BG106278A - Специфични молекули на антитела за човешки туморен некрозен фактор алфа, и тяхното използване - Google Patents

Специфични молекули на антитела за човешки туморен некрозен фактор алфа, и тяхното използване Download PDF

Info

Publication number
BG106278A
BG106278A BG106278A BG10627802A BG106278A BG 106278 A BG106278 A BG 106278A BG 106278 A BG106278 A BG 106278A BG 10627802 A BG10627802 A BG 10627802A BG 106278 A BG106278 A BG 106278A
Authority
BG
Bulgaria
Prior art keywords
seq
antibody molecule
heavy chain
sequence
human
Prior art date
Application number
BG106278A
Other languages
English (en)
Other versions
BG66072B1 (bg
Inventor
Diljeet ATHWAL
Derek Brown
Andrew WEIR
Andrew POPPLEWELL
Andrew Chapman
David King
Original Assignee
Celltech R&D Limited
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=9893121&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=BG106278(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Celltech R&D Limited filed Critical Celltech R&D Limited
Publication of BG106278A publication Critical patent/BG106278A/bg
Publication of BG66072B1 publication Critical patent/BG66072B1/bg

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/241—Tumor Necrosis Factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6845—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a cytokine, e.g. growth factors, VEGF, TNF, a lymphokine or an interferon
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6875—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody being a hybrid immunoglobulin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Compression Of Band Width Or Redundancy In Fax (AREA)

Abstract

Изобретението се отнася до молекули на антитела, съдържащи най-малко една CDR производна или мише моноклонално антитяло, имащи специфичност към човешки TNFалфа, до CDR присадено антитяло, където най-малко една от CDRs е хибридна CDR. Изобретението се отнася и до ДНК последователности, кодиращи веригите на молекулите на антитела, до вектори, до трансформирани клетки гостоприемници, до използванетона молекулите на антитела при лечението на заболявания, медиирани чрез TNFалфа.

