-01 日商武田藥品工業股份有限公司 鳥苷酸環化酶ｃ（ｇｃｃ）抗原結合劑之組成物及其使用方法
TW202237638A (zh) 2020-12-09 2022-10-01 日商武田藥品工業股份有限公司 烏苷酸環化酶ｃ（ｇｃｃ）抗原結合劑之組成物及其使用方法
US20240226295A9 (en) 2021-02-15 2024-07-11 Takeda Pharmaceutical Company Limited Cell therapy compositions and methods for modulating tgf-b signaling
US20250002527A1 (en) 2021-08-26 2025-01-02 Duality Biologics (Suzhou) Co., Ltd. Steroid compound and conjugate thereof
KR20240099199A (ko) 2021-09-24 2024-06-28 엑스브레인 바이오파마 에이비 재조합 단백질을 발현시키기 위한 dna 구조체 및 숙주 세포
SE545714C2 (en) * 2021-09-24 2023-12-19 Xbrane Biopharma Ab Dna contructs for producing a pelb signal peptide
SE545694C2 (en) * 2021-09-24 2023-12-05 Xbrane Biopharma Ab Dna construct comprising nucleotide sequences encoding amino acid sequences of certolizumab and pelb signal peptides
WO2023154799A1 (en) 2022-02-14 2023-08-17 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Combination immunotherapy for treating cancer
IL319526A (en) 2022-09-30 2025-05-01 Extend Biosciences Inc Long-acting parathyroid hormone
WO2024180518A1 (en) * 2023-03-01 2024-09-06 Lupin Limited Process for manufacturing antibody fragment protein
TW202525846A (zh) 2023-08-25 2025-07-01 美商普羅特歐拉吉克適美國公司 抗ｉｌ—１３多特異性抗體構築體及其用途
WO2025099576A1 (en) 2023-11-06 2025-05-15 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treating rheumatoid arthritis

Family Cites Families (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8422238D0 (en) 1984-09-03 1984-10-10 Neuberger M S Chimeric proteins
DK336987D0 (da) 1987-07-01 1987-07-01 Novo Industri As Immobiliseringsmetode
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
GB8719042D0 (en) 1987-08-12 1987-09-16 Parker D Conjugate compounds
US5030570A (en) 1988-06-30 1991-07-09 The Eunice Kennedy Shriver Center For Mental Retardation DNA encoding and method of expressing human monoamine oxidase type A
IL162181A (en) 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
PT92900A (pt) * 1989-01-24 1990-07-31 Sistema de vectores de expressao para a producao de anticorpos monoclonais quimericos
GB8907617D0 (en) 1989-04-05 1989-05-17 Celltech Ltd Drug delivery system
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
GB9109645D0 (en) * 1991-05-03 1991-06-26 Celltech Ltd Recombinant antibodies
US5919452A (en) 1991-03-18 1999-07-06 New York University Methods of treating TNFα-mediated disease using chimeric anti-TNF antibodies
GB9112536D0 (en) 1991-06-11 1991-07-31 Celltech Ltd Chemical compounds
GB9120467D0 (en) 1991-09-26 1991-11-06 Celltech Ltd Anti-hmfg antibodies and process for their production
WO1994029347A1 (en) * 1993-06-03 1994-12-22 Therapeutic Antibodies Inc. Antibody fragments in therapy
NO309690B1 (no) 1995-01-23 2001-03-12 Western Atlas Int Inc Detonasjonsanordning av type eksploderende brotråd for bruk med et perforeringsverktöy i en brönn
EP0871641A4 (en) 1995-04-20 2001-09-26 Kennedy Inst Of Rheumatology MULTIPLE ADMINISTRATION OF ANTI-TNF ANTIBODIES
BRPI9707379C8 (pt) 1996-02-09 2017-12-12 Abbott Biotech Ltd composições farmacêuticas compreendendo anticorpo humano recombinante geneticamente engenheirado, e anticorpo humano recombinante geneticamente engenheirado.
US5980898A (en) 1996-11-14 1999-11-09 The United States Of America As Represented By The U.S. Army Medical Research & Material Command Adjuvant for transcutaneous immunization
GB9625640D0 (en) 1996-12-10 1997-01-29 Celltech Therapeutics Ltd Biological products
CA2297692A1 (en) * 1997-08-18 1999-02-25 Innogenetics N.V. Interferon-gamma-binding molecules for treating septic shock, cachexia, immune diseases and skin disorders
GB9720054D0 (en) * 1997-09-19 1997-11-19 Celltech Therapeutics Ltd Biological products
CA2323048C (en) 1998-03-12 2006-10-10 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) derivatives with proximal reactive groups
GB9812545D0 (en) * 1998-06-10 1998-08-05 Celltech Therapeutics Ltd Biological products
GB0013810D0 (en) * 2000-06-06 2000-07-26 Celltech Chiroscience Ltd Biological products

