PL212738B1 - Czasteczka przeciwciala, zwiazek, sekwencja DNA, wektor do klonowania lub ekspresji, komórka gospodarza, sposób wytwarzania czasteczki przeciwciala, kompozycja terapeutyczna lub diagnostyczna, zastosowanie czasteczki przeciwciala albo zwiazku - Google Patents

Czasteczka przeciwciala, zwiazek, sekwencja DNA, wektor do klonowania lub ekspresji, komórka gospodarza, sposób wytwarzania czasteczki przeciwciala, kompozycja terapeutyczna lub diagnostyczna, zastosowanie czasteczki przeciwciala albo zwiazku

Info

Publication number
PL212738B1
PL212738B1 PL353960A PL35396001A PL212738B1 PL 212738 B1 PL212738 B1 PL 212738B1 PL 353960 A PL353960 A PL 353960A PL 35396001 A PL35396001 A PL 35396001A PL 212738 B1 PL212738 B1 PL 212738B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
antibody molecule
seq
antibody
dna
heavy chain
Prior art date
Application number
PL353960A
Other languages
English (en)
Other versions
PL353960A1 (pl
Inventor
Diljeet Singh Athwal
Derek Thomas Brown
Andrew Neil Charles Weir
Andrew George Popplewell
Andrew Paul Chapman
David John King
Original Assignee
Ucb Pharma Sa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=9893121&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=PL212738(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Ucb Pharma Sa filed Critical Ucb Pharma Sa
Publication of PL353960A1 publication Critical patent/PL353960A1/pl
Publication of PL212738B1 publication Critical patent/PL212738B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/241—Tumor Necrosis Factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6845—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a cytokine, e.g. growth factors, VEGF, TNF, a lymphokine or an interferon
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6875—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody being a hybrid immunoglobulin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Compression Of Band Width Or Redundancy In Fax (AREA)