Description

Това изобретение се отнася до молекули на антитела. В молекулата на антитяло, има две тежки вериги, и две леки вериги. Всяка тежка верига и всяка лека верига има на нейния N-терминален край променлив домен. Всеки променлив домен се състои от четири рамкирани области (FRs), редуващи се с три комплементарно детерминантни области (CDRs). Остатъците в променливите домени се номерират конвенционално
I съгласно системата, създадена от Kabat et al., 1987 г., в Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, USA (тук по-надолу наричан “Kabat et al. (supra)”). Тази система за номериране се използува в настоящето описание, освен в случаите, когато се посочва друго.
Означенията на остатъка на Kabat не винаги съответствуват директно на линейното номериране на амино киселинните остатъци. Действителната линейна амино киселинна пос© ледователност може да съдържа по-малко, или повече амино киселини, отколкото в стриктното номериране на Kabat, отговаряйки на скъсяването на, или вмъкването във основна-та структура на променливия домен, на структурни компонен-ти, било рамки, било CDR. Точното номериране на Kabat на остатъците за дадено антитяло може да се определи чрез хомоложен ред на остатъци в последователност на анти-тялото със “стандартна” последователност, номерирана по Kabat.
CDRs на тежката верига на променлива област са е локализирани при остатъци 31 - 35 (CDRH1), остатъци 50 - 65 (CDRH2), и остатъци 95 - 102 (CDRH3), съгласно номерирането по Kabat.
CDRs на леката верига на променлива област са локализирани при остатъци 24 - 34 (CDRL1), остатъци 50 - 56 (CDRL2), и остатъци 89 - 97 (CDRL3), съгласно номерирането по Kabat.
Конструкцията на CDR -присадени антитела се описва в European Patent Application ЕР-А-0239400, който описва метод, по който CDRs на мише монокпонално антитяло се присажда върху рамкираните области на променливите домени на човешки имуноглобулин, посредством сайт насочена мутагенеза, използувайки дълги олигонуклеотиди. CDRs определят антиген свързващата специфичност на антителата, и са относително къси пептидни последователности, носени от рамковите области на променливите домени.
Последната работа върху хуманизирани моноклонални антитела чрез CDR-присаждане е осъществена върху моноклонални антитела, разпознаващи синтетични антигени, таки-ва като NP. Обаче, примери, в които мише моноклинално © антитяло, разпознаващо лизозим и моноклинално антитяло от плъх, разпознаващо антиген на човешки Т-клетки, са хуманизирани чрез CDR-присаждане, са описани от Verhoeyen et al. (Science, 239, 1534 - 1536, 1988), и Riechmann et al. (Nature, 332, 323-324, 1988), съответно.
Riechmann et al. смятат, че трансфера на CDRs единствено (както е дефинирано от Kabat (Kabat et al. (supra) и Wu et al., J. Exp. Med., 132, 211-250, 1970)) не е достатъчен, за да осигури задоволителна антиген свързваща активност в CDRприсадения продукт. Установено е, че голям брой от рамкирани остатъци трябва да са били изменени, така че те съответствуват на тези от рамковата област на донора. Предложените критерии за това, как да се избере кои от рамкираните остатъци имат нужда да бъдат променени, са описани в International Patent Application WO 90/07861.
Доста статии, дискутиращи CDR-присадени антитела бяха публикувани, включително Vaughan et al. (Nature Biotechnology, 16, 535-539, 1998).
TN Fa е про-възпалителен цитокин, който се освобождава от, и взаимодействува със клетки от имунната система. Така,
TN Fa се освобождава от макрофаги, които са били активирани посрадством липополизахариди (LPS) на грам отрицателни бактерии. Като такъв, TNFa изглежда, че се явява като ендогенен медиатор от централна величина, вклю-чен в развитието и патогеназиса на ендотоксичен шок, свър-зан с бактериален сепсис. TNFa също така е показал, че е upрегулиран в много от заболяванията на човека, включител-но хронични заболявания, такива като ревматоиден артрит, болестта на Крон, язвеноподобни колити и мултиплена Q склероза. Мишики, трансгенни за човешки TNFa, продуцират високи нива на TNFa в основни линии, и развиват спонтанни, деструктивни полиартрити, наподобяващи ревматоиден ар-трит (Kaffer et al., EMBP J., 10, 4025-4031, 1991). Поради това TNFa се смята за про-възпалителен цитокин.
Моноклонални антитела срещу TNFa бяха описани в предшествуващтото състояние на техниката. Medgar et al., (Hybridoma, 6, 305-311, 1987) описва миши моноклинални антитела срещу рекомбинантен TNFa. Fendly et al., (Hybridoma, 6, 359-370, 1987), описва използуването на миши моноклонални антитела срещу рекомбинантен TNFa при дефиниране на неутрализиращи епитопи на TNFa. Shimamoto et al., (Immunology Letters, 17, 311-318, 1988) описва изпол-зуването на миши моноклонални антитела срещу рекомби-нантен TNFy, и тяхното използуване за предотвратяване на ендотоксичен шок при мишки. Освен това, в International Patent Application WO 92/11383, са описани антитела, включи-телно CDR-присадени антитела, специфични за TNFa. Rankin et al., (British J. Rheumatology, 34, 334-342, 1995), описват използуването на такива CDR-присадени антитела при лече-нието на
ревматоиден артрит. US-A-5 919 452 описва анти-TNF химерни антитела и тяхното използуване при лече-ние на патологични случаи, свързани с наличието на TNF.
Антитела на TNFa са предложени за профилактика и лечение на ендотоксичен шок (Beulter et al., Science, 234, 470474, 1985). Bodmer et al., (Critical Care Medicine, 21, S446-, 1993) и Wherry et al., (Critical Care Medicine, 21,S436-S440, 1993) описват лечебната сила на анти-TNFa антитела при лечението на септичен шок. Използуването на анти-TNFa антитела при Q лечението на септичен шок също така е описано от Krischenbaum et al., (Critical Care Medicine, 26, 1625-1626, 1998). Артрит, индуциран от колаген, може да се лекува ефи-касно, използувайки анти-TNFa моноклонално антитяло (Williams et al. (PNAS-USA, 89, 9784-9788, 1992)).
Повишени нива на TNFa са намерени и в синувиалната течност, и в периферната кръв на пациенти, страдащи от ревматоиден артрит. Когато TNFa блокиращи средства се прилагат на пациенти, страдащи от ревматоиден артрит, те намаляват възпалението, подобряват симптоматиката, и забавят уврежданията на ставата (Artritis Rheum., 42, 1204-1208, 1999).
Използуването на анти-TNFa антитела при лечението на ревматоиден артрит и болестта на Крон е описано във Feldman et al., (Transplantation Proceedings, 30, 4126-4127, 1998), Adorini et al., (Trends in Immunology Today, 18, 209-211, 1997), и във Feldman et al., Advances in Immunology, 64, 283-350, 1997). Антителата за TNFa, използувани при такива лечения обикновенно са химерни антитела, такива като тези, описани в US-A-5 919 452.
Два продукта, блокиращи TNFa, са лицензирани понастоящем за лечение на ревматоиден артрит. Първият, наречен етанерсепт (etanercept), се продава от Immunen Corporation като Enbrel™. Той е рекомбинантен слят протеин, съдържащ две р75 разтворими области на TNF-рецептора, свързани към Fc протона на човешки имуноглобулин. Вторият, наречен инфликсимаб (infliximab), се продава от Centocor Corporation като Ремикад™ (Remicade™). Той е химерно антитяло, имащо миши анти-TNFa променливи области, и човешки lgG1 константни области.
В предшествуващото състояние на техниката рекомбинантните анти-TNFa молекули на антитела обикновенно имат намален афинитет към TNFa, в сравнение с антителата, от които произлизат променливите области, или CDRs, обикновенно се продуцират в клетки на бозайник, и са скъпи за производство. Анти-TNFa на антитела в предшествуващото състояние на техниката са описани в Stephens et al., \lmmunflfgy, 85, 668-674, 1995), GB-A-2 246 570 и GB-A-2-297 145.
ТЕХНИЧЕСКА СЪЩНОСТ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО
Има необходимост от молекула на антитяло за лечение на хронични възпалителни заболявания, която може да се използува с повторяемост, и да се получава лесно и резултатно. Има необходимост, също така, от молекула на антитяло, която има голям афинитет към TNFa, и ниска имуногеничност при човека.
По първия аспект, настоящето изобретение предоставя молекула на антитяЛЬ, която има специфичност към TNFa, съдържайки тежка верига, в която променливата област съдържа CDR (съгласно дефинирането по Kabat et al. (supra)), имаща последователността, дадена като Н1 на фигура 3 (SEQ ID N0:1) за CDRH1, като Н2’ на фигура 3 (SEQ ID N0:2), или като Н2 на фигура 3 (SEQ ID N0 : 7) за CDRH2, или като НЗ на фигура 3 (SEQ ID N0 : 3) за CDRH3.
Молекулата на антитяло по първия аспект на настоящето изобретение съдържа най-малко една CDR, избрана от групата, състояща се от Н1, Н2’, или Н2 и НЗ (SEQ ID N0:1; © SEQ ID NO : 2, или SEQ ID NO : 7и SEQ ID NO : 3), за променливата област на тежката верига. За предпочитане, молекулата на антитяло съдържа най-малко две, или повече, за предпочитане всичките три CDRs в тежката верига на променливата област.
Във втория аспект на настоящето изобретение, се предоставя молекула на антитяло, която има специфичност към човешки TNFa, съдържайки лека верига, в която променливата област съдържа CDR (съгласно дефинирането по Kabat eet al. (supra)), имаща последователността, дадена като L1 на фигура 3 (SEQ ID N0 : 4) за CDRL1, като L2 на фигура 3 (SEQ ID N0 : 5) за CDRL2, или като L3 на фигура 3 (SEQ ID N0 : 6) за CDRB3.
Молекулата на антитяло във втория аспект на настоящето изобретение съдържа най-малко една CDR, избрана от групата, състояща се от L1, L2 и L3 (SEQ ID N0 : 4 до SEQ ID N0 : 6) за леката верига на променливата област. За предпочитане, молекулата на антитялото съдържа най-малко две, или повече, за предпочитане всичките три CDRs в променливия домен на леката верига.
Молекулите на антитяло в първия и във втория аспект на настоящето изобретение за предпочитане имат комплементарна лека верига, или комплементарна тежка верига, съответно.
За предпочитане, молекулата на антитяло в първия и във втория аспект на настоящето изобретение съдържа тежка верига, в която променливата област съдържа CDR (съгласно дефинирането по Kabat et al. (supra)), имаща последователността, дадена като Н1 на фигура 3 (SEQ ID N0 : 1) за CDRH1, като Н2’ или като Н2 на фигура 3 (SEQ ID N0 : 2, или SEQ ID N0 : 7) за CDRH2, или като НЗ на фигура 3 (SEQ ID N0 : 3) за CDRH3, и лека верига, в която променливата област съдържа CDR (съгласно дефинирането по Kabat et al. (supra)), имаща последователността, дадена като L1 на фигура 3 (SEQ ID N0 : 4) за CDRL1, като L2 на фигура 3 (SEQ ID N0 : 5) за CDRL2, или като L3 на фигура 3 (SEQ ID N0 : 6) за CDRB3.
CDRs, дадени в SEQ IDS NOS : 1 и 3 до 7, и на фигура 3, отнасящи се до горното, са производни на моноклонално антитяло hTNF40 на мишка. Обаче, SEQ ID N0 : 2 се състои от хибридна CDR. Хибридната CDR съдържа част от тежката верига CDR2 на мише моноклонално антитяло I1TNF40 (SEQ ID NO : 7) и част от тежката верига от CDR2 на човешка група 3 зародишна линия последователност на V област.
Пълните последователности на променливите области на мише hTNF40 антитяло са показани на фигура 6 (лека верига) (SEQ ID N0 : 99) и на фигура 7 (тежка верига) (SEQ ID N0 : 100). Това мише антитяло по-долу се приема като “донорното антитяло”.
Първи алтернативно предпочитан вариант на първия, или на втория аспект на настоящето изобретение е монокло-нално мише антитяло hTNF40, имащо последователности на променливия домен на леката и на тежката верига, показани на фигура 6 (SEQ ID NO : 99), и на фигура 7 (SEQ ID NO : 100), съответно. Константната област на леката верига на hTNF40 е капа, а константната област на тежката верига е lgG2a.
Във втория алтернативно предпочитан вариант, антитялото съгласно, било първия, било втория аспект на настояще0 то изобретение, е химерна молекула на мише/човешко антитяло, приемано тук като химерна молекула на hTNF40 антитяло. Химерната молекула на антитяло съдържа променливи области на мише монокпонално антитяло hTNF40 (SEQ ID NO 99 и 100), и човешки константни области. За предпочитане, химерната молекула на антитяло hTNF40 съдържа човешка С капа област (Hieter et al., Cell, 22, 197-207, 1980; Genebank accession number J00241) в леката верига, и човешките гама 4 области (Flanagan et al., Nature, 300, 709-713,1982№, в теж-ката верига.
В трети алтернативно предпочитан вариант за изпълнение на настоящето изобретение, антитялото, било съгласно първия, било съгласно втория аспект на настоящето изобретение, е CDR-присадена молекула на антитяло. Терминът “CDRприсадена молекула на антитяло”, така, както се използува тук, се отнася до молекула на антитяло, където тежката и/или леката верига съдържа една, или повече CDRs (включително, при избор, хибридна CDR) от антитялото донор (например, мише моноклонално антитяло) присадено в рамката на променливата област на тежката и/или леката верига (например човешко антитяло).
За предпочитане, такова CDR-присадено антитяло има променлива област, съдържаща рамкови области на човешки приемник, така както и една, или повече от CDRs на донора, посочени по-горе.
Когато CDRs са присадени, която и да е приемлива рамкирана последователност на променлива област на приемника може да се използува, имаща отношение към класа/вида на ф антитялото на донора, от който произлизат CDRs, включително миши рамкирани области, рамкирани области на примат, или на човек. Примери за рамки на човек, които могат да се използуват в настоящето изобретение, са KOL, NEWM, REI, EU, TUR, TEI, LAY и РОМ Kabat et al. (supra)). Например, KOL и NEWM могат да се използуват за тежката верига, REI може да се използува за леката верига, a EU, LAY и РОМ могат да се | използуват за двете, и за тежката верига, и за леката верига.
Предпочитаните рамкирани области за леката верига са рамкираните области на човешка група 1, показани на фигура 1 (SEQ ID NO : 83, 85, 87 и 89). Предпочитаните рамкирани области за тежката верига са рамкираните области на човешка група 1 и група 3, показани на фигура 2 (SEQ ID NO : 91, 93, 95 и 97, и SEQ ID N0 : 106, 107, 108 и 109), съответно.
В CDR-присадено антитяло на настоящето изобретение, за предпочитане е като антитяло приемник да се използува такова, имащо вериги, които са хомолози на веригите на антитялото на донора. Не е необходимо тежката и леката вериги на приемника да бъдат непременно производни на същото анти
тяло, и могат, при желание, да съдържат вериги, имащи рамкирани области, производни на различни вериги.
Също така, в CDR-присадено антитяло на настоящето изобретение, рамкираните области не се нуждаят точно от същата последователност както тази на антитялото на приемника. Например, необичайните остатъци могат да бъдат променени до много по-често срещаните остатъци за този клас, или вид верига на приемника. Алтернативно, избрани остатъци в рамковите области могат да бъдат променени, така че те да Q съответствуват на остатъка, намиращ се на същата позиция в антитялото на донора. Такива промени би трябвало да се поддържат до минималната необходимост да възстановят афинитета на антитялото на донора. Протокол за избор на остатъци в рамковите области на приемника, които може да е необходимо да бъдат променени е описан във WO 91/09967.
За предпочитане, в молекула на CDR-присадено антитяло на настоящето изобретение, ако тежката верига на приемника има човешка група 1 на рамковите области (показано е на — фигура 2) (SEQ ID NOS : 91, 93, 95 и 97 ), тогава рамковите области на тежката верига на приемника съдържат, допълнително към една, или повече CDRs на донора, остатъци от донора на позиции 28, 69 и 71 (съгласно Kabat et al. (supra)).
Алтернативно, ако тежката верига на приемника има рамкови области група 1, тогава рамковите области на теж.ката верига на приемника съдържат, допълнително към една, или повече CDRs на донора, остатъци от донора на позиции 28, 38, 46, 67, 69 и 71 (съгласно Kabat et al. (supra)).
За предпочитане, в молекула на CDR-присадено антитяло на настоящето изобретение, ако тежката верига на приемника има рамкови области човешка група 3 (показано е на фигура 2) (SEQ ID NOS : 106, 107, 108 и 109 ), тогава рамковите области на тежката верига на приемника съдържат, допълнително към една, или повече CDRs на донора, остатъци от донора на позиции 27, 18, 30, 48, 49, 69, 71, 73, 76 и 78 (съгласно Kabat et al. (supra)).
За предпочитане, в молекула на CDR-присадено антитяло на настоящето изобретение, ако леката верига на приемника има рамкови области човешка група 1 (показано е на фигура 1) (SEQ ID NOS : 83, 85, 87 и 89 ), тогава рамковите области на леката верига на приемника съдържат, остатъци от донора на позиции 46, и 60 (съгласно Kabat et al. (supra)).
Остатъци от донора са остатъци от антитяло на донора, тоест, антитяло, от което произлизат оригиналните CDRs.
Молекулата на антитяло на настоящето изобретение може да съдържа: завършена молекула на антитяло, имаща цяла дължина тежка и лека верига; нейна част, такава, като например Fab, модифициран Fab, Fab’, F(ab’)2, или Fv фрагмент; мономер, или димер на лека верига, или мономер или димер на тежка верига; една верига на антитяло, например, една верига Fv, в която променливите области на тежката верига и на леката верига са свързани посредством пептиден линкер. По подобен начин, променливите области на тежката верига и на леката верига могат да са комбинирани с други области на антитяло като подходящи.
За предпочитане, молекулата на антитяло съгласно настоящето изобретение е фрагмент Fab. За предпочитане, фрагментът Fab има тежка верига, имаща последователността, дадена като SEQ ID N0 : 111, и лека верига, имаща последова13 телността, дадена като SEQ ID NO : 113. Амино киселинните последователности, дадени в SEQ ID NO 111 и SEQ ID NO : 113 за предпочитане са кодирани посредством нуклеотидните последователности, дадени в SEQ ID N0 :110, и SEQ ID N0 :112, съответно.
Алтернативно, за предпочитане, молекулата на антитяло съгласно настоящето изобретение е фрагмент Fab, в който модифицирането е присъединяването към С-терминалния край на неговата тежка верига на една, или повече амино киселини, за да дадат възможност за прикрепянето на молекула ефектор, или молекула репортер. За предпочитане, присъединените амино киселини образуват модифицирана стърчаща (hinge) област, съдържаща един, или два цистеинови остатъка, към които може да е прикрепена молекулата ефектор, или репортер. Такъв модифициран фрагмент Fab за предпочитане има тежка верига, имаща последователността, дадена като SEQ ID N0 ; 115, и лека верига, имаща последователността, дадена като SEQ ID N0 : 113. Амино киселинната последователност, дадена в SEQ ID N0 : 115 за предпочитане е кодирана посредством нуклеотидната последователност в SEQ ID N0: 114.
Предпочитана група ефектор е полимерна молекула, която може да бъде прикрепена към модифициран фрагмент Fab, за да повиши неговия полу-живот in vivo.
Полимерната молекула може, обикновенно, да бъде синтетичен, или природен полимер, например, по избор заместен полиалкилен, полиалкиленов, или полиоксиалкиленов полимер с права, ^ли разклонена верйга, иЛи полизахарид с разклонена, или с неразклонена верига, например, хомо-, или хетеропол изахарид.
По-специални заместители по избор, които могат да присъствуват в по-горе посочените синтетични полимери включват една, или повече хидрокси, метилови, или метокси групи. Поспециални примери на синтетични полимери включват по избор заместен поли(етиленгликол), поли(винилалкохол) поли(етиленгликол), или техни производни, с права, или с разклонена верига, по-специално, по избор заместен поли(етилен© гликол), такъв като метоксиполи(етиленгликол), или негови производни. По-специални природни полимери включват лактоза, амилоза, декстран, гликоген, или техни производни. “Производни”, така, както се използува тук, означава, че включва реактивни производни, например, тиол-селективни реактивни групи, такива като малеимиди, и други подобни. Реактивната група може да бъде свързана директно, или чрез свързващ сегмент към полимера. Трябва да се отбележи, че остатъкът на такава група понякога образува част от продукта, като свързваща група между фрагмента на антитялото и полимера.
Големината на полимера може да бъде различна, според желанието, но обикновенно трябва да е със средно молекулно тегло в границите от 500Da до 50000Da, за предпочитане, от SOOODa до 40000Da, а по-за предпочитане OT25000Da до 40000Da. Големината на полимера може по-специално да се избере на базата на използуването, за което е предназначен продукта. Така, например, Когато продукта е предназначен да напусне кръвообръщението и да проникне в тъканта, например, за използуване при лечение на тумор, може да е благоприатно да се използува полимер с малко молекулно тегло, например, с молекулно тегло от порядъка на приблизително 5000Da. При приложение, когато продукта остава в кръвообръщението, може да е благоприятно да се използува полимер с по-голямо молекулно тегло, например, имащ молекулно тегло в границите от 25000Da до 40000Da.
Особено предпочитаните полимери включват полиалкиленов полимер, такъв като например, поли(етиленгликол), I или, по-специално, метоксиполи(етиленгликол), или техни производни, и по-специално с молекулно тегло в границите от 0 25000Da до около 40000Da.
Всяка полимерна молекула, прикрепена към модифициран фрагмент на антитяло може да бъде прикрепена ковалентно към серния атом на цистеиновия остатък, намиращ се във фрагмента. Ковалентната връзка обикновенно е дисулфидна връзка, или, по-специално, връзка сяра-въглерод.
При желание, фрагментът на антитяло може да има една, или повече молекули ефектори, или репортери, при-качени към него. Молекулите ефектори, или репортери, могат да бъдат прикачени към фрагмента посредством която и да е подходяща амино киселинна странична верига, или терминал на амино киселинна функционална група във фрагмента, например, която и да е свободна амино, имино, хидрокси, или карбоксилна група.
Активиран полимер може да се използува като изходен продукт при получаването на полимер-модифицирани фрагменти на антитела, съгласно горното описание. Активираният | полимер може да бъде който и да е полимер, съдържащ тиолова реактивна група, такъв като а-халогенокарбоксилна j киселина, или естер, например, йодацетамид, имид, например, винил сулфон, или дисулфид. Такива изходни продукти могат да се доставят от търговската мрежа (например, от Shearwater Polymers Inc., Huntsville, AL, USA), или могат да се получат от достъпни чрез търговската мрежа изходни про-дукти, използувайки конвенционални химични методи.
По отношение на прикрепването на поли(етиленгликол)ови (PEG) остатъци, направена е литературна справка с “Poly(ethyleneglycol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications”, 1992, J. Milton Harris (ed), Plenum Press, New York, “Poly(ethyleneglycol) Chemistry and Biological Applications”, 1997, J. Milton Harris and S. Zalipsky (eds), American Chemical Society, Washington DC and “Bioconjugation Protein Coupling Technics for the Biomedical Sciences”, 1998, M. Aslam and A. Dent, Grove Publishers, New York.
Когато желанието е да се получи фрагмент на антитяло, свързан с молекула ефектор, или репортер, това може да се осъществи чрез стандартни химични методи, или стандартни методи за рекомбинантна ДНК, при които фрагмент на антитяло се свързва или директно, или посредством присъединяващо средство, към молекулата ефектор, или репортер, било преди, било след взаимодействие с активирания полимер, който е подходящ. По-специалните химични методи включват, например, тези, описани във WO 93/06231, WO 92/22583, WO 89/00195 и WO 89/01476. Алтернативно, когато молекулата ефектор, или репортер е протеин, или полипептид, свързването може да се осъществи, като се използуват методи за рекомбинантна ДНК, например, съгласно описаното във WO 86601533 и ЕР-А-0392745.
За предпочитане, модифицираният Fab фрагмент съгласно настоящето изобретение е PEG-илиран (тоест, има PRG (поли(етиленгликол)) ковалентно прикрепен към него) съгласно метода, описан в ЕР-А-0948544. За предпочитане, молекулата на антитяло съгласно настоящето изобретение е PEG-илиран модифициран Fab фрагмент, както е показано на фигура 13. Както е показано на фигура 13, модифицираният Fab фрагмент има малеимидна група, ковалентно свързана към единична тиолова група в модифицирана висяща област. Лизинов ф остатък е свързан ковалентно към малеимидната група. Към всяка една от амино групите на лизиновия остатък е прикрепен метоксиполи(етиленгликол)ов полимер, имащ молекулно тегло от порядъка на приблизително 20,000Da. Общото молекулно тегло на цялата молекула ефектор е приб-лизително 40,000Da.
За предпочитане, в съединенията, показани на фигура 13, тежката верига на частта от антитялото има последователността, дадена като SEQ ID N0 : 115, а леката верига има последователността, дадена като SEQ ID N0 : 113. Това & съединение тук се обозначава като CDP870.
Домените от константната област на молекулата на антитяло съгласно настоящето изобретение, ако присъствува, може да се избере, като се има предвид предложената функция на молекулата на антитялото, и по-специално, функциите на ефектор, които могат да се изискват. Например, домените на константните областите могат да са човешки IgA, IgD, IgE, IgG, или IgM области. По-специално, човешки IgG домени на константни области могат да се използуват, особено от изовидовете lgG1 и lgG3, когато молекулата на антитяло е предназначена да се използува за терапевтични цели, и се изисква
антитялото да има ефекторни функции. Алтернативно, изовидовете lgG2 и lgG4 могат да се използуват, когато молекулата на антитялото е предназначена да се използува за терапевтични цели, и не се изисква антитялото да има ефекторни функции, например, само за блокиране на активността на TNFa.
Също така, молекулата на антитяло съгласно настоящето изобретение може да има молекула ефектор, или репор-тер, прикрепена към нея. Например, тя може да има макро-цикъл, за превръщане на атом на тежък метал, или токсин, в хелатно съединение, такъв като рицин, прикрепен към нея, посредством ковалентна мостова структура. Алтернативно, технологии на методи за рекомбинантна ДНК могат да се използуват за получаването на молекула на антитяло, в която Fc фрагментът (СН2, СНЗ и висящи области), областите СН2 и СНЗ, или областта СНЗ на завършена молекула имуногробулин е (са) заместена (заместени) от, или е прикрепена към него посредством пептидна връзка, функционално не-имуноглобулинов протеин, такъв като ензим, или молекула токсин.
Молекулата на антитяло съгласно настоящето изобретение за предпочитане има свързващ афинитет най-малко 0,85x10’10М, по-предпочитано най-малко 0,75x10'10М, а найпредпочитано най-малко 0,5x10’10М. (Това не пречи, да се отбележи, че предпочитаната хуманизирана молекула на антитяло съгласно настоящето изобретение, както е описано подолу, има афинитет от порядъка на приблизително 0,5x10’10М, който е по-добър отколкото афинитета на мишето монокпонално антитяло, от което произлиза. Мишето антитяло има афинитет от порядъка на приблизително 0,85x10*1°М).
