PT2132221E - Peptidomiméticos fixados num molde - Google Patents

Description

ΡΕ2132221 1 DESCRIÇÃO "PEPTIDOMIMETICOS FIXADOS NUM MOLDE" A presente invenção proporciona peptidomiméticos de gancho β fixados num molde que têm actividade antagoni-zante de CXCR4 e que estão abrangidos pela descrição geral do, mas não especificamente descritos no W02004/096840 AI.

Demarco et ai., Bioorganic & Medicinal Chemistry 14, 8369-8404 (2006), descrevem inibidores de CXCR4 miméticos em gancho beta selectivos que são úteis no tratamento de infecções por VIH, cancro, inflamação e na terapêutica do transplante de células estaminais bem como a síntese desses peptidomiméticos cíclicos.

Os peptidomiméticos de gancho β da invenção são Cyclo(-Tyr-His-X-Cys-Ser-Ala-DPro-Dab-Arg-Tyr-Cys-Tyr-Gln-Lys-°Pro-Pro), ligação dissulfureto entre Cys4 e Cysll, e os seus sais farmaceuticamente aceitáveis, em que A é Ala ou Tyr.

De acordo com a invenção, os anteriormente referidos peptidomiméticos de gancho β e os seus sais farmaceuticamente aceitáveis podem ser preparados por um processo que compreende 2 ΡΕ2132221 (a) acoplamento de um suporte sólido, adequadamente funcionalizado com um derivado de Pro N-protegido apropriadamente; (b) remoção do grupo protector de N do produto obtido no passo (a); (c) acoplamento do produto assim obtido com um derivado de DPro N-protegido apropriadamente; (d) remoção do grupo protector de N do produto assim obtido; (e) acoplamento do produto assim obtido com um derivado N-protegido apropriadamente do amino ácido que no produto final desejado está na posição 14, i.e. Lys, estando analogamente o grupo amino presente na sua cadeia lateral protegido apropriadamente; (f) remoção do grupo protector de N do produto assim obtido; (g) efectuar passos substancialmente correspondentes aos passos (e) e (f) utilizando derivados N-protegidos apropriadamente dos aminoácidos que no produto final desejado estão nas posições 13 a 1, i.e. Gin, Tyr, Cys, Tyr, Arg, DAB, DPro, Ala, Ser, Cys, Ala ou Tyr, His e Tyr, estando qualquer grupo funcional que pode estar presente nos referidos derivados de aminoácidos N-protegidos igualmente protegidos de modo apropriado; 3 ΡΕ2132221 (h) formar a ligação dissulfureto de cadeia β entre as cadeias laterais dos resíduos de Cys nas posições 4 e 11; (i) separar o produto assim obtido do suporte sólido; (j) ciclizar o produto clivado do suporte sólido; (k) remover quaisquer grupos protectores presentes em grupos funcionais de quaisquer membros da cadeia de resíduos de aminoácidos; e (l) se desejado, converter o produto assim obtido num sal farmaceuticamente aceitável ou converter um sal farmaceuticamente aceitável, ou inaceitável, assim obtido no correspondente composto livre ou num sal diferente, farmaceuticamente aceitável.

Os passos do processo anteriormente referido podem ser realizados por métodos que são bem conhecidos por quem tem conhecimentos adequados em química de péptidos.

Os peptidomiméticos de gancho β da invenção podem ser utilizados numa ampla gama de aplicações para a prevenção de infecções por VIH em indivíduos saudáveis ou para retardar e interromper a progressão do vírus em doentes infectados; ou onde o cancro é mediado por ou 4 ΡΕ2132221 resultante da actividade dos receptores CXCR4; ou onde as doenças imunológicas são mediadas ou resultantes da actividade dos receptor CXCR4; ou para o tratamento da imunossu-pressão; ou para o tratamento de inflamação ou, em particular, para a mobilização de células estaminais de células estaminas de sangue periférico e/ou células estaminais mesenquimatosas (MSC) e/ou outras células estaminais cuja retenção depende dos receptores de CXCR4.

Os peptidomiméticos de gancho β da invenção podem ser administrados per se ou podem ser aplicados como uma formulação apropriada conjuntamente com veículos, diluentes ou excipientes bem conhecidos na técnica.

Em particular, os peptidomiméticos de gancho β da invenção podem ser utilizados como um tratamento para aumentar a libertação de células estaminais hematopoiéticas (HSC) a partir da medula óssea para serem utilizadas em transplantes alogénicos ou autólogos. 0 tratamento agudo com HSC perfundido é largamente utilizado para restaurar funções imunológicas em doentes que receberam terapêutica mieloablativa durante o tratamento de doenças malignas tais como mieloma múltiplo e de linfoma não Hodgkin. Os doentes ou os doadores são tratados com o agente de mobilização de HSC, tal como um composto da invenção, e as células são subsequentemente colhidas do sangue periférico por aférese. As HSC são retransplantadas, após e.g. tratamento por quimioterapia, 5 ΡΕ2132221 no doente (transplante autólogo) ou do dador para o recep-tor (transplante alogénico), promovendo assim a restauração da função imunitária (Fruhauf et al., Br. J. Haematol. 122, 360-375 (2003)) .

Outras aplicações do tratamento com HSC incluem, mas não estão limitados a angiogénese terapêutica em caso de e.g. ataque cardíaco (Shepherd R. M. et al., Blood 2006 108(12) :3662-3667) .

Os peptidomiméticos de gancho β da invenção também podem ser utilizados para tratar ou impedir infecções por VIH ou cancro tal como cancro da mama, cancro do cérebro, cancro da próstata, cancro do pulmão, cancro do rim, neuroblastoma, linfoma não Hodgkin, cancro do ovário, mieloma múltiplo, leucemia linfocitica crónica, cancro do pâncreas, melanoma, angiogénese e tecidos hematopoiéticos; ou doenças inflamatórias tais como asma, rinite alérgica, doenças pulmonares por hipersensibilidade, pneumonite por hipersensibilidade, pneumonias eosinofilicas, hipersensibilidade do tipo retardado, doença pulmonar intersticial (ILD), fibrose pulmonar idiopática, ILD associada a artrite reumatóide, lúpus eritematoso sistémico, espondilite anqui-losante, doença vascular periférica, esclerose sistémica, síndroma de Sjogren, doença de von Hippel Lindau, anafi-laxia sistémica ou respostas por hipersensibilidade, alergias a fármacos, artrite reumatóide, artrite psoriática, síndrome de Behcet, mucosite, doença de Crohn, esclerose múltipla, miastenia grave, diabetes juvenil, glomerulone- 6 ΡΕ2132221 frite, tiroidite autoimune, rejeição de enxertos, incluindo rejeição de homoenxerto ou doença do enxerto contra o hospedeiro, doenças inflamatórias dos intestinos, derma-toses inflamatórias; ou para tratar a imunossupressão, incluindo imunossupressão induzida por rejeição de enxerto /transplantação.