Description

Przedmiotem wynalazku jest cząsteczka przeciwciała, związek, sekwencja DNA, wektor do klonowania lub ekspresji, komórka gospodarza, sposób wytwarzania cząsteczki przeciwciała, kompozycja terapeutyczna lub diagnostyczna, zastosowanie cząsteczki przeciwciała albo związku.
Obecny wynalazek dotyczy cząsteczki przeciwciała swoistej wobec determinant antygenowych ludzkiego czynnika martwicy nowotworów alfa (TNF-α). W cząsteczce przeciwciała są dwa łańcuchy ciężkie i dwa łańcuchy lekkie. Każdy łańcuch ciężki i każdy łańcuch lekki ma na swoim końcu N domenę zmienną. Każda domena zmienna składa się z czterech regionów zrębowych (FR) występujących na przemian z regionami determinującymi dopasowanie (CDR). Reszty w domenach zmiennych są zwykle numerowane zgodnie z systemem opracowanym przez Kabat i wsp. System ten jest przedstawiony w Kabat i wsp., 1987, w Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, USA (tu dalej cytowany jako Kabat i wsp. (jak wyżej)). Ten system numeracji jest stosowany w niniejszym opisie, o ile nie zaznaczono inaczej.
Oznaczenie reszt według Kabat nie zawsze odpowiada bezpośrednio liniowej numeracji reszt aminokwasowych. Rzeczywista liniowa sekwencja aminokwasowa może zawierać mniej albo dodatkowe aminokwasy w stosunku do dokładnej numeracji Kabat, odpowiadające skróceniu albo wstawieniu do składnika strukturalnego, zrębowego lub CDR, do podstawowej struktury domeny zmiennej. Prawidłową numerację reszt według Kabat można ustalić dla danego przeciwciała przez dopasowanie reszt homologicznych w sekwencji przeciwciała i sekwencji o standardowej numeracji według Kabat.
CDR domeny zmiennej łańcucha ciężkiego są zlokalizowane w pozycjach reszt 31-35 (CDRH1), reszt 50-65 (CDRH2) i reszt 95-102 (CDRH3) według numeracji Kabat.
CDR domeny zmiennej łańcucha lekkiego są zlokalizowane w pozycjach reszt 24-34 (CDRL1), reszt 50-56 (CDRL2) i reszt 89-97 (CDRL3) według numeracji Kabat.
Konstrukcja przeciwciał z przeszczepionymi CDR jest opisana w europejskim zgłoszeniu patentowym EP-A-0239400, w którym ujawniono proces, w którym CDR z monoklonalnych przeciwciał mysich są przeszczepiane do regionów zrębowych domen zmiennych immunoglobuliny ludzkiej przez ukierunkowaną mutagenezę z zastosowaniem długich oligonukleotydów. CDR określają specyficzność wiązania antygenu i są stosunkowo krótkimi sekwencjami peptydowymi znajdującymi się w regionach zrębowych domen zmiennych.
Najwcześniejsze prace nad humanizowaniem monoklonalnych przeciwciał przez przeszczepienie CDR przeprowadzono na przeciwciałach monoklonalnych rozpoznających syntetyczne antygeny, takie jak NP. Jednakże przykłady, w których mysie monoklonalne przeciwciało rozpoznające lizozym i szczurze monoklonalne przeciwciało rozpoznające antygen na ludzkich komórkach T były humanizowane przez przeszczepienie CDR, zostały opisane przez Verhoeyen i wsp. (Science, 239, 1534- 1536, 1988) i Riechmann i wsp. (Nature, 332, 323-324, 1988), odpowiednio.
Riechmann i wsp. stwierdzili, że przeniesienie samych CDR (jak określone przez Kabat (Kabat i wsp. (jak wyżej) i Wu i wsp., J. Exp. Med., 132, 211-250, 1970)) nie wystarczyło dla dostarczenia zadawalającej aktywności wiązania antygenu przez produkt z przeszczepionym CDR. Stwierdzono, że liczba reszt zrębowych, musi być zmieniona tak, aby odpowiadały resztom w donorowym regionie zrębowym. Proponowane kryteria wyboru reszt zrębowych, które trzeba zmienić, są opisane w międzynarodowym zgłoszeniu patentowym WO 90/07861.
Wiele prac przeglądowych omawiających przeciwciała z przeszczepionymi CDR, zostało opublikowanych, w tym Vaughan i wsp. (Nature Biotechnology, 16, 535-539, 1998).
TNF-α jest pro-zapalną cytokiną, która jest uwalniana przez komórki układu odpornościowego i z nimi oddziałuje. Zatem TNFa jest uwalniany przez makrofagi, które zostały zaktywowane przez lipopolisacharydy (LPS) gram ujemnych bakterii. Jako taki TNFa wydaje się być wewnętrznym mediatorem o kluczowym znaczeniu, uczestniczącym w rozwoju i patogenezie szoku endotoksycznego związanego z posocznicą bakteryjną. Wykazano również, że poziom TNF-α zwiększa się w wielu ludzkich chorobach, w tym chorobach przewlekłych, takich jak reumatoidalne zapalenie stawów, choroba Crohna, wrzodziejące zapalenie okrężnicy i stwardnienie rozsiane. Myszy transgeniczne pod względem ludzkiego TNFa wytwarzają wysokie poziomy TNFa konstytutywnie i rozwija się u nich spontaniczne, wyniszczające zapalenie wielostanowe przypominające reumatoidalne zapalenie stawów (Kaffer i wsp., EMBO J. 10, 4025-4031, 1991). TNF-α określa się zatem jako cytokinę pro-zapalną.
Przeciwciała monoklonalne przeciw TNF-α zostały opisane w stanie techniki. Meager i wsp., (Hybridoma, 6:, 305-311, 1987) opisują mysie monoklonalne przeciwciała przeciw zrekombinowanemu
PL 212 738 B1
TNF-α. Fendly i wsp., (Hybridoma, 6, 359-370, 1987) opisują zastosowanie mysich monoklonalnych przeciwciał przeciw zrekombinowanemu TNFa w określaniu neutralizujących epitopów na TNF. Shimamoto i wsp., (Immunology Letters, 17, 311-318, 1988) opisują zastosowanie mysich monoklonalnych przeciwciał przeciw ΤΝΡ-γ i ich zastosowanie w zapobieganiu szokowi endotoksycznemu u myszy. Ponadto, w międzynarodowym zgłoszeniu patentowym WO 92/11383 ujawnione są zrekombinowane przeciwciała, w tym przeciwciała z przeszczepionymi CDR, specyficzne wobec TNFa. Rankin i wsp., (British J. Rheumatology, 34, 334-342, 1995) opisują zastosowanie takich przeciwciał z przeszczepionymi CDR w leczeniu reumatoidalnego zapalenia stawów. W US-A-5 919 452 ujawniono chimerowe przeciwciała anty-TNF i ich zastosowanie w leczeniu patologii związanych z obecnością TNF.
Zaproponowano przeciwciała wobec TNFa do profilaktyki i leczenia szoku endotoksycznego (Beutler i wsp., Science, 234, 470-474, 1985). Bodmer i wsp., (Critical Care Medicine, 21, S441-S446, 1993) oraz Wherry i wsp., (Critical Care Medicine, 21, S436S440, 1993) omawiają potencjał terapeutyczny przeciwciał anty-TNF a w leczeniu szoku posocznicowego. Zastosowanie przeciwciał anty-TNFα w leczeniu szoku posocznicowego jest również omawiane przez Kirschenbaum i wsp., (Critical Care Medicine, 26, 1625-1626, 1998). Zapalenie stawów indukowane kolagenem można skutecznie leczyć stosując przeciwciała monoklonalne anty-TNFa (Williams i wsp. (PNAS-USA, 89, 9784-9788, 1992)).
Podwyższone poziomy TNF-α znajdują się zarówno w płynie maziówkowym, jak i krwi obwodowej pacjentów cierpiących na reumatoidalne zapalenie stawów. Czynniki blokujące TNF-a podawane pacjentom cierpiącym na reumatoidalne zapalenie stawów zmniejszają zapalenie, łagodzą objawy i opóźniają uszkodzenie stawów (McKown i wsp. (Arthritis Rheum., 42, 1204-1208, 1999).
Zastosowanie przeciwciał anty-TNFa w leczeniu reumatoidalnego zapalenia stawów i choroby Crohna jest omawiane w Feldman i wsp., (Transplantation Proceedings, 30, 4126-4127, 1998), Adorini i wsp., (Trends in Immunology Today, 18, 209-211, 1997) oraz w Feldman i wsp., (Advances in Immunology, 64, 283-350, 1997). Przeciwciała wobec TNFa stosowane w takim leczeniu są na ogół przeciwciałami chimerowymi, takimi jak te opisane w US-A-5919452.
Obecnie na dwa produkty blokujące TNFa do leczenia reumatoidalnego zapalenia stawów została udzielona licencja.
Pierwszy o nazwie etanercept, jest sprzedawany przez Immunex Corporation jako EnbrelTM. Jest to zrekombinowane białko fuzyjne zawierające dwie rozpuszczalne domeny p75 receptora TNF połączone z częścią Fc ludzkiej immunoglobuliny. Drugi, o nazwie infliksimab, jest sprzedawany przez Centocor Corporation jako Remicade™. Jest to chimerowe przeciwciało mające mysie domeny zmienne anty-TNFa i ludzkie domeny stałe IgG1.
Znane ze stanu techniki zrekombinowane cząsteczki przeciwciała anty-TNF-α mają na ogół zmniejszone powinowactwo wobec TNFa w porównaniu z przeciwciałami, z których pochodzą regiony zmienne lub CDR, na ogół muszą być wytwarzane w komórkach ssaczych, a ich wytwarzanie jest kosztowne. Przeciwciała anty-TNF-α ze stanu techniki są opisane w Stephens i wsp., (Immunology, 85; 668674, 1995), GB-A-2 246 570 i GB-A-2 297 145.
Istnieje zapotrzebowanie na cząsteczkę przeciwciała do leczenia przewlekłych chorób zapalnych, która może być stosowana wielokrotnie i wytwarzana łatwo i wydajnie. Istnieje również zapotrzebowanie na cząsteczkę przeciwciała, które ma wysokie powinowactwo wobec TNFa i niską immunogenność u ludzi.
Niniejszy wynalazek dotyczy cząsteczki przeciwciała swoistego wobec ludzkiego TNF-α zawierającej region zmienny łańcucha lekkiego podany w SEK NR ID: 8 (hTNF40-gL1) i region zmienny łańcucha ciężkiego podany w SEK NR ID: 11 (gh3hTNF40.4).
Korzystnie cząsteczka przeciwciała zawiera łańcuch lekki obejmujący sekwencję podaną w SEK NR ID: 113 i łańcuch ciężki obejmujący sekwencję podaną w SEK NR ID: 115.
Korzystna jest również cząsteczka, która zawiera łańcuch lekki składający się z sekwencji podanej w SEK NR ID: 113 i łańcuch ciężki składający się z sekwencji podanej w SEK NR ID: 115.
Cząsteczka przeciwciała według wynalazku korzystnie zawiera co najmniej jedną ludzką domenę stałą, która korzystnie jest IgG, a bardziej korzystnie IgG2 lub IgG4
Korzystnie cząsteczka przeciwciała, która zawiera wskazany powyżej łańcuch lekki i ciężki oraz regiony zmienne łańcucha lekkiego i ciężkiego jest fragmentem Fab, zmodyfikowanym fragmentem
Fab, fragmentem Fab', F(ab')2 lub fragmentem Fv jednołańcuchowego przeciwciała lub fragmentem Fv pojedynczego łańcucha, bardziej korzystnie fragmentem Fab zawierającym łańcuch ciężki o sekwencji przedstawionej w SEK NR ID: 111 i łańcuch lekki o sekwencji przedstawionej w SEK NR ID: 113, a jesz4
PL 212 738 B1 cze bardziej korzystnie jest zmodyfikowanym fragmentem Fab, o jednym albo większej liczbie aminokwasów na C-końcu łańcucha ciężkiego, które umożliwiają przyłączenie cząsteczki efektorowej albo reporterowej.
Korzystnie dodatkowe aminokwasy w tym fragmencie Fab tworzą zmodyfikowany region zawiasowy zawierający jedną albo dwie reszty cysteinowe, do których cząsteczka efektorowa albo reporterowa może być przyłączona.
Korzystnie cząsteczka przeciwciała ma w tym zmodyfikowanym regionie zawiasowym kowalencyjnie związaną jedną grupę tiolową lub maleimidową, a bardziej korzystnie cząsteczka ma kowalencyjnie związaną lizynę z grupą maleimidową. Jeszcze korzystniej do każdej grupy aminowej lizyny jest przyłączony polimer o ciężarze cząsteczkowym 500 do 50 000 Da, którym jest polimer o ciężarze cząsteczkowym około 20 000 Da.
Niniejszy wynalazek dotyczy także związku zawierającego cząsteczkę przeciwciała według wynalazku, która jest zmodyfikowanym fragmentem Fab, o jednym albo większej liczbie aminokwasów na końcu łańcucha ciężkiego, który ma kowalencyjnie przyłączoną cząsteczkę efektorową albo reporterową do aminokwasu na końcu C albo po stronie końca C łańcucha ciężkiego.
Korzystnie związek zawiera cząsteczkę efektorową, która korzystnie stanowi jeden albo większą liczbę polimerów, a większa liczba polimerów, a jeden lub większą liczbę polimerów stanowi ewentualnie podstawiony polimer polialkilenowy, polialkenylenowy lub polioksyalkilenowy o łańcuchu prostym albo rozgałęzionym albo polisacharyd o łańcuchu rozgałęzionym albo nierozgałęzionym.
Korzystnie jeden albo większą liczbą polimerów stanowi metoksypoli(glikol etylenowy).
Korzystnie związek ma do jednej z reszt cysteinowych na końcu C łańcucha ciężkiego przyłączoną grupę lizylomaleimidową, w której z każdą grupą aminową reszty lizylowej jest kowalencyjnie związana reszta metoksypoli(glikolu etylenowego) o ciężarze cząsteczkowym około 20000 Da.
W zakresie wynalazku wchodzi sekwencja DNA kodująca ciężki i/lub lekki łańcuch cząsteczki przeciwciała według wynalazku.
Korzystnie sekwencja obejmuje sekwencję przedstawioną w SEK NR ID: 8, 11, 110, 112 lub 114.
W zakresie wynalazku wchodzi także wektor do klonowania lub ekspresji zawierający określoną powyżej sekwencję DNA według wynalazku.
Korzystnie wektorem ekspresyjnym jest E. coli.
Wynalazek dotyczy też komórki gospodarza transformowanej wektorem według wynalazku. Cząsteczka przeciwciała opisana w wynalazku o specyficzności wobec ludzkiego TNF-α, zawiera łańcuch ciężki, w którym domena zmienna zawiera CDR (jak określony przez Kabat i wsp., (jak wyżej) o sekwencji podanej jako H1 na Fig. 3 (SEK NR ID: 1) dla CDRH1, jako H2' na Fig. 3 (SEK NR ID: 2) lub jako H2 na Fig. 3 (SEK NR ID: 7) dla CDRH2 albo jako H3 na Fig. 3 (SEK NR ID: 3) dla CDRH3. Ta cząsteczka przeciwciała opisana w wynalazku zawiera co najmniej jeden CDR wybrany spośród H1, H2' lub H2 i H3 (SEK NR ID: 1; SEK NR ID: 2 lub SEK NR ID: 7 i SEK NR ID: 3) dla domeny zmiennej łańcucha ciężkiego. Korzystnie jednak cząsteczka przeciwciała zawiera co najmniej dwa, a korzystniej wszystkie trzy CDR w domenie zmiennej łańcucha ciężkiego.
PL 212 738 B1
Cząsteczka przeciwciała opisana w wynalazku o specyficzności wobec ludzkiego TNF-α zawiera łańcuch lekki, w którym domena zmienna zawiera CDR (jak określony przez Kabat i wsp., (powyżej) o sekwencji podanej jako L1 na Fig. 3 (SEK NR ID: 4) dla CDRL1, L2 na Fig. 3 (SEK NR ID: 5) dla CDRL2 lub L3 na Fig. 3 (SEK NR ID: 6) dla CDRL3.
Cząsteczka przeciwciała opisana w wynalazku zawiera co najmniej jeden CDR wybrany spośród L1, L2 i L3 (SEK NR ID: 4 do SEK NR ID: 6) dla domeny zmiennej łańcucha lekkiego. Korzystnie, jednak cząsteczka przeciwciała zawiera co najmniej dwa, a korzystniej wszystkie trzy CDR w domenie zmiennej łańcucha lekkiego.
Korzystnie, cząsteczki przeciwciała opisane w wynalazku zawierają odpowiedni łańcuch lekki komplementarny do łańcucha lekkiego opisanego powyżej albo łańcuch ciężki komplementarny do łańcucha ciężkiego opisanego powyżej.
Korzystnie cząsteczka przeciwciała opisana w wynalazku zawiera łańcuch ciężki, w którym domena zmienna zawiera CDR (jak określony przez Kabat i wsp., (powyżej) o sekwencji podanej jako H1 na Fig. 3 (SEK NR ID: 1) dla CDRH1, jako H2' lub H2 na Fig. 3 (SEK NR ID: 2 lub SEK NR ID: 1) dla CDRH2 lub jako H3 na Fig. 3 (SEK NR ID: 3) dla CDRH3 i łańcuch lekki, w którym domena zmienna zawiera CDR (określony przez Kabat i wsp., (jak wyżej) o sekwencji podanej jako L1 na Fig. 3 (SEK NR ID: 4) dla CDRL1, jako L2 na Fig. 3 (SEK NR ID: 5) dla CDRL2 lub jako L3 na Fig. 3 (SEK NR ID: 6) dla CDRL3.
CDR podane w SEK NR ID: 1 i 3 do 7 i na Fig. 3 dotyczącej powyższych CDR pochodzą z mysiego monoklonalnego przeciwciała hTNF40. Jednak SEK NR ID: 2 stanowi hybrydowy CDR. Hybrydowy CDR zawiera części łańcucha ciężkiego CDR2 z mysiego monoklonalnego przeciwciała hTNF40 (SEK NR ID: 7) i część CDR2 łańcucha ciężkiego z sekwencji ludzkiego regionu V grupy 3 linii zarodkowej.
Pełne sekwencje domen zmiennych mysiego przeciwciała hTNF40 są pokazane na Fig. 6 (łańcuch lekki) (SEK NR ID: 99) i Fig. 7 (łańcuch ciężki) (SEK NR iD: 100). To mysie przeciwciało jest określane poniżej jako przeciwciało donorowe.
Uzyskano mysie monoklonalne przeciwciało hTNF40 mające sekwencje domen zmiennych łańcucha lekkiego i ciężkiego pokazane na Fig. 6 (SEK NR ID: 99) i Fig. 7 (SEK NR ID: 100), odpowiednio. Regionem stałym łańcucha lekkiego hTNF40 jest kappa, a regionem stałym łańcucha ciężkiego jest IgG2a.
Innym przeciwciałem jest cząsteczka chimerowego mysiego/ludzkiego przeciwciała, określana tu jako cząsteczka chimerowego przeciwciała hTNF40. Cząsteczka chimerowego przeciwciała zawiera domeny zmienne mysiego monoklonalnego przeciwciała hTNF40 (SEK NR ID: 99 i 100) i ludzkie domeny stałe. Korzystnie chimerowa cząsteczka przeciwciała hTNF40 zawiera ludzką domenę C kappa (Hieter i wsp., Cell, 22, 197-207, 1980; nr dostępu do Genebank JO0241) w łańcuchu lekkim i ludzkie domeny gamma 4 (Flanagan i wsp., Nature, 200, 709-713, 1982) w łańcuchu ciężkim.
Przeciwciało opisane w wynalazku może zawierać łańcuch ciężki i łańcuch lekki z przeszczepionymi CDR. Stosowany tu termin cząsteczka przeciwciała z przeszczepionymi CDR dotyczy cząsteczki przeciwciała, w której łańcuch ciężki i/lub lekki zawierają jeden albo więcej CDR (w tym jeżeli trzeba hybrydowy CDR) z przeciwciała donorowego (np. mysiego przeciwciała monoklonalnego) wszczepione do zmiennego regionu zrębowego łańcucha ciężkiego i/lub lekkiego przeciwciała akceptorowego (np. przeciwciała ludzkiego).
Korzystnie, takie przeciwciało z przeszczepionym CDR ma domenę zmienną zawierającą ludzkie akceptorowe regiony zrębowe jak również jeden albo więcej opisanych powyżej donorowych CDR.
Przy przeszczepianiu CDR, można zastosować dowolną odpowiednią sekwencję akceptorowego zmiennego regionu zrębowego w odniesieniu do klasy/typu przeciwciała donorowego, z którego pochodzą CDR, w tym, regiony zrębowe mysie, naczelnych i ludzkie. Przykładami ludzkich regionów zrębowych, które można zastosować w niniejszym wynalazku są KOL, NEWM, REI, EU, TUR, TEI, LAY i POM (Kabat i wsp. (powyżej)). Na przykład, KOL i NEWM można zastosować do łańcucha ciężkiego, REI można zastosować do łańcucha lekkiego, a EU, LAY i POM można zastosować zarówno do łańcucha ciężkiego, jak i łańcucha lekkiego. Korzystnymi regionami zrębowymi dla łańcucha lekkiego są ludzkie regiony zrębowe grupy 1 pokazane na Fig. 1 (SEK NR ID: 83, 85, 87 i 89). Korzystnymi regionami zrębowymi dla łańcucha ciężkiego są ludzkie regiony zrębowe grupy 1 i 3 pokazane na Fig. 2 (SEK NR ID: 91, 93, 95 i 97 oraz SEK NR ID: 106, 107, 108 i 109), odpowiednio.
W cząsteczce przeciwciała z przeszczepionymi CDR, korzystne jest zastosowanie takiego przeciwciała akceptorowego, które ma łańcuchy homologiczne z łańcuchami przeciwciała donorowego. Akceptorowe łańcuchy lekkie i ciężkie nie muszą koniecznie pochodzić z tego samego przeciwciała i mogą, w razie potrzeby, zawierać łańcuchy złożone, mające regiony zrębowe pochodzące z różnych łańcuchów.
PL 212 738 B1
Ponadto w cząsteczce przeciwciała z przeszczepionymi CDR, regiony zrębowe nie muszą mieć dokładnie takiej samej sekwencji, jak te w przeciwciałach akceptorowych. Na przykład, reszty zwykle niewystępujące można zmienić na reszty występujące częściej w tej klasie albo typie łańcucha akceptorowego. Alternatywnie, można zmienić wybrane reszty w akceptorowych regionach zrębowych, tak aby odpowiadały resztom znajdowanym w tej samej pozycji w przeciwciele donorowym. Takie zmiany powinny być ograniczone do niezbędnego minimum koniecznego dla odzyskania powinowactwa przeciwciała donorowego. Protokół wyboru reszt w akceptorowych regionach zrębowych, które należałoby zmienić, jest przedstawiony w WO 91/09967.
Korzystnie, w cząsteczce przeciwciała z przeszczepionymi CDR, jeżeli akceptorowy łańcuch ciężki ma ludzkie regiony zrębowe grupy 1 (pokazane na Fig. 2) (SEK NR ID: 91, 93, 95 i 97), to akceptorowe regiony zrębowe łańcucha ciężkiego zawierają oprócz jednego albo więcej donorowych CDR, donorowe reszty w pozycjach 28, 69 i 71 (według Kabat i wsp. (jak wyżej)).
Alternatywnie, jeżeli akceptorowy łańcuch ciężki ma regiony zrębowe grupy 1, wtedy akceptorowe regiony zrębowe łańcucha ciężkiego zawierają oprócz jednego albo więcej donorowych CDR, donorowe reszty w pozycjach 28, 38, 46, 67, 69 i 71 (według Kabat i wsp. (powyżej)).
Korzystnie, w cząsteczce przeciwciała z przeszczepionym CDR, jeżeli akceptorowy łańcuch ciężki ma ludzkie regiony zrębowe grupy 3 (pokazane na Fig. 2) (SEK NR ID: 106, 107, 108 i 109), to akceptorowe regiony zrębowe łańcucha ciężkiego zawierają oprócz jednego albo więcej donorowych CDR, reszty donorowe w pozycjach 27, 28, 30, 48, 49, 69, 71, 73, 76 i 78 (według Kabat i wsp. (powyżej)).
Korzystnie, w przeciwciele z przeszczepionymi CDR, jeżeli akceptorowy łańcuch lekki ma ludzkie regiony zrębowe grupy 1 (pokazane na Fig. 1) (SEK NR ID: 83, 85, 87 i 89), to akceptorowe regiony zrębowe łańcucha lekkiego zawierają reszty donorowe w pozycjach 46 i 60 (według Kabat i wsp. (jak wyżej)).
Resztami donorowymi są reszty z przeciwciała donorowego, tj. przeciwciała, z którego CDR wyjściowe pochodziły.
Cząsteczka przeciwciała według niniejszego wynalazku może obejmować: cząsteczkę całego przeciwciała, mającego łańcuchy ciężkie i lekkie pełnej długości; jego fragment, taki jak Fab, zmodyfikowany fragment Fab, Fab', F(ab')2 lub Fv; monomer albo dimer łańcucha lekkiego lub łańcucha ciężkiego, przeciwciało jednołańcuchowe, np. pojedynczy łańcuch Fv, w którym domeny zmienne łańcucha ciężkiego i lekkiego są połączone przez łącznik peptydowy. Podobnie, regiony zmienne łańcucha ciężkiego i lekkiego można łączyć, jeśli trzeba, z innymi domenami przeciwciała.
Korzystnie, cząsteczką przeciwciała według niniejszego wynalazku jest fragment Fab. Korzystnie, fragment Fab ma łańcuch ciężki o sekwencji podanej jako SEK NR ID: 111, a łańcuch lekki o sekwencji podanej jako SEK NR ID: 113. Korzystnie, sekwencje aminokwasowe podane w SEK NR ID: 111 i SEK NR ID: 113 były kodowane przez sekwencje nukleotydowe podane w SEK NR ID: 110 i SEK NR ID: 112, odpowiednio.
Alternatywnie, korzystnie, cząsteczką przeciwciała według niniejszego wynalazku jest zmodyfikowany fragment Fab, gdzie modyfikacją jest dodanie na końcu C jego łańcucha ciężkiego jednego albo więcej aminokwasów dla umożliwienia przyłączenia cząsteczki efektorowej albo reporterowej.
Korzystnie, dodatkowe aminokwasy tworzą zmodyfikowany region zawiasowy zawierający jedną albo więcej reszt cysteinowych, do których cząsteczka efektorowa albo reporterowa może być dołączona. Korzystnie, taki zmodyfikowany fragment Fab ma łańcuch ciężki o sekwencji podanej jako SEK NR ID: 115 i łańcuch lekki o sekwencji podanej jako SEK NR ID: 113. Korzystnie, sekwencja aminokwasowa podana w SEK NR ID: 115 jest zakodowana przez sekwencję nukleotydową podaną w SEK NR ID: 114.
Korzystną grupą efektorową jest cząsteczka polimeru, która może być przyłączona do zmodyfikowanego fragmentu Fab w celu zwiększenia jego okresu półtrwania in vivo.
Cząsteczką polimeru może być na ogół polimer syntetyczny albo polimer występujący naturalnie, na przykład, ewentualnie podstawiony polimer polialkilenowy, polialkenylenowy lub polioksyalkilenowy o łańcuchu prostym albo rozgałęzionym, Iub homo- lub hetero-polisacharyd.
Konkretne ewentualne podstawniki, które mogą być obecne we wspomnianych powyżej polimerach syntetycznych, obejmują jeden albo więcej grup hydroksylowych, metylowych lub metoksylowych. Konkretne przykłady polimerów syntetycznych obejmują ewentualnie podstawione poli(etylenoglikol), poli(propylenoglikol), poli(alkohol winylowy) o łańcuchu prostym albo rozgałęzionym albo ich pochodne, a zwłaszcza ewentualnie podstawiony poli(etylenoglikol), taki jak metoksypoli(etylenoglikol) lub jego pochodne. Konkretne, występujące naturalnie polimery obejmują laktozę, amylozę, dekstran, glikogen lub ich pochodne. Stosowany tu termin pochodne ma obejmować reaktywne pochodne, na przykład, grupy reaktywne wybiórczo reagujące z tiolem takie jak maleimidy i temu podobne. Grupy reaktywne można
PL 212 738 B1 łączyć bezpośrednio z polimerem albo przez odcinek łącznikowy. Jest to zrozumiałe, że reszty takiej grupy będą w niektórych przypadkach tworzyć część produktu jako grupy łącznikowe między fragmentem przeciwciała i polimerem.
Wielkość polimeru może być zróżnicowana zgodnie z potrzebami, ale na ogół polimer będzie miał średni ciężar cząsteczkowy w zakresie od 500 Da do 50000 Da, korzystnie od 5000 do 40000 Da, a najkorzystniej od 25000 do 40000 Da. W szczególności, konkretną wielkość polimeru można wybrać na podstawie zamierzonego zastosowania produktu. Zatem, na przykład, gdy produkt jest przeznaczony do opuszczenia układu krwionośnego i przeniknięcia do tkanki, na przykład, do zastosowania w leczeniu nowotworu, może być korzystne zastosowanie polimeru o małym ciężarze cząsteczkowym, na przykład, mającego ciężar cząsteczkowy około 5000 Da. Do zastosowań, w których produkt pozostaje w krwiobiegu, może być korzystne zastosowanie polimeru o wyższym ciężarze cząsteczkowym, na przykład mającego ciężar cząsteczkowy około 25000 Da do 40000 Da.
Szczególnie korzystne polimery obejmują polimer polialkilenowy, taki jak poli(etylenoglikol), a zwłaszcza metoksypoli(etylenoglikol) lub jego pochodne, a zwłaszcza o ciężarze cząsteczkowym w zakresie od około 25000 Da do około 40000 Da.
Każda cząsteczka polimeru przyłączona do zmodyfikowanego fragmentu przeciwciała może być połączona kowalencyjnie z atomem siarki albo resztą cysteinową znajdującą się we fragmencie. Połączenie kowalencyjne będzie na ogół wiązaniem disiarczkowym, albo, w szczególności, wiązaniem siarka-węgiel.
Tam, gdzie to pożądane, fragment przeciwciała może mieć przyłączoną jedną albo więcej cząsteczek efektorowych albo reporterowych. Cząsteczki efektorowe albo reporterowe mogą być przyłączone do fragmentu przeciwciała przez dowolny dostępny łańcuch boczny aminokwasu albo końcową grupę czynną aminokwasu umiejscowioną we fragmencie, na przykład wolną grupę aminową, iminową, hydroksylową lub karboksylową.
Jako materiał wyjściowy przy wytwarzaniu zmodyfikowanych polimerem fragmentów przeciwciała, jak opisane powyżej, można zastosować aktywowany polimer. Aktywowanym polimerem może być dowolny polimer zawierający reaktywną grupę wobec tiolu, taką jak kwas lub ester α-halogenokarboksylowy, np. jodoacetamid, imid, np. maleimid, grupa winylosulfonowa lub disulfid. Takie materiały wyjściowe można kupić (na przykład z Shearwater Polymers Inc., Huntsville, AL, USA) albo wytworzyć z handlowo dostępnych materiałów wyjściowych z zastosowaniem konwencjonalnych procedur chemicznych.
Jako publikacje dotyczące przyłączania reszt poli(etylenoglikolu) (PEG), powołuje się Poly(ethyloeneglycol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications, 1992, J. Milton Harris (wyd.), Plenum Press, New York, Poly(ethyleneglycol) Chemistry and Biological Applications, 1997, J. Milton Harris i S. Zalipsky (wyd.), American Chemical Society; Washington DC and Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences, 1998, M. Aslam and A. Dent, Grove Publishers, New York.
Tam, gdzie jest to wskazane w celu otrzymania fragmentu przeciwciała połączonego z cząsteczką efektorową albo reporterową, można wytworzyć takie połączenie z zastosowaniem standardowych procedur chemicznych albo rekombinowania DNA, w których fragment przeciwciała jest łączony bądź bezpośrednio, bądź za pośrednictwem czynnika łączącego z cząsteczką efektorową albo reporterową przed lub po reakcji z aktywowanym polimerem, odpowiednio. Konkretne procedury chemiczne obejmują, na przykład, te opisane w WO 93/62331, WO 92/22583, WO 90,195 i WO 89/1476. Alternatywnie, tam gdzie cząsteczką efektorową albo reporterową jest białko albo polipeptyd, połączenie można uzyskać stosując procedury rekombinowania DNA, na przykład, jak opisane w WO 86/01533 i EP-A 0392745.
Korzystnie, zmodyfikowany fragment Fab jest PEGylowany (tj. ma przyłączony kowalencyjnie PEG (poli(etylenoglikol) ) według metody ujawnionej w EP-A-0948544. Korzystnie, przeciwciało według niniejszego wynalazku jest PEGylowanym zmodyfikowanym fragmentem Fab, jak pokazany na Fig. 13. Jak pokazano na Fig. 13, zmodyfikowany fragment Fab ma grupę maleimidową połączoną kowalencyjnie z pojedynczą grupą tiolową w zmodyfikowanym regionie zawiasowym. Reszta lizynowa jest połączona kowalencyjnie z grupą maleimidową. Do każdej grupy aminowej w reszcie lizynowej przyłączony jest polimer metoksypoli(etylenoglikol)owy o ciężarze cząsteczkowym około 20000 Da. Całkowity ciężar cząsteczkowy całej cząsteczki efektorowej wynosi zatem około 40000 Da.
Korzystnie, w związku pokazanym na Fig. 13 łańcuch ciężki części przeciwciała ma sekwencję podaną jako SEK NR ID: 115, a łańcuch lekki ma sekwencję podaną w SEK NR ID: 113. Związek ten określa się tu jako CDP870.
PL 212 738 B1
Domeny regionu stałego cząsteczki przeciwciała według niniejszego wynalazku, jeżeli są tam obecne, można wybrać biorąc pod uwagę proponowane funkcje cząsteczki przeciwciała, a w szczególności funkcje efektorowe, które mogą być wymagane. Na przykład, domenami regionu stałego mogą być ludzkie domeny IgA, IgD, IgB, IgG lub IgM. Konkretnie, można zastosować ludzkie domeny regionu stałego IgG, zwłaszcza izotypy IgG1 i IgG3, gdy cząsteczka przeciwciała jest przeznaczona do zastosowań terapeutycznych i wymagane są funkcje efektorowe przeciwciała. Alternatywnie, gdy cząsteczka przeciwciała jest przeznaczona do celów terapeutycznych, a funkcje efektorowe przeciwciała nie są wymagane, np. w celu prostego blokowania aktywności TNFa, można zastosować izotypy IgG2 i IgG4.
Ponadto, cząsteczka przeciwciała według niniejszego wynalazku może mieć przyłączoną jedną albo więcej cząsteczek efektorowych albo reporterowych. Na przykład, może mieć przyłączone przez kowalencyjną strukturę mostka: makrocykl w celu chelatowania atomu jonu metalu ciężkiego albo toksynę, taką jak rycyna. Alternatywnie można zastosować procedury technologii rekombinowania DNA w celu wytworzenia cząsteczki przeciwciała, w której fragment Fc (CH2, CH3 i domeny zawiasowe) oraz domeny CH2 i CH3 lub domena CH3 z całkowitej cząsteczki immunoglobuliny została(-y) zastąpiona albo ma przyłączone do niej przez wiązanie peptydowe funkcjonalne białko nieimmunoglobulinowe, takie jak enzym albo cząsteczka toksyny.
Korzystnie, cząsteczka przeciwciała według niniejszego wynalazku ma powinowactwo wiązania co najmniej 0,85 x 10-10 M, korzystniej co najmniej 0,75 x 10-10 M, a najkorzystniej co najmniej 0,5 x 10-10 M. (Warto zauważyć, że korzystna humanizowana cząsteczka przeciwciała według wynalazku, jak opisana poniżej, ma powinowactwo około 0,5 x 10-10 M, które jest lepsze niż powinowactwo mysiego monoklonalnego przeciwciała z którego pochodzi. Mysie przeciwciało ma powinowactwo około
0,85 x 10-10 M).
Można uzyskać warianty cząsteczki przeciwciała według niniejszego wynalazku, które mają zwiększone powinowactwo wobec TNFa. Takie warianty można otrzymać przy zastosowaniu licznych protokołów dojrzewania powinowactwa, w tym mutowanie CDR (Yang i wsp., J. Mol. Biol. 254, 392-403, 1995), zamianę łańcuchów (Marks i wsp., Biotechnology, 10, 779-783, 1992), zastosowanie szczepów mutatorowych E. coli (Low i wsp., J. Mol. Biol. 250, 359-368, 1996), zamianę DNA (Patten i wsp., Curr. Opin. Biotechnol., 8, 724-733, 1997), prezentowanie na fagach (Thompson i wsp., J. Mol. Biol. 256, 7788, 1996) i płciowy PCR (Crarneri i wsp., Nature, 391, 288-291, 1998). Vaughan i wsp. (jak wyżej) omawiają te metody dojrzewania powinowactwa.
Sekwencja DNA według niniejszego wynalazku może obejmować DNA syntetyczny, na przykład wytworzony przez obróbkę chemiczną, cDNA, DNA genomowy albo dowolną ich kombinację.
Niniejszy wynalazek dotyczy również wektora do klonowania lub ekspresji zawierającego sekwencję DNA według niniejszego wynalazku.
Korzystnie wektor do klonowania lub ekspresji zawiera dwie sekwencje DNA, kodujące lekki i ciężki łańcuch cząsteczki przeciwciała według niniejszego wynalazku, odpowiednio.
Korzystnie wektor do ekspresji jest wektorem ekspresyjnym E. coli.
Korzystnie wektorem do ekspresji jest pTTO(CDP870) jak pokazano schematycznie na Fig. 22.
Drugim przykładem wektora opisanego w wynalazku jest wektor pDNAbEng-G1 jak pokazano na Fig. 19.
Niniejszy wynalazek dotyczy również komórki gospodarza transformowanej wektorem według wynalazku.
Ogólne metody, z zastosowaniem których można skonstruować wektory, sposoby transfekcji i metody hodowli są dobrze znane specjalistom w tej dziedzinie. W tym przypadku odnośnikiem jest Current Protocols in Molecular Biology, 1999, F. M. Ausubel (wyd.), Wiley Interscience, New York oraz Maniatis Manual wydany przez Cold Spring Harbor Publishing.
Sekwencje DNA, które kodują cząsteczkę przeciwciała według niniejszego wynalazku, można otrzymać metodami dobrze znanymi specjalistom w tej dziedzinie. Przykładowo, można zsyntetyzować żądane sekwencje DNA kodujące część albo całe ciężkie i lekkie łańcuchy przeciwciała z określonych sekwencji DNA albo na podstawie odpowiadających im sekwencji aminokwasowych.
DNA kodujące akceptorowe sekwencje zrębowe są szeroko dostępne dla specjalistów w tej dziedzinie i można je łatwo zsyntetyzować na podstawie znanych sekwencji aminokwasowych.
Do wytworzenia sekwencji DNA kodujących cząsteczkę przeciwciała według niniejszego wynalazku można zastosować standardowe techniki biologii molekularnej. Żądane sekwencje DNA można zsyntetyzować całkowicie albo częściowo przy zastosowaniu technik syntezy oligonukleotydów. Jeśli trzeba, można zastosować ukierunkowaną mutagenezę i techniki reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR).
PL 212 738 B1
Do ekspresji sekwencji DNA kodujących cząsteczkę przeciwciała według wynalazku można zastosować dowolny system komórka gospodarza/wektor. Do ekspresji fragmentów przeciwciał, takich jak fragmenty Fab i F(ab')2 a w szczególności fragmenty Fv i fragmenty przeciwciał jednołańcuchowych, na przykład, jednołańcuchowe Fv można zastosować systemy bakteryjne, na przykład E. coli lub inne mikroorganizmy. Do wytwarzania większych cząsteczek przeciwciała, w tym, kompletnej cząsteczki przeciwciała, można zastosować systemy ekspresji z eukariotyczną, np. ssaczą komórką gospodarza. Odpowiednie ssacze komórki gospodarza obejmują komórki CHO, szpiczaka i/lub komórki hybrydoma.
