PT2136771E - Composições contendo n-acetilglucosamina para utilização em dermocosmética e medicina estética - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "COMPOSIÇÕES CONTENDO N-ACETILGLUCOSAMINA PARA UTILIZAÇÃO EM DERMOCOSMÉTICA E MEDICINA ESTÉTICA"

Introdução

Estrutura da pele

Diferente do que pode parecer, a pele tem uma estrutura bastante complexa e pode ser esquematicamente comparada à sobreposição de três camadas de tecido, nomeadamente a epiderme, derme e tecido cutâneo, cada caracterizada por funções precisas, bem diferenciadas. A camada superior, conhecida como epiderme, é um pouco resistente e parece fina quando ao microscópio. Esta desgasta-se progressivamente e é constantemente renovada. É translúcida e permite que a luz apenas passe parcialmente, um pouco como vidro fosco. A epiderme não contém quaisquer vasos sanguíneos, esta recebe oxigénio e nutrientes das camadas mais profundas do tecido cutâneo, impede a excessiva perda de humidade do corpo e confere à pele saudável uma aparência atrativa.

Todas as células da epiderme originam-se a partir de uma única camada conhecida como a camada basal. 0 tipo de célula dominante na epiderme é o queratinócito, cujo nome deriva da sua capacidade de sintetizar queratina. As queratinas são proteínas naturais não solúveis em água, com elevada resistência à temperatura e pH; estas estão divididas em queratinas moles e duras: as queratinas duras do cabelo, pele e unhas, enquanto as queratinas moles são os principais componentes das células cornificadas das camadas mais externas da epiderme e são também encontradas, como substâncias conectivas, no espaço extracelular de outras camadas da epiderme.

Para além dos queratinócitos, a epiderme também contém melanócitos, os quais estão localizados na camada basal e produzem o pigmento da pele conhecido como melanina, o qual, dependendo da quantidade, determina a cor da pele e cabelo; além disso, os melanócitos aumentam a expressão de melanina, em resultado do efeito da radiação solar como uma reação de defesa contra o potencial dano sobre o tecido da pele provocado pelo impacto de raios ultravioleta. A camada basal mencionada acima, que separa a derme da epiderme, consiste precisamente de células melanocíticas e queratinócitos cilíndricos, responsáveis pela mitose celular, garantindo a contínua regeneração epidérmica e a divisão celular que depende, por sua vez, do papel desempenhado por outras substâncias, tais como os vários fatores de crescimento, hormonas e vitaminas variadas.

Entre a camada basal da epiderme e a derme está localizada a membrana basal (ela própria também desprovida de vasos sanguíneos), também conhecida como a junção dermo-hipodérmica, a qual, além de separar as duas camadas cutâneas, está também envolvida na fixação de células basais à derme e na mediação de várias funções nutricionais e metabólicas. A segunda camada, i. e., a derme, contém vasos sanguíneos, nervos, as raízes do cabelo, glândulas sudoríparas e todas as estruturas que conferem resistência e elasticidade à pele. A derme é principalmente composta de feixes de colagénio horizontais dispostos ao longo desta e imersos em substância gelatinosa conhecida como substância fundamental, a qual, por sua vez, faz parte da matriz extracelular. 0 colagénio constitui até 75% do peso da derme e é responsável pela tonicidade e elasticidade da pele. Os feixes de colagénio são mantidos juntos por fibras elásticas constituídas por uma proteína denominada elastina, a qual representa menos do que 5% do peso da derme e, apesar do nome, não é diretamente responsável pela elasticidade natural da pele. 0 colagénio e as fibras elásticas são produzidos por células conhecidas como fibroblastos, os quais são encontrados na derme. Os fibroblastos não só produzem e organizam a matriz extracelular da derme, mas também comunicam entre si e com outros tipos de células, realizando funções muito importantes na fisiologia da pele, tal como, por exemplo, a libertação de fatores de crescimento/citocinas os quais, por sua vez, desempenhem um papel significativo na cicatrização de feridas através da modelação da atividade de queratinócitos (Sorrell M. e Caplan AI, 2004). O ácido hialurónico (HA) é outro componente fundamental da matriz extracelular elastoviscosa, no qual estão imersas as fibras de colagénio, fibras elásticas e outras estruturas celulares. Este tem a capacidade de atrair água em quantidades iguais a centenas de vezes o seu peso e, por este motivo, representa uma substância hidratante natural, responsável pela tonicidade da pele e das suas reservas de humidade. Além disso, o HA facilita o transporte de nutrientes essenciais do sangue para as células da pele. 0 HA é um polissacárido natural, linear, composto por uma unidade estrutural dissacaridica constituída por monossacáridos de ácido D-glucurónico e N-acetil-glucosamina (NA) e está presente em todos os organismos vivos. Ao contrário do colagénio, o ácido hialurónico não mostra especificidade de tecido ou espécie e não é alergénico ou irritante.

Outra classe de substâncias presentes na matriz extracelular e estrutural e funcionalmente próximas associadas com HA é representada pelos glicosaminoglicanos (GAG). Estes são constituídos por cadeias longas de unidades dissacarídicas, em que os monómeros são representados por glucosamina ou galactosamina e ácidos urónicos. Os GAG transportam cargas negativas, devido à presença de grupos sulfónicos e aos ácidos urónicos mencionados cima (e esta estrutura explica a sua potente capacidade de atrair iões negativos e grandes quantidades de H20) e ligam-se a cadeias proteicas (proteínas nucleares) para formar os proteoglicanos. Os proteoglicanos são o componente principal da matriz extracelular e, em conjunto com o HA, ao qual estes estão covalentemente ligados (por meio de proteínas de ligação) e fibras de colagénio, constituem a estrutura extracelular de tecido conectivo e, assim, a pele, dotando o referido tecido com a maioria das suas características mecânicas/funcionais caracterizadoras.

Por fim, a parte mais interna da pele é representada pela hipoderme ou pela camada subcutânea, consistindo de vasos sanguíneos, nervos e aglomerados de adipócitos. Do ponto de vista estrutural, a separação da derme sobreposta não está bem definida, enquanto que mais profunda, a hipoderme está ligada ao músculo subjacente e tecido adiposo, o qual está ai depositado em várias quantidades e exerce uma função de isolamento e modelação bem definida.

Características funcionais da pele e fatores condicionantes

Foram realizados vários estudos com o âmbito de determinar o efeito do ácido hialurónico e outras substâncias sobre a atividade celular da pele. - 0 ácido hialurónico exógeno pode influenciar a proliferação de fibroblastos da pele e este efeito varia dependendo da densidade celular e da concentração do próprio ácido hialurónico. A este respeito e como observado por Yoneda M. et al. (1988), a adição de HA a culturas primárias de fibroblastos de pele de murganho, provoca a síntese de ADN transiente com apoio positivo consequente constituído por um aumento nos próprios fibroblastos da pele e, assim, a expressão de HA endógeno. - A importância de HA exógeno é ainda confirmada pelo facto

de que, de acordo com Isnard N et al. (2001), em culturas de fibroblastos e queratinócitos humanos, a adição de HA (1 mg/mL) provoca um claro aumento na expressão de metaloproteinases da matriz extracelular, conhecidas por desempenharem um importante papel na remodelação de tecido em vários processos fisiológicos e patológicos.

Com o avançar da idade, a elasticidade da pele e tónus reduzem visivelmente com o consequente aparecimento de rugas de várias profundidades e perda da turgescência caracteristica de pele mais jovem esteticamente mais agradável. Este envelhecimento é essencialmente associado com a desaceleração da renovação do HA, consequentemente com capacidade reduzida de absorver/reter a humidade do tecido, e do colagénio, com deterioração das outras caracteristicas funcionais da pele, tais como resistência a stress externo e elasticidade. A procura por substâncias a serem utilizadas em dermocosmética e medicina estética para utilização tópica ou como um enchimento de pele para a correção de rugas da pele faciais e para a melhoria do tecido mole facial tem sido submetida a um esforço continuo desde há vários anos. Estão atualmente disponíveis vários biomateriais, mas todos têm mostrado pesadas limitações: estes são absorvidos demasiado rápido e, por este motivo, não são de utilização prática ou estes podem dar origem a reações alérgicas (tal como, por exemplo, no caso do colagénio) ou mesmo migrar para longe do local de injeção.

Uma substância segura e eficaz para as utilizações mencionadas acima deve ser biocompatível, não pirogénica, não deve ser nem alergénica nem tóxica, não deve provocar inflamação, deve ser de fácil utilização, estável e não migrar após a injeção, deve durar tanto quanto possível mas, ao mesmo tempo, deve ser reabsorvível e deve conferir à pele uma aparência natural: devido às suas caracteristicas físico-químicas e mecânicas/estruturais, o ácido hialurónico tem-se mostrado capaz de satisfazer simultaneamente todos estes requisitos funcionais. Este foi desenvolvido como um enchimento da pele pela primeira vez em 1989 por E. Balazs, que observou a biocompatibilidade e ausência de imunogenicidade (Balazs E.A. e

Leshchiner E.A. 1989). 0 ácido hialurónico exógeno é rapidamente reabsorvido pela derme e metabolizado no fígado com a formação de dióxido de carbono e água. 0 processo de reabsorção de HA é rápido e completo e depende da ligação ao recetor e degradação intracelular. A semi-vida na pele é muito curta, i. e., menos do que 24 horas.

Para evitar a referida desvantagem, o ácido hialurónico para utilização como um enchimento de efeito prolongado pode ser quimicamente reticulado. Enquanto mantém inalterada a sua biocompatibilidade, o processo de reticulação altera a solubilidade e propriedades reológicas deste polissacárido, tornando-se mais viscoso e assumindo a consistência de um gel. Os géis de ácido hialurónico utilizados como enchimento da pele são "hidrogéis", uma vez que estes são redilatados por 95% do seu peso em água e permanecem estáveis no tecido, sendo reabsorvidos apenas após diversos meses, tornando-os assim vantajosos para utilização em dermocosmética e medicina estética.

Uma vantagem adicional é representada pelo facto de que, ao contrário de outros enchimentos temporários, tal como colagénio, os géis à base de ácido hialurónico são eliminados do tecido por degradação isovolúmica e que, a pouco e pouco, à medida que as moléculas de ácido hialurónico são degradadas e eliminadas, os resíduos podem ligar-se a mais água, com a vantagem de que todo o volume injetado permanece inalterado.