Os peptidomiméticos de gancho β da invenção podem ser administrados individualmente, como misturas de mais do que um peptidomimético de gancho β, em associação com, conforme o caso, outros agentes de mobilização de HSC, ou agentes anti-VIH, ou agentes antimicrobianos, ou agentes anticancerigenos, ou agentes anti-inflamatórios e/ou em associação com outros agentes farmaceuticamente activos.

Podem ser produzidas composições farmacêuticas que compreendem peptidomiméticos de gancho β da invenção por meio de processos convencionais de mistura, dissolução, granulação, produção de comprimidos revestidos, pulverização, emulsionação, encapsulação, retenção ou liofilização. As composições farmacêuticas podem ser formuladas de modo convencional utilizando um ou mais veículos, diluentes, excipientes ou adjuvantes fisiologicamente aceitáveis que facilitam o processamento do composto activo peptidomimé-tico de gancho β em preparações que podem ser utilizadas farmaceuticamente. A formulação apropriada depende do método de administração escolhido.

Para administraçao tópica os peptidomiméticos de 7 ΡΕ2132221 gancho β da invenção podem ser formulados como soluções, geles, pomadas, cremes, suspensões, etc. tal como são bem conhecidos na técnica.

As formulações sistémicas incluem as concebidas para administração por injecção, e.g. injecção subcutânea, intravenosa, intramuscular, intratecal ou intraperitoneal, bem como as concebidas para administração transdérmica, transmucosas, oral ou pulmonar.

Para injecções, os peptidomiméticos de gancho β da invenção podem ser formulados em soluções adequadas, preferencialmente em tampões fisiologicamente compatíveis tais como solução de Hank, solução de Ringer ou tampão de soro fisiológico. As soluções podem conter agentes de formulação tais como agentes de suspensão, agentes estabilizantes e/ou agentes dispersantes.

Alternativamente, os peptidomiméticos de gancho β da invenção podem estar na forma de pó para combinação com um veiculo adequado, e.g., água estéril isenta de piro-génios, antes da utilização.

Para administração transmucosas, penetrantes apropriados para a barreira a ser permeada são utilizados na formulação como é conhecido na técnica.

Para administração oral, os compostos podem ser facilmente formulados por associação dos peptidomiméticos ΡΕ2132221 de gancho β activos da invenção com veículos farmaceuti-camente aceitáveis bem conhecidos na técnica. Esses veículos permitem que os peptidomiméticos de gancho β da invenção sejam formulados como comprimidos, pílulas, drageias, cápsulas, líquidos, geles, xaropes, pastas, suspensões, etc., para ingestão oral por um doente a ser tratado. Para formulações orais tais como, por exemplo, pós, cápsulas e comprimidos, os excipientes adequados incluem cargas tais como açúcares, e.g. lactose, sacarose, manitol e sorbitol; preparações de celulose tais como amido de milho, amido de trigo, amido de arroz, fécula de batata, gelatina, goma de tragacanto, metilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose, car-boximetilcelulose de sódio; agentes de granulação; e agentes aglutinantes. Se desejado, podem ser adicionados agentes desintegrantes, tais como polivinilpirrolidonas reticuladas, agar, ou ácido algínico ou um seu sal, tal como alginato de sódio. Se desejado, as formas de dosagem sólidas podem ser revestidos com açúcar ou com revestimentos entéricos utilizando técnicas correntes.

Para preparações líquidas orais tais como, por exemplo, suspensões, elixires e soluções, os veículos, excipientes ou diluentes adequados incluem água, glicóis, óleos, álcoois, etc. Além disso, podem ser adicionados agentes aromatizantes, conservantes, agentes corantes e outros semelhantes.

Para administração bucal, a composição pode tomar a forma de comprimidos, pastilhas, etc., formulado como é usual. 9 ΡΕ2132221

Para administração por inalação, os peptidomimé-ticos de gancho β da invenção são convenientemente administrados na forma de uma pulverização em aeorossol a partir de embalagens pressurizadas ou de um nebulizador, com a utilização de um propulsor adequado, e.g. dicloro-difluorometano, triclorofluorometano, dióxido de carbono ou outro gás adequado. No caso de um aerossol pressurizado a unidade de dosagem pode ser determinada proporcionando uma válvula para distribuir uma quantidade medida. Cápsulas e cartuchos de e.g. gelatina para utilização num inalador ou insuflador podem ser formuladas contendo uma mistura em pó dos peptidomiméticos de gancho β da invenção e uma base em pó adequada tal como lactose ou amido.

Os compostos também podem ser formulados em composições rectais ou vaginais tais como supositórios juntamente com bases para supositório apropriadas tais como manteiga de cacau ou outros glicéridos.

Para além das formulações descritas anteriormen-te, os peptidomiméticos de gancho β da invenção também podem ser formulados como preparações de depósito. Essas formulações de actuação longa podem ser administradas por implantação (e.g. subcutaneamente ou intramuscularmente) ou por injecção intramuscular. Para o fabrico dessas preparações de depósito os peptidomiméticos de gancho β da invenção podem ser formulados com materiais poliméricos ou hidrófobos adequados (e.g. como uma emulsão num óleo acei- 10 ΡΕ2132221 tável) ou resinas de permuta iónica, ou como sais moderadamente solúveis.

Além disso, podem ser utilizados outros sistemas de administração tais como lipossomas e emulsões bem conhecidos na técnica. Também podem ser utilizados determinados solventes orgânicos tais como sulfóxido de dimetilo. Adicionalmente, os peptidomiméticos de gancho β da invenção podem ser administrados utilizando um sistema de libertação prolongada, tais como matrizes semipermeáveis de polímeros sólidos contendo o agente terapêutico. Têm sido estabelecidos vários materiais de libertação prolongada e são bem conhecidos pelos especialistas na técnica. As cápsulas de libertação prolongada podem, dependendo da sua natureza química, libertar os compostos durante algumas semanas até mais de 100 dias. Dependendo da natureza química e da estabilidade biológica do agente terapêutico, podem ser utilizadas estratégias adicionais para a estabilização de proteínas.