Also Published As

Publication number Publication date
CN1383450A (zh) 2002-12-04
BR0106682A (pt) 2002-05-14
CY1121173T1 (el) 2020-05-29
TWI316088B (en) 2009-10-21
DK2308975T3 (da) 2016-10-31
OA12282A (en) 2006-05-11
CA2380298C (en) 2010-09-28
PT2308975T (pt) 2016-11-14
DK2230308T3 (da) 2013-05-06
US7402662B2 (en) 2008-07-22
IL195085A0 (en) 2009-08-03
AP2092A (en) 2010-02-28
NO20160694A1 (no) 2002-04-08
KR20020047097A (ko) 2002-06-21
ES2230975A1 (es) 2005-05-01
GB0013810D0 (en) 2000-07-26
AR033978A1 (es) 2004-01-21
PT2230308E (pt) 2013-05-03
ECSP024210A (es) 2002-05-23
WO2001094585A1 (en) 2001-12-13
SK288343B6 (sk) 2016-04-01
HUP1600016A2 (en) 2002-10-28
JP2007105043A (ja) 2007-04-26
HK1148776A1 (en) 2011-09-16
IL147992A0 (en) 2002-09-12
IS6217A (is) 2002-01-03
SK3152002A3 (en) 2002-07-02
EP3059314B1 (en) 2018-10-24
EP2308975A1 (en) 2011-04-13
JP2009171966A (ja) 2009-08-06
PT1287140E (pt) 2010-03-08
BG106278A (bg) 2002-12-29
IL147992A (en) 2009-06-15
US20060233800A1 (en) 2006-10-19
FR10C0015I1 (pl) 2010-04-16
CA2707766C (en) 2013-05-21
EP3059314A1 (en) 2016-08-24
EP2308975B1 (en) 2016-08-10
CY1114143T1 (el) 2016-07-27
PL399351A1 (pl) 2012-12-17
NO20020554L (no) 2002-04-08
AU783756B2 (en) 2005-12-01
FR10C0015I2 (fr) 2011-12-30
BG66072B1 (bg) 2011-01-31
ES2707714T3 (es) 2019-04-04
JP4064812B2 (ja) 2008-03-19
US20020151682A1 (en) 2002-10-17
ES2337763T3 (es) 2010-04-29
ES2403217T3 (es) 2013-05-16
RU2303604C2 (ru) 2007-07-27
ES2600080T3 (es) 2017-02-07
CY1109889T1 (el) 2012-01-25
JP4476989B2 (ja) 2010-06-09
PE20020292A1 (es) 2002-05-08
HU230561B1 (hu) 2016-12-28
PL212738B1 (pl) 2012-11-30
MY136603A (en) 2008-10-31
HK1051385A1 (en) 2003-08-01
GB2366800A (en) 2002-03-20
NO339282B1 (no) 2016-11-21
TWI353358B (en) 2011-12-01
HU230669B1 (hu) 2017-07-28
NO2014026I1 (no) 2014-10-23
BRPI0106682B8 (pt) 2021-05-25
ZA200200097B (en) 2003-01-06
JP2003535591A (ja) 2003-12-02
SI2308975T1 (sl) 2016-11-30
US7977464B2 (en) 2011-07-12
PL353960A1 (pl) 2003-12-15
DE122010000027I1 (de) 2010-08-12
ATE451460T1 (de) 2009-12-15
CY2010011I2 (el) 2012-01-25
LT2308975T (lt) 2016-11-10
PT3059314T (pt) 2019-02-01
NZ516596A (en) 2004-07-30
IS3016B (is) 2019-10-15
EP2230308A1 (en) 2010-09-22
IS2808B (is) 2012-09-15
EP1287140B1 (en) 2009-12-09
ES2230975B2 (es) 2007-04-16
AP2002002690A0 (en) 2002-12-31
CA2380298A1 (en) 2001-12-13
CN1289671C (zh) 2006-12-13
NO334808B1 (no) 2014-06-02
CY2010011I1 (el) 2012-01-25
US7186820B2 (en) 2007-03-06
CY1118220T1 (el) 2017-06-28
BRPI0106682B1 (pt) 2020-10-13
EP1287140A1 (en) 2003-03-05
GB2366800B (en) 2005-01-19
EP2230308B1 (en) 2013-01-23
TR201900227T4 (tr) 2019-02-21
CZ300737B6 (cs) 2009-07-29
NL300982I9 (nl) 2019-05-06
BE2010C019I2 (pl) 2020-08-20
NO20020554D0 (no) 2002-02-04
NL300982I1 (pl) 2019-05-01
CA2707766A1 (en) 2001-12-13
LU91674I9 (pl) 2019-01-03
CY2019018I2 (el) 2020-05-29
DE60140738D1 (de) 2010-01-21
US20080269465A1 (en) 2008-10-30
HUP0202346A3 (en) 2004-11-29
CY2019018I1 (el) 2020-05-29
DK1287140T3 (da) 2010-04-19
SI2230308T1 (sl) 2013-06-28
US7012135B2 (en) 2006-03-14
HUP0202346A2 (en) 2002-10-28
NO2014026I2 (no) 2018-02-14
NO341218B1 (no) 2017-09-11
CZ2002837A3 (cs) 2002-05-15
HUP1600483A2 (pl) 2002-10-28
SI1287140T1 (sl) 2010-04-30
LU91674I2 (fr) 2010-05-31
NO20131316L (no) 2002-04-08
TW200817430A (en) 2008-04-16
DE10192353T1 (de) 2003-05-22
AU6051101A (en) 2001-12-17
DK3059314T3 (en) 2019-02-18
MXPA01013440A (es) 2003-09-04
HUS1700013I1 (hu) 2017-08-28
US20030026805A1 (en) 2003-02-06
GB0128386D0 (en) 2002-01-16
HU230553B1 (hu) 2016-11-28
JP5185143B2 (ja) 2013-04-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA2380298C (en) Antibody molecules having specificity for human tumor necrosis factor alpha, and use thereof
HK1228449B (en) Antibody molecules having specificity for human tumor necrosis factor alpha, and use thereof
HK1228449A1 (en) Antibody molecules having specificity for human tumor necrosis factor alpha, and use thereof
HK1156657B (en) Antibody molecules having specificity for human tumor necrosis factor alpha, and use thereof
HK1156657A (en) Antibody molecules having specificity for human tumor necrosis factor alpha, and use thereof
HK1051385B (en) Antibody molecules having specificity for human tumor necrosis factor alpha, and use thereof
HK1148776B (en) Antibody molecules having specificity for human tumor necrosis factor alpha, and use thereof