Para completar a imagem sobre a utilização de ácido hialurónico em dermocosmética, deve sublinhar-se que, na sua forma não reticulada, este pode, de um modo vantajoso, ser utilizado como tal e em associação com outros ingredientes ativos, em soluções, géis, cremes ou outras formas para aplicação tópica, com efeitos benéficos óbvios sobre o tónus da pele e turgescência, promovendo a hidratação e, por este motivo, a aparência estética.

Os resultados de vários ensaios clínicos publicados na literatura, sobre vários géis de ácido hialurónico, estão geralmente de acordo: de facto, do ponto de vista do médico e do doente, são observadas melhorias muito satisfatórias com os defeitos de pele e o grau de correção foi avaliado como entre 60 e 90%, 6-9 meses após a primeira injeção (Duranti F. et al. 1998; Olenius M. 1998; Carruthers J. et al., 2005; S. di Bosniak et al., 2004; Narins R. S. et al. 2003; Lindqvist C et al., 2005; Carruthers J. & Carruthers A., 2003) .

Como já mencionado anteriormente, entre os componentes fundamentais da matriz extracelular de tecido conectivo e, assim, a pele, verificou-se que os glicosaminoglicanos (GAG) e ácido hialurónico e as características, propriedades e funções do último foram já exaustivamente descritas e especificadas.

Em ambos os casos, do ponto de vista estrutural, estes são polímeros glicosídicos não ramificados, em que a unidade repetitiva é constituída por dissacáridos, os monómeros da qual são representados por ácidos urónicos, tais como ácido glucurónico, galacturónico ou idurónico e aminoaçucares, tais como N-acetilglucosamina ou N-acetilgalactosamina, diversamente substituídos. A partir do acima, é simples deduzir que, além do HA, existem outras substâncias que podem ser extremamente importantes na preservação e/ou melhoria da funcionalidade da pele e aparência estética. Uma deles é NAG.

Estão disponíveis estudos na literatura e testes, descritos abaixo na secção experimental do presente pedido de patente, mostrando como a NAG exerce uma ação positiva indiscutível sobre as características e funcionalidade da pele de modo a justificar e recomendar a sua utilização vantajosa na dermocosmética e medicina estética. Por este motivo, por exemplo: - A NAG estimula a atividade da enzima hialuronato sintetase nas frações da membrana plasmática dos fibroblastos da pele humana (Mian 1986), suportando e sinergizando assim a utilização de HA exógeno na defesa da pele contra stress externo e processos de envelhecimento naturais e/ou patogénicos com consequente perda de tónus, turgescência, luminosidade e o aparecimento de rugas de várias profundidades. - Num modelo "in vitro" reproduzindo as várias camadas da pele, i. e., modelo de pele MatTek Human Skin EpiDemFT (MakTek Corp., Ashland, MA, EUA), a adição de NAG provocou um aumento muito elevado, significativo e dependente da dose de HA e pró-colagénio 1 (Osborne R et ai., 2006). - Para completar a documentação científica existente e a partir da secção experimental detalhada abaixo, é evidente que, em culturas "in vitro" de fibroblastos e queratinócitos de origem humana, a NAG exerce um efeito claramente dependente da dose sobre a expressão de HA (testado em fibroblastos por si só) , colagénio, elastina e outras proteínas normalmente produzidas na derme, justificando e apoiando ainda a sua utilização em dermocosmética, de acordo com os métodos descritos, exemplificados e reivindicados no presente pedido de patente. 0 documento US-A-3697652 divulga N-acetilglucosamina e sulfato de sódio em preparações farmacêuticas para o tratamento de problemas degenerativos das articulações. 0 documento EP-A-1384482 divulga composições de cuidado da pele compreendendo N-acetilglucosamina e, pelo menos, um de retinoide ou pró-vitamina A. 0 documento EP-A-1075836 divulga a utilização de N-acetilglucosamina como um agente de cuidado da pele para administração oral.

Sumário da Invenção A partir da descrição proporcionada na introdução é claramente óbvio que a utilização de HA exógeno e NAG é certamente eficaz e para ser recomendada em preparações para utilização tópica (dermocosmética) e intradérmica (medicina estética). A presente invenção é baseada no reconhecimento do facto de que a atividade de NAG é potenciada devido à associação entre NAG e um sulfato de metal alcalino dentro de uma gama de razão de peso definida. Por este motivo, uma composição sinérgica, como definida nas reivindicações seguintes, constitui o objetivo da invenção.

De acordo com a invenção, foi realizada e estudada uma composição molecular entre NAG e um sulfato de metal alcalino (aqui a seguir sulfato de sódio anidro (ASS) será utilizado como referência ponderai), em que a razão de massa equivalente entre NAG e ASS pode variar entre 1:0,5 e 1:3, depois utilizando na prática, por razões que irão ser clarificadas na secção experimental, a razão mais vantajosa, i. e., 1:1 (correspondendo em termos ponderais a 75,7% de NAG e 24,3% de ASS). Em relação a este objetivo, deve ser sublinhado que, de modo a evitar confusão, aqui a seguir, a combinação molecular que corresponde à razão experimentalmente mais vantajosa entre massas equivalentes, i. e., 1:1 será conhecida como Condramina (CA) enquanto todas as outras combinações na gama 1:0,5 - 1:3 (obviamente excluindo 1:1), serão identificadas pela abreviatura COMBI. Após um estádio experimental preliminar, revelando a utilização vantajosa de CA em relação a todas as outras preparações COMBI (em qualquer caso conveniente em relação à utilização de NAG em doses correspondentes), as atividades de CA na estimulação da expressão de HA, colagénio, elastina e outras proteínas, em culturas "in vitro" de fibroblastos e queratinócitos, foram testadas e comparadas com as de NAG e sulfato de sódio, consideradas individualmente e em doses/concentrações correspondentes às presentes em CA, utilizadas nos mesmos testes. - Como esperado e como descrito em detalhe na secção experimental, NAG obteve resultados ótimos em culturas de fibroblastos e queratinócitos enquanto que, num modo predizível semelhante, mostrou-se que o sulfato de sódio era totalmente inativo, consequentemente com resultados não significativamente distinguíveis daqueles das culturas de controlo. - De um modo totalmente inesperado e imprevisível, exceto no caso da estimulação da expressão da elastina em culturas de fibroblastos, onde não existe diferença significativa com NAG, a CA deu invariavelmente melhores resultados do que aqueles de NAG nas doses/concentrações correspondentes. Esses efeitos foram consistemente mostrados como sendo dependentes da dose e estatisticamente significativos, levando à conclusão, totalmente imprevisível de antemão, da inegável existência de uma ação sinergística entre NAG e ASS quando exerce a estimulação útil da produção de substâncias úteis para o trofismo cutâneo por aquelas células características do próprio tecido cutâneo, tal como fibroblastos e queratinócitos. - Além disso, visto que as concentrações/doses utilizadas nos testes são absolutamente compatíveis com pedidos práticos potenciais e testes paralelos sobre a potencial citotoxicidade de CA obtiveram resultados bastante tranquilizadores, existe uma possibilidade prática óbvia, de um modo vantajoso, de utilizar CA, em vez de NAG, ambos para utilização oral e para utilização tópica e intradérmica, de um modo preferido, em associação com HA, em dermocosmética e medicina estética, como descrito em detalhe nos exemplos descritos abaixo no presente pedido de patente.

Informação sobre os ingredientes ativos utilizados nas composições descritas e reivindicadas no presente pedido de patente Ácido hialurónico (HA) utilizado como tal ou como um sal de sódio: - CAS N2 (ácido): 9004-61-9 - CAS N2 (sal de sódio): 9067-32-7 - Origem: biofermentação - Peso molecular: compreendido entre 0,5 e 3xl05 Da - Nivel de reticulação (quando utilizado): compreendido entre 0,5 e 5%

As concentrações de HA descritas e reivindicadas no presente pedido de patente não excedem 4% e estão, de um modo preferido, compreendidas na gama de 1-3%.

Combinação NAG-ASS (COMBI): COMBI é composto por NAG e ASS em razões de peso equivalentes variando entre 1:0,5 e 1:3 (excluindo a razão de 1:1 já identificada como Condramina (CA)), correspondendo a razões ponderais oscilando entre 86,17% e 50,93% para NAG e entre 13,83% e 49,07% para ASS:

Condramina (CAS):

A CA é composta por NAG e ASS numa razão de peso equivalente igual a 1:1, correspondendo em termos ponderais a 75,7% CA e 24,3% ASS COMBI e CA são ambos constituídos por: a. NAG: - Nome: N-acetil-2-amino-2-desoxiglicose - CAS N2: 7512-17-6 - Peso molecular: 221,19 - Fórmula empírica: C8H15N06 b. ASS: - CAS N2: 7757-82-6 - Peso molecular: 142,05

- Fórmula empírica: Na204S

As concentrações/doses de CA utilizadas dentro do âmbito da invenção estão, de um modo preferido, compreendidas entre 0,05% e 2,5% em peso e, de um modo mais preferido, entre 0,1 e 0,5% em relação às formas tópica e intradérmica enquanto, se utilizada para administração oral, a CA pode ser tomada em doses diárias, expressa em termos de base de glucosamina, compreendida entre 100 e 1000 e, de um modo preferido, 250-750 mg, numa ou mais administrações, dependendo da dose e forma farmacêutica utilizada.

Secção experimental 0 efeito sinergístico obtido pela composição de acordo com a invenção foi verificado através de uma série de testes "in vitro", avaliando e comparando os resultados experimentais em relação à Condramina (CA) com aqueles dos seus componentes, i. e., N-acetilglucosamina (NAG) e sulfato de sódio anidro (ASS) considerados individualmente, a concentrações consistentes com a razão entre os seus pesos equivalentes em CA, que se mostrou serem os mais convenientes, i. e., 1:1. A referida razão foi selecionada com base nos resultados de um teste preliminar onde a avaliação foi focada no efeito experimental da variação da razão reciproca de NAG e ASS em COMBI. Métodos

Os testes selecionados foram: 1. Avaliação in vitro da estimulação da sintese de ácido hialurónico (HA) por CA, NAG e ASS em culturas de fibroblastos humanos (ver também: Sayo et al., 2004) 0 teste foi conduzido em duas etapas, i. e.: - etapa A: na qual foi avaliada a estimulação da expressão de HA por COMBI enquanto se manteve a concentração constante e variou as quantidades reciprocas dos seus componentes. A concentração utilizada foi selecionada de modo a permitir a comparação com os resultados derivados da etapa B; - etapa B: na qual foi avaliado o efeito de CA sobre a expressão de HA através da variação da sua concentração e em comparação com doses consistentes com os seus componentes . Lógica do teste

Uma vez que o teor de HA da pele diminui com a idade, dando origem ao envelhecimento da pele, com o consequente aparecimento de rugas e perda de elasticidade, o âmbito do teste foi a avaliação e comparação da potencial estimulação, exercida pelas substâncias de teste, sobre a expressão de HA em culturas "in vitro" de células derivadas da pele, tal como fibroblastos. 0 teste em questão, apesar de conduzido "in vitro", pode ser considerado como sendo preditivo dos efeitos da utilização das mesmas substâncias "in vivo".