Como os peptidomiméticos de gancho β da invenção contêm resíduos carregados, podem ser incluídos em qualquer das formulações descritas acima como tal ou na forma de sais farmaceuticamente aceitáveis. Os sais farmaceutica-mente aceitáveis tendem a ser mais solúveis em meio aquoso e outros solventes próticos do que as correspondentes formas livres. Os sais farmaceuticamente aceitáveis particularmente adequados incluem sais com ácidos carboxílicos, fosfónicos, sulfónicos e sulfâmicos, por exemplo ácido acé- 11 ΡΕ2132221 tico, ácido propiónico, ácido octanóico, ácido decanóico, ácido dodecanóico, ácido glicólico, ácido láctico, ácido fumárico, ácido succinico, ácido adípico, ácido pimélico, ácido subérico, ácido azelaico, ácido málico, ácido tartárico, ácido cítrico, aminoácidos, tais como ácido glutâmico ou ácido aspártico, ácido maleico, ácido hidro-ximaleico, ácido metilmaleico, ácido ciclo-hexanocarboxí-lico, ácido adamantanocarboxílico, ácido benzóico, ácido salicílico, ácido 4-aminosalicílico, ácido ftálico, ácido fenilacético, ácido mandélico, ácido cinâmico, ácido metano- ou etano-sulfónico, ácido 2-hidroxietanossulfónico, ácido etano-1,2-dissulfónico, ácido benzenossulfónico, ácido 2-naftalenossulfónico, ácido 1,5-naftaleno-dissulfónico, ácido 2-, 3- ou 4-metilbenzenossulfónico, ácido metilsul-fúrico, ácido etilsulfúrico, ácido dodecilsulfúrico, ácido N-ciclo-hexilsulfâmico, ácido N-metil-, N-etil- ou N-pro-pil-sulfâmico, e outros ácidos orgânicos protonados, tais como ácido ascórbico. Os ácidos inorgânicos adequados são, por exemplo, halogeno ácidos tais como o ácido clorídrico, ácido sulfúrico e ácido fosfórico.

Os peptidomiméticos de gancho β da invenção, na forma livre ou na forma de sais f armaceut icamente aceitáveis, ou as suas composições, vão geralmente ser utilizados numa quantidade eficaz para atingir o objectivo pretendido. Entender-se-á que a quantidade utilizada vai depender de uma aplicação particular.

Para administraçao tópica para tratar ou impedir 12 ΡΕ2132221 infecções por VIH uma dose terapeuticamente eficaz pode ser determinada utilizando, por exemplo, os ensaios in vitro apresentados nos exemplos. 0 tratamento pode ser aplicado enquanto a infecção por VIH é visível, ou mesmo quando não é visível. Uma pessoa com conhecimentos correntes será capaz de determinar as quantidades terapeuticamente eficazes para tratar topicamente infecções por VIH sem experimentação desnecessária.

Para administração sistémica, a dose terapeuticamente eficaz pode ser estimada inicialmente a partir de ensaios in vitro. Por exemplo, uma dose pode ser formulada em modelos animais para se conseguir uma gama de concentração de peptidomimético de gancho β circulante que inclui a IC50 determinada em cultura de células (i.e., a concentração de um composto de teste que é letal para 50% de uma cultura de células). Essa informação pode ser utilizada para determinar com maior exactidão doses úteis em seres humanos.

As dosagens iniciais também podem ser determinadas a partir de dados in vivo, e.g. modelos animais, utilizando técnicas que são bem conhecidas na técnica. Uma pessoa com conhecimentos correntes da matéria pode prontamente optimizar a administração a seres humanos com base nos dados de animais.

As quantidades de dosagem para aplicações como agentes anti-VIH podem ser ajustadas individualmente para 13 ΡΕ2132221 obter níveis plasmáticos dos peptidomiméticos de gancho β da invenção que são suficientes para manter o efeito terapêutico. Níveis séricos terapeuticamente eficazes pode ser conseguidos por administração diária de doses múltiplas .

Em casos de administração local ou absorção selectiva, a concentração local eficaz dos peptidomiméticos de gancho β da invenção pode não estar relacionada com a concentração plasmática. Uma pessoa com conhecimentos correntes da matéria vai ser capaz de optimizar as dosagens locais terapeuticamente eficazes sem experimentação desnecessária. A quantidade de peptidomiméticos de gancho β administrada vai, é claro, estar dependente do indivíduo a ser tratado, do peso do indivíduo, da gravidade da doença, do modo de administração e da avaliação do médico que prescreve. A terapêutica anti-VIH pode ser repetida de forma intermitente enquanto as infecções são detectáveis ou mesmo quando não são detectáveis. A terapêutica pode ser proporcionada só ou em associação com outros fármacos, tais como, por exemplo, outros agentes anti-VIH ou agentes anti-cancro, ou outros agentes antimicrobianos.

Normalmente, uma dose terapeuticamente eficaz dos peptidomiméticos de gancho β aqui descritos vai proporcio- 14 ΡΕ2132221 nar vantagens terapêuticas sem causar toxicidade substancial . A toxicidade dos peptidomiméticos de gancho β da invenção pode ser determinada por procedimentos farmacêuticos correntes em culturas de células ou animais exper-mentais, e.g., por determinação da LD50 (a dose letal para 50% da população) ou a LDioo (a dose letal para 100% da população). A razão da dose entre efeito tóxico e terapêutico é o índice terapêutico. Os compostos que apresentam índices terapêuticos elevados são preferidos. Os dados obtidos a partir destes ensaios em cultura de células e estudos em animais podem ser utilizados na formulação de uma gama de dosagem que é não tóxica para utilização em seres humanos. A dosagem dos peptidomiméticos de gancho β da invenção reside de preferência dentro de uma gama de concentrações circulantes que incluem a dose eficaz com pouca ou nenhuma toxicidade. A dosagem pode variar dentro da gama dependendo da forma de dosagem utilizada e da via de administração utilizada. A formulação exacta, via de administração e dose podem ser escolhidas pelo médico individual tendo em vista o estado do doente (ver, e.g. Fingi et al. 1975, in: The Pharmacological Basis of

Therapeutics, Capítulo 1, página 1).

Os exemplos seguintes ilustram a invenção em mais pormenor, mas não se destinam a limitar o seu âmbito por qualquer forma. São utilizadas as seguintes abreviaturas nestes exemplos: 15 ΡΕ2132221 HBTU: Hexafluorofostato de 1-benzotriazol-l-il-tetrametil-urónio (Knorr et al. Tetrahedron Lett. 1989, 30, 1927-1930); HOBt: 1-hidroxibenzotriazole; DIEA: diisopropiletilamina; HOAT: 7-aza-1-hidroxibenzotriazole; HATU: Hexafluorofosfato de O-(7-aza-benzotriazole-l-il)-N,N,N',N'-tetrametilurónio (Carpino et al. Tetrahedron Lett. 1994, 35, 2279-2281). 1. Síntese de péptidos

Acoplamento do primeiro resíduo de aminoácido protegido à resina 0,5 g de resina de cloreto de 2-clorotritilo (malha 100-200, matriz polimérica de copoli(estireno-1% de DVB) , N° cat. 01-64-0114, Novabiochem, Merck Biosciences

Ltd.) (Barlos et al. Tetrahedron Lett. 1989,30, 3943-3946) (1,4 mMol/g, 0,7 mmol) foram colocados num balão seco. A resina foi suspensa em CH2CI2 (2,5 mL) e deixou-se inchar à temperatura ambiente com agitação constante durante 30 min. A resina foi tratada com 0,49 mMol (0,7 eq) do primeiro resíduo de aminoácido adequadamente protegido e 488 pL (4 eq) de diisopropiletilamina (DIEA) em CH2CI2 (2,5 mL) , a mistura foi agitada a 25°C durante 4 horas. A resina foi agitada (CH2Cl2/MeOH/DIEA: 17/2/1), 30 mL, durante 30 minutos; depois foi lavada pela ordem seguinte com CH2C12 (lx), DMF (lx), CH2C12 (lx), MeOH (lx), CH2C12 (lx), MeOH (lx), CH2C12 (2x), Et20 (2x) e seca em vácuo durante 6 horas. 16 ΡΕ2132221 0 carregamento foi tipicamente de 0,6-0,9 mMol/g.