Wynalazek dotyczy również sposobu wytwarzania cząsteczki przeciwciała według wynalazku, który obejmuje hodowanie komórki gospodarza według wynalazku i izolowanie cząsteczki przeciwciała.
Sposób wytwarzania cząsteczki przeciwciała odbywa się w warunkach odpowiednich do doprowadzenia do ekspresji białka z DNA kodującego cząsteczkę przeciwciała według niniejszego wynalazku i izolację cząsteczki przeciwciała.
Korzystnie komórką gospodarza jest E. coli. Cząsteczka przeciwciała może być wydzielana z komórki albo kierowana do periplazmy przez odpowiednie sekwencje sygnałowe.
Korzystnie cząsteczka przeciwciała jest kierowana do periplazmy. Alternatywnie, cząsteczki przeciwciała mogą akumulować się w cytoplazmie komórki. W zależności od wytwarzanej cząsteczki przeciwciała i zastosowanego sposobu, pożądane jest umożliwienie cząsteczce przeciwciała sfałdowania się i przyjęcia konformacji funkcjonalnej. Procedury umożliwienia sfałdowania cząsteczek przeciwciała są dobrze znane specjalistom w tej dziedzinie.
Cząsteczka przeciwciała może zawierać polipeptyd jedynie ciężkiego albo lekkiego łańcucha i wówczas do transfekowania komórek gospodarza należy użyć sekwencji kodujących jedynie polipeptyd łańcucha ciężkiego lub łańcucha lekkiego. Do wytwarzania produktów zawierających zarówno łańcuch ciężki, jak i lekki, linie komórkowe mogą być transfekowane dwoma wektorami, pierwszym wektorem kodującym polipeptyd łańcucha lekkiego i drugim wektorem kodującym polipeptyd łańcucha ciężkiego. Alternatywnie, można zastosować pojedynczy wektor, wektor zawierający sekwencje kodujące polipeptydy łańcucha lekkiego i łańcucha ciężkiego.
Niniejszy wynalazek dostarcza również kompozycji terapeutycznej albo diagnostycznej zawierającej cząsteczkę przeciwciała według niniejszego wynalazku albo związek według wynalazku. Taka kompozycja farmaceutyczna lub diagnostyczna zawiera ponadto farmaceutycznie dopuszczalną zaróbkę, rozcieńczalnik albo nośnik.
Cząsteczka przeciwciała może być jedynym składnikiem aktywnym w kompozycji terapeutycznej lub diagnostycznej albo mogą jej towarzyszyć inne składniki aktywne, w tym inne przeciwciała na przykład, przeciwciała anty-komórka T, anty- IFNy lub anty-LPS albo składniki, które nie są przeciwciałem, takie jak ksantyny.
Korzystnie, kompozycje farmaceutyczne zawierają terapeutycznie skuteczną ilość przeciwciała według wynalazku. Stosowany tu termin terapeutyczne skuteczna ilość dotyczy ilości czynnika terapeutycznego niezbędnej do leczenia, łagodzenia albo zapobiegania docelowej chorobie lub stanowi albo do wykazania wykrywalnego efektu terapeutycznego lub zapobiegawczego. Dla dowolnego przeciwciała terapeutycznie skuteczną dawkę można określić wyjściowo bądź w testach hodowli komórkowej, bądź na modelach zwierzęcych, zazwyczaj u gryzoni, królików, psów, świń albo naczelnych. Model zwierzęcy można również zastosować do określenia odpowiedniego zakresu stężeń i drogi podawania. Takie informacje można następnie wykorzystać do określenia przydatnych dawek i dróg podawania ludziom.
Dokładna skuteczna dawka dla człowieka będzie zależała od ostrości stanu chorobowego, ogólnego zdrowia danej osoby, wieku, wagi i płci osobnika, diety, czasu i częstości podawania, kombinacji leków, wrażliwości i tolerancji/odpowiedzi na terapię. Ilość tę można określić przez rutynowe doświadczenia i jest to w zakresie możliwości oceny klinicysty. Na ogół, skuteczna dawka będzie wynosić od 0,01 mg/kg do 50 mg/kg, korzystnie 0,1 mg/kg do 20 mg/kg, korzystniej około 15 mg/kg. Jak pokazano w Przykładach, poniżej, dawki 1, 5 i 20 mg/kg zastosowano do leczenia pacjentów cierpiących z powodu reumatoidalnego zapalenia stawów.
Kompozycje można podawać pacjentowi pojedynczo albo mogą być podawane w skojarzeniu z innymi czynnikami, lekami albo hormonami.
Dawka, w której cząsteczka przeciwciała według niniejszego wynalazku jest podawana, zależy od natury leczonego stanu chorobowego, stopnia w jakim podwyższony poziom TNF-α powyżej pożądanego poziomu ma być zneutralizowany lub w jakim oczekuje się, że będzie zneutralizowany i od tego czy cząsteczka przeciwciała jest stosowana profilaktycznie czy do leczenia istniejącego już stanu.
PL 212 738 B1
Zatem, na przykład, gdy produkt jest przeznaczony do leczenia lub profilaktyki przewlekłej choroby zapalnej, takiej jak reumatoidalne zapalenie stawów, odpowiednia dawka cząsteczki przeciwciała według niniejszego wynalazku mieści się w zakresie między 0,5 i 50 mg/kg, korzystniej między 1 i 20 mg/kg, a najkorzystniej wynosi około 15 mg/kg. Częstość podawania dawki będzie zależała od czasu półtrwania cząsteczki przeciwciała i czasu trwania jej działania.
Jeżeli cząsteczka przeciwciała ma krótki okres półtrwania (np. 2 do 10 godzin) może być konieczne podawanie jednej albo więcej dawek dziennie. Alternatywnie, jeżeli cząsteczka przeciwciała ma długi okres półtrwania (np. 2 do 15 dni), może być konieczne podawanie dawki raz dziennie, co tydzień albo nawet raz na 1 lub 2 miesiące.
Kompozycja farmaceutyczna może również zawierać farmaceutycznie dopuszczalny nośnik do podawania przeciwciała. Nośnik sam nie powinien indukować wytwarzania przeciwciał szkodliwych dla osobnika otrzymującego kompozycję i nie powinien być toksyczny. Odpowiednimi nośnikami mogą być duże, wolno metabolizowane makrocząsteczki, takie jak białka, polipeptydy, liposomy, polisacharydy, polikwasy (mlekowe), kwasy poliglikolowe, polimerowe aminokwasy, kopolimery aminokwasów i nieaktywne cząstki wirusowe.
Można zastosować farmaceutycznie dopuszczalne sole, na przykład sole kwasów mineralnych, takie jak chlorowodorki, bromowodorki, fosforany i siarczany albo sole kwasów organicznych, takie jak octany, propioniany, jabłczany i benzoesany.
Farmaceutycznie dopuszczalne nośniki w kompozycjach farmaceutycznych mogą dodatkowo zawierać ciecze, takie jak woda, sól, glicerol i etanol. Dodatkowo w takich kompozycjach mogą być obecne substancje pomocnicze, takie jak czynniki zwilżające i emulgujące albo substancje buforujące pH. Takie nośniki umożliwiają uformowanie kompozycji farmaceutycznych w tabletki, pigułki, drażetki, kapsułki, płyny, żele, syropy, rzadkie zawiesiny i zawiesiny do połykania przez pacjenta.
Korzystne postaci do podawania obejmują formy odpowiednie do podawania pozajelitowego, np. przez iniekcję albo wlew, na przykład, w jednej iniekcji albo jako wlew ciągły. Gdy produkt jest przeznaczony do iniekcji albo wlewu, może on być w postaci zawiesiny, roztworu albo emulsji w nośniku olejowym albo wodnym i może zawierać formulator, taki jak czynnik zawieszający, konserwujący, stabilizujący i/lub dyspergujący. Alternatywnie, cząsteczka przeciwciała może być w postaci suchej do rekonstytuaowania przy zastosowaniu odpowiedniej sterylnej cieczy.
Po przygotowaniu, kompozycję według wynalazku można podawać bezpośrednio osobnikowi. Osobnikiem, który ma być leczony, mogą być zwierzęta. Jednakże korzystnie kompozycje są przystosowane do podawania ludziom.
Kompozycje farmaceutyczne według wynalazku można podawać dowolną drogą, w tym między innymi, drogą doustną, dożylną, domięśniową, dotętniczą, doszpikową, dooponową, dokomorową, przezskórną (patrz na przykład WO 98/20734), podskórną, dootrzewnową, donosową, dojelitową, miejscową, podjęzykową, dopochwową lub doodbytniczą. Do podawania kompozycji farmaceutycznych według wynalazku można również zastosować rozpylacze podciśnieniowe. Typowo, kompozycje farmaceutyczne można przygotować jako możliwe do wstrzyknięcia, bądź jako wodne roztwory lub zawiesiny. Można również przygotować postaci stałe odpowiednie do rozpuszczania albo zawieszenia w nośnikach ciekłych przed wstrzyknięciem.
Dostarczanie bezpośrednie kompozycji będzie na ogół odbywać się przez iniekcje podskórne, dootrzewnowe, dożylne albo domięśniowe albo dostarczane do przestrzeni śródmiąższowej tkanki. Kompozycje można również podawać do uszkodzonego miejsca. Dawkowanie może być w postaci pojedynczej dawki albo wielu dawek.
Składnikiem aktywnym kompozycji jest cząsteczka przeciwciała. Jako taka, będzie ona podatna na rozkład w przewodzie żołądkowo-jelitowym. Zatem jeżeli kompozycja ma być podawana drogą wykorzystującą przewód żołądkowo-jelitowy, będzie musiała zawierać czynniki, które chronią przeciwciało przed rozkładem, ale które uwalniają przeciwciało po jego wchłonięciu z przewodu żołądkowo-jelitowego.
Szczegółowe omówienie tematu farmaceutycznie dopuszczalnych nośników jest dostępne w Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, N.J. 1991).
Bierze się również pod uwagę, że przeciwciało według niniejszego wynalazku będzie podawane przy stosowaniu terapii genowej. Aby to osiągnąć, sekwencje DNA kodujące lekki i ciężki łańcuch cząsteczki przeciwciała pod kontrolą odpowiednich składników DNA wprowadza się pacjentowi tak, aby łańcuchy przeciwciała były wyrażane z sekwencji DNA i składane razem in situ.
PL 212 738 B1
Niniejszy wynalazek obejmuje również cząsteczkę przeciwciała według niniejszego wynalazku lub związek według wynalazku do zastosowania w leczeniu choroby zapalnej lub autoimmunologicznej, choroby neurodegeneracyjnej, oparzeń lub epizodów po odrzuceniu narządu lub tkanki.
Niniejszy wynalazek dotyczy ponadto cząsteczki przeciwciała lub związku według wynalazku do zastosowania w leczeniu reumatoidalnego zapalenia stawów, zapalenia kości i stawów, choroby Crohna, zapalnych chorób kości i łuszczycy.
Cząsteczka przeciwciała według niniejszego wynalazku może być stosowana w dowolnej terapii, gdzie pożądane jest obniżenie poziomu aktywnego biologicznie TNFa obecnego w organizmie ludzkim albo zwierzęcym. TNFa może krążyć w organizmie albo może być obecny na niepożądanie wysokim poziomie zlokalizowanym w konkretnym miejscu organizmu.
Na przykład, postuluje się podwyższone poziomy TNF-α w ostrych i przewlekłych chorobach immunologicznych i immunoregulatorowych, infekcjach, w tym, w szoku posocznicowym, endotoksycznym i sercowo-naczyniowym, w chorobach zapalnych, chorobach neurodegeneracyjnych, w chorobach nowotworowych i zapaleniu wątroby wywołanym alkoholem. Szczegóły dotyczą wielu chorób związanych z podwyższonymi poziomami TNFa są przedstawione w US-A-5 919452. Choroby, które można leczyć cząsteczką przeciwciała według niniejszego wynalazku, obejmują posocznicę, zastoinową niewydolność serca, szok posocznicowy albo endotoksyczny, kacheksję, zespół ostrego wyczerpania oddechowego dorosłych, AIDS, alergię, łuszczycę, TB, choroby zapalne kości, zaburzenia związane z krzepnięciem krwi, oparzenia, odrzuty po transplantacji narządów i tkanek, chorobę Crohna i choroby autoimmunologiczne, takie jak zapalenie tarczycy i reumatoidalne zapalenie stawów oraz zapalenie kości i stawów.
Ponadto cząsteczkę przeciwciała albo kompozycję można zastosować do zmniejszenia efektów ubocznych związanych z wytwarzaniem TNFa w czasie terapii nowotworów; do eliminacji albo zmniejszania objawów szokowych związanych z leczeniem albo zapobieganiem odrzuceniu przeszczepu przez zastosowanie przeciwciała anty-limfocyty albo leczenia niewydolności wielonarządowej.
Cząsteczkę przeciwciała według niniejszego wynalazku można również zastosować do diagnozowania, na przykład do diagnozowania in vivo i obrazowania stanów chorobowych z udziałem podwyższonych poziomów TNFa.
Cząsteczka przeciwciała może zawierać hybrydowy CDR zawierający skróconą donorową sekwencję CDR, w której brakująca część skróconego donorowego CDR jest zastąpiona przez różne sekwencje i tworzy funkcjonalny CDR. Stosowany tu termin hybrydowy oznacza CDR zawierający donorowy CDR, który został skrócony w jednej albo większej liczbie pozycji, na przykład na jednym albo obydwu końcach. Brakująca część skróconego donorowego CDR jest zastąpiona przez inną sekwencję i tworzy kompletny i funkcjonalny CDR. Hybrydowy CDR ma co najmniej jedną zmianę aminokwasową w porównaniu do kompletnego i funkcjonalnego donorowego CDR. Sekwencją zastępującą skróconą część CDR może być dowolna sekwencja. Korzystnie, niedonorowa część sekwencji CDR jest z przeciwciała, z którego pochodzą regiony zrębowe cząsteczki przeciwciała, takie jak sekwencje przeciwciała linii zarodkowej.
Wynalazek dotyczy również zastosowania cząsteczki przeciwciała według wynalazku albo związku według wynalazku do wytwarzania leku do leczenia choroby zapalnej lub autoimmunologicznej, choroby neurodegeneracyjnej, oparzeń lub epizodów po odrzuceniu przeszczepu narządu lub tkanki.
Korzystnie patologią jest reumatoidalne zapalenie stawów, zapalenie kości i stawów, choroba Crohna, zapalne choroby kości i łuszczyca.
Stwierdzono, że cząsteczki przeciwciała zawierające hybrydowy CDR zachowują zasadniczo takie samo powinowactwo wiązania jak cząsteczka przeciwciała zawierająca kompletne donorowe CDR. Stosowany tu termin zasadniczo takie samo powinowactwo wiązania oznacza co najmniej 70%, korzystniej co najmniej 85%, a najkorzystniej co najmniej 95 powinowactwa wiązania odpowiedniej cząsteczki przeciwciała zawierającej kompletny donorowy CDR. Jak zaznaczono powyżej, w niektórych przypadkach, powinowactwo przeciwciała według wynalazku może być większe niż przeciwciała donorowego. Zastosowanie hybrydowych CDR dostarcza korzyści zmniejszenia ilości obcych (tj. donorowych) sekwencji obecnych w cząsteczce przeciwciała i może zwiększyć powinowactwo wiązania cząsteczki przeciwciała w porównaniu z odpowiadającą jej cząsteczką przeciwciała zawierającą kompletne donorowe CDR.
Dowolny spośród CDR-ów cząsteczki przeciwciała może być hybrydowy. Korzystnie, w cząsteczce przeciwciała hybrydowy jest CDR2 łańcucha ciężkiego.
PL 212 738 B1
Korzystnie, skrócenie donorowego CDR wynosi od 1 do 8 aminokwasów, korzystnej 4 do 6 aminokwasów. Ponadto korzystne jest, jeżeli skrócenie jest na końcu C CDR.
W zależności od sekwencji skróconej części CDR i innych sekwencji zastępujących brakującą część, można dokonać różnych zmian aminokwasowych. Korzystne są co najmniej 2 zmiany aminokwasowe, korzystniej co najmniej 3 zmiany aminokwasowe, a najkorzystniej co najmniej 4 zmiany aminokwasowe.
Konkretnym wykonaniem tego przeciwciała jest przeciwciało, które ma łańcuch ciężki jak przeciwciało według wynalazku, ale drugi CDR w łańcuchu ciężkim ma sekwencję podaną jako SEK NR ID: 2. Ma ono lepsze powinowactwo wobec antygenu niż przeciwciało donorowe, z którego pochodzi część CDR.
Niniejszy wynalazek jest dalej opisany jedynie drogą ilustracji w następujących przykładach, które odnoszą się do towarzyszących im Figur, w których:
Na Fig. 1 pokazano regiony zrębowe ludzkiego łańcucha lekkiego podgrupy 1 w porównaniu z regionami zrębowymi łańcucha lekkiego hTNF40 (SEK NR ID:83 do 90);
Na Fig. 2 pokazano regiony zrębowe ludzkiego łańcucha ciężkiego podgrupy 1 i podgrupy 3 w porównaniu z regionami zrębowymi łańcucha ciężkiego hTNF40 (SEK NR ID: 91 do 98 i 106 do 109);
Na Fig. 3 pokazano sekwencję aminokwasową CDR hTNF40 (SEK NR ID: 1 do 7), w której CDR H2' jest hybrydowym CDR, w którym sześć C-końcowych aminokwasów jest z sekwencji H2 CDR ludzkiego przeciwciała podgrupy 3 linii zarodkowej, a zmiany aminokwasowe w sekwencji będące wynikiem otrzymania takiej hybrydy są podkreślone;
Na Fig. 4 pokazano wektor pMR15.1;
Na Fig. 5 pokazano wektor pMR14;
Na Fig. 6 pokazano sekwencję nukleotydową i przewidywaną aminokwasową mysiego hTNF40Vl (SEK NR ID: 99);
Na Fig. 7 pokazano sekwencję nukleotydową i przewidywaną aminokwasową mysiego hTNF40Vh (SEK NR ID:100);
Na Fig. 8 pokazano sekwencję nukleotydową i przewidywaną aminokwasową hTNF40-gL1(SEK
NR ID: 8);
Na Fig. 9 pokazano sekwencję nukleotydową i przewidywaną aminokwasową hTNF40-gL2 (SEK
NR ID: 9);
Na Fig. 10 pokazano sekwencję nukleotydową i przewidywaną aminokwasową gh1hTNF40.4 (SEK NR ID: 10);
Na Fig. 11 pokazano sekwencję nukleotydową i przewidywaną aminokwasową gh3hTNF40.4 (SEK NR ID: 11);
Na Fig. 12 pokazano wektor CTIL5-gL6;
Na Fig. 13 pokazano strukturę związku nazwanego CDP870 zawierającego zmodyfikowany fragment Fab pochodzący z przeciwciała hTNF40 kowalencyjnie połączony przez reszty cysteinowe z łącznikiem lizylomaleidowym, gdzie każda grupa reszty lizynowej ma dołączoną kowalencyjne resztę metoksy- PEG, przy czym n wynosi około 420;
Na Fig. 14 pokazano wektor pTTQ9;
Na Fig. 15 pokazano sekwencję adaptora oligonukleotydowego OmpA (SEK NR ID: 101);
Na Fig. 16 pokazano wektor pACYC184;
Na Fig. 17 pokazano wektor pTTO-1;
Na Fig. 18 pokazano wektor pTTO-2;
Na Fig. 19 pokazano wektor pDNAbEng-G1;
Na Fig. 20 pokazano kasety oligonukleotydowe kodujące różne międzygenowe sekwencje do ekspresji zmodyfikowanych Fab w E. coli (SEK NR ID: 102 do 105);
Na Fig. 21 pokazano akumulację w periplazmie wariantów IGS zmodyfikowanego Fab;
Na Fig. 22 pokazano wektor pTTO(CDP870);
Na Fig. 23 pokazano wskaźnik aktywności choroby (ang. disease activity score, DAS) u pacjentów leczonych różnymi dawkami CDP870 i placebo. Zakresy mediany i IQ są przedstawione dla badanej populacji po dokonaniu ostatniej obserwacji. Małe kwadraty oznaczają placebo, romby oznaczają 1 mg/kg, trójkąty oznaczają 5 mg/kg, a duże kwadraty oznaczają 20 mg/kg;
Na Fig. 24 pokazano liczbę wrażliwych stawów, liczbę spuchniętych stawów, ocenę bólu, ogólną ocenę przez badającego aktywności choroby, zmodyfikowany kwestionariusz oceny zdrowia (ang. modified health assessment questionnaire, HAQ), białko C-reaktywne (CRP) i szybkość sedymentacji erytrocytów (ESR) u pacjentów leczonych różnymi dawkami CDP870 i placebo. Zakresy mediany i IQ są
PL 212 738 B1 przedstawione dla badanej populacji po dokonaniu ostatniej obserwacji. Małe kwadraty oznaczają placebo, romby oznaczają 1 mg/kg, trójkąty oznaczają 5 mg/kg, a duże kwadraty oznaczają 20 mg/kg.
P r z y k ł a d y
Klonowanie genu i ekspresja cząsteczki chimerowego przeciwciała hTNF40
Wytwarzanie RNA z komórek hybrydoma hTNF40
Całkowity RNA otrzymano z 3 x 107 komórek hybrydoma hTNF40h jak opisano poniżej. Komórki przemywano solą fizjologiczną i rozpuszczano w RNAzolu (0,2 ml na 106 komórek). Dodawano chloroform (0,2 ml na 2 ml homogenatu), mieszaninę wytrząsano energicznie przez 15 sekund i pozostawiono w lodzie na 15 minut. Uzyskane fazy wodne i organiczne rozdzielano przez wirowanie przez 15 minut w wirówce Eppendorf, a RNA wytrącano z fazy wodnej przez dodanie równej objętości izopropanolu. Po 15 minutach w lodzie, RNA osadzano przez wirowanie, przemyto 70% etanolem, wysuszono i rozpuszczono w sterylnej, wolnej od RNAzy wodzie. Wydajność RNA wynosiła 400 μg.
Klonowanie hTNF40 Vh i Vl przez PCR
Sekwencje cDNA kodujące domeny zmienne łańcuchów lekkich i ciężkich hTNF40 zsyntetyzowano przy zastosowaniu odwrotnej transkryptazy w celu wytworzenia jednoniciowych kopii cDNA z mRNA obecnego w całkowitym RNA, a następnie reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) na cDNA ze specyficznymi starterami oligonukleotydowymi.
a) Synteza cDNA cDNA zsyntetyzowano w objętości 20 μl mieszaniny reakcyjnej zawierającej następujące reagenty: 50 mM Tris-HCl pH 8,3, 75 mM KCl, 10 mM ditiotreitol, 3 mM MgCl2, 0,5 mM każdego z trifosforanów deoksyrybonukleozydów, 20 jednostek RNAzyny, 75 ng losowego startera heksanukleotydowego, 2 μg hTNF40 RNA i 200 jednostek odwrotnej transkryptazy wirusa mysiej białaczki Moloneya. Po inkubacji w 42°C przez 60 minut, reakcję zatrzymywano przez ogrzewanie w 95°C przez 5 minut.
b) PCR
Próbki cDNA poddawano reakcji PCR stosując kombinacje starterów specyficznych dla łańcuchów lekkich i ciężkich. Sekwencje nukleotydowe starterów 5' dla łańcuchów lekkich i ciężkich są pokazane w Tabelach 1 i 2, odpowiednio. Wszystkie te sekwencje zawierają, kolejno, miejsce restrykcyjne zaczynające się 7 nukleotydów od ich końców 5', sekwencję GCCGCCACC (SEK NR ID:12), dla umożliwienia optymalnej translacji otrzymanych mRNA, kodon inicjacyjny i 20-30 nukleotydów w oparciu o sekwencje peptydów liderowych znanych mysich przeciwciał (Kabat i wsp., Sequences of proteins of immunological interest, Wydanie 5, 1991, U.S. Department of Health and Human Services, Public Health Service, National Institutes of Health).
Startery 3' są pokazane w Tabeli 3. Starter dla łańcucha lekkiego rozciąga się od złącza J-C przeciwciała i zawiera miejsce restrykcyjne dla enzymu Sp1I dla ułatwienia klonowania fragmentu PCR dla Vl. Startery 3' dla łańcucha ciężkiego są mieszaniną zaprojektowaną tak, że obejmują miejsce złącza J-C. Starter 3' zawiera miejsce restrykcyjne dla enzymu ApaI dla ułatwienia klonowania. Region 3' starterów zawiera mieszaną sekwencję w oparciu o te znalezione w znanych mysich przeciwciałach (Kabat i wsp., 1991, jak wyżej).
Kombinacja opisanych powyżej starterów umożliwia bezpośrednie klonowanie produktów PCR dla Vh i Vl w odpowiednim wektorze ekspresyjnym (patrz poniżej) w celu wytworzenia chimerowych (mysich-ludzkich) łańcuchów ciężkich i lekkich i ekspresji tych genów w komórkach ssaczych w celu wytworzenia chimerowych przeciwciał o żądanym izotypie.
Mieszaniny inkubacyjne (100 μθ do PCR sporządzono, jak następuje. Każda mieszanina reakcyjna zawierała 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 1,5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 0,01% wag./obj. żelatyny, 0,25 mM każdego z trifosforanów deoksyrybonukleozydów, 10 pmoli mieszaniny starterów 5' (Tabela 4), 10 pmoli startera 3' (CL12 (łańcuch lekki) lub R2155 (łańcuch ciężki) (Tabela 3)), 1 μl cDNA i 1 jednostkę polimerazy Tag. Mieszaniny reakcyjne inkubowano w 95°C przez 5 minut, a następnie przeprowadzono cykle: 94°C przez 1 minutę, 55°C przez 1 minutę i 72°C przez 1 minutę. Po 30 cyklach próbki z każdej mieszaniny reakcyjnej analizowano przez elektroforezę w żelu agarozowym. Mieszaniny reakcyjne dla łańcucha lekkiego zawierające mieszaninę starterów 5' z puli łańcuchów lekkich 1, 2 i 7 dawały prążki o wielkościach zgodnych z fragmentami Vl pełnej długości, podczas gdy reakcje z puli 3 dla łańcucha ciężkiego dawały fragment o wielkości spodziewanej dla genu Vh. Prążek wytwarzany przez startery z puli 1 dla łańcucha ciężkiego nie ulegał dalszej obróbce, ponieważ wcześniejsze wyniki pokazały, że prążek ten odpowiada pseudo genowi dla łańcucha lekkiego wytwarzanemu przez ko14
PL 212 738 B1 mórkę hybrydoma. Prążek wytwarzany w przypadku starterów dla puli 7 dla łańcucha lekkiego był słabszy niż prążek dla starterów dla puli 2, a zatem nie był dalej badany. Jedynie prążek z mieszaniny reakcyjnej dla puli 2 łańcucha lekkiego, który był najmocniejszym prążkiem, był poddany dalszej obróbce.
c) Klonowanie molekularne fragmentów PCR
Fragmenty DNA wytworzone w mieszaninie reakcyjnej dla puli 2 dla łańcucha lekkiego strawiono enzymami BstBl i Sp1l, zagęszczono przez wytrącenie etanolem, poddano elektroforezie w 1,4% żelu agarozowym i odzyskano prążki DNA w zakresie 400 par zasad. Sklonowano je przez ligację z wektorem pMR15.1 (Fig. 4), który strawiono enzymami restrykcyjnymi BstBI i Sp1I. Po ligacji, mieszaniny transformowano do E. coli LM 1035, a plazmidy z otrzymanych kolonii bakteryjnych przeszukiwano pod kątem wstawek przez trawienie BstBI i Sp1l. Przedstawicieli ze wstawkami z każdej ligacji analizowano dalej przez sekwencjonowanie nukleotydów.
W podobny sposób, fragmenty DNA wytworzone w puli reakcyjnej 3 dla łańcucha ciężkiego strawiono HindIII i ApaI i sklonowano w wektorze pMR14 (Fig. 5), który był strawiony HindIII i ApaI. Ponownie, reprezentatywne plazmidy zawierające wstawki analizowano dalej przez sekwencjonowanie nukleotydów.
d) Analiza sekwencji nukleotydowej
Plazmidowy DNA z kilku izolatów zawierających wstawki Vh zsekwencjonowano przy użyciu starterów R1053 (patrz Tabela 5) (które rozpoczynają syntezę w regionie 3' promotora HCMV w pMR14) i R720 (patrz Tabela 5) (które rozpoczynają syntezę w regionie 5' ludzkiego C-gamma 4 i umożliwiają sekwencjonowanie przez wstawkę DNA w pMR14). Stwierdzono, że sekwencje nukleotydowe wstawki Vh w pewnej ilości klonów były identyczne z wyjątkiem różnic w peptydzie sygnałowym i regionach J. Wskazuje to, że badane klony są niezależnymi izolatami powstałymi w wyniku zastosowania różnych starterów z mieszaniny oligonukleotydów podczas etapu PCR. Ustalona sekwencja nukleotydowa i przewidywana sekwencja aminokwasowa domeny zmiennej łańcucha ciężkiego przeciwciała hTNF40 (hTNF40Vh) są podane na Fig. 7 (SEK NR ID: 100).
W celu przeanalizowania klonów łańcucha lekkiego zbadano sekwencję pochodzącą z syntezy ze starterami R1053 (patrz Tabela 5) i R684 (SEK NR ID:62) (które rozpoczynają syntezę w regionie 5' ludzkiego C-kappa i umożliwiają sekwencjonowanie przez wstawkę DNA w pMR15.1). Sekwencja nukleotydowa i przewidywana sekwencja aminokwasowa genów VI powstających w mieszaninie reakcyjnej dla puli 2 była analizowana podobnie. Ponownie stwierdzono, że sekwencje nukleotydowe wstawki Vl w pewnej ilości klonów były identyczne z wyjątkiem różnic w peptydzie sygnałowym i regionach J, co wskazuje, że badane klony są niezależnymi izolatami powstałymi w wyniku zastosowania różnych starterów z mieszaniny oligonukleotydów stosowanych podczas etapu PCR. Ustalona sekwencja nukleotydowa i przewidywana sekwencja aminokwasowa domeny zmiennej łańcucha ciężkiego przeciwciała hTNF40 (hTNF40Vl) są podane na Fig. 6 (SEK NR ID: 99).
T a b e l a 1
Startery oligonukleotydowe dla regionu 5' mysich łańcuchów ciężkich
CH1: 5'ATGAAATGCAGCTGGGTCAT(G,C)TTCTT3' (SEK NR ID:13)
CH2: 5'ATGGGATGGAGCT(A,G)TATCAT(C,G)(C,T)TCTT3' (SEK NR ID:14)
CH3: 5' ATGAAG(A,T)TGTGGTTAAACTGGGTTTT3' (SEK NR ID:15)
CH4: 5'ATG(G,A)ACTTTGGG(T,C)TCAGCTTG(G,A)T3' (SEK NR ID:16)
CH5: 5'ATGGACTCCAGGCTCAATTTAGTTTT3' (SEK NR ID:17)
CH6: 5'ATGGCTGTC(C,T)T(G,A)G(G,C)GCT(G,A)CTCTTCTG3' (SEK NR ID:18)
CH7: 5'ATGG(G,A)ATGGAGC(G,T)GG(G,A)TCTTT(Α,C)TCTT3' (SEK NR ID:19)
CH8: 5'ATGAGAGTGCTGATTCTTTTGTG3' (SEK NR ID:20)
CH9: 5'ATGG(C,A)TTGGGTGTGGA(A,C)CTTGCTATT3' (SEK NR ID:21)
CH10: 5'ATGGGCAGACTTACATTCTCATTCCT3' (SEK NR ID:22)
CH11: 5'ATGGATTTTGGGCTGATTTTTTTTATG3' (SEK NR ID:23)
CH12: 5'ATGATGGTGTTAAGTCTTCTGTACCT3' (SEK NR ID:24)
Każdy z powyższych starterów ma sekwencję
5' GCGCGCAAGCTTGCCGCCACC3' (SEK NR ID:25) dodaną do jego końca 5'.
T a b e l a 2
Startery oligonukleotydowe dla regionu 5' mysich łańcuchów lekkich
CL1: 5'ATAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCT3' (SEK NR ID:26)
CL2: 5'ATGGAG(T,A)CAGACACACTCCTG(T,C)TATGGGT3' (SEK NR ID:27)
CL3: 5'ATGAGTGTGCTCACTCAGGTCCT3' (SEK NR ID:28)
CL4: 5'ATGAGG(G,A)CCCCTGCTCAG(A,T)TT(C,T)TTGG3' (SEK NR ID:29)
PL 212 738 B1
CL5: 5'ATGGATTT(T,A)CAGGTGCAGATT(T,A)TCAGCTT3' (SEK NR ID:30)
CL5A: 5'ATGGATTT(T,A)CA(A,G)GTGCAGATT(T,A)TCAGCTT3' (SEK NR ID:31)
CL6: 5'ATGAGGT(T,G)C(T,C)(T,C)TG(T,C)T(G,C)AG(T,C)T(TC)CTG(A,G)G3' (SEK NR ID:32)
CL7: 5'ATGGGC(T,A)TCAAGATGGAGTCACA3' (SEK NR ID:33)
CL8: 5'ATGTGGGGA(T,C)CT(G,T)TTT(T,C)C((A,C)(A,C)TTTTTCAAT3' (SEK NR ID:34)
CL9: 5'ATGGT(G,A)TCC(T,A)CA(G,C)CTCAGTTCCTT3' (SEK NR ID:35)
CL10: 5'ATGTATATATGTTTGTTGTCTATTTC3' (SEK NR ID:36)
CL11: 5'ATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTT3' (SEK NR ID:37)
CL12A: 5'ATG(A,G)AGT(T,C)(A,T)CAGACCCAGGTCTT(T,C)(A,G)T3' (SEK NR ID:38)
CL12B: 5'ATGGAGACACATTCTCAGGTCTTTGT3' (SEK NR ID:39)
CL13: 5'ATGGATTCACAGGCCCAGGTTCTTAT3' (SEK NR ID:40)
CL14: 5'ATGATGAGTCCTGCCCAGTTCCTGTT3' (SEK NR ID:41)
CL15: 5'ATGAATTTGCCTGTTCATCTCTTGGTGCT3' (SEK NR ID:42)
CL16: 5'ATGGATTTTCAATTGGTCCTCATCTCCTT3' (SEK NR ID:43)
CL17A: 5'ATGAGGTGCCTA(A,G)CT(C,G)AGTTCCTG(A,G)G3' (SEKNR:44)
CL17B: 5'ATGAAGTACTCTGCTCAGTTTCTAGG3' (SEK NR ID:45)
CL17C: 5'ATGAGGCATTCTCTTCAATTCTTGGG3' (SEK NR ID:46)
Każdy z powyższych starterów ma sekwencję
5'GGACTGTTCGAAGCCGCCACC3' (SEK NR ID:47) dodaną do jego końca 5'.
T a b e l a 3
Startery oligonukleotydowe dla końców 3' mysich genów Vh i Vl
Łańcuch lekki (CL12):
5'GGATACAGTTGGTGCAGCATCCGTACGTTT3'(SEK NR ID:48)
Łańcuch ciężki (R2155):
5'GCAGATGGGCCCTTCGTTGAGGCTG(A,C)(A,G)GAGAC(G,T,A)GTGA3' (SEK NR ID:49).
T a b e l a 4
a) Mieszaniny starterów 5' dla reakcji PCR dla łańcucha lekkiego pula 1: CL2 pula 2: CL7 pula 3: CL13 pula 4: CL6 pula 5: CL5A, CL9, CL17A pula 6: CL8 pula 7: CL12A pula 8: CL1, CL3, CL4, CL5, CL10, CL11, CL2B, CL14, CL15, CL16, CL17B, CL17C
b) Mieszaniny starterów 5' dla reakcji PCR dla łańcucha ciężkiego pula 1: CH1, CH2, CH3, CH4.
pula 2: CH5, CH6, CH7, CH8. pula 3: CH9, CH10, CH11, CH12.
T a b e l a 5
Startery użyte w analizie sekwencji nukleotydowej R1053: 5'GCTGACAGACTAACAGACTGTTCC3' (SEK NR ID:50) R720: 5'GCTCTCGGAGGTGCTCCT3' (SEK NR ID:51)
Ocena aktywności chimerowych genów
Aktywności chimerowych genów oceniano przez uzyskanie ich ekspresji w komórkach ssaczych i oczyszczenie i ocenę ilościową nowo zsyntetyzowanych przeciwciał. Metodologia jest opisana poniżej, a po niej następuje opis testów biochemicznych i testów opartych na komórkach zastosowanych do charakteryzowania biochemicznego przeciwciał.
a) Wytwarzanie chimerowej cząsteczki przeciwciała hTNF40
Chimerowe przeciwciało do oceny biologicznej wytworzono przez przejściową ekspresję odpowiednich części ciężkiego i lekkiego łańcucha po kotransfekcji do komórek jajnika chomika chińskiego (CHO) z zastosowaniem precypitacji fosforanem wapnia.
Dzień przed transfekcją, kolby z prawie konfluentnymi komórkami CHO-L761 trypsynizowano, komórki zliczono i w każdej z kolb T75 umieszczano 107 komórek.
Następnego dnia 3 godziny przed transfekcją zmieniano pożywkę hodowlaną. Do transfekcji osad fosforanu wapnia przygotowywano przez zmieszanie 1,25 ml 0,25 M CaCl2 zawierającego 50 μg każdego z wektorów ekspresyjnych dla łańcucha ciężkiego i lekkiego z 1,25 ml 2 x HBS (16,36 g NaCl, 11,0 g HEPES
PL 212 738 B1 i 0,4 g Na2HPO4 w 1 litrze wody o pH doprowadzonym do 7,1 przy użyciu NaOH) i natychmiastowe dodanie do pożywki z komórkami. Po 3 godzinach w 37°C w inkubatorze CO2 pożywkę i precypitat usunięto, a komórki poddano szokowi przez dodanie 15 ml 15% glicerolu w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) przez 1 minutę. Glicerol usunięto, komórki przemyto raz PBS i inkubowano przez 48-96 godzin w 25 ml pożywki zawierającej 10 mM maślan sodowy. Przeciwciała można było oczyścić z pożywki hodowlanej przez wiązanie ze złożem Protein A-Sepharose i elucję.
b) ELISA
W celu przeprowadzenia ELISA, płytki Nunc ELISA opłaszczono przez noc w 4°C fragmentem F(ab')2 poliklonalnych kozich anty-ludzkich przeciwciał specyficznych wobec fragmentu Fc (Jackson Immunoresearch, kod 109-006-098) w 5 μg/ml buforu do opłaszczania (15 mM węglan sodu, 35 mM wodorowęglan sodu, pH 6,9). Nieopłaszczone przeciwciało usunięto przez 5-krotne przemycie wodą destylowaną. Próbki i oczyszczone standardy do oznaczeń ilościowych rozcieńczono do około 1 μ/ml w buforze koniugacyjnym (0,1 M Tris-HCl, pH 7,0, 0,1 M NaCl, 0,2% obj./obj. Tween 20, 0,2% wag./obj. kazeina Hammersten). Próbki miareczkowano w studzienkach do mikromiareczkowania w dwukrotnych rozcieńczeniach, tak aby uzyskać końcową objętość 0,1 ml w każdej studzience i płytki inkubowano w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę z wytrząsaniem. Po pierwszym etapie inkubacji płytki przemyto 10-krotnie wodą destylowaną, a następnie inkubowano przez 1 godzinę jak wcześniej z 0,1 ml mysich monoklonalnych przeciwciał anty-ludzki łańcuch kappa (klon GDI2) skoniugowanych z peroksydazą (The Binding Site, kod MP135) w rozcieńczeniu 1 do 700 w buforze koniugacyjnym. Płytki ponownie przemyto i do każdej studzienki dodawano roztwór substratu (0,1 ml). Roztwór substratu zawierał 150 μl N,N,N,N-tetrametylobenzydyny (10 mg/ml w DMSO), 150 μl nadtlenku wodoru (roztwór 30%) w 10 ml 0,1 M octanu sodu/cytrynianu sodu, pH 6,0. Płytki wywoływano przez 5-10 minut, aż do momentu gdy absorbancja przy 630 nm wynosiła około 1,0 dla górnego standardu. Absorbancję przy 630 nm zmierzono przy użyciu czytnika płytek, a stężenie próbki ustalono przez porównanie krzywych miareczkowania z korzystnymi dla standardu.
c) Określenie stałych powinowactwa przez analizę BiaCore
Interakcje przy wiązaniu hTNF40 i ludzkiego TNF zbadano przy zastosowaniu technologii BIA. Oczyszczone przez powinowactwo kozie poliklonalne przeciwciało skierowane przeciw regionowi stałemu hTNF40, unieruchomiono na powierzchni dekstranowej polimerowej mikropłytki sensorowej z zastosowaniem standardowej reakcji chemicznej NHS/EDC. Wyłapywano stosunkowo niskie poziomy hTNF40 (200-500 RU) dla zapewnienia zminimalizowania efektu transportu masy. Przez wyłapane hTNF40 przepuszczano ludzkie TNF w różnych stężeniach w celu umożliwienia pomiaru kinetyk łączenia. Po wstrzyknięciu ligandu, nad powierzchnią przepuszczono bufor, tak aby można było zmierzyć dysocjację. Obliczano stałe szybkości asocjacji i dysocjacji dla oddziaływania pomiędzy hTNF40 w fazie stałej i ludzkim TNF i wyprowadzano wartość KD.
P r z y k ł a d 1
Przeszczepienie CDR do hTNF40
Klonowanie molekularne genów dla regionów zmiennych ciężkich i lekkich łańcuchów przeciwciała hTNF40 i ich zastosowanie do wytwarzania chimerowych (mysie-ludzkie) przeciwciał hTNF40 opisano powyżej. Sekwencje nukleotydowe i aminokwasowe mysich Vl i Vh hTNF40 są pokazane na Fig. 6 i 7 (SEK ID NR:99 i 100), odpowiednio. Przykład ten opisuje przeszczepienie CDR do przeciwciała hTNF40.
Przeszczepienie CDR do łańcucha lekkiego hTNF40
