PT2175859E - Heteroarilpiridil- e fenil-benzenossulfonamidas condensadas como moduladores de ccr2 para o tratamento de inflamação - Google Patents
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Description
ΡΕ2175859 1
DESCRIÇÃO "HETEROARILPIRIDIL— E FENIL—BENZENOSSULFONAMIDAS CONDENSADAS COMO MODULADORES DE CCR2 PARA O TRATAMENTO DE INFLAMAÇÃO"
Antecedentes da Invenção A presente invenção proporciona compostos, composições farmacêuticas contendo um ou mais destes compostos ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis, os quais são eficazes na inibição da função ou ligação de várias quimiocinas a recetores de quimiocina. Como antagonistas ou moduladores de recetores de quimiocina, os compostos e composições têm utilidade no tratamento de várias desordens, condições e doenças imunes. são responsáveis pela iniciação e
As quimiocinas, também conhecidas como citocinas quimiotáticas, são um grupo de proteínas de pequena massa molecular que são libertadas por uma larga variedade de células e têm uma variedade de atividades biológicas. As quimiocinas atraem vários tipos de células do sistema imune, tais como macrófagos, células T, eosinófilos, basófilos e neutrófilos, e são causa deles migrarem do sangue para vários tecidos linfoides e não linfoides. Elas medeiam a infiltração de células inflamatórias para sitios de inflamação, e 2 ΡΕ2175859 perpetuação de muitas doenças de inflamação (revisto em Schall, Cytokine, 3 (1991) 165-183, Schall et al., Curr. Opin. Immunol., 6 (1994) 865-873).
Para além do quimiotatismo de estimulação, as quimiocinas podem induzir outras mudanças em células responsivas, incluindo mudanças na forma da célula, exocitose de grânulos, regulação em alta de integrina, formação de lipidos bioativos (e.g., leucotrienos), explosão respiratória associada com ativação de leucócito, proliferação celular, resistência à indução de apoptose e angiogénese. Por conseguinte, as quimiocinas são desenca-deadores precoces da resposta inflamatória, causando libertação do mediador inflamatório, quimiotatismo e extravasamento para sitios de infeção ou inflamação. Elas são também estimuladoras de uma multidão de processos celulares que carregam importantes funções fisiológicas bem como consequências patológicas.
As quimiocinas exercem os seus efeitos pela ativação dos recetores de quimiocina expressos por células responsivas. Os recetores de quimiocina são uma classe de recetores acoplados à proteína G, também conhecidos como sete recetores transmembrana, encontrados na superfície duma larga variedade de tipos de células tais como leucócitos, células endoteliais, células do músculo liso e células de tumor.
As quimiocinas e os recetores de quimiocina são 3 ΡΕ2175859 expressos por células renais intrínsecas e células que se infiltram durante a inflamação renal (Segerer et al., J. Am. Soc. Nephrol., 11 (2000) 152-76; Morii et al., J.
Diabetes Complications, 17 (2003) 11-5; Lloyd et al. J.
Exp. Med., 185 (1997) 1371-80; Gonzalez-Cuadrado et al.
Clin. Exp. Immunol., 106 (1996) 518-22; Eddy & Giachelli,
Kidney Int., 47 (1995) 1546-57; Diamond et al., Am. J. Physiol., 266 (1994) F926-33) . Em humanos, CCR2 e ligando MCP-1 estão entre as proteínas expressas na fibrose renal, e estão correlacionados com a extensão da infiltração de macrófago no interstício (Yang et al., Zhonghua Yi Xue Za Zhi, 81 (2001) 73-7; Stephan et al., J. Urol., 167 (2002) 1497-502; Amann et al., Diabetes Care, 26 (2003) 2421-5;
Dai et al., Chin. Med. J. (Engl), 114 (2001) 864-8). Em modelos animais de fibrose renal, o bloqueio de CCR2 ou MCP-1 conduz a uma redução marcada na severidade da inflamação renal (Kitagawa et al., Am. J. Pathol., 165 (2004) 237-46; Wada et al.. Am. J. Pathol., 165 (2004) 237-46; Shimizu et al., J. Am. Soc. Nephrol., 14 (2003) 1496- 505) . A artrite reumatoide é uma doença crónica das articulações caraterizada por inflamação sinovial que leva à destruição da cartilagem e osso. Ainda que as causas subjacentes da doença sejam desconhecidas, acredita-se que macrófagos e células T do tipo Th-1 desempenham um papel-chave na iniciação e perpetuação do processo inflamatório crónico (Vervoordeldonk et al., Curr. Rheumatol. Rep., 4 (2002) 208-17) . 4 ΡΕ2175859 MCP-1 está entre as várias quimiocinas, incluindo ΜΙΡ-Ια e IL-8, identificadas na sinóvia reumatoide (Villiger et al., J. Immunol., 149 (1992) 722-7; Scaife et al., Rheumatology (Oxford), 43 (2004) 1346-52; Shadidi et al., Scand. J. Immunol., 57 (2003) 192-8; Taylor et al., Arthritis Rheum., 43 (2000) 38-47; Tucci et al., Biomed. Sei. Instrum., 34 (1997) 169-74) . Os recetores de quimiocina CCR1, CCR2, CCR3 e CCR5 são regulados em alta nas articulações de ratos artríticos (Plater-Zyberk et al., Immunol. Lett., 57 (1997):117-20. O bloqueamento da atividade de MCP-1 usando um antagonista de CCR2 ou um antagonista contra MCP-1 verificou-se ser eficaz na redução da inflamação da articulação em modelos experimentais de artrite reumatoide (Gong et al., J. Exp. Med., 186 (1997) 131-7; Ogata et al., J. Pathol., 182 (1997) 106-14). A infiltração de macrófagos mediada por recetor de quimiocina nos tecidos gordos também pode contribuir para as complicações originadas pela obesidade, uma condição resultante da acumulação excessiva da gordura no corpo. A obesidade predispõe os indivíduos afetados para muitas desordens, tais como diabetes não dependentes de insulina, hipertensão, acidente vascular cerebral e doença da artéria coronária. Na obesidade, os tecidos adiposos têm funções metabólica e endócrina alteradas que conduzem a uma libertação aumentada de ácidos gordos, hormonas e moléculas pró-inflamatórias. Os macrófagos do tecido adiposo são tidos como sendo uma fonte-chave de citocinas pró- 5 ΡΕ2175859
inflamatórias incluindo TNF-alfa, iNOS e IL-6 (Weisberg et al., J. Clin. Invest., 112 (2003) 1796-808). O recrutamento de macrófagos para o tecido adiposo é provavelmente mediado por MCP-1 produzida por adipócitos (T. Christiansen, et al., Int J Obes (Lond), 29(1) (Jan 2005) 146-50; Sartipy et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 100 (2003) 7265-70). MCP-1 elevada pode induzir diferenciação de adipócito e resistência a insulina, e contribuir para patologias associadas com hiperinsulinemia e obesidade. MCP-1 é sobreexpressa no plasma em ratos obesos comparados a controlos magros e adiposo branco é uma fonte principal. MCP-1 tem-se também revelado a acelerar a cura de feridas, e tem um efeito angiogénico direto sobre as células epiteliais, e pode desempenhar um papel direto na remodelação de tecido adiposo na obesidade (P. Sartipy, D. J. Loskutoff, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 100 (2003) 7265).
Os niveis no plasma de MCP-1 são substancialmente aumentados em ratos com Obesidade Induzida por Dieta (DIO), e uma forte correlação entre niveis de MCP-1 no plasma e massa corporal foi identificada. Além disso, a elevação de MCP-1 induzida por dieta alta em gordura causa mudanças na população de monócito positivo CD11 b em ratos DIO (K. Takahashi, et al., J. Biol. Chem., (2003) 46654).
Além disso, a inflamação crónica na gordura é 6 ΡΕ2175859 tida como desempenhando um papel crucial no desenvolvimento de resistência a insulina relacionada com obesidade (H. Xu, et al., J Clin Invest., 112(12) (Dez. 2003) 1821-30). Foi proposto que a resistência a insulina relacionada com obesidade é, pelo menos em parte, uma doença inflamatória crónica iniciada no tecido adiposo. Muitos genes específicos da inflamação e macrófagos são dramaticamente regulados em alta no tecido adiposo branco em modelos de rato de obesidade induzida por dieta alta em gordura (DIO) e genética, e esta regulação em alta precede um aumento dramático na insulina circulante. Níveis de expressão aumentados de CCR2 de monó-cito e proteína-1 quimioatratora de monócito em pacientes com diabetes mellitus (Biochemical e Biophysical Research Communications, 344(3) (2006) 780-5) foram encontrados num estudo envolvendo pacientes diabéticos. Concentrações de MCP-1 no soro e expressão em superfície de CCR2 em monócitos em pacientes diabéticos foram significativamente mais altas do que em não diabéticos, e os níveis no soro de MCP-1 correlacionados com HbAlc, triglicéridos, BMI, hs-CRP. Níveis de expressão em superfície de CD36 e CD68 em monócitos foram significativamente aumentados em pacientes diabéticos e mais não regulados por MCP-1 em diabéticos, aumentando a captação de ox-LDL, e por isso potencialmente transformação de célula em espuma. MCP-1 no soro elevado e expressão de CCR2, CD36 e CD68 de monócito aumentada correlacionaram-se com controlo de glucose no sangue pobre e potencialmente correlacionam-se com recrutamento de monócito de parede de vaso aumentado. 7 ΡΕ2175859 MCP-1 é um ator potencial na relação cruzada negativa entre tecido adiposo e músculo esquelético (J. J. Bianco et al., Endocrinology, (2006) 2458). MCP-1 pode reduzir significativamente a captação de glucose estimulada por insulina, e é um indutor proeminente de resistência a insulina na célula do músculo esquelético humano. O tecido adiposo é um órgão ativo segregador e endócrino maior produzindo proteínas bioativas que regulam o metabolismo da energia e a sensibilidade a insulina. CCR2 modula os efeitos inflamatórios e metabólicos da alimentação alta em gordura (S. P. Weisberg, et al., J. Clin. Invest., 115 (2006)). A deficiência genética em CCR2 reduziu a entrada de comida e atenuou o desenvolvimento de obesidade em ratos alimentados com dieta alta em gordura. Em ratos obesos emparelhados para adiposidade, a deficiência em CCR2 reduziu o conteúdo de macrófago e o perfil inflamatório do tecido adiposo, aumentou a expressão da adiponectina, e melhorou a homeostase da glucose e sensibilidade a insulina. Em animais magros, nenhum efeito do genótipo de CCR2 sobre traços metabólicos foi encontrado. Em ratos com dieta alta em gordura, o genótipo de CCR2 modulou a alimentação, o desenvolvimento de obesidade e a inflamação do tecido adiposo. Uma vez estabelecido, o antagonismo de curto prazo mostrou atenuar a acumulação de macrófago no tecido adiposo e a resistência a insulina. A quimiocina e os recetores de quimiocina são os ΡΕ2175859 reguladores-chave do tráfico da célula imune. MCP-1 é um quimioatrator potente de monócitos e células T; a sua expressão é induzida sob condições inflamatórias incluindo estimulações de citocina pró-inflamatória e hipoxia. A interação entre MCP-1 e CCR2 medeia a migração de monócitos, macrófagos bem como células T ativadas e desempenha um papel-chave na patogénese de muitas doenças inflamatórias. A inibição de funções de CCR2 usando antagonistas de molécula pequena descritos nesta invenção representa uma nova aproximação para os tratamentos de desordens inflamatórias . A psoriase é uma doença inflamatória crónica caraterizada pela hiperproliferação de ceratinócitos e infiltração pronunciada de leucócitos. É conhecido que os ceratinócitos da lesão da psoriase expressam MCP-1 ligando de CCR2 abundante, particularmente quando estimulados por citocinas pró-inflamatórias tais como TNF-α (Vestergaard et ai., Acta. Derm. Venereol., 84(5) (2004) 353-8; Gillitzer et al., J. Invest. Dermatol., 101 (2) (1993) 127--31; Deleuran et al., J. Dermatol. Sei., 13 (3) (1996) 228--36) . Visto que MCP-1 pode atrair a migração de não só macrófagos mas também células dendriticas expressando CCR2 para a pele, este recetor e par ligando acredita-se ser importante na regulação da interação entre ceratinócitos proliferantes e macrófago dermal durante o desenvolvimento da psoriase. O antagonista de molécula pequena pode por conseguinte ser útil no tratamento da psoriase. 9 ΡΕ2175859
Em adição às doenças inflamatórias, as quimioci-nas e os recetores de quimiocina têm também sido implicados em cancros (Broek et al., Br. J. Câncer, 88(6) (2003) 855-62) . As células de tumor estimulam a formação de estroma que segrega vários mediadores fundamentais para o crescimento de tumor, incluindo fatores de crescimento, citocinas e proteases. É conhecido que o nivel de MCP-1 está associado significativamente com acumulação de macrófago associada a tumor, e a análise de prognóstico revela que a alta expressão de MCP-1 é um indicador significativo de recidiva precoce no cancro da mama (Ueno et al., Clin. Câncer Res., 6(8) (2001) 3282-9). Um antagonista de molécula pequena duma quimiocina pode por conseguinte ser capaz de reduzir a libertação de citocinas estimulantes do crescimento pelo bloqueio da acumulação de macrófagos em sitios de formação de tumor. A US compostos úteis CCR9 da fórmula 6 939 885 (ChemoCentryx, Inc.) revela na modulação a atividade na quimiocina de
NHSO,.
O Pedido Publicado PCT WO 2003/099773 (Millennium Pharmaceuticals, Inc.) revela compostos que podem ligar-se a recetores CCR9 da fórmula
10 ΡΕ2175859 O Pedido Publicado PCT WO 2005/004810 (Merck & Co., Inc.) revela antagonistas ou agonistas inversos de brandicinina BI da fórmula R1a»
HN zJ-Z O
í'"Y"YS yx'x
Rib x R2a Y O Pedido de Patente Publicado US 2007/0037794 AI (ChemoCentryx, Inc.) revela moduladores de CCR2, incluindo o seguinte composto:
Infelizmente, o composto acima sofre rápida eliminação in vivo. Tais fármacos muitas vezes requerem múltiplas administrações do fármaco para alcançar niveis no sangue terapeuticamente eficazes ao longo dum período de tempo significativo. Outros métodos estão também disponíveis incluindo formulações e dispositivos de libertação sustentada . WO 2004/046092 revela arilsulfonamidas como antagonistas do recetor CCR2. WO 2008/008374 revela arilsulfo-namidas como antagonistas do recetor CCR2 e CCR9. WO 2006/076644 revela arilsulfonamidas como antagonistas do recetor CCR9. 11 ΡΕ2175859
Breve Sumário A presente invenção diz respeito a compostos e seus sais farmaceuticamente aceitáveis, composições, e seu uso na modulação da atividade de quimiocina. Os compostos e seus sais, composições, e métodos aqui descritos são úteis no tratamento de ou prevenção de condições ou doenças mediadas por quimiocina, incluindo certas desordens e doenças inflamatórias e imunorreguladoras.
Os compostos da presente invenção têm-se revelado a modular um ou mais de CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CCR10, CXCR3, CXCR4, CXCR5 e CX3CR1. Em particular, vários compostos da presente invenção modulam CCR2 conforme mostrado nos exemplos.
Em certas formas de realização, a presente invenção diz respeito a um composto da fórmula (II) ou um seu sal: R1
onde: R1 e R2 são cada um independentemente hidrogénio 12 ΡΕ2175859 halogéneo, alquilo Ci-Cs, -CN, ou haloalquilo Ci-Cs, com a condição de que pelo menos um dos R1 ou R2 é diferente de hidrogénio; R4 é hidrogénio; R5 é halogéneo ou alquilo Ci-Cs; R11 é selecionado de entre o grupo constituido por hidrogénio, alquilo Ci-Cs, alcenilo C2-C8, alcinilo C2-C8, arilo C6-C10 substituído ou não substituído, heteroarilo de 5 a 10 membros substituído ou não substituído e heterociclo de 3 a 10 membros substituído ou não substituído.
Em certas formas de realização, para compostos de fórmula II R1 é Cl.
Em certas formas de realização, para compostos de fórmula II, R2 é -CF3,
Em certas formas de realização, para compostos de fórmula II, R5 é Cl ou metilo.
Em certas formas de realização, para compostos de fórmula II, R5 é metilo.
Em certas formas de realização, para compostos de fórmula II, R1 é Cl, R2 é CF3, R5 é Cl.
Num aspeto particular, a presente invenção diz respeito a um composto selecionado de entre o grupo constituido por: 13 ΡΕ2175859
Num outro aspeto particular, a presente invenção diz respeito a um composto selecionado de entre o grupo constituído por:
6 ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.
Num outro aspeto, a presente invenção proporciona composições úteis na modulação da atividade de quimiocina. 14 ΡΕ2175859
Numa forma de realização, uma composição de acordo com a presente invenção compreende um composto de acordo com a invenção e um agente de suporte ou excipiente farmaceuti-camente aceitável.
Num ainda outro aspeto, a presente invenção proporciona um método de modulação da função de quimiocina numa célula in vitro, compreendendo o contacto da célula com uma quantidade de modulação de CCR2 de um composto ou composição de acordo com a invenção.
Um método para a modulação da função de quimiocina, compreendendo contacto de um recetor de quimiocina com uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto ou composição de acordo com a invenção, é também contemplado .
Num ainda outro aspeto, a presente invenção proporciona um método para o tratamento de uma condição ou doença mediada por quimiocina, compreendendo a administração a um indivíduo duma quantidade segura e eficaz dum composto ou composição de acordo com a invenção.
Num aspeto particular, a presente invenção diz respeito a um método de tratamento de uma condição ou doença mediada por CCR2 compreendendo a administração a um indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto ou sal farmaceuticamente aceitável de um composto de fórmula II. Em certas formas de realização, uma condição 15 ΡΕ2175859 ou doença mediada por CCR2 é aterosclerose. Em certas formas de realização, uma condição ou doença mediada por CCR2 é restenose. Em certas formas de realização, uma condição ou doença mediada por CCR2 é esclerose múltipla. Em certas formas de realização, uma condição ou doença mediada por CCR2 é selecionada de entre o grupo constituído por doença inflamatória intestinal, fibrose renal, artrite reumatoide, obesidade e diabetes não dependente de insulina. Em certas formas de realização, uma condição ou doença mediada por CCR2 é diabetes tipo 2, Em certas formas de realização, uma condição ou doença mediada por CCR2 é selecionada de entre o grupo constituído por doença pulmonar obstrutiva crónica, fibrose pulmonar idiopática e síndrome da pneumonia idiopática.
Em adição aos compostos aqui proporcionados, a presente invenção proporciona ainda composições farmacêuticas contendo um ou mais destes compostos, bem como métodos para o uso destes compostos em métodos terapêuticos, principalmente para tratar doenças associadas com atividade de sinalização de quimiocina.
Num outro aspeto, a presente invenção proporciona formas cristalinas de sal de sódio de 4-cloro-N-[5-metil-2--(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidina-4-carbonil)-piridin-3-il]-3--trifluorometil-benzenossulfonamida. Em certas formas de realização, uma forma cristalina de sal de sódio de 4-cloro-N-[5-metil-2-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidina-4-carbo-nil)-piridin-3-il]-3-trifluorometil-benzenossulfonamida tem 16 ΡΕ2175859 uma difracção de raios X pelo método do pó compreendendo os seguintes valores 2-teta ± 0,2 medidos usando radiação CuKa: 6,9, 7,7, 20,0, 24,3, 24,7 e 25,1. Noutras formas de realização, uma forma cristalina da reivindicação 23, em que a referidas forma cristalina tem uma difracção de raios X pelo método do pó compreendendo os seguintes valores 2-teta ± 0,2 medidos usando radiação CuKa: 6,9, 7,7, 10,6, 11,3, 1—1 1—> co 12,5, 13,7, 15,1, 15,3, 16,1, 16,9, 17,3, 1—1 CO LO V oo \—1 19,5, 20,0, 21,6, 21,8, 22, 6, 24,3, 24,7, 25,1, 25, 6, 26,3, 27,5, 28,5, 28,8, 29,3, 31,4 e 32,4 e
Breve Descrição do Desenho FIG. 1 desenha um espetro de XPRD (difracção de raios X pelo método do pó) de sal de sódio da 4-cloro-N-[5--metil-2-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidina-4-carbonil)-piridin--3-il]-3-trifluorometil-benzenossulfonamida conforme descrito no Exemplo 14.
Descrição Detalhada
Geral A presente invenção diz respeito a compostos e seus sais, composições e métodos úteis na modulação da função do recetor de quimiocina, particularmente função de CCR2. A modulação da atividade do recetor de quimiocina, conforme aqui usado nas suas várias formas, tem a intenção de abranger o antagonismo, agonismo, antagonismo parcial, agonismo inverso e/ou agonismo parcial da atividade asso- 17 ΡΕ2175859 ciada com um recetor de quimiocina particular, preferivelmente o recetor CCR2. Em concordância, os compostos da presente invenção são compostos que modulam pelo menos uma função ou caraterística de CCR2 de mamífero, por exemplo, uma proteína CCR2 humana. A capacidade dum composto para modular a função de CCR2, pode ser demonstrada num ensaio de ligação (e.g., ligação de ligando ou ligação de agonista) , um ensaio de migração, um ensaio de sinalização (e.g., ativação de uma proteína G de mamífero, indução de aumento rápido e transiente na concentração de cálcio livre citosólico), e/ou ensaio de resposta celular (e.g., estimulação de quimiotatismo, exocitose ou libertação do mediador inflamatório por leucócitos).