Foi preparada a seguinte resina pré-carregada: Fmoc-Pro-2-clorotritilresina. Síntese do fragmento de péptido completamente protegido A síntese foi realizada num sintetizador de péptidos Syro (Multisyn Tech GmbH) utilizando 24 a 96 reactores. Em cada reactor foram colocados aproximadamente 60 mg (peso da resina antes da carga) de resina acima referida. Foram programados e realizados os seguintes ciclos de reacção:

Tempo 1x3 min. 1 x 60 min. 2x5 min. 5x1 min. 2 x 60 min. 5x1 min. 2x5 min. 5x1 min. 3x1 min.

Passo Reagente 1 CH2CI2, lavar e inchar (manual) 2 DMF, lavar e inchar

3 40% de piperidina/DMF 4 DMF, lavar

5 5 equiv. de Fmoc-aminoácido/DMF + 5 eq. de HBTU

+ 10 eq. de DIEA 6 DMF, lavar

7 40% de piperidina/DMF 8 DMF, lavar 9 CH2CI2, lavar (no final da síntese 17 ΡΕ2132221

Os passos 3 a 6 sao repetidos para adicionar cada aminoácido. Método analítico:

Os tempos de retenção em HPLC analítica (RT, em minutos) foram determinados utilizando uma coluna Júpiter Proteo 90 A, 150 x 2,0 mm, (cod. 00F-4396-B0 - Phenomenex) com os seguintes solventes A (H20 + 0,1% de TFA) e B (CH3CN + 0,1% de TFA) e o gradiente: 0 min: 95% de A, 5% de B; 0,5 min: 95% de A, 5% de B; 20 min: 40% de A, 60% de B; 21 min: 0% de A, 100% B; 23 minutos: 0% de A, 100% B; 23,1 min: 95% de A, 5% de B; 31 min: 95% de A, 5% de B.

Formação da ligação dissulfureto da cadeia β

Depois de completada a síntese, a resina foi inchada em 3 mL de DMF seca durante 1 h. Em seguida adicionou-se 10 eq. de solução de iodo em DMF (6 mL) ao reactor, a que se seguiu agitação durante 1,5 h. A resina foi filtrada e adicionou-se uma solução fresca de iodo (10 eq.) em DMF (6 mL), a que se seguiu agitação durante mais 3 h. A resina foi filtrada e lavada com DMF (3x) e CH2CI2 (3x) .

Clivagem, ciclização do esqueleto, desprotecção e purificação do péptido

Após a formação da ligação dissulfureto da cadeia β, a resina foi suspensa em 1 mL de (0,14 mMol) de 1% de 18 ΡΕ2132221 TFA em CH2C12 (v/v) durante 3 minutos e filtrada, e o filtrado foi neutralizado com 1 mL (1,15 mMol) de DIEA a 20% em CH2CI2 (v/v) . Este procedimento foi repetido duas vezes para assegurar a clivagem completa. A resina foi lavada três vezes com 1 mL de CH2CI2. A camada de CH2CI2 foi evaporada até à secura.

Os voláteis foram removidos e adicionou-se 8 mL de DMF seca ao tubo. Depois adicionou-se 2 equivalentes de HATU em DMF seca (1 mL) e 4 equivalentes de DIPEA em DMF seca (1 mL) ao péptido, a que se seguiu agitação durante 16 h. Os voláteis foram evaporados até à secura. O péptido ciclizado em bruto foi dissolvido em 7 mL de CH2CI2 e extraído com 10% de acetonitrilo em Η20 (4,5 mL) três vezes. A camada de CH2CI2 foi evaporada até à secura. Para desproteger totalmente o péptido, adicionou-se 3 mL de mistura de clivagem TFA:TIS:H20 (95:2,5:2,5) e a mistura foi mantida durante 2,5 h. Os voláteis foram evaporados até à secura e o péptido em bruto foi dissolvido em 20% de AcOH em água (7 mL) e extraído com éter isopropílico (4 mL) por três vezes. A camada aquosa foi recolhida e evaporada até à secura, e o resíduo foi purificado por HPLC preparativa de fase inversa.

Após liofilização os produtos foram obtidos na forma de pós brancos e analisados por pelo método analítico de HPLC-ESI-MS descrito acima. São apresentados os dados analíticos compreendendo pureza após HPLC preparativa e ESI-MS. 19 ΡΕ2132221

Exemplo 1: 0 péptido foi sintetizado começando com o aminoácido L-Pro que foi enxertado na resina. A resina de partida foi resina de Fmoc-Pro-2-clorotritilo, que foi preparada tal como descrito acima. 0 péptido linear foi sintetizado num suporte sólido de acordo com o procedimento descrito acima na seguinte sequência: Resina-Pro-DPro-Lys-Gln-Tyr-Cys-Tyr-Arg-Dab-DPro-Ala-Ser-Cys-Ala-His-Tyr. Foi introduzida uma ligação dissulfureto na cadeia β tal como descrito acima. 0 produto foi clivado da resina, ciclizado, desprotegido e purificado tal como indicado por LC-MS preparativa de fase inversa.

Após liofilização, o produto foi obtido como um pó branco e analisado pelo método analítico de HPLC-ESI-MS descrito acima ([M+2H]2+: 933, 1; RT: 10,47; pureza por UV: 72%) .

Exemplo 2: 0 péptido foi sintetizado começando com o aminoácido L-Pro que foi enxertado na resina. A resina de partida foi resina de Fmoc-Pro-2-clorotritilo, que foi preparada tal como descrito acima. O péptido linear foi sintetizado num suporte sólido de acordo com o procedimento descrito acima na seguinte sequência: Resina-Pro-DPro-Lys-Gln-Tyr-Cys-Tyr-Arg-Dab-DPro-Ala-Ser-Cys-Tyr-His-Tyr. Foi introduzida uma ligação dissulfureto na cadeia β tal como descrito acima. O produto foi clivado da resina, ciclizado, desprotegido e purificado tal como indicado por LC-MS preparativa de fase inversa. 20 ΡΕ2132221 obtido como um de HPLC-ESI-MS pureza por UV:

Após liofilização, o produto foi pó branco e analisado pelo método analítico descrito acima ([M+2H] 2+: 978,6 ; RT: 10,95; 82%) . 2. Métodos Biológicos 2.1. Preparação dos péptidos.