Modelo celular

Foram utilizados fibroblastos humanos, Detroit 551 ATCC CCL III de LGC Promochem (Milão, Itália).

Substâncias de teste e concentrações

As substâncias testadas para o seu efeito sobre a expressão de HA em culturas de fibroblastos humanos foram:

Etapa A: - COMBI: a uma concentração constante de 1,98 mg/mL com razões NAG para ASS, em termos de peso equivalente igual a 1:0,4; 1:0,5; 1:3 e 1:3.5 - CA: a uma concentração de 1,98 mg/mL com uma razão de peso equivalente, entre NAG e ASS, igual a 1:1

Etapa B: - CA: em que a razão entre os componentes, em termos de peso equivalente, foi mantida constante e igual a 1:1 e as concentrações testadas são 0-66; 1,32; 1,98; 2,64 e

3,3 mg/mL - NAG a concentrações de 0,5, 1,0, 1,5, 2,0 e 2,5, que correspondem ao teor de NAG na CA nas concentrações e na razão de peso equivalente (1:1) utilizadas no mesmo teste - ASS a concentrações de 0,16, 0,32, 0,48, 0,64 e 0,80 mg/mL, que correspondem ao teor de ASS na CA nas concentrações e na razão de peso equivalente (1:1) utilizadas no mesmo teste

Preparação de culturas celulares

Os fibroblastos humanos cresceram em meio de crescimento adequado (meio essencial minimo de Eagle) suplementado com 10% de soro bovino fetal (FCS), 1 mM de piruvato de sódio, 2 mM de glutamina, aminoácidos não essenciais e 50 yg/mL de gentamicina. As células confluentes foram plaqueadas em placas de 24 poços, 5xl04 células/poço, utilizando o mesmo meio. Na confluência, as células foram pré-expostas a meio contendo 5% de soro, antes da adição das substâncias de teste nas concentrações desejadas. Após 48 horas, o sobrenadante foi removido e utilizado para a determinação dos parâmetros de interesse. O teste foi conduzido em duplicado e foram utilizadas culturas celulares não tratadas como controlos.

Ensaio de HA

Utilizando um kit disponível comercialmente, o HA foi ensaiado (doseado) por meio de um teste imunoenzimático (EIA, Corgenix) . A síntese de novo de HA foi avaliada no meio de cultura após o tratamento com as substâncias de teste, de acordo com o protocolo proporcionado com o teste e contra a curva de calibração obtida utilizando o padrão de HA contido no kit.

Avaliação dos resultados Etapa A: - a avaliação dos efeitos de COMBI e CA sobre culturas de fibroblastos, a várias razões recíprocas dos seus componentes dentro de uma concentração constante mantida, foi expressa como o aumento absoluto e percentual ou diminuição da expressão de HA em relação à correspondente cultura de controlo após 48 horas de incubação e por comparação com os efeitos exercidos por NAG nas concentrações que correspondem exata ou aproximadamente aquelas presentes em CA e em COMBI, a várias razões recíprocas entre os seus componentes de NAG e ASS.

Etapa B: - a avaliação dos efeitos das substâncias testadas, nas várias concentrações, sobre as culturas de fibroblastos foi expressa como o aumento absoluto e percentual ou diminuição da expressão de HA, em relação à correspondente cultura de controlo, após 48 horas de incubação. A diferença do aumento ou diminuição percentual dos efeitos exercidos por CA e NAG, a correspondentes concentrações foi depois calculado, com avaliação da sua potência significância por meio do teste "t" de Student. 2. Avaliação in vitro da estimulação da sintese de colagénio e elastina por CA, NAG e ASS em culturas de fibroblastos humanos (ver também: Booth et al., 1980; Fenwick et al., 2001) Lógica do teste 0 âmbito do teste foi a avaliação e a comparação da potencial estimulação exercida pelas substâncias de teste sobre a expressão de colagénio e elastina em culturas "in vitro" de células derivadas de pele, tal como fibroblastos. 0 teste em questão, apesar de conduzido "in vitro", pode ser considerado como sendo preditivo dos efeitos de utilização das mesmas substâncias "in vivo".

Modelo celular

Foram utilizados fibroblastos humanos, Detroit 551 ATCC CCL III de LGC Promochem (Milão, Itália).

Substâncias de teste e concentrações

As substâncias e concentrações testadas foram as mesmas que aquelas já descritas para a etapa B do teste sobre a estimulação de expressão de HA, i. e.:

- CA: 0,66, 1,32, 1,98, 2,64 e 3,3 mg/mL

- NAG: 0,5, 1,0, 1,5, 2,0 e 2,5 mg/mL

- ASS: 0,16,0,32, 0,48, 0,64 e 0,80 mg/mL

Preparação de culturas celulares

As células foram plaqueadas em placas de 96 poços, 2500 células/poço durante 24 horas em meio de crescimento de células (Meio Essencial Mínimo de Dulbecco, DMEM) + 10% de soro bovino fetal (FCS). Foi adicionado meio de cultura fresco, enriquecido com apenas 5% de FCS e contendo as substâncias a serem testadas, de modo a atingir as concentrações finais desejadas. As amostras foram dissolvidas diretamente no meio de cultura. Cada amostra foi testada em duplicado e as experiências foram repetidas duas vezes. Os parâmetros de interesse foram determinados após 24 horas em placas separadas. As culturas de células não tratadas foram utilizadas como controlos.

Ensaio de colagénio

Foi utilizado um kit comercialmente disponível (Sircol™, biodye science) que utiliza a capacidade da coloração Sirius Red para interagir com as cadeias laterais básicas dos aminoácidos presentes no próprio colagénio, para ensaios de colagénio. A síntese de novo de colagénio foi avaliada no meio de cultura após tratamento com as substâncias de teste, seguindo o protocolo proporcionado com o kit e utilizando a curva de calibração obtida empregando o padrão de colagénio contido por sua vez no kit.

Ensaio de elastina A elastina foi ensaiada utilizando um teste comercialmente disponível (Fastin™, biodye science) . 0 ensaio é baseado na interação de 5,10,15,20-tetrafenil-21,23-porfirina com moléculas de elastina. A síntese de novo da elastina foi avaliada no meio de cultura após o tratamento com as substâncias de teste, depois do protocolo proporcionado com o teste e utilizando a curva de calibração obtida empregando o padrão de elastina contido no próprio kit.

Avaliação dos resultados A avaliação dos efeitos das substâncias testadas, nas várias concentrações, sobre as culturas de fibroblastos, foi expressa como o aumento ou diminuição absoluta e percentual da expressão de colagénio e elastina, em relação à cultura de controlo correspondente, após 24 horas de incubação.

Foi calculada a diferença do aumento ou diminuição percentual dos efeitos exercidos por CA e NAG, a concentrações correspondentes, com consequente avaliação da sua potencial significância estatística por meio do teste "t" de Student. 3. Avaliação "in vitro" da estimulação de sintese proteica por CA e NAG em culturas de fibroblastos e queratinócitos humanos: (ver também: Lowry et al., 1951; Creighton et al., 1984; Sengupta et al., 1993)

Informação preliminar

Os fibroblastos e queratinócitos, presentes na derme e epiderme, além de estarem envolvidos na síntese de colagénio, elastina e HA, estão também envolvidos na expressão de várias espécies de proteínas incluindo, por exemplo, queratina por queratinócitos e as denominadas proteínas de ligação e nucleares, às quais estão ligadas vários tipos de GAG para formar proteoglicanos, os quais são, por sua vez, componentes fundamentais da matriz celular. 0 nível de viabilidade e a eficácia dessas células, na presença ou ausência de agentes cuja ação benéfica em relação à pele se pretende verificar, pode ser avaliado e deduzido a partir da sua capacidade de síntese de proteínas.

Modelos celulares

Foi utilizado o seguinte:

- Fibroblastos humanos, Detroit 551 ATCC CCL III de LGC

Promochem (Milão, Itália); - Cultura primária de queratinócitos humanos: HEKA, Cascade

Biologies, cat. 005-5C.

Substâncias de teste e concentrações

As substâncias e concentrações testadas são aquelas referidas abaixo (nos fibroblastos e nos queratinócitos):

- CA: 0,13, 0,66, 1,32, e 2,64 mg/mL

- NAG: 0,1, 0,5, 1,0, e 2,0 mg/mL Lógica do teste

Com base na informação mencionada anteriormente relativa a indicadores de eficácia de células presentes na pele, o âmbito do teste foi a avaliação e comparação da potencial estimulação, exercida pelas substâncias de teste, sobre a expressão proteica em culturas "in vitro" de fibroblastos e queratinócitos. 0 teste em questão, apesar de conduzido "in vitro", pode ser considerado como preditivo dos efeitos da utilização das mesmas substâncias "in vivo".

Preparação de culturas celulares 0 método é idêntico ao já descrito para o colagénio e elastina com a diferença de que, após a adição das substâncias de teste ao meio de cultura, o meio foi substituído diariamente durante três dias. Cada amostra foi testada em duplicado e as experiências foram repetidas duas vezes. 0 parâmetro de interesse, i. e., síntese proteica, foi avaliado às 24, 48 e 72 horas em placas separadas. As culturas celulares não tratadas foram utilizadas como controlos.