Dopasowanie regionów zrębowych łańcucha lekkiego hTNF40 z regionami pochodzącymi z czterech podgrup ludzkich łańcuchów lekkich (Kabat i wsp., 1991, jak wyżej) wykazało, że hTNF40 było najbardziej homologiczne z przeciwciałami z podgrupy 1 ludzkich łańcuchów lekkich. Konsekwentnie, w celu skonstruowania łańcucha lekkiego z przeszczepionym CDR, wybrane regiony zrębowe odpowiadały regionom ludzkich sekwencji najwyższej zgodności grupy 1.
Porównanie sekwencji aminokwasowych regionów zrębowych mysiego hTNF40 i sekwencji najwyższej zgodności ludzkich łańcuchów lekkich grupy 1 jest podane na Fig. 1 i wykazuje istnienie 22 różnic (podkreślonych) między tymi dwiema sekwencjami. Analiza wkładu, który może mieć każda z tych różnic w wiązaniu antygenu, zidentyfikowała 2 reszty do badania; znajdują się one w pozycjach 46 i 60. W oparciu o tę analizę skonstruowano dwie wersje łańcucha lekkiego z przeszczepionym CDR. W pierwszej z nich, hTNF40-gL1 (SEK NR ID:8), reszty 46 i 60 pochodziły z łańcucha lekkiego hTNF40, podczas gdy w drugiej hTNF40-gL2 (SEK NR ID: 9) wszystkie reszty są resztami ludzkimi najwyższej zgodności z wyjątkiem reszty numer 60, która pochodzi z łańcucha lekkiego hTNF40.
PL 212 738 B1
Konstrukcja łańcucha lekkiego hTNF40-gL1 z przeszczepionymi CDR
Konstrukcja hTNF40-gL1 jest podana poniżej ze szczegółami. Następujące zachodzące na siebie oligonukleotydy (P7982-P7986) zastosowano w reakcjach łańcuchowych polimerazy (PCR) dla złożenia skróconego łańcucha lekkiego z przeszczepieniem. W złożonym fragmencie brakuje sekwencji liderowej przeciwciała i pierwszych 17 aminokwasów regionu zrębowego 1.
oligo 1 P7982:
5'GAATTCAGGGTCACCATCACTTGTAAAGCCAGTCAGAACGTAGGTAGTAGCCTGGTATCAGCAAA3' (SEK NR ID:52) oligo 2 P7983:
5'ATAGAGGAAAGAGGCACTGTAGATGAGGGCTTTTGGGGCTTTACCTGGTTTTTGCTGATACCAGGCTACGT 3' (SEK NR ID:53) oligo 3 P7984:
5'TACAGTGCCTCTTTCCTCTATAGTGGTGTACCATACAGGTTCAGCGGATCCGGTAGTGGTACTGATTTCAC3' (SEK NR ID:54) oligo 4 P7985:
5'GACAGTAATAAGTGGCGAAATCTTCTGGCTGGAGGCTACTGATCGGTGAGGGTGAAATCAGTACCACTACCG3' (SEK NR ID: 55) oligo 5 P7986:
5'ATTTCGCCACTTATTACTGTCAACAGTATAACATCTACCCACTCACATTCGGTCAGGGTCTAAAGTAGAAATCAAACGTACGGAATTC3' (SEK NR ID:56)
Fwd P7981:
5'GAATTCAGGGTCACCATCACTTGTAAAGCC3' (SEK NR ID:57)
Bwd P7980
5'GAATTCCGTACGTTTGATTTCTACTTTAGT3' (SEK NR ID:58)
Sporządzono 100 μI mieszaniny reakcyjnej do PCR, zawierającej, 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 1,5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 0,01% wag./obj. żelatyny, 0,25 mM każdego z trifosforanów deoksyrybonukleozydów, 2 pmole P7982, P7983, P7984, P7985, P7986, 10 pmoli P7980, P7981 i 1 jednostkę polimerazy Taq. Mieszaniny reakcyjne poddano cyklom: 94°C przez 1 minutę, 55°C przez 1 minutę i 72°C przez 1 minutę. Po 30 cyklach próbki z każdej mieszaniny reakcyjnej analizowano przez elektroforezę w żelu agarozowym i fragmenty PCR wycięto z żelu i odzyskano przy użyciu Mermaid Kit. Odzyskany fragment strawiono enzymami restrykcyjnymi BstEII i SplI w odpowiednim buforze. Na koniec uzyskany produkt poddano elektroforezie w żelu agarozowym i fragment DNA o wielkości 270 par zasad DNA odzyskano z fragmentu żelu i poddano ligacji z wektorem CTIL5-gL6 (Fig. 12), który strawiono uprzednio tymi samymi enzymami. Powyższy wektor dostarcza brakującej sekwencji liderowej przeciwciała i pierwszych 17 aminokwasów regionu zrębowego 1.
Mieszaninę ligacyjną zastosowano do transformacji szczepu E. coli LM1035, a uzyskane kolonie przeanalizowano przez PCR, trawienie enzymami restrykcyjnymi i sekwencjonowanie nukleotydów. Sekwencja nukleotydowa i aminokwasowa regionu Vl hTNF40-gL1 jest pokazana na Fig. 8 (SEK NR ID: 8).
Konstrukcja łańcucha lekkiego hTNF40-gL2 z przeszczepionymi CDR hTNF40-gL2 (SEK NR ID:9) skonstruowano przy zastosowaniu PCR. Do wprowadzenia zmian aminokwasowych zastosowano następujące oligonukleotydy:
R1053: 5'GCTGACAGACTAACAGACTGTTCC3' (SEK NR ID:59)
R5350: 5'TCTAGATGGCACACCATCTGCTAAGTTTGATGCAGCATAGATCAGGAGCTTAGGAGC3' (SEK NR ID:60)
R5349: 5'GCAGATGGTGTGCCATCTAGATTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACAGACTTTACCCTAAC3' (SEK NR ID:61)
R684: 5'TTCAACTGCTCATCAGAT3' (SEK NR ID:62)
Sporządzono dwie mieszaniny reakcyjne, każda po 20 pi, zawierające, 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 1,5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 0,01% wag./obj. żelatyny, 0,25 mM każdego z trifosforanów deoksyrybonukleozydów, 6 pmoli R1053/R5350 i R5349/R684 i 1 jednostkę polimerazy Taq. Mieszaniny reakcyjne poddano cyklom: 94°C przez 1 minutę, 55°C przez 1 minutę i 72°C przez 1 minutę. Po 30 cyklach próbki z każdej mieszaniny reakcyjnej przeanalizowano przez elektroforezę w żelu agarozowym, a fragmenty PCR wycięto z żelu i odzyskano przy użyciu Mermaid Kit.
Próbki z tych reakcji poddano następnie drugiej rundzie PCR. Mieszanina reakcyjna, 100 pi, zawierała 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 1,5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 0,01% wag./obj. żelatyny, i 1/5 każdego z fragmentów PCR z pierwszego zestawu reakcji, 30 pmoli R1053 i R684 i 2,5 jednostek polimerazy
PL 212 738 B1
Taq. Temperatury reakcji były jak wyżej. Po reakcji PCR, mieszaninę ekstrahowano fenolem//chloroformem, a następnie chloroformem i wytrącano etanolem. Osad etanolowy odzyskano przez odwirowanie, rozpuszczono w odpowiednim buforze i strawiono enzymami restrykcyjnymi BstEII i SplI. Na koniec uzyskany produkt poddano ostatecznie elektroforezie w żelu agarozowym, a fragment DNA o wielkości 270 par zasad odzyskano z fragmentu żelu i poddano ligacji z wektorem pMR15.1 (Fig. 4), który strawiono uprzednio tymi samymi enzymami.
Mieszaninę ligacyjną zastosowano do transformacji szczepu E. coli LM1035, a uzyskane kolonie przeanalizowano przez PCR, trawienie enzymami restrykcyjnymi i sekwencjonowanie nukleotydów. Sekwencja nukleotydowa i aminokwasowa regionu Vl hTNF40-g1L2 jest pokazana na Fig. 9 (SEK NR ID: 9).
Przeszczepienie CDR do łańcucha ciężkiego hTNF40
Przeszczepienie CDR do łańcucha ciężkiego hTNF40 przeprowadzono stosując tę samą strategię jak dla łańcucha lekkiego. Stwierdzono, że łańcuch ciężki hTNF40 jest najbardziej homologiczny z ludzkimi łańcuchami ciężkimi należącymi do podgrupy 1, a zatem sekwencję najwyższej zgodności ludzkiego regionu zrębowego podgrupy 1 wybrano do przyjęcia CDR-ów łańcucha ciężkiego hTNF40.
W celu zbadania wymagań dla działania homologicznego regionu zrębowego jako akceptorowego regionu zrębowego dla przeszczepienia CDR wybrano drugi region zrębowy dla ludzkiej grupy 3 w celu humanizowania łańcucha ciężkiego hTNF40. Porównanie hTNF40 z dwoma różnymi regionami zrębowymi jest pokazane na Fig. 2, gdzie można zobaczyć, że hTNF40 różni się od ludzkich sekwencji najwyższej zgodności podgrupy 1 w 32 pozycjach (podkreślone) i różni się od ludzkich sekwencji najwyższej zgodności podgrupy 3 w 40 pozycjach (podkreślone). Po analizie udziału, który każda z nich może mieć w wiązaniu antygenu, reszty 28, 38, 46, 67, 69 i 71 pozostawiono jako reszty donorowe w łańcuchu ciężkim gh1hTNF40.1 z przeszczepionymi CDR, stosując region zrębowy grupy 1. Reszty 27, 28, 30, 48, 49, 69, 71, 73, 76 i 78 pozostawiono jako donorowe w łańcuchu ciężkim gh3hTNF40.4 z przeszczepionymi CDR, stosując region zrębowy grupy 3. Reszty 28, 69 i 71 pozostawiono jako donorowe w łańcuchu ciężkim gh1hTNF40.4 z przeszczepionymi CDR, stosując region zrębowy grupy 1.
Konstrukcja łańcucha ciężkiego gh1hTNF40.4 z przeszczepionymi CDR gh1hTNF40.4 (SEK NR ID:10) złożono przez poddanie zachodzących na siebie oligonukleotydów reakcji PCR w obecności odpowiednich starterów. W reakcji PCR zastosowano następujące oligonukleotydy:
Przeszczepienie grupy 1 oligo 1 P7989:
5'GAAGCACCAGGCTTCTTAACCTCTGCTCCTGACTGGACCAGCTGCACCTGAGAGTGCACGAATTC3' (SEK NR ID:63) oligo 2 P7990:
5'GGTTAAGAAGCCTGGTGCTTCCGTCAAAGTTTCGTGTAAGGCCTCAGGCTACGTGTTCACAGACTATGGTA3' (SEK NR ID:64) oligo 3 P7991:
5'CCAACCCATCCATTTCAGGCCTTGTCCCGGGGCCTGCTTGACCCAATTCATACATAGTCGTGAACACGT3' (SEK NR ID:65) oligo 4 P7995:
5'GGCCTGAAATGGATGGGTTGGATTAATACTTACATTGGAGAGCCTATTTATGTTGACGACTTCAAGGGCAGATTCACGTTC3' (SEK NR ID:66) oligo 5 P7992:
5'CCATGTATGCAGTGCGTTGTGGAGGTGTCTAGAGTGAACGTGAATCTGCCCTTGAA3' (SEK NR ID:67) oligo 6 P7993:
5'CCACAAGCACTGCATACATGGAGCTGTCATCTCTGAGATCCGAGGACACCGCAGTGTACTAT3' (SEK NR ID:68) oligo 7 P7994:
5'GAATTCGGTACCCTGGCCCCAGTAGTCCATGGCATAAGATCTGTATCCTCTAGCACAATAGTACACTGCGGTGTCCTC3' (SEK NR ID:69)
Fwd: P7988:
5' GAATTCGTGCACTCTCAGGTGCAGCTGGTC3' (SEK NR ID:70)
Bwd P7987:
5'GAATTCGGTACCCTGGCCCCAGTAGTCCAT3' (SEK NR ID:71)
PL 212 738 B1
Mieszanina reakcyjna do składania, 100 pl, zawierała 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 1,5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 0,01% wag./obj. żelatyny, 0,25 mM każdego z trifosforanów deoksyrybonukleozydów, po 2 pmole każdego spośród p7989, p7990, p7991, p7995, p7992, p7993 i p7994, po 10 pmoli każdego spośród p7988 i p7987 oraz 1 jednostkę polimerazy Taq. Mieszaniny reakcyjne poddano cyklom: 94°C przez 1 minutę, 55°C przez 1 minutę i 72°C przez 1 minutę. Po 30 cyklach, mieszaninę ekstrahowano fenol/chloroform (1/1), a następnie chloroformem i wytrącano etanolem. Po odwirowaniu, DNA rozpuszczono w odpowiednim buforze i strawiono enzymami restrykcyjnymi ApaLI i KpnI. Uzyskany fragment wyizolowano z żelu agarozowego i poddano ligacji z wektorem pMR14 (Fig. 5), który strawiono uprzednio tymi samymi enzymami. pMR14 zawiera ludzki region stały łańcucha ciężkiego gamma 4 i gdy pMR14 jest przecinany ApaLI i KpnI, przecięty wektor jest zdolny do przyjmowania strawionego DNA tak, aby koniec 3' strawionego DNA połączył się w ramce odczytu z końcem 5' sekwencji kodującej region stały gamma 4. Zatem, łańcuch ciężki wyrażony z tego wektora będzie miał izotyp gamma 4. Mieszaninę ligacyjną zastosowano do transformowania E. coli LMI035, a uzyskane w wyniku kolonie bakteryjne zbadano przez trawienie restrykcyjne i analizę sekwencji nukleotydowej. W ten sposób zidentyfikowano plazmid zawierający prawidłową sekwencję dla gh1hTNF40.4 (Fig. 10) (SEK NR ID:10).
Konstrukcja łańcucha ciężkiego gh3hTNF40.4 z przeszczepionymi CDR gh3hTNF40.4 (SEK NR ID: 11) złożono przez poddanie zachodzących na siebie oligonukleotydów reakcji PCR w obecności odpowiednich starterów. W reakcji PCR zastosowano następujące oligonukleotydy:
Przeszczepienie grupy 3 oligo 1 P7999:
5'GATCCGCCAGGCTGCACGAGACCGCCTCCTGACTCGACCAGCTGAACCTCAG AGTGCACGAATTC3' (SEK NR ID:72) oligo 2 P8000:
5'TCTCGTGCAGCCTGGCGGATCGCTGAGATTGTCCTGTGCTGCATCTGGTTACG TCTTCACAGACTATGGAA3' (SEK NR ID:73) oligo 3 P8001
5'CCAACCCATCCATTTCAGGCCCTTTCCCGGGGCCTGCTTAACCCAATTCATTC CATAGTCTGTGAAGACGT3' (SEK NR ID:74) oligo 4 P7995:
5'GGCCTGAAATGGATGGG1TGGATTAATACTTACATTGGAGAGCCTATTTATGT TGACGACTTCAAGGGCAGATTCACGTTC3' (SEK NR ID:66) oligo 5 P7997:
5'GGAGGTATGCTGTTGACTTGGATGTGTCTAGAGAGAACGTGAATCTGCC CTTGAA3' (SEK NR ID:75) oligo 6 P7998:
5' CCAAGTCAACAGCATACCTCCAAATGAATAGCCTGAGAGCAGAGGACACCAGTGTACTA T3' (SEK NR ID:76) oligo 7 P7993:
5'GAATTCGGTACCCTGGCCCCAGTAGTCCATGGCATAAGATCTGTATCCTCT CACAATAGTACACTGCGGTGTCCTC3' (SEK NR ID:77)
5Fwd P7996:
5'GAATTCGTGCACTCTGAGGTTCAGCTGGTC3' (SEK NR ID:78)
Bwd P7987:
5' GAATTCGGTACCCTGGCCCCAGTAGTCCAT3' (SEK NR ID:71)
Mieszanina reakcyjna do składania, 100 pl zawierała 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 1,5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 0,01% wag./obj. żelatyny, 0,25 mM każdego z trifosforanów deoksyrybonukleozydów, po 2 pmole każdego spośród p7999, p8000, p8001, p7995, p7997, p7998 i p7993, po 10 pmoli p7996 i p7987 oraz 1 jednostkę polimerazy Taq. Mieszaniny reakcyjne poddano cyklom: 94°C przez 1 minutę, 55°C przez 1 minutę i 72°C przez 1 minutę. Po 30 cyklach mieszaninę poddano ekstrakcji fenol/chloroform(1/1), a następnie chloroformem i wytrącono etanolem. Po odwirowaniu, DNA rozpuszczono w odpowiednim buforze i strawiono enzymami restrykcyjnymi ApaLI i KpnI. Uzyskany fragment wyizolowano z żelu agarozowego i poddano ligacji z wektorem pMR14 (Fig. 5), który strawiono uprzednio tymi samymi enzymami. pMR14 zawiera ludzki region stały łańcucha ciężkiego gamma 4. Gdy pMR14 jest przecinany ApaLI i KpnI, przecięty wektor ma zdolność pobrania strawionego DNA tak, aby koniec 3' strawionego DNA połączył się w ramce odczytu z końcem 5' sekwencji kodującej region stały gamma
PL 212 738 B1
4. Zatem, łańcuch ciężki wyrażony z tego wektora będzie miał izotyp gamma 4. Mieszaninę ligacyjną zastosowano do transformowania E. coli LMI035, a uzyskane kolonie bakteryjne zbadano przez trawienie restrykcyjne i analizę sekwencji nukleotydowej. W ten sposób zidentyfikowano plazmid zawierający prawidłową sekwencję dla gh3hTNF40.4 (SEK NR ID:11) (Fig. 11).
Wytwarzanie zmodyfikowanego fragmentu Fab z przeszczepionymi CDR
Zmodyfikowany fragment Fab z przeszczepionymi CDR w oparciu o przeciwciało hTNF40 skonstruowano przy użyciu wektora E. coli pTTO-1. Regiony zmienne przeciwciała hTNF40 subklonowano w tym wektorze i międzygenową sekwencję optymalizowano w celu wytworzenia pTTO(CDP870). Wektor ekspresyjny pTTO jest zaprojektowany tak, aby dawał rozpuszczalną, periplazmatyczną akumulację zrekombinowanych białek w E. coli. Główne cechy tego plazmidu to:
(i) marker oporności na tetracyklinę - antybiotyk nie jest inaktywowany przez produkt genu oporności, a zatem selekcja na komórki niosące plazmid jest utrzymywana;
(ii) niska liczba kopii - miejsce początku replikacji pochodziło z plazmidu p15A, który jest całkowicie zgodny z plazmidami zawierającymi replikony pochodzące od colE1;
(iii) silny, indukowalny promotor tac do transkrypcji sklonowanego genu(ów);
(iv) gen IacIq - daje konstytutywną ekspresję białka represorowego lac, utrzymując promotor tac w stanie represji aż do czasu indukcji przez IPTG/allolaktozę;
(v) sekwencja sygnałowa OmpA - daje periplazmatyczną sekrecję sklonowanego genu(ów); i (vi) połączenie translacyjne sekwencji sygnałowej OmpA z krótkim peptydem IacZ z uzyskaniem wydajnej inicjacji translacji.
Wektor opracowano do ekspresji zmodyfikowanych fragmentów Fab z dwucistronowych mRNA przez zaprojektowanie sposobu doświadczalnej selekcji optymalnej międzygenowej sekwencji z serii czterech wbudowanych w tym celu kaset. Zastosowanie tego konstruktu pTTO(CDP870) jest opisane.
Materiały i Metody
Techniki DNA
W protokołach zastosowano standardowe procedury obejmujące trawienie DNA enzymami restrykcyjnymi, elektroforezę w żelu agarozowym, ligację i transformację. Enzymy restrykcyjne i enzymy do modyfikacji DNA otrzymano z New England Biolabs lub Boehringer Mannheim i zastosowano zgodnie z zaleceniami producentów. Fragmenty DNA oczyszczano z agarozy stosując protokół GeneClean (BIO 101). Oligonukleotydy były dostarczone przez Oswel Oligonucleotide Service i syntetyzowane na skalę 40 nm. Plazmidowy DNA wyizolowano przy użyciu zestawów Plasmid DNA Mini/Midi kits z Qiagen. PCR przeprowadzono stosując Perkin Elmer' Amplitaq' jak zalecano. Sekwencjonowanie DNA przeprowadzono przy użyciu zestawu do sekwencjonowania Applied Biosystems Taq cycle sequencing kit.
Indukcja w kolbach z wytrząsaniem
Hodowle E. coli W311 prowadzono w bulionie L uzupełnionym tetracykliną (75 μg/ml). W celu indukcji, świeże nocne hodowle (hodowane w 30°C) rozcieńczono do OD600 0,1 w 200 ml bulionu L w 2 l kolbach z przegrodami i hodowano w 30°C na wytrząsarce orbitalnej. Przy OD600 0,5 dodano IPTG do 200 μΜ. Próbki (znormalizowane na OD) pobierano w pewnych odstępach czasu.
Ekstrakcja periplazmatyczna
Próbki hodowli schładzano w lodzie (5 minut), a następnie komórki zbierano przez odwirowanie. Po ponownym zawieszeniu w buforze do ekstrakcji (100 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, pH 7,4) próbki inkubowano przez noc w 30°C, a następnie klarowano przez odwirowanie.
Test składania
Stężenia zmodyfikowanych Fab określono przez ELISA. Płytki opłaszczano przez noc w 4°C anty-ludzkimi Fd 6045 (2 μg/ml w buforze do opłaszczania, sól fizjologiczna, 100 μl na studzienkę). Po przemyciu, nałożono 100 μl próbki na studzienkę; oczyszczoną A5B7 gamma-1 Fab', początkowo w stężeniu 2 μg/ml, zastosowano jako standard. Wykonano seryjne dwukrotne rozcieńczenie próbek na płytce w buforze koniugacyjnym (na litr: 6,05 g trisaminometanu; 2,92 g NaCl; 0,1 ml Tween-20; 1 ml kazeiny (0,2%)); płytki inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem. Płytki przemyto, wysuszono, a następnie dodano 100 μl przeciwciał anty-ludzki C kappa (GD12)-peroksydaza (rozcieńczone w buforze koniugacyjnym próbki). Inkubację prowadzono przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem. Płytki przemyto, wysuszono, a następnie dodano 100 μl roztworu substratu (10 ml octan sodu/cytrynian sodu (0,1 M pH 6,0); 100 μl roztworu H2O2; 100 μl roztworu tetrametylobenzydyny (10 mg/ml w dimetylosulfotlenku). Absorbancję przy 630 nm odczytywano 4-6 minut po dodaniu substratu.
PL 212 738 B1
Konstrukcja plazmidu pTTO-1 (a) Wymiana polilinkera pTTQ9
Plazmid pTTQ9 otrzymano z Amersham i pokazano na Fig. 14. Próbkę (2 μg) strawiono enzymami restrykcyjnymi SalI i EcoRI, produkt trawienia rozdzielono w 1% żelu agarozowym i oczyszczono duży fragment DNA (4520 bp). Zsyntetyzowano dwa oligonukleotydy, które po połączeniu się ze sobą kodują region polilinkera OmpA pokazany na Fig. 15. Sekwencja ta ma lepkie końce, które pasują do końców wytwarzanych przez SalI i EcoRI przy trawieniu pTTQ9. Przy klonowaniu tej „kasety oligonukleotydowej w wektorze pTTQ9 miejsce SalI nie odtwarza się, a miejsce EcoRI jest utrzymywane. Kaseta koduje pierwszych 13 aminokwasów sekwencji sygnałowej białka zewnętrznej błony komórkowej Omp-A E. coli poprzedzonych przez miejsce wiązania rybosomu Shine Daigarno genu OmpA. Ponadto obecne są miejsca dla enzymów restrykcyjnych XbaI, MunI, Styl i SplI. Miejsca MunI i Styl są w obrębie regionu kodującego sekwencję sygnałową OmpA i są przeznaczone jako miejsca do klonowania 5' dla wstawienia genów. Dwa oligonukleotydy, które tworzą tę kasetę, łączy się razem przez zmieszanie przy stężeniu 5 pmoli^l i ogrzewanie w łaźni wodnej do 95°C przez 3 minuty, a następnie powolne schłodzenie do temperatury pokojowej. Połączone sekwencje poddaje się ligacji z pTTQ9 przeciętym Sall/EcoRI. Otrzymany w rezultacie plazmid pośredni, nazwany, pTQOmp, sprawdzono przez sekwencjonowanie DNA.
(b) Otrzymywanie i ligacja fragmentu
Plazmid pTTO-1 skonstruowano przez ligację jednego fragmentu DNA z plazmidu pACYCT84 z dwoma fragmentami wytworzonymi z pTQOmp. Plazmid pACYC184 otrzymano z New England Biolabs, a jego mapa restrykcyjna jest pokazana na Fig. 16. Próbki (2 μg) strawiono całkowicie enzymem restrykcyjnym Styl, a następnie traktowano nukleazą Mung Bean; traktowanie takie doprowadza do tępych końców przez odcięcie wystających końców 5'. Po ekstrakcji fenolem i wytrąceniu etanolem, DNA strawiono enzymem PvuII, wytwarzając fragmenty 2348, 1081, 412 i 403 bp. Fragment 2348 bp oczyszczono przez elektroforezę w żelu agarozowym. Fragment ten koduje marker oporności na tetracyklinę i początek replikacji p15A. Fragment traktowano następnie alkaliczną fosfatazą z jelita cielęcego w celu usunięcia 5'-końcowych fosforanów, zapobiegając w ten sposób ligacji cząsteczki samej ze sobą.
Próbkę (2 μg) plazmidu pTQOmp strawiono enzymami SspI i EcoRI i fragment 2350 bp odczyszczono od niepożądanych fragmentów 2040 bp i 170 bp po elektroforezie w żelu agarozowym. Fragment ten koduje region terminacji transkrypcji i gen IacIq. Inną próbkę (2 μg) pTQOmp strawiono EcoRI i XmnI, wytwarzając fragmenty 2289, 1670, 350 i 250 bp. Fragment 350 bp, kodujący promotor tac, sekwencje sygnałową OmpA i miejsce wielokrotnego klonowania, oczyszczono z żelu.
Trzy fragmenty poddano następnie ligacji, przy użyciu w przybliżeniu równomolowej ilości każdego z fragmentów, w celu wytworzenia plazmidu pTTO-1. Wszystkie miejsca połączenia przy klonowaniu zweryfikowano przez sekwencjonowanie DNA.
Mapa restrykcyjna tego plazmidu jest pokazana na Fig. 17. Plazmid pTTO-2 utworzono następnie przez wstawienie DNA domeny stałej łańcucha lekkiego kappa ludzkiej Ig. Został on otrzymany jako fragment restrykcyjny SplI-EcoRI z plazmidu pHC132 i wstawiony w odpowiednich miejscach plazmidu ρΤΤΟ-1. Plazmid pTTO-2 jest pokazany na Fig. 18.
Wstawienie regionów zmiennych humanizowanego hTNF40 do pTTO-2
Region zmienny łańcucha lekkiego hTNF40gLl (SEK NR ID:8) otrzymano przez odzysk w reakcji PCR z odpowiedniego wektora do ekspresji w komórkach ssaczych pMR10.1. Sekwencja liderowa OmpA zastępuje natywny lider Ig. Sekwencja starterów do PCR jest pokazana poniżej:
starter 5':
CGCGCGGCAATTGCAGTGGCCTTGGCTGGTTTCGCTACCGTAGCGCAAGCTGACATTCAAA TGACCCAGAGCCC (SEK NR ID:79) starter 3':
TTCAACTGCTCATCAGATGG (SEK NR ID:80)
Po reakcji PCR w warunkach standardowych, produkt oczyszczono, strawiono enzymami MunI i SplI, a następnie oczyszczono w żelu. Oczyszczony fragment został następnie wstawiony w miejsca MunI i SplI pTTO-2 w celu wytworzenia plazmidu przejściowego dla łańcucha lekkiego TTO(hTNF40L).
Region zmienny łańcucha lekkiego gh3hTNF40.4 otrzymano w ten sam sposób z wektora pGamma-4. Sekwencja starterów do PCR jest pokazana poniżej:
starter 5':
GCTATCGCAATTGCAGTGGCGCTAGCTGGTTTCGCCACCGTGGCGCAAGCTGAGGTTCAGC TGGTCGAGTCAGGAGGC (SEK NR ID:81)
PL 212 738 B1 starter 3':
GCCTGAGTTCCACGACAC (SEK NR ID:82)
Po reakcji PCR produkt oczyszczono, strawiono enzymami NheI i ApaI, a następnie subklonowano do wektora pDNAbEng-G1 (Fig. 19). Po weryfikacji przez sekwencjonowanie DNA, łańcuch ciężki strawiono enzymem EcoRI i subklonowano w miejscu EcoRI pTTO(hTNF40L) z wytworzeniem plazmidu do ekspresji w E. coli pTTO(hTNF40).
Optymalizacja sekwencji międzygenowej dla ekspresji zmodyfikowanego Fab
Ekspresja zmodyfikowanego Fab w wektorze pTTO następuje z dwucistronowego mRNA kodującego najpierw łańcuch lekki, a następnie łańcuch ciężki. Sekwencja DNA między dwoma genami (sekwencja międzygenowa, ang. intergenic sequence, IGS) może wpływać na poziom ekspresji łańcucha ciężkiego przez wpływanie na szybkość inicjacji translacji. Na przykład, krótka sekwencja międzygenowa może doprowadzać do powiązania translacyjnego między łańcuchami lekkim i ciężkim, ponieważ przeprowadzający translację rybosom może nie w pełni oddysocjować od mRNA po zakończeniu syntezy łańcucha lekkiego przed rozpoczęciem syntezy łańcucha ciężkiego. Siła miejsca wiązania rybosomu Shine Dalgarno (SD) (homologia do 16S rRNA) może mieć również wpływ, podobnie jak odległość i skład sekwencji między SD i kodonem startowym ATG. Potencjalna struktura drugorzędowa mRNA wokół ATG jest innym ważnym czynnikiem; ATG powinien być w pętli, a nie uwięziony w obrębie trzonka, podczas gdy odwrotnie jest w przypadku SD. Zatem przez modyfikowanie składu i długości IGS możliwe jest modyfikowanie siły inicjacji translacji, a zatem poziomu wytwarzania łańcucha ciężkiego. Jest prawdopodobne, że optymalna szybkość inicjacji translacji musi być osiągnięta, aby uzyskać maksymalną ekspresję łańcucha ciężkiego danego zmodyfikowanego Fab. Na przykład, dla jednego zmodyfikowanego Fab, może być tolerowany wysoki poziom ekspresji, ale dla innego zmodyfikowanego Fab z inną sekwencją aminokwasową, wysoki poziom ekspresji może okazać się toksyczny, prawdopodobnie z powodu różnic w wydajności wydzielenia i fałdowania. Z tego powodu zaprojektowano serie czterech sekwencji międzygenowych (Fig. 20), umożliwiających określenie empiryczne optimum IGS dla zmodyfikowanych Fab opartych na hTNF40. IGSI i IGS2 mają bardzo krótkie sekwencje międzygenowe (-1 i +1, odpowiednio) i można się spodziewać, że będą dawały ściśle powiązaną translację; sekwencje SD (podkreślone) różnią się niewiele. Te dwie sekwencje najprawdopodobniej nie będą dawały wysokich poziomów inicjacji translacji. IGS3 i IGS4 mają większą odległość pomiędzy kodonami start i stop (+13) i różnią się składem sekwencji; IGS3 ma mocniejszą sekwencję SD. Wszystkie sekwencje przebadano pod kątem struktury drugorzędowej (z zastosowaniem programu m/fold) i optymalizowano w możliwym zakresie jak to tylko możliwe; jednakże przy ścisłym powiązaniu translacji dwóch łańcuchów brak dysocjacji rybosomów oznacza, że mRNA może nie być nagi, co zapobiega tworzeniu struktury drugorzędowej.
Klonowanie wariantów IGS
Kaseta IGS pokazana na Fig. 20 jest oflankowana miejscami do klonowania SacI i MunI. Zostały one wbudowane przez połączenie komplementarnych par oligonukleotydów. Fragment wektora otrzymano przez trawienie pTTO (hTNF40) SacI i NotI, a fragment łańcucha ciężkiego otrzymano przez strawienie pDNAbEngGl (hTNF40H) MunI i NotI. Przeprowadzono potrójną ligację, używając równomolarnych ilości dwóch fragmentów restrykcyjnych i około 0,05 pmoli każdej z kaset połączonych oligonukleotydów. Powstają w ten sposób cztery plazmidy ekspresyjne pTTO(hTNF40 IGS-I), pTTO(hTNF40 IGS2), pTTO(hTNF40 IGS3), pTTO(hTNF40 IGS-4).
Analiza ekspresji w kolbach z wytrząsaniem
Cztery plazmidy transformowano do szczepu E. coli W3110 razem z oryginalnym konstruktem ekspresyjnym, a następnie analizowano pod kątem ekspresji w kolbach z wytrząsaniem jak opisano. Wyniki typowego doświadczenia są pokazane na Fig. 21. Różne sekwencje międzygenowe nadają różne profile ekspresji. IGS1 i IGS2 akumulują szybko periplazmatyczny zmodyfikowany Fab z pikiem po około 1 godzinie po indukcji, po czym uzyskiwany poziom spada. Pik jest większy i spadek ostrzejszy dla IGS1. Wyniki te są zgodne z wysokim poziomem syntezy, co jest spodziewane dla ścisłego powiązania translacyjnego dla tych konstruktów. IGS1 wydaje się nadawać wyższy poziom ekspresji łańcucha ciężkiego niż IGS2. W tym przypadku, wydaje się, że wysoki poziom ekspresji jest słabo tolerowany, ponieważ poziom ekspresji periplazmatycznej spada po osiągnięciu piku po 1 godzinie. Jest to widoczne dla profilu wzrostu hodowli IGS1 (niepokazane), który osiąga pik po 1 godzinie po indukcji przed spadkiem, sugerując śmierć i lizę komórek. IGS3 akumuluje zmodyfikowany Fab wolniej, ale osiąga pik po 32 godzinach po indukcji z wyższą wartością piku (325 ng/ml/OD) przed spadkiem. Wzrost tej hodowli był kontynuowany do 3 godzin po indukcji i osiągnął wyższy pik biomasy (nie pokazane). Pozostaje to
PL 212 738 B1 w zgodzie z niższym poziomem syntezy łańcucha ciężkiego. IGS4 akumuluje materiał z mniejszą szybkością i nie osiąga piku produktywności 3 innych konstruktów. Wszystkie warianty znacząco przewyższają oryginalny wektor. Hipoteza, że różne sekwencje IGS nadają różne szybkości inicjacji translacji, jest poparta tymi wynikami eksperymentalnymi. Dla zmodyfikowanego Fab opartego na hTNF40 wydaje się, że wyższe tempo inicjacji translacji łańcucha ciężkiego jest słabo tolerowane, a zatem nie jest optymalne. Niższe tempo, takie jak nadane przez IGS3, prowadzi do lepszej charakterystyki wzrostu i w konsekwencji wyższej wydajności akumulacji w czasie.
Po porównaniu wydajności wytwarzania w fermentorze, konstrukt IGS3 został wybrany jako dający najwyższą wydajność i nazwany pTTO(CDP870), patrz Fig. 22. Łańcuch ciężki kodowany przez plazmid pTTO(CDP870) ma sekwencję podaną w SEK NR ID:115, a łańcuch lekki ma sekwencję podaną w SEK NR ID:113.
PEGylowanie zmodyfikowanego Fab z przeszczepionymi CDR opartego o hTNF40
Oczyszczone zmodyfikowane Fab połączono miejscowo specyficznie z rozgałęzioną cząsteczką PEG. Uzyskano to, przez aktywację pojedynczej reszty cysteinowej w skróconym regionie zawiasowym zmodyfikowanego Fab, a następnie reakcję z (PEG)-Iizylomaleimidem, jak wcześniej opisano (A.P. Chapman i wsp., Nature Biotechnology 17, 780-783; 1999). PEGylowana cząsteczka jest pokazana na Fig. 13 i jest nazwana związkiem CDP870.
Skuteczność PEGylowanego zmodyfikowanego Fab z przeszczepionymi CDR opartego na hTNF40(CDP870) w leczeniu reumatoidalnego zapalenia stawów
CDP870 ma długi okres półtrwania wynoszący około 11 dni.
Ocenialiśmy bezpieczeństwo i skuteczność podawanego dożylnie CDP870 w randomizowanych testach z podwójnym placebo i kontrolowanym zwiększaniem dawki u pacjentów z RA.
Metody
Pacjenci w wieku między 18 a 75 lat i którzy spełnili zrewidowane w 1987 r. przez American College of Rheumatology (ACR) kryteria dla reumatoidalnego zapalenia stawów (RA) (Arnett i wsp., Arthritis Rheum. 31, 315-324, 1988) rekrutowali się z pacjentów ambulatoryjnych klinik reumatologicznych w Londynie, Cambridge, Norfolk i Norwich (Wielka Brytania). Wymogiem było, aby pacjenci mieli aktywną klinicznie chorobę, co było zdefiniowane na podstawie 3 następujących kryteriów: >6 bolesnych albo czułych stawów; >45 minut sztywności porannej i szybkość sedymentacji erytrocytów (ESR) >28 mm/godz. Musieli wykazywać brak odpowiedzi na co najmniej jeden lek przeciwreumatyczny modyfikujący przebieg choroby (DRARD) i mieć odstawione leczenie przez co najmniej 4 tygodnie. Kortykosteroidy były dopuszczone, jeżeli dawka wynosiła >7,5 mg/dzień prednizolonu. Kobiety w ciąży, kobiety karmiące, kobiety, które potencjalnie mogły mieć dziecko nie używając skutecznych metod antykoncepcji były wykluczone. Wykluczono również pacjentów jeżeli wcześniej mieli nowotwór, jednoczesne poważne niekontrolowane stany chorobowe, wcześniejsze niepowodzenie terapii neutralizującej TNFa, lub alergię na glikol polietylenowy. Przed zarejestrowaniem chorego na listę badań od każdego z nich otrzymano po poinformowaniu pisaną zgodę. Badanie były zatwierdzone przez lokalne komitety etyczne.
Protokół leczenia:
pacjentów z RA podzielono na 3 grupy, każda z nich miała otrzymać wzrastające dawki testowanego leku (1, 5 lub 20 mg/kg). Każdą grupę liczącą 12 osób podzielono losowo na 8 otrzymujących CDP870 i 4 otrzymujące placebo. CDP870 podawano jako pojedynczy dożylny wlew (ogółem 100 ml) w czasie 60 minut. Placebo (octan sodu) podawano podobnie jako pojedynczy dożylny wlew 100 ml w czasie 60 minut. Leczenie podawano ambulatoryjnie. Po 8 tygodniach wszyscy pacjenci mieli okazję otrzymać wlew 5 lub 20 mg/kg CDP870 w sposób jawny.
Ocena kliniczna
Aktywność choroby RA oceniano opierając się na podstawowym zestawie danych dla 28 stawów według World Heath Organization and International League of Associations for Rheumatology (Boers i wsp., J. Rheumatol Supplement, 41, 86-89, 1994) i European League Against Rheumatism (EULAR) (Scott i wsp., Clin. Exp. Rheumatol., 10, 521-525, 1992). Zmiany w aktywności choroby oceniano wskaźnikiem aktywności choroby, ang. Disease Activity Score (Prevoo i wsp., Arthritis Rheum. 38, 4448, 1995) i kryteriami odpowiedzi ACR (Felson i wsp., Arthritis Rheum. 38, 727-735, 1995). Oceny przeprowadzono przed leczeniem i po 1, 2, 4, 6 i 8 tygodniach po leczeniu. Pacjenci byli również badani pod kątem bezpieczeństwa i tolerancji badanego leku. Hematologia, biochemia, przeciwciała anty-CDP870 i skutki uboczne były badane przy każdej wizycie.
PL 212 738 B1
Stężenie CDP870 w osoczu i przeciwciała anty-CDP870
CDP870 oznaczano w enzymatycznym teście immunosorpcyjnym (ELISA). Seryjne rozcieńczenia osocza pacjentów inkubowano w płytce do mikromiareczkowania (Nunc) opłaszczonej zrekombinowanym ludzkim TNFa (Strathmann Biotech GmbH, Hannover). Wyłapane CDP870 ujawniano skoniugowanymi z peroksydazą przeciwciałami anty-ludzki łańcuch lekki kappa (Cappel, ICN), a następnie substratem tetrametylobenzydyny (TMB).
Przeciwciał wobec CDP870 poszukiwano (przy rozcieńczeniu osocza 1/10) przy zastosowaniu kanapkowego testu ELISA z dwoma antygenami i biotynylowanym CDP870 jako drugą warstwą. Związane przeciwciała ujawniano z zastosowaniem HRP-streptawidyna i substratu TMB. Test wykalibrowano stosując jako standard hiperaktywną w reakcji immunologicznej króliczą IgG. Jednostka aktywności odpowiada 1 μg standardu króliczego.
Analiza statystyczna
Badanie miało charakter poznawczy i wielkość próbki opierała się na wcześniejszych doświadczeniach z podobnymi czynnikami. Skuteczność CDP870 analizowano przez obliczenie wskaźnika aktywności choroby (DAS) i odpowiedzi ACR20/50 po wyrażeniu chęci leczenia i w trakcie przeprowadzania protokołu przy użyciu tajnych procedur testowych. Wskaźnik aktywności choroby wyliczono jak następuje: DAS = 0,555 x pierwiastek kwadratowy (28 wrażliwych stawów) + 0,284 x pierwiastek kwadratowy (28 opuchniętych stawów) + 0,7 x In(ESR) + 0,0142 x (ogólna ocena pacjenta). Najpierw spulowane grupy aktywne porównano z placebo. Jeżeli porównanie było na poziomie 5% istotności, każdą grupę dawkowania porównywano z placebo. Wszystkie te porównania prowadzono dwukierunkowo przy poziomie istotności 5%. Wszystkie wartości P pochodziły z analizy badawczej i nie powinny być stosowane do konkluzywnej interpretacji.
Wyniki
Demografia:
Wytypowano 36 pacjentów z RA. Szczegóły demograficzne są podane w tabeli 6. Średnia wieku wynosiła 56 lat, a 30 pacjentów to kobiety. Średnia trwania RA wynosiła 13 lat, a 21 pacjentów było reumatologicznie dodatnich. Pacjenci w różnych grupach mieli podobną charakterystykę demograficzną.
W okresie dawkowania próby ślepej, 6/12 pacjentów traktowanych placebo wycofało się z badań z powodu pogarszającego się RA >4, po tygodniach dawkowania. 2/24 pacjentów leczonych CDP870 wycofało się, w obydwu przypadkach w grupie 1 mg/kg, z powodu pogorszenia RA/utraty możliwości monitorowano >4 tygodni po dawkowaniu. Różnica była statystycznie istotna (p=0,009, test dokładności Fishera).
T a b e l a 6: Szczegóły demograficzne (średnia ± odchylenie standardowe)