Os péptidos liofilizados foram pesados numa mi-crobalança (Mettler MT5) e dissolvidos em água estéril até uma concentração final de 1 mM salvo indicação em contrário. As soluções mães foram mantidas a +4°C, protegidas da luz . 2.2. Ensaio de Ca2+: actividade antagonizante de CXCR4 dos péptidos.

Aumentos do cálcio intracelular foram monitorizados utilizando uma Flexstation 384 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) para analisar os péptidos quanto ao antagonismo de CXCR4 numa linha celular pré-B 300-19 de ratinho transfectada de modo estável com CXCR4 humana [ver referências 1, 2 e 3 adiante] . As células foram carregadas em descontínuo com o estojo ("kit") de Calcium 3 Assay (Molecular Devices) em tampão de ensaio (solução salina equilibrada de Hank, HBSS, HEPES 20 mM, pH 7,4, 0,1% de BSA) durante 1 h à temperatura ambiente e depois 200000 21 ΡΕ2132221 células marcadas foram distribuídas em placas de ensaio com 96 poços pretas (Costar n° 3603). Uma solução concentrada 20 vezes de péptido em tampão de ensaio foi adicionada às células e toda a placa foi centrifugada para sedimentar as células no fundo dos poços. A mobilização de cálcio induzida por factor-1 derivado estromal a 10 nM (SDF-1) foi medida na Flexstation 384 (excitação, 485 nM; emissão, 525 nM) durante 90 segundos. Uma alteração máxima na resposta de fluorescência acima da linha de base foi utilizada para calcular a actividade antagonista. Os dados para as curvas de resposta à dose (concentração de antagonista em função da % de resposta máxima) foram ajustados a uma equação logística de quatro parâmetros utilizando o SoftmaxPro 4.6 (Molecular Devices), a partir da qual foram calculados os valores da ICso%. 2.3. Ensaio FIGS™ O ensaio foi realizado de acordo com a ref. 5, adiante. Diluições das soluções mães dos péptidos (10 μΜ) foram preparadas por dissolução em Tris-HCl 10 μΜ à temperatura ambiente. As soluções mães foram mantidas a +4°C ao abrigo da luz. Diluições de trabalho foram preparadas extemporaneamente por diluição em série em soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS) e adicionadas num volume final de 10 pL directamente às culturas de células. Após 48 horas de co-cultura, as culturas foram lavadas com PBS e depois exposto a glutaraldeído/formaldeído (0,2%/2%) em PBS durante cinco minutos. Para quantificação fotométrica as 22 ΡΕ2132221 culturas fixadas foram subsequentemente incubadas com orto-nitro-fenil-galactopiranosido (ONPG) como um substrato de β-galactosidase, que foi convertido enzimaticamente no cromóforo orto-nitrofenol (ONP). A leitura é obtida direc-tamente por medição da densidade óptica dos poços a 405 nm num leitor de placas de 96 poços iEMS. 2.4. Ensaio de citotoxicidade A citotoxicidade dos péptidos a células HELA (Acc57) e a células COS-7 (CRL-1651) foi determinada utilizando o ensaio de redução de MTT [ver ref. 6 e 7, adiante]. Resumidamente, o método foi como a seguir: células HELA e células COS-7 foram semeadas a 7,0xl03 e, respectivamente, 4,5xl03 células por poço e cultivadas em placas de microtitulação com 96 poços durante 24 horas a 37°C em 5% de CO2. Neste ponto, o tempo zero (TZ) foi determinado por redução de MTT (ver adiante) . O sobrenadante dos poços remanescentes foi eliminado, e meio fresco e os péptidos em diluições em série de 12,5, 25 e 50 μΜ foram transferidos por pipeta para os poços. Cada concentração de péptido foi ensaiada em triplicado. A incubação das células continuou durante 48 horas a 37°C em 5% de CO2. Os poços foram então lavados uma vez com PBS e subsequentemente 100 pL de reagente MTT (0,5 mg/mL em meio RPMI1640 e, respectivamente, DMEM) foram adicionados aos poços. Esta foi incubada a 37°C durante 2 horas e subsequentemente o meio foi aspirado e 100 pL de isopropanol foram adicionados a cada poço. A absorvência a 595 nm do produto solubilizado foi medida 23 ΡΕ2132221 (OD595Péptido). Para cada concentração foram calculadas as médias de triplicados. A percentagem de crescimento foi calculada como se segue: (OD595péptido - OD595Tz - OD595P0ÇO vazio) / (OD595Tz - OD595P0ÇO vazio) x 100% e foi registada num gráfico para cada concentração de péptido.

Os valores da IC50 (concentração letal, definida como a concentração que mata 50% das células) foram determinados para cada péptido utilizando a função de linha de tendência de EXCEL (Microsoft Office 2000) para as concentrações (50, 25, 12,5 e 0 μΜ) , as percentagens de crescimento correspondentes e o valor -50, (= TENDÊNCIA (C50:C0,%50:%0,-50)). As concentrações de GUI 50 (Inibição do crescimento) foram calculadas para cada péptido utilizando uma função de linha de tendência para as concentrações (50, 25, 12,5 e 0 pg/mL) , as percentagens correspondentes e o valor 50, (= TENDÊNCIA (C50 : C0, %so : %o, 50 ) . 2.5. Cultura de células Células 'CCR5' foram cultivadas em meio DMEM com 4500 mg/mL de glucose, 10% de soro fetal de bovino (FBS), suplementado com 50 U/mL de penicilina e 50 pg/mL de estre-ptomicina (Pen/Estrept.). Células Hut/4-3 foram mantidas em meio RPMI, 10% de FBS suplementado com Pen/Estrept. e HEPES 10 mM. Células HELA e células CCRF-CEM foram mantidas em RMPI1640 mais 5% de FBS, Pen/Estrept. e L-glutamina 2 mM. 24 ΡΕ2132221 Células Cos-7 foram cultivadas em meio DMEM com 4500 mg/mL de glucose suplementada com 10% de FCS, Pen/Estrept. e L-glutamina 2 mM. Todas as linhas celulares foram cultivadas a 37°C em 5% de CO2. Os meios das células, os suplementos dos meios, o tampão de PBS, HEPES, Pen/Estrept., L-gluta-mina e os soros foram comprados a GIBCO (Pailsey, UK) . Todos os produtos químicos finos eram provenientes da Merck (Darmstadt, Alemanha). 2.6. Hemólise

