PT2225233E - Derivados de oxadiazole activos sobre a esfingosina-1- fosfato (s1p) - Google Patents

Description

ΡΕ2225233 1

DESCRIÇÃO "DERIVADOS DE OXADIAZOLE ACTIVOS SOBRE A ESFINGOSINA-1- FOSFATO (S1P)" A presente invenção relaciona-se com um novo derivado de oxadiazole possuindo actividade farmacológica, com composições farmacêuticas que o contenham e com a sua utilização no tratamento de diversos distúrbios. 0 1-fosfato de esfingosina (S1P) é um mediador lipidico bioactivo formado pela fosforilação de esfingosina por esfingosina quinases e é encontrado em niveis elevados no sangue. É produzido e secretado por diversos tipos de células, incluindo as de origem hematopoieticas, como as plaquetas e mastócitos (Okamoto et al., 1998, J. Biol. Chem. 273 (4) :27104; Sanchez e Hla, 2004, J. Cell Biochem, 92:913). Tem uma grande variedade de acções biológicas, incluindo a regulação da proliferação celular, diferenciação, motilidade, vascularização e activação de células inflamatórias e plaquetas (Pyne e Pyne, 2000, Biochem. J., 349:385). Foram descritos cinco subtipos de receptores que respondem ao S1P, os S1P1 (Edg-1), S1P2 (Edg-5), S1P3 (Edg-3), S1P4 (Edg-6) e S1P5 (Edg-8), formando parte da família de receptores dos genes de diferenciação endotelial ligado à proteína G (Chun et al., 2002, Pharmacological Reviews, 54:265, Sanches e Hla, 2004, 2 ΡΕ2225233 J. Cellular Biochemistry, 92:913). Estes 5 receptores mostram expressão diferencial no mRNA, sendo os S1P1-3 largamente expressos, o S1P4 expresso nos tecidos linfóides e hematopoiéticos e o S1P5 basicamente no cérebro e, em mais baixo grau, no baço. Esles sinalizam via deferentes subconjuntos de proteínas G para promoverem uma variedade de respostas biológicas (Kluk e Hla, 2002, Biochem et Biophysica Acta 1582:72, Sanches e Hla, 20034, J. Cellular Biochem. 92:913) .

Os papeis propostos para o receptor S1P1 incluem o tráfico linfocitário, indução/supress°ao de citoquinas e efeitos sobre as células endoteliais (Rosen e Goetzl, 2005, Nat. Ver. Immunol., 5:560). Os agonistas do receptor SlPl têm sido utilizados em diversos modelos animais autoimunes e de transplante, incluindo modelos MS de Encefalomielite Autoimune Experimental (EAE), para reduzir a gravidade da doença induzida (Brinkman et al., 2003, JBC, 277:21453; Fujino et al., 2003, J. Pharmacol. Exp. Ther., 30570; Webb et al., 2004, J. Neuroimmunol., 153:108; Rausch et al., 2004, J. Magn. Reson. Imaging, 20:16). Esta actividade é reportada como sendo mediada pelo efeito de agonistas SlPl sobre a circulação de linfócitos através do sistema linfático. O tratamento com agonistas SlPl resulta no sequestro de linfócitos em órgãos linfóides secundários, tais como os nódulos linfáticos, induzindo uma linfopenia periférica reversível, em modelos animais (Chiba et al., J. Immunology, 160:5037, Forrest et al., 2004, J. Pharmacol. Exp. Ther., 309:758; Sanna et al., 2004, JBC, 279:13839). Os dados publicados sobre os agonistas sugerem que o 3 ΡΕ2225233 composto de tratamento induz a perda do receptor S1P1 da superfície das células, por internalização (Graler e Goetzl 2004, FASEB J., 18:551; Matloubian et al., 2004, Nature, 427:355; Jo et al., 2005, Chem. Biol. 12:703) e que é esta redução de receptores S1P1 sobre as células imunes que contribui para a redução do movimento de células T desde os nódulos linfáticos para a corrente sanguínea. O desaparecimento do gene S1P1 provoca letalidade embriónica. Experiência par se examinar o papel do receptor S1P1 sobre a migração e tráfego dos linfócitos, incluíram a transferência adaptativa de células T com deficiência em S1P1, marcadas, para murganhos de tipo selvagem. Estas células mostraram uma reduzida saída a parti de órgãos linfóides secundáros (Matloubian et al., 2004, Nature, 427:355).

Também foi atribuído ao S1P1 um papel na modulação da junção de células endoteliais (Allende et al., 2003, 102:3665, Blood, Singleton et al., 2005, FASEB J., 19:1646). Em relação a esta acção endotelial, tem sido relatado que os agonistas S1P1 possuem um efeito sobre nódulos linfáticos isolados, o que pode contribuir para um papel na modulação de distúrbios imunes. Os agonistas S1P1 provocaram o fecho dos "portões" dos estromas endoteliais nos seios linfáticos que drenam os nódulos linfáticos evitando o escoamento de linfócitos (Wei et al., 2005, Nat. Immunology, 6:1228).

Demonstrou-se que o composto imunossupressivo 4 ΡΕ2225233 FTY720 (JP1108Ο026-A) diminui os linfócitos circulantes em animais e no homem, possui actividade moduladora da doença em modelos animais de distúrbios imunes e reduz as taxas de remissão em relapso de remissão na esclerose múltipla (Brinkman et al., 2002, JBC, 277:21453, Mandala et al., 2002, Science, 296:346, Fujino et al., 2003, J.Pharma-cological and Experimental Therapeutics, 305: 45658, Brinkman et al., 2994, American J. Transplantation, 4: 1019, Webb et al., 2004, J. Neuroimmonology, 153:108, Morris et al., 2005, Eur. J. Immunol., 35:3570, Chiba, 2005, Pharma-cology and Therapeutics, 108:308, Kahan et al., Transplantation, 76:1079, Kappos et al., 2006, New Eng. J. Medicine, 335:1124). Este composto é um profármaco que é fosforilado in vivo por esfingosina quinases para dar uma molécula que possui actividade agonista dos receptores S1P1, S1P3, S1P4 e S1P5. Os estudos clínicos demonstraram que o tratamento com FTY720 resulta em braquicardia nas primeiras 24 horas de tratamento (Kappos et al., 2006, New Eng. J. Medicine 335:1124). Julga-se que a bradicardia é devida ao agonismo do receptor S1P3, com base em diversas experiências com células e modelos animais. Estes incluem a utilização de animais com anulação dos S1P3 que, ao contrário do murganho selvagem, não demonstram bradicardia após administração do FTY720 e a utilização de compostos selectivos para os S1P1 (Hale et al., 2004, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 14:3501, Sanna et al., JBC, 279:13839, Koyrakh et al., 2005, American J. Transplantation, 5:529). 5 ΡΕ2225233

Assim, existe uma necessidade de compostos agonistas para o receptor S1P1 com selectividade sobre o S1P3, que se pode esperar, exiba uma tendência reduzida para induzir bradicardia.

Os pedidos de patente que se seguem descrevem derivados de oxadiazole como agonistas S1P1; W003/105771, WO05/058848, WO06/047195, WO06/100633, WO06/115188, WO06/131336, WO07/024922 w WO07/116866.

Os pedidos de patente que se seguem descrevem derivados de tetra-hidroisoquinolinil-oxadiazole como agonistas do receptor SP1: WO06/064757, W006/001463 e W004/113330.

Cooke et al. (Annual Reports in Medicinal Chemistry, 2007, vol. 42, p. 245-263) identifica a necessidade de agonistas selectivos S1P1 e revela compostos que se sabe serem selectivos no receptor S1P1 sobre o receptor S1P3.

Foi agora encontrada uma nova classe estrutural de compostos que proporciona agonistas do receptor S1P1.