Liczba Płeć (M:F) Wiek Czas trwania choroby Wskaźnik reumatologiczny Liczba wcześniejszych DMARD
Placebo 12 1:11 51 ± 8 12 ± 8 8(67%) 5 ± 1
1 mg/kg 8 1:7 59 ± 7 12 ± 7 4(50%) 4 ± 1
5 mg/kg 8 2:6 54 ± 13 13 ± 5 5(63%) 5 ± 2
20 mg/kg 8 2:6 61 ± 11 14 ± 13 4(50%) 4 ± 2
Skuteczność kliniczna:
Udział pacjentów z polepszeniem ACR20 dla populacji poddanej badaniu po przeprowadzeniu ostatniej obserwacji wynosiła 16,7, 50, 87,5 i 62,5% po podaniu placebo, 1, 5 i 20 mg/kg CDP870 (wynik skojarzonego leczenia p=0,012) po 4 tygodniach i 16,7, 25, 75 i 75% (p=0,032) po 8 tygodniach. Zmniejszenie wskaźników DAS (mediana) dla populacji poddanej badaniu po ostatniej przeprowadzonej obserwacji wynosiło 0,15, 1,14, 1,91 i 1,95 po placebo, 1, 5 i 20 mg/kg CDP870 (wynik skojarzonego leczenia p=0,001) po 4 tygodniach i 0,31, 0,09, 2,09 i 1,76 (p=0,008) po 8 tygodniach (Fig. 23). Zmiany w poszczególnych składnikach z zestawu wskaźników według World Health Organization and International League of Associations for Rheumatology są pokazane na Fig. 24.
Po jawnym dawkowaniu CDP870, uzyskano podobne korzystne wyniki. Spośród 36 pacjentów wytypowanych do badania, 32 otrzymało drugi wlew CDP870. Udział pacjentów z polepszeniem ACR20 w stosunku do pierwszego wlewu wynosił 72,2 i 55,6% po 5 i 20 mg/kg CDP870 po 4 tygodniach i 55,6 oraz 66,7% po 8 tygodniach.
PL 212 738 B1
Skutki uboczne
Leczenie było dobrze tolerowane bez reakcji związanej z wlewem. Nie zanotowano żadnych reakcji alergicznych ani zmian skórnych. W fazie podwójnej ślepej próby, wystąpiło 19, 38, 8 i 14 skutków ubocznych w placebo, 1, 5 i 20 mg/kg grupy, odpowiednio. Najczęściej był to ból głowy, z 9 epizodami u 5 pacjentów (1 placebo, 3 przy 1 mg/kg, 1 przy 20 mg/kg). U jednego pacjenta, który otrzymywał placebo i 3 pacjentów, którzy otrzymywali CDP870 (1 przy 5 mg/kg i 2 przy 20 mg/kg) rozwinęły się infekcje dolnych dróg oddechowych. Zostały one odnotowane jako łagodne albo umiarkowane. Były leczone antybiotykami doustnymi i ustąpiły po okresie 1-2 tygodni. U trzech pacjentów, po jednym w grupach 1 i 5 mg/kg i u jednego w grupie 20 mg/kg rozwinęła się infekcja przewodu moczowego 1-2 miesięcy po leczeniu CDP870. Jednym skutkiem ubocznym opisanym jako poważny był epizod bólu szyi mający miejsce 3 dni po wlewie 1 mg/kg. Zwiększenie poziomu przeciwciał antyjądrowych obserwowano u 4 pacjentów: 1 w grupie placebo (ujemny do 1/40), 2 w grupie 1 mg/kg (ujemny do 1/40, ujemny do 1/80) i 1 w grupie 20 mg/kg (ujemny do 1/40). Żadnej zmiany nie stwierdzono dla przeciwciał anty-DNA lub antykardiolipina.
Stężenie CDP870 w osoczu i poziomy Anty-CDP870
Jak się spodziewano, dla wszystkich dawek CDP870, pik stężenia w osoczu występował na zakończenie wlewu i był proporcjonalny do dawki z następującym później powolnym spadkiem stężenia w osoczu. Profil stężenia CDP870 w osoczu wydawał się być bardzo podobny do obserwowanego uprzednio u ochotników, gdzie okres półtrwania obliczono na około 14 dni. Przy ponownym dawkowaniu, zaobserwowano podobny profil jak przy wlewie pojedynczej dawki.
Po jednym dożylnym wlewie poziomy przeciwciał anty-CDP870 były niskie albo niewykrywalne.
Dyskusja
Neutralizacja TNFa jest skuteczną strategią leczenia w RA. Obecnie wymaga to stosowania czynników biologicznych, takich jak chimerowe mAb albo rozpuszczalne ludzkie białko fuzyjne receptor/ludzki Fc, których wytwarzanie jest kosztowne. Terapeutyczny czynnik neutralizujący TNFa powinien wiązać się z TNFa z wysokim powinowactwem i mieć długi okres półtrwania w osoczu, niską antygenowość i wysoki poziom tolerancji i bezpieczeństwa. Powinien on być również dostępny dla wszystkich pacjentów z RA, którzy odnieśliby korzyść z blokowania TNF-α. Jedną z technologii, którą można osiągnąć te cele, jest skoniugowanie fragmentu przeciwciała wiążącego TNFa wytwarzanego w E. coli z glikolem polietylenowym. W tych wstępnym badaniu stwierdziliśmy, że CDP870, PEGylowany, anty-TNFa, zmodyfikowany Fab jest skuteczny i dobrze tolerowany przez pacjentów z RA.
Badania in vitro pokazały, że CDP870 ma podobną aktywność neutralizującą TNF-α do mysiego przeciwciała rodzicielskiego anty-TNF-α. Badanie to potwierdza, że CDP870 zmniejsza zapalenie i łagodzi objawy RA. Polepszenie stanu klinicznego mierzone na podstawie kryteriów odpowiedzi ACR20 w grupach 5 i 20 mg/kg (75%, 75%) było porównywalne do entraceptu (60%) (Moreland i wsp., Annals Int. Med., 130, 478-486, 1999) i infliksimabu (50%) (Maini i wsp., Lancet, 354, 1932-1939, 1999). Przy średnim i wysokim poziomie testowanych dawek, działanie terapeutyczne trwało 8 tygodni, co jest porównywalne z innymi wcześniejszymi mAbs (Elliott i wsp., Lancet, 344, 1105-1110, 1994 i Rankin i wsp., Br. J. Rheumatol. 34, 334-342, 1995). Poprzednie badania pokazały, że działanie terapeutyczne przeciwciała anty-TNF-α jest związane z jego okresem półtrwania w osoczu i wytwarzaniem krążących przeciwciał (Maini i wsp., Arthritis Rheum. 38 (Supplement): S186 1995 (Abstract)). Nasze badania pokazały, że CDP870 ma okres półtrwania w osoczu wynoszący 14 dni, co jest odpowiednikiem dla okresu całego przeciwciała (Rankin i wsp., (jak wyżej)) i jest znacznie dłuższy niż w przypadku okresu półtrwania nieskoniugowanych fragmentów Fab'. Ponadto, CDP870 wytwarza jedynie bardzo niskie poziomy odpowiedzi w postaci przeciwciał.
Jednym z ważnych celów tego badania jest sprawdzenie tolerancji i bezpieczeństwa podawania tego PEGylowanego Fab'. W naszych badaniach CDP870 okazał się być dobrze tolerowany. Jednakże dalsze badania będą wymagane do przetestowania toksyczności długoterminowej, a w szczególności ryzyka choroby demielizacyjnej, infekcji i zmian skórnych, które były notowane w przypadku etanercept i infliximab.
Podsumowując, CDP870 jest skuteczny terapeutycznie i był dobrze tolerowany w tych krótkoterminowych badaniach.
PL 212 738 B1 <110>
<120>
<130>
Lista sekwencj i
CELLTECH CHIROSCIENCE LIMITED
BIOLOGICAL PRODUCTS
PO21741WO <140>
<141>
<160> 115 <170> Patentln wersja 2.1 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Sekwencj a sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: hINF40 CDRH1 <400> 1
Asp Tyr Gly Met Asn 1 5
<210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>
C223> Qpj_s sekwencji sztucznej: hTNF40 CDRH3 <400> 3
Gly Tyr Arg Ser Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5
PL 212 738 B1 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220 <223> Opis sekwencji sztucznej: hTNF40 CDRL1 <400> 4
Lys Ala Ser Gin Asn Val Gly Thr Asn Val Ala i 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: hTNF40 CDRL2 <400> 5
Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220 <223> Opis sekwencji sztucznej: hTNF40 CDRL3 <4O0> 6
Gin Gin Tyr Asn Ile Tyr Pro Leu Thr 1 5 <210 7 <211> 17 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> opis sekwencji sztucznej: hTNF40 CDRH2 <400 7 Trp
Ile Asn Thr Tyr Ile Gly Glu Pro Ile Tyr Val Asp Asp Phe Lys
Gly <210> 8
PL 212 738 B1 <211> 321 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<221> CDS <222> {1}..(321) <220> , , <223> Opis sekwencji sztucznej: hTNFiO-gLlj <4OO> 8 gac att caa atg acc cag agc cca tcc agc ctg agc gca tct gta gga Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
X 5 10 15 gac cgg
acc atc act tgt aaa gcc agt cag aac gta ggt act aac 96
Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asn Val Gly Thr Asn
20 25 30
tat cag caa aaa cca ggt aaa gcc cca aaa gcc ctc atc 144
Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ala Leu Ile
40 45
tct ttc ctc tat agt ggt gta cca tac agg ttc agc gga 192
Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly
tcc ggt agt ggt act gat ttc acc ctc acg atc agt agc ctc cag cca
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro
65. 70 75 80 gaa gat ttc gcc act tat tac tgt caa cag tat aac atc tac cca ctc
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Asn Ile Tyr Pro Leu “ 8-5 90 95
240
288 aca ttc ggt cag ggt act aaa gta gaa atc aaa Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
321 <210> 9 <211> 321 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<221> CDS <222> (1). (321) <223> opis sekwencji sztucznej: hTNF4Q-gL2 <400> 9 gac att caa atg acc cag agc cca tcc agc ctg agc gca tct gta gga 46
Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
PL 212 738 B1
1_ 5 10 15
gac cgg gtc acc atc act tgt aaa gcc agt cag aac gta ggt act aac 96
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asn Val Gly Thr Asn
20 25 30
gta gcc tgg tat cag caa aaa cca ggt aaa gcc cca aaa ctc ctc atc 144
Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
tac agt gcc tct ttc ctc tat agt ggt gta cca tac agg ttc agc gga 192
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly
50 55 60
tcc ggt agt ggt act gat ttc acc ctc acg atc agt agc ctc cag cca 240
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro
65 70 75 80
gaa gat ttc gcc act tat tac tgt caa cag tat aac atc tac cca ctc 288
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Asn Ile Tyr Pro Leu
85 90 95
aca. ttc ggt cag ggt act aaa gta gaa atc aaa 321
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 <210> 10 <211> 354 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<221> CDS <222> (1} · · (354) sZZU/ , , 1 π <223> Opis sekwencji sztucznej: ghlhTNF40.4 (Fig. ) <400> 10 cag gtg cag ctg gtc cag tea gga gca gag gtt aag aag cct ggt get 48
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
5 10 15 tcc gtc aaa gtt teg tgt aag gcc tea ggc tac gtg ttc aca gac tat 96
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys' Ala Ser Gly Tyr Val Phe Thr Asp Tyr
25 30 ggt atg aat tgg gtc aga cag gcc ccg gga caa ggc ctg gaa tgg atg 144
Gly Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met
40 45 get tgg att aat act tac att gga gag cct att tat get caa aag ttc 192
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Ile Gly Glu Pro Ile Tyr Ala Gin Lys Phe 50 55 60
PL 212 738 B1 cag ggc aga gtc acg ttc act eta gac acc tcc aca agc act gca tac
Gin Gly Arg Val Thr Phe Thr Leu Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 70 75 80 atg gag ctg tca tct ctg aga tcc gag gac acc gca gtg tac tat tgt
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
90 95
240
288 gct aga gga tac aga tct tat gcc atg gac tac tgg ggc cag ggt acc Al-a Arg Gly Tyr Arg Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110 eta gtc aca gtc tcc tca Leu Val Thr Val Ser Ser
115
336
354 <210> 11 <211> 354 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<221> CDS <222> (1) .. (354) <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: gh3hTNF40.4 (Fig. 11) <400> 11 gag gtt cag ctg gtc gag tca gga ggc ggt ctc gtg cag cct ggc gga
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly i 5 10 15 tca ctg aga ttg tcc tgt gct gca tct ggt tac gtc ttc aca gac tat
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Val Phe Thr Asp Tyr
25 30 gga
aga cag gcc ccg gga aag ggc ctg gaa tgg atg 144
Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
40 45
tac att gga gag cct att tat gct gac agc gtc 192
Tyr Ile Gly Glu Pro Ile Tyr· Ala Asp Ser Val
ttc tct eta gac aca tcc aag tca aca gca tac
Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr
70 75 80
ctg aga gca gag gac acc gca gtg tac tat tgt
Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
90 95
tct tat gcc atg gac tac tgg ggc cag ggt acc
240
288
336
PL 212 738 B1
Ala Arg Gly Tyr Arg Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 “ 110
eta gtc aca gtc tcc tca 35/
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 12
<211> 9
<212> DNA
<213> Sekwencja sztuczna
<220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: część sekwencji startera
<400> 12
gccgccacc 9
<210> 13
<211> 2£
<212> DNA
<213> Sekwencja sztuczna
<220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: starter CHI
<400> 13
atgaaatgca gctgggtcat sttctt 26 <210> 14 <211> 26 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: starter CH2 <400> 14 atgggatgga gctrtatcat sytctt 26 <210> 15 <211> 26 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> opis sekwencji sztucznej: starter CH3 <400> 15 atgaagwtgt ggttaaactg ggtttt 26
PL 212 738 B1 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: starter CH4 <400> 16 atgractttg ggytcagctt grt <210> 17 <211> 26 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: starter CH5 <400> 17 atggactcca ggctcaattt agtttt <210> 18 <211> 26 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220> ^TT< <223> Opis sekwencji sztucznej: starter CH6 <400> 18 atggctgtcy trgsgctrct cttctg <210> 19 <211> 25 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220> , <223> Opis sekwencji sztucznej: starter tu <400> 19 atggratgga gckggrtctt tmtctt <210> 20 <211> 23 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: starter CH8 <400> 20
PL 212 738 B1 atgagagtgc fcgafctctttt ybg <210> 21 <211> 26 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220> , <223> OP1S sekwencji sztucznej starter CH9 <400> 21 atggmttggg tgtggamctt gctatt <210> 22 <211> 26 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztuczne;
starter CH10 <400> 22 atgggcagac ttacattctc attcct <210> 23 <211> 28 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <22O>
<223>
Opis sekwencji sztucznej: starter CH11 <4O0> 23 atggattttg ggctgatttt ttttattg <210> 24 <211> 26 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> °pis sekwencji sztucznej: starter CH12 <400> 24 atgatggtgt taagtcttct gtacct <210> 25 <211> 21 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220> <223>
<400> 25
Opis sekwencji sztucznej: starter końca 5'
PL 212 738 B1
PL 212 738 B1
PL 212 738 B1 <212> DNA <213>Sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: starter CLIO <4OO> 36 atgtatatat gtttgttgtc tatttc <210> 37 <211> 26 <212> DNA <213> Artifici j a sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: starter CLII <400> 37 atggaagccc cagctcagct tctctt <210> 38 <211> 26 <212> -DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: starter CL12A <400> 38 atgragtywc agacccaggt cttyrt <210> 39 <211> 26 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: starter CL12B <400> 39 atggagacac attctcaggt ctttgt <210> 40 <211> 26 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: starter CL13 <400> 40 atggattcac aggcccaggt tcttat <210> 41 <211> 26 <212> DNA
PL 212 738 B1 <213> Sekwencja sztuczna <220 <223> opis sekwencji sztucznej: starter CL14 <400 41 atgatgagtc ctgcccagtt cctgtt 26 <210 42 <211> 29 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220 <223> Opis sekwencji sztucznej: starter CL15 <400 42 atgaatttgc ctgttcatct cttggtgct 29 <210 43 <211> 29 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220 <223> Opis sekwencji sztucznej: starter CL16 <400> 43 atggattttc aattggtcct catctcctt 29 <210 44 <211> 26 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220 <223> Opis sekwencji sztucznej: starter CL17A <400 44 atgaggtgcc tarctsagtt cctgrg 26 <210 45 <211> 26 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220 <223> Opis sekwencji sztucznej: starter CL17B <400 45 atgaagtact ctgctcagtt tctagg 26 <210 46 <211> 26 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna
PL 212 738 B1 <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: starter CL17C <400> 46 atgaggcatt ctcttcaatt cttggg <210> 47 <211> 21 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: starter końca 5' <400> 47 ggactgttcg aagccgccac c <210> 48 <211> 30 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220> , , .
<223> Opis sekwencji sztucznej: starter CL12 <400> 48 ggatacagtt ggtgcagcat ccgtacgttt <210> 49 <211> 37 <212> DNA <213> Sekwencj a sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: starter R2155 <400> 49 gcagatgggc ccttcgttga ggctgmrgag acdgtga <210> 50 <211> 24 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <22 0>
<223> Opis sekwencji sztucznej: starter R1053 <400> 50 gctgacagac taacagactg ttcc <210> 51 <211> 18 <212> DNA <213> sekwencja sztuczna <220>
<223>opis sekwencji sztucznej: starter R720
PL 212 738 B1 <400> 51 gctctcggag gtgctcct <210> 52 <211> 70 <212> DNA <213> sekwencja sztuczna <220>
<223>
Opis sekwencji sztucznej: oligonukleotyd P7982 <400> 52 gaattcaggg tcaccatcac ttgtaaagcc agtcagaacg taggtactaa cgtagcctgg 60 tatcagcaaa 70 <210> 53 <211> 71 <212> DNA <213>. Sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: oligonukleotyd P7983 <400> 53 atagaggaaa gaggcactgt agatgagggc ttttggggct ttacctggtt tttgctgata 60 ccaggctacg t 71 <210> 54 <211> 71 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: oligonukleotyd P7984 <400> 54 taeagtgcct ctttcctcta tagtggtgta ccatacaggt tcagcggatc cggtagtggt 60 actgatttca c 71 <210> 55 <211> 71 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: oligonukleotyd P7985 <400> 55 gacagtaata agtggcgaaa tcttctggct ggaggctact gatcgtgagg gtgaaatcag 60 taccactacc g <210> 56 <211> 89 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna
PL 212 738 B1 <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: oligonukleotyd P7986 atttcgccac ttattactgt caacagtata acatctaccc actcacattc ggtcagggta 60 ctaaagtaga aatcaaacgt acggaattc <210> 57 <211> 30 <212> DNA <213> gej:wencja sztuczna <220 <223> Opis sekwencji sztucznej: oligonukleotyd P7981 <400 57 gaattcaggg tcaccatcac ttgtaaagcc <210 58 <211> 30 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220 <223> Opis sekwencji sztucznej: oligonukleotyd P7980 <40 0 58 gaattccgta cgtttgattt ctactttagt <210> 59 <211> 24 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: oligonukleotyd R1053 <400> 59 gctgacagac taacagactg ttcc <210> 60 <211> 57 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223>
Opis sekwencji sztucznej: oligonukleotyd R5350 <400> 60 tctagatggc acaccatctg ctaagtttga tgcagcatag atcaggagct taggagc <210> 61 <211> 59 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna
PL 212 738 B1 <220>
<223> θρί3 sekwencji sztucznej: oligonukleotyd R5349 <400> 61 C Λ gcagatggtg tgccatctag attcagtggc agtggatcag gcacagactt taccctaac 59 <210> 62 .
<211> 18 <212> DNA <213> sekwencja sztuczna ' <220>
<223> Opis s ekwencji sztucznej: oligonukleotyd R684 <400> 62 ttcaactgct catcagat <210> 63 <211> 65 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: starter P7989 <400> 63 aaagcaccag gcttcttaac ctctgctcct gactggacca gctgcacctg agagtgcacg 60 aattc 65 <210> 64 <211> 71 <212> DNA <213> sekwencja sztuczna <220> . . .
<223> Opis sekwencji sztucznej: starter P7990 <400> 64 ggttaagaag cctggtgctt ccgtcaaagt ttcgtgtaag gcctcaggct acgtgttcac 60 agaętatggt a <210> 65 <211> 71 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: starter P7991 <400> 65 ccaacccatc catttcaggc cttgtcccgg ggcctgcttg acccaattca taccatagtc 60 tgtgaacacg t <210> 66 <211> 81 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna
PL 212 738 B1 <223> Opis sekwencji sztucznej: starter P7995 <400> 66 ggcctgaaat ggatgggttg gattaatact tacattggag agcctattta tgttgacgac 60 ttcaagggca gattcacgtt c 81 <210> 67 <211> 56 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: starter P7992 <400> 67 ccatgtatgc agtgcgttgt ggaggtgtct agagtgaacg tgaatctgcc cttgaa 56 <210> 68 <211> 62 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: starter P7993 <400> 68 ccacaagcac tgcatacatg gagctgtcat ctctgagatc cgaggacacc gcagtgtact 60
<210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
<4 00>
78 DNA
Sekwencja sztuczna
Opis sekwencji sztucznej: starter P7994 _____ 69 gaattcggta ccctggcccc agtagtccat ggcataagat ctgtatcctc tagcacaata 60 gtacactgcg gtgtcctc 75
30 DNA
Sekwencja sztuczna
Opis sekwencji sztucznej: starter P7988 70 gaattcgtgc actctcaggt gcagctggtc 30 <210> 71 <211> 30 <212> DNA
PL 212 738 B1 <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> θΡ^3 sekwencji sztucznej: starter P79 <400> 71 gaattcggta ccctggcccc agtagtccat <210> 72 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Seguence <220> .
<223> Opis sekwencji sztucznej: starter P7999 <400> 72 gatccgccag gctgcacgag accgcctcct gactcgacca gctgaacctc agagtgcacg 60 aattc 65 <210> 73 <211> 71 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> ’ Opis sekwencji sztucznej: starter P8000 <400> 73 tctcgtgcag cctggcggat cgctgagatt gtcctgtgct gcatctggtt acgtcttcac 60 agactatgga a 71 <210> 74 <211> 71 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <223> °Pis sekwencji sztucznej: starter P8001 <400> 74 ccaacccatc catttcaggc cctttcccgg ggcctgctta acccaattca ttccatagtc 60 tgtgaagacg t 71 <210> 75 <211> 55 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <223: Opis sekwencji sztucznej: starter P7997 <400> 75 ggaggtatgc tgttgacttg gatgtgtcta gagagaacgt gaatctgccc ttgaa 55 <210> 76 <211> 62 <220>
PL 212 738 B1 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <223> Opis sekwencji sztucznej: starter P7998 <400> 75 ccaagtcaac agcatacctc caaatgaata gcctgagagc agaggacacc gcagtgtact 60 at 62 <210> 77 <211> 78 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: starter P7993 <400> 77 gaattcggta ccctggcccc agtagtccat ggcataagat ctgtatcctc tagcacaata 60 gtacactgcg gtgtcctc 78 <210> 78 <211> 30 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: starter P7996 <400> 78 gaattcgtgc actctgaggt tcagctggtc 30 <210> 79 <211> 74 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220> . , <223> Opis sekwencji sztucznej: starter 5 <400> 79 cgcgcggcaa ttgcagtgge cttggctggt ttcgctaccg tagcgcaagc tgacattcaa 60 atgacccaga gccc 74 <210> 80 <211> 20 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: starter 3' <400> 80 ttcaactgct catcagatgg 20
PL 212 738 B1 <210> SI <211> 78 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <223> Opis sekwencji sztucznej: starter 5' <400> 81 gctatcgcaa ttgcagtggc gctagctggt ttcgccaccg tggcgcaagc tgaggttcag 60 ctggtcgagt caggaggc 78 <210> 82 <211> 18 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: starter 3' <400> 82 gcctgagttc cacgacac 1® <210> 83 <211> 23 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: region zrębowe Ll ludzkiej grupy 1 o najwyższej zgodności <400> 83
Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys 20 <210> 84 <211> 23 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <223> Opis sekwencji sztucznej: region zrębowe Ll hTNF40 <400> 84
Asp Ile Val Met Thr Gin Ser Gin Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Val Thr Cys 20
PL 212 738 B1 <210> 85 <211> 15 <212> PRT <213> Qe»kwencia sztuczna <223> Opis sekwencji sztucznej: region zrębowe L2 ludzkiej grupy 1 o najwyższej zgodności <400> 85
Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr i 5 10 15 <210> 86 <211> 15 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <22O>
<223> Opis sekwencji sztucznej: region zrębowe L2 hTNF40 <400> 86
Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Giy -Gin Se-r Pro Lys- Al-a- Leu Il-e-Tyr 1 5 10 15 <210> 87 <211> 32 <212> PRT <213> sekwencja sztuczna <223> Opis sekwencji sztucznej: region zrębowe L3 ludzkiej grupy 1 o najwyższej zgodności <400> 87
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr X 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 88 <211> 32 <212> PRT <213> sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: region zrębowe L3 hTNF40 <400> 88
Gly Val Pro Tyr Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr ί 5 10 15
PL 212 738 B1
Leu Thr Ile Ser Thr Val Gin Ser Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys 20 25 30 <210> 89 <211> 11 <212> PRT <213> sekwencja sztuczna <220 <223> Opis sekwencji sztucznej: region zrębowe L4 ludzkiej grupy 1 o najwyższej zgodności <400> 89 _
Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu 11« lys Arg 1 5 10 <210 90 <211> 11 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220 , . . , , <223> Opis sekwencji sztucznej: region zrębowe L4 hTNF40 <400> 90
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg 1 5 10 <210 91 <211> 30 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220 _ , . . . . <223> Opis sekwencji sztucznej: region zrębowe HI ludzkiej] grupy i o najwyższej zgodności <400 91
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala ! 5 10 15
Ser tal Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30 <210> 92 <211> 30 <212? PRT <213> Sekwencja sztuczna <220> .
<223> Opis sekwencji sztucznej: region zrębowe HI hTNF40
PL 212 738 B1
<400> 92
Gin Ile Gin Leu Val Gin Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Val Phe Thr
20 25 30
<210> 93 <211> 14 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: region, zrębowe H2 ludzkiej grupy 1 o najwyższej zgodności <40G> 93
Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met Gly 1 5 10 <210> 94 <211> 14 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <223> opis sekwencji sztucznej: region zrębowe H2 hTNF40 <400> 94
Trp Val Lys Gin Ala Pro Gly Lys Ala Phe Lys Trp Met Gly 1 5 10 <210> 95 <211> 32 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220> , , <92^ °Pis sekwenc3i sztucznej: region zrębowe H3 ludzkiej grupy 1 o ~ najwyższej zgodności <400> 95
Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu 1 5 10 15
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 <210> 96
PL 212 738 B1 <211> 32 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> °P1S sekwencji sztucznej: region zrębowe H3 hTNF40 <400> 96
Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Phe Leu Gin
1 5 10 15
Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 97 <211> 11 <212> PRT <213> sekwencja sztuczna <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: region zrębowe H4 ludzkiej grupy 1 o najwyższej zgodności <400> 97
Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 98 <211> 11 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> opis sekwencji sztucznej: region zrębowe H4 hTNF40 <400> 98
Trp Gly Gin Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 15 10 <210> 99 ' <211> 324 <212> DNA <213> mysi <22 0>
<221> CDS <222> (1)..(324) <223> domena zmienna łańcucha lekkiego mysiego hTNF40 <400> 99
PL 212 738 B1
gac Asp 1 att Ile gtg Val atg acc cag tct caa aaa ttc atg tcc aca tca Met Thr Gin Ser Gin Lys Phe Met Ser Thr Ser gta Val 15 gga Gly 48
5 10
gac agg gtc agc gtc acc tgc aag gcc agt cag aat gtg ggt act aat 96
Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asn Val Giy Thr Asn
20 25 30
gta gcc tgg tat caa cag aaa cca gga caa tct cct aaa gca ctg att 144
Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Lys Ala Leu Ile
35 40 45
tac tcg gca tcc ttc eta tat agt gga gtc cct tat cgc ttc aca ggc 192
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Thr Gly
50 55 60
agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc atc agc act gtg cag tct 240
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Thr Val Gin Ser
65 70 75 80
gaa gac ttg gca gag tat ttc tgt cag caa tat aac atc tat cct ctc 288
Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gin Gin Tyr Asn Ile Tyr Pro Leu
85 90 95
acg ttc ggt gct ggg acc aag ctg gag ctg aaa cgt 324
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg
100 105 <210> 100 <211> 354 <212> DNA <213> mysi <220>
<221> CDS <222> (1)..(354) , ,™Tr,„n <223> domena zmienna łańcucha ciężkiego mysiego hTNF4u <400> 100
cag Gin 1 atc Ile cag ttg Gin Leu gtg cag tct gga cct gag ctg aag aag cct gga Gly 15 gag Glu
Val 5 Gin Ser Gly Pro Glu 10 leu Lys Lys Pro
aca gtc aag atc tcc tgc aag gct tct gga tat gtt ttc aca gac tat
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Val Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
gga atg aat tgg gtg aag cag gct cca gga aag gct ttc aag tgg atg 144
Gly Met Asn Trp Val lys Gin Ala Pro Gly Lys Ala Phe Lys Trp Met
40 45 ggc tgg ata aac acc tac att gga gag cca ata tat gtt gat gac ttc 192
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Ile Gly Glu Pro Ile Tyr Val Asp Asp Phe
55 60
PL 212 738 B1
aag gga ega ttt gcc ttc tct ttg gaa acc tct gcc agc act gcc ttt 240
Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Phe
65 70 75 80
ttg cag atc aac aac ctc aaa aat gag gac acg gct aca tat ttc tgt 288
Leu Gin Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
gca aga ggt tac cgg tcc tat gct atg gac tac tgg ggt caa gga acc 336
Ala Arg Gly Tyr Arg Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr
100 105 110
tca gtc acc gtc tct tca 354
Ser Val Thr Val Ser Ser
115 <210> 101 <211> 84 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<221> CDS <222> (29)..(67} <223> °Pis sekwencji sztucznej: adaptor oligonukleotydowy OmpA <400> 101 tcgagttcta gataacgagg cgtaaaaa atg aaa aag aca gct atc gca att 52
Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile
5 gca gtg gcc-ttg gct ctgaegt-acg agtcagg 84
Ala Val Ala Leu Ala <210> 102 <211> 67 <212> DNA <213; Sekwencja sztuczna <220>
<221> CDS <222> (2) . . (40) <220>
<221> CDS <222> (43).. (66) <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: IGS kaseta-1 <400> 102 g agc tca cca gta aca aaa agt ttt aat aga gga gag tgt ta atg aag 48
PL 212 738 B1
PL 212 738 B1
20 <210> 105 <211> 81 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<221> CDS <222> (2) . . (43) <220>
<221> CDS <222> (57) . . (80) <220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: IGS kaseta-4 <400> 105 g agc tea cca gta aca aaa agt ttt aat aga gga gag tgt tga 43
Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe .Asn Arg Gly Glu Cys ' 10 cgaggatfcat ata atg aag aaa act get ara gca att g SI
Met lys Lys Thr Ala Tle Ala Ile ’ 20 <210> 106 <211> 30 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220> . . <223> Opis sekwencji sztucznej: region zrębowy HI ludzkiej grupy 3 o najwyższej zgodności
<400> 106 Glu Val Gin 1 Len Val 5 Glu Ser Gly Gly Gly 10 Leu Val Gin Pro Gly Gly 15
Ser Leu Arg Leu 20 Ser Cys Ala Ala Ser 25 Gly Phe Thr Phe Ser 30
<210> 107 <211> 13 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220> , . .
<223> Opis sekwencji sztucznej: region zrębowy H2 ludzkiej grupy 3 o najwyższej zgodności <400> 107
PL 212 738 B1
Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser 15 10 <210> 108 <211> 32 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna .
<220>
<223> Opis sekwencji sztucznej: region zrębowy H3 ludzkiej grupy 3 o najwyższej zgodności <400> 108
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin 15 10 15
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 <210> 10S <211> 11 <212> PRT <213> sekwencja sztuczna <220>
<223> opis sekwencji sztucznej: region zrębowy Ή4 ludzkiej grupy 3 o najwyższej zgodności <400> 109
Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser ΐ 5 10
<210> 110
<211> 548
<212> DNA
<213> Sekwencja sztuczna
<220> <223> Przeszczepiony łańcuch ciężki dla Fab
<400> 110
gaggttcagc tggtcgagtc aggaggcggt ctcgtgcagc ctggcggatc actgagattg 60
tcctgtgctg catctggtta cgtcttcaca gactatggaa tgaattgggt tagacaggcc 120 ccgggaaagg gcctggaatg gatgggttgg attaatactt acattggaga gcctatttat 180 gctgacagcg tcaagggcag attcacgttc tctctagaca catccaagtc aacagcatac 240 ctccaaatga atagcctgag agcagaggac accgcagtgt actattgtgc tagaggatac 300 agatcttatg ccatggacta ctggggccag ggtaccctag tcacagtctc ctcagcttcc 360 accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca 420 gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 480 tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 540 tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc 600
PL 212 738 B1
PL 212 738 B1
PL 212 738 B1
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
-<210> 114 <211> 687 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220 , <223> Przeszczepiony łańcuch ciężki dla modyfikowanego Fab <400 114 gaggttcagc tggtcgagtc aggaggcggt ctcgtgcagc ctggcggatc actgagattg 60 tcctgtgctg catctggtta cgtcttcaca gactatggaa tgaattgggt tagacaggcc 120 ccgggaaagg gcctggaatg gatgggttgg attaatactt acattggaga gcctatttat 180 gctgacagcg tcaagggcag attcacgttc tctctagaca catccaagtc aacagcatac 240 ctccaaatga atagcctgag agcagaggac accgcagtgt actattgtgc tagaggatac 300 agatcttatg ccatggacta ctggggccag ggtaccctag teacagtctc ctcagcttcc 360 accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca 420 gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 480 tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 540 tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc 600 tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtcgaca agaaagttga gcccaaatct 660 tgtgacaaaa ctcacacatg cgccgcg 687 <210> 115 <211> 229 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <223> Przeszczepiony łańcuch ciężki dla Fab
<40' 0> 115
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Val Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Ile Gly Glu Pro Ile Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Phe Ser Leu A.sp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
PL 212 738 B1
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Gly Tyr Arg Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110
Leu Val Thr 115 Val Ser Ser ' Ala Ser 120 Thr Lys Gly Pro Ser 125 Val Phe Pro
Leu Ala 130 Pro Ser Ser Lys Ser 135 Thr Ser Gly Gly Thr 140 Ala Ala Leu Gly
Cys 145 Leu Val Lys Asp Tyr 150 Phe Pro Glu Pro Val 155 Thr Val Ser Trp Asn 160
Ser Gly Ala Leu Thr 165 Ser Gly Val His Thr 170 Phe Pro Ala Val Leu 175 Gin
Ser Ser Gly Leu 180 Tyr Ser Leu Ser Ser 185 Val Val Thr Val Pro 190 Ser Ser
Ser Leu Gly 195 Th.r Gin Thr Tyr Ile 200 Cys Asn Val Asn His 205 Lys Pro Ser
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220 flis Thr Cys Ala Ala 225
PL 212 738 B1