Os péptidos foram testados quanto à sua activi-dade hemolítica contra glóbulos vermelhos do sangue humano (hRBC) . hRBC frescas foram lavadas três vezes com soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS) por centrifugação durante 10 min a 2000 x g. Os péptidos numa concentração de 100 μΜ foram incubados com 20% v/v de hRBC durante 1 hora a 37°C. A concentração final de eritrócitos era aproximada-mente 0,9xl09 células por mL. Um valor de 0% de resp. 100% de lise celular foi determinado por incubação das hRBC na presença de PBS só e respectivamente 0,1% de Triton X-100 em H20. As amostras foram centrifugadas e o sobrenadante foi diluído 20 vezes em tampão PBS e mediu-se a densidade óptica (OD) da amostra a 540 nm. O valor de lise a 100% (OD540H2O) deu uma OD54o de aproximadamente 1,3-1,8. A percentagem de hemólise foi calculada como se segue: (OD54opéptido/OD540H2O) xl0 0% . 25 ΡΕ2132221 2.7. Ensaio quimiotáctico (ensaio de migração de células) A resposta quimiotáctica de células CCRF-CEM a um gradiente de factor la derivado de células do estroma (SDF-i) foi medida utilizando placas de ensaio descartáveis de Neuroprobe (tamanho de poro de 5 pm) (Gaithersburg, MD), de acordo com as instruções do fabricante e referências ai citadas [especialmente a ref. 8, adiante]. Resumidamente, um balão de 175 cm3 foi lavado uma vez com soro fisiológico tamponado com fosfato de Dubecco (DPBS) e tripsinizado durante 10 minutos ou até as células terem levantado. A tripsina foi neutralizada pela adição de meio fresco contendo soro e as células foram sedimentadas, lavadas uma vez em DPBS, e ressuspensas a l-0,5xl07 células/mL em RPMI + 0,5% de albumina de soro de bovino (BSA) . 45 pL de suspensão de células foram misturados com 5 pL de péptido de PEM concentrado 10 vezes diluído no mesmo meio de ensaio. 35 pL desta mistura foram aplicados no topo do filtro de ensaio. As células foram deixadas migrar (a 37°) para dentro da câmara do fundo da placa de ensaio contendo SDF-1 a 1 nM. Após 4 horas, o filtro foi removido e adicionou-se MTT às células que migraram até uma concentração final de 0,5 mg/mL, e incubou-se durante mais 4 horas. Após marcação com MTT, todo o meio foi removido e adicionou-se 100 pL de isopropanol + HC1 10 mM às células. A absorvência óptica a 595 nm (ABS595) foi lida utilizando um leitor de placas de Tecan Génios com software Magellan. O número de células que migraram foi determinado por 26 ΡΕ2132221 comparação dos valores de ABS595 contra uma curva padrão gerada com um número conhecido de células na placa de ensaio e foram representadas graficamente contra a concentração de SDF-1 para se obter uma curva sigmoidal e para determinar os valores da IC5o· Os valores da IC50 foram determinadas usando a função Trendline em Microsoft Excel por ajustamento de uma curva logarítmica às médias dos pontos de dados. 2.8 Plasmastabilidade 405 pL de plasma/solução de albumina foram colocados num tubo de polipropileno (PP) e fortificados com 45 pL de composto a partir de uma solução B a 100 pM, derivada de 135 pL de PBS e 15 pL de péptido 1 mM em PBS, pH 7,4. Alíquotas de 150 pL foram transferidas para poços individuais da placa de filtração de 10 kDa (membrana Millipore MAPPB 1010 Biomax). Para "controlos aos 0 minutos 270 pL de PBS foram colocados num tubo de PP e adicionou-se 30 pL de solução mãe B e agitou-se num Vortex. 150 pL de solução de controlo foram colocados dentro de um poço de uma placa de filtração e serve como "controlo filtrado".

Mais 150 pL de solução de controlo foram colocados directamente num poço receptor (reservado para filtrado) e serve como "controlo não filtrado". A totalidade da placa incluindo a tampa de evaporação foi incubada durante 60 min a 37°C. As amostras de plasma (plasma de 27 ΡΕ2132221 rato: Harlan Sera lab UK, plasma humano: Blutspendezentrum Ziirich) foram centrifugadas durante pelo menos 2 h a 4300 rpm (3500 g) e 15°C para se obter 100 yL de filtrado. Por amostras "de albumina sérica" (preparadas de fresco a partir de albumina humana: Sigma A-4327, albumina de rato: Sigma A-6272, todas numa concentração de 40 mg/mL em PBS) é suficiente aproximadamente 1 hora de centrifugação. Os filtrados na placa de PP receptora foram analisados por LC/MS como se segue: Coluna: Júpiter C18 (Phenomenex) , fases móveis: (A) ácido fórmico a 0,1% em água e (B) acetonitrilo, gradiente: 5%-100% de (B) em 2 minutos, ionização por electropulverização, detecção MRM (quadrupólo triplo). As áreas dos picos foram determinadas e fez-se a média dos valores em triplicado. A ligação é expressa em percentagem do controlo 1 e 2 (ponto de tempo de 0 minutos, filtrado e não filtrado) por: 100-(100*T6o/To) . A média destes valores é depois calculada (ver ref. 9 adiante). 3.0 Estudos in vivo 3.1. Dose máxima tolerada em ratinhos a) O composto do Exemplo 1, disperso em água para injecção ou soro fisiológico a 0,9%), foi administrado, no estudo preliminar, por injecção intravenosa a níveis de dose de 35, 50, 70, 85, 100, 150, 250 ou 500 mg/kg a grupos consistindo num ratinho macho e um ratinho fêmea (Cri:CD1(ICR)). Além disso, dois grupos compreendendo dois machos e duas fêmeas de ratinhos receberam níveis de dose de 90 e 100 mg/kg, respectivamente, e o nível de dose de 50 28 ΡΕ2132221 mg/kg foi repetido num grupo compreendendo um macho e uma fêmea. b) Os estudos de dose máxima tolerada (MTD) realizados com o composto do Exemplo 2 utilizando ratinhos CDl (3 ratinhos/grupo) e foram efectuados utilizando administração i.v., ip e administração sc. 3.2 Estudos de toxicidade repetida em ratinhos A toxicidade e toxicocinética do composto do Exemplo 1 foi investigada após uma injecção i.v. diária no ratinho durante pelo menos 14 dias. Grupos de 12 ratinhos machos e 12 fêmeas Crl:CDl(ICR) receberam preparações de doses contendo produto de controlo (tampão de di-hidrogeno ortofosfato de sódio 50 mM contendo cloreto de sódio a 0,9% p/v) ou 8, 24, ou 40 mg/kg/dia de POL6326 num volume de dose de 5 mL/kg. Grupos satélite de 24 animais por sexo por grupo foram incluidos em cada nivel de dose. A avaliação da toxicidade foi com base na mortalidade, sinais clinicos, pesos corporais, consumo de alimentos, exames oftálmicos, patologia clinica e anatómica, e avaliações toxicociné-ticas. 3.3 Mobilização de células estaminais a) Modelo do ratinho: O objectivo do estudo foi avaliar a capacidade do composto do Exemplo 1 e Exemplo 2 para mobilizar progenito- 29 ΡΕ2132221 res hematopoiéticos de medula óssea de ratinho para sangue periférico, utilizando ensaios de colónias hematopoiéticas in vitro. Em seres humanos, informação exacta sobre a mobilização de células progenitoras é proporcionada pelo ensaio de unidades formadoras de colónias de granulócitos-monócitos (CFU-GM) ou por determinação da abundância de células CD34(+) por análise FACS (ver ref. 10 adiante). Em ratinhos, CD34 não é um marcador útil para células estami-nais; em vez disso, é mais vulgarmente utilizado o CFU-GM (ver ref. 11 adiante).