Consequentemente, a presente invenção proporciona um composto, o ácido 3-[6-(5-{3-ciano-4-[(1-metiletil)oxi]-fenil}-l,2,4-oxadiazol-3-il)-5-metil-3,4-di-hidro-2(1H)-isoquinolinil]propanóico ou um sal farmaceuticamente aceitável seu derivado. 6 ΡΕ2225233

Deve tomar-se em consideração que o composto da invenção pode conter tanto grupos ácido como básicos e consequentemente existir como zwiterião a certos valores de PH. A invenção inclui qualquer sal, ester ou sal de tal ester, farmaceuticamente aceitável, do composto da invenção que, aquando administração a um receptor, seja capaz de proporcionar (directa ou indirectamente) um composto de fórmula (I) ou um seu metabolito ou residuo activo. 0 composto da invenção pode formar sais. Será tomado em consideração que para utilização em medicina, os sais do composto da invenção devem ser farmaceuticamente aceitáveis. Sais farmaceuticamente aceitáveis serão óbvios para os técnicos da matéria e incluem os descritos em J. Pharm. Sei., 1977, 66, 1-19, tais como os sais de adição de ácido formados com ácidos inorgânicos, e.g., ácido clorídrico, bromidrico, sulfúrico, nitrico ou fosfórico; e ácidos orgânicos, e.g., ácido succinico, maleico, acético, fumárico, citrico, tartárico, benzóico, p-toluenossulfó-nico, metanossulfónico ou naftalenossulfónico. Alguns dos 7 ΡΕ2225233 compostos de fórmula(I) podem formar sais de adição de ácido com um ou mais equivalentes de ácido. A presente invenção inclui no seu âmbito todas as possivesi formas estequiométricas e não estequiométricas. Os sais também podem ser preparados a partir de bases farmaceuticamente aceitáveis, incluindo bases inorgânicas e orgânicas. Os sais derivados de bases inorgânicas incluem os sais de alumínio, amónio, cálcio, cobre, férrico, ferroso, lítio magnésio, sais mangânicos, manganosos, sódio, potássio, zinco e outros do mesmo tipo. Os sais derivados de bases farmaceuticamente aceitáveis incluem sais de aminas primárias, secundárias e terciárias; aminas substituídas, incluindo aminas substituídas de ocorrência natural; e aminas cíclicas. As bases orgânicas farmaceuticamente aceitáveis particulares incluem arginina, betaína, cafeína, colina, N,N'-dibenziletilenodiamina, dietilamina, 2-dietil-aminoetanol, 2-dimetilaminoetanol, etanolamina, etileno-diamina, N-etil-morfolina, N-etilpiperidina, glucamina, glucosamina, histidina, hidrabamina, isopropilamina, lisi-na, metilglucamina, morfolina, piperazina, piperidina, pro-caína, purinas, teobromina, trietilamina, trimetilamina, tripropilamina, tris(hidroximetil)aminometano (TRIS, trome-tanol) e outras do mesmo tipo. Os sais também podem ser formados a partir de resinas básicas de troca iónica, por exemplo, resinas de poliamida.

Os sais farmaceuticamente aceitáveis de adição podem ser preparados de forma convencional, por reacção com o ácido ou derivado ácido apropriado. Os sais farmaceut- 8 ΡΕ2225233 icamente aceitáveis com bases podem ser preparados convencionalmente por reacção com a base inorgânica ou orgânica apropriada. 0 composto da invenção pode ser preparado em forma cristalina ou não cristalina e, se cristalina, pode, opcionalmente, ser hidratada ou solvatada. A invenção inclui no seu âmbito os hidratos ou solvatos estequiomé-tricos, assim como os compostos contendo quantidades variáveis de água e/ou solvente.

Estão incluidos no âmbito da invenção todos os sais, solvatos, hidratos, complexos, polimorfos, derivados radioactivamente marcados, de compostos da invenção.

As potências e eficácias do composto desta invenção para o eceptor S1P1, podem ser determinadas por um ensaio com GTPyS com o receptor humano clonado, como aqui descrito. 0 composto da invenção demonstrou actividade agonista no receptor S1P1, utilizando os ensaios funcionais aqui descritos. asma 0 composto da invenção e seus sais farmaceu-ticamente aceitáveis têm, consequentemente, actividade no tratamento de condições ou distúrbios mediados via receptor S1P1. Os compostos da invenção e seus sais farmaceu-ticamente aceitáveis são, em particular, de utilidade no tratamento de esclerose múltipla, doenças autoimunes, distúrbios inflamatórios crónicos, asma, neuropatias infla- 9 ΡΕ2225233 matórias, artrite, transplantes, doença de Crohn, colite ulcerosa, lúpus eritematoso, psoriase, lesões isquémicas-de reperfusão, tumores sólidos e metástases tumurais, doenças associadas com angiogénese, doenças vasculares, condições dolorosas, doenças virais agudas, condições inflamatórias do intestino, diabetes dependente e não dependente de insulina (daqui em diante referidas como os "Distúrbios da Invenção"). 0 composto da invenção e os seus sais farma-ceuticamente aceitáveis são, assim, úteis no tratamento de lúpus eritematoso. 0 composto da invenção e os seus sais farma-ceuticamente aceitáveis são, assim, úteis no tratamento de psoriase. 0 composto da invenção e os seus sais farma-ceuticamente aceitáveis são, assim, úteis no tratamento de esclerose múltipla.

Deve tomar-se em consideração que "tratamento", tal como aqui utilizado, inclui a profilaxia, assim como o alivio de sintomas estabelecidos.

Assim, a invenção proporciona o composto da invenção ou os seus sais farmaceuticamente aceitáveis para utilização como substâncias terapêuticas, em particular no tratamento das condições ou distúrbios mediados via rece- 10 ΡΕ2225233 ptor S1P1. A invenção proporciona, em particular, um composto da invenção ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, para utilização como substância terapêutica no tratamento de esclerose múltipla, doenças autoimunes, distúrbios inflamatórios crónicos, asma, neuropatias inflamatórias, artrite, transplantes, doença de Crohn, colite ulcerosa, lupus eritematoso, psoríase, lesões isquémicas-de reperfusão, tumores sólidos e metástase tumoral, doenças associadas com angiogénese, doenças vasculares, condições dolorosas, doenças virais agudas, condições inflamatórias do intestino, diabetes dependente e não dependente de insulina. O ceuticamente terapêuticas composto da invenção e os seus sais farma-aceitáveis têm utilidade como substâncias no tratamento de lupus eritematoso. seus sais farma-como substâncias O composto da invenção e os ceuticamente aceitáveis têm utilidade terapêuticas no tratamento de psoríase. invenção e os têm utilidade de esclerose seus sais farma-como substâncias múltipla. O ceuticamente terapêuticas composto da aceitáveis no tratamento

Noutro aspecto, a invenção proporciona a utilização de um composto da invenção ou de um seu sal farmaceuticamente aceitável, na manufactura de um medicamento para utilização no tratamento e condições ou distúrbios mediados via receptor S1P1. 11 ΡΕ2225233 A invenção proporciona, em particular, o composto da invenção ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, para utilização na manufactura de um medicamento para utilização no tratamento de esclerose múltipla, doenças autoimunes, distúrbios inflamatórios crónicos, asma, neuropatias inflamatórias, artrite, transplantes, doença de Crohn, colite ulcerosa, lupus eritematoso, psoríase, lesões isquémicas-de reperfusão, tumores sólidos e metástases tumorais, doenças associadas com angiogénese, doenças vasculares, condições dolorosas, doenças virais agudas, condições inflamatórias do intestino, diabetes dependente e não dependente de insulina. 0 composto da invenção e os seus sais farma-ceuticamente aceitáveis têm utilidade na manufactura de um medicamento para utilização no tratamento de lupus eritematoso . 0 composto da invenção e os seus sais farma-ceuticamente aceitáveis têm utilidade na manufactura de um medicamento para utilização no tratamento de psoríase. 0 composto da invenção e os seus sais farma-ceuticamente aceitáveis têm utilidade na manufactura de um medicamento para utilização no tratamento de esclerose múltipla.