Ensaio de proteína A proteína foi ensaiada utilizando o método de Lowry [Lowry et ai., 1951] consistindo de uma reação de redução de Biuret que contempla a utilização de reagente de Folin-Ciocalteau como cromóforo, com uma alteração de cor de amarelo para azul e medição espetrof otométrica a 750 nm [Creighton et ai., 1984; Sengupta et ai., 1993]. O teor de proteína das culturas em questão foi obtido a partir da comparação das suas densidades óticas com uma curva de titulação preparada utilizando albumina como um padrão de proteína.

Avaliação dos resultados A avaliação do efeito das substâncias testadas, nas várias concentrações e tempos, sobre as culturas dos fibroblastos e dos queratinócitos, foi expressa em termos absolutos (produção de proteína expressa em mg/mL) e como aumento ou diminuição percentual em relação a culturas de controlo.

Foi depois calculada a diferença do aumento ou diminuição percentual dos efeitos exercidos por CA e NAG, ao longo de vários dias e nas concentrações correspondentes, com avaliação da sua potencial significância estatística por meio do teste "t" de Student. 4. Avaliação "in vitro" do potencial citotóxico de substâncias para utilização tópica cosmética e intradérmica: (ver também: Mossman, 1993) Lógica do teste

As características particulares de substâncias a serem utilizadas para utilização tópica ou intradérmica em cosméticos devem ser absolutamente livres de quaisquer efeitos citotóxicos dentro da gama de dose/concentração para a sua aplicação prática pretendida.

Existem testes "in vitro" apropriados, conduzidos sobre células derivadas de tecido da pele, tais como fibroblastos e queratinócitos, para a predição da potencial citotoxicidade de substâncias de teste "in vivo".

Para este objetivo, foi selecionado o teste de viabilidade celular utilizando MTT (brometo de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il] -2,5-difeniltetrazólio) [Mossman 1993] um reagente colorimétrico, por meio do qual é possível distinguir entre células vivas, danificadas ou mortas, sendo, por este motivo, preditivo da segurança da utilização de substâncias de teste, mesmo "in vivo" .

Modelos celulares

Foram utilizados os seguintes:

- fibroblastos humanos, Detroit 551 ATCC CCL III de LGC

Promochem (Milão, Itália); - cultura primária de queratinócitos humanos (HEKA), Cascade

Biologies, cat. - 005-5c.

Substâncias de teste e concentrações

Uma vez que na composição que forma o objeto da presente invenção NAG e ASS nunca são reivindicados para utilização individual, mas sempre em associação na composição de CA, a única substância testada para o seu potencial efeito citotóxico foi CA, em concentrações tais de modo a ser preditiva e aplicável às utilizadas no teste de atividade "in vitro" sobre as culturas de fibroblastos e queratinócitos anteriormente descritas.

No estudo em questão, a CA foi previamente dissolvida e colocada em contacto com as culturas celulares selecionadas de modo a alcançar diretamente as concentrações desejadas, i. e.: 0,026, 0,053, 0,106, 0,211, 0,409, 0,818, 1,65 e 3,30 mg/mL.

Foram utilizadas amostras análogas de fibroblastos e/ou queratinócitos humanos não tratados como controlos negativos.

As amostras análogas de fibroblastos e/ou queratinócitos humanos foram tratadas com um tensioativo de atividade conhecida (SDS), dissolvidas em meio de cultura a concentrações compreendidas entre 0,05 e l,6xl0~3 mg/mL e utilizadas como um controlo positivo. A exposição foi durante um período de 24 horas, no fim da qual, foi conduzido o teste de citotoxicidade.

Descrição do teste de citotoxicidade utilizando MTT

Como anteriormente mencionado, o reagente chave é MTT, uma substância de cor amarela em solução aquosa, o qual, quando as desidrogenasses mitocondriais presentes em células viáveis atuam sobre este, é transformado em cristais roxos, insolúveis em água, mas solúveis em isopropanol acidificado. A absorvância da solução roxa resultante a 540 nm é utilizada como um indicador do nível de citotoxicidade das substâncias em teste.

Em termos operacionais, o reagente chave é preparado por adição de 15 mg de MTT a 30 mL de meio de cultura. À parte, após 24 horas em contacto com a substância de teste e/ou SDS, os fibroblastos ou queratinócitos são lavados com 400 pL de solução de lavagem (Solução Salina Tamponada com Fosfato de Dulbecco, DPBS) e, após remoção da solução, são adicionados 200 pL de meio de MTT e as amostras de células incubadas durante 4 horas, a 37 °C. Na conclusão do período de incubação, o meio de MTT é removido e são adicionados 400 pL de solução solubilizante de MTT (10% de Triton X-100 + 0,1 N de HC1 em isopropanol anidro) . As placas são agitadas durante 20-30 minutos até ser formada uma solução homogénea, a absorvância da qual é depois lida a 540 nm com uma leitura de controlo a 670 nm.

Os resultados são expressos como:

Avaliação dos resultados

Os dados de citotoxicidade, obtidos utilizando o teste de MTT, são representados graficamente num gráfico em função da concentração do produto em teste, obtendo-se assim uma curva dose-resposta, permitindo a determinação de: - a curva de regressão teórica; - o valor de IC50 teórica ou a concentração resultante numa redução de 50% na viabilidade celular em relação àquela de células não tratadas. O potencial irritante de um composto está relacionado com o valor de IC50 de acordo com os seguintes critérios de avaliação: - IC50 <0,5: efeito citotóxico/irritante forte - IC50 entre 0,5 e 1,5: efeito citotóxico/irritante moderado - IC50 >1,5: ausência de qualquer efeito citotóxico/irritante

Resultados 1. Estimulação da sintese de HA por CA, NAG e ASS em culturas de fibroblastos humanos

Etapa A: A partir dos resultados apresentados na Tabela 3, Etapa A, é óbvio que existe um claro sinergismo entre NAG e ASS dependendo das razões, em termos de peso equivalente, variando entre 1:0,5 e 1:3 com a razão mais favoravelmente verificável sendo 1:1. Para combinações que se situam fora da referida gama favorável, não é detetável sinergismo, uma vez que o efeito da combinação entre NAG e ASS nessas condições é ainda menos do que aquele de NAG por si só e a concentrações correspondendo àquelas presentes na própria combinação. De facto, pode ser observado como para uma razão NAG/ASS igual a 1:0,4 (o mais favorável para NAG), o aumento na expressão de HA é aprox. 65%, marcadamente inferior aquele para NAG na mesma concentração, o qual é certamente maior do que 75%. Analogamente, para uma razão NAG/ASS igual a 1:3,5 (o mais favorável para ASS), o aumento é aprox. 50% comparado com aquele de NAG por si só, o qual se aproxima de 60% na mesma concentração.

Etapa B: A partir dos resultados apresentados nas Tabelas 1 a 3, Etapa B, é possível retirar as seguintes conclusões: - O ASS por si só, em doses crescentes correspondentes àquelas presentes em CA, testado na mesma experiência, não exerce estimulação nem inibição e, de facto, em todas as concentrações testadas, as diferenças em relação à expressão de HA da cultura de base são irrelevantes, em valores absolutos e percentuais. Em confirmação do acima, a partir do exame dos dados experimentais, não é possível identificar qualquer correlação entre a concentração de ASS e expressão de HA, uma vez que o coeficiente de correlação associado com a regressão correspondente, calculada utilizando o método dos mínimos quadrados, não é estatisticamente significativo (r=0,345 com DoF=4).

- Diferentemente dos resultados de Sayo T et ai., 2004 para NAG, CA e NAG, nas concentrações testadas absolutamente consistentes como expressão da dosagem correspondente de NAG, mostram ambos uma clara estimulação da secreção de HA em culturas de fibroblastos humanos derivados da pele. Em ambos os casos, o referido efeito é muito evidente, com uma diferença já a aparecer a 0,66 mg/mL para CA (correspondendo a 0,5 mg/mL de NAG) enquanto é retardada para 1 mg/mL no caso de NAG. É também observado que, em ambos os casos, a intensidade do efeito é dependente da dose (r=0, 973 para NAG e 0, 939 para CA, ambos estatisticamente significativos para os graus de liberdade das correlações correspondentes) e que a expressão de HA aparece, em todas as concentrações, mais marcada no caso de estimulação por CA com um aumento igual a aprox. 99%, a 1,98 mg/mL (correspondendo a 1,5 mg/mL de NAG), um aumento apenas obtido por NAG, como tal, na dose mais elevada testada, i. e., 2,5 mg/mL. - Fazendo referência à Tabela 4, para avaliar a diferença na estimulação da expressão de HA por CA e NAG, a diferença foi calculada entre aumentos percentuais, nas doses correspondentes de ambas as substâncias de teste e foi confirmado que, em todas as concentrações, o CA exerce uma maior percentagem de estimulação que a NAG. Ao aplicar o teste "t" de Student às diferenças entre os aumentos percentuais mencionados acima, verifica-se que o valor para "t" é altamente significativo, levando à conclusão altamente imprevisível e surpreendente de que existe um claro efeito sinergístico entre ASS e NAG uma vez que, como já verificado, o ASS por si só não tem efeito sobre os fibroblastos H, enquanto por outro lado, existe uma clara ação estimuladora se associado com NAG na composição de CA, tornando a utilização funcional e de formulação em vez de NAG, se utilizado por si só, clara e inesperadamente vantajosa. 2. Estimulação da síntese de colagénio e elastina por CA, NAG e ASS em culturas de fibroblastos humanos A. Colagénio A partir dos resultados apresentados nas Tabelas 5 -7 é possível retirar as seguintes conclusões: - Novamente neste caso, o ASS, considerado individualmente dentro da gama de concentração consistente com aquela utilizada para outras 2 substâncias de teste, i. e., CA e NAG, não exerce qualquer tipo de estimulação ou inibição sobre a expressão de colagénio nas culturas de fibroblastos derivados de pele humana. Novamente neste caso, para ASS, não é possível identificar qualquer tipo de relação de concentração/efeito, uma vez que o coeficiente de correlação da regressão entre a sua concentração e expressão de colagénio (r=0,298) não é estatisticamente significativa. - Ambos CA e NAG, nas concentrações testadas e totalmente consistentes como expressão da mesma dose de NAG, exercem um claro efeito de estimulação sobre a secreção de colagénio nas culturas de fibroblastos derivados de pele humana. Em ambos os casos, a intensidade deste efeito é muito marcada e dependente de dose, de modo que para ambos, é possível calcular uma concentração/efeito de regressão caracterizados por um coeficiente de correlação elevado e estatisticamente significativo (r=0,927 para estimulação por NAG e 0,929 para estimulação por CA). - A partir dos dados na Tabela 11, apresentando os aumentos percentuais em relação ao controlo de base, para a expressão de colagénio estimulada por CA e NAG, novamente em niveis comparáveis, verifica-se que o efeito de estimulação percentual de CA é superior à da NAG em todas as concentrações testadas. Ao aplicar o teste "t" de Student às diferenças entre os aumentos percentuais mencionados acima, verifica-se que o valor determinado para "t" é altamente significativo, destacando assim novamente, neste caso, o efeito sinérgico e anteriormente inesperado que existe entre ASS e NAG em CA, confirmando assim a utilização funcional e de formulação vantajosa do último em lugar do NAG por si só. B. Elastina A partir dos resultados apresentados nas Tabelas 8-10 é possível retirar as seguintes conclusões: - Como anteriormente verificado no caso dos testes da expressão de colagénio e HA, ASS, a concentrações consistentes com as das outras duas substâncias de teste, i. e., CA e NAG, é incapaz de exercer qualquer efeito, estimulador ou inibidor, sobre a expressão de elastina por fibroblastos humanos derivados da pele.