Abreviaturas e Definições
Aquando da descrição dos compostos, composições, métodos e processos desta invenção, os termos seguintes têm os significados seguintes, a menos que indicado de outra maneira. ciclopentilo, "Alquilo" por si próprio ou como parte de um outro substituinte refere-se a um grupo hidrocarboneto que pode ser linear, cíclico ou ramificado ou uma sua combinação tendo o número de átomos de carbono designados (isto é, Ci-Cs significa um até oito átomos de carbono) . Exemplos de grupos alquilo incluem metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, t-butilo, isobutilo, sec--butilo, ciclo-hexilo, ciclopentilo, (ciclo-hexil)metilo, 18 ΡΕ2175859 ciclopropilmetilo, biciclo[2,2,1]heptano, biciclo[2,2,2]-octano. Os grupos alquilo podem ser substituídos ou não substituídos, a menos que indicado de outra maneira. Exemplos de alquilo substituído incluem haloalquilo, tioalquilo, aminoalquilo. "Alcoxi" refere-se a -O-alquilo. Exemplos de um grupo alcoxi incluem metoxi, etoxi, n-propoxi. "Alcenilo" refere-se a um grupo hidrocarboneto insaturado que pode ser linear, cíclico ou ramificado ou uma sua combinação. Os grupos alcenilo com 2-8 átomos de carbono são preferidos. 0 grupo alcenilo pode conter 1, 2 ou 3 ligações duplas carbono-carbono. Exemplos de grupos alcenilo incluem etenilo, n-propenilo, isopropenilo, n-but--2-enilo, n-hex-3-enilo, ciclo-hexenilo, ciclopentenilo. Os grupos alcenilo podem ser substituídos ou não substituídos, a menos que indicado de outra maneira. "Alcinilo" refere-se a um grupo hidrocarboneto insaturado que pode ser linear, cíclico ou ramificado ou uma sua combinação. Os grupos alcinilo com 2-8 átomos de carbono são preferidos. 0 grupo alcinilo pode conter 1, 2 ou 3 ligações triplas carbono-carbono. Exemplos de grupos alcinilo incluem etinilo, n-propinilo, u-but-2-inilo, n-hex-3-inilo. Os grupos alcinilo podem ser substituídos ou não substituídos, a menos que indicado de outra maneira. "Arilo" refere-se a um grupo hidrocarboneto 19 ΡΕ2175859 aromático polinsaturado tendo um único anel (monociclico) ou múltiplos anéis (biciclico), os quais podem ser fundidos um com o outro ou ligados de modo covalente. Os grupos arilo com 6-10 átomos de carbono são preferidos, onde este número de átomos de carbono pode ser designado por C6-Ci0, por exemplo. Exemplos de grupos arilo incluem fenilo e naftaleno-l-il, naftaleno-2-il, bifenilo. Os grupos arilo podem ser substituídos ou não substituídos, a menos que indicado de outra maneira. "Halo" ou "halogéneo", por si próprio ou como parte de um substituinte refere-se a um átomo de cloro, bromo, iodo ou flúor. "Haloalquilo", como um grupo alquilo substituído, refere-se a um grupo mono-haloalquilo ou poli-haloalquilo, a maior parte das vezes tipicamente substituído com desde 1-3 átomos de halogéneo. Exemplos incluem 1-cloroetilo, 3-bromopropilo, trifluorometilo. "Heterociclilo" refere-se a um anel não aromático saturado ou insaturado contendo pelo menos um heteroátomo (tipicamente 1 a 5 heteroátomos) selecionado de entre azoto, oxigénio ou enxofre. O anel heterociclilo pode ser monociclico ou biciclico. Preferivelmente, estes grupos contêm 0-5 átomos de azoto, 0-2 átomos de enxofre e 0-2 átomos de oxigénio. Mais preferivelmente, estes grupos contêm 0-3 átomos de azoto, 0-1 átomos de enxofre e 0-1 átomos de oxigénio. Exemplos de grupos heterociclo incluem 20 ΡΕ2175859 pirrolidina, piperidina, imidazolidina, pirazolidina, butirolactama, valerolactama, imidazolidinona, hidantoína, dioxolano, ftalimida, piperidina, 1,4-dioxano, morfolina, tiomorfolina, tiomorfolina-S-óxido, tiomorfolina-S,S-dióxi-do, piperazina, pirano, piridona, 3-pirrolina, tiopirano, pirona, tetra-hidrofurano, tetra-hidrotiofeno, quinuclidi-na. Os grupos heterociclicos preferidos são monociclicos, ainda que eles possam ser fundidos ou ligados de modo covalente a um sistema em anel de arilo ou heteroarilo.
Numa forma de realização preferida, os grupos heterociclicos podem ser representados pela fórmula (AA) abaixo:
onde a fórmula (AA) está ligada via uma valência livre em qualquer dos M1 ou Μ2; M1 representa 0, NRe ou S(0)i; M2 representa CRfR9, 0, S (0) 1 ou NRe; 1 é 0, 1 ou 2; j é 1, 2 ou 3 e k é 1, 2 ou 3, com a condição de que j + k é 3, 4, ou 5; e Ra, Rb, Rc, Rd, Re, Rf e Rg são independentemente selecionados de entre o grupo constituído por hidrogénio, halogéneo, alquilo CR-Cs não substituído ou substituído, alcenilo C2-C8 não substituído ou substituído, alcinilo C2-C8 não substituído ou substituído, -CORh, -C02Rh, -Q1S02R28 -CONRhR1, -NR^OR1, -S02Rh, -S02NRhRi, -NS02RhR1-NRhR1, -ORh, -Q1CORh, -Q1C02Rh, -Q1CONRhRi, -Q1NRhCOR1, 21 ΡΕ2175859 -Q1S02NRhR1, -Q1NS02RhR1, -Q1NRhR1, -Q1ORh, em que Q1 é um membro selecionado de entre o grupo constituído por alquileno Ci-C4, alcenileno C2-C4 e alcinileno C2-C4, e Rh e R1 são independentemente selecionados de entre o grupo constituído por hidrogénio e alquilo Ci-Cs, e em que as porções alifáticas de cada um dos substituintes Ra, Rb, RCr Rd, Re, Rf, R9, Rh e R1 são facultativamente substituídos com desde um até três membros selecionados de entre o grupo constituído por halogéneo, -OH, -0Rn, -0C(0)NHRn, -0C (0) NRnR°, -SH, -SRn, -S(0)Rn, -S(0)2Rn, -S02NH2, -S (0) 2NHRn, -S (0) 2NRnR°, -NHS(0)2Rn, -NRnS(0)2R°, -C(0)NH2, -C (0) NHRn, -C (0) NRnR°, -C(0)Rn, -NHC(0)R°, -NRnC(0)R°, -NHC(0)NH2, -NRnC (0) NH2, -NRnC (0) NHR°, -NHC (0) NHRn, -NRnC (0) NR°RP, -NHC (0)NRnR°, -C02H, -C02Rn, -NHC02Rn, -NRnC02R°, -CN, -N02, -NH2, -NHRn, -NRnR°, -NRnS(0)NH2 e -NRnS (0) 2NHR°, em que Rn, R° e Rp são independentemente um alquilo Ci-C8 não substituído. Adicionalmente, quaisquer dois de Ra, Rb, Rc, Rd, Re, Rf e Rg podem ser combinados para formarem um sistema em anel em ponte ou espirocíclico.
Numa forma de realização preferida, o número de grupos Ra + Rb + Rc + Rd que são diferentes de hidrogénio é 0, 1 ou 2. Numa forma de realização mais preferida, Ra, Rb,
Rc, Rd, Re, Rf, e Rg são independentemente selecionados de entre o grupo constituído por hidrogénio, halogéneo, alquilo Ci-C8 não substituído ou substituído, -C0Rh, -C02Rh, -C0NRhRh, -NRhC0Rh, -S02Rh, -S02NRhRi, -NS02RhRi, -NRhRd e -0Rh, em que Rh e R1 são independentemente selecionados de entre o grupo constituído por hidrogénio e alquilo Ci-C8 não 22 ΡΕ2175859 substituído e em que as porções alifáticas de cada um dos substituintes Ra, Rb, Rc, Rd, Re, Rf e Rg são facultativamente substituídos com desde um até três membros selecionados de entre o grupo constituído por halogéneo, -OH, -0Rn, -0C (0) NHRn, -0C(0)NRnR°, -SH, -SRn, -S(0)R°, -S(0)2Rn, -S02NH2, -S (0) 2NHRn, -S (0) 2NRnR°, -NHS(0)2Rn, -NRnS(0)2R°, -C(0)NH2, -C (0) NHRn, -C(0)NRnR°, -C(0)Rn, -NHC (0) Rn, -NRnC (0) R°, -NHC(0)NH2, -NRnC(0)NH2, -NRnC (0) NHR°, -NHC (0) NHRn, -NRnC (0) NR°RP, -NHC (0) NRnR°, -C02H, -C02Rn, -NHC02Rn, -NRnC02R°, -CN, -N02, -NH2, -NHRn, -NRnR°, -NRnS (0) NH2 e -NRnS (0) 2NHR°, em que Rn, R° e Rp são independentemente um alquilo Ci-Cs não substituído.
Numa forma de realização mais preferida, Ra, Rb, R°, Rd, Re, Rf e Rg são independentemente hidrogénio ou alquilo C1-C4. Numa outra forma de realização preferida, pelo menos três dos Ra, Rb, Rc, Rd, Re, Rf e Rg são hidrogénio. "Heteroarilo" refere-se a um grupo aromático contendo pelo menos um heteroátomo, onde o grupo heteroarilo pode ser monocíclico ou bicíclico. Exemplos incluem piridilo, piridazinilo, pirazinilo, pirimidinilo, triazi-nilo, quinolinilo, quinoxalinilo, quinazolinilo, cinolini-lo, ftalazinilo, benzotriazinilo, purinilo, benzimidazo-lilo, benzopirazolilo, benzotriazolilo, benzisoxazolilo, isobenzofurilo, isoindolilo, indolizinilo, benzotriazinilo, tienopiridinilo, tienopirimidinilo, pirazolopirimidinilo, imidazopiridinas, benzotiazolilo, benzofuranilo, benzoti- 23 ΡΕ2175859 enilo, indolilo, azaindolilo, azaindazolilo, quinolilo, isoquinolilo, isotiazolilo, pirazolilo, indazolilo, pteri-dinilo, imidazolilo, triazolilo, tetrazolilo, oxazolilo, isoxazolilo, oxadiazolilo, tiadiazolilo, pirrolilo, tiazo-lilo, furilo ou tienilo. Os grupos heteroarilo preferidos são aqueles que têm pelo menos um átomo de azoto do anel arilo, tais como quinolinilo, quinoxalinilo, purinilo, benzimidazolilo, benzopirazolilo, benzotriazolilo, benzo-tiazolilo, indolilo, quinolilo, isoquinolilo. Os sistemas heteroarilo em anel de 6 preferidos incluem piridilo, piridazinilo, pirazinilo, pirimidinilo, triazinilo e semelhantes. Os sistemas heteroarilo em anel de 5 preferidos incluem isotiazolilo, pirazolilo, imidazolilo, tienilo, furilo, triazolilo, tetrazolilo, oxazolilo, isoxazolilo, oxadiazolilo, tiadiazolilo, pirrolilo, tiazolilo.
Heterociclilo e heteroarilo podem ser ligados em qualquer carbono ou heteroátomo do anel disponível. Cada heterociclilo e heteroarilo pode ter um ou mais anéis. Quando anéis múltiplos estão presentes, eles podem ser fundidos em conjunto ou ligados de modo covalente. Cada heterociclilo e heteroarilo deve conter pelo menos um heteroátomo (tipicamente 1 a 5 heteroátomos) selecionados de entre azoto, oxigénio ou enxofre. Preferivelmente, estes grupos contêm 0-5 átomos de azoto, 0-2 átomos de enxofre e 0-2 átomos de oxigénio. Mais preferivelmente, estes grupos contêm 0-3 átomos de azoto, 0-1 átomos de enxofre e 0-1 átomos de oxigénio. Os grupos heterociclilo e heteroarilo podem ser substituídos ou não substituídos, a menos que 24 ΡΕ2175859 indicado de outra maneira. Para grupos substituídos, a substituição pode ser num carbono ou heteroátomo. Por exemplo, quando a substituição é oxo (=0 ou -0~) , o grupo resultante pode ter ou um carbonilo (—C (0) —) ou um N-óxido (-N+-0~) .
Substituintes adequados para alquilo substituído, alcenilo substituído, e alcinilo substituído incluem halo-géneo, -CN, -C02R\ -C(0)R', -C(0)NR'R", oxo (=0 ou -0') , -0R', -0C (0) R' , -0C (0) NR' R" -N02, -NR'C(0)R', -NR'',C(0)NR,R", -NR'R", -NR'C02R", -NR'S(0)R", -NR' S (0) 2R' ' ' , -NR' ' ' S (0) NR' R", -NR' ' ' S (0) 2NR' R", -SR', -S(0)R' , -S(0)2R', -s(0) 2NR'R", -NR'-C(NHR")=NR"', -SiR'R"R"', -N3, arilo Cô-Cio substituído ou não substituído, heteroarilo de 5 a 10 membros substituído ou não substituído, e heterociclilo de 3 a 10 membros substituído ou não substituído. 0 número de substituintes possíveis está num intervalo desde zero a (2m'+l), onde m' é o número total de átomos de carbono em tal radical.
Substituintes adequados para arilo substituído, heteroarilo substituído e heterociclilo substituído incluem halogéneo, -CN, -C02R', -C(0)R', -C(0)NR'R", oxo (=0 ou -0"), -0R', -0C (0) R ' , -0C (0) NR ' R" , -N02, -NR'C(0)R", -NR'"C(0)NR'R", -NR'R",-NR'C02R", -NR'S(0)R", -NR'S (0) 2R", -NR'"S(0)NR'R", -NR'"S(0) 2NR'R", -SR', -S(0)R', -S(0)2R', -S(0)2NR'R", -NR,-C(NHR")=NR" ' , -SiR^R" ' , -n3, alquilo Ci-C8 substituído ou não substituído, alcenilo C2-C8 substituído ou não substituído, alcinilo C2-C8 substituído 25 ΡΕ2175859 ou não substituído, arilo C6-C10 substituído ou não substituído, heteroarilo de 5 a 10 membros substituído ou não substituído, e heterociclilo de 3 a 10 membros substituído ou não substituído. O número de substituintes possíveis está no intervalo desde zero até ao número total de valências abertas no sistema em anel aromático.
Conforme usado acima, R', R" e R"' cada um independentemente refere-se a uma variedade de grupos incluindo hidrogénio, alquilo Ci-Cs substituído ou não substituído, alcenilo C2-C8 substituído ou não substituído, alcinilo C2-C8 substituído ou não substituído, arilo substituído ou não substituído, heteroarilo substituído ou não substituído, heterociclilo substituído ou não substituído, arilalquilo substituído ou não substituído, ariloxialquilo substituído ou não substituído. Quando R' e R" são ligados ao mesmo átomo de azoto, eles podem ser combinados com o átomo de azoto para formar um anel de 3, 4, 5, 6 ou 7 membros (por exemplo, -NR'R" inclui 1-pirro-lidinilo e 4-morfolinilo) . Além disso, R' e R", R" e R"' , ou R' e R'" podem em conjunto com o ou os átomos ao qual eles estão ligados, formar um anel de 5 , 6 ou 7 membros substituído ou não substituído.
Dois dos substituintes nos átomos adjacentes de um anel arilo ou heteroarilo podem facultativamente ser trocados com um substituinte da fórmula -T-C(O)-(CH2) q-U-, em que T e U são independentemente -NR"-O-, -CH2- ou uma ligação simples, e q é um inteiro desde 0 até 2. 26 ΡΕ2175859
Alternativamente, dois dos substituintes em átomos adjacentes do anel arilo ou heteroarilo podem facultativamente ser trocados com um substituinte da fórmula -A' - (CH2) rB'em que A' e B' são independentemente -CH2-, -0-, -NR""-, -S-, -S(0)-, -S(0)2_, -S (0) 2NR"ou uma ligação simples, e r é um inteiro desde 1 até 3. Uma das ligações simples do novo anel assim formado pode facultativamente ser trocada com uma ligação dupla. Alternativamente, dois dos substituintes sobre átomos adjacentes do anel arilo ou heteroarilo podem facultativamente ser trocados com um substituinte da fórmula - (CH2) S_X_ (CH2) t~ r onde set são independentemente inteiros desde 0 até 3, e X é -0-, -NR"-S-, -S(0)-, -S(0)2 ou -S (0) 2NR' -. R"" é selecionado de entre hidrogénio ou alquilo Ci-Cg não substituído. "Heteroátomo" tem a intenção de incluir oxigénio (0), azoto (N), enxofre (S) e silicio (Si).
Agente de suporte, diluente ou excipiente "farma-ceuticamente aceitável" é um agente de suporte, diluente ou excipiente compatível com os outros ingredientes da formulação e não deletério para o seu recipiente. "Sal farmaceuticamente aceitável" refere-se a um sal que é aceitável para administração a um paciente, tal como um mamifero (e.g., sais tendo segurança aceitável para mamíferos para um dado regime de dosagem). Tais sais podem ser derivados de bases farmaceuticamente aceitáveis e de ácidos inorgânicos ou orgânicos farmaceuticamente 27 ΡΕ2175859 aceitáveis, dependendo dos substituintes particulares encontrados nos compostos aqui descritos. Quando os compostos da presente invenção contêm funcionalidades relativamente acidicas, os sais de adição de base podem ser obtidos pelo contacto da forma neutra de tais compostos com uma quantidade suficiente da base desejada, ou sem diluição ou num solvente inerte adequado. Os sais derivados de bases inorgânicas farmaceuticamente aceitáveis incluem alumínio, amónio, cálcio, cobre, férrico, ferroso, lítio, magnésio, mangânico, manganoso, potássio, sódio, zinco. Os sais derivados de bases orgânicas farmaceuticamente aceitáveis incluem sais de aminas primária, secundária, terciária e quaternária , incluindo aminas substituídas, aminas cíclicas, aminas de ocorrência natural, tais como arginina, betaína, cafeína, colina, N,N'-dibenziletilenodiamina, dietilamina, 2-dietilaminoetanol, 2-dimetilaminoetanol, etanolamina, etilenodiamina, N-etilmorfolina, N-etilpi-peridina, glucamina, glucosamina, histidina, hidrabamina, isopropilamina, lisina, metilglucamina, morfolina, pipera-zina, piperidina, resinas de poliamina, procaína, purinas, teobromina, trietilamina, trimetilamina, tripropilamina, trometamina. Quando os compostos da presente invenção contêm funcionalidades relativamente básicas, os sais de adição de ácido podem ser obtidos pelo contacto da forma neutra de tais compostos com uma quantidade suficiente do ácido desejado, ou sem diluição ou num solvente inerte adequado. Os sais derivados de ácidos farmaceuticamente aceitáveis incluem acético, ascórbico, benzenossulfónico, benzóico, canforossulfónico, cítrico, etanossulfónico, 28 ΡΕ2175859 fumárico, glucónico, glucurónico, glutâmico, hipúrico, bromídrico, clorídrico, isetiónico, lático, latobiónico, maleico, málico, mandélico, metanossulfónico, múcico, naftalenossulfónico, nicotínico, nítrico, pamóico, panto-ténico, fosfórico, succínico, sulfúrico, tartárico, p-toluenossulfónico.
Também incluídos estão os sais de aminoácidos tais como arginato e semelhantes, e sais de ácidos orgânicos como os ácidos glucurónico ou galacturónico (ver, por exemplo, S. M. Berge et al., "Pharmaceutical Salts" in J. Pharmaceutical Science, 66 (1977) 1-19). Certos compostos específicos da presente invenção contêm funcionalidades não só básicas mas também acídicas que permitem aos compostos ser convertidos em sais de adição quer de base que de ácido.
As formas neutras dos compostos podem ser regeneradas pelo contacto do sal com uma base ou ácido e isolando o composto progenitor da maneira convencional. A forma progenitora dos composto difere das várias formas de sal em certas propriedades físicas, tais como solubilidade em solventes polares, mas por outro lado os sais são equivalentes à forma progenitora dos composto para os propósitos da presente invenção. "Seu sal" refere-se a um composto formado quando o hidrogénio de um ácido é trocado por um catião, tal como catião de metal ou um catião orgânico. Preferivelmente, o 29 ΡΕ2175859 sal é um sal f armaceuticamente aceitável, ainda que isto não seja requerido para sais de compostos intermediários, os quais não são pretendidos para administração a um paciente.
Os pró-fármacos dos compostos aqui descritos são aqueles compostos que prontamente se submetem a mudanças químicas sob condições fisiológicas para proporcionarem os compostos da presente invenção. Adicionalmente, os pró-fármacos podem ser convertidos aos compostos da presente invenção por métodos químicos ou bioquímicos num ambiente ex vivo. Por exemplo, os pró-fármacos podem ser lentamente convertidos aos compostos da presente invenção quando colocados num reservatório de penso transdérmico com uma enzima ou reagente químico adequados.