De modo a utilizar o composto da invenção ou os 12 ΡΕ2225233 seus sais farmaceuticamente aceitáveis em terapia, eles serão, normalmente, formulados numa composição farmacêutica de acordo com a prática farmacêutica corrente. A presente invenção também proporciona uma composição farmacêutica compreendendo o composto da invenção ou um seu sal farma-ceuticamente aceitável e um veiculo ou excipiente farma-ceuticamente aceitável.

Noutro aspecto, a presente invenção proporciona um processo para preparação de uma composição farmacêutica, compreendendo o processo a mistura do composto da invenção ou de um seu sal farmaceuticamente aceitável com um veiculo ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

Uma composição farmacêutica da invenção, que pode ser preparada por mistura, adequadamente à temperatura ambiente e à pressão atmosférica, é geralmente adaptada para administração oral, parenteral ou rectal e, como tal, pode tomar a forma de comprimidos, cápsulas, preparações liquidas orais, pós, grânulos, lozangos, pós reconsti-tuíveis, soluções injectáveis ou infusiveis ou suspensões ou supositórios. As composições oralmente administráveis são geralmente preferidas.

Os comprimidos e cápsulas para administração oral pode ser uma forma de dosagem unitária e pode conter excipientes convencionais, tais como agentes ligantes (e.g., amido de milho pregelatinizado, polivinilpirrolidona ou hidroxipropil metilcelulose); agentes de volume (e.g., 13 ΡΕ2225233 lactose, celulose microcristalina ou hidrogeno fosfato de cálcio); lubrificantes de compressão (e.g., estearato de magnésio, talco ou silica); desintegrantes (e.g., amido de batata ou amido glicolato de sódio); e agentes molhantes aceitáveis (e.g., lauril sulfato de sódio). Os comprimidos também podem ser revestidos de acordo com métodos bem conhecidos na prática farmacêutica vulgar.

As preparações liquidas orais podem tomar a forma, por exemplo, de suspensões aquosas ou oleosas, soluções, emulsões, xaropes ou elixires, ou podem estar na forma de um produto seco para reconstituição dom água ou outro veiculo adequado antes da utilização. Tais preparações liquidas podem conter aditivos convencionais, como agentes de suspensão (e.g., xarope de sorbitol, derivados de celulose ou gorduras hidrogenadas ediveis, agentes emulsionantes (e.g., lecitina ou acácia), veiculos não aquosos (que podem incluir óleos ediveis, e.g., óleo de amêndoa, esteres oleosos, álcool etilico ou óleos vegetais fraccionados) , conservantes (e.g., metil ou propil-p-hidro-xibenzoatos ou ácido sórbico) e, se desejado, aromatizantes ou corantes convencionais, sais tampão e agentes edulco-rantes, como apropriado. As preparações para administração oral podem ser adequadamente formuladas para conceder uma libertação controlada do composto activo.

Para administração parenteral, as formas fluidas de dosagem unitária são preparadas utilizando o composto da invenção ou os seus sais farmaceuticamente aceitáveis e um 14 ΡΕ2225233 veículo estéril. As formulações para injecção podem ser apresentadas em forma de dosagem unitária, e.g., em ampolas, ou como multi-dose, utilizando um composto da invenção ou um seu derivado farmaceuticamente aceitável e um veículo estéril, opcionalmente com um conservante adicionado. As composições podem tomar formas como suspensões, soluções ou emulsões em veículos oleosos ou aquosos, e podem conter agentes de formulação, tais como agentes de suspensão, estabilizantes e/ou dispersantes. Alternativamente, o ingrediente activo pode estar sob a forma de pó para constituição com um veículo adequado, e.g., água estéril, sem pirógenos, antes da utilização. 0 composto, dependendo do veículo e concentração utilizados, pode ser ou suspenso ou dissolvido no veículo. Na preparação das soluções, o composto pode ser dissolvido para injecção e esterilizado por filtragem antes de ser colocado num frasco ou ampola adequado e selado. É vantajoso que os adjuvantes, tais como anestésico local, conservantes e agentes tampão, estejam dissolvidos no veículo. Para melhorar a estabilidade, a composição pode ser congelada após ter sido colocada no frasco, e a água removida sob vácuo. As suspensões parenterais são preparadas substancialmente da mesma forma, excepto por o composto ser suspenso no veículo, em vez de ser dissolvido, e a esterilização não poder ser efectuada por filtração. 0 composto pode ser esterilizado por exposição a óxido de etileno antes da suspensão num veículo estéril. Um surfactante ou um agente molhante é, vantajosamente, incluído na composição, para facilitar a distribuição uniforme do composto. 15 ΡΕ2225233

As loções podem ser formuladas com uma base aquosa ou oleosa e conterão, geralmente, um ou mais agentes emulsionantes, agentes estabilizantes, agentes dispersan-tes, agentes de suspensão, agentes espessantes ou agentes corantes. Podem ser formuladas gotas com uma base aquosa ou não aquosa, compreendendo também um ou mais agentes de dispersão, agentes estabilizantes, agentes solubilizantes ou agentes de suspensão. Podem também conter um conservante . 0 composto da invenção ou o seu sal farmaceu-ticamente aceitável, pode ser também formulado em composições rectais, tais como supositórios ou enemas de retenção, e.g., contendo bases convencionais para supositórios, tal como manteiga de cacau ou outros glicéridos. 0 composto da invenção ou os seus sais farmaceu-ticamente aceitáveis também podem ser formulados como preparações "depot". Tais formulações de acção prolongada podem ser administradas por implantação (por exemplo, subcutaneamente ou intramuscularmente) ou por injecção intramuscular. Assim, por exemplo, os compostos da invenção podem ser formulados com materiais poliméricos ou hidrofóbicos adequados (por exemplo, como emulsão num óleo aceitável) ou resinas de troca iónica ou como derivados pouco solúveis, por exemplo, como um sal fracamente solúvel. 16 ΡΕ2225233

Para administração intranasal, o composto da invenção ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, pode ser formulado em como soluções para administração via um dispositivo adequado de medição de dose ou dose unitária ou, alternativamente, como um pó em mistura com um veiculo adequado, utilizando um dispositivo de libertação adequado. Assim, os compostos da invenção ou os seus sais farma-ceuticamente aceitáveis, podem ser formulados para administração oral, bucal, parenteral, tópica, (incluindo oftálmica e nasal), "depot" ou rectal, ou numa forma adequada para administração por inalação insuflação (através da boca ou nariz).

Os compostos de fórmula (I) ou os seus sais farmaceuticamente aceitáveis, podem ser formulados para administração tópica, sob a forma de pomadas, cremes, geles, loções, pessários, aerossóis ou gotas (e.g., gotas oculares, para o ouvido ou nasais) . As pomadas e cremes podem ser formulados com uma base aquosa ou oleosa, com a adição dos agentes espessantes e/ou gelificantes adequados. As pomadas para administração ocular podem ser manufacturadas de forma estéril, utilizando componentes esterilizados . A composição pode conter entre 0,1% e 99% em peso, preferencialmente de 10 a 60% em peso, de material activo, dependendo do método de administração. A dose do composto utilizado no tratamento dos distúrbios anterior-mente mencionados, variará, da forma usual, com a gravidade 17 ΡΕ2225233 do distúrbio, do peso do paciente e outros factores similares. Contudo, como guia geral, as doses unitárias adequadas podem conter 0,05 a 1000 mg, 1,0 a 500 mg ou 1,0 a 200 mg e tais doses unitárias podem ser administradas mais do que uma vez por dia, por exemplo, duas ou três vezes por dia. O composto da invenção ou os seus sais farmaceu-ticamente aceitáveis podem ser utilizados em preparações combinadas. Por exemplo, o composto pode ser utilizado em combinação com ciclosporina A, metotrexato, esteróides, rapamicina, inibidores de citoquina próinflamatória, imuno-moduladores, incluindo os biológicos ou outros compostos terapeuticamente activos. A invenção também inclui compostos isotópicamente marcados, que são idênticos aos compostos da invenção, excepto pelo facto de um ou mais átomos terem sido substituídos por um átomo possuindo uma massa atómica ou número de massa diferente da massa atómica ou número de massa vulgarmente encontrado na natureza. Exemplos de isótopos que podem ser incorporados nos compostos da invenção incluem isótopos de hidrogénio, carbono, azoto, oxigénio, fósforo, flúor, iodo e cloro, tais como 3H, nC, 14C, 18F, 123I e 125I. O composto da presente invenção e os sais farmaceuticamente aceitáveis dos referidos compostos, que contenham isótopos acima mencionados e/ou outros isótopos 18 ΡΕ2225233 de outros átomos estão englobados no âmbito da presente invenção. Os compostos isotópicamente marcados da presente invenção, por exemplo aqueles em que foi incorporados o 1 Λ r. e., isótopos radioactivos tais como He C, são uteis em ensaios de distribuição de fármaco e/ou substrato nos tecidos. Os isótopos de tritio, i.e. 3H e de carbono 14, 14C, são particularmente preferidos pela sua faci- lidade de preparação e detectabilidade. Os isótopos nC e °F são particularmente úteis em PET (tomografia por emissão de positrões) e os isótopos de 125I são particularmente úteis em SPECT (tumografia computadorizada por emissão de fotão único), ambos únicos ma imageologia do cérebro. Adicionalmente, a substituição com isótopos mais pesados, como o deutério, i.e., 2H, pode conceder algumas vantagens terapêuticas resultantes de maior estabilidade metabólica, por exemplo, aumento da semi-vida in vivo ou necessidade de menor dosagem e, por isso, poderem ser preferidos em algumas circunstâncias. 0 composto isotópicamente marcado da invenção seguindo-se esta invenção, podem no geral, ser preparados realizando os procedimentos revelados nos Esquemas e/ou Exemplos abaixo., substituindo-se um reagente isotópicamente marcado disponibilizado no mercado por um reagente isotópicamente não marcado.