За предпочитане, молекулата на антитяло съгласно настоящето изобретение, съдържа променлива област hTNF40-gL1 (SEQ ID NO : 8) на леката верига, и променлива област gh3hTNF40.4 (SEQ ID NO : 11) на тежката верига. Последователностите на променливите области на тези лека и тежка вериги са показани на фигури 8 и 11, съответно.
Настоящето изобретение се отнася, също така, до варианти на молекулата на антитяло съгласно настоящето изобретение, които имат подобрен афинитет за TNFa. Такива ф варианти могат да се получат посредством многобройни протоколи за афинитетно узряване, включително мутиране на CDRs (Yang et al., J. Mol. Biol., 254, 392-403, 1995), размесване на верига (Marks et al., Bio/Technology, 10, 779-783, 1992), използуване на мутаторни щамове от Е. coli (Low et al., J. Mol. Biol., 250, 359-368, 1996№, ДНК размесване (Pattern et al., Curr. Opin. Biotechnol., 8, 724-733, 1997), phage display (Thomson et al., J. Mol. Biol., 256, 77-88, 1996), и сексуална PCR (Crameri et al., Nature, 391, 288-291, 1998). Vaughan et al. (supra) дискутира ©тези методи за афинитетно узряване.
Настоящето изобретение също така предоставя ДНК последователност, кодираща тежка(и) и/или лека(и) верига(и) на молекулата на антитяло съгласно настоящето изобретение.
За предпочитане, ДНК последователността, кодира тежка, или лека верига на молекулата на антитяло съгласно настоящето изобретение.
Съгласно един предпочитан вариант за изпълнение на настоящето изобретение, ДНК последователността кодира лека верига, и съдържа последователността, показана в
SEQ ID NO : 8 (hTNF40-gL1), или SEQ ID NO : 9 (h-TNF40-gL2 , или негов еквивалентен разпад на генетичния код.
Съгласно един алтернативен предпочитан вариант за изпълнение на настоящето изобретение, ДНК последователността кодира тежка верига, и съдържа последователността, показана в SEQ ID N0 : 10 (gh1hTNF40.4), или SEQ ID NO : 11 (gh3hTNF40.4 , или техен еквивалентен дегенерат.
ДНК последователността съгласно настоящето изобретение може да съдържа синтетична ДНК, например, получена ф посредством химичен процес, сДНК, геномна ДНК, или каквато и да е комбинация от тях.
Настоящето изобретение се отнася, също така, до вектор за клонирне, или за експресиране, съдържащ една, или повече ДНК последователности съгласно настоящето изобретение. За предпочитане, клониращият, или експресиращият вектор, съдържа леката верига, и тежката верига на молекулата на антитяло съгласно настоящето изобретение, съответно.
Съгласно един предпочитан вариант за изпълнение, настоящето изобретение предоставя експресиращ вектор на №
Е. coli, съдържащ ДНК последователност съгласно настоящето изобретение. За предпочитане, експресиращият вектор е pTTO(CDP870), както е показано схематично на фигура 22.
Настоящето изобретение също така съдържа вектор pDNAbEng-G1, както е показано на фигура 19.
Общи методи, чрез които могат да се конструират векторите, методи на трансфектиране, и методи за култивиране, са добре известни на специалистите в областта на техниката. В това отношение, е направена справка с “Current Protocols in Molecular Biology”, 1999, F. M. Ausubel (ed), Wley Interscience,
New York и the Maniatis Manual produced by Cold Spring Harbor Publishing.
ДНК последователности, които кодират молекулата на антитяло съгласно настоящето изобретение могат да бъдат получени посредством методи, добре познати на специалистите в областта на техниката. Например, ДНК последователности, кодиращи за част, или за цялата тежка, и лека вериги, могат да бъдат синтезирани от определени ДНК последователности, или на базата на съответстуващите амино кисеФ линни последователности.
ДНК кодираща за последователности на рамката за разчитане на приемника се прилага широко от специалистите в областта на техниката, и може лесно да се синтезира, на базата на нейните известни амино киселинни последовател
ности.
Стандартни техники на молекулярната биология могат да се използуват за получаване на ДНК последователности, кодиращи за молекулата на антитяло съгласно настоящето изобретение. Желаните ДНК последователности могат да се синтезират изцяло, или част от тях, използувайки олигонуклеотидни синтетични техники. Техники на сайт-насочена мутагенеза и на полимеразна верижна реакция (PCR), могат успешно да се използуват.
Която и да е подходяща система клетка гостоприемник/вектор, може да се използува за експресиране на ДНК последователности, кодиращи молекулата на антитяло съгласно настоящето изобретение. Бактериална, например Е. coli, и други микробни системи могат да се използуват, отчасти, за експресиране на фрагменти на антитяло, такива като Fab и
F(ab’)2 фрагменти, и по-специално Fv фрагменти и единични фрагменти от веригата на антитяло, например, единични Fvs. Еукариотни, например, системи за експреси-ране на клетки гостоприемници от бозайници, могат да се използуват за получаването на по-голями молекули на антитяло, включително завършени молекули на антитяло. Подходящи клетъчни системи гостоприемници на бозайници включват клетки СНО, клетки миелома, или хибридома.
Настоящето изобретение предоставя също така метод за О получаването на молекулата на антитяло съгласно настоящето изобретение, който се състои в култивиране на клетка гостоприемник, съдържаща вектор съгласно настоящето изобретение, в условия, подходящи за провеждане на експресиране на протеин от ДНК кодираща молекулата на антитяло съгласно настоящето изобретение, и изолиране на молекулата на антитяло.
За предпочитане, методът за получаване на молекулата на антитяло съгласно настоящето изобретение се състои в А култивиране на Е. coli, съдържащ Е. coli експресиращ вектор, съдържащ ДНК последователността съгласно настоящето изобретение, в условия, подходящи за провеждане на експресиране на протеин от ДНК последователността, и изолиране на молекулата на антитяло. Молекулата на антитяло може да се отдели от клетката, или да се насочи към периплазмата чрез подходящи единични последователности. Алтернативно, молекулите на антитяло могат да се натрупват вътре в клетъчната цитоплазма. За предпочитане, молекулата на антитяло се насочва в периплазмата. В зависимост от молекулата на антитяло, която е получена, и от метода, който е използуван, желателно е да се предостави възможност на молекулите на антитяло да обхванат и да възприемат функционално устройство. Методи за предоставяне на възможност на молекулите на антитяло да обхванат са добре познати на специалистите в областта на техниката.
Молекулата на антитялото може да съдържа полипептид само с тежка, или с лека верига, като в такъв случай е необходимо да се използува последователност, кодираща полипептид само с тежка, или с лека верига, за трансфектиране на ф клетки гостоприемници. За получаването на продукти, съдържащи и двете вериги, и тежка, и лека вериги, клетъчната линия може да се трансфектира с два вектора, първият вектор кодиращ полипептид с лека верига, а вторият вектор кодиращ полипептид с тежка верига. Алтернативно, може да се използува единичен вектор, като векторът включва последователности, кодиращи полипептиди с лека верига, и полипептиди с тежка верига.
Настоящето изобретение също така осигурява терапев©тичен, или диагностичен състав, съдържащ молекула на антитяло съгласно настоящето изобретение в комбинация с фармацевтично приемлив инертен пълнител, разредител, или носител.
Настоящето изобретение също така осигурява метод за получаване на терапевтичен, или диагностичен състав, съдържащ смес от молекула на антитяло съгласно настоящето изобретение, заедно с фармацевтично приемлив инертен пълнител, разредител, или носител.
Молекулата на антитяло може да е единствената активна съставна част в терапевтичния, или диагностичния състав, или може да се придружава от други активни съставни части, включително други сътавни части на антитела, например, антиТ клетка, анти-IFNy, или анти-LPS антитела, или съставни части, които не са на антитела, такива като ксантин.
Фармацевтичният състав за предпочитане трябва да съдържа терапевтично ефективно количество от антитялото съгласно изобретението. Терминът “терапевтично ефективно количество”, така както се използува тук, се отнася до количество от терапевтично средство, необходимо, за да лекува, подобрява, или да предотвратява набелязана болест, или състояние, или да показва откриваем терапевтичен, или превантивен ефект. За което и да е антитяло, терапевтично ефективната доза за еднократно приложение може да се прецени първоначално било при изследване на клетъчна култура, било в животински модели, обикновенно в гризачи, зайци, кучета, прасета, или примати. Животинският модел може също така да се използува, за да се определи границата на подходящата концентрация, и начина на приложение. Тази информация след това може да се използува, за да се определят полезните дози за еднократно приложение, и начина на приложение при човека.
Точното ефективно количество за човешки субект зависи от това, колко тежко е болестното състояние, от общото здравословно състояние на субекта, от възрастта, от теглото, и от пола на субекта, от хранителния режим, от времето и от честотата на приложение, от лекарствена(и) комбинация(и), от реакциите на чувствителност, и от толеранс/отговор към лечението. Това количество може да се определи, като се направи рутинно експериментиране и се преценява от клиницистите.
Обикновенно, ефективна доза за еднократно приложение е от 0,01 mg/kg до 50 mg/kg, за предпочитане 0,1 до 20 mg/kg, попредпочитано приблизително 15 mg/kg. Както е показано в примерите по-долу, дози за еднократно приложение от 1, 5 и 20 mg/kg се използуват за лечение на пациенти, страдащи от ревматоиден артрит.
Съставите могат да се прилагат индивидуално върху пациент, или могат да се прилагат в комбинация с други средства, лекарствени средства, или хормони.
© Дозата за еднократно приложение, при която се прилага молекулата на антитяло съгласно настоящето изобретение, зависи от характера на състоянието, което трябва да се лекува, степента, до която трябва да се неутрализира, нивото на TNFa, или да се експресира, повишаване на желано ниво, и дали молекулата на антитяло е била използувана профилактично, или за лечение на съществуващо болестно състояние.
Така, например, когато продуктът е за лечение, или за профилактика на хронично възпалително заболяване, такова като ревматоиден артрит, подходящите дози за еднократно приложение на молекулата на антитяло съгласно настоящето изобретение са в границите от 0,5 и 50 mg/kg, по-п ред почитано между 1 и 20 mg/kg, а най-предпочитано приблизително 15 mg/kg. Честотата на приложение на дозата за еднократно приложение зависи от полу-живота на молекулата на антитялото, и от продължителността на нейния ефект.
Ако молекулата на антитялото има кратък полу-живот (например 2 до 10 часа), може да е необходимо да се приемат една, или повече дози за еднократно приложение на ден. Алтернативно, ако молекулата на антитялото njyia дълъг полу живот (например 2 до 15 дена), може да е необходимо да се приеме дозата за еднократно приложение само веднъж на ден, на седмица, или даже веднъж на всеки 1, или 2 месеца.
Фармацевтичният състав може също така да съдържа фармацевтично приемлив носител за приложение на антитялото. Самият носител не трябва да индуцира получаването на антитела, вредни за индивида, получаващ състава, и не трябва да бъде токсичен. Подходящи носители могат да бъдат голями, слабо метаболизирани макромолекули, такива като протеини, полипептиди, липозоми, полизахариди, полимлечни киселини, полигликолови киселини, полимерни амино киселини, съполимери на амино киселини, и инактиви-рани части от вируси.
Могат да се използуват фармацевтично приемливи соли, например, соли на минерални киселини, такива като хидрохлориди, хидробромиди, фосфати и сулфати, или соли на органични киселини, такива като ацетати, пропионати, малонати, и бензоати.
Фармацевтично приемливите носители в лекарствените състави могат допълнително да съдържат течности, такива като вода, физиологичен разтвор, глицерол и етанол. Освен това, в такива състави могат да присъствуват помощни вещества, такива като овлажнители, или емулгиращи средства, или pH буфериращи вещества. Такива носители дават възможност от фармацевтичните състави да бъдат изготвени лекарствени форми като таблетки, пилюли, дражета, капсули, течности, гелове, сиропи, емулсии и суспензии, за приемане от пациента.
Предпочитаните форми за приложение включват форми, подходящи за парентерално приложение, например, чрез инжектиране, или чрез инфузия, например, чрез голяма инжекция, или продължителна инфузия. Когато продуктът е за инжектиране, или за инфузия, той може да е под формата на суспензия, разтвор, или емулсия в маслен, или воден вехикулум, и може да съдържа средства, подпомагащи образуването на лекарствената форма, такива като суспендиращи средства, консервиращи средства, стабилизиращи сред© ства и/или диспергиращи средства. Алтернативно, молекулата на антитяло може да е под формата на сух продукт, за възстановяване преди използуването с подходяща стерилна течност.
След като вече са получени под формата на лекар-твени форми, съставите съгласно изобретението могат да се прилагат директно върху субекта. Субекта, който ще се лекува може да е животно. Обаче, за предпочитане е съставите да са пригодени за приложение върху субекти хора.
• Фармацевтичните състави съгласно това изобретение могат да се прилагат посредством който и да е от многобройните начини, включително, но без да се ограничават от, орално, венозно, мускулно, интрартериално, интрамедуларно, в гръбначно мозъчния канал, интравентрикуларно, трансдермално, през кожата (например, виж WO98/20734), подкожно, интраперитонеално, в носа, чревно, локално, под езика, във вагината, или ректума. Хипоспрейове могат също така да се използуват за приложение на фармацевтичните състави на изобретението. Характерно, лекарствените състави могат да се приготвят като инжектируеми, било като течни разтвори, било
като суспензии. Могат да се получават твърди форми, подходящи за разтваряне в течни вехикулуми, или за суспендиране в течни вехикулуми, преди инжектирането.
Директното доставяне на съставите обикновенно се осъществява чрез инжектиране, подкожно, интраперитонеално, интравенозно, или интрамускулно, или доставяни в промеждутъчните цепнатини на тъканта (интерстициално). Съставите могат също така да се прилагат в лезия. Лечението с дози за еднократно приложение може да е съгласно разписание с единична доза за еднократно приложение, или съгласно разписание с повече дози за еднократно приложение.
Трябва да се отбележи, че активната съставна част в състава е молекула на антитяло. И като такъв, той трябва да е чувствителен към разграждане в гастроинтестиналния тракт. Така, например, ако съставът е за приложение по начин, използуващ гастроинтестиналния тракт, съставът трябва да съдържа средства, които защитават антитялото от разграждане, но които освобождават антитялото, след като вече е бил абсорбиран от гастроинтестиналния тракт.
Пълна дискусия за фармацевтично приемливи носители е предоставена от Remington’s Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, N. J. 1991).
Предвижда се, също така, антитялото съгласно настоящето изобретение да се прилага за целите на генната терапия. С цел да се постигне това, ДНК последователности, кодиращи тежка верига и лека верига на молекулата на антитяло при контролиране на подходящи съставни части на ДНК, се внасят в пациент по такъв начин, че веригите на антитялото се експресират от ДНК последователностите, и се натрупват in situ.
Настоящето изобретение също така предоставя молекулата на антитялото съгласно настоящето изобретение за използуване при лечението на заболяване, медиирано от TNFa.
Настоящето изобретение също така предоставя използуването на молекулата на антитялото съгласно настоящето изобретение при получаването на лекарствено средство за ф лечението на заболяване, медиирано от TNFa.
Молекулата на антитялото съгласно настоящето изобретение може да се използува при каквото и да е лечение, където е желателно да се редуцира нивото на биологично активен TNFa, присъствуващ в тялото на човек, или в тялото на животно. TNFa може да циркулира в тялото, или да присъствува в нежелателно високо ниво, локализиран в специален сайт в тялото.
Например, повишени нива на TNFa са замесени при остри • и хронични имунни и имунорегулаторни заболявания, инфекции включващи сепсис, ендотоксичен шок и шок на сърдечносъдовата система, възпалителни заболявания, нервнодегенеративни заболявания, злокачествени заболявания и индуциран от алкохол хепатит. Подробности за многобройните заболявания, свързани с повишени нива на TNFa са изложени в US-A-5 919 452. Молекулата на антитяло съгласно настоящето изобретение може да се използува при лечението на заболявания, медиирани от TNFa. Особено важни заболявания, които могат да се лекуват посредством молекулата на антитяло съгласно настоящето изобретение включват сепсис,
конгестивна сърдечна недостатъчност, септичен, или ендотоксичен шок, кахексия, синдром на дихателно страдание при възрастни, СПИН, алергии, псориазис, туберкулоза, възпалителни заболявания на костите, заболявания свързани със съсирването на кръвта, изгаряния, епизодите на отхвърляне след трансплантиране на органи и тъкани, болестта на Крон, и автоимунни заболявания, такива като тироидит и ревматоиден- и остео-артрити.
Освен това, молекулата на антитяло, или състава могат да се използуват: за намаляване на странични ефекти, свързани с генериране на TNFa по време на неопластично лечение; за отстраняване, или за намаляване на шокови симптоми, свързани с лечението, или с предотвратяването на отхвърлянето на присаждания чрез използуване на анти-лимфоцитно антитяло; или за лечение на увреждане на много органи.
Молекулата на антитялото съгласно настоящето изобретение за предпочитане се използува за лечение на ревматоиден- и остео-артрити.
Настоящето изобретение също така предоставя метод за лечение на субекти хора, или животни, страдащи от, или при риск от увреждания, медиирани от TNFa, като методът се състои в приложение върху субекта на ефективно количество от молекулата на антитяло съгласно настоящето изобретение.
Молекулата на антитялото съгласно настоящето изобретение за може също така да се използува при поставяне на диагнози, например при поставяне на диагнози in vitro, и образно представяне на болестни състояния, включващи повишени нива на TNFa.
~ .............. ..... ' .-
Настоящето изобретение също така предоставя молекула на антитяло, съдържаща хибриден CDR, съдържащ съкратена последователност от CDR на донор, където липсващата част от съкратената CDR на донор е заместена от различна последователност, и образува функционална CDR. Терминът “хибридна CDR”, така, както се използува тук, означава CDR, съдържаща CDR от донор, който е бил изрязан в една, или друга позиция, например, в единия, или и в двата му краища. Липсващата част от изрязаната CDR на донор е © заместена от различна последователност, и образува цяла и функционална CDR. Хибридната CDR има най-малко една промяна на амино киселина, сравнен с цялата CDR от донора. Последователността, заместваща изрязаната част на CDR може да е която и да е последователност. За предпочитане, недонорната част на CDR последователността е от антитялото, от което произлизат рамкираните области на молекулата на антитялото, такава като последователност на антитяло на зародишна линия.
Установено е, че молекулата на антитяло, съдържаща хибридна CDR запазва по същество същия афинитет на свързване, както молекула на антитяло, съдържаща цели CDRs на донор. Терминът “по същество същия афинитет”, така, както се използува тук, означава най-малко 70 %, по-предпочитано наймалко 85 %, а най-предпочитано най-малко 95 %, от афинитета на свързване на съответната молекулата на антитяло, съдържаща цели CDRs на донор. Както се посочва по-горе, в някои случаи, афинитетът на антитялото съгласно изобретението може да бъде по-голям, отколкото този на антитялото на донора. Използуването На хибридна CDR предоставя
МЙМ предимството за намаляване количеството на чуждата (тоест, от донора) последователност, присъствуваща в молекулата на антитялото, и може да повиши афинитета на свързване на молекулата на антитялото, в сравнение със съответната молекула на антитялото, съдържаща цели CDRs на донор.
Които и да са от CDRs на молекулата на антитялото могат да са хибриди. За предпочитане, CDR2 от тежката верига е хибридна в молекулата на антитялото.
За предпочитане, изрязването на CDR на донора е от 1 до 0 8 амино киселини, по-предпочитано от 4 до 6 амино киселини.
Предпочитано е, също така, изрязването да се прави при С-терминуса на CDR.
В зависимост от последователността на изрязаната част на CDR, и от последователността на различната последователност, заместваща липсващата част, могат да се направят множество промени на амино киселини. За предпочитане, правят се промени най-малко на 2 амино киселини, по-предпочитано, правят се промени най-малко на 3 амино киселини, а найпредпочитано, правят се промени най-малко на 4 амино киселини.
По-специален вариант за изпълнение в този аспект на изобретението е антитяло, съгласно първия аспект на изобретението, в който втората CDR в тежката верига има последователността, дадено като SEQ ID NO : 2. Тя има по-добър афинитет към неговия антиген, отколкото има антитялото на донора, от който произлиза част от CDR.
Настоящето изобретение също така предоставя последователност на нуклеинова киселина, която кодира молеку33 лата на антитяло, съдържаща хибридна CDR съгласно настоящето изобретение.
Настоящето изобретение също така предоставя вектор за експресиране, съдържащ последователността на нуклеинова киселина, кодираща молекулата на антитяло, съдържаща хибридна CDR съгласно настоящето изобретение.
Настоящето изобретение също така предоставя клетка гостоприемник, трансформирана с вектора съгласно настоящето изобретение.
© Настоящето изобретение също така предоставя метод за получаване на молекула на антитяло, съдържаща хибридна CDR, който се състои в култивиране на клетка гостоприемник съгласно настоящето изобретение, и изолиране на молекулата на антитялото.
Настоящето изобретение също така описва само по илюстративен начин в следващите примери, които се отнасят до придружаващите фигури, в които:
Фигура 1 показва рамкирани области на лека верига на човешка подгрупа 1, сравнени с рамкирани области на лека ® верига на hTNF40 (SEQ ID NOS : 83 до 90);
Фигура 2 показва рамкирани области на тежка верига на човешка подгрупа 1 и подгрупа 3, сравнена с рамкирани области на лека верига на hTNF40 (SEQ ID NOS : 98 и 106 до 109);
Фигура 3 показва аминокиселинна последователност на CDRs на hTNF40 (SEQ ID NOS : 1 до 7), където CDR Н2’ е хибридна CDR, където шестте амино киселини на С-терминала са от Н2 CDR последователността на антитяло на зародишна линия на човешка подгрупа 3, и амино киселинните промени в последователността, получени в резултат на това хибридизиране са подчертани;
Фигура 4 показва вектор pMR15.1;
Фигура 5 показва вектор pMR14;
Фигура 6 показва нуклеотида и предварително зададената амино киселинна последователност на миши hTNF40VI (SEQ ID NO : 99);
Фигура 7 показва нуклеотида и предварително зададената амино киселинна последователност на миши hTNF40Vh О (SEQ ID NO: 100);
Фигура 8 показва нуклеотида и предварително зададената амино киселинна последователност на hTNF40-gL1 (SEQ ID NO : 8);
Фигура 9 показва нуклеотида и предварително зададената амино киселинна последователност на hTNF40-gL2 (SEQ ID NO : 9);
Фигура 10 показва нуклеотида и предварително зададената амино киселинна последователност на gh1hTNF40.4 (SEQ ©ID NO: 10);
Фигура 11 показва нуклеотида и предварително зададената амино киселинна последователност на gh3hTNF40.4 (SEQ ID NO: 11);
Фигура 12 показва вектор CTIL-gL6;
Фигура 13 показва структурата на съединение наречено CDP870, съдържащо модифициран Fab фрагмент, производен на антитяло hTNF40, ковалентно свързан посредством цистеинов остатък към лизил-малеимиден линкер, където всяка амино група на лизиловия остатък има ковалентно прикрепен към нея метокси PEG остатък, където η е приблизително 420.
Фигура 14 показва вектор pTTQ9;
Фигура 15 показва последователността на ОтрА олигонуклеотидния адаптер, (SEQ ID NO : 101);
Фигура 16 показва вектор pACYC184;
Фигура 17 показва вектор рТТО-1;
Фигура 18 показва вектор рТТО-2;
Фигура 19 показва вектор pDNAbEng-G1;
Фигура 20 показва олигонуклеотидните касети, кодиращи различни междугенни последователности за експресиране на © модифициран Fab в Е. coli (SEQ ID NOS : 102 до 105);
Фигура 21 показва акумулиране на периплазматичен модифициран Fab на IGS варианти.
Фигура 22 показва вектор pTTO(CDP870);
Фигура 23 показва резултата за активността на заболяването (DAS) при пациенти, лекувани с различни дози от CDP870 и с плацебо. Средните и IQ граници са представени за популация на протокол, с последното проведено наблюдение преди това. Малките карета показват плацебо, карото показват 1 mg/kg, триъгълниците показват 5 mg/kg, а големите карета ©
показват 20 mg/kg;
Фигура 24 показва броя на меките стави, броя на подутите стави, резултата за болка, общата оценка на експерта за активността на заболяването, въпросника за оценка на модифицираното здравословно състояние (HAQ), С реактивен протеин (CPR) и скоростта на утаяване на еритроцитите (ESR) при пациенти, лекувани с различни дози от CDP870 и с плацебо. Средните и IQ граници са представени за популация на протокол, с последното проведено наблюдение преди това. Малките карета показват плацебо, карото показват 1 mg/kg, триъгълниците показват 5 mg/kg, а големите карета показват 20 mg/kg;
ПРИМЕРИ ЗА ИЗПЪЛНЕНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО
Генно клон и ра не и експресиране на химерна молекула на антитяло hTNF40
Получаване на РНК от hTNF40 хибридома клетки
Обща РНК се получава от 3 х 107 hTNF40 хибридома © клетки, както е описано по-долу. Клетките се промиват с физиологичен разтвор, и се разтварят в РНК-зол (0,2 ml на 106 клетки). Прибавя се хлороформ (0,2 ml на 2 ml хомогенат), сместа се разклаща енергично в продължение на 15 секунди, и след това се оставя в лед в продължение на 15 минути. Получените водна и органична фази се разделят чрез центрофугиране в продължение на 15 минути в центрофуга Eppendorf, и РНК се утаява из водната фаза чрез прибавяне на равен обем изопропанол. След 15 минути в лед, РНК се гранулира чрез центрофугиране, промива се със 70 % етанол, суши се, и се разтваря в стерилна, вода не съдържаща РНК-за. Добивът на РНК е 400 pg.
PCR клониране на hTNF40Vh и VI
Последователности сДНК, клониращи за различни области на тежка и лека вериги на hTNF40, се синтезират, използувайки обратна транскриптаза, за да се получат копия еднична верижна сДНК от иРНК, присъствуващи в общата РНК, последвано от верижна полимеразна реакция (PCR) в сДНК-тата, със специфични олигонуклеотидни праймери.
WmWiWWHIi