Claims (34)

1. Cząsteczka przeciwciała swoistego wobec ludzkiego TNF-α zawierająca region zmienny łańcucha lekkiego podany w SEK NR ID: 8 (hTNF40-gL1) i region zmienny łańcucha ciężkiego podany w SEK NR ID: 11 (gh3hTNF40.4).
2. Cząsteczka przeciwciała według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera łańcuch lekki obejmujący sekwencję podaną w SEK NR ID: 113 i łańcuch ciężki obejmujący sekwencję podaną w SEK NR ID: 115.
3. Cząsteczka przeciwciała według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera łańcuch lekki składający się z sekwencji podanej w SEK NR ID: 113 i łańcuch ciężki składający się z sekwencji podanej w SEK NR ID: 115.
4. Cząsteczka przeciwciała według zastrz. 1 lub 2 lub 3, znamienna tym, że zawiera co najmniej jedną ludzką domenę stałą.
5. Cząsteczka przeciwciała według zastrz. 4, znamienna tym, że ludzką domeną stałą jest IgG.
6. Cząsteczka przeciwciała według zastrz. 5, znamienna tym, że ludzką domeną stałą jest IgG2 lub IgG4.
7. Cząsteczka przeciwciała według zastrz. 1, 2 lub 3, znamienna tym, że jest fragmentem Fab, zmodyfikowanym fragmentem Fab, fragmentem Fab', F(ab')2 lub fragmentem Fv jednołańcuchowego przeciwciała lub fragmentem Fv pojedynczego łańcucha.
8. Cząsteczka przeciwciała według zastrz. 7, znamienna tym, że jest fragmentem Fab zawierającym łańcuch ciężki o sekwencji przedstawionej w SEK NR ID: 111 i łańcuch lekki o sekwencji przedstawionej w SEK NR ID:113.
9. Cząsteczka przeciwciała według zastrz. 8, znamienna tym, że jest zmodyfikowanym fragmentem Fab, o jednym albo większej liczbie aminokwasów na końcu łańcucha ciężkiego, które umożliwiają przyłączenie cząsteczki efektorowej albo reporterowej.
10. Cząsteczka przeciwciała według zastrz. 9, znamienna tym, że dodatkowe aminokwasy tworzą zmodyfikowany region zawiasowy zawierający jedną albo dwie reszty cysteinowe, do których cząsteczka efektorowa albo reporterowa może być przyłączona.
11. Cząsteczka przeciwciała według zastrz. 10, znamienna tym, że ma w zmodyfikowanym regionie zawiasowym kowalencyjnie związaną jedną grupę tiolową lub maleimidową.
12. Cząsteczka przeciwciała według zastrz. 11, znamienna tym, że ma kowalencyjnie związaną lizynę z grupą maleimidową.
13. Cząsteczka przeciwciała według zastrz. 12, znamienna tym, że do każdej grupy aminowej lizyny ma przyłączony polimer o ciężarze cząsteczkowym 500 do 50 000 Da.
14. Cząsteczka przeciwciała według zastrz. 13, znamienna tym, że do każdej grupy aminowej lizyny ma przyłączony polimer metoksypoli(glikolu etylenowego) o ciężarze cząsteczkowym około 20 000 Da.
15. Związek zawierający cząsteczkę przeciwciała określoną w zastrz. 9, który ma kowalencyjnie przyłączoną cząsteczkę efektorową albo reporterową do aminokwasu na końcu-C albo po stronie końca C łańcucha ciężkiego.
16. Związek według zastrz. 15, znamienny tym, że zawiera cząsteczkę efektorową.
17. Związek według zastrz. 16, znamienny tym, że cząsteczka efektorowa stanowi jeden albo większą liczbę polimerów.
18. Związek według zastrz. 17, znamienny tym, że jeden albo większą liczbę polimerów stanowi ewentualnie podstawiony polimer polialkilenowy, polialkenylenowy lub polioksyalkilenowym o łańcuchu prostym albo rozgałęzionym albo polisacharyd o łańcuchu rozgałęzionym albo nierozgałęzionym.
19. Związek według zastrz. 18, znamienny tym, że jednym albo większą liczbą polimerów jest metoksypoli(glikol etylenowy).
20. Związek według zastrz. 19, znamienny tym, że ma do jednej z reszt cysteinowych na końcu C łańcucha ciężkiego przyłączoną grupę lizylomaleimidową, w której z każdą grupą aminową reszty lizylowej jest kowalencyjnie związana reszta metoksypoli(glikolu etylenowego) o ciężarze cząsteczkowym około 20000 Da.
21. Związek według zastrz. 20, znamienny tym, że ma wzór:
PL 212 738 B1
22. Sekwencja DNA kodująca ciężki i/lub lekki łańcuch cząsteczki przeciwciała określonej w zastrz. 1-8.
23. Sekwencja DNA według zastrz. 22, znamienna tym, że obejmuje sekwencję przedstawioną w SEK NR ID: 8, 11, 110, 112 lub 114.
24. Wektor do klonowania lub ekspresji zawierający sekwencję DNA określoną w zastrz. 22 lub 23.
25. Wektor do ekspresji według zastrz. 24, znamienny tym, że jest wektorem ekspresyjnym E. coli.
26. Komórka gospodarza transformowana wektorem określonym w zastrz. 24 lub 25.
27. Sposób wytwarzania cząsteczki przeciwciała określonej w zastrz. 1-8, znamienny tym, że obejmuje hodowanie komórki gospodarza określonej w zastrz. 26 i izolowanie cząsteczki przeciwciała.
28. Sposób według zastrz. 27, znamienny tym, że komórką gospodarza jest E. coli.
29. Sposób według zastrz. 28, znamienny tym, że cząsteczka przeciwciała jest kierowana do periplazmy.
30. Kompozycja terapeutyczna lub diagnostyczna, znamienna tym, że zawiera cząsteczkę przeciwciała określoną w zastrz. 1-8 albo związek określony w zastrz. 15-21.
31. Cząsteczka przeciwciała określona w zastrz. 1-8 albo związek określony w zastrz. 15-21 do zastosowania w leczeniu choroby zapalnej lub autoimmunologicznej, choroby neurodegeneracyjnej, oparzeń lub epizodów po odrzuceniu przeszczepu narządu lub tkanki.
32. Cząsteczka przeciwciała albo związek według zastrz. 31 do zastosowania w leczeniu reumatoidalnego zapalenia stawów, zapalenia kości i stawów, choroby Crohna, zapalnych chorób kości i łuszczycy.
33. Zastosowanie cząsteczki przeciwciała określonej w zastrz. 1-8 albo związku określonego w zastrz. 15-12 do wytwarzania leku do leczenia choroby zapalnej lub autoimmunologicznej, choroby neurodegeneracyjnej, oparzeń lub epizodów po odrzuceniu przeszczepu narządu lub tkanki.
34. Zastosowanie według zastrz. 33, znamienne tym, że patologią jest reumatoidalne zapalenie stawów, zapalenie kości i stawów, choroba Crohna, zapalne choroby kości i łuszczyca.
PL353960A 2000-06-06 2001-06-05 Czasteczka przeciwciala, zwiazek, sekwencja DNA, wektor do klonowania lub ekspresji, komórka gospodarza, sposób wytwarzania czasteczki przeciwciala, kompozycja terapeutyczna lub diagnostyczna, zastosowanie czasteczki przeciwciala albo zwiazku PL212738B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB0013810.7A GB0013810D0 (en) 2000-06-06 2000-06-06 Biological products
PCT/GB2001/002477 WO2001094585A1 (en) 2000-06-06 2001-06-05 Antibody molecules having specificity for human tumor necrosis factor alpha, and use thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL353960A1 PL353960A1 (pl) 2003-12-15
PL212738B1 true PL212738B1 (pl) 2012-11-30