Por outro lado, ambos CA e NAG, nas concentrações testadas e consistentes um com o outro, exercem um efeito estimulador bastante marcado que, em ambos os casos, é já evidente na concentração mais baixa testada, i. e., 0,5 mg/mL para NAG e 0,66 mg/mL para CA (correspondendo a 0,5 mg/mL de NAG) aumentando de um modo dependente da dose até exceder 300% em relação ao controlo de base, na concentração máxima, i. e., 2,5 mg/mL de NAG e 2,64 mg/mL de CA (correspondendo a 2,5 mg/mL NAG) . - A partir dos dados apresentados na Tabela 12, em que os resultados do teste são expressos como aumento percentual em relação ao controlo de base e, contrariamente à imagem que se verifica para os testes relacionados com a expressão de HA e colagénio, neste caso, não é possível identificar qualquer diferença entre as ações estimuladoras exercidas por CA e NAG. Este evidência experimental é confirmada pelo facto de que o teste "t" de Student, aplicado às diferenças entre os aumentos percentuais em relação aos dois ingredientes ativos em teste, não mostra significância estatística. Esta tendência, a qual não confirma aquela já observada em termos dos efeitos sobre a expressão de HA e colagénio, onde a estimulação exercida por CA é sempre superior, é mais provável que seja atribuída à elevada intensidade da própria estimulação, a qual provoca uma expressão de elastina aumentada igual a aprox. 200% já na concentração mais baixa, i. e., correspondendo a 0,5 mg/mL de NAG. 3. Estimulação da sintese de proteínas por CA e NAG em cultura de fibroblastos e queratinócitos humanos A. Queratinócitos A partir dos resultados apresentados na Tabela 13 é possível retirar as seguintes conclusões: - Para ambas NAG e CA, é observada estimulação da expressão de proteínas nas concentrações mais elevadas, i. e., 1 e 2 mg/mL, após apenas 24 horas, também com consideráveis aumentos percentuais i. e., superiores a 50% para NAG, na dose mais elevada e quase 70% na concentração correspondendo a essa para CA. - Como uma consequência, o culminar da ação de estimulação por ambas as substâncias de teste é observado após 48 horas quando, contrariamente às observações às 24 horas, já nas concentrações mais baixas, i. e., 0,1 e 0,5 mg/mL de NAG e 0,66 de CA, a expressão de proteína aumentada por queratinócitos assume um valor positivo de cerca de 20% para NAG e atinge mesmo 30-40% para CA. Contudo, é obtida uma imagem final quando ambas as substâncias de teste mostram uma clara estimulação da expressão de proteína sobre queratinócitos em todas as concentrações testadas e de um modo dependente da dose, como demonstrado pela significância estatística dos coeficientes de correlação associados com a concentração/efeito de regressão, igual a 0,726 para NAG e 0,909 para CA. - Após 72 horas, ainda existe ação estimuladora residual nas duas concentrações mais elevadas, mas parece óbvio que este efeito é apenas a cauda do pico atingido às 48 horas e, como tal, não é significativo. - Em relação à comparação das atividades entre CA e NAG, as diferenças entre os aumentos percentuais na estimulação exercida pelas duas substâncias de teste foram avaliadas utilizando o teste "t" de Student, já realizado para os resultados experimentais dos outros testes anteriormente examinados (ver estimulação da expressão de HA, colagénio e elastina) .

Particularmente, através do exame e comparação das ações exercidas pelas duas substâncias às 48 horas, i. e., no pico do seu efeito estimulador (a referida comparação às 24 e 72 horas tem pouca significância, uma vez que é temporariamente prematuro ou tardio) é claro que a CA exerce uma ação estimuladora marcadamente superior sobre a expressão de proteína em querat inócitos do que a de NAG nas doses correspondentes. Estes resultados experimentais são ainda confirmados pelo valor de "t" de Student, aplicado às diferenças na estimulação percentual das duas substâncias de teste, o que é altamente significativo.

Assim, uma vez mais, o efeito sinérgico inesperado e imprevisível entre ASS e NAG é provado, tornando a utilização funcional e de formulação de CA certamente preferida e vantajosa em relação a NAG em concentrações e/ou dosagens equivalente.

Fibroblastos A partir dos resultados apresentados na Tabela 14 é possível retirar as seguintes conclusões: - Novamente, em culturas de fibroblastos humanos derivados de pele, é possível observar uma clara estimulação de secreção de proteína por NAG e CA. A referida estimulação atinge o seu pico após 24 horas, permanecendo indistinguível daquela expressa naturalmente por células não tratadas às 48 e 72 horas. 0 aparecimento do efeito estimulador é já evidente a 0,5 mg/mL para NAG e a 0,6 6 mg/mL para CA, aumentando de um modo dependente da dose (coeficiente de correlação significativo para a concentração/efeito de regressão em ambos os casos, i. e., r=0,844 para NAG e 0,845 para CA) até à concentração máxima testada, i. e., 2 mg/mL para NAG e 2,64 mg/mL para CA.

Como já destacado anteriormente, a estimulação exercida por ambas as substâncias de teste é muito marcada, atingindo e excedendo, nas concentrações máximas testadas, um aumento de 50% em relação à expressão de proteína das culturas de controlo e, por este motivo, confirmando o efeito altamente positivo exercido por ambas as substâncias ativas sobre as funções específicas de células de origem cutânea, tais como fibroblastos e queratinócitos . - No que se refere à comparação entre CA e NAG, novamente, também neste caso foi avaliada uma potencial diferença na atividade utilizando o teste "t" de Student, aplicado às diferenças entre os aumentos percentuais na estimulação exercida pelas duas substâncias de teste, nas concentrações correspondentes. A referida avaliação foi realizada sob os valores medido às 24 horas, uma vez que estes são altamente significativos, proporcionado assim confirmação estatística da imagem que já foi verificada para a comparação em relação à expressão de elastina, colagénio e HA por células derivadas da pele, i. e., mostra-se que a CA, devido ao sinergismo imprevisto entre ASS e NAG, dos quais é composta, é mais ativa que a própria NAG e, de um modo estatisticamente significativo, torna assim a utilização funcional e de formulação mais vantajosa.

4. Avaliação "in vitro" do potencial efeito citotóxico de CA utilizando o teste de MTT A. Sobre fibroblastos humanos derivados da pele

Como já explicado na secção descritiva, a inibição da viabilidade celular foi calculada sobre uma série de culturas de fibroblastos, na presença de um conjunto de concentrações estabelecidas para CA e por aplicação da fórmula (i) , em que "OD540 de células tratadas" representa a absorvância a 540 nm das culturas contendo CA e "OD540 de células não tratadas" do controlo negativo (branco). A eficácia do teste e avaliada sobre uma cultura contendo um tensioativo altamente citotóxico, i. e., dodecilsulfato de sódio (SDS), a uma concentração (0,05 mg/mL) na qual a absorvância a 540 nm deve ser praticamente zero, sendo completamente inibido o crescimento bacteriano:

Os resultados obtidos são apresentados na tabela seguinte:

Teste de MTT em fibroblastos na presença de CA - Resultados

A partir dos dados tabulados, podem ser retiradas as seguintes conclusões: - A eficácia do teste é confirmada pelo facto de que, após exposição dos fibroblastos humanos a 0,5 mg/mL de SDS, foi verificada mortalidade celular de aprox. 100% (96, 05%) . - Como já referido, o parâmetro que permite a avaliação do potencial irritante de uma substância a ser utilizada para aplicação tópica ou como um enchimento intradérmico, é baseado na determinação do IC50, calculado a partir da correlação entre a concentração e os valores de inibição de viabilidade celular correspondentes, assumindo os seguintes critérios de avaliação: o IC5o = 0,5 mg/mL: efeito citotóxico/irritante forte o IC50 entre 0,5 e 1,5 mg/mL: efeito citotóxico/irritante moderado o IC50 >1,5 mg/mL: sem efeito citotóxico/irritante

No caso de CA, uma vez que na concentração máxima testada, i. e., 3,30 mg/mL, a inibição percentual de viabilidade celular não atinge sequer os 20% (18,44%), é obvio que o IC50 é muito menos do que 1,5 mg/mL e, por esse motivo, CA, de acordo com os dados deduzidos do modelo preditivo "in vitro", pode ser considerada desprovida de qualquer potencial citotóxico em relação aos fibroblastos humanos derivados da pele e, como tal, passível de ser livremente utilizada, para utilização tópica e como um enchimento intradérmico. B. Sobre queratinócitos:

No caso de querat inócitos, para os quais foi utilizado o mesmo teste de MTT e os mesmos critérios de avaliação, deduzíveis a partir do valor de IC50, os resultados obtidos são apresentados na seguinte tabela:

Teste de MTT em queratinócitos na presença de CA -Resultados

(Continuação)

A partir dos dados tabulados, podem ser retiradas as seguintes conclusões: - Novamente neste caso, a eficácia do teste é confirmada pelo facto de que a mortalidade da cultura de queratinócitos, exposta a 0,5 mg/mL de SDS, é praticamente 100% (94,28%) . - Em relação às culturas de queratinócitos; uma vez que, novamente também neste caso, na concentração máxima de CA testada (3,30 mg/mL), a % de inibição da viabilidade celular não atinge os 20% e, assim, o IC50 é muito menor do que 1,5 mg/mL, a CA pode ser considerada completamente desprovida de efeitos citotóxicos, também em relação as queratinócitos humanos.