De modo a avaliar a capacidade dos compostos do Exemplo 1 e Exemplo 2 para mobilizar células estaminais murinas (CFU-GM) ratinhos fêmeas C3H/Hej (Jackson Labora-tory) foram injectados s.c. com 5 mg/k dos compostos do Exemplo 1 e do Exemplo 2 e como referência AMD3100 (Broxmeyer et al., J. Exp. Med. 201, 1307-1318), (actual-mente a ser submetido a ensaios clínicos de Fase III) para a mobilização de células estaminais. Amostras de sangue periférico de 5 animais por grupo de teste foram recolhidas em cada ponto de tempo e as contagens de células nucleadas foram realizadas como ensaios correntes. b) Modelo do macaco:

Realizou-se uma avaliação da mobilização de células estaminais hematopoiéticas de sangue periférico em macacos cynomolgus (Macaca fascicularis) . O composto do 30 ΡΕ2132221

Exemplo 1 foi administrado a 4 macacos (2 machos e 2 fêmeas) na forma de uma injecção i.v. bolus lenta durante 2 minutos e as células CD34(+) foram determinadas por análise por FACS. Também foi realizada amostragem de sangue toxico-cinética. 4.0. Resultados em 2.2-2 .

Os resultados das experiências descritas 2.8 acima estão indicados nas seguintes Tabelas 1 e

Tabela 1

Ex. IC50 (nM) Ensaio de Ca2+ FIGS IC50 (nM) Citotoxicidade LD50/GI50 Células Hela Hemólise a 100 μΜ IC50 (μΜ) Ensaio de migração de células 1 5,5 n.d. >50 0,6 n.d. 2 4,1 24,7 94 0,3 0,5 n.d.: não determinado

Tabela 2

Ex. Estabilidade em plasma humano ty2 (min) Estabilidade em plasma de rato t,1/2 (min) 1 >240 >240 2 >300 >300

Os resultados da experiência descrita em 3.1-3.3 são aqui apresentados adiante. 31 ΡΕ2132221 4.1: Estudo da MTD em ratinhos a) Estudo da MTD, composto do Exemplo 1

Verificou-se que o nível de dose intravenosa letal mínima aguda do Ex. 1 no ratinho excedia 90 mg/kg. b) Estudo da MTD, composto do Exemplo 2 A dose mais elevada testada, para todas as três vias de administração foi 120 mg/kg bolus. A esta dose todos os animais sobreviveram e apenas foram observados sintomas leves. Os sintomas apresentados foram ligeira depressão comportamental, ligeira cianose, um aumento da profundidade respiratória e relaxação muscular. 4.2: Estudo da toxicidade de injecção intravenosa durante 14 dias e da toxicocinética O nível NOAEL para o composto do Exemplo 1 após administração i.v. no ratinho foi de 40 mg/kg/dia. Não houve nenhum efeito assinalável do tratamento sobre o peso corporal, alteração do peso corporal ou consumo de alimentos, ou sobre as observações oftálmicas durante a semana final da fase de administração. 32 ΡΕ2132221 A administração do composto do Exemplo 1 foi associada a contagens de leucócitos e linfócitos absolutos moderadamente mais elevadas para fêmeas tratadas com 40 mg/kg/dia. Os machos tratados com 40 mg/kg/dia não foram afectadas de modo semelhante, e estes efeitos minoritários não foram considerados adversos. Os resultados da química clínica não foram afectados pela administração do composto do Exemplo 1. Os aumentos dos pesos de órgãos (rins em machos tratados com 8 mg/kg/dia e vesículas seminais em machos tratados com 24 ou 40 mg/kg/dia) foram considerados acidentais e não relacionadas com o tratamento. Não foram registadas lesões graves relacionadas com os produtos de teste. Três animais (1 fêmea do grupo de controlo, 1 macho a 8 mg/kg/dia e 1 fêmea a 24 mg/kg/dia) tinham uma área de crosta vermelha, focal, no local da injecção (cauda), que foi o resultado de picadas de agulha hipodérmica. Não foram observadas lesões microscópicas relacionadas com os produtos de teste. 4.3: Mobilização de células estaminais a) Mobilização de células estaminais em ratinhos, composto do Exemplo 1: A administração de 5 mg/kg do composto do Exemplo 1 aumentou o número de células de sangue CFU-GM, com um efeito máximo aos 120 minutos e regresso aos níveis da linha de base 6 h após a administração. (Figura 1) . No 33 ΡΕ2132221 mesmo ensaio, utilizou-se AMD3100 (actualmente a ser submetido a ensaios clínicos de Fase III para a mobilização de células estaminais) como um comparador. Num estudo de acompanhamento, determinou-se a resposta à dose do Ex. 1 na libertação de CFU-GM (Figura 1) . Existe um efeito claro de resposta à dose do Ex. 1 na libertação de CFU-GM em ratinhos com um aumento do nível de pico a 5 mg/kg.

Figura 1. Aumento de unidades formadoras de colónias por mL de sangue (CFU-GM) ao longo do tempo para ambos o composto do Exemplo 1 (5 mg) e o composto de referência AMD3100. b) Mobilização de células estaminais em ratinhos, composto do Exemplo 2: A administração de 5 mg/kg do composto do Exemplo 2 aumentou o número de células sanguíneas CFU-GM até seis horas após a administração com um efeito máximo aos 240 minutos, ao passo que a administração de AMD3100 está associada a um aumento da frequência e número de progenitores aos 30 e 60 minutos em comparação com ratinhos de controlo (Figura 2).

Figura 2. Aumento de unidades formadoras de colónias por mL de sangue (CFU-GM) ao longo do tempo, tanto para o composto do Exemplo 2 como para o composto de referência AMD3100. 34 ΡΕ2132221 c) Mobilização de células estaminais no macaco, composto do Exemplo 1: A administração do composto do Exemplo 1 induziu a mobilização de células hematopoiéticas CD34(+) em macacos cynomolgus. Tal como observado em ratinhos, o inicio da mobilização foi rápido com um nivel de pico às duas horas. A mobilização também foi transitória e os números de células estaminais no sangue periférico regressaram ao nivel da linha de base com decréscimo dos níveis plasmáticos do composto do Exemplo 1 (Figura 3).