Family

ID=9893121

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL353960A PL212738B1 (pl) 2000-06-06 2001-06-05 Czasteczka przeciwciala, zwiazek, sekwencja DNA, wektor do klonowania lub ekspresji, komórka gospodarza, sposób wytwarzania czasteczki przeciwciala, kompozycja terapeutyczna lub diagnostyczna, zastosowanie czasteczki przeciwciala albo zwiazku
PL399351A PL218516B1 (pl) 2000-06-06 2001-06-05 Cząsteczka przeciwciała, związek zawierający cząsteczkę przeciwciała, sekwencja DNA, wektor do klonowania lub ekspresji, komórka gospodarza, sposób wytwarzania cząsteczki przeciwciała, kompozycja terapeutyczna lub diagnostyczna, zastosowanie cząsteczki przeciwciała albo związku

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL399351A PL218516B1 (pl) 2000-06-06 2001-06-05 Cząsteczka przeciwciała, związek zawierający cząsteczkę przeciwciała, sekwencja DNA, wektor do klonowania lub ekspresji, komórka gospodarza, sposób wytwarzania cząsteczki przeciwciała, kompozycja terapeutyczna lub diagnostyczna, zastosowanie cząsteczki przeciwciała albo związku

Country Status (42)

Country Link
US (4) US7012135B2 (pl)
EP (4) EP1287140B1 (pl)
JP (3) JP4064812B2 (pl)
KR (1) KR20020047097A (pl)
CN (1) CN1289671C (pl)
AP (1) AP2092A (pl)
AR (1) AR033978A1 (pl)
AT (1) ATE451460T1 (pl)
AU (1) AU783756B2 (pl)
BE (1) BE2010C019I2 (pl)
BG (1) BG66072B1 (pl)
BR (2) BR0106682A (pl)
CA (2) CA2380298C (pl)
CY (6) CY1109889T1 (pl)
CZ (1) CZ300737B6 (pl)
DE (3) DE122010000027I1 (pl)
DK (4) DK3059314T3 (pl)
EC (1) ECSP024210A (pl)
ES (5) ES2230975B2 (pl)
FR (1) FR10C0015I2 (pl)
GB (2) GB0013810D0 (pl)
HU (4) HU230561B1 (pl)
IL (3) IL147992A0 (pl)
IS (2) IS2808B (pl)
LT (1) LT2308975T (pl)
LU (1) LU91674I2 (pl)
MX (1) MXPA01013440A (pl)
MY (1) MY136603A (pl)
NL (1) NL300982I9 (pl)
NO (4) NO334808B1 (pl)
NZ (1) NZ516596A (pl)
OA (1) OA12282A (pl)
PE (1) PE20020292A1 (pl)
PL (2) PL212738B1 (pl)
PT (4) PT1287140E (pl)
RU (1) RU2303604C2 (pl)
SI (3) SI1287140T1 (pl)
SK (1) SK288343B6 (pl)
TR (1) TR201900227T4 (pl)
TW (2) TWI316088B (pl)
WO (1) WO2001094585A1 (pl)
ZA (1) ZA200200097B (pl)