Os pró-fármacos podem ser preparados pela modificação de grupos funcionais presentes nos compostos duma maneira tal que as modificações são clivadas, ou em manipulação de rotina ou in vivo, até aos compostos progenitores. Os pró-fármacos incluem compostos em que os grupos hidroxilo, amino, sulfidrilo ou carboxilo são ligados a qualquer grupo que, quando administrado a um indivíduo mamífero, cliva para formar um grupo livre hidroxilo, amino, sulfidrilo ou carboxilo respetivamente. Exemplos de pró-fármacos incluem derivados acetato, formato e benzoato de grupos funcionais álcool e amina nos compostos da invenção. A preparação, seleção e uso de pró--fármacos é discutida em T. Higuchi e V. Stella, "Pro-drugs 30 ΡΕ2175859 as Novel Delivery Systems", Vol. 14 de A.C.S. Symposium Series; "Design of Prodrugs", ed. H. Bundgaard, Elsevier, 1985; e em Bioreversible Carriers in Drug Design, ed. Edward B. Roche, American Pharmaceutical Association e Pergamon Press, 1987.
Os compostos da invenção podem estar presentes na forma dos seus metabolitos farmaceuticamente aceitáveis. O termo "metabolito" significa uma forma farmaceuticamente aceitável de um derivado metabólico dum composto da invenção (ou um seu sal) . Em alguns aspetos, o metabolito pode ser um derivado funcional dum composto que é prontamente convertivel in vivo num composto ativo. Noutros aspetos, o metabolito pode ser um composto ativo. "Quantidade terapeuticamente eficaz" refere-se a uma quantidade suficiente para efetuar o tratamento quando administrada a um paciente com necessidade de tratamento. "Tratamento" conforme aqui usado refere-se ao tratamento de uma doença ou condição médica (tal como uma infeção virai, bacteriana ou fúngica ou outras doenças infeciosas, bem como condições autoimunes ou inflamatórias) num paciente, tal como um mamífero (particularmente um humano ou um animal de companhia) que inclui a melhoria da doença ou condição médica, isto é, a eliminação ou regressão da cura da doença ou condição médica num paciente; a supressão da doença ou condição médica, isto é, o abrandamento ou paragem do desenvolvimento da doença ou 31 ΡΕ2175859 condição médica num paciente; ou o alivio dos sintomas da doença ou condição médica num paciente.
Certos compostos da presente invenção podem existir em formas não solvatadas, incluindo formas hidratadas. Em geral, ambas as formas solvatada e não solvatada têm a intenção de estar abrangidas pelo âmbito e alcance da presente invenção. Certos compostos da presente invenção podem existir em formas cristalinas múltiplas ou amorfas (isto é, como polimorfos) . Em geral, todas as formas físicas são equivalentes para os usos contemplados pela presente invenção e têm a intenção de estar dentro do âmbito e alcance da presente invenção.
Será evidente para um perito na técnica que certos compostos da presente invenção podem existir em formas tautoméricas, estando todas tais formas tautoméricas dos compostos dentro do âmbito e alcance da invenção. Certos compostos da presente invenção possuem átomos de carbono assimétricos (centros óticos) ou ligações duplas; os racematos, diastereómeros, isómeros geométricos e isómeros individuais (e.g., enantiómeros separados) são todos pensados como estando englobados dentro do âmbito e alcance da presente invenção. Os compostos da presente invenção também podem conter proporções não naturais de isótopos atómicos num ou mais dos átomos que constituem tais compostos. Por exemplo, os compostos podem ser marcados radioativamente com isótopos radioativos, tais como por exemplo trítio (3H) , iodo-125 (125I) ou carbono-14 32 ΡΕ2175859 (14C). Todas as variações isotópicas dos compostos da presente invenção, quer radioativas ou não, têm a intenção de estar abrangidas pelo âmbito e alcance da presente invenção.
Os compostos da presente invenção podem incluir um rótulo detetável. Um rótulo detetável é um grupo que é detetável em baixas concentrações, usualmente inferiores a micromolar, possivelmente inferiores a nanomolar, e que podem ser prontamente distinguidos de outras moléculas, devido a diferenças numa propriedade molecular (e.g. massa molecular, razão massa por carga, radioatividade, potencial redox, luminescência, fluorescência, propriedades eletromagnéticas, propriedades de ligação). Os rótulos detetáveis podem ser detetados por meios espetroscópicos, fotoqui-micos, bioquimicos, imunoquimicos, elétricos, magnéticos, eletromagnéticos, óticos ou quimicos.
Uma grande variedade de rótulos detetáveis estão dentro do âmbito e alcance da presente invenção, incluindo rótulos de hapteno (e.g. biotina, ou rótulos usados em conjunção com detetáveis anticorpos tais como anticorpos de peroxidase de rábano silvestre); rótulos de etiqueta de massa (e.g. rótulos de isótopo estável); rótulos radio-isotópicos (incluindo 3H, 125I, 35S, 14C ou 32P) ; rótulos de quelato de metal; rótulos luminescentes incluindo rótulos fluorescentes (tais como fluoresceina, isotiocianato, vermelho do Texas, rodamina, proteina fluorescente verde), rótulos fosforescentes e rótulos quimioiluminescentes, 33 ΡΕ2175859 tendo tipicamente rendimento de quantum maior do que 0,1; rótulos de transferência eletroativa e de eletrão; rótulos moduladores de enzima incluindo coenzimas, catalisadores organometálicos peroxidase de rábano silvestre, fosfatase alcalina e outras comummente usadas num ELISA; rótulos fotossensibilizadores; rótulos de pérola magnética incluindo Dynabeads; rótulos colorimétricos tais como rótulos de ouro coloidal, prata, selénio ou outros metais sol (ver Patente dos E.U.A N° 5 120 643, ou rótulos de pérola de vidro ou plástico colorido (e.g., polistireno, polipro-pileno, látex); e rótulos pretos de carbono. Patentes ensinando o uso de tais rótulos detetáveis incluem as Patentes dos E.U.A Nos 3 817 837, 3 850 752, 3 939 350, 3 996 345, 4 277 437, 4 275 149, 4 366 241, 6 312 914, 5 990 479, 6 207 392, 6 423 551, 6 251 303, 6 306 610, 6 322 901, 6 319 426, 6 326 144 e 6 444 143 Rótulos detetáveis estão comercialmente disponíveis ou podem ser preparados conforme conhecido de um perito na técnica. Os rótulos detetáveis podem ser ligados de modo covalente aos compostos usando um grupo funcional reativo, os quais podem ser localizados em qualquer posição apropriada. Métodos para prender um rótulo detetável são conhecidos de um perito na técnica. Quando o grupo reativo está ligado a um alquilo, ou a cadeia de alquilo substituído amarrada a um núcleo de arilo, o grupo reativo pode estar localizado numa posição terminal duma cadeia de alquilo. 34 ΡΕ2175859
Compostos
Em certas formas de realização, os compostos da presente invenção são compostos da fórmula (II), ou seus sais: R1
onde: 1 2 R e R são cada um independentemente hidrogénio, halogéneo, alquilo Ci-C8, -CN ou haloalquilo Ci-C8, com a condição de que pelo menos um dos R1 ou R2 é diferente de hidrogénio; R4 é hidrogénio; R5 é halogéneo ou alquilo Ci-C8; R11 é selecionada de entre o grupo constituído por hidrogénio, alquilo Ci-C8, alcenilo C2_C8, alcinilo C2-C8, arilo C6_Cio substituído ou não substituído, heteroarilo de 5 a 10 membros substituído ou não substituído e heterociclo de 3 a 10 membros substituído ou não substituído.
Formas de realização Preferidas em qualquer uma da fórmula II: R1 é halogéneo. 35 ΡΕ2175859 R2 é haloalquilo Ci-Cg. R1 é Cl e R2 é CF3. R1 é metilo e R2 é CF3. R5 é halogéneo. R5 é cloro. R5 é alquilo Ci-Cg. R5 é metilo. R11 é H ou alquilo C1-C4, mais preferivelmente H.
Compostos que Modulam a Atividade de CCR2 A presente invenção proporciona compostos que modulam pelo menos uma atividade de CCR2. Os recetores de quimiocina são proteínas de membrana integrais que interagem com um ligando extracelular, tais como uma quimiocina, e medeiam a resposta celular ao ligando, e.g., quimiotatismo, concentração de ião cálcio intracelular aumentada. Por conseguinte, a modulação duma função do recetor de quimiocina, e.g., interferência com interação do ligando do recetor de quimiocina, vai modular uma resposta mediada pelo recetor de quimiocina, e tratar ou prevenir uma condição ou doença mediada pelo recetor de quimiocina. A modulação duma função do recetor de quimiocina inclui não só a indução mas também a inibição da função. 0 tipo de modulação efetuada dependerá das caraterísticas do composto, isto é, antagonista ou agonista completo, parcial ou inverso. 36 ΡΕ2175859
Sem a pretensão de estar limitado por qualquer teoria particular, acredita-se que os compostos aqui proporcionados interferem com a interação entre um recetor de quimiocina e um ou mais ligandos cognatos. Em particular, acredita-se que os compostos interferem com a interação entre CCR2 e um ligando de CCR2, tal como MCP-1. Os compostos contemplados pela invenção incluem os compostos exemplares aqui proporcionados e seus sais.
Por exemplo, os compostos desta invenção atuam como antagonistas potentes de CCR2, e esta atividade antagonistica foi ainda confirmada em testagem animal à inflamação, um dos estados de doença marca registada para CCR2. Em concordância, os compostos aqui proporcionados são úteis em composições farmacêuticas, métodos para o tratamento de doenças mediadas por CCR2, e como controlos em ensaios para a identificação de antagonistas de CCR2 competitivos.
Composições que Modulam a Atividade de Quimiocina
Num outro aspeto, a presente invenção proporciona composições que modulam a atividade de quimiocina, especificamente a atividade de CCR2. Geralmente, as composições para a modulação da atividade do recetor de quimiocina em humanos e animais compreenderá um excipiente ou diluente farmaceuticamente aceitável e um composto tendo a fórmula proporcionada acima como fórmula (II). 37 ΡΕ2175859 0 termo "composição" conforme aqui usado tem a intenção de abranger um produto compreendendo os ingredientes especificados nas quantidades especificadas, bem como qualquer produto que resulta, diretamente ou indiretamente, da combinação dos ingredientes especificados nas quantidades especificadas. Por "farmaceuticamente aceitável" entende-se que o agente de suporte, diluente ou excipiente deve ser compatível com os outros ingredientes da formulação e não deletérios para o seu recipiente.
As composições farmacêuticas para a administração dos compostos desta invenção podem convenientemente ser apresentadas em forma de dosagem unitária e podem ser preparadas por qualquer dos métodos bem conhecidos na técnica de farmácia. Todos os métodos incluem o passo de levar o ingrediente ativo à associação com o agente de suporte o qual constitui um ou mais ingredientes acessórios. Em geral, as composições farmacêuticas são preparadas levar o ingrediente ativo à associação com a agente de suporte líquido ou um agente de suporte sólido finamente dividido ou ambos, e em seguida, se necessário, dando forma ao produto na formulação desejada. Na composição farmacêutica o composto objeto ativo é incluído numa quantidade suficiente para produzir o efeito desejado no processo ou condição de doenças.
As composições farmacêuticas contendo o ingrediente ativo podem estar numa forma adequada para uso oral, por exemplo, na forma de comprimidos, trociscos, 38 ΡΕ2175859 pastilhas, suspensões aquosas ou oleosas, pós ou grânulos dispersíveis, emulsões e autoemulsificações conforme descrito na Patente dos E.U.A. 6 451 339, cápsulas duras ou moles, ou xaropes ou elixires. As composições pretendidas para uso oral podem ser preparadas de acordo com qualquer método conhecido na técnica para o fabrico de composições farmacêuticas. Tais composições podem conter um ou mais agentes selecionados de entre agentes adoçantes, agentes de aromatização, agentes corantes e agentes conservantes de maneira a proporcionar preparações farmaceuticamente elegantes e de bom paladar. Os comprimidos contêm o ingrediente ativo em mistura com outros excipientes farmaceuticamente aceitáveis não tóxicos os quais são adequados para o fabrico de comprimidos. Estes excipientes podem ser, por exemplo, diluentes inertes tais como celulose, dióxido de silício, óxido de alumínio, carbonato de cálcio, carbonato de sódio, glucose, manitol, sorbitol, lactose, fosfato de cálcio ou fosfato de sódio; agentes de granulação e desintegração, por exemplo, amido de milho, ou ácido algínico; agentes de ligação, por exemplo PVP, celulose, PEG, amido, gelatina ou acácia, e agentes de lubrificação, por exemplo estearato de magnésio, ácido esteárico ou talco. Os comprimidos podem ser não revestidos ou eles podem ser revestidos entericamente ou de outro modo por técnicas conhecidas para atrasar a desintegração e absorção no trato gastrointestinal e por esse meio proporcionar uma ação sustentada ao longo de um período mais longo. Por exemplo, um material que atrasa o tempo tal como monostearato de glicerilo ou distearato de glicerilo 39 ΡΕ2175859 pode ser empregue. Eles também podem ser revestidos pelas técnicas descritas nas Pat. dos E.U.A. Nos 4 256 108, 4 166 452 e 4 265 874 para formar comprimidos terapêuticos osmóticos para libertação de controlo.
Formulações para uso oral também podem ser apresentadas na forma de cápsulas de gelatina dura em que o ingrediente ativo é misturado com um diluente sólido inerte, por exemplo, carbonato de cálcio, fosfato de cálcio ou caulino, ou as cápsulas de gelatina mole em que o ingrediente ativo é misturado com água ou um meio de óleo, por exemplo óleo de amendoim, parafina liquida, ou óleo de oliva. Adicionalmente, as emulsões podem ser preparadas com um ingrediente não miscível em água tal como óleos e estabilizadas com agentes tensioativos tais como mono-diglicéridos, ésteres de PEG.
As suspensões aquosas contêm os materiais ativos em mistura com excipientes adequados para o fabrico de suspensões aquosas. Tais excipientes são agentes de suspensão, por exemplo carboximetilcelulose sódica, metil-celulose, hidroxipropilmetilcelulose, alginato de sódio, polivinilpirrolidona, goma tragacanta e goma acácia; agentes de dispersão ou molhantes podem ser um fosfatídio de ocorrência natural, por exemplo lecitina, ou produtos de condensação de um óxido de alquileno com ácidos gordos, por exemplo estearato de polioxietileno, ou produtos de condensação de óxido de etileno com álcoois alifáticos de cadeia comprida, por exemplo heptadecaetileno-oxicetanol, 40 ΡΕ2175859 ou produtos de condensação de óxido de etileno com ésteres parciais derivados de ácidos gordos e um hexitol tal como polioxietileno monooleato de sorbitol, ou produtos de condensação de óxido de etileno com ésteres parciais derivados de ácidos gordos e anidridos de hexitol, por exemplo polietileno monooleato de sorbitano. As suspensões aquosas também podem conter um ou mais conservantes, por exemplo p-hidroxibenzoato de etilo ou n-propilo, um ou mais agentes corantes, um ou mais agentes de aromatização, e um ou mais agentes adoçantes, tais como sacarose ou sacarina.
As suspensões oleosas podem ser formuladas suspendendo o ingrediente ativo num óleo vegetal, por exemplo óleo de aráquis, óleo de oliva, óleo de sésamo ou óleo de coco, ou num óleo mineral tal como parafina liquida. As suspensões oleosas podem conter um agente espessante, por exemplo cera de abelhas, parafina dura ou álcool cetilico. Agentes adoçantes, tais como aqueles estabelecidos acima, e agentes de aromatização podem ser adicionados para proporcionarem uma preparação oral agradável ao paladar. Tais composições podem ser conservadas pela adição de um antioxidante tal como ácido ascórbico. Pós e grânulos dispersiveis adequados para a preparação de uma suspensão aquosa pela adição de água proporcionam o ingrediente ativo em mistura com um agente de dispersão ou molhante, agente de suspensão e um ou mais conservantes. Agentes de dispersão ou molhantes e agentes de suspensão adequados são exemplificados por aqueles já 41 ΡΕ2175859 mencionados acima. Excipientes adicionais, por exemplo agentes adoçantes, aromatizantes e corantes, também podem estar presentes.
As composições farmacêuticas da invenção também podem estar na forma de óleo em emulsões em água. A fase oleosa pode ser um óleo vegetal, por exemplo óleo de oliva ou óleo de aráquis, ou um óleo mineral, por exemplo parafina liquida ou misturas destes. Os agentes de emulsificação adequados podem ser gomas de ocorrência natural, por exemplo goma acácia ou goma tragacanta, fosfatidios de ocorrência natural, por exemplo soja, lecitina, e ésteres ou ésteres parciais derivados de ácidos gordos e anidridos de hexitol, por exemplo monooleato de sorbitano, e produtos de condensação dos referidos ésteres parciais com óxido de etileno, por exemplo polioxietileno monooleato de sorbitano. As emulsões também podem conter adoçantes e agentes de aromatização.
Xaropes e elixires podem ser formuladas com agentes adoçantes, por exemplo glicerol, propilenoglicol, sorbitol ou sacarose. Tais formulações também podem conter um demulcente, um conservante e aromatizante e agentes corantes. As soluções orais podem ser preparadas em combinação com, por exemplo, ciclodextrina, PEG e agentes tensioativos.
As composições farmacêuticas pode estar na forma de uma suspensão aquosa ou oleaginosa injetável estéril. 42 ΡΕ2175859
Esta suspensão pode ser formulada de acordo com a técnica conhecida usando aqueles agentes de dispersão ou molhantes e agentes de suspensão adequados que foram mencionados acima. A preparação injetável estéril também pode ser uma solução ou suspensão injetável estéril num diluente ou solvente parentericamente aceitável não tóxico, por exemplo na forma duma solução em butano-1,3-diol. De entre os veículos e solventes aceitáveis que podem ser empreguem estão a água, solução de Ringer e solução isotónica de cloreto de sódio. Em adição, óleos fixados, estéreis, são convencionalmente empregues como solvente ou meio de suspensão. Para este propósito qualquer óleo fixado suave pode ser empregue incluindo mono ou diglicéridos sintéticos. Em adição, ácidos gordos tais como ácido oleico encontram uso na preparação de injetáveis.
Os compostos da presente invenção também podem ser administrados na forma de supositórios para administração retal do fármaco. Estas composições podem ser preparadas por mistura do fármaco com um excipiente adequado não irritante que é sólido a temperaturas ordinárias mas liquido à temperatura retal e por conseguinte fundirá no reto para libertar o fármaco. Tais materiais são manteiga de cacau e polietilenoglicois. Adicionalmente, os compostos podem ser administrados via entrega ocular por meio de soluções ou pomadas. Mais ainda, a entrega transdérmica dos compostos sujeitos pode ser conseguida por meio de pensos ionoforéticos e semelhantes. 43 ΡΕ2175859
For uso tópico, são empregues cremes, pomadas, geleias, soluções ou suspensões contendo os compostos da presente invenção. Conforme aqui usado, aplicação tópica significa também que inclui o uso de lavagens e gargarejos para a boca.
As composições farmacêuticas e métodos da presente invenção podem ainda compreender outros compostos terapeuticamente ativos conforme aqui notado, tais como aqueles aplicados no tratamento das condições patológicas acima mencionadas.
Numa forma de realização, a presente invenção proporciona uma composição constituída por um agente de suporte farmaceuticamente aceitável e um composto da invenção.
Medição da Eficácia de Moduladores de Quimiocina
Ensaios In Vitro
Uma variedade de ensaios pode ser usada para avaliar os compostos aqui proporcionados, incluindo ensaios de sinalização, ensaios de migração, ensaios de ligação de ligando, e outros ensaios de resposta celular. Os ensaios de sinalização do recetor de quimiocina podem ser usados para medir a capacidade dum composto, tal como um potencial antagonista de CCR2, para bloquear a sinalização induzida por ligando de CCR2 (e.g. MCP-1) . Um ensaio de migração pode ser usado para medir a capacidade dum composto de 44 ΡΕ2175859 interesse, tal como um possível antagonista de quimiocina, para bloquear a migração da célula in vitro mediada por quimiocina. Esta última é acreditada assemelhar-se à migração de célula in vivo induzida por quimiocina. Um ensaio de ligação de ligando pode ser usado para medir a capacidade dum composto, tal como um potencial antagonista de CCR2, para bloquear a interação de MCP-1 com o seu recetor.