a) Синтезиране на сДНК сДНК се синтезира в 20 μΙ реакционен обем, съдържащ следните реактиви: 50 тМ трис-HCI pH 8,3, 75 mM KCI, 10 тМ дитиотрейтол, 3 mM MgCI2, 0,5 тМ от всеки един дезоксирибонуклеозиден трифосфат, 20 единици PHK-sin, 75 ng случаен хексануклеотиден праймер, 2 pg hTNF40 РНК и 200 единици Moloney Murine Leukemia Virus обратна транскриптаза. След инкубиране при 42°С в продължение на 60 минути, реакцията се спира, посредством нагряване при 95°С в продължеО ние на 5 минути.
b) PCR
Аликвотни части от сДНК се подлагат на PCR, използувайки комбинации от праймери, специфични за тежка и лека верига. Нуклеотидните последователности на 5’ прайме-рите за тежката и за леката верига са показани в таблици 1 и 2, съответно. Всички тези последователности съдържат, по реда на начални 7 нуклеотиди на рестрикционен сайт откъм неговите 5’ краища, последователността GCCGCCACC (SEQ ID N0 : 12), за да предостави оптимална транслация на получената иРНК, кодон за иницииране и 20 - 30 нуклеотиди, базиращи се на лидерните пептидни последователности на известни миши антитела (Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, 5th Edition, 1991, U. S. Departement of Health and Human Services, Public Health Serviceq National Institutes of Health).
Праймерите З’са показани на таблица 3. Праймера на леката верига обхваща J-С връзката на антитялото, и съдържа рестрикционен сайт за ензима Sp1l, за да се улесни клонирането на фрагмента V1 PCR. Праймерите на тежките вериги 3’ са смес, предназначена да обхване -С връзката на антитялото.
Праймерът 3’ включва Apal рестрикционен сайт, за да се улесни клонирането. Регионът 3’ на праймерите съдържа смесена последователност, на базата на тази, намерена в познати миши антитела (Kabat et al., 1991, supra).
Описаните по-горе комбинации от праймери дава възможност на продуктите PCR за Vh и V1, да бъдат клонирани директно в подходящ експресиращ вектор (виж по-долу), за получаване на химерни (миши - човешки) тежка и лека вериги, и за това да бъдат експресирани гени в клетки на бозайник, за © получаване на химерни антитела от желания изотип.
Осъществява се инкубибиране (100μΙ) за PCR, както следва. Всяка реакция се състои от 10 тМ трис-HCI pH 8,3, 1,5 mM MgCI2, 50 тМ KCI, 0,01 % wtaenaTHH, 0,25 тМ всеки дезоксирибонуклеозид трифосфат, 10 pmoles 5’ праймер смес (таблица 4), 10 pmoles 3’ праймер (CL12 (лека верига), или R2155 (тежка верига) (таблица 3)), 1 μΙ сДНК, и 1 единица Taq полимераза. Реакциите се инкубират при 95°С в продължение на 5 минути, и след това се пускат в цикъл при 94°С в продължение на 1 минута, при 55°С в продължение на 1 ©
минута, и при 72°С в продължение на 1 минута. След 30 цикъла, аликвотни части от всяка реакция се анализират чрез електрофореза върху агарозен гел. Реакциите с лека верига, съдържащи смеси 5’ праймер от обединения 1, 2 и 7 на лека верига продуцират ивици с размери в съгласие с фрагменти VI в цяла държина, докато реакцията от реакционно обединение 3 на тежка верига продуцира фрагмент с размер очакван за Vh ген. Ивицата, продуцирана от праймери на обединение 1 на лека верига не се следва, като предишните резултати показват, че тази ивица съответствува на псевдоген на лека верига, продуциран от клетка хибридома. Ивицата, продуцирана от праймери на обединение 7 от лека верига е по-тънка от ивицата на праймерите на обединение 2, и поради това не се следва. Само ивицата от реакционно обединение 2 на лека верига, която е най-здравата ивица, се следва.
c) Молекулярно клониране на фрагменти PCR
ДНК фрагментите, продуцирани в реакционния състав 2 на лека верига, разграден с ензимите BstBI и Sp11, концентриран чрез утаяване с етанол, подложен на електрофореза в Q 1,4 % агарозен гел, и възтановени ДНК ивици в границите на 400 базови двойки. Те се клонират чрез лигиране във вектора PMR15.1 (фигура 4), който е обработен с рестрикционни ензими BstBI и Sp11. След лигирането, смесите се трансформират в Е. coli LM 1035, и плазмиди от получените бактериални колонии скринирани за инсерти чрез разграждане с BstBI и Sp1l. Представители с инсерти от всяко лигиране се анализират след това, чрез нуклеотидно секвениране.
По подобен начин, ДНК фрагменти, продуцирани в реакционното обединение 3 на тежка верига, се разграждат с Hindlll и Apal, и клонирани във вектор pMR14 (фигура 5), който се обработва с рестрикционни ензими Hindlll и Apal. Отново, представителни плазмиди, съдържащи инсерти, се анализират чрез нуклеотидно секвениране.
d) Изследване на нуклеотидна последователност
Плазмидна ДНК от голям брой изолати, съдържаща Vh инсерти се секвенира, използувайки праймерите R1053 (виж таблица 5) (който праймира 3’ областта на HCMV промотора в pMR14) и R720 (виж таблица 5) (който праймира 5’ областта на човешки С - гама 4 и дават възможност да се секвенира чрез
ДНК инсерт върху pMR14). Установи се, че нуклеотидните последователности на Vh инсерта в голям брой клонове са идентични, с изключение за различията в сигналния пептид и J областите. Това посочва, че изследваните клонове са независими изолати, произтичащи от използуването на различни праймери от сместа на олигонуклеотиди в течение на CDR етапа. Определената нуклеотидна последователност и предварително зададената амино киселинна последователност на променливия домен на тежката верига на антитяло hTNF40 © (hTNF40Vh) са дадени на фигура 7 (SEQ ID NO : 100).
За да се анализират клоновете на лекато верига, изследва се последователността, произлизаща от праймирането с R1053 (виж таблица 5) и R684 (SEQ ID NO : 62) (който запълва 5’ областта на човешки С - капа, и дава възможност да се проследи последователност чрез ДНК инсерт в pMR15.1). Нуклеотидната последователност и предварително зададената амино киселинна последователност на гените VI, произтичащи от реакциите на обединение 2, са анализирани по еднакъв начин. Отново, се установи, че нуклеотидните последова® телности на Vh инсерт в голям брой клонове са идентични, с изключение за различията в сигналния пептид и J областите, което показва, че изследваните клонове са независими изолати, произтичащи от използуването на раз-лични праймери от сместа на олигонуклеотиди, използувана в течение на CDR етапа. Определената нуклеотидна последо-вателност и предварително зададената амино киселинна последователност на променливия домен на леката верига на антитяло hTNF40 (hTNF40V1) са дадени на фигура 6 (SEQ ID NO : 99).
Таблица 1
Олигонуклеотидни праймери за областта 5’ на миши тежки вериги.
СН1 : 5’
ATGAAATGCAGCTGGGTCAT(G,C)TTCTT3’ (SEQ ID N0:13)
СН2 : 5’ATGGGATGGAGCT(A,G)TATCAT(C,G)(C,T)TCTT3’ (SEQ ID N0:14) © CH3 : 5ATGAAG(A,T)TGTGGTTAAACTGGGTTTT3’ (SEQ ID N0:15)
CH4 : 5ATG(G,A)ACTTTGGG(T,C)TCAGCTTG(G,A)T3’ (SEQ ID N0:16)
CH5 : 5ATGGACTCCAGGCTCAATTTAGTTTT3’ (SEQ ID N0:17)
CH6 : 5’ATGGCTGTC(C,T)T(G,A)G(G,C)GCT(G,A)CTCTTCTG3’ • (SEQ ID N0:18)
CH7 : 5’ATGG(G,A)ATGGAGC(G,T)GG(G,A)TCTTT(A,C)TCTT3’ (SEQ ID N0:19)
CH8 : 5’ATGAGAGTGCTGATTCTTTTGTG3’ (SEQ ID N0:20)
CH9 : 5’ATGG(C,A)TTGGGTGTGGA(A,C)CTTGCTATT3’ (SEQ ID N0:21)
CH10: 5’ATGGGCAGACTTACATTCTCATTCCT3’ (SEQ ID N0:22) ш
СН11: 5ATGGATTTTGGGCTGATTTTTTTTATTG3’ (SEQ ID N0:23)
CH12: 5 ATGATGGTGTTAAGTCTTCTGTACCT3’ (SEQ ID N0:24)
Всеки един от горните праймери има последователността 5’GCGCGCAAGCTTGCCGCCACC3’ (SEQ ID NO : 25), прибавена към неговия 5’ край.
ф Таблица 2
Олигонуклеотидни праймери за областта 5’ на миши леки вериги.
CL1 : 5’ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCT3’ (SEQ ID N0:26)
CL2 : 5ATGGAG(T,A)CAGACACACTCCTG(T,C)TATGGGT3’ (SEQ ID N0:27)
CL3 : 5’ATGAGTGTGCTCACTCAGGTCCT3’ _ (SEQ ID N0:28) • CL4 :
5ATGAGG(G,A)CCCCTGCTCAG(A,T)TT(C,T)TTGG3’ (SEQ ID N0:29)
CL5 :
5ATGGATTT(T,A)CAGGTGCAGATT(T,A)TCAGCTT3’ (SEQ ID N0:30)
CL5A :
5’ATGGATTT(T,A)CA(A,G)GTGCAGATT(T,A)TCAGCTT3’ (SEQ ID N0:31)
CL6 :
5ATGAGGT(T,G)C(T,C)(T,C)TG(T,C)T(G,C)AG(T,C)T(T,C)
CTG(A,G)G3’ (SEQ ID N0:32)
CL7 : 5ATGGGC(T,A)TCAAGATGGAGTCACA3’ (SEQ ID N0:33)
CL8:
5ATGTGGGGA(T,C)CT(G)OTTT(T,C)C(A>C)(A,C)TTTTTCAAT3’ (SEQ ID N0:34)
CL9 :
© 5ATGGT(G,A)TCC(T,A)CA(G,C)CTCAGTTCCTT3’ (SEQ ID N0:35)
CL10 : 5’ATGTATATATGTTTGTTGTCTATTTC3’ (SEQ ID N0:36)
CL11 : 5ATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTT3’ (SEQ ID N0:37)
CL12A:
5ATG(A,G)AGT(T,C)(A,T)CAGACCCAGGTCTT(T,C)(A,G)T3’ (SEQ ID N0:38)
CL12B:
® 5ATGGAGACACATTCTCAGGTCTTTGT3’ (SEQ ID N0:39)
CL13:
5ATGGATTCACAGGCCCAGGTTCTTAT3’ (SEQ ID N0:40) CL14:
5ATGATGAGTCCTGCCCAGTTCCTGTT3’ (SEQ ID N0:41) CL15:
5ATGAATTTGCCTGTTCATCTCTTGGTGCT3’ (SEQ ID N0:42)
CL16:
5’ATGGATTTTCAATTGGTCCTCATCTCCTT3’ (SEQ ID N0:43)
CL17A:
5ATGAGGTGCCTA(A,G)CT(C,G)AGTTCCTG(A,G)G3’ (SEQ ID N0:44)
CL17B :
5ATGAAGTACTCTGCTCAGTTTCTAGG3’ (SEQ ID N0:45) CL17C :
© 5ATGAGGCATTCTCTTCAATTCTTGGG3’ (SEQ ID N0:46)
Всеки един от горните праймери има последователността 5’GGACTGTTCGAAGCCGCCACC3’ (SEQ ID NO : 47), прибавена към неговия 5’ край.
Таблица 3
Олигонуклеотидни праймери за областта 3’ на миши Vh и VI гени w Лека верига (CL12):
5OGATACAGTTGGTGCAGCATCCGTACGTTT3’ (SEQ ID NO : 48)
Тежка верига (R2155): 5’GCAGATGGGCCCTTCGTTGAGGCTG(A,C)(A,G)GAGAC (G,T,A)GTGA3’ (SEQ ID NO : 49)
Таблица 4
a) 5’ смеси от праймери за PCR реакции на лека верига
обединение 1 обединение 2 обединение 3 обединение 4 обединение 5 обединение 6 обединение 7 обединение 8 CL2. CL7. CL13. CL6. CL5A, CL9, CL17A. CL8. CL12A. CL1, CL3, CL4, CL5, CL10, CL11, CL2B
CL14, CL15, CL16, CL17B, CL17C
Ь) 5’ смеси от праймери за PCR реакции на тежка верига обединение 1 : СН1, СН2, СНЗ, СН4.
обединение 2 : СН5, СН6, СН7, СН8.
обединениеЗ : СН9, СН10, СН11, СН12.
Таблица 5
Праймери, използувани при изследване на нуклеотидна последователност
R1053 : 5’GCTGACAGACTAACAGACTGTTCC3’ (SEQ ID NO : 50)
R720: 5OCTCTCGGAGGTGCTCCT3’ (SEQ ID NO : 51)
Оценяване на активностите на химерните гени
Активностите на химерните гени се оценява чрез тяхното експресиране в клетки на бозайник, и пречистване и количествено определяне на синтезираните нови антитела. Методиката за това е описана по-долу, след което следва описание на изследванията на биохимична и клетъчна основа, използувани за биохимичната характеристика на антителата.
!
а) Получаване на молекула на химерно hTNF40 антитяло.
Химерно антитяло за биологична оценка се получава чрез временно експресиране на подходящи двойки тежка и лека верига след съ-трансфектиране в клетки от яйчник на китайкси хамстер (СНО), използувайки утайка от калциев фосфат.
В деня преди трансфектирането, полу-вливащи се колби с клетки CHO-L761 се обработват с трипсин, клетките се преброяват, и всяка колба Т75 се зарежда с 107 клетки.
На следващия ден, културалната среда се сменя 3 часа преди трансфектирането. За трансфектиране, утайката от калциев фосфат се получава чрез смесване на 1,25 ml 0,25 М СаС12, съдържащ 50 цд от всеки един от векторите, експресиращи тежка и лека верига, с 1,25 ml от 2 х HBS (16q36 g NaCI, 11,0 g HEPES и 0,4 g Na2HPO4 в 1 литър вода c pH доведено до 7,1 c NaOH), и веднага се прибавя в средата на клетките. След 3 часа при 37°С в инкубатор с СО2, средата и утайката се отстраняват, и клетките шокират, като се прибавят 15 ml 15 % глицерол във физиологичен разтвор, буфериран с фосфатен буфер (PBS) в продължение на 1 минута. Глицеролът се отстранява, клетките се промиват веднъж с PBS, и се инкубират в продължение на 48 - 96 часа в 25 ml среда, съдържаща 10 тМ натриев бутират. Антитялото трябва да се пречисти от културалната среда, чрез прикрепяне към, и елуиране с протеин А-сефароза.
b) ELISA
За ELISA, Nunc ELISA блюда се покриват в продължение на една нощ при 40°С с фрагмент F(ab)2 на поликлонално козе анти-човешко антитяло специфично за фрагмен Fc (Jackson Immunoresearch, code 109-006-098) при 5 gg/ml в поквиращ буфер (15 mM натриев карбонат, 35 тМ кисел натриев карбонат, pH 6,9). Непокритото антитяло се отстранява, като се промива 5 пъти с дестилирана вода. Проби и пречистени стандартни образци за количествено определение се разреждат до приблизително 1 pg/ml в буфер (0,1 М трис-HCI, pH 7,0, 0,1 М NaCI, 0,2 % обем/обем Tween 20, 0,2 % тегло/обем казеин Hammersten.). Пробите се титруват в ямки за микро-титруване в
2-кратни разреждания, до получаването на краен обем от 0,1 ml във всяка ямка, и блюдата се инкубират при стайна температура в продължение на 1 час, на клетачен апарат. След първия етап на инкубиране блюдата се проми-ват 10 пъти с дестилирана вода, и след това се инкубират в продължение на 1 час както преди това, с 0,1 ml от мише моноклонално анти-човешко капа антитяло (клон GD12), конюгирано с пероксидаза, (The binding Site, code MP135) при разреждане 1 към 700 в конюгиран буфер. Блюдото се проми-ва отново, и във всяка ямка се прибавя субстратен разтвор (0,1 ml). Субстратният разтвор съдържа 150 μΙ Ν,Ν,Ν,Ν-тетра-метилбензидин (10 mg/ml в DMSO), 150 μΙ водороден пероксид (30 % разтвор) в 10 ml 0,1 М натриев ацетатбнатриев цитрат, pH 6,0. Блюдото се развива за
-Λ--. ь
Μ···
5-10 минути, докато абсорб-цията при 630 nm е приблизително 1,0 за най-големия стан-дартен образец. Абсорбцията при 630 nm се измерва, изпол-зувайки брояч за блюдо, и концентрацията на пробата се определя чрез сравняване на кривите на титруване с тези на стандартния образец.
с) Определяне на константи на афинитет по метода на анализ BiaCore
Взаимодействието на свързване между hTNF40 и човешки TNF се изследва, използувайки технология BIA. Пречистено козе поликлонално антитяло, насочено срещу константната област на hTNF40, се фиксира върху сензорната повърхност на стружка от декстранов полимер, използувайки стандарна NHS/EDC химия. Относително ниски нива (200 - 5 - RU) от hTNF40 се улавят, за да се осигури, че се свеждат до минимум
I ефектите на мас транспорта. Човешки TNF с различни
концентрации се пропускат над уловените hTNF40, което дава възможност за оценяването на асоциираните кинетики. След ©· инжектирането на лиганда, се пропуска буфер върху повърх| ността, така че дисоциирането да може да се измери. Скоростните константи на асоциирането и на дисоциирането за взаимодействието между твърдата фаза на hTNF40 и човешки TNF се п j изчисляват, и се извежда KD стойност.
Пример 1
CDR-присаждане на hTNF40
Молекулярното клониране на гени за вариабилните области на тежки и леки вериги на антитялото hTNF40 и използуването му за получаване на химерни (миши-човешки) антитела hTNF40 е описано по-горе. Нуклеотидната и амино киселинната последователности на миши hTNF40 VI и Vh са показани на фигури 6 и 7 (SEQ ID NOs : 99 и 100), съответно. Този опит описва CDR-присаждането на антитялото hTNF40.
CDR-присаждане на hTNF40 лека верига
Подреждането на рамковите области на hTNF40 лека верига с тези на четирите човешки подгрупи леки вериги (Kabat et al., 1991, supra) разкриват, че hTNF40 е най-хомоложен към © антитела в човешка подгрупа лека верига 1. Следователно, за конструирането на CDR-присадена лека верига, избраните рамкирани области съответствуват на тези на човеш-ката група 1 консенсус последователност.
Сравнение на амино киселинните последователности на рамковите области на мише hTNF40 и на консенсус леки вериги на човешка група 1 е дадено на фигура 1, и показва, че има 22 различия (подчертани) между двете последователности. Анализирането на приноса, който което и да е от тези рамкови различия би могло да има върху антигенното свързване ©
идентифицира 2 остатъка за изследване; те са на позиции 46 и 60. На базата на този анализ, са създадени две версии на CDRприсадени леки вериги. Съгласно първата от тях, hTNF40-gL1 (SEQ ID NO : 8), остатъци 46 и 60 произлизат от леката верига на hTNF40, докато съгласно втората, hTNF40-gL1 (SEQ ID NO : 9), всичките остатъци са човешки консенсус, с изключение на остатък номер 60, който е от ле-ката верига на hTNF40.
нншммм
Конструиране на CDR-присадена лека верига на hTNF40-gL1.
Конструиране на hTNF40-gL1 е дадено по-долу в подробности. Следващото препокриване с олигонуклеотиди (Р7982 - Р7986) се използува при верижните реакции на полимераза (PCR), за да се събере накъсаната присадена лека верига. Събраните фрагменти имат нужда от лидерна последователност на антитялото, и от първите 17 амино киселини на рамка 1.
Олиго 1 Р7982:
5’GAATTCAGGGTCACCATCACTTGTAAAGCCAGTCAGA ACGTAGGTACTAACGTAGCCTGGTATCAGCAAA3’ (SEQ ID N0:52)
Олиго 2 Р7983:
5ATAGAGGAAAGAGGCACTGTAGATGAGGGCTTTTGGG GCTTTACCTGGTTTTTGCTGATACCAGGCTACGT3’ (SEQ ID N0:55)
Олиго 3 P7984:
5’TACAGTGCCTCTTTCCTCTATAGTGGTGTACCATACAG GTTCAGCGGATCCGGTAGTGGTACTGATTTCAC3’ (SEQ ID N0:54)
Олиго 4 P7985:
5’GACAGTAATAAGTGGCGAAATCTTCTGGCTGGAGGCT ACTGATCGTGAGGGTGAAATCAGTACCACTACCG3’ (SEQ ID N0:55)
Олиго 5 Р7986:
5’ATTTCGCCACTTATTACTGTCAACAGTATAACATCTAC CCACTCACATTCGGTCAGGGTACTAAAGTAGAAATCAAACGT ACGGAATTC3’ (SEQ ID N0:56)
FwdP7981:
5OAATTCAGGGTCACCATCACTTGTAAAGCC3’ (SEQ ID N0:57)
Bwd P7980: 5OAATTCCGTACGTTTGATTTCTACTTTAGT3’
C (SEQ ID N0:58)
Реакция PCR, 100 μΙ, се прави да съдържа 10 mM трис-HCI pH 8,3, 1,5 mM MgCI2) 50 mM KCI, 0,01 % тегло/обем желатин, 0,25 mM на всеки дезоксирибонуклеозиден трифосфат, 2 pmoles от Р7982, Р7983, Р7984, Р7985, Р7986, 10 pmoles от Р7980, Р7981 и 1 единица Taq полимераза. Реакциите протичат в цикъл при 94°С в продължение на 1 минута, при 55°С в продължение на 1 минута, и при 72°С в продължение на 1 ©минута. След 30 цикъла, всяка една реакция се анализира чрез електрофореза върху агарозен гел и фрагмента PCR се изрязва от гела и се възстановява, използувайки Mermaid Kit. Възстановеният фрагмент се обработва с рестрикционните ензими BstEII и Sp1l в подходящ буфер. Полученият продукт накрая се подлага на електрофореза вър-ху агарозен гел и ДНК фрагментът от 270 базови двойки се възстановява от гелния срез и се лигира във във вектора CTIL5-gL6 (фигура 12), който предварително се разгражда със същите ензими. Горният вектор предоставя липсващата лидерна последователност на антитялото, и първите 17 амино киселини на рамката 1.
Сместа за лигиране се използува за трансформиране на щам Е. Coli щам LM1053, и получените колонии се анализират чрез PCR, разграждания с рестрикционен ензим, и нуклеотидно секвениране. Нуклеотидната и амино киселинната последователност на областта VI на hTNF40-gL1 е показана на фигура 8 (SEQ ID NO : 8).
Конструиране на CDR-присадена лека верига на hTNF40-gL2.
hTNF40-gL2 (SEQ ID NO : 9) се конструира, използувайки PCR. Използуват се следните олигонуклеотиди, за да се въведат промените на амини киселини:
R1053: 5’GCTGACAGACTAACAGACTGTTCC3’ (SEQ ID N0:59)
R5350:
5’TCTAGATGGCACACCATCTGCTAAGTTTGATGCAGCAT AGATCAGGAGCTTAGGAGC3’ (SEQ ID N0:60)
R5349:
5’GCAGATGGTGTGCCATCTAGATTCAGTGGCAGTGGAT CAGGCACAGACTTTACCCTAAC3’ (SEQ ID N0:61)
R684: 5’TTCAACTGCTCATCAGAT3’ (SEQ ID N0:62)
Две реакции, всяка по 20 μΙ, като се прави всяка една да съдържа 10 тМ трис-HCI pH 8,3, 1,5 mM MgCI2, 50 тМ KCI, 0,01 % тегло/обем желатин, 0,25 тМ на всеки дезоксирибонуклеозиден трифосфат, 0,1 pg hTNF40-gL1, 6 pmoles от R1053/R5350, или R5349/R684, и 0,25 единици Taq полимераза. Реакциите протичат в цикъл при 94°С в продължение на 1 минута, при 55°С в продължение на 1 минута, и при 72°С в
продължение на 1 минута. След 30 цикъла, всяка една реакция се анализира чрез електрофореза върху агарозен гел и фрагмента PCR се изрязва от гела и се възстановява, използувайки Mermaid Kit.
Аликвотни части от тях след това се подлагат на втори кръг от PCR. Реакцията, 100 μΙ, съдържаща 10 тМ трис-HCI pH
8,3, 1,5 mM MgCI2, 50 тМ KCI, 0,01 % тегло/обем желатин, 1/5 от всеки от PCR фрагментите от първия комплект реакции, 30 pmoles от R1053 и R684, и 2,5 единици Taq полимераза. Температурите на реакциите са както по-горе. След PCR, сместа се екстрахира с фенол/хлороформ, и след това с хлороформ, и се утаява с етанол. Етаноловата утайка се възстановява чрез центрофугиране, разтваря се в подходящ буфер, и се обработват с рестрикционните ензими BstEII и Sp1l. Полученият продукт накрая се подлага на електрофореза върху агарозен гел и ДНК фрагмента от 270 основни двойки се възстановява от гелен срез и се лигира във вектора pMR15.1 (фигура 4), който предварително е се разгражда със същите ензими.
Сместа за лигиране се използува за трансформиране на Е. Coli щам LM1053, и получените колонии се анализират чрез PCR, разграждания с рестрикционен ензим, и нуклеотидно секвениране. Нуклеотидната и амино киселинната последователност на областта VI на hTNF40-gL2 е показана на фигура 9 (SEQ ID NO : 9).
CDR-присаждане на тежка верига на hTNF40
CDR-присаждане на тежката верига на hTNF40 се осъществява, като се използува същата стратегия, както описаната за леката верига. Установено е, че тежката верига на hTNF40 е най-хомоложна към човешка тежка верига, принадлежаща на подгрупа 1, и поради това консенсус последователност на рамките на човешка подгрупа 1 се избират да приемат hTNF40 тежката верига на CDRs.
За да се изследва необходимостта хомоложна човешка рамка да действува като рамка приемник за CDR присаждане, избира се втора рамка, човешка група 3, да хуманизира тежка верига на hTNF40.
с Сравнение на hTNF40 с двете различни рамкови облас-ти е показано на фигура 2, където може да се види, че hTNF40 се различава от консенсус човешка подгрупа 1 в 32 позиции (подчертано), и се различава от консенсус човешка подгрупа 3 в 40 позиции (подчертано). След анализирането на ползата, което всяко едно от тях би могло да даде за свързване на антиген, остатъци 28, 38, 46, 67, 69 и 71 се ангажират като донор в CDRприсадената тежка верига на hTNF40.1, използувайки рамката на група 1. Остатъци 27, 28, 30, 48, 49, 69, 71, 73, 76 и 78 се ©ангажират като донор в CDR-присадената тежка верига, gh3hTNF40.4, използувайки рамката на група 3. Остатъци 28, 69, и 71, се ангажират като донор в CDR-при-садената тежка верига, gh3hTNF40.4, използувайки рамката на група 1.
Конструиране на CDR-присадена тежка верига на gh1hTNF40.4
Gh1hTNF40.4 (SEQ ID NO : 10) се събира, като се подложи на препокриване на олигонуклеотиди за PCR в присъствие на подходящи праймери. Следващите олигонуклеотиди се използуват в PCR:
Група 1 присадка
Олиго 1 Р7989:
5’GAAGCACCAGGCTTCTTAACCTCTGCTCCTGACTGGA CCAGCTGCACCTGAGAGTGCACGAATTC3’ (SEQ ID N0:63)
Олиго 2 Р7990:
5’GGTTAAGAAGCCTGGTGCTTCCGTCAAAGTTTCGTGT AAGGCCTCAGGCTACGTGTTCACAGACTATGGTA3’ (SEQ ID N0:64)
Олиго 3P7991:
5'CCAACCCATCCATTTCAGGCCTTGTCCCGGGGCCTGC
TTGACCCAATTCATACCATAGTCTGTGAACACGT3’ (SEQ ID N0:65)
Олиго 4 P7995:
5’GGCCTGAAATGGATGGGTTGGATTAATACTTACATTG GAGAGCCTATTTATGTTGACGACTTCAAGGGCAGATTCACGT TC3’ (SEQ ID N0:66)
Олиго 5 P7992:
5’CCATGTATGCAGTGCGTTGTGGAGGTGTCTAGAGTGA
ACGTGAATCTGCCCTTGAA3’ (SEQ ID N0:67) ® Олиго 6 P7993:
5’CCACAAGCACTGCATACATGGAGCTGTCATCTCTGAG ATCCGAGGACACCGCAGTGTACTAT3’ (SEQ ID N0:68)
Олиго 7 P7994:
5’GAATTCGGTACCCTGGCCCCAGTAGTCCATGGCATAA
GATCTGTATCCTCTAGCACAATAGTACACTGCGGTGTCCTC3’ (SEQ ID N0:69)
Fwd: P7988:
5’GAATTCGTGCACTCTCAGGTGCAGCTGGTC3’ (SEQ ID N0:70)
Bwd: P7987:
5’GAATTCGGTACCCTGGCCCCAGTAGTCCAT3’ (SEQ ID N0:71)
Агрегата от реакцията, 100 μΙ, съдържаща 10 mM трис-HCI pH 8,3, 1,5 mM MgCI2, 50 mM KCI, 0,01 % тегло/обем желатин, 0,25 mM на всеки дезоксирибонуклеозиден трифосфат, 2 pmoles от р7989, р7990, р7991, р7995, р7992, р7993 и р7994, 10 pmoles от всеки един от р7988, и р7987 и 1 единица Taq полимераза. Реакциите протичат в цикъл при 94°С в продължение на 1 минута, при 55°С в продължение на 1 минута, и при 72°С в продължение на 1 минута. След 30 цикъла, реакцията се екстрахира с фенол/хлороформ (1/1), след това с хлороформ, и се утаява с етанол. След центро-фугиране ДНК се разтваря в подходящия рестрикционен буфер, и се разгражда с ApaLI и Kpnl. Полученият фрагмент се изолира от агарозен гел и се лигира в pMR14 (фигура 5), който предварително се разгражда със същите ензими. pMR14 съдържа константната област на човешка гама 4 тежка вери-га, когато pMR14 се разцепва с ApaLI и Kpnl, отцепеният век-тор е в състояние да получи разградената ДНК, така че 3’ краят на разградената ДНК съединява в рамка за разчитане на 5’ края на последователността кодираща гама 4 констант-ната област. Поради това, тежката верига, експресирана от този вектор ще бъде изотип на гама 4. Сместа за свързване се използува за трансформиране на Е. Coli LM1053, и получе-ните бактериални колонии, скринирани чрез рестрикционно разграждане и анализиране на нуклеотидна последователност. По този начин, се идентифи цира плазмид, съдържащ коректната последователност за gh1hTNF40.4 (фигура 10) (SEQ ID NO : 10).
Конструиране на CDR-присадена тежка верига на gh3hTNF40.4 gh3hTNF40.4 (SEQ ID NO : 11) се събира, като се подложи на припокриване на олигонуклеотиди за PCR в присъствие на подходящи праймери. Следващите олигонуклеотиди се използуват в PCR:
Група 3 присадка
Олиго 1 Р7999:
5’GATCCGCCAGGCTGCACGAGACCGCCTCCTGACTCG ACCAGCTGAACCTCAGAGTGCACGAATTC3’ (SEQ ID N0:72)
Олиго 2 Р8000:
5’TCTCGTGCAGCCTGGCGGATCGCTGAGATTGTCCTGT GCTGCATCTGGTTACGTCTTCACAGACTATGGAA3’ (SEQ ID N0:73)
Олиго 3 P8001:
5’CCAACCCATCCATTTCAGGCCCTTTCCCGGGGCCTGC TTAACCCAATTCATTCCATAGTCTGTGAAGACGT3’ (SEQ ID N0:74)
Олиго 4 P7995:
5’GGCCTGAAATGGATGGGTTGGATTAATACTTACATTG GAGAGCCTATTTATGTTGACGACTTCAAGGGCAGATTCACGT TC3’ (SEQ ID N0:66)
Олиго 5 P7997:
5’GGAGGTATGCTGTTGACTTGGATGTGTCTAGAGAGAA CGTGAATCTGCCCTTGAA3’ (SEQ ID N0:75)
Олиго 6 Р7998:
5’CCAAGTCAACAGCATACCTCCAAATGAATAGCCTGAG
AGCAGAGGACACCGCAGTGTACTAT3’ (SEQ ID N0:76)
Олиго 7 P7993:
5’GAATTCGGTACCCTGGCCCCAGTAGTCCATGGCATAA GATCTGTATCCTCTAGCACAATAGTACACTGCGGTGTCCTC3’ (SEQ ID N0:77)
Fwd: P7996: 5OAATTCGTGCACTCTGAGGTTCAGCTGGTC3’ © (SEQ ID N0:78)
Bwd: P7987:
5OAATTCGGTACCCTGGCCCCAGTAGTCCAT3’ (SEQ ID N0:71)
Агрегата от реакцията, 100 μΙ, съдържаща 10 mM трис-HCI pH 8,3, 1,5 mM MgCI2, 50 mM KCI, 0,01 % тегло/обем желатин, 0,25 mM на всеки дезоксирибонуклеозиден трифосфат, 2 pmoles от р7999, р8000, р8001, р7995, р7997, р7998 и р7993, ©10 pmoles от всеки един от р7996, и р7987 и 1 единица Taq полимераза. Реакциите протичат в цикъл при 94°С в продължение на 1 минута, при 55°С в продължение на 1 минута, и при 72°С в продължение на 1 минута. След 30 цикъла, реакцията се екстрахира с фенол/хлороформ (1/1), след това с хлороформ, и се утаява с етанол. След центрофугиране ДНК се разтваря в подходящия рестрикционен буфер, и се разгражда с ApaLI и Kpnl. Полученият фрагмент се изолира от агарозен гел и се лигира в pMR14 (фигура 5), който предварително се разгражда със същите ензими. pMR14 съ-държа константна област на тежка верига на човешки гама 4. Когато pMR14 се отцепва с
ApaLI и Kpnl, присъединеният вектор е в състояние да получи разградената ДНК, така че 3’ краят на разградената ДНК да съединява в рамка за разчи-тане на 5’ края на последователността кодираща гама 4 кон-стантната област. Поради това, тежката верига, експресирана от този вектор ще бъде изотип на гама 4. Сместа за свързване се използува за трансформиране на Е. Coli LM1053, и получените бактериални колонии, скринирани чрез рестрикционно разграждане и анализиране на нуклеотидна последователност. По този начин, е идентифициран плазмид, съдържащ ко-ректната последователност за gh3hTNF40.4 (SEQ ID NO : 11) (фигура 11).
Получаване на CDR-присаден модифициран Fab фрагмент.
CDR-присаден, модифициран Fab фрагмент, на базата на антитяло hTNF40, се конструира, като се използува Е. coli вектора рТТО-1. Вариабилните области на hTNF40 се суб-клонират в този вектор, и междугенната последователност се оптимизира, за да създаде pTTO(CDP870). Векторът, експресиращ рТТО е предназначен да даде повишаване на разтворимото, периплазматично акумулиране на рекомбинантни протеини в Е. coli. Главните особености на този плазмид са:
(i) маркер за резистентност на тетрациклин - антибиотика не се инактивира от продукта на резистентен ген, от което следва, че се поддържа селекционирането на плазмид-съдържащи клетки.
(ii) Малък брой копия - начало на репликация произхождаща от плазмид р15А, който е срав ним с плазмид, съдържащ colE произлизащи репликони;
(iii) (iv) (ν)
(vi)
Силен, индуцируем tac промотор за транскриптиране на клониран(и) ген(и);
Lacl4 ген - дава конститутивно експресиране на lac репресорния протеин, поддържащ tac промотора в репресирано състояние, до индуциране с IPTG/алолактоза;
ОтрА сигнална последователност - дава периплазматично секретиране на клониран(и) ген(и); и
Транслационно свързване на ОтрА сигнална последователност към къс lacZ пептид, даващ резултатно иницииране на транслиране.
Векторът е развит за експресиране на модифицирани Fab фрагменти от дицистронно съобщение от проектирането на метода да селекционира емпирично оптимална интергенна последователност от серия от по четири целесъобразно създадени касети. Описано е апликирането им в конструкцията на pTTO(CDP870).
Материали и методи
ДНК техники
Стандартни методики се използуват за протоколи, включително ДНК обработване с рестрикционни ензими, електрофореза върху агарозен гел, лигиране и трансформиране. Рестрикционни ензими и ДНК модифициращи ензими се доставят от New England Biolab, или Boehringer Mannheim, и се използуват съгласно приложените упътвания. ДНК фраг ментите се пречистват от агароза, използувайки GeneClean protocol (BIO 101). Олигонукпеотиди се доставят от Oswel Oligonucleotide Service, и се синтезират по скалата 40 nm. Плазмид ДНК се изолира, използувайки Plasmid DNA Mini / Midi kits от Qiagen. PCR се осъществява, използувайки Perkin Elmer “Amplitaq”, съгласно указанието. ДНК секвенирането се осъществява, използувайки Applied Biosystems Tag cycl sequencing kit.
Индуциране в клатачна колба ф Култура Е. coli W3110 се посяват в L-бульон в който се добавя тетрациклин (7,5 pg/ml). За индуцирания, свежа култура от една нощ (прорастнала при 30°С) се долива до Οϋθοο на 0,1 в 200 ml L-бульон в 2 L разделителна колба, и прорастват при 30°С в орбитален инкубатор. При OD6oo от 0,5, се прибавя IPTG към 200 μΜ. Взимат се проби (калибрирани за OD) на интервали.
Периплазматично екстрахиране
Проби от култура се замразяват на лед (5 минути), след А това се събират клетки чрез центрофугиране. След повторно суспендиране в екстракционен буфер (100 тМ трис-HCI, 10 тМ EDTA, pH 7,4), пробите се инкубират в продължение на една нощ при 30°С, след това се избистрят (изчистват от примеси) чрез центрофугиране.
Количествен анализ на агрегата
Модифицирани Fab концентрати се определят чрез ELISA. Блюдата ссе покриват при 4°С с анти-човешки Fd 6045 (2 pg/ml в покриващ буфер, физиологичен разтвор, 100 μΙ на ямка). След промиване, 100 μΙ от проба се пълни в ямка; Като стандарт се използува пречистен А5В7 гама-1 Fab’, отначало при 2 pg/ml. Пробите се разреждат на серии 2-кратно в блюдото в проба от конюгиращ буфер (на литър: 6,05 g трис-аминометан; 2,92 g NaCI; 0,1 ml Tween-20; 1 ml казеин (0,2 %)); блюдата се инкубират в продължение на 1 час при стайна температура, при разбъркване. Блюдата се промиват и се сушат, след това се прибавят 100 μΙ от анти-човешка С-капа (GD12)-nepоксидаза (разредена в буфер съединен с проба). Инкубирането се озвършва при стайна температура в продължение на 1 час, ф при разбъркване. Блюдата се проми-ват и се сушат, след това се прибавят 100 μΙ от субстратния разтвор (10 ml разтвор натриев ацетат/цитрат (0,1 М pH 6); 100 μΙ разтвор на Н2О2;
100 μΙ тетраметилбензидинов разтвор (10 pg/ml в диметилсулфоксид)). Абсорбция при 630 mm се отчита 4-6 минути след прибавянето на субстрата.
Конструиране на плазмид рТТО-1 (а) заместване на pTTQ9 полилинкер А Плазмид pTTQ9 се доставя от Amersham и е показан на фигура 14. Една аликвотна час (2 pg) се разгражда с рестрикционни ензими Sall и EcoRI, разградният продукт се пуска на % агарозен гел, и широк ДНК фрагмент (4520 Ьр) се пречиства. Синтезират се два олигонукрлеотида, които, когато са хибридизирани заедно, кодират областта ОтрА на полилинкера, показана на фигура 15. Тази последователност има кохезивни краища, които са сравними с краищата на Sall и EcoRI, генерирани от обработването с рестрикционни ензими на pTTQ9. Чрез кпониране на тази олигонукрлеотидна “касета” във вектора pTTQ9, Sall сайта не се регенерира, но EcoRI сайта се поддържа. Касетата кодира първите 13 амино киселини на сигналната последователност на протеина на външната мембрана Отр-А на Е. coli, предхождан от Shine Dalgarno рибозом свързващия сайт на гена ОтрА. Освен това, присъствуват рестрикционни сайтове за ензими Xbal, Muni, Styl, и Spll. Сайтовете Muni и Styl са в кодиращата област на сигналната последователност ОтрА, и са предназначени да са 5’ клониращи сайтове за инсериране на гени. Двата олигонуклеотида, които правят тази касета, се хибридизират заедно, чрез смесваф не при концентрация на 5 pmoles/μΙ, и водна баня до 95°С в продължение на 30 минути, след това бавно се охлаждат до стайна температура. Хибридизираната последователност след това се лигира в Sall / EcoRI срязан pTTQ9.
(b| Получаване и лигиране на фрагмент
Плазмид рТТО-1 се конструира чрез лигиране на един ДНК фрагмент от плазмид pACYC184 до два фрагмента генерирани от pTQOmp. Плазмид pACYC184 се доставя от New England Biolabs, а рестрикционна карта е показана на фигура • 16. Една аликвотна част (2 цд) се разгражда напълно с рестрикционен ензим Styl, след това й се действува с Mung Been Nucleasa; при това въздействие се създават тъпи краища, чрез срязване след 5’ висящите бази. След екстрахиране с фенол и утаяване с етанол, ДНК се разгражда с ензими Pvull, генериращи фрагменти на 2348, 1081, 412 и 403 Ьр.
Фрагментът 2348 Ьр се пречиства след електрофореза върху агарозен гел. Този фрагмент кодира маркер за резистентност на тетрацикпин, и началото на репликирането на р15А. След това на фрагмента се действува с телешка интестинална алкална фосфатаза, за да се отстранят 5’ терминалните фосфати, като с това се предотвратява само-лигирането на тези молекули.
Една аликвотна част (2 pg) от плазмид pTQOmp се разгражда с ензимите Styl и EcoRI, и фрагментът 2350 Ьр се пречиства от нежелани фрагменти 2040 Ьр и 170 Ьр, след електрофореза върху агарозен гел; този фрагмент кодира областта на транскрипционния терминатор и гена lacl4. Друга аликвотна част (2 pg) от плазмид pTQOmp се разгражда с EcoRI и Xmnl, генериращи фрагменти 2289, 1670, 350 и 250 Ьр. Ф Фрагментът 350 Ьр, кодиращ tac промотора, ОтрА сигналната последователност, и мултиклониращия сайт, се пречиства чрез гел.
След това трите фрагмента се лигират, използувайки приблизително еквимоларни количества от всеки фрагмент, за да се генерира плазмида рТТО-1. Всички клониращи съединения се проверяват чрез ДНК секвениране. Рестрикционната карта на този плазмид е показана на фигура 17. След това се създава плазмид рТТО-2, като се инсерира ДНК кодираща капа • константен домен на лека верига на човешки lg. Той се получава като рестрикционен фрагмент Sp1 I - EcoRI от плазмид рНС132, и инсериран в съответните сайтове в рТТО-1. Плазмид в рТТО-2 е показан на фигура 18.
Инсериране на хуманизирани hTNF40 вариабилни области в рТТО-2
Вариабилната област на леката верига на hTNF40gL1 (SEQ ID NO : 8) се получава чрез PCR “освобождаване” от съответния вектор за експресиране на клетка от бозайник PMR10.1. Лидерната последователност ОтрА замества натив65 ния lg лидер. Последователността на PCR праймерите е показана по-долу:
Праймер 5’:
CGCGCGGCAATTGCAGTGGCCTTGGCTGGTTTCGCTAC CGTAGCGCAAGCTGACATTCAAATGACCCAGAGCCC (SEQ ID N0:79)
Праймер 3’:
Ф TTCAACTGCTCATCAGATGG (SEQ ID N0:80)
След PCR при стандартни условия, продуктът се пречиства, разгражда се с ензими Muni и Sp1l, след това се пречиства с гел. След това пречистеният фрагмент се инсерира в сайтовете Muni / Sp11 на рТТО-2, за да се създаде междинната pTTO(hTNF40L) лека верига.
Вариабилната област на тежката верига на gh3hTNF40.4 се получава по същия начин от вектора pGamma-4. Последователността на PCR праймерите е показана по-долу:
Праймер 5’:
GCTATCGCAATTGCAGTGGCGCTAGCTGGTTTCGCCAC CGTGGCGCAAGCTGAGGTTCAGCTGGTCGAGTCAGGAGGC (SEQ ID N0:81)
Праймер 3’:
GCCTGAGTTCCACGACAC (SEQ ID N0:82)
След PCR продуктът се пречиства, разгражда се с ензими Nhel и Apal, след това се суб-клонира във вектора рДНКЬЕпд-GI (фигура 19). След проверяване чрез ДНК секвениране, тежката верига се обработва с рестрикционнен ензим EcoRI, и се суб-клонира в EcoRI сайта на pTTO(hTNF40L), за да се създаде експресионния плазмид pTTO(hTNF40L) на Е. coli.
Оптимизиране на междугенна последователност за експресиране на модифициран фрагмент
Във вектора рТТО, модифициран Fab фрагмент се появява от дицистронно съобщение, кодиращо първо лека ф верига, след това тежка верига. ДНК последователността между двата гена (междугенна последователност, IGS) може да оказва влияние върху нивото на експресиране на тежката верига, като засяга скоростта на транслационното иницииране. Например, къса междугенна последователност може да доведе до транслационно присъединяване между леката и тежката вериги, при което транслационният рибозом може да не се дисоциира напълно от иРНК след като синтезирането на леката верига завърши преди иницииране на синтезирането на е тежката верига. “Силата” на който и да е Shine Delgarno (SD) рибозомен присъединяващ сайт (хомолог на 16S гРНК) може също така да има ефект, както може да има и разстоянието и състава на последователността между SD и ATG стартовия кодон. Потенциалната вторична структура на иРНК около ATG, е друг важен фактор; ATG ще бъде в “бримка” и няма да е скован в “стебло”, докато обратното важи за SD. Така, чрез модифициране на състава и дължината на IGS, е възможно да се модифицира дължината на транслационното иницииране, а от тук и нивото на получаването на тежка вери-га. Подходящо е, оптималната степен на транслационно иницииране да
изисква да се осъществи до максимално експресиране на тежката верига на даден модифициран Fab. Например, с един модифициран Fab, може да се толерира високо ниво на експресиране, но за различно модифициран Fab с различна амино киселинна последователност, високо ниво на експресиране може да се окаже токсично, може би поради различните резултати от секретиране, или прегъване. Поради тази причина, създават се серии от четири междугенни последователности (фигура 20), позволяващи емпиричното определяне на оптимално IGS за hTNF40-6a3npaH модифици-ран Fab. IGS1 и IGS2 имат много къси междугенни последователности (-1 и +1 съответно), и може да се очаква да дадат плътно свързана транслация; SD последователностите (под-чертани) са незабележимо различни. Тези две последователности най-вероятно дават високо ниво на транслационно иницииране. IGS3 и IGS4 имат по-дълго разстояние между стартовите и стоп кодоните (+13), и се различават по състава на тяхната последователност; IGS3 има “по-силна” SD последователност. Всички последователности се изследват за вторична структура (използувайки програма m/гънка), и “се оптимизират” толкова, колкото е възможно; обаче, с недостатъчно съединяване на транслацията на двете вериги, липсата на рибозомно дисоцииране означава, че иРНК може да не е “оголена”, предотвратяващо образуването на вторична структура.
Клониране на IGS варианти
Касетите IGS, показани на фигура 20 имат граничещи Sacl и Muni клониращи сайтове. Те са построени чрез хибридизиране на комплементарни олигонуклеотидни двойки. Векторен фрагмент се получава чрез разграждане на pTTO(hTNF40) със Sacl и Notl, а фрагмент на тежка верига се получава чрез разграждане на pflHKbEngG1(hTNF40H) с Muni и Notl. След това се осъществяват три начина на лигиране, използувайки еквимоларни количества от двата рестрикционни фрагмента, и приблизително 0,05 pmoles от всяка една от хибридизираните олиго касети. Това създава четирите експресионни плазмида pTTO(hTNF40 IGS-1), pTTO(hTNF40 IGS-2), pTTO(hTNF40 IGS-
3), pTTO(hTNF40 IGS-4).
Експресионен анализ в клатачна колба
Четирите плазмида се трансформират в Е. coli щам W3110, заедно с оригиналната експресионна конструкция, и след това се анализират за експресиране в кпатачни колби, съгласно описанието. Резултатите от характерния експеримент са посочени на фигура 21. Различните междугенни последователности дават различни експресионни профили. IGS-1 и IGS-2 акумулират периплазматичен модифициран Fab бързо, с пик на 1 час след индуциране, след което възстановеното ниво спада. Пикът е по-голям, и спадът е по-остър за IGS1. Тези резултати съответствуват с високо ниво на синтезиране, както се очаква за плътно транслационно свързване на тези конструкции. IGS1 очевидно води до по-високо ниво на експресиране на тежка верига, отколкото IGS2. В този случай, изглежда че това високо ниво на експресиране е по-слабо толерирано, тъй като нивата на периплазматично експресиране спадат след пика на 1 час. Това се вижда на профила на растеж на културата IGS1 (не е показано), чийто пик на 1 час след индуциране преди спадане, предполага умйране на клетките и лизис. IGS3 акумулира модифициран Fab по-бавно, но се издига най-високо на 2 час след индуцирането, с найвисока стойност на пика (325 ng/ml/OD), преди спадането на нивата. Растежа на тази култура продължава до 3 часа след индуцирането, и достига до по-висок пик на биомаса (не е показано).
Това е в съгласие с по-ниското ниво на синтезиране на тежка верига. IGS4 акумулира материал при по-малка скорост все още, и не успява да достигне високия пик на продуктивност на другите 3 конструкции. Всички IGS варианти превъзхождат оригиналния вектор значително. Хипотезата, че различните IGS последователности дават различни скорости на транслационно иницииране се поддържа от тези експериментални резултати. За модифициран Fab на базата на hTNF40, изглежда че висока скорост на транслационно иницииране на тежка верига е слабо толерирана, и поради това не е оптимална. По-малка скорост, както е за IGS3, води до по-добри растежни характеристики, и, следователно, натрупване на по-добър добив с времето.
След сравняване на продуктивността във ферментатора, конструкцията IGS3 се избира като даваща най-висок добив, и е наречена pTTO(CDP870) - виж фигура 22.
Тежката верига, кодирана от плазмида pTTO(CDP870) има последователността, дадена в SEQ ID N0 : 115, а леката верига има последователността, дадена в SEQ ID N0 :113.
PEG-илиране на CDR-присаден, hTNF40-6a3npaH модифициран Fab
Пречистеният модифициран Fab е специфично сайт конюгиран с разклонена молекула на PEG. Това се осъществява чрез активиране на единичен цистеинов остатък в отрязана стърчаща област на модифицирания Fab, последвано от реакция с (РЕС)-лизил малеимид, както е описано предварително (А. Р. Chapman et al., Nature Biotechnology 17, 780-783, 1999). PEG-илираната молекула е показана на фигура 13, и се нарича съединение CDP870.
Ефикасност на PEG-илиран CDR-присаден, hTNF40базиран модифициран Fab (CDP870) при лечение на ревматоиден артрит
CDP870 има дълъг полу-живот от порядъка на приблизително 11 дни.
Ние оценяваме безопасността и ефикасността на интравенозен CDP870 при опит със случайно двойно-сляпо дозиране с контрола плацебо, при пациенти с RA.
Методи
Пациенти:
Пациенти на възраст между 18 и 75 години, и които удовлетворяват преразгледания през 1987 г. от American College of Rheumatology (ACR) diagnostic criteria for reumatoid arthritis (RA) (критерии за диагностициране на ревматоиден apTpnT)(Amet et al., Arthritis Reum., 31,315-324, 1988), се избират от приходящи пациенти на Rheumatologiy clinics at London, Cambrige, Norfolk and Norwich (Unated Kingdom). Изисква се пациентите да имат клинично активно заболяване, което се определя, ако имат най-малко 3 от следните критерии: > 6 болезнени, или меки стави; > 45 минути на сутрешна скованост; и скорост на утаяване на еритроцитите (ESR) > 28 mm/hr. Те трябва да са имали неуспех при отговор на най-малко едно модифициращо болестта противо-ревматично лекарствено средство (Disease Modifying Anti-Rheumatic Drug (DRARD)) и са били подложени на лечение най-малко 4 седмици. Кортикостероиди са позволени, ако дозата е > 7,5 mg/ден преднизолон. Бременни жени, кърмачки и жени в детеродна способност, не използуващи ефективен контра-цептивен метод се изключват. Пациентите се изключват също така, ако те имат предшествуваща история на злокачествено заболяване, съпътф ствуващи тежки неконтролирани медицински състояния, предишен неуспех на лечение неутрализиращо TNF, или алергия към полиетилен гликол. Писменно информиращо съгласие се получава от всеки пациент преди записва-нето. Изследването е одобрено от местния комитет по етика на изследванията.
Протокол на лечението
RA пациенти се разделят на 3 групи, като всяка една получава повишаваща доза от опитното лекарствено средство • (1, 5, или 20mg/kg). Всяка група от 12 се разделя произволно на
8, които да получат CDP870, и 4, които да получат плацебо. CDP870 се дава като единична интравенозна инфузия (100 ml общо) в продължение на 60 минути. Плацебо (натриево ацетатен буфер) се дава по подобен начин като единична интравенозна инфузия от 100 ml в продължение на 60 минути. Лечението се провежда на базата на приходящи пациенти. След 8 седмици, всички пациенти са имали възможността да получат инфузия или от 5, или от 20 mg/kg CDP870 по отворен начин.
Клинично изследване:
Активността на RA заболяване се изследва на базата на World Health Organization (Световната здравна организация) и International League of Associations for Reumatology (Международен съюз на асоциациите по ревматология) (Boers et al., Reumatol - Supplement, 41, 86-89, 1994) и European League Ageinst Reumatism (EULAR) (Европейския съюз срещу ревматизъм) (Scott et al., Clin. Exp. Reumatol., 10, 521-525, 1992) съществените данни са изложени за бройка от 28 стави. Промени в активността на заболяването се изследват чрез Disease Activity Score (Prevoo et al., Arthritis Rheum., 38, 44-48, 1995) и ACR responses criteria (Felson et al., Arthritis Rheum., 38, 727-735, 1995). Изследвания се провеждат преди лечението, и на 1, 2, 4, 6 и 8 седмици след лечението. Пациентите също така се изследват за безопасност и поносимост на изследваното лекарствено средство. Хематология, биохимия, противоCDP870 антитела и различни възможности се изследват при всяка визита.
CDP870 плазмена концентрация и противо-СОР870 антитела:
CDP870 се измерва чрез изследване на ензимно-свързан имуносорбент (ELISA). Серийни разреждания на плазма от пациенти се инкубират в блюда за микротитруване (Nunc) покрити с рекомбинантни човешки TNFa (Strathmann Biotech GmbH, Hannover). Уловен CDP870 се проявява чрез козя противочовешка капа лека верига конюгирана с пероксидаза от хрян (Cappel, INC), последвано от тетраметилбензидинов (ТМВ) субстрат.
Антитела срещу CDP870 се скринират (при 1/10 разреждане на плазма), използувайки сандвич ELISA двоен антиген с биотинилиран CDP870 като втори пласт. Свързаните антитела се освобождават, използувайки HRP-стрептавидин и ТМВ субстрат. Изследването се калибрира, използувайки свръхимунен заешки IG стандарт. Единицата за активност е еквивалентна на 1 μg заешки стандарт.
Статистически анализ ф Изследването е изследователско по отношение на природата, и размера на пробата се базира на предварителен опит с подобни срадства. Ефикасността на CDP870 се анализира, като се изчисли резултата от активността на заболяването (DAS) и ACR20/50 отговори за намерението да се лекува и за протокол, използувайки методика на плътно изпитание. Резултата от активността на заболяването се изчислява както следва: DAS = 0,555 х корен квадратен от (28 меки стави) + 0,284 х корен квадратен от (28 подути стави) + 0,7 х In(ESR) ©+ 0,0142 х (обща оценка на пациента). Най-напред, обединеI ните активни групи се сравняват с плацебо. Ако това сравнеI ние е значимо при 5 % ниво, всяка група на дозиране се сравj нява с плацебо. Всички сравнения са двойно обработени със
I
I значимо ниво от 5 %. Всички Р-стоиности произлизат от | изследователските анализи, и не се използуват за инференциращи интерпретации.
Резултати Демография:
Приемат се 36 пациенти с RA. Техните демографски подробности са дадени на таблица 6. Средната възраст е 56 години, и 30 пациенти са жени. Средната продължителност на RA е 13 години, а 21 пациенти са с положителен ревматоиден фактор. Пациенти в различните групи имат подобни демографски характеристики. През периода на сляпо дозиране, 6/12 пациенти лекувани с плацебо отпадат от изследването поради О влошаване на RA > 4, седмици след дозирането. 2/24 пациенти, лекувани с CDP870 отпадат, и двата в групата с 1 mg/kg, поради влошаване на RA/загуба при следващите > 4 седмици след дозирането. Разликата е статистически значителна (р = 0,009, Fisher exact test).
Таблица 6: Демографски подробности (средно ± стандартно отклонение)
Брой Пол Възраст Продължителност на заболяването Ревматоиден фактор Брой на предишни DMARDs
(М:Ж)
Плацебо 12 1,11 51+8 12±8 8(67%) 5+1
1 mg/kg 8 1:7 59±7 12±7 4(50%) 4±1
5 mg/kg 8 2:6 54±13 13±5 5(63%) 5+2
20 mg/kg 8 2:6 61+11 14+13 4(50%) 4+2
Клинична ефикасност
Пропорционалността на пациенти с ACR20 подобрение за популацията на протокол с последно извършено наблюдение преди това, е 16,7, 50, 87,5, и 62,5 % след плацебо, 1,5 и 20 mg/kg CDP870 (комбиниран лечебен ефект р = 0,012) на 4 седмици, и 16,7, 25, 75 и 75 % (р = 0,032) на 8 седмици. Намалени на резултата на DAS (средно) за популацията на протокол с последно извършено наблюдение е 0,15, 1,14, 1,91 и 1,95 след плацебо, 1,5 и 20 mg/kg CDP870 (комбиниран лечебен ефект р = 0,001) на 4 седмици, и 0,31, 0,09, 2,09 и 1,76 (р = 0,008) на 8 седмици (фигура 23). Изменения в отделните съставни части на World Health Organisation и International League of Associations for Rheumatology комплект от съществени даднни е показан на фигура 24.
След отворената белязана доза за еднократно дозиране на CDP870, се постигат подобни благоприятни ефекти. От 36-те пациенти, приети за изследването, 32 получават втора инфузия с CDP870. Пропорционалността на пациенти с ACR20 подобрение от предществуващото първо инфузиране е 72,2 и 55,6 % след 5 и 20 mg/kg CDP870 на 4 седмици, и 55,6 и 66,7 % на 8 седмици.
Нежелателни явления
Лечението се понася добре, без свързана с инфузия реакция. Не се докладва за никаква алергична реакция, или кожен обрив. При двойно-сляпата фаза, има 19, 38, 8 и 14 нежелателни явления с плацебо, в групите с 1, 5 и 20 mg/kg съответно. Най-общото е главоболие с 9 епизоди при 5 пациента (1 с плацебо, 3 с 1 mg/kg, 1 с 20 mg/kg). Един пациент, който получва плацебо и 3 пациенти, които получа-ват CDP870 (1 с 5 mg/kg, и 2 с 20 mg/kg) развиват инфекции в долните дихателни пътища. Те се докладват като като средни, или умерени. Те се лекуват с орално приложение на антибиотици, и се възстановяват след 1 - 2 седмичен период. Трима пациенти, всеки един от които в групите с 1 и 5 mg/kg и един в групата с 20 mg/kg развиват инфекция на пикочните пътища 1 - 2 месеца след лечението с CDP870. Едно нежелателно явление е описано като тежко, което е епизод на болки в гърлото, появили се 3 © дена след инфузия с 1 mg/kg. Повиша-ване на анти-нуклеарно антитяло се наблюдава при 4 пациенти: 1 в групата на плацебо (отрицателно до 1/40), 2 в групата с 1 mg/kg (отрицателно до 1/40, отрицателно до 1/80), и 1 в групата с 20 mg/kg (отрицателно до 1/40). Не се установяват промени в анти-ДНК антителата, или в антителата анти-кардиолипини.
CDP870 плазмена концентрация и анти- CDP870 нива
Съгласно очакването, за всички нива на дозиране на ©CDP870, пикът на плазмена концентрация се появява в края на инфузията, и е с доза пропорционална на бавното спадане на плазмената концентрация след това. Профилът на плазмената концентрация на CDP870 изглежда много подобен на този, наблюдаван предварително при доброволци, където полуживотът се изчислява че е приблизително 14 дена. При повторно дозиране, се наблюдава подобен профил за единична доза на инфузия.
След единична интравенозна инфузия, нивата на антиCDP870 са ниски, или неоткриваеми.
ЙгпЩиг
Обсъждане
Неутрализирането на TNFa е ефективна стратегия за лечение на RA. Понастоящем, това изисква използуването на биологични средства, такива като mAb, или разтворим рецептор/човешки Fc слят протеин, които са скъпи в търговската мрежа. Терапевтичното средство за неутрализиране на TNFa се нуждае от свързване към TNFa с висок афинитет, и има дълъг плазмен полу-живот, ниска антигенност, и висока поносимост и безопасност. То също така се нуждае от това да бъде Q приемливо за всички пациенти с RA, които биха се подобрили от блокиране на TNFa. Една технология, която би могла да постигне тези цели е конюгирането с полиетилен гликол на TNFa свързващ фрагмент от антитяло в Е. coli. В това предварително изследване, ние установяваме, че CDP870, PEGилиран, анти-TNFa, модифициран Fab, е ефективен, и добре поносим от пациенти с RA.
Изследванията in vitro показват, че CDP870 има подобна TNFa неутрализираща активност към мише анти-TNFa родителско антитяло. Това изследване потвърждава, че CDP870 © намалява възпалението, и подобрява симптомите на RA. Клинично подобрение, както се измерва чрез критерий за ACR20 отговор в групите с 5 и с 20 mg/kg (75 %, 75 %) е сравнимо с етанерцепт (etanercept) (60 %) (Moreland et al., Annal Int. Med., 130, 478-486, 1999) и инфликсимаб (infliximab) (50 %) (Maini et al., Lancet, 354, 1932-1939, 1999). При средните и при най-високите изследвани нива на дозиране, терапевтичният ефект достига до 8 седмици, което е сравнимо с предшествуващите други mAbs (Elliott et al., Lancet, 344, 1105-1110, 1994 и Rankin et al., Br. J. Rheumatol., 34, 334-342, 1995). Предшествуващо изследване показва, че терапевтичният ефект на анти-TNFa антитяло е сварзан с неговия плазмен полу-живот и генерирането на циркулиращи антитела (Maini et al., Artritis Rheum. 38, (Supplement): S 186 1995 (Abstract)). Нашето изследване показва, че CDP870 има плазмен полу-живот 14 дена, който е еквивалентен на този на цяло антитяло (Rankin et al., (supra)) и много по-дълъг от полу-живота на не-конюгирани фрагменти Fab’. Освен това, CDP870 генерира само много ниски нива на отговор на антитяло.
© Една от важните цели на това изследване е да се изпита поносимостта и безопасността при прилагането на тези PEG-илирани Fab’. В нашето изследване, CDP870 се показва добре поносимо. Въпреки това, необходимо е допълнително изследване, за да се оцени дългосрочна токсичност, по-специално риска от демиелиниращо заболяване, инфекция и кожни обриви, за които е докладвано при етанерцепт и инфликсимаб.
Като обобщение, CDP870 е терапевтично ефективно при ©RA, и е добре поносимо при това краткотрайно изследване.
Трябва да се разбира, че горе описаните примери са само примерни образци, и не ограничават обхвата на настоящето изобретение, както се дефинира в следващите претенции.