Num outro aspecto, este pedido descreve processos para a preparação de compostos similares ao composto da invenção, em que Ri, R2, R4 e A são como definidos para o composto da invenção, n é 3, hal é cloro, bromo ou iodo, P é um grupo 19 ΡΕ2225233 de protecção e R representa um grupo alquilo (e.g., etilo ou terc-butilo).

Esquema 1

Os compostos de fórmula (ii) (preparados, por exemplo, como descrito em Tetrahedron (2006), 62 (29), 6869-6875) pode ser convertido num derivado protegido adequado (iii) , em que P é, por exemplo, t-butiloxicarbonilo, utilizando um reagente de protecção adequado, tal como dicarbonato de bis(1,1-dimetiletilo). Os compostos de fórmula (iii) podem ser convertidos em compostos de fórmula (iv) por reacção com hidroxilamina em presença de uma base adequada, como o bicarbonato de sódio. Os compostos de 20 ΡΕ2225233 fórmula (iv) podem ser convertidos em compostos de fórmula (vi) por reacção com um cloreto ácido de fórmula (v) , em presença de uma base adequada, como a W^W-diisopro-piletilamina, opcionalmente em presença de um catalisador, como a 4-dimetilaminopiridina. A reacção pode ser realizada inicialmente à temperatura ambiente, seguindo-se aquecimento para se efectuar a ciclização do oxadiazole. Os compostos de fórmula (vi) podem ser desprotegidos, para dar compostos de fórmula (vii), por exemplo com um ácido adequado, como o ácido clorídrico, em que P representa t-butoxicarbonilo. Os compostos de fórmula (vii) podem ser convertidos em compostos de fórmula (ix) por reacção com um agente alquilante de fórmula (viii), em presença de uma base adequada, como o carbonato de césio. Os compostos de fórmula (ix) podem ser convertidos em alguns compostos de fórmula (I) por hidrólise com uma base adequada, como o hidróxido de lítio ou (para R = t-butilo) um ácido adequado, como o ácido clorídrico ou ácido trifluoro-acético. Os compostos de fórmula (v) são ou compostos conhecidos ou que podem ser preparados por meios convencionais a partir dos ácidos correspondentes, que são, eles próprios, compostos conhecidos ou que podem ser preparados por meios convencionais.

Os compostos de fórmula (iii) em que R2 está na posição 5 e o grupo ciano está na posição 6 do sistema de anéis da tetra-hidroisoquinolina, podem ser preparados como mostrado no Esquema 2, em que Ri é como definido para a fórmula (I), R4 é hidrogénio e P é um grupo de protecção. ΡΕ2225233 21 -

Esquema 2

Os compostos de fórmula (x) podem ser convertidos em compostos de fórmula (xii) por reacção com nitrometano, em presença de uma base adequada, como o acetato de amónio. Os compostos de fórmula (xi) podem ser convertidos rm compostos de fórmula (xii) por redução com um agente redutor adequado, como o boro-hidreto de litio em presença de clorotrimetilsilano. Os compostos de fórmula (xii) podem ser convertidos em compostos de fórmula (xii) por reacção com um agente formilante adequado, como o formato de etilo. Os compostos de fórmula (xiii) podem ser convertidos em compostos de fórmula (xiv) por reacção com uma fonte adequada de formaldeido, como o paraformaldeido, em presença 22 ΡΕ2225233 de um catalisador ácido adequado, como o ácido fórmico. Os compostos de fórmula (xiv) podem ser convertidos em compostos de fórmula (xv) por reacção com um agente desme-tilante adequado, como o tribrometo de boro.

Os compostos de fórmula (xv) podem ser convertidos em derivados protegidos adequados, de fórmula (xvi), em que P é, por exemplo, t-butoxicarbonilo, utilizando um reagente de protecção adequado, como o dicarbonato de bis(1,1-dimetiletilo). Os compostos de fórmula (xvi) podem ser convertidos em compostos de fórmula (xvii) , por reacção com um agente de trifluorometanossulfonação adequado, como o anidrido trifluorometanossulfónico.

Os compostos de fórmula (xvii) podem ser convertidos em compostos de fórmula (iii) (em que R2 está na posição 5, R4 é hidrogénio e o grupo ciano está na posição 6) , por reacção com uma fonte de ciano adequada, como o cianeto de zinco, em presença de um catalisador adequado, como o tetraquis(trifenilfosfina)paládio(0).

As Descrições e Exemplos que se seguem ilustram a preparação dos compostos da invenção.

Abreviaturas: g - gramas mg - miligramas mL - mililitros ΡΕ2225233 23 μΕ - microlitros MeCN - acetonitrilo MeOH - metanol EtOH - etanol Et20 - éter dietilico EtOAc - acetato de etilo DCM - diclorometano DIAD - azodicarboxlato de di-isopropilo DIPEA - W/W-diisopropiletilamina DMAP - N, N- dimeti1-4-piridinamina DME - 1,2-bis(metiloxi)etano DMF - N,N- dimetilformamida DMSO - sulfóxido de dimetilo EDAC - cloridrato de N- (3-dimetilamino propil)-N'-etilcarbodiimida EDC - cloridrato de N-(3-dimetilamino propil)-N '-etilcarbodiimida EDCI - cloridrato de N-(3-dimetilamino propil)-N '-etilcarbodiimida HOBT/HOBt - hidroxibenzotriazole IPA - álcool isopropilico NCS - N-clorosuccinimida ΡγΒΟΡ - hexafluorofosfato de benzotriazol 1-il-oxitripirrolidinofosfónio THF - tetra-hidrofurano dba - dibenzilidenoacetona TA - temperatura ambiente °C - graus Celsius M - Molar ΡΕ2225233 - 24 - Η -s -d -t - q - MHz -MeOD -LCMS - LC/MS - MS -ES - MH+ -MDAP - sat. -Boc - SCX ou SCX-3 protão singuleto dubleto tripleto quarteto megahertz metanol deuterado

Cromatografia Líquida Espectrome-tria de Massa

Cromatografia Líquida Espectrome- tria de Massa espectrometria de mass electrospray massa do ião + H+ cromatografia líquida preparativa automatizada dirigida pela massa saturado terc-butiloxicarbonilo coluna de extracção em fase sólida (SPE) com resíduos de ácido ben- zenossulfónico imobilizados sobre

a fase sólida (e.g., colunas IST

Isolute™)