Num ensaio adequado, uma proteína quimiocina (quer isolada quer recombinante) é usada, a qual tem pelo menos uma propriedade, atividade, ou caraterística funcional duma proteína quimiocina de mamífero. A propriedade pode ser uma propriedade de ligação (a, por exemplo, um ligando ou inibidor), uma atividade de sinalização (e.g., ativação duma proteína G de mamífero, indução de aumento rápido e transiente na concentração de ião cálcio livre citosólico), função resposta celular (e.g., estimulação de quimiotatismo ou libertação do mediador inflamatório por leucócitos). 0 ensaio pode ser um ensaio à base de célula que utiliza células estavelmente ou transientemente transfetadas com um vetor ou cassete de expressão tendo uma sequência de ácido nucleico que codifica o recetor de quimiocina. As linhas celulares expressando naturalmente a quimiocina também podem ser usadas. As células são mantidas sob condições apropriadas para a expressão do recetor e são postas em contacto com um agente putativo sob condições 45 ΡΕ2175859 apropriadas para a ligação ocorrer. A ligação pode ser detetada usando técnicas padrão. Por exemplo, a extensão da ligação pode ser determinada relativamente a um controlo adequado (por exemplo, relativamente ao fundo na ausência de um agente putativo, ou relativamente to um ligando conhecido). Facultativamente, uma fração celular, tal como uma fração de membrana, contendo o recetor pode ser usada em vez de células completas. A deteção de ligação ou formação de complexo pode ser detetada diretamente ou indiretamente. Por exemplo, o agente putativo pode ser rotulado com um rótulo adequado (e.g., rótulo fluorescente, rótulo quimioluminescente, rótulo de isótopo, rótulo de enzima e a ligação pode ser determinada pela deteção do rótulo. A ligação especifica e/ou competitiva pode ser avaliada por estudos de competição ou deslocamento, usando agente não rotulado ou um ligando (e.g., MCP-1) como competidor.
Ensaios de inibição de ligação podem ser usados para avaliar os compostos presentes. Nestes ensaios, os compostos são avaliados como inibidores de ligação de ligando usando, por exemplo, MCP-1. Numa forma de realização, o recetor CCR2 é posto em contacto com um ligando tal como MCP-1 e é feita uma medida da ligação do ligando. 0 recetor é em seguida posto em contacto com um agente de teste na presença dum ligando (e.g., MCP-1) e é feita uma segunda medida da ligação. Uma redução na extensão da ligação de ligando é indicativa da inibição da 46 ΡΕ2175859 ligação pelo agente de teste. Os ensaios de inibição da ligação podem ser realizados usando células completas que expressam a quimiocina, ou uma fração de membrana de células que expressam a quimiocina. A ligação dum recetor acoplado à proteina G por, por exemplo, um agonista, pode resultar num evento de sinalização pelo recetor. Em concordância, os ensaios de sinalização também podem ser usados para avaliar os compostos da presente invenção e a indução da função sinalização por um agente pode ser monitorizada usando qualquer método adequado. Por exemplo, a atividade da proteina G, tal como hidrólise de GTP a GDP, ou eventos de sinalização tardios desencadeados pela ligação do recetor podem ser avaliados por métodos conhecidos (ver, por exemplo, PCT/US97/15915; Neote et al., Cell, 72 (1993) 415425; Van Riper et al., J. Exp. Med., 177 (1993) 851-856 e Dahinden et al., J. Exp. Med., 179 (1994) 751-756).
Os ensaios de quimiotatismo também podem ser usados para avaliar a função do recetor e avaliar os compostos aqui proporcionados. Estes ensaios são baseados na migração funcional de células In vltro ou in vivo induzida por um agente, e podem ser usados para avaliar a ligação e/ou efeito no quimiotatismo de ligandos, inibido-res ou agonistas. Uma variedade de ensaios de quimiotatismo são conhecidos na técnica, e qualquer ensaio adequado pode ser usado para avaliar os compostos da presente invenção. Exemplos de ensaios adequados incluem aqueles descritos em 47 ΡΕ2175859 PCT/US97/15915; Springer et al., WO 94/20142; Berman et al., Immunol. Invest., 17 (1988) 625-677; e Kavanaugh et al., J. Immunol., 146 (1991) 4149-4156).
Os ensaios de sinalização de cálcio medem a concentração de cálcio ao longo do tempo, preferivelmente antes e depois da ligação ao recetor. Estes ensaios podem ser usados para quantificar a geração dum mediador de sinalização de recetor, Ca++, a seguir à ligação ao recetor (ou sua ausência). Estes ensaios são úteis na determinação da capacidade dum composto, tais como aqueles da presente invenção, para gerar o mediador de sinalização de recetor pela ligação a um recetor de interesse. Também, estes ensaios são úteis na determinação da capacidade dum composto, tais como aqueles da presente invenção, para inibir a geração do mediador de sinalização de recetor por interferência com a ligação entre um recetor de interesse e um ligando.
Em ensaios de sinalização de cálcio usados para determinar a capacidade de um composto interferir com a ligação entre um recetor de quimiocina e um ligando de quimiocina conhecido, células expressando o recetor de quimiocina (células expressando CCR2 tais como células THP-1) são primeiro incubadas com um composto de interesse, tal como um potencial antagonista de quimiocina, em concentrações crescentes. O número de células pode ser desde 105 a 5xl05 células por cavidade numa placa de microtitulação de 96 cavidades. A concentração do composto a ser testado pode 48 ΡΕ2175859 variar desde 0 a 100 μΜ. Após um período de incubação (que pode variar desde 5 até 60 minutos), as células tratadas são colocadas num Leitor de Placa de Imagens Fluorimétricas («Fluorometric Imaging Plate Reader») (FLIPR®) (disponível em Molecular Devices Corp., Sunnyvale, CA) de acordo com as instruções do fabricante. O sistema FLIPR® é bem conhecido dos peritos na técnica como método padrão de realização de ensaios. As células são em seguida estimuladas com uma quantidade apropriada do ligando de quimiocina (MCP-1 para CCR2) numa concentração final de 5-100 nM, e o sinal de aumento do cálcio intracelular (também chamado fluxo de cálcio) é registado. A eficácia de um composto como inibidor de ligação entre a quimiocina e o ligando pode ser calculada como uma CI5o (a concentração necessária para causar 50% de inibição na sinalização) ou CI90 (com 90% de inibição).
Ensaios de migração celular in vitro podem ser realizados usando a microcâmara de 96 cavidades (chamada ChemoTX™) . 0 sistema ChemoTX™ é bem conhecido dos peritos na técnica como um tipo de instrumento de migração quimiotática/celular. Neste ensaio, as células expressando CCR2 (tais como THP-1) são primeiro incubadas com um composto de interesse, tal como um possível antagonista de CCR2, respetivamente, em concentrações crescentes. Tipicamente, são usadas cinquenta mil células por cavidade, mas a quantidade pode variar desde 103-106 células por cavidade. O ligando de quimiocina (por exemplo, MCP-1 ligando de CCR2, tipicamente em 0,1 nM (mas pode variar desde 5- 49 ΡΕ2175859 100 nM) é colocado na câmara inferior e o aparelho de migração é montado. Vinte microlitros de células tratadas com composto de teste são em seguida colocadas sobre a membrana. A migração é deixada ocorrer a 37 °C durante um período de tempo, tipicamente 1,5 horas para CCR2. No fim da incubação, o número de células que migrou através da membrana para a câmara inferior é em seguida quantificado. A eficácia de um composto como inibidor de migração celular mediada por quimiocina é calculada como CI5o (a concentração necessária para migração celular reduzida por 50%) ou CI9o (para 90% de inibição) .
Ensaio BiRAM
Exemplos de rastreios primários para identificar antagonistas de quimiocina incluem o ensaio BiRAM (WO 02101350, US 2004023286), o qual deteta impactos potenciais pela sua capacidade para ativar a migração celular sob concentração inibitória de quimiocina. Para começar um tal ensaio, células expressando quimiocina (tais como células THP-1 para ensaio de CCR2) são colhidas por centrifugação de suspensão celular a 1000 RPM numa centrífuga GS-6R Beckman. O pélete celular é ressuspenso em tampão de quimiotatismo (HBSS/BSA 0,1%) a 10 x 106 células/mL para ensaio de CCR2. Vinte e cinco microlitros de células são misturados com um volume igual dum composto de teste diluído até 2 0 μΜ no mesmo tampão. Vinte microlitros da mistura são transferidos para o filtro na câmara de quimiotatismo superior, com 29 pL de solução de quimiocina 50 ΡΕ2175859 contendo ligando de quimiocina (quimiocina MCP-1 100 nM e proteína ΜΙΡ-Ια para ensaio de CCR2) são colocados na câmara inferior. A seguir a uma incubação a 37 °C (90 minutos para CCR2), o ensaio é terminado por remoção de gotas de células do alto do filtro. Para quantificar as células migradas através da membrana, 5 yL de solução 7X CyQUANT® são adicionados a cada cavidade na câmara inferior, e o sinal de fluorescência medido num leitor de placa de fluorescência Spectrafluor Plus (TECAN, Durham, NC) .
Para a seleção de impactos potenciais, o nível de ativação de migração é calculado como um índice RAM - a razão entre o sinal duma cavidade particular e o sinal mediano da placa completa. Os compostos com um índice RAM maior do que 1,5 para ensaio de CCR2 são vistos como positivo a RAM, e são selecionados para determinações de CI50 em ensaios funcionais convencionais.
Ensaio de Fluxo de Cálcio O ensaio de fluxo de cálcio mede um aumento no cálcio intracelular a seguir à ativação do recetor induzida por ligando e pode ser empregue um ensaio secundário a seguir ao rastreio primário. Um tal ensaio pode ser realizado, por exemplo, numa máquina FLIPR® (Molecular Devices, Mountain View, CA). Para começar um ensaio, células expressando quimiocina (tais como células THP-1 para ensaio de CCR2) são colhidas por centrifugação da suspensão celular, e ressuspensas a 1,5 x 106 células/mL em 51 ΡΕ2175859 HBSS (com soro bovino fetal 1%). As células são em seguida rotuladas com um corante indicador de cálcio Fluo-4 AM durante 45 minutos a 37 °C com agitação suave. A seguir à incubação, as células fazem um pélete, são lavadas uma vez com HBSS e ressuspensas no mesmo tampão a uma densidade de 1,6 x 106 células/mL. Cem microlitros de células rotuladas são misturados com 10 yL de composto de teste nas concentrações apropriadas numa placa de ensaio. A proteína quimiocina (MCP-1 numa concentração final de 0,1 nM para ensaio de CCR2) é adicionada para ativar o recetor. O grau de inibição é determinado por comparação dos sinais de cálcio entre células tratadas com composto e não tratadas. Cálculos de CI50 são ainda realizados por análise de regressão não linear método dos quadrados usando Graphpad Prism (Graphpad Software, San Diego, CA).
Ensaio de Ligação de Ligando O ensaio de ligação de ligando pode ser usado para determinar a capacidade de potenciais antagonistas de CCR2 para bloquear a interação entre CCR2 e o seu ligando MCP-1. Células THP-1 expressando CCR2 são centrifugadas e ressuspensas em tampão de ensaio (HEPES 20 mM pH 7,1, NaCl 140 mM, CaCl2 1 mM, MgCl2 5 mM, e com albumina de soro bovino 0,2%) até uma concentração de 2,2 x 105 células/mL. Os ensaios de ligação são estabelecidos como segue. Primeiro, 0,09 mL de células (1 x 105 células THP-1/ cavidade) foram adicionados às placas de ensaio contendo os compostos, dando uma concentração final de ~2-10 μΜ de cada 52 ΡΕ2175859 composto para rastreio (ou parte duma resposta à dose para determinações de CI5o do composto). Em seguida 0,09 mL de MCP-1 rotulada com 125I (obtido de Amersham; Piscataway, NJ) diluídos em tampão de ensaio até uma concentração final de -50 pM, produzindo ~30 000 cpm por cavidade, são adicionados, as placas seladas e incubadas durante aproximadamente 3 horas a 4 °C numa plataforma agitadora. As reações são aspiradas sobre filtros de vidro GF/B pré-embebidos em solução 0,3% de polietilenoimina (PEI), num colhedor de células a vácuo (Packard Instruments; Meriden, CT) . O fluido de cintilação (50 yL; Microscint 20, Packard Instruments) é adicionado a cada cavidade, as placas são vedadas e a radioatividade medida num contador de cintilação Top Count (Packard Instruments). As cavidades de controlo contendo ou apenas diluente (para contagens totais) ou MCP-1 em excesso (1 yg/mL, para ligação não específica) são usadas para calcular a percentagem de inibição total para o composto. O programa de computador Prism de GraphPad, Inc. (San Diego, Ca) é usado para calcular valores CI5o. Os valores CI5o são aquelas concentrações requeridas para reduzir a ligação de MCP-1 rotulada ao recetor por 50%. Métodos de Tratamento intramuscular
Dependendo da doença a ser tratada e da condição do indivíduo, os compostos e composições da presente invenção podem ser administrados por vias de administração oral, parenteral (e.g., intramuscular, intraperitoneal, 53 ΡΕ2175859 intravenosa, ICV, injeção ou infusão intracisternal, injeção subcutânea, ou implante), inalação, nasal, vaginal, retal, sublingual ou tópica e podem ser formulados, isolados ou em conjunto, em formulações de unidade de dosagem adeguadas contendo agentes de suporte, adjuvantes e veículos convencionais não tóxicos farmaceuticamente aceitáveis apropriados para cada via de administração. A presente invenção também contempla a administração dos compostos e composições da presente invenção numa formulação de depósito.
No tratamento ou prevenção de condições gue reguerem modulação do recetor de guimiocina, um nível de dosagem apropriado será geralmente 0,001 a 100 mg por kg de massa corporal do paciente por dia o qual pode ser administrado em doses única ou múltiplas. Preferivelmente, o nível de dosagem será 0,01 a 25 mg/kg por dia; mais preferivelmente 0,05 a 10 mg/kg por dia. Um nível de dosagem adequado pode ser 0,01 a 25 mg/kg por dia, 0,05 a 10 mg/kg por dia, ou 0,1 a 5 mg/kg por dia. Dentro deste intervalo a dosagem pode ser 0,005 a 0,05, 0,05 a 0,5, 0,5 a 5,0, ou 5,0 a 50 mg/kg por dia. Para administração oral, as composições são preferivelmente proporcionadas na forma de comprimidos contendo 1,0 a 1000 miligramas do ingrediente ativo, particularmente 1,0, 5,0, 10,0, 15,0, 20,0, 25,0, 50.0, 75,0, 100,0, 150,0, 200,0, 250,0, 300,0, 400,0, 500.0, 600,0, 750,0, 800,0, 900,0, e 1000,0 miligramas do ingrediente ativo para o ajustamento sintomático da dosagem ao paciente a ser tratado. Os compostos podem ser 54 ΡΕ2175859 administrados num regime de 1 a 4 vezes por dia, preferivelmente uma vez ou duas vezes por dia.
Será entendido, contudo, que o nivel de dose especifico e a frequência de dosagem para qualquer paciente particular pode ser variados e dependerão duma variedade de fatores incluindo a atividade do composto especifico empregue, da estabilidade metabólica e raio de ação daquele composto, da idade, massa corporal, caraterísticas hereditárias, saúde geral, sexo, dieta, modo e tempo de administração, velocidade de excreção, combinação de fármacos, da severidade da condição particular, e da terapia a que o hospedeiro se submete.
Farmacológicos a serem usados em conjunção com compostos CCR2
Os agentes farmacológicos que podem ser usados em conjunção com os antagonistas de CCR2 da corrente invenção incluem aqueles usados para os tratamentos de ateros-clerose, restenose, esclerose múltipla, fibrose pulmonar, doença inflamatória intestinal, artrite reumatoide, doença do enxerto contra o hospedeiro, fibrose renal, psoríase, rejeição de transplante, obesidade, diabetes, hipercoleste-rolemia e cancro.
Ainda noutras formas de realização, os métodos presentes são dirigidos ao tratamento de doenças alérgicas, em que um composto ou composição da invenção é administrado 55 ΡΕ2175859 ou isolado ou em combinação com um segundo agente terapêutico, em que o referido segundo agente terapêutico é uma anti-histamina. Quando usada em combinação, o médico pode administrar a combinação dos compostos ou composição da presente invenção e um segundo agente terapêutico. Também, os composto ou composição e o segundo agente terapêutico podem ser administrados sequencialmente, em qualquer ordem.
Os compostos e composições da presente invenção podem ser combinados com outros compostos e composições tendo utilidades relacionadas para prevenir e tratar a condição ou doença de interesse, tais como condições inflamatórias e doenças, incluindo doença inflamatória intestinal, doenças alérgicas, psoríase, dermatite atópica e asma, e aquelas patologias anotadas acima. A seleção dos agentes apropriados para uso em terapias de combinação pode ser feita por um perito vulgar na técnica. A combinação de agentes terapêuticos pode atuar sinergisticamente para efetuar o tratamento ou prevenção de várias desordens. Usando esta aproximação, é possível alcançar eficácia terapêutica com dosagens mais baixas de cada agente, reduzindo por conseguinte o potencial para efeitos secundários adversos.
No tratamento, prevenção, melhoria, controlo ou redução do risco de inflamação, os compostos da presente invenção podem ser usados em conjunção com um agente anti--inflamatório ou analgésico tal como um agonista opiato, um 56 ΡΕ2175859 inibidor de lipoxigenase, tal como um inibidor de 5-lipoxigenase, um inibidor de cicloxigenase, tal como um inibidor de cicloxigenase-2, um inibidor de interleucina, tal como um inibidor de interleucina-1, um antagonista de NMDA, um inibidor de óxido nítrico ou um inibidor da síntese de óxido nítrico, um agente não esteroide anti-inflamatório, ou um agente anti-inflamatório supressor de citocina, por exemplo com um composto tal como acetamino-feno, aspirina, codeína, sequestrantes de TNF biológico, fentanilo, ibuprofeno, indometacina, cetorolac, morfina, naproxeno, fenacetina, piroxicam, um analgésico esteroide, sufentanilo, sunlindac, tenidap.
De modo semelhante, os compostos da presente invenção podem ser administrados com um aliviador da dor; um potenciador tal como cafeína, um antagonista H2, simeticona, hidróxido de alumínio ou magnésio; um descongestionante tal como pseudofedrina; um antitússico tal como codeína; um diurético; uma anti-histamina sedante ou não sedante; um antagonista de antigénio muito tardio («very late antigen») (VLA-4); um imunossupressor tal como ciclosporina, tacrolimus, rapamicina, agonistas do recetor de EDG, ou outros imunossupressores do tipo FK-506; um esteroide; um agente antiasmático não esteroide tal como um agonista β2, antagonista de leucotrieno, ou inibidor da biossíntese de leucotrieno; um inibidor de fosfodiesterase tipo IV (PDE-IV); um agente de abaixamento de colesterol tal como um inibidor HMG-CoA-redutase, sequestrante, ou inibidor de absorção de colesterol; e um agente anti- 57 ΡΕ2175859 diabético tal como insulina, inibidores de α-glucosidase ou glitazonas. A razão ponderai dos composto da presente invenção para o segundo ingrediente ativo pode ser variada e dependerá da dose eficaz de cada ingrediente. Geralmente, uma dose eficaz de cada um será usada. Por conseguinte, por exemplo, quando um composto da presente invenção é combinado com um fármaco ΑΙΝΕ a razão ponderai dos composto da presente invenção para o fármaco ΑΙΝΕ variará geralmente desde cerca de 1000:1 até cerca de 1:1000, preferivelmente desde cerca de 200:1 até cerca de 1:200. As combinações de um composto da presente invenção e outros ingredientes ativos estarão geralmente também dentro do intervalo acima mencionado, mas em cada caso, uma dose eficaz de cada ingrediente ativo deverá ser usada.
Tratamento ou Prevenção de Condições ou Doenças Mediadas por CCR2
Num ainda outro aspeto, a presente invenção diz respeito ao tratamento ou prevenção de uma condição ou doença mediada por CCR2 pela administração a um indivíduo tendo uma tal condição ou doença de uma quantidade terapeuticamente eficaz de qualquer composto de fórmula (II) acima. Compostos para uso nos presentes métodos incluem aqueles compostos de acordo com fórmula (II), aqueles proporcionados acima como formas de realização, aqueles especificamente exemplificados nos Exemplos abaixo, 58 ΡΕ2175859 e aqueles proporcionados com as estruturas específicas presentes. 0 "indivíduo" é aqui definido como incluindo animais tais como mamíferos, incluindo, mas sem constituir limitação, primatas (e.g., humanos), vacas, ovelhas, cabras, cavalos, cães, gatos, coelhos, ratazanas, ratos e semelhantes. Em formas de realização preferidas, o indivíduo é um humano.
Conforme aqui usada, a frase "condição ou doença mediada por CCR2" e frases e termos relacionados refere-se a uma condição ou doença caraterizada por atividade funcional de CCR2 inapropriada, isto é, inferior ou superior à normal. A atividade funcional de CCR2 inapropriada pode ser originada como resultado da expressão de CCR2 em células que normalmente não expressam CCR2, expressão de CCR2 aumentada (conduzindo a, e.g., desordens e doenças inflamatórias e imunorreguladoras) ou expressão de CCR2 diminuída. A atividade funcional de CCR2 inapropriada pode também originar-se como resultado da secreção de MCP-1 por células que normalmente não segregam MCP-1, expressão de MCP-1 aumentada (levando a, e.g., desordens e doenças inflamatórias e imunorreguladoras) ou expressão de MCP-1 diminuída. A condição ou doença mediada por CCR2 pode ser completamente ou parcialmente mediada por atividade funcional inapropriada de CCR2. Contudo, uma condição ou doença mediada por CCR2 é uma na qual a modulação de CCR2 resulta em algum efeito na condição ou doença subjacente (e.g., um antagonista de CCR2 resulta em alguma melhoria no bem-estar do paciente em pelo menos 59 ΡΕ2175859 alguns pacientes) . Além disso, MCP-2, 3 e 4 são também ligandos de CCR2.
Numa forma de realização, a presente invenção diz respeito ao tratamento duma condição ou doença mediada por CCR2 envolvendo a administração a um indivíduo duma quantidade segura e eficaz do composto ou composição da invenção.