Claims (67)

1. Молекула на антитяло, имаща специфичност за човешки TNFa, съдържаща тежка верига, в която променливата област съдържа CDR, имаща последователността, дадена като Н1 на фигура 3 (SEQ ID NO : 1) за CDRH1, като Н2’ на фигура 3 (SEQ ID NO : 2), или като Н2’ на фигура 3 (SEQ ID NO : 7) за CDRH2, или като НЗ на фигура 3 (SEQ ID NO : 3) за CDRH3.
2. Молекула на антитяло, имаща специфичност към човешки TNFa, съдържаща лека верига, в която променливата област съдържа CDR, имаща последователността, дадена като L1 на фигура 3 (SEQ ID NO : 4) за CDRL1, като L2 на фигура 3 (SEQ ID NO : 5) за CDRL2, или като L3 на фигура 3 (SEQ ID NO : 6) за CDRB3.
3. Молекулата на антитяло съгласно претенция 1, или 2, характеризираща се с това, че съдържа тежка верига, в която променливата област съдържа CDR, имаща последователността, дадена в SEQ ID NO : 1 за CDRH1, SEQ ID NO : 2, или SEQ ID NO : 7, за CDRH2, или SEQ ID NO : 3 за CDRH3, и лека верига, в която променливата област съдържа CDR, имаща последователността, дадена в SEQ ID N0 : 4 за CDRL1, SEQ ID N0 : 5 за CDRL2, или SEQ ID N0 : 6 за CDRB3.
4. Молекулата на антитяло съгласно претенция 3, характеризираща се с това, че съдържа SEQ ID N0 : 1 за CDRH1, SEQ ID N0 : 2, или SEQ ID N0 : 7, за CDRH2,
SEQ ID N0:3 за CDRH3, SEQ ID N0:4 за CDRL1, SEQ ID NO : 5 за CDRL2, и SEQ ID NO ; 6 за CDRB3.
5. Молекулата на антитяло съгласно която и да е претенция от 1 до 4, характеризираща се с това, че съдържа SEQ ID N0 : 2 за CDRH2 .
6. Молекулата на антитяло съгласно която и да е претенция от 1 до 5, характеризираща се с това, че е CDR-при- ф садена молекула на антитяло.
7. Молекулата на антитяло съгласно претенция 6, характеризираща се с това, че вариабилният домен съдържа рамкирани области на човешки приемник, и не-човешки донорни CDRs.
8. Молекулата на антитяло съгласно претенция 7, характеризираща се с това, че рамкираните области на вариабилния домен на тежката верига на човешки приемник се е базират на човешка група 1 консенсус последователност, и съдържа не-човешки донорни остатъци в позиции 28, 69 и 71.
9. Молекулата на антитяло съгласно претенция 7, характеризираща се с това, че рамкираните области на вариабилния домен на тежката верига на човешки приемник се базират на човешка група 1 консенсус последователност, и съдържа не-човешки донорни остатъци в позиции 28, 38,46, 67 и71.
10. Молекулата на антитяло съгласно претенция 7, характеризираща се с това, че рамкираните области на вариабилния домен на тежката верига на човешки приемник се базират на човешка група 3 консенсус последователност, и съдържа не-човешки донорни остатъци в позиции 27, 28, 30, 48, 49, 69, 71,73, 76 и 78.
11. Молекулата на антитяло съгласно претенция 7, характеризираща се с това, че рамкираните области на вариа- © билния домен на леката верига на човешки приемник се базират на човешка група 1 консенсус последователност, и съдържа не-човешки донорни остатъци в позиции 46 и 60.
12. Молекулата на антитяло съгласно която и да е претенция от 1 до 11, характеризираща се с това, че съдържа вариабилната област на леката верига на hTNF40-gL1 (SEQ ID NO : 8) и вариабилната област на тежката Bepnragh3h hTNF40-4 (SEQ ID NO: 11).
13. Молекулата на антитяло съгласно която и да е претенция от 1 до 12, характеризираща се с това, че е Fab фрагмент.
14. Молекулата на антитяло съгласно претенции 12 и 13, характеризираща се с това, че Fab фрагментът съдържа тежка верига, имаща последователността, дадена в SEQ ID NO : 111, и лека верига, имаща последователността, дадена в SEQIDNO: 113.
I
15. Молекулата на антитяло съгласно която и да е претенция от 1 до 12, характеризираща се с това, че е модифициран Fab фрагмент, имащ на С-терминалния край на неговата тежка верига една, или повече амино киселини, което позволява прикрепването на молекула ефектор, или молекула репортер.
16. Молекулата на антитяло съгласно претенция 15, характеризираща се с това, че допълнителните амино киселини образуват модифицирана стърчаща област, съдържаща един, или два цистеинови остатъка, към които може да се прикачи молекулата ефектор, или молекулата репортер.
17. Молекулата на антитяло съгласно претенция 12, характеризираща се с това, че е модифициран Fab фрагмент, съдържащ тежка верига, имаща последователността, дадена в SEQ ID N0 : 115, и лека верига, имаща последователността, дадена в SEQ ID N0 : 113.
18. Молекула на антитяло, имаща специфичност към човешки TNFa, имаща лека верига, съдържаща последователността, дадена в SEQ ID N0 : 113.
19. Молекула на антитяло, имаща специфичност към човешки TNFa, имаща лека верига, състояща се от последователността, дадена в SEQ ID N0 : 113.
20. Молекула на антитяло, имаща специфичност към човешки TNFa, имаща тежка верига, съдържаща последователността, дадена в SEQ ID N0 : 115.
21. Молекула на антитяло, имаща специфичност към човешки TNFa, имаща тежка верига, състояща се от последователността, дадена в SEQ ID N0 :115.
22. Молекула на антитяло, имаща специфичност към © човешки TNFa, имаща лека верига, състояща се от последователността, дадена в SEQ ID N0 : 113, и тежка верига, съдържаща последователността, дадена в SEQ ID N0 :115.
23. Молекула на антитяло, имаща специфичност към човешки TNFa, имаща лека верига, състояща се от последователността, дадена в SEQ ID N0 : 113, и тежка верига, състояща се от последователността, дадена в SEQ ID N0 :115.
•
24. Вариант на молекулата на антитяло съгласно която и да е претенция от 1 до 23, характеризираща се с това, че има подобрен афинитет към TNFa.
25. Вариантът съгласно претенция 24, характеризираща се с това, че се получава посредством протокол за афинитетно узряване.
26. Антитялото съгласно която и да е претенция от 1 до 3, характеризиращо се с това, че е мише онти-TNFa монокпонално антитяло hTNF40.
27. Молекулата на антитяло съгласно която и да е претенция от 1 до 3, характеризираща се с това, че е молекула на химерно антитяло, съдържащо вариабилни домени на леката и на тежката верига на моноклоналното антитяло от претенция 26.
28. Съединение, съдържащо молекулата на антитяло съгласно която и да е претенция от 15 до 23, имаща молекула ефектор, или молекула репортер, ковалентно прикрепена към
Q амино киселина на, или към С-терминалния край на неговата тежка верига.
29. Съединението съгласно претенция 28, което съдържа молекула ефектор.
30. Съединението съгласно претенция 29, където молекулата ефектор съдържа един, или повече полимери.
31. Съединението съгласно претенция 30, където единият, или повечето полимери е/са по избор заместен/и полиалкилен/и, полиалкиленов/ови, или полиоксиалкиленов/ови полимер/и с права, или разклонена верига, или полизахарид/и с разклонена, или с неразкпонена верига.
32. Съединението съгласно претенция 31, където единият, или повечето полимери е/са метоксиполи(етиленгликол).
33. Съединение, съдържащо молекулата на антитяло съгласно претенция 17, имащо прикрепена към един от цистеиновите остатъци на С-терминалния край на тежката верига лизил-малеимидна група, където всяка амино група на лизиловия остатък има ковалентно свързан към нея метоксиполи(етиленгликол)-ов остатък, имащ молекулно тегло приблизително 20,000Da.
34. Съединение, съдържащо молекула на антитяло, © имаща специфичност към човешки TNFa, имаща лека верига, съдържаща последователността, дадена в SEQ ID N0 : 113, и тежка верига, съдържаща последователността, дадена в SEQ ID N0 : 115, имащо прикрепен/и към един от цистеиновите остатъци на С-терминалния край на тежката верига един, или повече синтетичен/и, или съществуващ/и в природата полимер/и.
35. Съединение, съдържащо молекула на антитяло, имаща специфичност към човешки TNFa, имаща лека верига, състояща се от последователността, дадена в SEQ ID N0 : 113, и тежка верига, състояща се от последователността, дадена в SEQ ID N0 : 115, имаща прикрепен/и към един от цистеиновите остатъци на С-терминалния край на тежката верига един, или повече синтетичен/и, или съществуващ/и в природата полимер/и.
36. Съединение, съдържащо молекула на антитяло, имаща специфичност към човешки TNFa, имаща лека верига, съдържаща последователността, дадена в SEQ ID N0 : 113, имаща прикрепена към един от цистеиновите остатъци на
С-терминалния край на тежката верига лизил-малеимидна група, където всяка амино група на лизиловия остатък има ковалентно свързан към нея метоксиполи(етиленгликол)-ов остатък, имащ молекулно тегло приблизително 20,000Da.
37. Съединение, съдържащо молекула на антитяло, имаща специфичност към човешки TNFa, имаща лека верига, състояща се от последователността, дадена в SEQ ID NO : 113, имаща прикрепена към един от цистеиновите оста- ф тъци на С-терминалния край на тежката верига лизилмалеимидна група, където всяка амино група на лизиловия остатък има ковалентно свързан към нея метоксиполи(етиленгликол)-ов остатък, имащ молекулно тегло приблизително 20,000Da.
38. Съединение, съдържащо молекула на антитяло, имащо специфичност към човешки TNFa, имаща тежка верига, съдържаща последователността, дадена в SEQ ID NO : 115, имаща прикрепена към един от цистеиновите остатъци на Ον терминалния край на тежката верига лизил-малеимидна група, където всяка амино група на лизиловия остатък има ковалентно свързан към нея метоксиполи(етиленгликол)-ов остатък, имащ молекулно тегло приблизително 20,000Da.
39. Съединение, съдържащо молекула на антитяло, имаща специфичност към човешки TNFa, имаща тежка верига, състояща се от последователността, дадена в SEQ ID NO : 115, имащо прикрепена към един от цистеиновите остатъци на С-терминалния край на тежката верига лизил малеимидна група, където всяка амино група на лизиловия остатък има ковалентно свързан към нея метоксиполи(етиленгликол)-ов остатък, имащ молекулно тегло приблизително 20,000Da.
40. Съединение, съдържащо молекула на антитяло, имаща специфичност към човешки TNFa, имаща лека верига, съдържаща последователността, дадена в SEQ ID N0 : 113, и тежка верига, съдържаща последователността, дадена в SEQ ID N0 : 115, имащо прикрепена към един от цистеиновите остатъци на С-терминалния край на тежката верига лизилмалеимидна група, където всяка амино група на лизиловия остатък има ковалентно свързан към нея метоксиполи(етиленгликол)-ов остатък, имащ молекулно тегло приблизително 20,000Da.
41. Съединение, съдържащо молекула на антитяло, имаща специфичност към човешки TNFa, имаща лека верига, състояща се от последователността, дадена в SEQ ID N0 : 113, и тежка верига, състояща се от последователността, дадена в SEQ ID N0 : 115, имаща прикрепена към един от цистеиновите остатъци на С-терминалния край на тежката верига лизил-малеимидна група, където всяка амино група на лизиловия остатък има ковалентно свързан към нея метоксиполи(етиленгликол)-ов остатък, имащ молекулно тегло приблизително 20,000Da.
42. Молекула на антитяло, съдържаща хибридна CDR, съдържаща срязана донорна CDR последователност, където липсващата част от донорната CDR е заместена с различна последователност, и образува функционална CDR.
43. Молекулата на антитяло съгласно претенция 42, характеризираща се с това, че липсващата част от CDR последователността е от антитялото, от което произлизат рамковите области на молекулата на антитялото.
44. Молекулата на антитяло съгласно претенция 43, © характеризираща се с това, че липсващата част от CDR последователността е от антитяло на зародишна линия, имащо консенсус рамкови области.
45. Молекулата на антитяло съгласно която и да е претенция от 42 до 44, характеризираща се с това, че CDRH2 на тежката верига е хибрид в молекулата на антитялото.
46. Молекулата на антитяло съгласно която и да е претенция от 42 до 45, характеризираща се с това, че отрязъкът на донорната CDR е от 1 до 8 амино киселини.
47. Молекулата на антитяло съгласно претенция 46 до 45, характеризираща се с това, че отрязъкът е от 4 до 6 амино киселини.
48. Молекулата на антитяло съгласно която и да е претенция от 42 до 47, характеризираща се с това, че изрязването се прави при С-терминала на CDR.
49. ДНК последователност, която кодира тежката верига и/или леката верига на молекулата на антитяло съгласно която и да е претенция от 1 до 27, и от 42 до 48.
50. ДНК последователността, съгласно претенция 49, характеризираща се с това, че съдържа последователността, показана в SEQ ID NO : 8, или 10.
51. ДНК последователността, съгласно претенция 49, характеризираща се с това, че съдържа последователността, показана в SEQ ID N0:10, или 11.
52. ДНК последователността, съгласно претенция 49, характеризираща се с това, че съдържа последователността, показана в SEQ ID N0 :110,112 или 114.
53. Клониращ, или експресиращ вектор, съдържащ ДНК последователността съгласно която и да е претенция от 49 до 52.
54. Е. coli енспресиращ вектор, съдържащ ДНК последователността съгласно която и да е претенция от 49 до 52.
55. Е. coli енспресиращият вектор съгласно претенция 54, характеризиращ се с това, че е pTTO(CDP870).
56. Клетка гостоприемник, трансформирана с вектора съгласно която и да е претенция от 53 до 55.
57. Метод за получаването на молекулата на антитяло съгласно която и да е претенция от 42 до 48, характеризиращ се с това, че се състои в култивиране на клетката гостоприемник съгласно претенция 56, и изолиране на молекулата на антитялото.
58. Метод за получаването на молекулата на антитяло съгласно която и да е претенция от 42 до 48, характеризиращ се с това, че се състои в култивиране на Е. coli съдържащ Е. coli експресиращ вектор, съдържащ ДНК последователността съгласно която и да е претенция от 53 до 55, и изолиране на молекулата на антитялото.
59. Методът съгласно претенция 58, характеризиращ се с това, че молекулата на антитяло се прицелва в периплазмата.
60. Терапевтичен, или диагностичен състав, характеризиращ се с това, че съдържа молекулата на антитяло съгласно която и да е претенция от 1 до 27, и от 42 до 48, или съединението съгласно която и да е претенция от 28 до 41.
61. Молекулата на антитяло съгласно която и да е претенция от 1 до 27, и от 42 до 48, имаща специфичност към човешки TNFa, или съединението съгласно която и да е претенция от 28 до 41, за използуване при лечение на патология, медиирана от TNFa.
62. Молекулата на антитяло, или съединението съгласно претенция 61, за използуване при лечение на ревматоиден-, или остео- артрит.
63. Използуване на молекулата на антитяло съгласно която и да е претенция от 1 до 27, и от 42 до 48, имаща специфичност към човешки TNFa, или съединението съгласно която и да е претенция от 28 до 41, при получаването на лекарство за лечение на патология, медиирана от TNFa.
64. Използуването съгласно претенция 63, където патологията е ревматоиден-, или остео- артрит.
65. Векторът рДНКЬЕпд-GI, както е показан на фигура
19.
66. Векторът pTTO(CDP870), както е показан на фигура
22.
67. Полипептид, имащ амино киселинната последователност, дадена в която е да е от SEQ ID N0 :1 до 7.
BG106278A 2000-06-06 2002-01-04 Специфични молекули на антитела за човешки туморен некрозен фактор алфа, и тяхното използване BG66072B1 (bg)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB0013810.7A GB0013810D0 (en) 2000-06-06 2000-06-06 Biological products
PCT/GB2001/002477 WO2001094585A1 (en) 2000-06-06 2001-06-05 Antibody molecules having specificity for human tumor necrosis factor alpha, and use thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
BG106278A true BG106278A (bg) 2002-12-29
BG66072B1 BG66072B1 (bg) 2011-01-31