Figura 3. Número médio de células CD34(+) por pL de sangue ao longo do tempo para o composto do Exemplo 1

Referências 1. Oberlin E., Amara A., Bachelerie F., Bessia C., Virelizier J-L, Arenzana-Seisdedos F., Schwartz 0., Heard J-M, Clark-Lewis I., Legler D. F., Loetscher M., Baggiolini M., Moser B. Nature. 1996. 352:833-835 2. Loetscher M., Geiser T., 0'Reilly T., Zwalen R., Baggiolini M., Moser B. J. Biol. Chem. 1994. 269:232-231 3. D'Apuuo M., Rolink A., Loetscher M., Hoxie J. A., Clark-Lewis I., Melchors F., Baggiolini M., Moser B. Eur. J. Immunol. 1997. 27:1788-1793 35 ΡΕ2132221 4. von Tscharner V., ProcThom B., Baggiolini M., Reuter H. Nature. 1986. 324:369-72. 5. Hamy F., Felder E. R., Heizmann G., Lazdins J., Aboul-ela F., Varani G., Kara J., Klimkait T. Proc. Natl. Acad. Sei. 1997. 94:3548-3553. 6. Mossman T. J Immunol. Meth. 1983, 65:55-63 7. Berridge Μ. V., Tan A. S. Arch. Biochem. Biophys. 1993, 303 :474-482 8. Frevert C. W., Wong V. A., Goodman R. V., Goodwin R., Martin T. R., J. Immunol. Meth. 1998. 213:41-52 9. Singh R., Chang, S. Y., Talor, L. C., Rapid Commun. Mass Spectrom., 1996, 10:1019-1026 10. To L. B., Haylock D. N., Simmons P. J., Juttner C. A. Blood 1997, 89(7):2233-2258. 11. Broxmeyer Η. E., Orschell C. M., Clapp D. W., Hangoc G., Cooper S., Plett P. A. et al. J. Exp. Med. 2005. 201(8):1307-1318.

Lisboa, 19 de Outubro de 2010

Claims (9)

1. ΡΕ2132221 1 REIVINDICAÇÕES 1. Ciclo(-Tyr-His-X-Cys-Ser-Ala-DPro-Dab-Arg-Tyr-Cys-Tyr-Gln-Lys-DPro-Pro), ligação dissulfureto entre Cys4 e Gysll, e os seus sais farmaceuticamente aceitáveis, em que X é Ala ou Tyr.
2. 2. Compostos de acordo com a reivindicação 1, para utilização como substâncias terapeuticamente activas.
3. 3. Compostos de acordo com a reivindicação 1 que têm actividade antagonizante de CXCR4 e são úteis para a prevenção de infecções por VIH em indivíduos saudáveis ou para retardar e interromper a progressão do vírus em doentes infectados; ou onde o cancro é mediado ou resultante de actividade de receptores de CXCR4; ou onde doenças imuno-lógicas são mediadas ou resultantes de actividade dos receptores de CXCR4; ou para o tratamento de imunossu-pressão; ou para o tratamento de inflamação, ou para a mobilização de células estaminais de células estaminais de sangue periférico e/ou células estaminais mesenquimatosas (MSC) e/ou outras células estaminais cuja retenção depende dos receptores de CXCR4.
4. 4. Composição farmacêutica contendo um composto de acordo com a reivindicação 1 e um veículo farmaceuti-camente inerte. 2 ΡΕ2132221
5. 5. Composições de acordo com a reivindicação 4 numa forma adequada para administração oral, tópica, trans-dérmica, por injecção, bucal, transmucosas, pulmonar ou por inalação.
6. 6. Composições de acordo com a reivindicação 4 ou 5 na forma de comprimidos, drageias, cápsulas, soluções, líquidos, geles, emplastros, cremes, unguentos, xaropes, pastas, suspensões, pulverizador, nebulizador ou supositórios.
7. 7. Utilização de compostos de acordo com a reivindicação 1 para o fabrico de um medicamento antagoni-zante de CXCR4.
8. 8. Utilização de acordo com a reivindicação 7, em que o referido medicamento antagonizante de CXCR4 se destina a ser utilizado para a prevenção de infecções por VIH em indivíduos saudáveis ou para retardar e interromper a progressão do vírus em doentes infectados; ou onde o cancro é mediado por ou resultante da actividade dos receptores de CXCR4; ou onde doenças imunológicas são mediadas ou resultante da actividade de receptores de CXCR4; ou para o tratamento de imuno supressão; ou para a mobilização de células estaminais de células estaminais de sangue periférico e/ou células estaminais mesenquimatosas (MSC) e/ou outras células estaminais que dependem da retenção dos receptores de CXCR4. 3 ΡΕ2132221
9. 9. Processo para o fabrico de compostos de acordo com a reivindicação 1 que compreende De acordo com a invenção, os anteriormente referidos pept idomimét icos de gancho β e os seus sais farmaceuticamente aceitáveis podem ser preparados por um processo que compreende (a) acoplamento de um suporte sólido adequada mente funcionalizado com um derivado de Pro N-protegido apropriadamente; (b) remoção do grupo protector de N do produto obtido no passo (a); (c) acoplamento do produto assim obtido com um derivado de DPro N-protegido apropriadamente; (d) remoção do grupo protector de N do produto assim obtido; (e) acoplamento do produto assim obtido com um derivado N-protegido apropriadamente do amino ácido que no produto final desejado está na posição 14, i.e. Lys, estando analogamente o grupo amino presente na sua cadeia lateral protegido apropriadamente; (f) remoção do grupo protector de N do produto assim obtido; 4 ΡΕ2132221 (g) efectuar passos substancialmente correspondentes aos passos (e) e (f) utilizando derivados N-protegi-dos apropriadamente dos aminoácidos que no produto final desejado estão nas posições 13 a 1, i.e. Gin, Tyr, Cys, Tyr, Arg, DAB, DPro, Ala, Ser, Cys, Ala ou Tyr, His e Tyr, estando qualquer grupo funcional que pode estar presente nos referidos derivados de aminoácidos N-protegidos igualmente protegidos de modo apropriado; (h) formar a ligação dissulfureto de cadeia β entre as cadeias laterais dos resíduos de Cys nas posições 4 e 11; (i) separar o produto assim obtido do suporte sólido; (j) ciclizar o produto clivado do suporte sólido; (k) remover quaisquer grupos protectores presentes em grupos funcionais de quaisquer membros da cadeia de resíduos de aminoácidos; e (l) se desejado, converter o produto assim obtido num sal farmaceuticamente aceitável ou converter um sal farmaceuticamente aceitável, ou inaceitável, assim obtido no correspondente composto livre ou num sal diferente, farmaceuticamente aceitável. Lisboa, 19 de Outubro de 2010