Numa forma de realização, a presente invenção diz respeito ao tratamento duma condição ou doença mediada por CCR2 envolvendo a administração a um indivíduo duma quantidade segura e eficaz do composto ou composição da invenção, onde a condição ou doença mediada por CCR2 é aterosclerose.
Numa forma de realização, a presente invenção diz respeito ao tratamento duma condição ou doença mediada por CCR2 envolvendo a administração a um indivíduo duma quantidade segura e eficaz do composto ou composição da invenção, onde a condição ou doença mediada por CCR2 é restenose.
Numa forma de realização, a presente invenção diz respeito ao tratamento duma condição ou doença mediada por CCR2 envolvendo a administração a um indivíduo duma quantidade segura e eficaz do composto ou composição da invenção, onde a condição ou doença mediada por CCR2 é esclerose múltipla.
Numa forma de realização, a presente invenção diz respeito ao tratamento duma condição ou doença mediada por 60 ΡΕ2175859 CCR2 envolvendo a administração a um indivíduo duma quantidade segura e eficaz do composto ou composição da invenção, onde a condição ou doença mediada por CCR2 é selecionada do grupo constituído por doença inflamatória intestinal, fibrose renal, artrite reumatoide, obesidade e diabetes não dependente de insulina.
Numa forma de realização, a presente invenção diz respeito ao tratamento duma condição ou doença mediada por CCR2 envolvendo a administração a um indivíduo duma quantidade segura e eficaz do composto ou composição da invenção, onde a condição ou doença mediada por CCR2 é diabetes tipo 2.
Numa forma de realização, a presente invenção diz respeito ao tratamento duma condição ou doença mediada por CCR2 envolvendo a administração a um indivíduo duma quantidade segura e eficaz do composto ou composição da invenção, onde a condição ou doença mediada por CCR2 é selecionada do grupo constituído por doença pulmonar obstrutiva crónica, fibrose pulmonar idiopática e síndrome da pneumonia idiopática.
Numa forma de realização, a presente invenção diz respeito ao tratamento duma condição ou doença mediada por CCR2 envolvendo a administração a um indivíduo duma quantidade segura e eficaz do composto ou composição da invenção, onde a administração é oral, parenteral, retal, transdermal, sublingual, nasal ou tópica. 61 ΡΕ2175859
Numa forma de realização, a presente invenção diz respeito ao tratamento duma condição ou doença mediada por CCR2 envolvendo a administração a um indivíduo duma quantidade segura e eficaz do composto ou composição da invenção, onde o composto é administrado em combinação com um agente anti-inflamatório ou analgésico.
Numa forma de realização, a presente invenção diz respeito ao tratamento duma condição ou doença mediada por CCR2 envolvendo a administração a um indivíduo duma quantidade segura e eficaz do composto ou composição da invenção, onde um agente anti-inflamatório ou analgésico é também administrado.
Numa forma de realização, a presente invenção diz respeito à modulação da função de CCR2 numa célula, onde a função de CCR2 na célula é modulada pelo contacto da célula com uma quantidade de modulação de CCR2 do composto da presente invenção.
Numa forma de realização, a presente invenção diz respeito ao tratamento duma condição ou doença mediada por CCR2 envolvendo a administração a um indivíduo duma quantidade segura e eficaz do composto ou composição da invenção, onde a doença é selecionada do grupo constituído por fibrose pulmonar, rejeição de transplante, doença do enxerto contra o hospedeiro e cancro. 62 ΡΕ2175859
Em ainda outras formas de realização, a presente invenção diz respeito ao tratamento de psoriase em que um composto ou composição da invenção é usado isolado ou em combinação com um segundo agente terapêutico tal como um corticosteroide, um lubrificante, um agente ceratolitico, um derivado de vitamina D3, PUVA e antralina.
Noutras formas de realização, a presente invenção diz respeito ao tratamento de dermatite atópica usando um composto ou composição da invenção ou isolado ou em combinação com um segundo agente terapêutico tal como um lubrificante e um corticosteroide.
Em demais formas de realização, a presente invenção diz respeito ao tratamento de asma usando um composto ou composição da invenção ou isolado ou em combinação com um segundo agente terapêutico tal como a agonista de β2 e um corticosteroide.
Preparação de Moduladores
Os exemplos seguintes são oferecidos para ilustrar, mas não para limitar, a invenção reivindicada.
Adicionalmente, os peritos na técnica reconhecerão que as moléculas reivindicadas nesta patente podem ser sintetizadas usando uma variedade de transformações de química orgânica padrão.
Certos tipos de reação geral empregues largamente 63 ΡΕ2175859 para sintetizar compostos alvos nesta invenção são sumariados nos exemplos. Especificamente, procedimentos genéricos para a formação de sulfonamida, formação de N-óxido de piridina e síntese 2-aminofenil-arilmetanona via aproximações do tipo Friedel-Crafts são dados, mas numerosas outras químicas padrão são aqui descritas e foram empregues rotineiramente.
Ainda que não pretendendo ser exaustivos, transformações orgânicas sintéticas representativas que podem ser usadas para preparar compostos da invenção são incluídas abaixo.
Estas transformações representativas incluem: manipulações de grupo funcional padrão; reduções tais como nitro a amino; oxidações de grupos funcionais incluindo álcoois e piridinas; substituição arilo via IPSO ou outros mecanismos para a introdução duma variedade de grupos incluindo nitrito, metilo e halogéneo; introduções e remoções de grupo de proteção; formação de Grignard e reação com um eletrófilo; acoplamentos cruzados mediados por metal incluindo mas sem constituir limitação reações de Buchwald, Suzuki e Sonigashira; halogenações e outras reações de substituição aromática eletrofílicas; formações de sal diazónio e reações destes espécies; eterificações; condensações cíclicas, desidratações, oxidações e reduções conduzindo a grupos heteroarilo; arilo metalações e transmetalações e reação das espécies aril-metal resultantes com um eletrófilo tal como um cloreto de ácido ou 64 ΡΕ2175859 amida de Weinreb; amidações; esterificações; reações de substituição nucleofilicas; alquilações; acilações; formação de sulfonamida; clorossulfonilações; éster e hidrólises relacionadas.
Certas moléculas reivindicadas nesta patente podem existir em diferentes formas enantioméricas e diastereoméricas todas tais variantes destes compostos estão dentro do âmbito e alcance da invenção.
Nas descrições das sinteses que seguem, alguns precursores foram obtidos de fontes comerciais. Estas fontes comerciais incluem Aldrich Chemical Co., Acros Organics, Ryan Scientific Incorporated, Oakwood Products Incorporated, Lancaster Chemicals, Sigma Chemical Co., Lancaster Chemical Co., TCI-America, Alfa Aesar, Davos Chemicals e GFS Chemicals.
Os compostos da invenção, incluindo aqueles listados no quadro de atividades, podem ser feitos pelos métodos e aproximações descritos na seguinte secção experimental, e pelo uso de transformações de quimica orgânica padrão que são bem conhecidas dos peritos na técnica.
Exemplos
Os seguintes compostos estão dentro do âmbito e alcance da invenção: 65 ΡΕ2175859
Os Compostos 3-10 têm uma CI50 inferior a 1000 nM no ensaio de quimiotatismo de CCR2.
Os compostos acima e outros dentro do âmbito e alcance desta invenção foram feitos e verificou-se serem antagonistas de CCR2 ativos usando os seguintes procedimentos .
Os reagentes e solventes usados abaixo podem ser obtidos de fontes comerciais tais como Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, Wisconsin, USA) . As 1H-RMN foram registadas num espetrómetro de RMN Varian Mercury 400 MHz. Os picos significativos são tabulados na ordem: multiplicidade (br, largo; s, singleto; d, dupleto; t, tripleto; q, quarteto; m, multipleto) e número de protões. Os resultados de espetrometria de massa são relatados como a razão da massa pela carga, seguido pela abundância relativa de cada ião 66 ΡΕ2175859 (entre parêntesis). Nos quadros, é registado um único valor m/e para M+H (ou, conforme anotado, M-H) ião contendo os isótopos atómicos mais comuns. Os padrões de isótopos correspondem à fórmula esperada em todos os casos. A análise de espetrometria de massa por ionização por eletrospray (ESI) foi conduzida num espetrómetro de massa por eletrospray Hewlett-Packard MSD usando HP1100 HPLC para a entrega da amostra. Normalmente o analito foi dissolvido em metanol a 0,1 mg/mL e 1 microlitro foi infundido com a entrega de solvente no espetrómetro de massa, que varreu desde 100 até 1500 daltons. Todos os compostos puderam ser analisados no modo ESI positivo, usando acetonitrilo/água com ácido fórmico 1% como solvente de entrega. Os compostos proporcionadas abaixo puderam também ser analisados no modo ESI negativo, usando NH4OAc 2 mM em acetonitrilo/água como sistema de entrega.
Preparação de Intermediários
Intermediário 1: Ácido 4-cloro-2-(4-cloro-3-trifluorometil--benzenossulfonilamino)-benzóico
A uma solução de Na2C03 (11,7 g, 110,7 mmol) em 67 ΡΕ2175859 água (50 mL) e 1,4-dioxano (50 mL) a 60 °C foi adicionado ácido 2-amino-4-cloro-benzóico (5,0 g, 29,14 mmol) seguido por cloreto de 4-cloro-3-trifluorometil-benzenossulfonilo (20,15 g, 72,48 mmol) em 3 porções e aqueceu-se a mistura reacional resultante a 80 °C durante 4 horas. HCl 2 N foi adicionado até a mistura reacional se tornar acidica (pH = ~2) e o sólido branco obtido foi filtrado, lavado com água, seco sob alto vácuo para se obter o composto mencionado em titulo (7,8 g) com 65% de rendimento. MS (ES) M+Na esperado 436,0, encontrado 435,8.
Intermediário 2: 4-Cloro-2-(4-cloro-3-trifluometil-benzenossulfonilamino)--N-metoxi-N-metil-benzamida
A uma solução de ácido 4-cloro-2-(4-chtoro-3--trifluorometil-benzenossulfonilamino)-benzóico (5,0 g, 12,1 mmol) em THF (20 mL) foi adicionado N, N'-carbonil-diimidazole (CDI, 2,45 g, 15,13 mmol) em porções (Cuidado!: C021) . A mistura reacional resultante foi em seguida aquecida em refluxo. Após 4 horas, a mistura reacional foi arrefecida até à temperatura ambiente e carregada com hidrocloreto de N, O-dimetil-hidroxilamina (1,3 g, 13,31 mmol) e aquecida em refluxo durante 1 hora. Água 68 ΡΕ2175859 (100 mL) foi adicionada seguida por EtOAc (100 mL) com agitação. A camada de EtOAc foi separada e a camada aquosa foi ainda extraída com EtOAc (2 x 50 mL). As camadas combinadas de EtOAc foram lavadas com HC1 aq 2 N (50 mL) , solução saturada de NaHC03 (50 mL) , água salgada (50 mL) , secas (Na2S04) e evaporadas. O produto cru obtido foi purificado por cromatografia em fase normal automatizada (50% de EtOAc em hexanos) para produzir o composto mencionado em título (4,0 g) com 73% de rendimento. MS (ES) M+H esperado 457,0, encontrado 456,9.
Intermediário 3: 2-Bromo-5-metil-3-nitropiridina
* POBb 0fcf.eX.f3h w
POBr3 (222,8 g, 0,78 mol) foi adicionado em porções a 2-hidroxi-5-metil-3-nitropiridina (100 g 0,65 mol) em DMF (500 mL) com agitação a 0-10 °C em seguida a mistura reacional foi agitada a 80 °C sob azoto durante 12 horas. A mistura reacional foi arrefecida e vertida em gelo moído (1 kg), o sólido obtido foi filtrado, lavado profundamente com água arrefecida em gelo (2 x 500 mL) , seco num exsicador sob alto vácuo durante um dia para se obter 2-bromo-5-metil-3-nitropiridina na forma dum sólido amarelo (121 g) com 86% de rendimento. (M+H) Esperado: 217; encontrado 216,9. ΡΕ2175859 69
Intermediário 4 : 2-Ciano-5-metil-3-nitropiridina:
HaC
CuCN OMF.Ttre
H
Um balão de fundo redondo foi carregado com 2-bromo-5-metil-3-nitropiridina (60,53 g, 278,9 mmol) e CuCN (27,52 g, 307,3 mmol) . O balão foi evacuado, e cheio em contracorrente com azoto. DMF (150 mL) foi adicionado via cânula. A solução foi aquecida até 70 °C durante 1,5 horas. Após arrefecimento até à temperatura ambiente, a mistura reacional foi vertida em EtOAc (500 mL) e água (250 mL) . Ambas as fases foram filtradas através dum leito de Celite de 1 cm. As camadas foram separadas, e a fase orgânica foi lavada com água (2 x 100 mL) em seguida com uma solução de NH4CI/NH4OH aq. sat. 1:1 (2 x 100 mL) . As camadas aquosas combinadas foram extraídas com EtOAc (2 x 200 mL) . As camadas orgânicas combinadas foram secas sobre MgS04 e concentradas em vácuo para produzirem o composto mencionado em título (36,10 g, 79% de rendimento).
Intermediário 5: 3-Amino-2-ciano-5-metilpiridina:
70 ΡΕ2175859 A ácido acético (300 mL) num balão de fundo redondo de 3 tubuladuras de 2 litros equipado com agitador mecânico e um termómetro foi adicionado pó de Fe (99,6 g, 1,78 mol) com agitação a 60 °C. 2-Ciano-5-metil-3-nitro-piridina (97 g, 0,59 mol) foi dissolvida em ácido acético (400 mL) com aquecimento suave e adicionada à mistura reacional acima gota a gota com agitação eficiente de maneira que a temperatura de reação foi mantida abaixo de 80 °C ao longo de 3,5 horas. A mistura reacional foi ainda agitada durante mais 30 min, arrefecida, diluída com EtOAc (750 mL) , filtrada através de Celite e lavada com EtOAc (1 x 500 mL, 3 x 250 mL) . As camadas combinadas de EtOAc foram evaporadas até à secura para se obter um sólido castanho escuro que foi neutralizado com solução saturada de NaHC03 (850 mL) , depois de adição de água (250 mL) para ficar homogénea, esta camada aquosa foi extraída com EtOAc (1 x 750 mL, 2 x 500 mL) . As camadas combinadas de EtOAc foram filtradas através duma pequena almofada de gel de sílica (areia-Si02-areia em funil sinterizado), secas (Na2S04) e evaporadas para se obter 3-amino-2-ciano-5--metilpiridina (60 g) na forma dum sólido amarelo com 76% de rendimento incluindo -10% da amida correspondente. À 3-amino-2-ciano-5-metilpiridina crua (contendo ~10% de carboxamida) (49 g) foi adicionado EtOAc (441 mL, proporção 9:1 em volume para anilina), a suspensão resultante foi aquecida até refluxar para formar uma solução límpida. Após arrefecimento até à temperatura 71 ΡΕ2175859 ambiente, o cristal resultante foi recolhido por filtração, lavado com uma pequena quantidade de EtOAc frio (44 mL (1/10 do volume inicial) x 2), e seco em vácuo para produzir a 3-amino-2-ciano-5-metilpiridina (35 g) pura na forma de agulhas amarelas pálidas. As águas-mães foram concentradas sob pressão reduzida, ao sólido amarelo resultante foi adicionado EtOAc (136 mL) e foi repetido o processo acima para produzir outros 4 g de 3-amino-2-ciano--5-metilpiridina pura; rendimento total da recuperação 79,5%. 1H-NMR (400 MHz, CDC13) δ 7,89 (1H, s) , 6,90 (1H, s), 4,39 (2H, br) , 2,30 (3H, s) . MS (ES) M+H esperado 134,0, encontrado 134,0.
Intermediário 6: Ácido 3-(4-cloro-3-trifluorometil-benzenossulfonilamino)-5--metil-piridina-2-carboxílico:
A 3-amino-5-metilpicolinonitrile (9,6 g, 72 mmol) em piridina (63 mL) foi adicionado cloreto de 4-cloro-3--trifluorometil-benzenossulfonilo (19,6 g, 80 mmol) numa porção e a mistura reacional resultante foi agitada a 60 °C durante a noite. A piridina foi removida em vácuo, foi adicionado HC1 2 N (100 mL) , extração com EtOAc (3 x 300 mL; Nota: devido à presença de amida, a 72 ΡΕ2175859 solubilidade em EtOAc é baixa). As camadas combinadas de EtOAc foram secas (Na2S04), evaporadas para se obter 26,3 g de produto cru que contêm uma pequena quantidade de bis--sulfonamida que foi sujeita a hidrólise em THF (200 mL) com NaOH 2 N (100 mL) à temperatura ambiente durante 2 horas. NaOH 2 N (100 mL) foi adicionado, extraido com EtOAc (1 x 700 mL, 1 x 250 mL) , as camadas combinadas de EtOAc foram lavadas com solução saturada de NaHC03 (2 x 250 mL) , secas (Na2S04) e evaporadas para se obterem 22 g de monossulfonamida. A isto dioxano (350 mL) , água (450 mL) (Nota: requer alta diluição para reação rápida) foram adicionados, seguido por NaOH (30 g, 0,75 mol) e agitou-se sob refluxo durante 24 horas. O dioxano foi removido em vácuo e HC1 conc. (75 mL) foi adicionado lentamente com arrefecimento. O sólido resultante foi filtrado, lavado com água e seco em vácuo para produzir o composto mencionado em titulo (22 g, 88% para 2 passos) na forma de sólido amarelo claro. (M+H) Esperado: 395,0; encontrado 394,9.
Intermediário 7: Ácido 5-cloro-3-(4-cloro-3-(trifluorometil)fenil--sulfonamido)picolínico
73 ΡΕ2175859
Passo 1: Um balão de 250 mL seco foi carregado com 2-bromo-5-cloro-3-nitropiridina (24 g, 101 mmol), CuCN (19 g, 212 mmol) e DMF (100 mL) . A mistura resultante foi agitada a 110 °C durante 2 horas. A mistura foi concentrada sob pressão reduzida. Água (100 mL) foi adicionada e extraida com EtOAc (3 x 250 mL) . A camada orgânica combinada foi lavada com água salgada, seca (MgS04) e filtrada. O solvente foi evaporado em vácuo para produzir um sólido amarelo claro (15 g) que foi usado diretamente para o passo seguinte.
Passo 2: Um balão de fundo redondo de 250 mL com uma barra agitadora magnética foi carregado com limalha de ferro (15,6 g, 0,3 mol) em ácido acético (80 mL) e aquecido até 80 °C (banho de óleo) sob N2. A esta mistura foi adicionada lentamente a nitrocianopiridina acima (10 g, 55 mmol) do Passo 1 em ácido acético (80 mL) via funil de gotejamento ao longo de 15 minutos. A mistura foi agitada a 80 °C durante outros 30 min depois da adição. Após arrefecimento, a mistura reacional foi diluída com EtOAc, filtrada através de Celite e o solvente evaporado em vácuo. O resíduo foi dissolvido em EtOAc e lavado com NaOH 3 N, água salgada, seco sobre MgS04, e concentrado em vácuo para produzir uma mistura 4:1 (7,7 g) de 3-amino-2-ciano-5-cloropiridina (maior) e a 2-amida. A mistura foi usada diretamente para o passo seguinte: MS (ES) (M+H)+ esperado 154,0, encontrado 154,0. 74 ΡΕ2175859
Passo 3: Um balão de fundo redondo de 100 mL foi carregado com a mistura acima de 3-amino-2-ciano-5-cloro-piridina (7,7 g, 50 mmol) , cloreto de 4-cloro-3-trifluoro-metilbenzenossulfonilo (28 g, 100 mmol), e piridina (50 mL) . A solução resultante foi aquecida até 70 °C e agitada durante 5 horas. A piridina foi removida em vácuo e EtOH 80% aq. (260 mL) foi adicionado, seguido por NaOH (30 g, 0,75 mol). A mistura foi agitada sob refluxo durante 12 horas. O solvente foi subsequentemente removido em vácuo e foi adicionado gelo (100 g). O pH foi ajustado a 2-3 com HCl conc.. A solução aquosa resultante foi extraída com EtOAc, lavada com água salgada, seca sobre MgS04 e concentrada em vácuo. O sólido amarelo claro resultante foi cristalizado em EtOAc/hexano (1:1) para produzir o ácido desejado na forma de agulhas brancas (10 g, 44% rendimento global): 1H-NMR (400 MHz, CDC13) δ 10,80 (s, 1H) , 8,23 (m, 3H) , 8,00 (d, 1H) , 7,63 (d, 1H) ; MS (ES) (M+H)+ esperado 415,0, encontrado 415,0.
Intermediário 8:
Metoxi-metil-amida do ácido 5-cloro-3-(4-cloro-3-tri-fluorometil-benzenossulfonilamino)-piridina-2-carboxílico
Ácido 5-cloro-3-(4-cloro-3-trifluorometil-benze- 75 ΡΕ2175859 nossulfonilamino)-piridina-2-carboxílico (15,8g, 38 mmol), hidrocloreto de N,O-dimetil-hidroxilamina (11,1 g, 114 mmol), DIEA (41 mL, 228 mmol) e BOP (69 g, 156 mmol), foram suspensos em 80 mL DMF e agitados à temperatura ambiente durante a noite. A mistura reacional foi diluída com HC1 1 M (100 mL) , extraída com EtOAc e as porções orgânicas foram lavadas com HC1 aquoso 1 M, NaHCCb e água salgada. Os extratos orgânicos combinados foram secos (Na2S04) , filtrados e concentradas sob pressão reduzida. O resíduo resultante foi purificado por cromatografia em coluna flash para produzir metoxi-metil-amida do ácido 5-cloro-3-(4-cloro-3-trifluorometil-benzenossulfonilamino) --piridina-2-carboxílico: MS m/z: (M+H) 458,0.