Secção de quimica geral

Os métodos descritos abaixo são fornecidos com fins ilustrativos, podendo os intermediários na preparação dos exemplos, não terem necessariamente sido preparados a partir dos lotes específicos descritos. ΡΕ2225233 25

Preparação 1 2-Metil-l-(metiloxi)3-((E)-2-nitroetenil]benzeno

f

Adicionou-se acetato de amónio (6,16 g; 80 mmol) a uma solução de 2-metil-3-(metiloxi)-benzaldeído (disponível em Allichem Product List; 20 g; 133 mmol) em nitrometano (400 mL), agitou-se a mistura laranja resultante durante lha 100°C, arrefeceu-se até à temperatura ambiente e concentrou-se in vacuo. Repartiu-se o resíduo entre acetato de etilo (x2) e solução aquosa saturada de cloreto de sódio, lavaram-se as camadas orgânicas com solução aquosa saturada de cloreto de sódio, secou-se (MgSCd) e concentrou-se in vacuo. A trituração com diclorometano/éter deu o composto em epígrafe como um sólido amarelo (6,6 g). 2H RMN (CDC13) δ: 8,35 (d, 1H) , 7,48 (d, 1H) , 7,22 2,33 (t, 1H), 7,11 (d, (s, 3H). 1H) , 6, 96 (d, 1H) , 3,86 (s, 3H) ,

Após evaporação da água-mãe obteve-se mais produto (7,22g) por trituração com éter dietilico. Evaporou-se novamente a água-mãe e purificou-se o resíduo por 26 ΡΕ2225233 de acetato de etilo em produto (3,45g), após cromatografia, eluindo com 5-10% ciclo-hexano, para dar mais trituração com éter.

Preparação 2 {2-[2-Metil-3-(metiloxi)fenil]etil}amina

Adicionou-se gota a gota, ao longo de 0,5 min., clorotrimetilsilano (1,02 mL; 8,00 mmol) a boro-hidreto de sódio (2M em THF; 2,0 mL; 4,0 mmol) (turvo), à temperatura ambiente. Formou-se um precipitado e após cerca de 3 min adicionou-se gota a gota, via uma seringa e ao longo de 5 min., 2-metil-l-(metiloxi)-3-[(E)-2-nitroetenil]-benzeno (Preparação 1, 193 mg; 1,0 mmol) em THF (4 mL) , certificando-se que a temperatura se mantinha a ca. 25°C (utilizando um banho de água fria). Agitou-se a solução à temperatura ambiente até ao dia seguinte. Arrefeceu-se a mistura num banho de gelo, adicionou-se lentamente metanol e removeu-se o solvente in vacuo. Repartiu-se o residuo entre solução aquosa a 25% de hidróxido de sódio e diclorometano. Separou-se a fase aquosa, extraiu-se três vezes com diclorometano e evaporaram-se as fases orgânicas combinadas. A purificação do resíduo por extracção em fase sólida (coluna SCX), eluindo com metanol seguido por amónia 27 ΡΕ2225233 2Ν em metanol e após a evaporação da fracção contendo a amónia, deu o composto em epígrafe. (80 mg). 1H RMN (CDC13) δ: 7,10 (t, 1H) , 6, 78 (d, 1H) 6,73 (d, 1H) , 3,81 (s, 3H) , 2,91 (t, 2H) , 2,77 (t, 2H) 2,18 (s, 3H), 1,76 (s largo, 2H).

Preparação 3 {2-[2-Metil-3-(metiloxi)fenil]etil}formamida

Aqueceu-se {2-[2-metil-3-(metiloxi) fenil] etil}-amina (Preparação 2; 1,75 g; 10,6 mmol) em refluxo, com formato de etilo (97%; 15 mL) durante 15 h. A remoção do solvente deu o produto cru (ca. 2 g) , que foi purificado por cromatografia em sílica gel, eluindo com um gradiente de 13-63% de acetato de tilo em ciclo-hexano, para dar o composto em epígrafe (1,57 g). MS m/z 194 [MH+]

Preparação 4 5-Metil-6-(metiloxi)-3,4-di-hidro-2(1H)-isoquino-linocarbaldeído 28 ΡΕ2225233

Adicionou-se paraformaldeido (0,315 g; 10,5 mmol) a uma solução de {2-[2-metil-3-(metiloxi)fenil]-etil}for-mamida (Preparação 3; 1,93 g; 10,0 inmol) em ácido fórmico (20 mL) e aqueceu-se a mistura resultante em refluxo (100°C) durante 20 min.

Arrefeceu-se rapidamente a mistura até à temperatura ambiente com água gelada e removeu-se o solvente. A purificação por cromatografia em sílica gel, eluindo com um gradiente de metanol em diclorometano, deu o composto em epígrafe como um sólido branco (1,64 g, que foi utilizado sem purificação adicional. MS m/z 20 6 [MH+]

Preparação 5 5-Metil-l,2,3,4-tetra-hidro-6-isoquinolinol

m

Adicionou-se lentamente tribrometo de boro (9,09 29 ΡΕ2225233 g; 36,3 iranol) a uma solução de 5-metil-6-(metiloxi)-3,4-di-hidro-2(1H)-isoquinolinocarbaldeído (Preparação 4; 1,49 g; 7,26 mmol) em diclorometano (25 mL) , a 0°C e sob azoto. Após 85 min. a 0°C, adicionou-se lentamente metanol (25 mL) e deixou-se a mistura resultante em repouso à temperatura ambiente durante 3 dias. A remoção do solvente e trituração com metanol/diclorometano deu um resíduo sólido branco. Concentraram-se as águas-mãe, aplicou-se o resíduo aum cartuxo SCX de extracção em fase sólida (20 g) e eluiu-se com metanol, seguido por amónia 2N em metanol para eluir o produto. Após evaporação do solvente, obteve-se o composto em epígrafe(780 mg) como um sólido amarelo claro. Ή RMN (DMSO-de) δ: 8,91 (s largo, 1H) , 6,62 (d 1H) , 6.56 (d, 1H) , 3,70 (s, 2H) , 2,92 (t, 2H) , 2,48 (t 2H), 1,96 (s, 3H).

Preparação 6 6-Hidroxi-5-metil-3,4-di-hidro-2(1H)-isoquinoline-carboxilato de 1,1-dimetiletilo

N

30 ΡΕ2225233

Adicionou-se trietilamina (0,21 mL; 1,50 mmol), seguida por dicarbonato de bis(1,1-dimetiletilo) (240 mg; 1,10 mmol) a uma suspensão de 5-metil-l,2,3,4-tetra-hidro- 6-isoquinolinol (Preparação 5; 163 mg; 1,0 mmol) em diclorometano (5 mL), a 0°C. Evaporou-se o solvente e repartiu-se o residuo entre acetato de etilo e solução aquosa saturada de cloreto de sódio. Extraiu-se adicionalmente a camada aquosa com acetato de etilo, secaram-se as camadas orgânicas (MgS04) e evaporaram-se para dar um óleo amarelo. A purificação por cromatografia com pressão de azoto, eluindo com um gradiente de 5-25% de acetato de etilo em ciclo-hexano, deu o composto em epígrafe como uma espuma branca (232 mg) . MS m/z 262 [M-H]

Preparação 7 5-Metil-6-{[(trifluorometil)sulfonil]oxi}-3,4-di-hidro-2(1H)-isoquinolinocarboxilato de 1,1-dimetiletilo

31 ΡΕ2225233

Adicionou-se piridina (0,162 mL; 2,00 iranol), seguido pela adição de anidrido trifluorometanossulfónico (0,186 mL; 1,10 iranol) a uma solução de 6-hidroxi-5-metil-3,4-di-hidro-2(1H)-isoquinolinocarboxilato de 1,1- dimetiletilo (preparação 6; 263 mg; 1,00 iranol) em diclorometano (5 mL) a -30°C e sob azoto. Após 0,5 h a uma temperatura entre -30°C e -20°C, removeu-se o solvente e tomou-se o resíduo em acetato de etilo. Lavou-se a solução com ácido clorídrico IN, seguido por solução saturada de bicarbonato de sódio, secou-se (MgS04) e concentrou-se in vacuo para dar o composto em epígrafe como um óleo amarelo claro (368 mg). MS m/z 394 [M-H]