Family

ID=9893121

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BG106278A BG66072B1 (bg) 2000-06-06 2002-01-04 Специфични молекули на антитела за човешки туморен некрозен фактор алфа, и тяхното използване

Country Status (43)

Country Link
US (4) US7012135B2 (bg)
EP (4) EP1287140B1 (bg)
JP (3) JP4064812B2 (bg)
KR (1) KR20020047097A (bg)
CN (1) CN1289671C (bg)
AP (1) AP2092A (bg)
AR (1) AR033978A1 (bg)
AT (1) ATE451460T1 (bg)
AU (1) AU783756B2 (bg)
BE (1) BE2010C019I2 (bg)
BG (1) BG66072B1 (bg)
BR (2) BR0106682A (bg)
CA (2) CA2380298C (bg)
CY (6) CY1109889T1 (bg)
CZ (1) CZ300737B6 (bg)
DE (3) DE10192353T1 (bg)
DK (4) DK3059314T3 (bg)
EC (1) ECSP024210A (bg)
ES (5) ES2707714T3 (bg)
FR (1) FR10C0015I2 (bg)
GB (2) GB0013810D0 (bg)
HK (2) HK1051385A1 (bg)
HU (4) HU230561B1 (bg)
IL (3) IL147992A0 (bg)
IS (2) IS2808B (bg)
LT (1) LT2308975T (bg)
LU (1) LU91674I2 (bg)
MX (1) MXPA01013440A (bg)
MY (1) MY136603A (bg)
NL (1) NL300982I9 (bg)
NO (4) NO334808B1 (bg)
NZ (1) NZ516596A (bg)
OA (1) OA12282A (bg)
PE (1) PE20020292A1 (bg)
PL (2) PL218516B1 (bg)
PT (4) PT2230308E (bg)
RU (1) RU2303604C2 (bg)
SI (3) SI1287140T1 (bg)
SK (1) SK288343B6 (bg)
TR (1) TR201900227T4 (bg)
TW (2) TWI353358B (bg)
WO (1) WO2001094585A1 (bg)
ZA (1) ZA200200097B (bg)