Intermediário 9:
Metoxi-metil-amida do ácido 5-cloro-3-(4-metil-3--trifluorometil-benzenossulfonilamino)-piridina-2- -carboxilico
Intermediário 10:
Metoxi-metil-amida do ácido 5-cloro-3-(4-metil-3--trifluorometil-benzenossulfonilamino)-piridina-2- -carboxilico 76 ΡΕ2175859
Foi preparado a partir de ácido 5-cloro-3- (4--metil-3-trifluorometil-benzenossulfonilamino)-piridina-2--carboxilico seguindo o procedimento descrito no exemplo precedente.
Intermediário 11:
Metoxi-metil-amida do ácido 5-cloro-3-[metoximetil-(4--metil-3-trifluorometil-benzenossulfonil)-amino]-piridina- -2-carboxílico
A uma mistura de hidreto de sódio (164 mg, 4,10 mmol) em 5 mL de THF foi adicionada uma mistura de metoxi-metil-amida do ácido 5-cloro-3-(4-metil-3-trifluorometil-benzenossulf onilamino)-piridina-2-carboxílico (1,50g, 3,42mmol) e éter clorometilico e metilico (0,388 mL, 5,13 mmol) em 5 mL de THF. A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante a noite. Após a remoção dos solventes o residuo foi purificado por coluna flash (acetato de etilo 20% em hexano) para produzir 1,50 gramas do composto mencionado em título na forma dum sólido branco: (M++H) esperado 482,0, encontrado 482,0. 77 ΡΕ2175859
Intermediário 12 :
Metoxi-metil-amida do ácido 5-cloro-3-[metoximetil-(4--cloro-3-trifluorometil-benzenossulfonil)-amino]-piridina- -2-carboxilico
A uma suspensão de hidreto de sódio (314 mg, 7,86 mmol) em 8 mL de THF foi adicionada uma mistura de metoxi-metil-amida do ácido 5-cloro-3-(4-cloro-3-trifluoro-metil-benzenossulfonilamino)-piridina-2-carboxílico (3,0 g, 6,55 mmol) e éter clorometilico e metilico (0,741 mL, 9,825 mmol) em 8 mL de THF. A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante a noite. Após a remoção dos solventes o resíduo foi purificado por coluna flash (acetato de etilo 20% em hexano) para produzir 2,70 gramas do composto mencionado em título na forma dum sólido branco. (M+H)+ esperado 502,0, encontrado 502,0.
Intermediário 13: Éster de metilo do ácido 3-amino-piridina-2-carboxílico
78 ΡΕ2175859 400 mg (2,9 iranol) de ácido 3-amino-piridina-2--carboxílico foi dissolvido em 3 mL de metanol. A esta solução 1,6 mL de solução 2 M de (trimetilsilil)diazometano em éter dietilico foi adicionado gota a gota a 0°C, seguido por agitação da mistura durante 2 horas à temperatura ambiente. A solução foi diluída com acetato de etilo e lavada com solução aquosa de bicarbonato de sódio. A cromatografia flash produziu o produto éster. LC-MSD, m/z para 07Η8Ν202 [M+H]+ = 153,0; HPLC tempo de retenção: 0,2 minutos.
Intermediário 14: Ácido 3-(4-cloro-3-triftuorometil-benzenossulfonilamino)- -piridina-2-carboxílico
Preparado a partir de 0,60 g (2,17 mmol) de cloreto de 4-cloro-3-trifluorometil-benzenossulfonilo e 0,30 g (1,97 mmol) de éster de metilo do ácido 3-amino--piridina-2-carboxílico em 3 mL de piridina usando o procedimento usado para preparar 4-cloro-N-(2-ciano-5--metilpiridin-3-il)3-(trifluorometil)benzenossulfonamida na preparação do Intermediário 6. 0 solvente foi mudado para THF, seguido pela adição de LiOH aquoso 1 M e a mistura foi 79 ΡΕ2175859 agitada durante 1 hora. 0 pH da mistura foi ajustado para neutro e o produto foi extraido com acetato de etilo. LC-MSD, m/z para Ci3H8ClF3N204S [M+H]+ = 380, 9, 383, 0; HPLC tempo de retenção: 1,8 minutos.
Intermediário 15:
Metoxi-metil-amida do ácido da 3-[(4-cloro-3-trifluoro-metil-benzenossulfonil)-metoximetil-amino]-piridina-2- -carboxilico
Preparado a partir de 1,05 g (2,48 mmol) de metoxi-metil-amida do ácido 3-(4-cloro-3-trifluorometil--benzenossulfonilamino)-piridina-2-carboxílico, 1,71 g de carbonato de potássio e 566 yL de cloreto de metoximetilo em 7 mL de THF usando o procedimento usada na preparação do Intermediário 12, Rendimento: 420 mg de um sólido branco. LC-MSD, m/z para Ci7Hi7C1F3N305S [M+Na]+ = 490, 0, 491, 9; HPLC tempo de retenção: 2,5 minutos.
Intermediário 16: 4-Cloro-N-(2-(5-metoxi-lH-pirrolo[2,3-b]piridina-4--carbonil)-5-(metoximetil)piridin-3-il)-3--(trifluorometil)benzenossulfonamida 80 ΡΕ2175859
Passo 1: A uma solução da bromopiridina (132 mg, 0,28 mmol) em tetracloreto de carbono (4 mL) foi adicionada IV-bromossuccinimida (60 mg, 1,2 equiv.), seguido por 2,2'--azobisisobutironitrilo (AIBN, 4,6 mg, 0,1 equiv.)· A mistura reacional foi aquecida a 60 °C durante a noite. Após arrefecimento até à temperatura ambiente, tetracloreto de carbono em excesso foi removido e o resíduo foi purificado por cromatografia flash sobre gel de sílica (EtOAc 33%/hexanos). O produto desejado foi obtido na forma dum sólido branco (107 mg, 70%). MS: (Μ + H)/z = 551.
Passo 2: O produto obtido do Passo 1 acima (51 mg, 0,093 mmol) foi dissolvido em 3 mL de metanol. À solução resultante foi adicionado metóxido de sódio (10 mg, 2,0 equiv.). A mistura reacional foi aquecida a 50 °C durante a noite. Após arrefecimento até à temperatura ambiente, a reação foi extinta com solução saturada de cloreto de amónio, e a mistura foi extraída com acetato de etilo. Os extratos foram lavados com água salgada, secos sobre MgS04 e concentrados em vácuo. O material cru foi purificado por cromatografia flash sobre gel de sílica (EtOAc 33%/hexanos). O produto desejado foi obtido na forma dum sólido branco (42 mg, 90%). MS: (M + H)/z = 503. 81 ΡΕ2175859
Intermediário 17 :
Metoxi-metil-amida do ácido 3-(4-cloro-3-trifluorometil--benzenossulfonilamino)-5-metil-piridina-2-carboxílico
10,49 g (26,6 iranol) de ácido 3-(4-cloro-3-triflu-orometil-benzenossulfonilamino)-5-metil-piridina-2-carboxí-lico reagiu com 5,40 g (33,2 inmol) de N, Ν'-carbonildiimida-zole em 4 0 mL de THF refluxante durante 3h. A temperatura foi diminuída até 50 °C, 2,86 g (29,3 iranol) de hidrocloreto de O,N-dimetil-hidroxilamina foram adicionados e a reação foi agitada durante a noite a 50 °C. Metade do solvente foi removida sob pressão reduzida e a mistura reacional foi diluída com 200 mL de água fria. Os sólidos foram separados por filtração, lavados com 100 mL de água e secos para darem 9,8 g (84%) do produto na forma dum pó acastanhado.
Intermediário 18:
Metoxi-metil-amida do ácido 3-[(4-cloro-3-triftuorometil--benzenossulfonil)-metoximetil-amino]-5-metil-piridina-2- -carboxílico 82 ΡΕ2175859
Preparado a partir de 223 mg (0,51 mmol) de metoxi-metil-amida do ácido 3-(4-cloro-3-trifluorometil--benzenossulfonilamino)-5-metil-piridina-2-carboxilico, 352 mg de carbonato de potássio e 116 yL de cloreto de metoximetilo em 1 mL de THF usando o procedimento usado para preparar o Intermediário 12. Rendimento: 200 mg de um sólido branco. LC-MSD, m/z para C18H19CIF3N3O5S [M+H]+ = 482,0, 484,0; HPLC tempo de retenção: 2,5 minutos.
Intermediário 19: 7-Cloro-3H-imidazo[4,5-b]piridina
0 produto foi preparado seguindo o procedimento de Bioorg. Med. Chem. Lett., (2004) 3165-3168.
Intermediário 20: 6-Iodo-9H-purina
Uma mistura de 6-cloro-9H-purina (684 mg, 83 ΡΕ2175859 4,46 mmol) e 6 mL de ácido iodídrico 57% foram agitados a 0 °C durante 1,5 horas. A reação produziu 840 mg do produto na forma dum pó branco. O sólido foi separado por filtração, suspenso em 5 mL de água e trazido até pH=8 com solução aquosa de amónia. A suspensão foi arrefecida até 0 °C e o sólido foi separado por filtração, lavado com água fria e seco para dar o produto.
Intermediário 21: 4-Iodo-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidina
Uma mistura de 4-cloro-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidina (673 mg, 4,41 inmol) e 7 mL de ácido iodidrico 57% foi agitada à temperatura ambiente durante 16 horas. O sólido foi separado por filtração, suspenso em 5 mL de água e trazido até pH=8 com solução aquosa de amónia. A suspensão foi arrefecida até 0°C e o sólido foi separado por filtração, lavado com água fria e seco para darem o produto para produzir 970 mg do produto na forma dum pó branco. O produto contém cerca de 10% do material de partida.
Intermediário 22: 7-Iodo-3H-imidazo[4,5-b]piridina
84 ΡΕ2175859
Uma mistura de 7-cloro-3H-imidazo[4,5-b]piridina (1,47 g, 9,64 mmol) e 15 mL de ácido iodidrico 57% reagiram a 80 °C durante 4 horas. Após o sólido ter sido separado por filtração, ele foi ressubmetido a uma reação com 10 mL de ácido iodidrico 57% fresco. A reação produziu 1,3 g do produto na forma dum pó branco, 90% puro.
Procedimento para a proteção de N dos iodo-heterociclos 1,65 mmol do iodo-heterociclo foram dissolvidas em 2 mL de DMF e arrefecidas até 0°C. A esta solução 1,81 mmol de hidreto de sódio 60% foram adicionados seguido por adição gota a gota de 1,81 mmol de cloreto de trimetil-sililetoximetilo ao longo do período de 5 minutos. A solução foi agitada a 0 °C durante 0,5 h, seguida por 0,5 h à temperatura ambiente. A esta solução 10 mL de água foram adicionados e a mistura foi extraída duas vezes com 10 mL de éter dietílico. As camadas orgânicas foram lavadas com 10 mL de água, em seguida secas sobre sulfato de magnésio anidro, evaporadas sob pressão reduzida e purificadas sobre sílica usando acetato de etilo em hexanos.
Intermediário 23: 6-Iodo-9-(2-trimetilsilanil-etoximetil)-9H-purina
85 ΡΕ2175859 405 mg (1,65 mmol) de 6-iodo-9H-purina foi dissolvido em 2 mL de DMF. 72 mg (1,81 mmol) de hidreto de sódio 60% foi adicionado seguido por 320 yL (1,81 mmol) de cloreto de trimetilsililetoximetilo. Rendimento: 343 mg de um produto oleoso.
Intermediário 24: 4-Iodo-7-(2-trimetilsilanil-etoximetil)-7H-pirrolo- [2,3-d]pirimidina
610 mg (2,49 mmol) de 4-iodo-7H-pirrolo[2,3-d]-pirimidina foi dissolvido em 2,5 mL de DMF. 110 mg (2,74 mmol) de hidreto de sódio 60% foi adicionado seguido por 480 pL (2,74 mmol) de cloreto de trimetilsililetoximetilo. Rendimento: 750 mg de um produto oleoso, 90% puro.
Intermediário 25: 4-Iodo-7-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidina
86 ΡΕ2175859 206 mg (0,84 mmol) de 4-iodo-7H-pirrolo[2,3-d]-pirimidina foi dissolvido em 1 mL de DMF. 37 mg (0,92 mmol) de hidreto de sódio 60% foi adicionado seguido por 58 pL (0,92 mmol) de iodometano. A reação foi extinta por adição de 10 mL de água, o sólido separado por filtração, lavado com 10 mL de água, em seguida 10 mL de hexanos e seco. Rendimento: 142 mg de um pó acastanhado, 90% puro.
Intermediário 2 6: 7-Iodo-3-(2-trimetilsilanil-etoximetil)-3H-imidazo[4,5-b]- piridina
em sódio cloreto de metilo. Rendimento: 424 mg de um produto oleoso, 850 mg (3,47 mmol) piridina foi dissolvido (3,82 mmol) de hidreto de por 670 pL (3,82 mmol) de de 7-iodo-3H-imidazo[4,5-b]-3,5 mL de DMF. 153 mg 60% foi adicionado seguido trimetilsililetoxi-90% puro.
Procedimento Geral A:
Preparação de cetonas a partir de amidas de Weinreb
87 ΡΕ2175859
Passo 1: Adição do reagente de Grignard 1 mmol do iodo-heterociclo foi dissolvido sob atmosfera de azoto em 4 mL de THF e arrefecido até -30°C. 0,50 mL de solução 2 M de cloreto de isopropilmagnésio em THF foi adicionado gota a gota. A mistura foi aquecida até -10 °C e agitada durante 10 minutos, o que resultou numa troca iodo-magnésio completa. A solução foi em seguida arrefecida até -20 °C e 1,0 mmol de amida de Weinreb sólida foi adicionada. Após 5 minutos, a mistura foi deixada aquecer até à temperatura ambiente e foi agitada à temperatura ambiente durante 1 hora. Solução aquosa de cloreto de amónio foi adicionada e a mistura foi extraida com DCM. A camada orgânica foi evaporada sob pressão reduzida. A cromatografia flash sobre silica usando acetato de etilo em hexanos produziu o produtos.
Passo 2: Desproteção 1 mmol do intermediário de cetona protegida foi dissolvida numa mistura de 2 0 mL de metanol e 2 0 mL de ácido clorídrico 6 N. A solução foi aquecida num tubo vedado a 95 °C durante 8 h, em seguida arrefecida e evaporada. O resíduo foi dissolvido em amónia metanólica e evaporado sobre gel de sílica sob pressão reduzida. A cromatografia flash sobre sílica usando acetato de etilo em hexanos produziu os produtos na forma dum sólido amarelo. Em alguns casos um passo de purificação por HPLC de inversão de fases adicional foi necessário para se obterem produtos puros. 88 ΡΕ2175859
Procedimento Geral B:
Procedimentos Gerais para a Preparação de Cetonas a partir de nitrilos
Ar
1 mmol de 4-iodo-7H-pirrolo[2,3-djpirimidina foi dissolvida sob atmosfera de azoto em 2,8 mL de THF e arrefecida até -10°C. 0,50 mL de solução 2 M de solução de cloreto de fenilmagnésio em THF foi adicionado gota a gota seguido por 0,50 mL de solução 2 M de cloreto de isopropilmagnésio solução em THF. A mistura foi aquecida até à temperatura ambiente e agitada durante 1 h, o que resultou numa troca iodo-magnésio completa. Uma solução separada de 0,77 mmol do correspondente nitrilo em 1 mL de THF foi preparada e 0,96 mmol de hidreto de sódio 60% foi adicionado a ela. As soluções foram combinadas e a mistura foi agitada a 45 °C durante 8 horas. A mistura reacional foi arrefecida até à temperatura ambiente, 0,52 mL de ácido clorídrico concentrado foi adicionado e a mistura foi agitada a 50 °C durante 0,5 hora. Os sólidos foram separados por filtração e lavados com três porções de 10 mL de THF, seguido por 10 mL de éter dietílico e quatro porções de ácido clorídrico 1 N. Os sólidos foram recebidos numa mistura de bicarbonato de sódio aquoso e acetato de 89 ΡΕ2175859 etilo. A camada orgânica foi passada através de uma almofada de gel de silica e evaporada sob pressão reduzida para dar os produtos.
Exemplo de Referência 1: 4-Cloro-N-[5-cloro-2-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidina-4--carbonil)-fenil]3-trifluorometil-benzenossulfonamida
iPrMgCl (3,84 mL, 7,56 mmol; solução 1,97 M em THF) foi adicionado a iodo-pirrolopirimidina (0,882 g, 3,6 mmol) em THF (5 mL) a -78 °C. Após 15 min, foi aquecida até a temperatura ambiente e adicionado brometo de 2,6-dimetilfenilmagnésio (2,4 mL, 2,4 mmol; solução 1,0 M em éter dietilico). A esta mistura reacional à temperatura ambiente foi adicionado uma solução em sal de sódio de THF de 4-cloro-2- (4-cloro-3-trifluorometil-benzenossulfonilami-no)-N-metoxi-N-metil-benzamida [preparado separadamente por adição de NaH 60% (0,144 g, 3,6 mmol) em THF (5 mL) ] e agitada durante a noite. Solução saturada de NH4C1 (5 mL) foi adicionada e extraida com EtOAc (2 x 50 mL) . A camada de EtOAc foi lavada com água salgada (25 mL) , seca (Na2S04) e evaporada. O produto cru foi purificado por purificação 90 ΡΕ2175859 em coluna (gel de sílica, EtOAc 60% em hexanos) seguido por recristalização em CH3CN para se obter o composto mencionado em título (1 g) na forma dum sólido amarelo cristalino com 67% de rendimento. MS (ES) M+H esperado 515,0, encontrado 514,9. 1H-NMR (CDC13, 400 MHz) : δ 10,75 (s, 1H) , 9, 92 (brs, 1H), 8,92 (d, 1H) , 8,05 (s, 1H) , 7,92 (dd, 1H) , 7,81 (m, 2H) , 7,58 (m, 1H) , 7,45 (dd, 1H), 7,3 (d, 1H) , 6,9 (m, 1H) .
Exemplo 3: 4-Cloro-N-[5-cloro-2-(7-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidina--4-carbonil)-piridin-3-il}-3-trifluorometil--benzenossulfonamida
Preparado a partir de 227 mg (0,45 mmol) de metoxi-metil-amida do ácido da 5-cloro-3-[(4-cloro-3-tri-fluorometil-benzenossulfonil)-metoximetil-amino]-piridina--2-carboxílico, 129 mg (0,45 mmol) de 4-iodo-7-metil-7H--pirrolo[2,3-d]pirimidina 90% dissolvidos em 2 mL de THF com 0,23 mL de solução 2 M de cloreto de isopropilmagnésio em THF adicionado. Toda a cetona intermediária resultante (80 mg) foi usada no segundo passo com mistura de 2 mL de etanol e 2 mL de ácido clorídrico 6 N para dar depois de 91 ΡΕ2175859 purificação 45 mg do produto final na forma dum sólido amarelo.
Exemplo de Referência 4:
Preparação de 4-cloro-N-(5-(metoximetil)-2-(7H-pirrolo-[2,3-d]pirimidina-4-carbonil)piridin-3-il)-3--(trifluorometil)benzenossulfonamida
Passo 1: A uma solução da bromopiridina obtida no Exemplo 13 (Passo 2) (74 mg, 0,15 mmol) em THF (1 mL) a 0 °C foi adicionado cloreto de isopropilmagnésio (147 pL, 2,0 M em THF) gota a gota. Após 45 minutos, uma solução de 7--(triisopropilsilil)-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidina-4-carbal-deído (67 mg, 0,22 mmol) em THF foi adicionada. A mistura reacional foi aquecida até à temperatura ambiente e agitada durante a noite. A reação foi extinta com solução saturada de cloreto de amónio, e a mistura foi extraida com acetato de etilo. Os extratos foram lavados com água salgada, secos sobre MgS04 e concentrados em vácuo. O material cru foi purificado por cromatografia flash sobre gel de silica 92 ΡΕ2175859 (EtOAc 33%/hexanos). O produto desejado foi obtido na forma dum sólido amarelo espumante (45 mg, 42%).MS: (M + H)/z = 728.
Passo 2: 0 produto obtido do Passo 1 acima (45 mg, 0,062 mmol) foi dissolvido em 3 mL de diclorometano. À solução resultante foi adicionado periodinano de Dess--Martin (42 mg, 1,6 equiv.) e agitados durante a noite à temperatura ambiente. A reação foi extinta com Na2S203 10%, e a mistura foi extraida com acetato de etilo. Os extratos foram lavados com NaHC03 saturado, água salgada, secos sobre MgS04 e concentrados em vácuo. O material cru foi purificado por cromatografia flash sobre gel de silica (EtOAc 33%/hexanos). O produto desejado foi obtido na forma dum sólido amarelo espumante (35 mg, 78%).MS: (M + H)/z = 726.