Conclusões

Os resultados experimentais resumidos acima destacam, pelo menos, duas considerações fundamentais, i. e., em primeiro lugar o efeito surpreendente associado à combinação entre NAG e ASS (como CA e como COMBI), imprevisível e inesperadamente vantajoso em relação a NAG em doses consistentes mas sem o suporte sinérgico de ASS (ASS por si só não tem efeito) e, em segundo lugar, o efeito sinérgico entre os componentes que atingem o seu máximo, no caso de CA, a uma razão, expressa em termos de peso equivalente, igual a 1:1, diminuindo progressivamente em valores de ambos os lados deste valor central.

Se ao acima for adicionado a completa ausência de quaisquer potenciais efeitos citotóxicos da composição de acordo com a invenção (sendo bem conhecida a ausência de toxicidade dos seus componentes, se administrada oralmente), pode concluir-se que a sua potencial utilização em associação com outros ingredientes ativos, tal como, por exemplo, HA, de um modo preferido, em doses/concentrações e de acordo com as formulações descritas e reivindicadas no presente pedido de patente, resulta em utilização vantajosa e segura, ambos para administração oral, por exemplo, em formulações de suplemento alimentar e para aplicação tópica ou como um enchimento intradérmico no restauro do tónus e vigor da pele.

Tabelas

Tabela 1: expressão de HA em culturas de fibroblastos na presença de ASS

Tabela 2: expressão de HA em culturas de fibroblastos na presença de NAG

Tabela 3 - Etapa A: Expressão de HA em culturas de fibroblastos na presença de combinações de NAG/ASS a concentração constante e razões NAG para ASS variáveis

Tabela 3 - Etapa B: Expressão de HA em culturas

de fibroblastos na presença concentrações variáveis de CA

Tabela 4: Expressão de HA em culturas de fibroblastos:

diferença em % entre os estímulos de CA e NAG

(Continuação)

Tabela 5: Expressão de colagénio em culturas de

fibroblastos na presença de ASS

Tabela 6: Expressão de colagénio em culturas de

fibroblastos na presença de NAG

Tabela 7: Expressão de colagénio em culturas de

fibroblastos na presença de concentrações variáveis de CA

Tabela 8: Expressão de elastina em culturas de fibroblastos na presença de ASS

Tabela 9: Expressão de elastina em culturas de fibroblastos na presença de NAG

Tabela 10: Expressão de elastina em culturas de

fibroblastos na presença de concentrações variáveis de CA

(Continuação)

Tabela 11: Expressão de colagénio em culturas de

fibroblastos: diferença em % entre os estímulos de CA e NAG

Tabela 12: Expressão de elastina em culturas de

f ibroblastos: diferença em % entre os estímulos de CA e NAG

Exemplos A. Soluções e/ou lipogéis contendo CA e HA não reticulado a serem utilizados para aplicação tópica

As formulações referidas abaixo, juntamente com a descrição dos procedimentos de operação utilizados nos exemplos 1 e 2, ilustram as possíveis aplicações práticas da presente invenção e, uma vez que estas são puramente a título exemplificativo, não devem ser consideradas limitativas, de qualquer modo, da própria invenção. É feita particular referência aos excipientes, os quais podem ser utilizados em alternativa aos mencionados de modo explícito na presente invenção, de acordo com os requisitos tecnológicos de formulação e os quais, em qualquer caso, podem ser selecionados de uma vasta gama de produtos disponíveis no mercado e bem conhecidos pelos especialistas no setor farmacêutico e, assim, sem originalidade inventiva.

Em relação à dosagem dos ingredientes ativos, as amostras descritas referem quantidades puramente indicativas, qualquer variação que não resulte em modificação substancial dos métodos de preparação ilustrados.

De um modo mais preciso, o HA, expresso como sal de sódio, pode ser, de um modo vantajoso, utilizado em concentrações não superiores a 4% (de um modo preferido, 1-3%), enquanto a CA pode variar entre 0,05 e 2,5% (de um modo preferido, 0,1-0,5%), de acordo com as concentrações utilizadas nos testes "in vitro", descritos na secção experimental e com a quantidade contida nas reivindicações do presente pedido de patente.

Exemplo 1: Solução de monodose para aplicação tópica A formulação referida na Tabela 1 refere-se a ingredientes ativos e excipientes (com descrição da função tecnológica correspondente) que podem ser utilizados na preparação de uma solução para aplicação tópica, para serem automaticamente loteados em recipientes descartáveis de volume definido. 0 material utilizado para os recipientes, por exemplo, polietileno, deve ser compatível com os componentes da formulação e com padrões atuais para materiais para utilização no campo da cosmética ou para um dispositivo médico.

Um exemplo de preparação da formulação em questão a ser loteada em recipientes de polietileno de monodose é aqui a seguir descrito: - pesar separadamente os componentes da formulação de acordo com as indicações nas instruções do fabricante; - num dispositivo de dissolução, equipado com um sistema de agitação adequado, adicionar uma quantidade de água duplamente destilada, a qual corresponde a, aproximadamente, metade do peso final da solução. Iniciar o processo de agitação de modo a obter um vórtex e, depois, adicionar, por ordem: metil para-hidroxi-benzoato de sódio (Me-parabeno Na ), CA, EDTA dissódico, 2-fenoxietanol e propil para-hidroxi-benzoato de sódio (Pr-parabeno Na ) assegurando que cada componente passou completamente para a solução antes da adição do subsequente; - verificar o pH da solução resultante e, se necessário, ajustar com ácido sulfúrico diluído até ser obtido um valor de pH igual a 7,2 ± 0,4; - muito lentamente e com contínua agitação vigorosa, adicionar a quantidade pesada de HA de sódio e manter sob agitação vigorosa até ser obtida a solubilização completa; - adicionar a restante quantidade de água duplamente destilada até ser obtido o peso final; - continuar a agitação durante a quantidade de tempo necessário para obter a viscosidade desejada (compreendida entre 2500 e 4500 Pa x s_1 medida com tensão de cisalhamento igual a 5 s_1) , verificar o pH mais uma vez e, se necessário, ajustar com ácido sulfúrico diluído ou hidróxido de sódio; - a solução final resultante é loteada em recipientes de polietileno do volume e forma desejados numa linha automática dedicada.

Tabela 1: Solução de monodose para aplicação tópica composição

(Continuação)

Exemplo 2; Lipogel hidratante para aplicação tópica: A formulação referida na Tabela 2 refere-se a ingredientes ativos e excipientes (com descrição da função tecnológica correspondente) que podem ser utilizados na preparação de um lipogel hidratante para aplicação tópica, a ser loteado, por exemplo, em recipientes multidose. 0 material utilizado para o recipiente, por exemplo, polietileno, deve ser compatível com os componentes da formulação e com os padrões atuais para materiais para utilização em dermocosmética ou para um dispositivo médico.

Um exemplo de preparação da formulação em questão a ser loteada em recipientes de multidose é referido abaixo a título exemplificativo: - pesar separadamente os componentes da formulação de acordo com as indicações nas instruções do fabricante; - etapa 1 (preparação da solução de CA) : a um turboemulsionante adequado, adicionar a quantidade estabelecida de água purificada e CA; misturar, utilizando apenas as lâminas, durante 30 minutos até ser obtida uma solução; - etapa 2 (fase aquosa): ao turboemulsionante contendo a solução de CA, adicionar a glicerina, o polímero de polietilenodimeticonol, o 2-fenoxietanol e o EDTA sódico; agitar utilizando apenas as lâminas, durante 30 minutos até os componentes estarem completamente homogeneizados; - etapa 3 (fase oleosa) : a um recipiente de fusão, equipado com um sistema de agitação adequado e ligado por meio de um sistema de transferência de vácuo ao turboemulsionante contendo a fase aquosa, adicionar o PEG-6 caprílico/capricoglicéridos, o Me-parabeno, o Pr-parabeno e agitar durante 20 minutos; depois, adicionar o carbonato de caprilo e agitar durante mais 10 minutos; - etapa 4 (formação de emulsão): ativar o sistema de ligação recipiente de fusão - turboemulsionante, transferir a etapa 3 para a etapa 2 e utilizar o turboemulsionante até ser obtida uma emulsão homogénea; - etapa 5 (adição de espessante): estabilizar a emulsão resultante através da adição de poliacrilamida C13-14 isoparafina/lauriléter-7 e agitar durante 20 minutos; - etapa 6 (fase de silicone): adicionar a etapa 5 resultante e, em sequência, polímero de reticulação dimeticona/dimeticona e ácido hialurónico/etil-hexil-palmitato, manter em agitação durante 20 minutos até ser obtida a completa homogeneização do gel final; antes da embalagem primária, verificar o pH, ο qual deve estar entre 5,0 e 6,0 e a viscosidade, a qual deve estar entre 22000 e 32000 cPs; - etapa 7 (embalagem primária): o gel resultante da etapa 6 pode ser transferido e loteado numa linha automática para tubos de enchimento multiusos, de um modo preferido, equipados com um aplicador de precisão. Como já anteriormente explicado, o material selecionado para os tubos, por exemplo, polietileno, deve ser compatível com os componentes da formulação e com os padrões atuais para materiais a serem utilizados em dermocosmética ou para um produto médico.

Tabela 2: Lipogel hidratante para aplicação tópica composição

(Continuação)

Tabela 3: Composição de HA/etil-hexil-palmitato

(Continuação)

B. Soluções viscoelásticas contendo CA e HA não reticulado, a serem utilizadas para revitalização da pele

As séries de operações descritas no Exemplo 3 devem ser consideradas puramente como um dos exemplos explanatórios da presente invenção e, uma vez que os procedimentos descritos não têm originalidade inventiva e não representam qualquer novidade tecnológica para os especialistas na técnica, estas não devem ser consideradas, de qualquer modo, limitativas da própria invenção.

Em relação às concentrações e caracteristicas fisico-quimicas dos dois ingredientes ativos, a informação proporcionada pelos Exemplos 1 e 2 permanece válida.