Families Citing this family (106)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB0013810D0 (en) * 2000-06-06 2000-07-26 Celltech Chiroscience Ltd Biological products
CA2868614A1 (en) 2001-06-08 2002-12-08 Abbott Laboratories (Bermuda) Ltd. Methods of administering anti-tnf.alpha. antibodies
US20060073141A1 (en) * 2001-06-28 2006-04-06 Domantis Limited Compositions and methods for treating inflammatory disorders
GB0129105D0 (en) * 2001-12-05 2002-01-23 Celltech R&D Ltd Expression control using variable intergenic sequences
JP4441269B2 (ja) * 2002-03-20 2010-03-31 ファルマシア コーポレーション 抗体ジスルフィド異性体、その使用及びその分析法
US20040009172A1 (en) * 2002-04-26 2004-01-15 Steven Fischkoff Use of anti-TNFalpha antibodies and another drug
EP2371392B1 (en) 2002-05-02 2015-07-08 Wyeth Holdings LLC Calicheamicin derivative-carrier conjugates
GB0210121D0 (en) * 2002-05-02 2002-06-12 Celltech R&D Ltd Biological products
ES2370710T3 (es) * 2002-05-28 2011-12-22 Ucb Pharma, S.A. ISÓMERO POSICIONAL DE PEG DE UN ANTICUERPO ANTI-TNFalfa (CDP870).
US9321832B2 (en) 2002-06-28 2016-04-26 Domantis Limited Ligand
US20040136990A1 (en) * 2002-07-19 2004-07-15 Abbott Biotechnology Ltd. Treatment of pain using TNFalpha inhibitors
AU2003265361A1 (en) * 2002-08-28 2004-03-19 Pharmacia Corporation Stable ph optimized formulation of a modified antibody
WO2004019860A2 (en) * 2002-08-28 2004-03-11 Pharmacia Corporation Formulations of modified antibodies and methods of making the same
US20040105858A1 (en) * 2002-08-29 2004-06-03 Kim Joanne Young Hee Kwak Diagnosis and treatment of infertility
MY150740A (en) 2002-10-24 2014-02-28 Abbvie Biotechnology Ltd Low dose methods for treating disorders in which tnf? activity is detrimental
EP2311867A1 (en) 2002-10-29 2011-04-20 Anaphore, Inc. Trimeric binding proteins for trimeric cytokines
US7101978B2 (en) 2003-01-08 2006-09-05 Applied Molecular Evolution TNF-α binding molecules
US7575893B2 (en) * 2003-01-23 2009-08-18 Genentech, Inc. Methods for producing humanized antibodies and improving yield of antibodies or antigen binding fragments in cell culture
GB0303337D0 (en) * 2003-02-13 2003-03-19 Celltech R&D Ltd Biological products
EP1597299A2 (en) * 2003-02-19 2005-11-23 Pharmacia Corporation Carbonate esters of polyethylene glycol activated by means of oxalate esters
WO2004098578A2 (en) * 2003-05-12 2004-11-18 Altana Pharma Ag Composition comprising a pde4 inhibitor and a tnf-alfa antagonist selected from infliximab, adalimumab, cdp870 and cdp517
PT1639011E (pt) * 2003-06-30 2009-01-20 Domantis Ltd Anticorpos (dab) de domínio único peguilados
WO2005014649A2 (en) * 2003-08-08 2005-02-17 Pharmacia Corporation Method for the preparation of molecules having antibody activity
US7785830B2 (en) * 2003-08-13 2010-08-31 Sandoz Ag Expression vectors, transformed host cells and fermentation process for the production of recombinant polypeptides
US20060173167A1 (en) * 2003-08-13 2006-08-03 Gunter Stempfer Process for the purification of recombinant polypeptides
GB0319601D0 (en) 2003-08-20 2003-09-24 Sandoz Ag Production process
KR100570422B1 (ko) * 2003-10-16 2006-04-11 한미약품 주식회사 대장균 분비서열을 이용하여 항체 단편을 분비·생산하는 발현벡터 및 이를 이용하여 항체 단편을 대량 생산하는 방법
CN100393748C (zh) * 2003-11-06 2008-06-11 上海中信国健药业有限公司 全人源肿瘤坏死因子抗体，其制备方法以及药物组合物
KR100772800B1 (ko) * 2003-11-17 2007-11-01 주식회사유한양행 인간 종양괴사인자 α를 인식하는 단일클론항체의가변영역 및 이를 코딩하는 유전자
US7435799B2 (en) 2004-01-08 2008-10-14 Applied Molecular Evolution TNF-α binding molecules
CN100427504C (zh) * 2004-06-02 2008-10-22 北京天广实生物技术有限公司 TNFα高亲和力嵌合抗体及其用途
JP2008504356A (ja) * 2004-06-30 2008-02-14 ドマンティス リミテッド 炎症性疾患を治療するための組成物及び方法
GB0425972D0 (en) * 2004-11-25 2004-12-29 Celltech R&D Ltd Biological products
US8022040B2 (en) * 2004-11-29 2011-09-20 The Regents Of The University Of California Hydroxyapatite-binding peptides for bone growth and inhibition
ES2359567T3 (es) * 2004-12-29 2011-05-24 Yuhan Corporation Anticuerpo humanizado específico para el factor de necrosis tumoral-alfa.
CN101500607B (zh) * 2005-05-16 2013-11-27 阿布维生物技术有限公司 TNFα抑制剂治疗腐蚀性多关节炎的用途
KR101340559B1 (ko) * 2005-06-01 2013-12-11 암젠 리서치 (뮌헨) 게엠베하 항-인터루킨2 항체
BRPI0611765B1 (pt) 2005-06-07 2022-09-27 Esbatech Ag Anticorpo ou fragmento de anticorpo estável e solúvel que se liga especificamente ao tnf-alfa seus usos e composição diagnóstica ou terapêutica
GB0520169D0 (en) * 2005-10-04 2005-11-09 Celltech R&D Ltd Biological products
JP2009533347A (ja) * 2006-04-07 2009-09-17 ネクター セラピューティックス エイエル，コーポレイション 抗ＴＮＦα抗体の複合体
US9399061B2 (en) 2006-04-10 2016-07-26 Abbvie Biotechnology Ltd Methods for determining efficacy of TNF-α inhibitors for treatment of rheumatoid arthritis
US9605064B2 (en) 2006-04-10 2017-03-28 Abbvie Biotechnology Ltd Methods and compositions for treatment of skin disorders
US9624295B2 (en) 2006-04-10 2017-04-18 Abbvie Biotechnology Ltd. Uses and compositions for treatment of psoriatic arthritis
US20080131374A1 (en) * 2006-04-19 2008-06-05 Medich John R Uses and compositions for treatment of rheumatoid arthritis
EP2046385B1 (en) 2006-07-03 2015-03-25 Charles David Adair Composition for modulating the expression of cell adhesion molecules
EP1914242A1 (en) * 2006-10-19 2008-04-23 Sanofi-Aventis Novel anti-CD38 antibodies for the treatment of cancer
EP2144599B1 (en) * 2007-03-02 2010-08-04 Farnam Companies, Inc. Sustained release pellets comprising wax-like material
WO2008153997A1 (en) * 2007-06-07 2008-12-18 Brookwood Pharmaceuticals, Inc. Reduced-mass, long-acting dosage forms
EP2171451A4 (en) 2007-06-11 2011-12-07 Abbott Biotech Ltd METHOD FOR TREATING JUVENILIAN IDIOPATHIC ARTHRITIS
WO2009026274A1 (en) * 2007-08-22 2009-02-26 Medarex, Inc. Site-specific attachment of drugs or other agents to engineered antibodies with c-terminal extensions
US20110002927A1 (en) * 2008-02-05 2011-01-06 Delenex Therapeutics Ag Antigen-binding polypeptides against cartilage degeneration
WO2009135861A2 (en) * 2008-05-07 2009-11-12 Novo Nordisk A/S Humanized antibodies against human interferon-alpha
DK3216803T3 (da) 2008-06-25 2020-06-02 Novartis Ag Stabile og opløselige antistoffer, der hæmmer vegf
SI2307458T1 (en) 2008-06-25 2018-08-31 Esbatech, An Alcon Biomedical Research Unit Llc Humanization of rabbit antibodies using a universal antibody framework
PL2307457T5 (pl) * 2008-06-25 2022-12-27 Novartis Ag Stabilne i rozpuszczalne przeciwciała hamujące tnf
SI3628686T1 (sl) 2008-06-25 2022-01-31 Novartis Ag Humaniziranje zajčjih protiteles z uporabo univerzalnega ogrodja protitelesa
CN101684156B (zh) * 2008-09-27 2011-12-28 苏州工业园区晨健抗体组药物开发有限公司 人TNFα单克隆抗体、其PEG化纳米颗粒及其应用
TW201031421A (en) * 2009-01-29 2010-09-01 Abbott Lab IL-1 binding proteins
US20110165063A1 (en) * 2009-01-29 2011-07-07 Abbott Laboratories Il-1 binding proteins
WO2011003622A1 (en) 2009-07-10 2011-01-13 Ablynx N.V. Method for the production of variable domains
HUE040306T2 (hu) 2009-09-24 2019-03-28 Ucb Biopharma Sprl Baktériumtörzs rekombináns fehérje expresszálására, amely tartalmaz proteázhiányos, de chaperonaktivitását megtartott DEGP-t és génkiütött TSP és PTR gént
CA2774032C (en) 2009-10-23 2019-03-26 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Anti-gcc antibody molecules and related compositions and methods
GB201000591D0 (en) 2010-01-14 2010-03-03 Ucb Pharma Sa Bacterial hoist strain
GB201000587D0 (en) 2010-01-14 2010-03-03 Ucb Pharma Sa Bacterial hoist strain
GB201000590D0 (en) 2010-01-14 2010-03-03 Ucb Pharma Sa Bacterial host strain
GB201000588D0 (en) 2010-01-14 2010-03-03 Ucb Pharma Sa Bacterial host strain
GB201001791D0 (en) 2010-02-03 2010-03-24 Ucb Pharma Sa Process for obtaining antibodies
US9616120B2 (en) 2010-03-04 2017-04-11 Vet Therapeutics, Inc. Monoclonal antibodies directed to CD20
BR112012022342A2 (pt) 2010-03-04 2017-02-14 Vet Therapeutics Inc anticorpos monoclonais dirigidos a cd52
AU2011237679B2 (en) 2010-04-07 2014-11-06 Abbvie Inc. TNF-alpha binding proteins
GB201012599D0 (en) * 2010-07-27 2010-09-08 Ucb Pharma Sa Process for purifying proteins
GB201012603D0 (en) 2010-07-27 2010-09-08 Ucb Pharma Sa Protein purification
GB201012784D0 (en) * 2010-07-29 2010-09-15 Ucb Pharma Sa Method
TWI538918B (zh) 2010-10-20 2016-06-21 財團法人工業技術研究院 人源化之單株抗體、其核苷酸序列與其用途
AR083495A1 (es) 2010-10-22 2013-02-27 Esbatech Alcon Biomed Res Unit Anticuerpos estables y solubles
WO2012164083A1 (en) 2011-06-01 2012-12-06 Actogenix N.V. Polycistronic expression system for bacteria
HUE035674T2 (en) 2011-07-13 2018-05-28 Ucb Biopharma Sprl Bacterial host strains expressing recombinant DSBC
EP2546267A1 (en) 2011-07-13 2013-01-16 UCB Pharma S.A. Bacterial host strain expressing recombinant DsbC
EP2758513B1 (en) 2011-09-23 2018-05-16 Intrexon Actobiotics NV Modified gram positive bacteria and uses thereof
EP2758512B1 (en) 2011-09-23 2018-05-09 Intrexon Actobiotics NV Modified gram positive bacteria and uses thereof
WO2013087914A1 (en) 2011-12-16 2013-06-20 Synthon Biopharmaceuticals B.V. EXPRESSION OF SECRETORY IgA ANTIBODIES IN DUCKWEED
US9156915B2 (en) 2012-04-26 2015-10-13 Thomas Jefferson University Anti-GCC antibody molecules
GB201208367D0 (en) 2012-05-14 2012-06-27 Ucb Pharma Sa Biological product
BR112015003032B1 (pt) 2012-08-13 2023-03-28 Genentech, Inc Anticorpos isolados, imunoconjugado, formulação farmacêutica e uso do anticorpo
JP2017518737A (ja) 2014-04-21 2017-07-13 ミレニアム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッドＭｉｌｌｅｎｎｉｕｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． ＳＹＫ標的治療薬のための抗ｐＳＹＫ抗体分子及びその使用
CA2964463C (en) 2014-10-22 2024-02-13 Extend Biosciences, Inc. Therapeutic vitamin d conjugates
US9616109B2 (en) 2014-10-22 2017-04-11 Extend Biosciences, Inc. Insulin vitamin D conjugates
CA2969981C (en) 2014-12-22 2024-06-25 Ucb Biopharma Sprl A method for manufacturing a protein coupled to a peg molecule
WO2017035430A2 (en) * 2015-08-27 2017-03-02 Kolltan Pharmaceuticals, Inc. Anti-alk antibodies and methods for use thereof
GB201522394D0 (en) 2015-12-18 2016-02-03 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
EP3919065B9 (en) 2016-01-14 2024-01-24 Intrexon Actobiotics NV Compositions and methods for the treatment of type 1 diabetes
RU2680011C2 (ru) 2016-04-29 2019-02-14 Закрытое Акционерное Общество "Биокад" Триспецифические антитела против il-17a, il-17f и другой провоспалительной молекулы
KR20220119529A (ko) * 2016-06-02 2022-08-29 애브비 인코포레이티드 글루코코르티코이드 수용체 작용제 및 이의 면역접합체
WO2019106609A1 (en) 2017-12-01 2019-06-06 Abbvie Inc. Glucocorticoid receptor agonist and immunoconjugates thereof
CN113631574A (zh) 2019-01-31 2021-11-09 努玛治疗有限公司 对TNFα和IL-17A具有特异性的多特异性抗体、靶向IL-17A的抗体及其使用方法
KR102323342B1 (ko) * 2019-04-26 2021-11-08 주식회사 와이바이오로직스 IL-17A 및 TNF-α에 특이적으로 결합하는 이중표적 항체
CN111909268B (zh) * 2019-05-07 2022-04-19 北京天成新脉生物技术有限公司 低免疫原性低ADCC/CDC功能抗TNF-α人源化单克隆抗体TCX060及其应用
TW202237639A (zh) 2020-12-09 2022-10-01 日商武田藥品工業股份有限公司 鳥苷酸環化酶ｃ（ｇｃｃ）抗原結合劑之組成物及其使用方法
TW202237638A (zh) 2020-12-09 2022-10-01 日商武田藥品工業股份有限公司 烏苷酸環化酶ｃ（ｇｃｃ）抗原結合劑之組成物及其使用方法
CA3208365A1 (en) 2021-02-15 2022-08-18 Chantal KUHN Cell therapy compositions and methods for modulating tgf-b signaling
CN117500816A (zh) 2021-08-26 2024-02-02 映恩生物制药（苏州）有限公司 一种甾体化合物及其缀合物
JP2024534603A (ja) 2021-09-24 2024-09-20 エックスブレイン バイオファーマ エービー 組換えタンパク質を発現させるためのｄｎａ構築物及び宿主細胞
SE545714C2 (en) * 2021-09-24 2023-12-19 Xbrane Biopharma Ab Dna contructs for producing a pelb signal peptide
SE545694C2 (en) * 2021-09-24 2023-12-05 Xbrane Biopharma Ab Dna construct comprising nucleotide sequences encoding amino acid sequences of certolizumab and pelb signal peptides
WO2023154799A1 (en) 2022-02-14 2023-08-17 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Combination immunotherapy for treating cancer
WO2024180518A1 (en) * 2023-03-01 2024-09-06 Lupin Limited Process for manufacturing antibody fragment protein

Family Cites Families (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8422238D0 (en) 1984-09-03 1984-10-10 Neuberger M S Chimeric proteins
DK336987D0 (da) 1987-07-01 1987-07-01 Novo Industri As Immobiliseringsmetode
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
GB8719042D0 (en) 1987-08-12 1987-09-16 Parker D Conjugate compounds
US5030570A (en) 1988-06-30 1991-07-09 The Eunice Kennedy Shriver Center For Mental Retardation DNA encoding and method of expressing human monoamine oxidase type A
IL162181A (en) 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
PT92900A (pt) * 1989-01-24 1990-07-31 Sistema de vectores de expressao para a producao de anticorpos monoclonais quimericos
GB8907617D0 (en) 1989-04-05 1989-05-17 Celltech Ltd Drug delivery system
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
GB9109645D0 (en) * 1991-05-03 1991-06-26 Celltech Ltd Recombinant antibodies
US5919452A (en) 1991-03-18 1999-07-06 New York University Methods of treating TNFα-mediated disease using chimeric anti-TNF antibodies
GB9112536D0 (en) 1991-06-11 1991-07-31 Celltech Ltd Chemical compounds
GB9120467D0 (en) 1991-09-26 1991-11-06 Celltech Ltd Anti-hmfg antibodies and process for their production
NO309690B1 (no) 1995-01-23 2001-03-12 Western Atlas Int Inc Detonasjonsanordning av type eksploderende brotråd for bruk med et perforeringsverktöy i en brönn
EP0871641A4 (en) 1995-04-20 2001-09-26 Kennedy Inst Of Rheumatology MULTIPLE ADMINISTRATION OF ANTI-TNF ANTIBODIES
CN103275221B (zh) 1996-02-09 2016-08-17 艾伯维生物技术有限公司 结合人TNFα的人抗体
US5980898A (en) 1996-11-14 1999-11-09 The United States Of America As Represented By The U.S. Army Medical Research & Material Command Adjuvant for transcutaneous immunization
GB9625640D0 (en) * 1996-12-10 1997-01-29 Celltech Therapeutics Ltd Biological products
WO1999009055A2 (en) * 1997-08-18 1999-02-25 Innogenetics N.V. Interferon-gamma-binding molecules for treating septic shock, cachexia, immune diseases and skin disorders
GB9720054D0 (en) * 1997-09-19 1997-11-19 Celltech Therapeutics Ltd Biological products
DK1061954T3 (da) 1998-03-12 2004-10-18 Nektar Therapeutics Al Corp Polyethylenglycolderivater med proximale reaktive grupper
GB9812545D0 (en) * 1998-06-10 1998-08-05 Celltech Therapeutics Ltd Biological products
GB0013810D0 (en) * 2000-06-06 2000-07-26 Celltech Chiroscience Ltd Biological products

Also Published As

Publication number Publication date
HK1148776A1 (en) 2011-09-16
AU783756B2 (en) 2005-12-01
JP2003535591A (ja) 2003-12-02
NO20020554L (no) 2002-04-08
CY1121173T1 (el) 2020-05-29
TR201900227T4 (tr) 2019-02-21
NZ516596A (en) 2004-07-30
ES2230975B2 (es) 2007-04-16
EP2308975A1 (en) 2011-04-13
CA2707766C (en) 2013-05-21
KR20020047097A (ko) 2002-06-21
IL195085A0 (en) 2009-08-03
PE20020292A1 (es) 2002-05-08
GB2366800B (en) 2005-01-19
US20020151682A1 (en) 2002-10-17
DK2230308T3 (da) 2013-05-06
BRPI0106682B8 (pt) 2021-05-25
EP3059314B1 (en) 2018-10-24
DE10192353T1 (de) 2003-05-22
NL300982I9 (nl) 2019-05-06
CZ300737B6 (cs) 2009-07-29
CN1383450A (zh) 2002-12-04
CZ2002837A3 (cs) 2002-05-15
HU230669B1 (hu) 2017-07-28
PT2230308E (pt) 2013-05-03
EP2230308B1 (en) 2013-01-23
ES2403217T3 (es) 2013-05-16
FR10C0015I1 (bg) 2010-04-16
IS6217A (is) 2002-01-03
RU2303604C2 (ru) 2007-07-27
NO339282B1 (no) 2016-11-21
SI2308975T1 (sl) 2016-11-30
GB0013810D0 (en) 2000-07-26
DE122010000027I1 (de) 2010-08-12
IL147992A0 (en) 2002-09-12
PT1287140E (pt) 2010-03-08
EP3059314A1 (en) 2016-08-24
TWI353358B (en) 2011-12-01
ECSP024210A (es) 2002-05-23
CY1109889T1 (el) 2012-01-25
CY2019018I1 (el) 2020-05-29
EP2230308A1 (en) 2010-09-22
IL147992A (en) 2009-06-15
US20060233800A1 (en) 2006-10-19
BG66072B1 (bg) 2011-01-31
DK3059314T3 (en) 2019-02-18
HUP1600016A2 (en) 2002-10-28
US20080269465A1 (en) 2008-10-30
BR0106682A (pt) 2002-05-14
ES2230975A1 (es) 2005-05-01
AR033978A1 (es) 2004-01-21
HUS1700013I1 (hu) 2017-08-28
JP2009171966A (ja) 2009-08-06
NO20020554D0 (no) 2002-02-04
OA12282A (en) 2006-05-11
NO20131316L (no) 2002-04-08
CA2380298C (en) 2010-09-28
PT3059314T (pt) 2019-02-01
LT2308975T (lt) 2016-11-10
CY2010011I1 (el) 2012-01-25
ZA200200097B (en) 2003-01-06
JP4476989B2 (ja) 2010-06-09
FR10C0015I2 (fr) 2011-12-30
HU230561B1 (hu) 2016-12-28
CA2707766A1 (en) 2001-12-13
PL212738B1 (pl) 2012-11-30
DE60140738D1 (de) 2010-01-21
SI1287140T1 (sl) 2010-04-30
BE2010C019I2 (bg) 2020-08-20
PT2308975T (pt) 2016-11-14
US7186820B2 (en) 2007-03-06
AU6051101A (en) 2001-12-17
ATE451460T1 (de) 2009-12-15
PL218516B1 (pl) 2014-12-31
NO20160694A1 (no) 2002-04-08
CA2380298A1 (en) 2001-12-13
AP2092A (en) 2010-02-28
LU91674I2 (fr) 2010-05-31
NO2014026I2 (no) 2018-02-14
MY136603A (en) 2008-10-31
HU230553B1 (hu) 2016-11-28
SK3152002A3 (en) 2002-07-02
ES2337763T3 (es) 2010-04-29
US20030026805A1 (en) 2003-02-06
WO2001094585A1 (en) 2001-12-13
DK1287140T3 (da) 2010-04-19
CY2010011I2 (el) 2012-01-25
ES2707714T3 (es) 2019-04-04
HK1051385A1 (en) 2003-08-01
MXPA01013440A (es) 2003-09-04
PL399351A1 (pl) 2012-12-17
JP2007105043A (ja) 2007-04-26
CN1289671C (zh) 2006-12-13
NO341218B1 (no) 2017-09-11
EP1287140A1 (en) 2003-03-05
SI2230308T1 (sl) 2013-06-28
CY2019018I2 (el) 2020-05-29
IS2808B (is) 2012-09-15
ES2600080T3 (es) 2017-02-07
NO2014026I1 (no) 2014-10-23
US7977464B2 (en) 2011-07-12
PL353960A1 (en) 2003-12-15
DK2308975T3 (da) 2016-10-31
IS3016B (is) 2019-10-15
HUP1600483A2 (bg) 2002-10-28
HUP0202346A3 (en) 2004-11-29
BRPI0106682B1 (pt) 2020-10-13
US7402662B2 (en) 2008-07-22
US7012135B2 (en) 2006-03-14
HUP0202346A2 (en) 2002-10-28
JP5185143B2 (ja) 2013-04-17
CY1114143T1 (el) 2016-07-27
GB2366800A (en) 2002-03-20
LU91674I9 (bg) 2019-01-03
JP4064812B2 (ja) 2008-03-19
SK288343B6 (sk) 2016-04-01
EP2308975B1 (en) 2016-08-10
EP1287140B1 (en) 2009-12-09
TWI316088B (en) 2009-10-21
NL300982I1 (bg) 2019-05-01
GB0128386D0 (en) 2002-01-16
CY1118220T1 (el) 2017-06-28
TW200817430A (en) 2008-04-16
AP2002002690A0 (en) 2002-12-31
NO334808B1 (no) 2014-06-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2308975B1 (en) Antibody molecules having specificity for human tumor necrosis factor alpha, and use thereof