Passo 3: 0 produto obtido do Passo 2 acima (35 mg, 0,048 mmol) foi dissolvido em 4 mL de HCl-dioxano (4,0 M) e 1 mL de água. A mistura foi aquecida a 85 °C durante 30 minutos e extinta com NaHC03 saturado. A mistura foi extraida com acetato de etilo. Os extratos foram lavados com água salgada, secos sobre MgS04 e concentrados em vácuo. O material cru foi purificado por cromatografia flash sobre gel de silica (metanol 10%/DCM). O produto desejado foi obtido na forma dum sólido amarelo (15 mg, 60%).MS: (Μ + H)/z = 526. 93 ΡΕ2175859
Exemplo 5: 4-Cloro-N-[5-metil-2-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidina-4-carbo-nil)-piridin-3-il]-3-trifluorometil-benzenossulfonamida
Preparado a partir de 200 mg (0,42 mmol) de metoxi-metil-amida do ácido 3-[(4-cloro-3-trifluorometil--benzenossulfonil)-metoximetil-amino]-5-metil-piridina-2--carboxílico, 202 mg (0,50 mmol) de 4-iodo-7-(2-trimetil-silanil-etoximetil)-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidina 90% dissolvidos em 2 mL de THF com 0,25 mL de solução 2 M de cloreto de isopropilmagnésio em THF adicionados. Toda a cetona intermediária resultante foi usada no segundo passo com mistura de 2 mL de metanol e 2 mL de ácido clorídrico 6 N para dar depois de purificação 29 mg do produto final na forma dum sólido amarelo.
Exemplo 6: 4-Metil-N-[5-metil-2-(7H-pirrolo[2,3-dlpirimidina-4-carbo-nil)-piridin-3-il]-3-trifluorometil-benzenossulfonamida
94 ΡΕ2175859
Preparado a partir de 496 mg (1,40 mmol) de N-(2--ciano-5-metil-piridin-3-il}-4-metil-3-trifluorometil-ben-zenossulfonamida e 70 mg (1,75 mmol) de hidreto de sódio 60% em 2 mL de THF. A solução de Grignard foi preparada a partir de 467 mg (1,82 mmol) de 4-iodo-7H-pynnlo[2,3-d]-pirimidina 95% dissolvidos em 5 mL de THF com 0,98 mL de cloreto de fenilmagnésio 2 M em solução em THF e 0,98 mL de solução 2 M de cloreto de isopropilmagnésio em THF foram adicionados. A reação produziu 340 mg do produto final na forma dum sólido amarelo.
Exemplo 7: 3,4-Dicloro-N-[5-metil-2-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidina-4--carbonil)-piridin-3-il]-benzenossulfonamida
Preparado a partir de 563 mg (1,55 mmol) do sal de sódio da 3,4-dicloro-N-(2-ciano-5-metil-piridin-3-il)--benzenossulfonamida, 506 mg (2,01 mmol) de 4-iodo-7H--pirrolo[2,3-d]pirimidina 97% dissolvidos em 6 mL de THF com 1,16 mL de solução 1,8 M de cloreto de fenilmagnésio em THF e 1,06 mL de solução 2 M de cloreto de isopropilmagnésio em THF foram adicionados. A reação produziu 471 mg do produto final na forma dum sólido amarelo. 95 ΡΕ2175859
Exemplo de Referência 8:
Preparação de 4-cloro-N-(5-metil-2-(2-metil-7H-pirrolo-[2,3-d]pirimidina-4-carbonil)piridin-3-il)-3--(trifluorometil)benzenossulfonamida
Passo 1: A uma suspensão de NaH (dispersão 60% em óleo mineral, 1,62 g, 40,5 mmol) em DMF (35 mL) e benzeno (12 mL) foi adicionado cianoacetato de etilo (4,7 mL, 44,2 mmol) gota a gota a -10 °C. Após agitação durante 1 hora à temperatura ambiente, 2-bromo-l,1-dietoxietano (5,6 mL, 0,82 equiv.) foi adicionado e a mistura reacional foi aquecida a 100 °C durante 2 horas. A mistura reacional foi em seguida arrefecida até à temperatura ambiente e filtrada. O filtrado foi condensado, e água foi adicionada. A mistura foi extraida com éter. Os extratos foram lavados com água salgada, secos sobre MgS04 e concentrados em vácuo. O material cru foi purificado por cromatografia flash sobre gel de silica (EtOAc 20%/hexanos). O produto desejado foi obtido na forma de óleo incolor (5 g, 60%) . MS: (M + Na)/z = 252. 96 ΡΕ2175859
Passo 2: Hidrocloreto de acetamidina (413 mg, 4,4 mmol) foi adicionado a uma solução de etóxido de sódio (594 mg, 2,0 equiv.) em etanol (8 mL) . Após agitação durante meia hora à temperatura ambiente, o cloreto de sódio resultante foi removido por filtração. 0 filtrado foi adicionado a 2-ciano-4,4-dietoxibutanoato de etilo (1,0 g, 4,4 mmol) e a mistura foi refluxada durante 5 horas. A maior parte do solvente foi removida e a pasta restante foi dissolvida em água com gelo, e extraída com acetato de etilo. Os extratos foram lavados com água salgada, secos sobre MgS04 e concentrados em vácuo. O material cru foi purificado por cromatografia flash sobre gel de sílica (metanol 100%). O produto desejado foi obtido na forma dum sólido vermelho (421 mg, 40%). MS: (Μ + H)/z = 242.
Passo 3: A pirimidina acima (2,0 g, 8,30 mmol) foi adicionada a uma solução de ácido sulfúrico (0,9 mL) em 50 mL de etanol e refluxada durante 2 horas. Após arrefecimento até à temperatura ambiente, a mistura foi concentrada em vácuo. O material cru (solúvel em água) foi usado diretamente para o passo seguinte. MS: (Μ + H)/z = 150.
Passo 4: Uma suspensão de 90 mg (0,60 mmol) da hidroxipir-rolopirimidina acima em 2 mL de cloreto de fosforilo foi refluxada durante 2 horas. O excesso de cloreto de fosforilo foi removido e o resíduo foi extinto cuidadosamente com gelo. A mistura foi extraída com acetato de etilo. Os extratos foram lavados com água salgada, secos 97 ΡΕ2175859 sobre MgS04 e concentrados em vácuo. 0 material cru foi purificado por cromatografia flash sobre gel de silica (metanol 10%/DCM). 0 produto desejado foi obtido na forma dum sólido incolor (86 mg, 85%). MS: (Μ + H)/z = 168.
Passo 5: A cloropirrolopirimidina acima (40 mg, 0,24 mmol) foi adicionada a uma solução aquosa de ácido iodidrico (57% m/m em água, 1,5 mL) e a mistura foi aquecida a 35 °C durante a noite. Após arrefecimento até à temperatura ambiente, uma solução de hidroxilamina foi adicionada e a mistura foi extraida com acetato de etilo. Os extratos foram lavados com água salgada, secos sobre MgS04 e concentrados em vácuo. O produto desejado foi obtido na forma dum sólido castanho (50 mg, 80%). MS: (M + H)/z = 260
Passo 6: A uma solução de 3-(4-cloro-3-(trifluorometil)-fenilsulfonamido)-N-metoxi-iV, 5-dimetilpicolinamida (56 mg, 0,13 mmol) em THF (1 mL) a 0 °C foi adicionado NaH (dispersão 60% em óleo mineral, 6 mg, 1,2 equiv.). A reação foi em seguida aquecida até à temperatura ambiente e agitada durante 0,5 horas.
Num balão separado foi carregada a iodopirrolo-pirimidina acima (40 mg, 1,2 equiv.) em 0,5 mL de THF. A solução foi arrefecida até -78 °C, e uma solução de cloreto de isopropilmagnésio em THF (2,0 M, 167 pL) foi adicionada gota a gota. A mistura reacional foi em seguida aquecida até à temperatura ambiente e uma solução de brometo de 2,6--dimetilfenilmagnésio (1,0 M, 167 pL, 1,3 equiv.) em THF 98 ΡΕ2175859 foi adicionada. Após agitação durante meia hora, a mistura foi adicionada à solução de amida de Weinreb acima e a reação foi agitada durante uma hora adicional antes de ser extinta com solução saturada de cloreto de amónio. A mistura foi extraida com acetato de etilo. Os extratos foram lavados com água salgada, secos sobre MgS04 e concentrados em vácuo. 0 material cru foi purificado por cromatografia flash sobre gel de silica (EtOAc 33%/hexanos). 0 produto desejado foi obtido na forma dum sólido amarelo (31 mg, 40%). MS: (Μ + H)/z = 510.
Exemplo 10: 4-Cloro-N-[5-cloro-2-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidina-4-car-bonil)-piridin-3-il]-3-trifluorometil-benzenossulfonamida
Preparada a partir de 259 mg (0,52 mmol) de metoxi-metil-amida do ácido 5-cloro-3-[(4-cloro-3-tri-fluorometil-benzenossulfonil)-metoximetil-amino]-piridina--2-carboxílico, 213 mg (0,52 mmol) de 4-iodo-7-(2-trimetil-silanil-etoximetil)-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidina 90% dissolvidos em 2 mL de THF com 0,26 mL de solução 2 M de cloreto de isopropilmagnésio em THF adicionados. Toda a cetona 99 ΡΕ2175859 intermediária resultante foi usada no segundo passo com mistura de 2 mL de metanol e 2 mL de ácido cloridrico 6 N para darem após purificação 40 mg do produto final na forma dum sólido amarelo.
Exemplo 13:
Sal de sódio da 4-cloro-N-[5-metil-2-(7H-pirrolo[2,3-d]-pirimidina-4-carbonil)-piridin-3-il]-3-trifluorometil- -benzenossulfonamida (a) Síntese de Sal de sódio de 3-(4-cloro-3-tri- fluorometil-benzenossulfonilamino)-5-metil-piridina-2-carbonitrilo:
A uma solução de 3-amino-2-ciano-5-metilpiridina (83 g, 0,619 mol) em piridina (625 mL) foi adicionado cloreto de 4-cloro-3-trifluorometilbenzenossulfonilo (207 g, 0,742 mol) numa porção e a mistura reacional resultante foi agitada a 60 °C durante a noite (13 horas). A piridina foi removida em vácuo, THF (350 mL) foi adicionado e removido em vácuo. Ao sólido castanho escuro obtido foi adicionado THF (650 mL) , H2O (550 mL) , seguido por NaOH (75 g, 1,88 mol) lentamente a 0 °C (em cinco porções) ao longo de 20 minutos. A solução resultante foi 100 ΡΕ2175859 agitada a 0 °C durante outros 30 minutos. Após remoção do THF em vácuo (-650 mL) , foi adicionada H20 (50 mL) e a suspensão foi aquecida até dissolver todos os sólidos. Após arrefecimento num banho de gelo durante 2 horas, o sólido resultante foi recolhido por filtração, lavado com água com gelo (100 mL x 3) e seco num forno a vácuo a 110 °C durante 24 horas para produzir o composto mencionado em titulo (190 g, 77%) na forma de agulhas brancas: p.f. 287,0-288,5 °C. 1H-NMR (400 MHz, d6-DMSO) δ 8,05 (1H, s) , 7,96 (d, 1H) , 7,76 (dd, 1H) , 7,63 (s, 1H) , 7,40 (s, 1H) , 2,12 (s, 3H) . MS (ES) M+H esperado 375, 9, encontrado 375, 9. As águas-mães foram concentradas (-2/3 do volume) em vácuo para produzir outros 30 g do composto mencionado em titulo depois lavagem e secagem, rendimento total 89%. (b) 4-Cloro-N-[5-metil-2-(7H-pirrolo[2,3-d]- pirimidina-4-carbonil)-piridin-3-il]-3-trifluorometil-benzenossulfonamida
4-Iodopirrolo[2,3-d]pirimidina (2b, 50,3 g, 95,5% de pureza, 196 mmol) foi dissolvida/suspensa em 0,64 L de THF anidro num balão de fundo redondo de 2 L de três tubuladuras sob uma atmosfera de azoto, equipado com um agitador mecânico e um termómetro. A solução foi arrefecida 101 ΡΕ2175859 até -15 °C num banho de gelo seco-acetona e foram lentamente adicionados 206 mL duma solução 1,0 M de cloreto de o-tolilmagnésio em THF (1,05 equiv.), de maneira que a temperatura interna não excedesse os -10 °C. Durante a adição todos os sólidos se dissolveram. O banho de arrefecimento foi removido e 104 mL duma solução 1,95 M de cloreto de isopropilmagnésio em THF (1,03 equiv.) foram adicionados ao longo de um período de 3 minutos. Durante a adição precipitaram sólidos acastanhados; a agitação deverá ser vigorosa para evitar a formação de grumos. A solução resultante foi aquecida rapidamente até à temperatura ambiente usando banho de água quente. A esta suspensão, 59,9 g do sal de sódio do nitrilo (19, 0,77 equiv.) em 120 mL de THF seco foi adicionado e a mistura resultante foi agitada a 45 °C durante 16 horas. A mistura foi arrefecida num banho de gelo e 101 mL de HC1 aquoso 36% foram adicionados gota a gota, de maneira que a temperatura interna não excedesse os 30 °C, enquanto vigorosamente agitados. Sólidos amarelos precipitaram e a suspensão espessa inteira foi mecanicamente agitada durante 30 minutos a 50 °C (os sólidos amarelos tornam-se laranjas), arrefecida até à temperatura ambiente e em seguida filtrada. Os sólidos foram lavados com 700 mL de THF, seguido por 700 mL de éter dietílico, seguido por duas porções de 1 L de HC1 aquoso 1 M. 0 sólido laranja húmido resultante foi recebido numa mistura de 0,9 L de acetato de etilo, 0,5 L de água e 50 g de bicarbonato de sódio e agitado até completamente dissolvido. A solução foi filtrada através de uma almofada de CELITE® e as camadas 102 ΡΕ2175859 foram separadas. A camada aquosa foi extraída com 50 mL de acetato de etilo. As camadas orgânicas combinadas foram filtradas através de uma almofada de 200 g de gel de sílica, seguido por lavagem com sílica com adição de 0,8 L de acetato de etilo. A solução foi concentrada em vácuo para produzir 56,5 g do produto na forma dum sólido amarelo (contém 2% m/m de acetato de etilo, rendimento 74%). (c) Sal de sódio da 4-cloro-N-[5-metil-2-(7H-pirrolo-[2,3-d]pirimidina-4-carbonil)-piridin-3-il]-3--trifluorometil-benzenossulfonamida 4-Cloro-N-[5-meti1-2-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidi-na-4-carbonil)-piridin-3-il]-3-tritluorometil-benzenossul-fonamida (6,85 g, 13,8 mmol) foi suspensa em 103 mL de álcool isopropílico e trazida até ao refluxo sob atmosfera de azoto. A suspensão foi tratada com 1,30 mL de hidróxido de sódio aquoso 10,6 N (1 equiv.) gota a gota com agitação, onde todos os sólidos se dissolveram. A mistura foi deixada arrefecer até à temperatura ambiente e semeada, em seguida ainda arrefecida num banho de gelo. 0 sólido é separado por filtração e lavado com 35 mL de álcool isoropílico, seguido por secagem durante a noite em vácuo a 80°C. Rendimento: 6,12 g (86%). O conteúdo de IPA é 800 ppm (determinada por 1H-RMN).
Exemplo 14 XPRD do composto do Exemplo 13 0 material do Exemplo 13 foi sujeito a análise de 103 ΡΕ2175859 difração de raios X pelo método do pó (XRPD). A análise foi realizada usando um difratómetro de raios X pelo método do pó Shimadzu XRD-6000 usando radiação CuKa. O instrumento é equipado com um tubo de raios X de foco fino comprido. A voltagem e amperagem do tubo foram reguladas para 4 0 kV e 40 mA, respetivamente. As fendas de divergência e dispersão foram reguladas para Io e a fenda de receção foi regulada para 0,15 mm. A radiação difratada foi detetada por detector de cintilação de Nal. Um exame contínuo Θ-2Θ em 3°/min (passo de 0,4 s/0,02°) desde 2,5 a 40° valor 2Θ foi usado. Um padrão de silício foi analisado para verificar o alinhamento do instrumento. Os dados foram recolhidos e analisados usando XRD-610017000 v.5.0. O exame XPRD é delineado na Figura 1. Os valores 2-teta são reportados no Quadro 3. A forma cristalina do composto do Exemplo 13 é designado como Forma A. A lista de picos (20°) e intensidades (CPS) observados no XRPD do composto cristalino do Exemplo 13. A intensidade do pico pode variar dependendo do tamanho e morfologia da partícula.
Quadro 3 Ângulo 20° Intensidade (CPS) 6, 9 635 7,7 1555 10, 6 340 ΡΕ2175859 104 (continuação) Ângulo 2Θ° Intensidade (CPS) 11,3 250 11,8 125 12,5 165 13,7 255 15, 1 300 15,3 305 16, 1 490 16, 9 290 17,3 485 18,2 195 18,5 190 19, 5 250 20,0 1485 21, 6 510 21,8 340 22, 6 680 24,3 635 24,7 615 25, 1 630 25, 6 255 ΡΕ2175859 105 (continuação) Ângulo 2Θ° Intensidade (CPS) 26, 3 255 27,5 490 28,5 605 28,8 345 29, 3 240 31,4 315 32,4 465
Exemplo Comparativo 1: 4-Cloro-N-(5-metil-2-(lH-pirazolo[3,4-blpiridina-4-car-bonil)piridin-3-il)-3-(trifluorometil)benzenossulfonamida
Este composto pode ser preparado conforme descrito na Publicação dos EUA N° 2007-0037794A1,
Os compostos dos Exemplos de Referência e Exemplos 1-12 têm cada um deles uma CI50 inferior a 1000 nM no seguinte ensaio de quimiotatismo de CCR2. O Composto 5 tem uma CI50 média de aproximadamente 5 nM neste ensaio. 106 ΡΕ2175859
Exemplo de ensaio in vitro
Reagentes
As células THP-1 foram obtidas em American Type Culture Collection (Manassas, VA) e cultivadas em meio de cultura de tecido RPMI suplementado com soro bovino fetal (SBF) 10% num incubador com CO2 humidificado 5% a 37 °C. Proteínas quimiocinas humanas recombinantes MCP-1 foram obtidas em R&D Systems (Minneapolis, MN). A proteína MCP-1 rotulada com 125I foi obtida em Amersham (Piscataway, NJ) . As microcâmaras de quimiotatismo ChemoTX® foram compradas em Neuro Probe (Gaithersburg, MD) . Os kits de proliferação celular CyQUANT® foram compradas em Molecular Probes (Eugeno, Oregon). O corante indicador de cálcio Fluo-4 AM foi comprado em Molecular Devices (Mountain View, CA).
Ensaio de migração convencional 0 ensaio de migração convencional foi usado para determinar a eficácia de potenciais antagonistas do recetor no bloqueio de migração mediada através de quimiocinas (tais como CCR2). Este ensaio foi rotineiramente realizado usando o sistema de microcâmara ChemoTX® com uma membrana de policarbonato de tamanho de poro de 5 pm. Para começar um tal ensaio, as células expressando quimiocina (tais como células THP-1 para ensaio de CCR2) foram colhidas por centrifugação da suspensão celular a 1000 rpm numa centrífuga GS-6R Beckman. O pélete celular foi ressuspenso em tampão de quimiotatismo (HBSS com BSA 0,1%) a 10xl06 cé- 107 ΡΕ2175859 lulas/mL para ensaio de CCR2. Os compostos de teste nas concentrações desejadas foram preparados a partir de soluções estoque 10 mM por diluições em série em tampão de quimiotatismo. Um volume igual de células e compostos foi misturado e incubado à temperatura ambiente durante 15 minutos. Depois disso, 20 yL da mistura foram transferidos para a membrana porosa duma microcâmara de migração, com 29 μΐ de ligando de quimiocina (proteína quimiocina MCP-1 0,1 nM para ensaio de CCR2) colocado na câmara inferior. A seguir a uma incubação a 37 °C (90 minutos para CCR2), durante a qual as células migraram contra o gradiente de quimiocina, o ensaio foi terminado pela remoção das gotas de célula do topo do filtro. Para quantificar as células migradas através da membrana, 5 yL de solução 7X CyQUANT® foram adicionados a cada cavidade na câmara inferior, e o sinal de fluorescência foi medido num leitor de placa de fluorescência Spectrafluor Plus (TECAN, Durham, NC). O grau de inibição foi determinado por comparação dos sinais de migração entre células tratadas e não tratadas com composto. Foi ainda realizado cálculo de CI5o por análise de regressão de quadrados não linear usando Graphpad Prism (Graphpad Software, San Diego, CA).