Preparação 8 6-Ciano-5-metil-3,4-di-hidro-2(1H)-isoquinoline-carboxilato de 1,1-dimetiletilo

32 ΡΕ2225233

Desgasificou-se, sob vácuo elevado, com agitação e durante 15 min., uma solução de 5-metil-6-{[(trifluo-rometil)sulfonil]oxi}-3,4-di-hidro-2(1H)-isoquino-linocar-boxilato de 1,1-dimetiletilo (Preparação 7; 395 mg; 1,00 mmol) em DMF (4 mL) , seguindo-se a adição de cianeto de zinco (153 mg; 1,30 mmol) e de tetraquis(trifenilfosfi-na)paládio(0) (116 mg; 0,10 mmol), sob azoto. Agitou-se a 100°C, durante 6 h a mistura amarela escura resultante. Removeu-se o solvente, dissolveu-se o resíduo em acetato de etilo e lavou-se a solução com bicarbonato de sódio saturado. A camada aquosa foi adicionalmente extraída com acetato de etilo e as camadas orgânicas combinadas foram lavadas com solução aquosa saturada de cloreto de sódio, secas (MgS0$) e evaporadas para dar o produto cru. A purificação por cromatografia com pressão de azoto, eluindo com um gradiente de 5-25% de acetato de etilo em ciclo-hexano, deu o composto em epígrafe (214 mg) como um sólido branco. RMN (CDC13) δ: 7,44 (d, 1H) , 7,04 (d, 1H) , 4,60 (s, 2H) , 3,69 (t, 2H) , 2,75 (t, 2H) , 2,46 (s, 3H) , 1,49 (s, 9H) .

Preparação 9 6-[(hidroxiamino)(imino)metil]-5-metil-3,4-di-hidro-2(1H)-isoquinolinocarboxilato de 1,1-dimetiletilo 33 ΡΕ2225233

Agitou-se de um dia para o seguinte, a 80°C, 6- ciano-5-metil-3,4-di-hidro-2(1H)-isoquinolinocarboxilato de 1, 1-dimetiletilo (Preparação 8; 404 mg; 1,48 mmol) com cloridrato de hidroxilamina (619 mg; 8,90 mmol) e bicarbonato de sódio (748 mg; 8,9 mmol) em etanol (10 mL). Adicionou-se mais bicarbonato de sódio (400 mg) e cloridrato de hidroxilamina (300 mg) e continuou-se o aquecimento durante ca. 8h. Arrefeceu-se a mistura até à temperatura ambiente, removeu-se o sólido resultante, lavou-se com etanol e secou-se sob vácuo elevado para dar o composto em epigrafe como um sólido branco (431 mg). RMN (DMSO-d6) δ: 7,06 (d, 1H) , 6,99 (d, 1H) , 4,48 (s largo, 2H) , 3,58 (t, 2H) , 2,67 (t, 2H) , 2,19 (s, 3H), 1,42 (s, 9H) (exchangeables não listados; não foram claramente observados) 34 ΡΕ2225233

Preparação 10 6-(5-{3-ciano-4-[(1-metiletil)oxi]fenil}-1,2,4-oxadiazol-3-il)-5-metil-3,4-di-hidro-2-(1H)-isoquinoline-carboxilato de 1,1-dimetiletilo

Adicionou-se cloreto de oxalilo (571 mg, 4,5 mmol) a uma solução de ácido 3-ciano-4-[(1-metiletil)oxi]-benzoico (disponível em AK Scientific Product Catalog; 800 mg, 3,90 mmol) em diclorometano (15 mL) , seguiindo-se a adição de DMF (quantidade catalítica). Agitou-se a mistura reaccional durante 45 minutos, adicionou-se mais cloreto de oxalilo (0,1 mL) e DMF (1 gota) e continuou-se a agitação durante 20 minutos.Evaporou-se o solvente, co-evaporou-se o resíduo com tolueno e secou-se sob vácuo elevado durante 30 minutos. Dissolveu-se o cloreto ácido cru em acetonitrilo (10 mL) e adicionou-se a uma suspensão de 6-[(hidroxi-amino)(imino)metil]-5-metil-3,4-di-hidro-2(1H)-isoquinoli-nocarboxilato de 1,1-dimetiletilo Preparação 9; 916 mg, 3,00 mmol) e trietilamina (607 mg, 6,00 mmol) em acetonitrilo (15 mL). Agitou-se a mistura reaccional à temperatura ambiente durante 40 minutos e depois aqueceu-se em refluxo durante 24 horas. Arrefeceu-se a mistura reaccional 35 ΡΕ2225233 e evaporou-se o solvente. Repartiu-se o resíduo entre acetato de etilo e solução saturada de bicarbonato de sódio. Separou-se a fase orgânica, lavou-se com solução aquosa saturada de cloreto de sódio, secou-se (MgSCd) e evaporou-se para dar o produto cru (1,3 g). Purificou-se o resíduo por cromatografia, eluindo com 8-38% de acetato de etilo em ciclo-hexano, para dar o composto em epígrafe (486 mg) . 2H RMN (CLOROFÓRMIO-d) δ: 8,42 (d, 1H), 8,33 (dd 1H) , 7, .76 (d, 1H) , 7,12 (d, 1H) , 7 ,11 (d, 1H), 4 ,80 (spt 1H) , 4, r 6 4 (s, 2H) , 3,72 (t, 2H) , 2,84 (t, 2H) , 2,52 (s 3H) , 1, 51 (s, 9H) , 1,48 (d, 6H) .

Preparação 11

Sal do ácido trifluoroacético de 2-[(l-metil-etil)oxi]-5-[3-(5-metil-l,2,3,4-tetra-hidro-6-isoquino-linil)-1,2,4-oxadiazol-5-il]benzonitrilo

Adicionou-se ácido trifluoroacético (3 mL) a uma solução arrefecida com gelo de 6- (5-{3-ciano-4-[(1-metiletil)oxi]fenil}-l,2,4-oxadiazol-3-il)-5-metil-3,4-di- 36 ΡΕ2225233 hidro-2-(1H)-isoquinolinocarboxilato de 1,1-dimetiletilo (Preparação 10; 486 mg, 1,02 mmol) em diclorometano (3 mL). Agitou-se a mistura reaccional a 0°C durante 30 minutos.

Evaporou-se o solvente e co-evaporou-se o resíduo a partir de tolueno (x2). A trituração do resíduo com éter dietílico deu o composto em epígrafe como um sólido incolor que foi removido por filtração e seco (485 mg) . RMN (400 MHz, CDC13) δ: 1,48 (6H, d), 2,54 (2H, s) , 3,09 (2H, m) , 3,5 (2H, obscurecido por solvente residual), 4,36 (2H,s), 4,80 (1H, m) , 7,08-7,15 (2H, m) , 7,85 (1H, d), 8,33 (1H, d), 8,42 (1H, s), 10,20 (2H, s largo). MS m/z 375 [MH]+.

Preparação 12 3-[6-(5-{3-ciano-4-[(1-metil)etil)oxi]fenil}-l,2,4-oxadiazol-3-il)-5-metil-3,4-di-hidro-2(1H)-isoquino-linil]propanoato de etilo

Agitou-se, à temperatura ambiente, durante 3 horas, uma mistura de sal do ácido trifluoroacético de 2-[(1-metiletil)oxi]-5-[3-(5-metil-l,2,3,4-tetra-hidro-6-iso-quinolinil)-1,2,4-oxadiazol-5-il]benzonitrilo (preparação 11; 100 mg; 0,20 mmol), acrilato de etilo (31 mg, 33μ1, 37 ΡΕ2225233 0,31 mmol) e 1, 8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno (DBU; 187 mg, 185 μ]1, 1,23 mmol) em acetonitrilo (3 mL) . Evaporou-se o solvente e dissolveu-se o resíduo em acetato de etilo (10 mL) ; lavou-se a solução com água (5 mL) , secou-se e evaporou-se. A purificação do resíduo por cromatografia em sílica gel, eluindo com 10% de acetato de etilo em ciclo-hexano, deu o composto em epígrafe como um óleo incolor (86 mg). MS m/z 475 [MH]+.