Exemplo 3: Soluções viscoelásticas a serem utilizadas como revitalizadores para utilização intradérmica A formulação referida na Tabela 4 refere-se a ingredientes ativos e excipientes (com descrições das funções tecnológicas correspondentes) que podem ser utilizadas na preparação de soluções viscoelásticas, a serem utilizadas como um dispositivo médico para utilização intradérmica em dermocosmética e medicina estética.

De um modo semelhante, os materiais de embalagem utilizados devem ser compatíveis com os componentes de formulação e com os regulamentos atuais que regulam a utilização na produção de um dispositivo médico. É referido abaixo um exemplo de preparação da classe de formulação em questão, a ser loteado em seringas monodose do volume desejado: - pesar separadamente os componentes da formulação de acordo com as indicações nas instruções do fabricante; - Etapa 1 (solução salina isotónica): num misturador equipado com um sistema de agitação adequado, preparar a solução salina isotónica, tamponada para pH 7,2, introduzindo os componentes listados abaixo, nas percentagens descritas na Tabela 4 e agitar até ser obtida uma solução límpida: o Cloreto de sódio (NaCl) o Di-hidrogenofosfato de sódio di-hidratado (NaH2P04 · 2H20) o Mono-hidrogenofosfato dissódico deca-hidratado (Na2HP04· 10H2O) o Água para injetáveis.

Verificar e, se necessário, ajustar o pH para 7,2 com HC1 1 N ou NaOH 1 N; - Etapa 2 (hidratação): num misturador adequado, equipado com sistema de agitação, revestimento de aquecimento e sistema de aplicação/monitorização de vácuo, adicionar a quantidade desejada de solução salina isotónica (etapa 1) e a CA em tais quantidades para obter a concentração desejada. Manter a agitar durante 10 minutos, depois adicionar a quantidade desejada de HA à solução resultante e deixar mistura a repousar durante um dia a uma temperatura compreendida entre 2 °C e 6 °C, i. e., até à completa hidratação do HA; - Etapa 3 (homogeneização): tendo completado o processo de hidratação, de modo a evitar a incorporação de bolhas de ar, aplicar um vácuo de 0,2 bar ao misturados e deixar a massa, obtida como descrito no parágrafo anterior, a agitar lentamente até estar completamente homogeneizada; - antes do loteamento em seringas, verificar o valor de osmolaridade da massa homogénea resultante, a qual deve estar compreendida entre 260 e 360 mOsm/L; - a solução viscoelástica final, a ser administrada utilizando agulhas hipodérmicas finas (calibre 27 e 30), deve ser cheia em seringas de monoutilização, do volume desejado, sob fluxo laminar num ambiente de contaminação controlado; - a embalagem final é subsequentemente submetida a um processo de esterilização, compatível com a formulação e os materiais com os quais esta é composta.

Tabela 4: Solução viscoelástica contendo CA e HA não reticulado - composição

C. Hidrogéis contendo CA e HA reticulado a ser utilizado como enchimento intradérmico

Os Exemplos 4 e 5 descrevem dois procedimentos nos quais CA e HA reticulado são incorporados numa única formulação, dando hidrogéis a serem utilizados para administração intradérmica.

Em ambos os casos existe uma etapa preliminar, i. e., a reticulação de HA, a qual não está abrangida pelas reivindicações contidas na presente invenção, mas que é descrita ao mesmo tempo, pelo menos, em resumo, de modo a tornar os procedimentos referidos nos exemplos em questão compreensíveis e homogéneos. 0 processo de reticulação descrito não tem novidade tecnológica para o setor e, assim, é enfatizado que não pode ser atribuída a este qualquer originalidade inventiva reivindicável, contrariamente aos hidrogéis finais, contendo HA reticulado em conjunto com CA, nunca anteriormente descritos e reivindicados devido à absoluta novidade representada pelas formulações que os incluem. 0 processo de reticulação mencionado acima consiste essencialmente da formação de pontes moleculares que ligam as unidades de HA individuais umas às outras por meio da formação de ligações covalentes com as moléculas bifuncionais do agente de reticulação. Deste modo, são formadas estruturas tridimensionais de consistência variável, as quais, em água ou em líquidos fisiológicas, têm a capacidade para voltar a inchar para um estado de equilíbrio diretamente em proporção com o grau de reticulação.

No HA, existem dois centros de reação, adequados para a formação de pontes, por meio de interação com agentes bifuncionais, i. e.: - o grupo carboxilo do ácido glucurónico, com a formação de pontes éster; - o grupo hidroxilo na posição 6 da molécula de N-acetilglucosamina, com a formação de pontes éter.

Existe uma vasta gama de agentes de reticulação bem conhecidos, amplamente utilizados e facilmente disponíveis no mercado e, entre estes, a requerente pode citar a título exemplificativo: éter 1,4-butanodiol-diglicidílico (BDDE), éter diglicidílico de polietilenoglicol, divinilsulfona (DVS), epicloridrina, 1,2,3,4-di-epoxibutano, 1,2,7, 8-di-epoxibutano e outros.

Entre os agentes de reticulação mencionados acima, o BDDE é preferido devido à sua toxicidade muito reduzida e, por esta razão, é utilizado nas formulações descritas e reivindicadas no presente pedido de patente e, consequentemente, no detalhe dos Exemplos 4, 5.

Para cada agente de reticulação existem modos de utilização práticos, precisos e, no caso de BDDE, o processo é realizado através da formação de ligações éter com os grupos hidroxilo de NAG sob as condições de trabalho aqui especificadas: o Razão BDDE/HA (p/p): 1/1-1/50 o Concentração de BDDE na mistura de reação: 0,5-20% (p/v) o Concentração de HA na mistura de reação: 10-20% o Peso molecular de HA: 0,5-3xl06 Da o Temperatura de reação: 30-60 °C o pH de reação: >11 o Tempo de reação: 2-4 horas

Em relação à dosagem de ingredientes ativos, as amostras descritas referem quantidades puramente indicativas e qualquer variação em relação às mesmas não resulta em modificação para os métodos de preparação ilustrados. Além disso, essas quantidades estão de acordo com as condições necessárias para a utilização de BDDE como um agente de reticulação e estão dentro das gamas já especificadas nos Exemplos 1, 2 e 3. Para maior clareza, a formulação que se refere aos Exemplos 4 e 5 está resumida quantitativamente na Tabela 5.

Exemplo 4: Hidrogéis de 2% de HA contendo 0,1% de CA (incorporação de CA por meio de reidratação de HA reticulado) O processo é descrito em detalhe por meio dos passos e etapas descritos abaixo: a. Preparação do hidrogel HA a 2% reticulado - etapa 1 (dissolver o HA) : num reator adequado, equipado com agitador, revestimento de aquecimento e sistema de controlo de vácuo, introduzir NaOH 0,25 N e HA (como sal de sódio) obtido de biofermentação (peso molecular compreendido entre 0,5 e 3xl06 Da) em tais quantidades como para dar uma concentração final de HA igual a 12% (p/v); deixar o HA para hidratar durante uma hora a 2-6 °C, depois aplicar um vácuo de 0,2 bar, de modo a evitar a incorporação de bolhas de ar na massa e iniciar agitação suave para obter uma homogeneização completa; - etapa 2 (reação de reticulação): no reator contendo a etapa 1, restaurar a pressão atmosférica, depois adicionar essa quantidade de BDDE como para dar uma razão de 1:16 (p/p) em relação ao teor de HA e manter a agitação durante mais dez minutos, de modo a dispersar uniformemente o BDDE em todo a massa de reação; neste ponto, parar a agitação e deixar a reação a repousar durante 2-4 horas, a 50 °C, até o processo de reticulação estar completo; utilizando um aparelho adequado, triturar o gel resultante para dar partículas de dimensões iguais a aprox. 1 cm3; - etapa 3 (purificação/hidratação): transferir o produto derivado da etapa 2 para um recipiente equipado com um agitador, preparar separadamente uma solução salina isotónica, tamponada para pH 7,2, de acordo com a composição referida na Tabela 6 e adicionar essa quantidade ao HA reticulado, para dar uma razão de 5:1 (p/p) em relação ao gel da etapa 2; iniciar agitação suave e ajustar para pH 7 com HC1 1 M e deixar a agitação durante 24 horas. Repetir a operação, pelo menos, três vezes, i. e., até atingir equilíbrio de redilatação, com a obtenção de um hidrogel de HA com a concentração desejada.

No decorrer das operações descritas acima, verificar repetidamente o pH da solução isotónica externa e a osmolaridade do hidrogel final, os quais devem corresponder aos relacionados com a concentração predefinida de HA (osmolaridade compreendida entre 260 e 360 mOsm/L e pH compreendido entre 6,8 e 7,6) b. Preparação da solução tamponada, pH 7,2, isotónica, contendo a concentração predeterminada de CA (0,1%) - num recipiente adequado equipado com agitador, carregar a quantidade predefinida de solução salina tamponada para pH 7,2, obtida de acordo com as instruções dadas na etapa 3 do passo a., verificar o pH e, se necessário, ajustar com HC1 1 N ou NaOH 1 N. - adicionar a quantidade predeterminada de CA e deixar a agitar até à completa solubilização. Transferir e armazenar a solução assim obtida para um recipiente vedado, afastada de fontes de calor.

c. Preparação de um hidrogel contendo 2% de HA reticulado e 0,1% de CA - etapa 1 (precipitação e secagem de HA reticulado): num sistema de diálise adequado, equipado com uma membrana adaptada para o objetivo (e. g.f espetros 4 MWCO:12-14000), introduzir a quantidade de hidrogel de HA reticulado referida, obtida de acordo com a descrição dada na etapa 3 do passo a., transferir o dialisador para um recipiente dimensionado adequadamente e introduzir uma tal quantidade de água que permitia a diálise exaustiva com completa eliminação do sal (substituindo o meio de diálise se necessário); transferir o gel resultante para um recipiente adequado equipado com um agitador, adicionar um elevado excesso de etanol e iniciar a agitação vigorosa até à completa precipitação do HA reticulado; separar a fase sólida por filtração e secá-la, sob vácuo, a uma temperatura não superior a 40 °C; após secar e para fácil utilização, reduzir o HA reticulado resultante em partículas de tamanho compreendido entre 20 e 50 pm por meio de um sistema de trituração/micronização adequado; - etapa 2 (incorporação de CA por reidratação): num recipiente adequado equipado com um agitador, transferir a quantidade necessária de HA reticulado, obtido de acordo com a descrição dada na etapa 1 e adicionar uma quantidade adequada de solução isotónica de CA tamponada para pH 7,2 (ver passo b.), de modo a dar as concentrações predefinidas dos ingredientes ativos e, depois, realizar a reidratação, enquanto se agita muito lentamente, até ser formado o hidrogel desejado; - etapa 3 (enchimento em seringas): o hidrogel resultante final é adequado para o loteamento em seringas monodose por meio de uma máquina de enchimento adequada, num ambiente dedicado sob fluxo laminar; a embalagem final é submetida a um processo de esterilização compatível com a formulação e com os materiais com os quais esta é composta.