Farmacocinética A farmacocinética (PK) e a biodisponibilidade oral do composto do Exemplo 5 foram determinadas no cão bigle. 108 ΡΕ2175859 A seguir a uma administração de bolo i.v. de 1 mg/kg de composto 5 (base livre) em N,N-dimetilacetamida 31,6%/água 36,8%/propilenoglicol 31,6% a cães bigles machos (n=2), foram recolhidas amostras de sangue nos seguintes instantes: Pré-dose, 2, 5, 15, 30 minutos, 1, 2, 4, 8, 12, e 24 horas pós-dosagem. A seguir a uma administração oral de 5 mg/kg do composto do Exemplo 5 em metocel 1% a cães bigles machos (n=2), foram recolhidas amostras de sangue nos seguintes instantes: Pré-dose, 5, 15, 30 minutos, e 1, 2, 4, 8, 12, e 24 horas pós-dosagem. O composto intacto do Exemplo 5 foi extraido de amostras de plasma usando ácido fórmico 3%/acetonitrilo e medido usando um método LC-MS/MS. Os parâmetros PK foram determinados por análise não comportamental. Os animais foram observados relativamente aos sinais de mal de saúde e mortalidade. O composto do Exemplo 5 foi bem tolerado pelos cães bigles sem sinais vincados de mal de saúde e mortalidade. A seguir à administração i.v. do composto do Exemplo 5, as concentrações no plasma do composto 5 intacto declinaram monoexponencialmente com uma meia-vida de eliminação terminal média ti/2 de 4,7 horas. O composto do Exemplo 5 foi removido do plasma muito lentamente a 0,2 mL/min/kg (<1% do fluxo sanguineo no figado de cão) e mostrou um muito baixo volume de distribuição (Vss) de 0,1 L/kg. O tempo de residência médio (MRTiv) foi estimado ser 109 ΡΕ2175859 7,2 horas. A seguir à administração oral, os composto do Exemplo 5 foram rapidamente absorvidos com um pico médio de concentração no plasma (Cmax) de 44,4 pg/mL (cerca de 59,5 pM) alcançado depois de 1,5 horas (Tmax) . 0 composto foi bem absorvido, com uma biodisponibilidade oral de cerca de 100%. O composto do Exemplo 5 revelou um excelente perfil PK i.v. e oral. A seguir a dosagem i.v., mostrou uma «clearance» muito baixa no cão bigle (inferior a 1% do fluxo de sangue do fígado) e um longo tempo de residência médio (cerca de 7 horas). O Composto 5 foi também rapidamente e bem absorvido oralmente, com uma biodisponibilidade de cerca de 100%.
Ensaios de Inibição de CYP2C9 e CYP3A4
Os compostos de teste foram incubados com microssomas de fígado humano combinados a 37 °C na presença de NADPH e concentrações apropriadas de substratos específicos para CYP2C9 e 3A4. As concentrações de ensaio finais de microssomas de fígado humano e substratos, as concentrações em DMSO da solução de estoque inicial, e os tempos usados para as incubações de várias isoenzimas são sumariados no Quadro 4. As concentrações de ensaio finais dos controlos de inibidor positivos em cada ensaio de isoenzima são listadas no Quadro 5. 110 ΡΕ2175859
Quadro 4. Concentrações de Incubação CYP450 Cone. de Proteína [mg/mL] Substrato Cone. de Substrato [μΜ) Tempo de Incubação [min] 2C9 0,05 Diclofenac 10 10 3A4 0,05 Midazolam 3 10 0,05 Testosterona 100 30
Quadro 5. Condições para Controlos CYP450 Substrato Controlo Concentração do Controlo de Incubação Final [μΜ] 2C9 Diclofenac Sulfafenazole 50 17 5,6 1,9 0,62 0,2 0,069 3A4 Midazolam Cetoconazole 1 0,33 0,11 0,037 0,012 0,0041 0,0014 Testosterona Cetoconazole 1 0,33 0,11 0,037 0,012 0,0041 0,0014
Incubação 120 yL de uma mistura de microssomas de figado humanos (MFH) em tampão fosfato de potássio 50 mM/MgCl2 5 mM foram adicionados em todas as cavidades da linha A numa placa de 96 cavidades. A concentração de proteina microssómica foi 2 vezes a concentração de proteina pretendida para o ensaio de isoenzima particular registado no Quadro 4. Além disso, 80 yL desta preparação de microssoma de figado humano fixada com DMSO 1% foram dispensados em todas as cavidades das linhas B até H. 1,2 yL de cada composto de teste individual em DMSO (10 mM) foram adicionados às primeiras 10 cavidades da 111 ΡΕ2175859 linha A (5 diferentes compostos de teste cada um em duplicado) . Adicionalmente, 1,2 yL do estoque em DMSO do inibidor de controlo para a isoenzima sob estudo foram adicionados nas duas cavidades finais da linha A até dar uma concentração duas vezes acima da concentração final mais alta. (Ver Quadro 5 para as concentrações de inibidor de controlo finais)
Diluições em tripla série foram realizadas tomando 40 yL de cada solução em cavidades da linha A (cavidades 1-12, ambos os compostos e controlos) e diluindo nas cavidades da linha B. Após mistura profunda, 40 yL de cada solução em cavidades da linha B foram dispensados com uma pipeta de multicanal (12 canais) nas cavidades da linha C e os controlos e composto de teste por isso ainda diluidos. Este processo foi repetido para as linhas D até G. Após mistura, 40 yL foram removidos e descartados das cavidades da linha G.
Este procedimento resultou em 80 yL de solução a estar presente em todas as cavidades de todas as linhas A até H, com concentrações de proteína a serem duas vezes as concentrações finais pretendidas em todas as cavidades das linhas, e a concentração do composto de teste e controlo a ser duas vezes as concentrações finais pretendidas nas linhas A até G. A linha H não foi bloqueada ou fixada com um composto de teste ou controlo positivo. A placa foi coberta e pré-incubada durante 10 112 ΡΕ2175859 minutos num incubador a 37 °C. A reação foi iniciada por adição de 80 pL duma solução do substrato para a isoenzima sob investigação em solução tampão de fosfato de potássio 50 mM/MgCÍ2 5 mM com NADPH 4 mM presente, numa concentração de substrato duas vezes as concentrações finais de substrato pretendidas usando uma pipeta multicanal. A solução de substrato foi adicionada a todas as linhas de cavidades A ao H excluindo as cavidades 95 e 96 (brancos microssómicos). As soluções de substrato foram preparadas a partir de várias soluções em estoque de substrato em DMSO preparadas em concentrações também anotadas no Quadro 4.
Este procedimento produziu as concentrações finais de proteína e substrato listadas no Quadro 4, as concentrações finais de controlo listadas no Quadro 5, e as concentrações de composto de teste de 50 μΜ, 16,7 μΜ, 5,6 μΜ, 1,9 μΜ, 618 ηΜ, 206 ηΜ e 69 ηΜ para cada composto de teste individual. A placa foi coberta e incubada a 37 °C durante o tempo listado no Quadro 4 para a isoforma sob investigação. A reação foi parada dispensando 120 pL de padrão interno (200 ng/mL de CCX915-6A) em acetonitrilo a todas as cavidades. 80 pL da solução substrato específico/NADPH descrita acima foram adicionados as cavidades 95 e 96 depois da paragem da reação para proporcionar o branco. A placa foi turbilhonada durante 10 min e sujeita a rotação numa centrífuga a 4450 rpm e 4 °C durante 10 min. Com uma pipeta multicanal, 80 pL do sobrenadante foram transferidos 113 ΡΕ2175859 para cavidades de placa de amostra contendo 80 yL de ácido fórmico 0,1%/água e bem misturados para análise de LC-MS/MS conforme descrito nas secções E e F. Método Analítico
As amostras foram analisadas pelo método de LC-MS/MS. Cada metabolito (Quadro 6) derivado do substrato particular para cada isoforma de CYP450 diferente foi monitorizado.
Condições de HPLC para Substratos
Instrumento: Shimadzu, equipado com sistema de cromatografia liquida LC-10AD VP.
Inibição de CYP2C9 e CYP3A4 (Midazolam)
Coluna: Waters, Sunfire C18, 3u, 2,1x50 mm
Fases Móveis: A: Ácido Fórmico 0,1% em Água B: Ácido Fórmico 0,1% em Acetonitrilo
Programa de Gradiente: para CYP2C9 e CYP3A4 (Midazolam)
Tempo [min] Solvente A Solvente B O O 1 o K> 95 5 0,3 - 1,0 5 95 1,0 - 3,0 95 5
Caudal: 300 pL/min Vol. Inj.: 10 pL 114 ΡΕ2175859
Tempo de Esguicho: 3 min para CYP2C9, 3A4 (Midazolam). Tempo de retenção para analito é 1,03 min para 2C9 (4'-Hidroxi-diclofenac) e 0,87 min para 3A4 (1'-hidroxil-midazolam)
Inibição de CYP3A4 (Testosterona)
Coluna: Waters, Sunfire C18, 3 u, 2,1x50 mm Fases Móveis: A: Ácido Fórmico 0,1% em Água B: Ácido Fórmico 0,1% em Acetonitrilo
Programa do Gradiente: para CYP3A4 (Testosterona)
Tempo [min] Solvente A Solvente B 0,0 -1,5 95 5 1,5 - 3,0 5 95 3,0 - 4,0 95 5
Caudal: 300 yL/min Vol. Inj.: 20 yL
Tempo de esguicho: 4,0 min para CYP3A4 (Testosterona). Tempo de retenção para analito (β-β-hidroxi-testosterona) é 1,35 min para 3A4 (Testosterona).
Condições do Espetrómetro de Massa
Instrumento: Espetrómetro de massa Applied Biosystems (Foster City, CA) API 3000 e 4000 Q-TRAP
Interface: Electrospray ("Turbo Ion Spray"), Ionização positiva
Modo: Monitorização de Reação Múltipla (MRM) 115 ΡΕ2175859
Quadro 6
Transições de massa para metabolitos e tempos de retenção em HPLC
Isoforma de CYP450 Substrato Metabolito Transição Tempo RT [min] substrato 2C9 Diclofenac 4'-Hidroxi-diclofenac 312,10/230,97 2,2 3A4 Midazolam 1'-hidroxil-midazolam 341,98/323,92 2,23 Testosterona δ-β-hidroxi-testosterona 305,13/269,28 2,1
*analisado num espetrómetro de massa API 4000 QTRAP Cálculo de Cl 50
As áreas de pico dos metabolitos foram obtidas por integração automática dos cromatogramas usando o programa Analyst® 1.4.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA) .
Inibição — 100 - ((AUCteste ~ AUCbranco)l (AUCCOntroio ~ AUCbranco) x 100) Eg. 1 AUCtester AUCcontroio e AUCbranco são as contagens da área de pico para o metabolito do controlo na presença do artigo de teste ou inibidor positivo, a contagem da área de pico do metabolito do controlo sem o artigo de teste, e contagem da área de pico observada no branco de microssoma, respetivamente. A percentagem de inibição foi representada em gráfico contra a concentração do artigo de teste usando Excel (Microsoft). Os valores CI50 foram calculados usando um ajustamento de 4 parâmetros em XLFit™ (IDBS Lid, Guildford, UK) . Os valores CI50 dos compostos selecionados são mostrados abaixo. 116 ΡΕ2175859
Avaliação Farmacocinética de Compostos Selecionados em Ratazanas
Sprague-Dawley
Um estudo de farmacocinética intravenosa/oral com os compostos selecionados foi conduzido em ratazanas Sprague-Dawley machos pesando entre 0,24 e 0,36 kg. Amostras de sangue foram recolhidas em instantes predeterminados e as correspondentes amostras de plasma dos animais foram analisadas às concentrações do composto de teste usando um método de LC-MS/MS. Os parâmetros farmaco-cinéticos foram derivados da curva concentração no plasma contra tempo.
Para análise de LC-MS/MS, uma solução de estoque a 1 mg/mL de composto de teste em acetonitrilo foi preparada, e soluções de estoque de trabalho preparadas em metanol 50%/água foram usadas para preparar padrões analíticos e amostras QC.
Plasma ratazana Sprague-Dawley macho pobre em plaquetas com EDTA sódico como anticoagulante foi obtido em Bioreclamation, Inc. (East Meadow, NY) e usado para a preparação dos padrões analíticos bem como para diluições em série das amostras selecionadas.
Animais
Oito animais pesando entre 0,24 e 0,36 kg foram usados para este estudo. Dois animais foram usados para a dosagem i.v., considerando que os últimos seis foram para dosagem oral. 117 ΡΕ2175859
Desenhos da Dosagem e Sangue
Para dosagem i.v., uma formulação de solução de composto de teste foi preparada em propilenoglicol/IV,IV-di-metilacetamida/EtOH (31,6/31,6/36,8) a 1 mg/mL e cada animal recebeu 1 mL/kg. Para dosagem oral, os compostos de teste foram suspensos em HPMC 1% a 0,5 mg/mL e cada animal recebeu 10 mL/kg.
Os animais jejuaram durante a noite e foram examinados antes da dosagem e na conclusão do estudo. Para doseamento intravenoso, foi drenado sangue (0,2 mL) na pré-dose e aos 2, 5, 10, 15, e 30 minutos, 1, 2, 4, 6, e 8 horas pós-dose. Para dosagem oral, foi drenado sangue (0,2 mL) na pré-dose e aos 5, 15, e 30 minutos, 1, 1,5, 2, 4, 6, 8, e 24 horas pós -dose. Foi amostrado sangue de animais canulados e em seguida colocado em tubos de polipropileno arrefecidos contendo EDTA sódico como anticoagulante e mantidos em gelo até centrifugação. O plasma foi recolhido através de centrifugação (Centrífuga Eppendorf 5417R) a 12 000 rpm e 4 °C durante 6 minutos e armazenado a -20°C até análise. Método Analítico
Amostras de plasma (50 pL) foram extraídas com 150 pL de acetonitrilo contendo o padrão interno num agitador linear durante 10 min. As amostras foram centrifugadas a 4450 rpm durante 10 min a 4°C (centrífuga Allegra X-15R, Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA). 80 pL 118 ΡΕ2175859 do sobrenadante resultante foram transferidos para novas cavidades da placa contendo 80 yL de ácido fórmico 0,1% em água e profundamente misturados.
Amostras extraídas preparadas usando o procedimento acima foram separadas por cromatografia líquida de alta eficiência usando um sistema Shimadzu (Kyoto, Japão) equipado com duas bombas LC-10 AD e uma coluna C-18 (Waters Sunfire, 2 x 30 mm, 3,5 pm; injeção de 10 pL) usando uma fase móvel constituída por (A) ácido fórmico 0,1% em água e (B) ácido fórmico 0,1% em acetonitrilo, a uma caudal de 0,35 mL/min. O gradiente foi 0-1,5 min B 5%, 1,5-2,5 min B 5-95%, 2,5-2,7 min B 95% a 5%, e 2,7-4,0 min B 5%. A eluição da HPLC foi conduzida num espetrómetro de massa de quadrupolo triplo Applied Biosystems (Foster City, CA) Sciex API 3000, operando no modo MS/MS de ionização positiva do Turbo Ionspray para análise. A aquisição e integração foram realizadas com software Applied Biosystems--Sciex Analyst (versão 1.4.1). A curva de calibração foi obtida através duma regressão quadrática (i.v.) ou linear (p.o.) e o intervalo de calibração foi 4-5000 ng/mL e 2-5000 ng/mL para os estudos i.v. e p.o., respetivamente.
Preparação de Padrões de Calibração de LC-MS/MS
Para determinar a concentração de composto de teste em amostras de plasma de ratazana, padrões contendo 5000, 1000, 500, 100, 50, 20, 10, 4, 2 e 1 ng/mL do composto foram preparados com plasma de ratazana obtido em Bioreclaimation Inc. (Lote N° RATBREC.47491M). Os padrões de plasma foram preparados em paralelo com as amostras de 119 ΡΕ2175859 plasma duma maneira idêntica. Três niveis das soluções de estoque padrão (1000, 100 e 10 ng/mL) foram considerados separadamente em plasma de ratazana macho Sprague-Dawley e usados como amostras QC.
Análise de Farmacocinética
Um total de onze instantes foram obtidos para cada via de dosagem durante o periodo de recolha de sangue. Os parâmetros de farmacocinética descritivos foram determinados a partir da curva concentração no plasma-tempo por uma análise não comportamental padrão (Wagner, 1993) para cada animal e via da dose. • Meia-vida (Ti/2) : Meia-vida terminal. • Cmax: Concentração máxima no plasma. • AUCo-oo: Área sob a curva concentração no plasma-tempo a partir do instante de dosagem extrapolada até ao infinito. • CL: «Clearance» corporal total. • MRTo-οο: Tempo médio de residência a partir do instante de dosagem extrapolada até ao infinito. • Vdss: Volume de distribuição em regime constante. • F: Biodisponibilidade. A análise farmacocinética foi realizada usando XLFit® v.4.1 (ID Business Solutions Inc., Alameda, CA).
Cl Cl
120 ΡΕ2175859 α α
PK MRT na ratazana 35 min 135 min CI50 Inibição CYP 3A4 3 μΜ 2 0 μΜ PK MRT na ratazana 22 min 135 min Rat PK Ti/2 19 min 161 min CI50 Inibição CYP 3A4 3 μΜ 2 0 μΜ PK MRT na ratazana 21 min 68 min Rat PK Ti/2 42 min 127 min Ciso Inibição CYP 2C9 3 μΜ 15 μΜ
Lisboa, 31 de Maio de 2012
Claims (10)
- ΡΕ2175859 1 REIVINDICAÇÕES 1. Um composto da fórmula (II) ou um seu sal:onde: 1 2 R e R são cada um independentemente hidrogénio, halogéneo, alquilo Ci-C8, -CN, ou haloalquilo Ci-C8, com a condição de que pelo menos um dos R1 ou R2 é diferente de hidrogénio; R1 2 é hidrogénio; R5 é halogéneo ou alquilo Ci-C8; R11 é selecionado de entre o grupo constituído por hidrogénio, alquilo Ci-C8, alcenilo C2-C8, alcinilo C2-C8, arilo C6-C10 substituído ou não substituído, heteroarilo de 5 a 10 membros substituído ou não substituído e heterociclo de 3 a 10 membros substituído ou não substituído.
- 2. O composto ou sal da reivindicação 1, onde R1 é Cl. 1 O composto ou sal da reivindicação 2, onde 2 R2 é -CF3. 2 ΡΕ2175859 4 0 composto ou sal da reivindicação 3, onde R5 é Cl ou metilo. 5. 0 composto ou sal da reivindicação 4, onde R5 é metilo. 6. 0 composto ou sal da reivindicação 1, em que R1 é Cl, R2 é CF3, e R5 é Cl. 7. 0 composto da reivindicação 1, o qual é selecionado do grupo constituído por:8. 0 composto da reivindicação 7, em que o composto é ΡΕ2175859 3 9. selecionado do0 composto da reivindicação grupo constituído por: 1, o qual éou um seu sal farmaceuticamente aceitável. que o
- 10. O composto da reivindicação 9, em composto éou um seu sal farmaceuticamente aceitável.
- 11. O composto da reivindicação 1, em composto é o sal de sódio da 4-cloro-N-[5-metil -pirrolo[2,3-d]pirimidina-4-carbonil)-piridin-3-il]-fluorometil-benzenossulfonamida. que o -2- (7H-3-tri- 4 ΡΕ2175859
- 12. Uma composição compreendendo um agente de suporte farmaceuticamente aceitável e um composto ou sal de qualquer das reivindicações precedentes.
- 13. Um método de modulação da função de CCR2 numa célula in vitro, compreendendo o contacto da célula com uma quantidade de modulação de CCR2 do composto ou sal ou composição de qualquer uma das reivindicações 1-12.
- 14. Um composto, sal ou composição de qualquer das reivindicações 1 a 12 para uso no tratamento de uma condição ou doença mediada por CCR2 em que a referida condição ou doença mediada por CCR2 é selecionada do grupo constituído por aterosclerose, restenose, fibrose renal, diabetes tipo 2, e cancro.
- 15. Um composto, sal ou composição de qualquer das reivindicações 1 a 12 para uso no tratamento de uma condição ou doença mediada por CCR2 em que a referida condição ou doença mediada por CCR2 é selecionada do grupo constituído por doença inflamatória intestinal, esclerose múltipla, diabetes não dependente de insulina, fibrose pulmonar, rejeição de transplante, doença do enxerto contra o hospedeiro, psoriase, dermatite atópica, e asma.
- 16. Um composto, sal ou composição de qualquer das reivindicações 1 a 12 para uso no tratamento de uma condição ou doença mediada por CCR2 em que a referida 5 ΡΕ2175859 condição ou doença mediada por CCR2 é selecionada do grupo constituído por artrite reumatoide, obesidade, doença pulmonar obstrutiva crónica, fibrose pulmonar idiopática, síndrome da pneumonia idiopática, e doenças alérgicas. 17. 0 composto da reivindicação 10 em forma cristalina. 18. 0 composto da reivindicação 17, em que a referida forma cristalina tem uma difracção de raios X pelo método do pó compreendendo os seguintes valores 2-teta ± 0,2 medidos usando radiação CuKa: 6,9, 7,7, 20,0, 24,3, 24,7, e 25,1.
- 19. O composto da reivindicação 18, em que a referida forma cristalina tem uma difracção de raios X pelo método do pó compreendendo os seguintes valores 2-teta ± 0,2 medidos usando radiação CuKa: 6, 9, 7,7, 10, 6, 11,3, 11,8, 12,5, 13,7, 15,1, 15,3, 16,1, 16, 9, 17,3, 18,2, 18,5, 19,5, 20,0, 21,6, 21,8, 22, 6, 24,3, 24,7, 25,1, 25, 6, 26,3, 27,5, 28,5, 28,8, 29,3, 31,4, e 32, 4 . Lisboa, 31 de Maio de 2012
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