Families Citing this family (111)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB0013810D0 (en) * 2000-06-06 2000-07-26 Celltech Chiroscience Ltd Biological products
CA2385745C (en) 2001-06-08 2015-02-17 Abbott Laboratories (Bermuda) Ltd. Methods of administering anti-tnf.alpha. antibodies
US20060073141A1 (en) * 2001-06-28 2006-04-06 Domantis Limited Compositions and methods for treating inflammatory disorders
GB0129105D0 (en) * 2001-12-05 2002-01-23 Celltech R&D Ltd Expression control using variable intergenic sequences
DK1495056T3 (da) * 2002-03-20 2011-05-02 Ucb Pharma Sa Fremgangsmåde til analyse af antistofdisulfidisomere
US20040009172A1 (en) * 2002-04-26 2004-01-15 Steven Fischkoff Use of anti-TNFalpha antibodies and another drug
GB0210121D0 (en) * 2002-05-02 2002-06-12 Celltech R&D Ltd Biological products
PT2371392E (pt) * 2002-05-02 2015-10-07 Wyeth Holdings Llc Conjugados de derivado da caliqueamicina - transportador
ATE518885T1 (de) * 2002-05-28 2011-08-15 Ucb Pharma Sa Peg-positionsisomer von einem antikorper gegen tnfalpha (cdp870)
US9321832B2 (en) 2002-06-28 2016-04-26 Domantis Limited Ligand
NZ555692A (en) * 2002-07-19 2009-02-28 Abbott Biotech Ltd Treatment of TNF alpha related disorders
US20040091490A1 (en) * 2002-08-28 2004-05-13 Robert Johnson Stable pH optimized formulation of a modified antibody
AU2003276844A1 (en) * 2002-08-28 2004-03-19 Pharmacia Corporation Formulations of modified antibodies and methods of making the same
US20040105858A1 (en) * 2002-08-29 2004-06-03 Kim Joanne Young Hee Kwak Diagnosis and treatment of infertility
MY150740A (en) 2002-10-24 2014-02-28 Abbvie Biotechnology Ltd Low dose methods for treating disorders in which tnf? activity is detrimental
AU2003277828B2 (en) 2002-10-29 2009-06-04 Anaphore, Inc. Trimeric binding proteins for trimeric cytokines
MXPA05005921A (es) 2002-12-02 2005-10-19 Abgenix Inc Anticuerpos dirigidos a factor de necrosis tumoral y sus usos.
US7101978B2 (en) 2003-01-08 2006-09-05 Applied Molecular Evolution TNF-α binding molecules
AU2004205684A1 (en) * 2003-01-23 2004-08-05 Genentech, Inc. Methods for producing humanized antibodies and improving yield of antibodies or antigen binding fragments in cell culture
GB0303337D0 (en) * 2003-02-13 2003-03-19 Celltech R&D Ltd Biological products
EP1597299A2 (en) * 2003-02-19 2005-11-23 Pharmacia Corporation Carbonate esters of polyethylene glycol activated by means of oxalate esters
WO2004098578A2 (en) * 2003-05-12 2004-11-18 Altana Pharma Ag Composition comprising a pde4 inhibitor and a tnf-alfa antagonist selected from infliximab, adalimumab, cdp870 and cdp517
DE602004017726D1 (de) * 2003-06-30 2008-12-24 Domantis Ltd Pegylierte Single-domain-antikörper (dAb)
WO2005014649A2 (en) * 2003-08-08 2005-02-17 Pharmacia Corporation Method for the preparation of molecules having antibody activity
EP1656455B1 (en) * 2003-08-13 2012-09-19 Sandoz Ag Process for the purification of recombinant polypeptides
ATE353969T1 (de) * 2003-08-13 2007-03-15 Sandoz Ag Expressionsvektoren, transformierte wirtszellen und fermentationsverfahren zur herstellung rekombinanter polypeptide
GB0319601D0 (en) 2003-08-20 2003-09-24 Sandoz Ag Production process
KR100570422B1 (ko) * 2003-10-16 2006-04-11 한미약품 주식회사 대장균 분비서열을 이용하여 항체 단편을 분비·생산하는 발현벡터 및 이를 이용하여 항체 단편을 대량 생산하는 방법
CN100393748C (zh) * 2003-11-06 2008-06-11 上海中信国健药业有限公司 全人源肿瘤坏死因子抗体，其制备方法以及药物组合物
KR100772800B1 (ko) * 2003-11-17 2007-11-01 주식회사유한양행 인간 종양괴사인자 α를 인식하는 단일클론항체의가변영역 및 이를 코딩하는 유전자
US7435799B2 (en) 2004-01-08 2008-10-14 Applied Molecular Evolution TNF-α binding molecules
CN100427504C (zh) * 2004-06-02 2008-10-22 北京天广实生物技术有限公司 TNFα高亲和力嵌合抗体及其用途
JP2008504356A (ja) * 2004-06-30 2008-02-14 ドマンティス リミテッド 炎症性疾患を治療するための組成物及び方法
GB0425972D0 (en) * 2004-11-25 2004-12-29 Celltech R&D Ltd Biological products
WO2006062776A2 (en) * 2004-11-29 2006-06-15 The Regents Of The University Of California Hydroxyapatite-binding peptides for bone growth and inhibition
JP4642862B2 (ja) * 2004-12-29 2011-03-02 ユーハン・コーポレイション ヒト腫瘍壊死因子−アルファに特異的なヒト化抗体
JP5757495B2 (ja) 2005-05-16 2015-07-29 アッヴィ バイオテクノロジー リミテッド びらん性多発性関節炎の治療のためのｔｎｆ阻害剤の使用
WO2006128690A1 (en) * 2005-06-01 2006-12-07 Micromet Ag Anti-il2 antibodies
EP2390267B1 (en) 2005-06-07 2013-06-05 ESBATech - a Novartis Company LLC Stable and soluble antibodies inhibiting TNF(alpha)
GB0520169D0 (en) 2005-10-04 2005-11-09 Celltech R&D Ltd Biological products
WO2007117685A2 (en) 2006-04-07 2007-10-18 Nektar Therapeutics Al, Corporation Conjugates of an anti-tnf-alpha antibody
EP2007426A4 (en) 2006-04-10 2010-06-16 Abbott Biotech Ltd COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT OF PSORIASTIC POLYARTHRITIS AND THEIR APPLICATIONS
US9399061B2 (en) 2006-04-10 2016-07-26 Abbvie Biotechnology Ltd Methods for determining efficacy of TNF-α inhibitors for treatment of rheumatoid arthritis
US9605064B2 (en) 2006-04-10 2017-03-28 Abbvie Biotechnology Ltd Methods and compositions for treatment of skin disorders
US20080131374A1 (en) * 2006-04-19 2008-06-05 Medich John R Uses and compositions for treatment of rheumatoid arthritis
AU2007269714A1 (en) 2006-07-03 2008-01-10 Charles David Adair Composition for modulating the expression of cell adhesion molecules
EP1914242A1 (en) * 2006-10-19 2008-04-23 Sanofi-Aventis Novel anti-CD38 antibodies for the treatment of cancer
CN101652128B (zh) * 2007-03-02 2012-12-19 法纳姆公司 使用蜡状材料的缓释组合物
EP2166844A4 (en) * 2007-06-07 2013-09-04 Evonik Corp DOSAGE FORMS WITH EXTENDED ACTION AND REDUCED MASS
EP2171451A4 (en) 2007-06-11 2011-12-07 Abbott Biotech Ltd METHOD FOR TREATING JUVENILIAN IDIOPATHIC ARTHRITIS
US8865875B2 (en) 2007-08-22 2014-10-21 Medarex, L.L.C. Site-specific attachment of drugs or other agents to engineered antibodies with C-terminal extensions
JP2011510667A (ja) * 2008-02-05 2011-04-07 デレネックス セラピューティクス アーゲー 軟骨変性に対する抗原結合性ポリペプチド
EP2279207B1 (en) * 2008-05-07 2015-09-09 Argos Therapeutics, Inc. Humanized antibodies against human interferon-alpha
CN102164958A (zh) 2008-06-25 2011-08-24 艾斯巴技术,爱尔康生物医药研究装置有限责任公司 使用通用抗体构架进行的兔抗体的人源化
CA2728004C (en) 2008-06-25 2022-05-24 Esbatech, An Alcon Biomedical Research Unit Llc Humanization of rabbit antibodies using a universal antibody framework
CA2727992C (en) 2008-06-25 2017-10-17 Esbatech, An Alcon Biomedical Research Unit Llc Stable and soluble antibodies inhibiting tnf.alpha.
KR102095257B1 (ko) 2008-06-25 2020-04-01 노바르티스 아게 Ｖｅｇｆ를 억제하는 안정하고 가용성인 항체
CN101684156B (zh) * 2008-09-27 2011-12-28 苏州工业园区晨健抗体组药物开发有限公司 人TNFα单克隆抗体、其PEG化纳米颗粒及其应用
SG172855A1 (en) * 2009-01-29 2011-08-29 Abbott Lab Il-1 binding proteins
US20110165063A1 (en) * 2009-01-29 2011-07-07 Abbott Laboratories Il-1 binding proteins
HUE051430T2 (hu) 2009-07-10 2021-03-01 Ablynx Nv Eljárás variábilis domének elõállítására
SI2993231T1 (sl) 2009-09-24 2018-10-30 Ucb Biopharma Sprl Bakterijski sev za izražanje rekombinantnega proteina, ki ima proteazno deficientno DEGP-zadrževalno šaperonsko aktivnost, ter onesposobljena gena TSP in PTR
NZ598791A (en) 2009-10-23 2014-05-30 Millennium Pharm Inc Anti-gcc antibody molecules and related compositions and methods
GB201000588D0 (en) 2010-01-14 2010-03-03 Ucb Pharma Sa Bacterial host strain
GB201000590D0 (en) 2010-01-14 2010-03-03 Ucb Pharma Sa Bacterial host strain
GB201000591D0 (en) 2010-01-14 2010-03-03 Ucb Pharma Sa Bacterial hoist strain
GB201000587D0 (en) 2010-01-14 2010-03-03 Ucb Pharma Sa Bacterial hoist strain
GB201001791D0 (en) 2010-02-03 2010-03-24 Ucb Pharma Sa Process for obtaining antibodies
WO2011109662A1 (en) 2010-03-04 2011-09-09 Vet Therapeutics, Inc. Monoclonal antibodies directed to cd52
US9616120B2 (en) 2010-03-04 2017-04-11 Vet Therapeutics, Inc. Monoclonal antibodies directed to CD20
SG184473A1 (en) 2010-04-07 2012-11-29 Abbvie Inc Tnf-alpha binding proteins
GB201012599D0 (en) 2010-07-27 2010-09-08 Ucb Pharma Sa Process for purifying proteins
GB201012603D0 (en) * 2010-07-27 2010-09-08 Ucb Pharma Sa Protein purification
GB201012784D0 (en) * 2010-07-29 2010-09-15 Ucb Pharma Sa Method
TWI538918B (zh) 2010-10-20 2016-06-21 財團法人工業技術研究院 人源化之單株抗體、其核苷酸序列與其用途
UY33679A (es) 2010-10-22 2012-03-30 Esbatech Anticuerpos estables y solubles
CN107267546B (zh) 2011-06-01 2021-08-17 英特瑞克斯顿阿克图比奥帝克斯有限公司 用于细菌的多顺反子表达系统
WO2013007388A1 (en) 2011-07-13 2013-01-17 Ucb Pharma, S.A. Bacterial host strain expressing recombinant dsbc
EP2546267A1 (en) 2011-07-13 2013-01-16 UCB Pharma S.A. Bacterial host strain expressing recombinant DsbC
CA2848471C (en) 2011-09-23 2021-11-16 Actogenix Nv Modified gram positive bacteria and uses thereof
HUE038830T2 (hu) 2011-09-23 2018-11-28 Intrexon Actobiotics Nv Módosított gram-pozitív baktériumok és alkalmazásaik
WO2013087912A1 (en) 2011-12-16 2013-06-20 Synthon Biopharmaceuticals B.V. Compounds and methods for treating inflammatory diseases
US9156915B2 (en) 2012-04-26 2015-10-13 Thomas Jefferson University Anti-GCC antibody molecules
GB201208367D0 (en) 2012-05-14 2012-06-27 Ucb Pharma Sa Biological product
RU2018130986A (ru) 2012-08-13 2018-10-09 Дженентек, Инк. Антитела к jagged и способы их применения
JP2017518737A (ja) 2014-04-21 2017-07-13 ミレニアム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッドＭｉｌｌｅｎｎｉｕｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． ＳＹＫ標的治療薬のための抗ｐＳＹＫ抗体分子及びその使用
JP6946182B2 (ja) 2014-10-22 2021-10-06 エクステンド バイオサイエンシズ インコーポレーテッドＥｘｔｅｎｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｉｎｃ 治療用ビタミンｄコンジュゲート
WO2016065052A1 (en) 2014-10-22 2016-04-28 Extend Biosciences, Inc. Insulin vitamin d conjugates
ES3046837T3 (en) 2014-12-22 2025-12-02 UCB Biopharma SRL Method of protein manufacture
WO2017035430A2 (en) * 2015-08-27 2017-03-02 Kolltan Pharmaceuticals, Inc. Anti-alk antibodies and methods for use thereof
GB201522394D0 (en) 2015-12-18 2016-02-03 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
CN108883140A (zh) 2016-01-14 2018-11-23 英特瑞克斯顿阿克图比奥帝克斯有限公司 治疗1型糖尿病的组合物和方法
RU2680011C2 (ru) * 2016-04-29 2019-02-14 Закрытое Акционерное Общество "Биокад" Триспецифические антитела против il-17a, il-17f и другой провоспалительной молекулы
MY194619A (en) 2016-06-02 2022-12-07 Abbvie Inc Glucocorticoid receptor agonist and immunoconjugates thereof
EP4467565A3 (en) 2016-12-21 2025-03-12 Amgen Inc. Anti-tnf alpha antibody formulations
BR112020010694A2 (pt) 2017-12-01 2020-11-10 Abbvie Inc. agonista de receptor de glicocorticoides e imunoconjugados do mesmo
IL320091A (en) 2019-01-31 2025-06-01 Numab Therapeutics AG Multispecific antibodies having specificity for tnfa and il-17a, antibodies targeting il-17a, and methods of use thereof
KR102323342B1 (ko) 2019-04-26 2021-11-08 주식회사 와이바이오로직스 IL-17A 및 TNF-α에 특이적으로 결합하는 이중표적 항체
CN111909268B (zh) * 2019-05-07 2022-04-19 北京天成新脉生物技术有限公司 低免疫原性低ADCC/CDC功能抗TNF-α人源化单克隆抗体TCX060及其应用
TW202237638A (zh) 2020-12-09 2022-10-01 日商武田藥品工業股份有限公司 烏苷酸環化酶ｃ（ｇｃｃ）抗原結合劑之組成物及其使用方法
TW202237639A (zh) 2020-12-09 2022-10-01 日商武田藥品工業股份有限公司 鳥苷酸環化酶ｃ（ｇｃｃ）抗原結合劑之組成物及其使用方法
KR20230146032A (ko) 2021-02-15 2023-10-18 다케다 야쿠힌 고교 가부시키가이샤 Tgf-b 신호전달을 조절하기 위한 세포 치료 조성물 및 방법
EP4393937A1 (en) 2021-08-26 2024-07-03 Duality Biologics (Suzhou) Co., Ltd. Steroid compound and conjugate thereof
SE545694C2 (en) * 2021-09-24 2023-12-05 Xbrane Biopharma Ab Dna construct comprising nucleotide sequences encoding amino acid sequences of certolizumab and pelb signal peptides
MX2024003696A (es) 2021-09-24 2024-05-29 Xbrane Biopharma Ab Construcciones de adn y celulas huespedes para expresar proteinas recombinantes.
SE545714C2 (en) * 2021-09-24 2023-12-19 Xbrane Biopharma Ab Dna contructs for producing a pelb signal peptide
WO2023154799A1 (en) 2022-02-14 2023-08-17 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Combination immunotherapy for treating cancer
JP2025534350A (ja) 2022-09-30 2025-10-15 エクステンド バイオサイエンシズ インコーポレーテッド 長時間作用型副甲状腺ホルモン
WO2024180518A1 (en) * 2023-03-01 2024-09-06 Lupin Limited Process for manufacturing antibody fragment protein
TW202525846A (zh) 2023-08-25 2025-07-01 美商普羅特歐拉吉克適美國公司 抗ｉｌ—１３多特異性抗體構築體及其用途
WO2025099576A1 (en) 2023-11-06 2025-05-15 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treating rheumatoid arthritis

Family Cites Families (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8422238D0 (en) 1984-09-03 1984-10-10 Neuberger M S Chimeric proteins
DK336987D0 (da) 1987-07-01 1987-07-01 Novo Industri As Immobiliseringsmetode
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
GB8719042D0 (en) 1987-08-12 1987-09-16 Parker D Conjugate compounds
US5030570A (en) 1988-06-30 1991-07-09 The Eunice Kennedy Shriver Center For Mental Retardation DNA encoding and method of expressing human monoamine oxidase type A
IL162181A (en) 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
PT92900A (pt) * 1989-01-24 1990-07-31 Sistema de vectores de expressao para a producao de anticorpos monoclonais quimericos
GB8907617D0 (en) 1989-04-05 1989-05-17 Celltech Ltd Drug delivery system
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
GB9109645D0 (en) 1991-05-03 1991-06-26 Celltech Ltd Recombinant antibodies
US5919452A (en) 1991-03-18 1999-07-06 New York University Methods of treating TNFα-mediated disease using chimeric anti-TNF antibodies
GB9112536D0 (en) 1991-06-11 1991-07-31 Celltech Ltd Chemical compounds
GB9120467D0 (en) 1991-09-26 1991-11-06 Celltech Ltd Anti-hmfg antibodies and process for their production
CA2163032C (en) * 1993-06-03 2001-02-06 John Landon Antibody fragments in therapy
NO309690B1 (no) 1995-01-23 2001-03-12 Western Atlas Int Inc Detonasjonsanordning av type eksploderende brotråd for bruk med et perforeringsverktöy i en brönn
AU2365795A (en) 1995-04-20 1996-11-07 Centocor Inc. Multiple administrations of anti-tnf antibody
DK0929578T3 (da) 1996-02-09 2003-08-25 Abbott Lab Bermuda Ltd Humane antistoffer, der binder human TNFalfa
US5980898A (en) 1996-11-14 1999-11-09 The United States Of America As Represented By The U.S. Army Medical Research & Material Command Adjuvant for transcutaneous immunization
GB9625640D0 (en) * 1996-12-10 1997-01-29 Celltech Therapeutics Ltd Biological products
US6350860B1 (en) * 1997-08-18 2002-02-26 Innogenetics N.V. Interferon-gamma-binding molecules for treating septic shock, cachexia, immune diseases and skin disorders
GB9720054D0 (en) * 1997-09-19 1997-11-19 Celltech Therapeutics Ltd Biological products
ATE268609T1 (de) 1998-03-12 2004-06-15 Nektar Therapeutics Al Corp Polyethylenglycolderivate mit benachbarten reaktiven gruppen
GB9812545D0 (en) * 1998-06-10 1998-08-05 Celltech Therapeutics Ltd Biological products
GB0013810D0 (en) * 2000-06-06 2000-07-26 Celltech Chiroscience Ltd Biological products

Also Published As

Publication number Publication date
CZ300737B6 (cs) 2009-07-29
HUP1600016A2 (en) 2002-10-28
HUP0202346A2 (en) 2002-10-28
PT3059314T (pt) 2019-02-01
DK2308975T3 (da) 2016-10-31
PL399351A1 (pl) 2012-12-17
US7012135B2 (en) 2006-03-14
SI2230308T1 (sl) 2013-06-28
BRPI0106682B1 (pt) 2020-10-13
EP2308975B1 (en) 2016-08-10
BR0106682A (pt) 2002-05-14
CY1121173T1 (el) 2020-05-29
EP3059314A1 (en) 2016-08-24
FR10C0015I2 (fr) 2011-12-30
IS2808B (is) 2012-09-15
US20030026805A1 (en) 2003-02-06
DE122010000027I1 (de) 2010-08-12
HUS1700013I1 (hu) 2017-08-28
TWI353358B (en) 2011-12-01
CY2010011I1 (el) 2012-01-25
BG106278A (bg) 2002-12-29
NO20020554D0 (no) 2002-02-04
TW200817430A (en) 2008-04-16
DK1287140T3 (da) 2010-04-19
JP2003535591A (ja) 2003-12-02
PL353960A1 (pl) 2003-12-15
SK3152002A3 (en) 2002-07-02
EP1287140B1 (en) 2009-12-09
ES2230975B2 (es) 2007-04-16
ECSP024210A (es) 2002-05-23
MXPA01013440A (es) 2003-09-04
ZA200200097B (en) 2003-01-06
CY1118220T1 (el) 2017-06-28
IS3016B (is) 2019-10-15
SI2308975T1 (sl) 2016-11-30
BE2010C019I2 (pl) 2020-08-20
CA2707766A1 (en) 2001-12-13
HUP0202346A3 (en) 2004-11-29
CY1109889T1 (el) 2012-01-25
CY2019018I2 (el) 2020-05-29
NZ516596A (en) 2004-07-30
CN1383450A (zh) 2002-12-04
IS6217A (is) 2002-01-03
HK1148776A1 (en) 2011-09-16
US7186820B2 (en) 2007-03-06
TWI316088B (en) 2009-10-21
NO20020554L (no) 2002-04-08
BG66072B1 (bg) 2011-01-31
NO20131316L (no) 2002-04-08
NL300982I9 (nl) 2019-05-06
ES2337763T3 (es) 2010-04-29
JP5185143B2 (ja) 2013-04-17
EP3059314B1 (en) 2018-10-24
US20060233800A1 (en) 2006-10-19
CN1289671C (zh) 2006-12-13
IL195085A0 (en) 2009-08-03
GB0128386D0 (en) 2002-01-16
NO2014026I1 (no) 2014-10-23
GB2366800A (en) 2002-03-20
MY136603A (en) 2008-10-31
CA2380298C (en) 2010-09-28
AP2092A (en) 2010-02-28
PL218516B1 (pl) 2014-12-31
JP2007105043A (ja) 2007-04-26
HUP1600483A2 (pl) 2002-10-28
PT1287140E (pt) 2010-03-08
FR10C0015I1 (pl) 2010-04-16
AR033978A1 (es) 2004-01-21
AU783756B2 (en) 2005-12-01
ES2600080T3 (es) 2017-02-07
CA2380298A1 (en) 2001-12-13
CY1114143T1 (el) 2016-07-27
EP2308975A1 (en) 2011-04-13
NO341218B1 (no) 2017-09-11
NO2014026I2 (no) 2018-02-14
NO339282B1 (no) 2016-11-21
OA12282A (en) 2006-05-11
AU6051101A (en) 2001-12-17
JP4476989B2 (ja) 2010-06-09
LT2308975T (lt) 2016-11-10
AP2002002690A0 (en) 2002-12-31
LU91674I9 (pl) 2019-01-03
HU230669B1 (hu) 2017-07-28
NL300982I1 (pl) 2019-05-01
SI1287140T1 (sl) 2010-04-30
ATE451460T1 (de) 2009-12-15
CY2010011I2 (el) 2012-01-25
TR201900227T4 (tr) 2019-02-21
US7977464B2 (en) 2011-07-12
DK2230308T3 (da) 2013-05-06
HK1051385A1 (en) 2003-08-01
SK288343B6 (sk) 2016-04-01
GB0013810D0 (en) 2000-07-26
DE60140738D1 (de) 2010-01-21
HU230553B1 (hu) 2016-11-28
DK3059314T3 (en) 2019-02-18
ES2707714T3 (es) 2019-04-04
US20080269465A1 (en) 2008-10-30
BRPI0106682B8 (pt) 2021-05-25
PE20020292A1 (es) 2002-05-08
LU91674I2 (fr) 2010-05-31
PT2308975T (pt) 2016-11-14
NO20160694A1 (no) 2002-04-08
JP4064812B2 (ja) 2008-03-19
CZ2002837A3 (cs) 2002-05-15
GB2366800B (en) 2005-01-19
ES2230975A1 (es) 2005-05-01
EP2230308B1 (en) 2013-01-23
EP1287140A1 (en) 2003-03-05
IL147992A0 (en) 2002-09-12
JP2009171966A (ja) 2009-08-06
NO334808B1 (no) 2014-06-02
EP2230308A1 (en) 2010-09-22
PT2230308E (pt) 2013-05-03
RU2303604C2 (ru) 2007-07-27
IL147992A (en) 2009-06-15
CA2707766C (en) 2013-05-21
HU230561B1 (hu) 2016-12-28
US7402662B2 (en) 2008-07-22
CY2019018I1 (el) 2020-05-29
US20020151682A1 (en) 2002-10-17
DE10192353T1 (de) 2003-05-22
KR20020047097A (ko) 2002-06-21
ES2403217T3 (es) 2013-05-16
WO2001094585A1 (en) 2001-12-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP3059314B1 (en) Antibody molecules having specificity for human tumor necrosis factor alpha, and use thereof
HK1228449B (en) Antibody molecules having specificity for human tumor necrosis factor alpha, and use thereof
HK1228449A1 (en) Antibody molecules having specificity for human tumor necrosis factor alpha, and use thereof
HK1156657A (en) Antibody molecules having specificity for human tumor necrosis factor alpha, and use thereof
HK1156657B (en) Antibody molecules having specificity for human tumor necrosis factor alpha, and use thereof
HK1051385B (en) Antibody molecules having specificity for human tumor necrosis factor alpha, and use thereof
HK1148776B (en) Antibody molecules having specificity for human tumor necrosis factor alpha, and use thereof