Exemplo 1

Sal sódico do ácido 3-[6-(5-{3-ciano-4-[(1-metil-etil)oxi]fenil}-1,2,4-oxadiazol-3-il)-5-metil-3,4-di-hidro-2(1H)-isoquinolinil]propanóico

Adicionou-se hidróxido de sódio 2M (2 mL) a uma solução a 60°C de 3-[6-(5-{3-ciano-4-[(1-metil)etil)-oxi]-fenil}-l,2,4-oxadiazol-3-il)-5-metil-3,4-di-hidro-2(1H) -isoquinolinil]propanoato de etilo (Preparação 12; 90 mg; 0,17 mmol) em etanol (2 mL). Agitou-se a mistura eaccional, a 60°C, durante 2 horas, arrefeceu-se até à temperatura ambiente e diluiu-se com água (2 mL) . Removeu-se o sólido por filtração, lavou-se com uma pequena quantidade de água 38 ΡΕ2225233 e secou-se para dar o composto em epígrafe como um sólido incolor (55 mg). 1H RMN (400 MHz, d6DMSO) δ: 1,39 (6H, d), 2,08 (2H, t) , 2,44 (3H, s) , 2,59-2,78 (6H, m) , 3 ,56 (2H, s), 4,98 (1H, m) , 7, 09 (1H, d), 7,55 (1H, d), 7, 65 (1H, d) , 8,40 (1H, dd), 8,50 (1H, s). MS m/z 447 [MH]+.

Preparação das membramas para o ensaio GTP/5 dos S1P1

Nas preparações das membranas todos os passos foram realizados a 4°C. Cultivaram-se células de hepatoma de rato expressando estavelmente o receptor S1P1 humano ou Células Leucémicas Basofílicas de Rato (RBL) expressando estavelmente o receptor S1P1 humano, até uma confluência de 80%, antes de serem recolhidas para 10 mL de Salina Tamponada com Fosfato (PBS) e centrifugadas a 1200 rpm durante 5 minutos. Após remoção do sobrenadante, ressuspendeu-se o depósito e homogenizaram-se as células num misturador de vidro Waring com dois ciclos de 15 segs., em 200 mL de tampão (50 mM de HEPES, 1 mM de leupeptina, 25 μρ/ιιίΙΟ de bacitracina, 1 mM de EDTA, 1 mM de PMSF, 2 μΜ de pepstatina A). Mergulhou-se o misturador em gelo durante 5 mins. Após o primeiro ciclo e 10-40 mins. Após o ciclo final para permitir a dissipação da espuma. O material foi depois centrifugado a 500 g durante 20 mins. e o sobrenadante centrifugado durante 36 mins. a 48 000 g. Ressuspendeu-se o depósito no mesmo tampão de acima, mas sem PMSF e pepstatina A. Forçou-se depois o material através de uma agulha de 0,6 mm, refez-se o volume requerido 39 ΡΕ2225233 (geralmente, x4 o volume original do depósito celular), retiraram-se aliquotas e armazenou-se congelado a -80°C.

Preparação alternativa das membramas para o ensaio GTPy5 dos S1P1

Todos os passos foram realizados a 4°C. Homogenizaram-se as células num misturador de vidro Waring com dois ciclos de 15 segs., em 200 mL de tampão (50 mM de HEPES, 1 mM de leupeptina, 25 μρ/ηΛ de bacitracina, 1 mM de EDTA, 1 mM de PMSF, 2 μΜ de pepstatina A) . Mergulhou-se o misturador em gelo durante 5 mins. Após o primeiro ciclo e 10-40 mins. após o ciclo final para permitir a dissipação da espuma. O material foi depois centrifugado a 500 g durante 20 mins. e o sobrenadante centrifugado durante 36 mins. a 48 000 g. Ressuspendeu-se o depósito no mesmo tampão de acima, mas sem PMSF e pepstatina A. Forçou-se depois o material através de uma agulha de 0,6 mm, refez-se o volume requerido (geralmente, x4 o volume original do depósito celular), retiraram-se aliquotas e armazenou-se congelado a -80°C.

Ensaio GTPy5 dos S1P1

Fizeram-se aderir membranas de hepatoma de rato S1P1 humano (1,5 μρ/poço) a pérolas de ensaio de proximidade de cintilação (SPA) revestidas com aglutinina de germen de trigo (WGA) (0,125 mg/poço) em tampão de ensaio (HEPES 20 mM, MgCl2 10 mM, NaCl 100 mM e pH ajustado 40 ΡΕ2225233 para 7,4, utilizando KOH 5 M, GDP μΜ CFE (concentração final de ensaio), tendo também sido adicionada saponina 90 μg/mL, CFE.

Após 30 minutos de pré-ligação em gelo, as pérolas e a suspensão de membrana foram colocadas em placas de polipropileno branco Greiner LV de 384 poços (5 μΕ/poço) , contendo 0,1 μ]1 de composto. Adicionaram-se depois às placas agonistas 5 μL/poço de [35S]-GTPyS (0,5 nM, concentração final de radioligando) feito em tampão de ensaio. A mistura final de ensaio (10,1 μ]0) foi depois selada, centrifugada a 1000 rpm durante 5 minutos e lida imediatamente a seguir num leitor Viewlux.

Todos os compostos de teste foram dissolvidos em DMSO, a uma concentração de 10 mM e foram preparados em 100% de DMSO utilizando um passo de diluição de 1 para 4 para proporcionar curvas de dose resposta com 11 pontos. As diluições foram transferidas para as placas de ensaio, assegurando que a concentração de DMSO era constante em toda a placa e em todos os ensaios.

Todos os dados foram normalizados para a média entre os 16 poços de controlo mais elevados e o 16 mais baixos. Aplicou-se depois a ajuste da curva com base em quatro parâmetros. Método alternativo para o ensaio GTPy5 dos S1P1 41 ΡΕ2225233

Homogenizaram-se membranas RH7777 expressando os S1P1 (1,5 μρ/ρορο) por passagem através de uma agulha 23G. Fizeram-de depois estas aderir a pérolas SPA revestidas com WGA (0,125 mg/poço) em tampão de ensaio (HEPES 20 mM, MgCl2 10 mM, NaCl 100 mM e pH ajustado para 7,4, utilizando KOH 5 M) . Também foram adicionados GDP 10 μΜ CFE e saponina 90 μρ/ηϋΐ CFE.

Após 30 minutos de pré-ligação em gelo, as pérolas e a suspensão de membrana foram colocadas em placas de polipropileno branco Greiner LV de 384 poços (5 μΕ/poço) , contendo 0,1 μ]1 de composto. Adicionaram-se depois às placas 5 μΕ/poço de [35S]-GTPyS (0,5 nM para os S1P1 ou 0,3 nM para os S1P3, concentração final de radioligando) feito em tampão de ensaio. A mistura final de ensaio (10,1 μΕ) foi depois selada, centrifugada numa centrífuga e imediatamente lida num instrumento Viewlux. 0 Exemplo 1 tinha um pEC50 >7. S1P3

Fizeram-se aderir membranas S1P3 de células leucémicas basófilicas de rato (RBL-2H3) a pérolas SPA revestidas com WGA (0,125 mg/poço) em tampão de ensaio (HEPES 20 mM, MgCl2 3 mM, NaCl 100 mM e pH ajustado para 7,4, utilizando KOH 5 M) . Também foram adicionados GDP 10 μΜ, CFE, e saponina 90 μρ/mL, CFE. 42 ΡΕ2225233

Após 30 minutos de pré-ligação em gelo, as pérolas e a suspensão de membrana foram colocadas em placas de polipropileno branco Greiner LV de 384 poços (5 μL/ρoço) , contendo 0,1 μ]0 de composto. Adicionaram-se depois às placas agonistas 5 μ]1/ρορο de [35S]-GTPyS (0,5 nM, concentração final de radioligando) feito em tampão de ensaio. A mistura final de ensaio (10,1 μΙΟ foi centrifugada a 1000 rpm e imediatamente lida num leitor Viewlux.