Exemplo 5: Hidrogéis de 2% de HA contendo 0,1% de CA (incorporação de CA por meio de difusão para o hidrogel de HA) O processo é descrito em detalhe por meio dos passos e etapas descritos abaixo: - etapa 1 (precipitação do hidrogel de HA reticulado): Preparado de acordo com os métodos operacionais descritos no Exemplo 4 -passo a. - etapa 2; - etapa 2 (preparação da solução tamponada, pH 7,2, isotónica, contendo a concentração predeterminada de CA (0,1%)): preparada de acordo com a descrição dada no exemplo 4 - passo b. - etapa 3 (preparação de um hidrogel de 2% de HA reticulado e CA (0,1%)): num recipiente apropriado equipado com um sistema de agitação adequado, introduzir a quantidade predefinida de hidrogel de HA, obtida de acordo com o método operativo da etapa 1, iniciar o processo de difusão através da adição de uma quantidade calculada da solução isotónica de CA (ver etapa 2) e manter sob agitação suave durante 24 horas; descartar a solução isotónica residual e verificar que os parâmetros do hidrogel resultante correspondem aos estabelecidos, i. e.:

o o valor de osmolaridade deve estar compreendido entre 260 e 360 mOsm/mL o o valor de pH deve estar compreendido entre 6,8 e 7,6; repetir a operação o número de vezes necessário e suficiente para obter a formulação final contendo HA reticulado e CA nas concentrações estabelecidas; - etapa 4 (enchimento em seringas): o produto resultante da etapa 3 é homogeneizado e reduzido para partículas de dimensões compreendidas entre 100 e 300 pm, i. e., de modo a ser capaz de ser loteado em seringas monodose, utilizando uma máquina de enchimento adequada num ambiente dedicado com fluxo laminar. A embalagem final é submetida, subsequentemente, a um processo de esterilização, compatível com a formulação e com os materiais com os quais esta é composta.

Tabela 5: Formulação pertencente aos Exemplos 4 e 5

Tabela 6: Solução tampão isotónica a pH 7,2 - Composição

C. Formas orais

As formulações aqui referidas a seguir ilustram potenciais aplicações práticas da presente invenção e, como tal, não devem ser consideradas, de qualquer modo, como limitativas da própria invenção. É feita particular referência aos excipientes das várias formas em consideração, as quais podem ser utilizadas em alternativa às explicitamente mencionadas nos exemplos ilustrados abaixo, dependendo dos requisitos tecnológicos e de formulação e os quais, em qualquer caso, podem ser selecionados de uma vasta gama de produtos disponíveis no mercado e bem conhecidos pelos especialistas no setor farmacêutico e, assim, sem originalidade inventiva.

Também no caso das formas orais, a dosagem de CA dada nos exemplos é puramente indicativa e está, em qualquer caso, dentro da gama de dosagem reivindicada na presente descrição da invenção, i. e., variável entre 100-1000 e, de um modo preferido, 250-750 mg por dia, expressa em termos de base de glucosamina. O mesmo também é verdade para a razão NAG para ASS dentro de CA, a qual, como anteriormente especificado, pode variar livremente em termos de peso equivalente entre 1:0,5 e 1:3 e a qual, nos exemplos descritos, foi mantida constante e igual a 1:1 sendo a mais vantajosa, de acordo com as verificações da secção experimental.

Também deve ser especificado que, quaisquer variações na dosagem de CA e no seu teor em relação a NAG e ASS não implicam quaisquer modificações substanciais aos métodos de preparação ilustrados.

Exemplo 6: Comprimidos para utilização oral

Para além do ingrediente ativo, a formulação referida na Tabela 7 compreende excipientes (com uma descrição da função tecnológica correspondente) que pode ser utilizada na preparação de comprimidos a serem utilizados para a administração oral do objeto da presente invenção, por si só ou em associação com outros ingredientes ativos. A técnica de transformação em veiculo da dose selecionada de CA, por si só ou em associação com outros ingredientes ativos, num comprimido, requere apenas operações que são tecnologicamente bem conhecidas e inteiramente normais para qualquer operador na técnica, i. e.: - pesagem dos componentes individuais da formulação - granulação a húmido, por meio de uma solução aquosa de polivinilpirrolidona K-25, de NAG e celulose microcristalina (granulado A) num granulador adequado - secagem do granulado A num forno de secagem com circulação de ar a uma temperatura não superior a 50 °C a peso constante (pode ser utilizado qualquer outro tipo de secagem desde que seja previamente validado) - peneira do granulado A e os outros componentes da formulação; - preparação da mistura para compressão por homogeneização do granulado A com os outros componentes da formulação num misturador adequado; - compressão da mistura resultante num máquina de preparação de comprimidos automatizada, com a eventual obtenção de comprimidos de forma e tamanho adequados.

Tabela 7: Exemplo de uma formulação na forma de comprimido

(Continuação)

Exemplo 7: Cápsulas para utilização oral

Além do ingrediente ativo, a formulação referida na Tabela 8 compreende excipientes (com uma descrição da função tecnológica correspondente) que podem ser utilizados na preparação de cápsulas de gelatina duras para serem utilizadas para a administração oral do objeto da presente invenção, por si só ou opcionalmente em associação com outros ingredientes ativos. A técnica de transformação em veiculo da dose selecionada de CA, por si só ou em associação com outros ingredientes ativos, numa cápsula de gelatina dura, requere apenas operações que são tecnologicamente bem conhecidas e inteiramente normais para qualquer operador na técnica, i. e.: - pesagem dos componentes individuais da formulação - preparação da mistura a ser encapsulada por homogeneização a seco num misturador adequado - enchimento automatizado em cápsulas de gelatina duras de tamanho adequado e cor desejada

Tabela 8: Exemplo de uma formulação na forma de cápsula

Exemplo 8: Saquetas termovedadas contendo pós para a preparação extemporânea de soluções/suspensões bebíveis

Além do ingrediente ativo, a formulação referida na Tabela 9 compreende excipientes (com uma descrição da função tecnológica correspondente) que podem ser utilizados na utilização do objeto da presente invenção, por si só ou opcionalmente em associação com outros ingredientes ativos, na formulação de um pó para a preparação de soluções/suspensões extemporâneas para serem tomadas oralmente.

Para este objetivo, a formulação em questão pode ser adequadamente transformada num veículo, numa saqueta termovedada constituída por uma camada exterior de papel, numa interface de alumínio e numa camada interior de polietileno, utilizando operações de preparação bem conhecidas e utilizáveis por qualquer equipa técnica que opere no campo específico, i. e.: - pesagem e peneira dos componentes individuais da formulação; - preparação da mistura de componentes por homogeneização a seco num misturador adequado; - termoformação das saquetas numa linha automatizada adequada - utilização da mesma linha automatizada para o enchimento e vedação das saquetas com a forma e dimensões adequadas e contendo os pós a serem utilizados para a preparação de soluções/suspensões a serem extemporaneamente tomadas oralmente.

Tabela 9: Formulação exemplificativa na forma de pó para a preparação de soluções/suspensões a serem extemporaneamente tomadas oralmente

Lisboa, 26 de agosto de 2015

Claims (16)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Composição útil para tratamento cosmético e estético da pele contendo N-acetilglucosamina e um sulfato de metal alcalino na razão de peso equivalente de 1:1.
2. 2. Composição de acordo com a reivindicação 1, em que o referido sulfato de metal alcalino é sulfato de sódio anidro.
3. 3. Composição de acordo com as reivindicações 1 ou 2, compreendendo ainda ácido hialurónico ou um seu sal.
4. 4. Composição de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3, compreendendo ainda ácido hialurónico ou um seu sal, em concentrações de até 4% em peso, fazendo referência ao peso total da composição.
5. 5. Composição de acordo com a reivindicação 4, compreendendo ácido hialurónico ou um seu sal em concentrações entre 1% e 3% em peso.
6. 6. Composição de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 5, numa forma adequada para utilização tópica ou intradérmica, compreendendo N-acetilglucosamina e sulfato de sódio anidro em quantidades totais compreendidas entre 0,05% e 2,5% em peso, fazendo referência ao peso total da composição.
7. 7. Composição de acordo com a reivindicação 6, compreendendo N-acetilglucosamina e sulfato de sódio anidro em quantidades totais entre 0,1% e 0,5% em peso.
8. 8. Composição de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, compreendendo veículos, excipientes e/ou conservantes para utilização cosmética.
9. 9. Composição de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, na forma de uma solução, lipogel ou hidrogel para aplicação tópica sobre a pele.
10. 10. Composição de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 5, na forma de uma dose unitária para administração oral.
11. 11. Composição de acordo com a reivindicação 10, compreendendo N-acetilglucosamina e sulfato de sódio anidro numa razão de peso equivalente de 1:1 e contendo uma quantidade de N-acetilglucosamina compreendida entre 100 e 1000 mg, expressa em termos de base de glucosamina.
12. 12. Utilização de uma composição contendo N-acetilglucosamina e um sulfato de metal alcalino na razão de peso equivalente entre 1:0,5 e 1:3 para o tratamento cosmético da pele.
13. 13. Utilização da reivindicação 12, em que N-acetilglucosamina e o sulfato de metal alcalino estão na razão de peso equivalente de 1:1.
14. 14. Utilização das reivindicações 12 ou 13, em que a referida composição compreende ainda ácido hialurónico ou um seu sal.
15. 15. Enchimento intradérmico útil para restaurar o tónus e vigor da pele, compreendendo uma composição contendo N-acetilglucosamina e um sulfato de metal alcalino na razão de peso equivalente entre 1:0,5 e 1:3.
16. 16. Suplemento alimentar para tropismo da pele, compreendendo uma composição de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 5. Lisboa, 26 de agosto de 2015