Todos os compostos de teste foram dissolvidos em DMSO, a uma concentração de 10 mM e foram preparados em 100% de DMSO utilizando um passo de diluição de 1 para 4 para proporcionar curvas de dose resposta com 11 pontos. As diluições foram transferidas para as placas de ensaio, assegurando que a concentração de DMSO era constante em toda a placa e em todos os ensaios.

Todos os dados foram normalizados para a média entre os 16 poços de controlo mais elevados e o 16 mais baixos. Aplicou-se depois o ajuste da curva com base em quatro parâmetros. Método alternativo para o ensaio GTPy5 dos S1P1

Homogenizaram-se as membranas RBL expressando os S1P1 (1,5 μρ/poço) por passagem através de uma agulha 23G.fizeram-de depois estas aderir a pérolas SPA revestidas com WGA (0,125 mg/poço) em tampão de ensaio (HEPES 20 mM, 43 ΡΕ2225233

MgCl2 10 mM, NaCl 100 mM e pH ajustado para 7,4, utilizando KOH 5 M). Também foram adicionados GDP 10 μΜ FAC e saponina 90 μρ/ηϋΐ.

Após 30 minutos de pré-ligação em gelo, as pérolas e a suspensão de membrana foram colocadas em placas de polipropileno branco Greiner LV de 384 poços (5 μL/poço) , contendo 0,1 μ]1 de composto. Adicionaram-se depois às placas 5 μL/poço de [35S]-GTPyS (0,5 nM para os S1P1 ou 0,3 nM para os S1P3, concentração final de radioligando) feito em tampão de ensaio. A mistura final de ensaio (10,1 μ]1) foi depois selada, centrifugada numa centrífuga e imediatamente lida num instrumento Viewlux. O Exemplo 1 tinha um pEC50 <5.

Lisboa, 13 de novembro de 2013

Claims (6)

1. ΡΕ2225233 1 REIVINDICAÇÕES 1. Composto de ácido 3-[6-(5-{3-ciano-4-[(1-metiletil)oxi]fenil}-l,2,4-oxadiazol-3-il)-5-metil-3,4-di-hidro-2(1H)-isoquinolinil]propanóico e sais farmaceuti-camente aceitáveis seus derivados.
2. 2. Composto de acordo com a reivindicação 1 para utilização no tratamento de condições ou distúrbios mediados pelos receptores S1P1 e em que a condição ou distúrbio é esclerose múltipla, doenças autoimunes, distúrbios inflamatórios crónicos, asma, neuropatias inflamatórias, artrite, transplantes, doença de Crohn, colite ulcerosa, lupus eritematoso, psoríase, lesões isquémicas-de reperfusão, tumores sólidos e metástases tumurais, doenças associadas com angiogénese, doenças vasculares, condições dolorosas, doenças virais agudas, condições inflamatórias do intestino, diabetes dependente e não dependente de insulina.
3. 3. Composto de acordo com a reivindicação 2 em que a condição é lupus eritematoso.
4. 4. Utilização de um composto de acordo com a reivindicação 1, para manufactura de um medicamento para utilização no tratamento de condições ou distúrbios mediados pelos receptores S1P1 e em que a condição ou distúrbio é esclerose múltipla, doenças autoimunes, distúrbios infla- 2 ΡΕ2225233 matórios crónicos, asma, neuropatias inflamatórias, artrite, transplantes, doença de Crohn, colite ulcerosa, lupus eritematoso, psoríase, lesões isquémicas-de reperfusão, tumores sólidos e metástases tumurais, doenças associadas com angiogénese, doenças vasculares, condições dolorosas, doenças virais agudas, condições inflamatórias do intestino, diabetes dependente e não dependente de insulina.
5. 5. Utilização de acordo com a reivindicação 4 em que a condição é lupus eritematoso.
6. 6. Composição farmacêutica compreendendo um composto de acordo com a reivindicação 1. Lisboa, 13 de novembro de 2013 1 ΡΕ2225233 REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO Esta lista de referências citadas pelo requerente é apenas para conveniência do leitor. A mesma não faz parte do documento da patente Europeia. Ainda que tenha sido tomado o devido cuidado ao compilar as referências, podem não estar excluídos erros ou omissões e o IEP declina quaisquer responsabilidades a esse respeito. Documentos de patentes citadas na Descrição JP 11880026 A WO 03105771 A vVO 08588648 A WO 06047195 A WO 06100633 A WO 56115188 A * WD 88131336 A * WO 07024022 A * WO 07116386 A * WO 08064757 A * WO 08001463 A * WO 04113330 A Literatura que não é de patentes citada na Descrição * OKAMOTO et ai. J 8m' Cftem, « vd. 273 (42). 27104 * S.ANCHEZ; HLA. J CeéfBíochem, 2804, voi. 82,913 * PYUE ; PffiE. Biasham 2080, voi. 349, 385 * CHUN «t ai. Pfotumacohgteaf fíovi&ws, 2:002, vd. 54,265 * SANCHEZ; HLA, J CeSufarBbchemísíry:. 20Θ4, vd. 32, §13 » KLUK; HLA, Biechem etBíophyskaAsta,2Q&2, vd. 1582, 72 * SANCHEZ; HLA. J CeSafer Biochatm, 2004, vd. 92, 913 * ROSEN ; G0E72L. Nat Rsv immmoí., 2005, voi. 5, 5S0 * BRiMKMAM et sL JBC, 2503, vd. 277,21453 * FUJI f NO *talJJ%aws»d£*p Tter, 2003, vd. 305. 70 * WEBB et ai. J Naurtánammà, 2004, voi. 153, 103 * RAUSCH et aí. J Maga Rasou tom&fog, 2004, vd. 20,16 * CHiBA «t at. J fmaxiRoSoqy. 1088, voi. 160, 5037 * FORfiEST et ai. J PhafmaoM Exp The?, 2004, voi. 308, 758 » SANHA et aL MC, 2084, voi. 279, 13839 * GRALER; COETZL FASES J, 2004, voi. 18, 551 * MAILOUSIAN et ai. Nsture, 2004, roi. 427, 355 * 40 st ai.,. Chem Bksi, 2005. voi. 12, 703 * ALLENDE et ai, Bfoorf, 2003. voi. 102, 3665 * SiNGELTON et ai- FASES Jf 2006, voi. 19» 1646 * WH. NsL Imtnurmíogy, 2005, voi, 8,1226 > BfBNKMAN et aí- JBC, 2002, vd. 277,21453 * MANBALA et ai. Science, 2002. voi, 296» 346 * FU4ÍNG «t ai. J Phsrmacosogy and Experimentai Thersp@Ííiics, 2003, voi. 305,45856 * BN&iKMAN et aLAtsenca» J TransplantaBsii, 2004» vd. 4,1019 * WEBS ®t ai. J «fettfo»»mí»idos^ 2004, voi. 153, 108 * MORRfS «t al. EurJ hamunol, 2005, vd. 35, 3570 * CHÍSA. Pfratrfíasofogysná Tbempeufos, 2005, voi, 108, 306 * KAHAN et at, Ttamplaniation, 2003, vd. 76, 1079 * KAPPGS et aí. NemEng J Medicine, 2006, vd. 335, 1124 * HALE et d, Bidorganic 4 Madkina! Chamlslry Leí-te.rs, 2004, vei, 14, 3501 * KOYRAKH et ai- Amarkan J Tmnspiatdaiktn, 2005, voi- S, 529 * COOKE et aí. Amuai Repoits is> Medicinei Chesnis-1¾ 2007, voi. 42, 245-2:63 * J. Pharm. Set, 1977, vd. 86,1-19 * Teirshedrse, 2006, voi. 62 (29), &8S8-S875