PT2032708E - Novirhabdovirus recombinantes e suas utilizações - Google Patents

Description

ΡΕ2032708 1 DESCRIÇÃO "NOVIRHABDOVIRUS RECOMBINANTES E SUAS UTILIZAÇÕES" A presente invenção relaciona-se com a utilização de Novirhabdovirus como um vector de genes, para produzir proteínas recombinantes, ou para a produção de vacinas úteis em peixe ou em vertebrados superiores.

Novirhabdovirus são vírus de ARN de cadeia negativa da família Rhabdoviridae. 0 género Novirhabdovirus compreende diversas espécies patogénicas para animais aquáticos, em particular para peixes. A estrutura do genoma de Novirhabdovirus é semelhante ao de Rhabdovirus de mamíferos, mas difere deste pela presença de um gene adicional, que codifica para uma proteína não estrutural, chamada proteína NV (de "não-virião"), cuja função actualmente permanece desconhecida. 0 genoma de Novirhabdovirus compreende seis genes, a organização dos quais pode ser representada esquematicamente como se segue: 3'-N-P-M-G-NV-L-5 2 ΡΕ2032708 N representa ο gene que codifica para a nucleo-proteína do virus associado ao ARN virai, P representa o gene que codifica para a fosfoproteina associada à polimerase virai, M representa o gene que codifica para a proteína de matriz, G representa o gene que codifica para a glicoproteína do envelope G, NV representa o gene que codifica para a proteína NV, e L representa o gene que codifica para a polimerase virai de ARN dependente de ARN.

Estes genes estão separados por regiões intergé-nicas: cada um deles compreende um sinal de terminação da transcrição/poliadenilação, e um sinal de iniciação da transcrição, que permitem a transcrição dos genes em mARNs individuais, separadas por um dinucleótido intergénico não transcrito. A espécie tipo do género o Vírus de Necrose Hematopoiética Infecciosa (IHNV), que é o agente etiológico de uma doença grave em várias espécies de salmonídeos, principalmente em trutas com menos de um ano. Outras espécies do género incluem rhabdovirus de Hirame (VFC), Vírus da Septicemia Hemorrágica Virai (VHS), e rhabdovirus do peixe cabeça-de-cobra (SKRV). A sequência genómica completa de IHNV está disponível no GenBank com o número de acesso L40883; a sequência genómica completa de VHSV está disponível no GenBank com o número de acesso Y18263; a sequência genómica completa de HRV está disponível no GenBank com o número de acesso AF104985; a sequência 3 ΡΕ2032708 genómica completa de SKRV está disponível no GenBank com o número de acesso AF147498.

Novirhabdovirus recombinantes podem ser obtidos por engenharia genética reversa, por co-transfecção de uma célula hospedeira com um ADN complementar antigenómico (cADN antigenómico) , isto é, uma cópia de sentido positivo do genoma virai, e com as moléculas de ADN que codificam para as proteínas virais N, P e L (BIACCHESI et ai., J Virol, 74, 11247-53, 2000), e modificar o seu genoma.

Esta abordagem também permitiu diferentes modificações no genoma de Novirhabdovirus. Por exemplo, tem sido mostrado que o gene NV do vírus NHI pode ser eliminado e substituído por um gene estranho (BIACCHESI et ai, 2000, citado acima;. THOULOUZE et ai, J Virol, 78, 4098-107, 2004; PCT WO 03/097090). Foi também demonstrado que seria possível substituir as proteínas estruturais principais (M e G) de IHNV com aquelas de VHSV (BIACCHESI et ai., J Virol, 76, 2881-9, 2002).

Também foi tentado inserir um gene adicional num Novirhabdovirus (BIACCHESI, Tese de Doutoramento: " GEN-ERATION DE RHABDOVIRUS AQUATIQUES RECOMBINANTS PAR GENETIQUE INVERSE", Universidade de Paris XI Orsay, 05 de Abril de 2 002) . Uma construção de ADN que contém um gene estranho (que codifica para a IL-1-β da truta arco-íris), flanqueado por um sinal de iniciação da transcrição e um sinal de terminação da transcrição/poliadenilação reconhe- 4 ΡΕ2032708 eidos pela polimerase L virai, foi inserida no cADN de IHNV, na região intergénica entre os genes M e G de IHNV. Mais especificamente, uma vez que este gene foi introduzido num local de restrição EagI de ocorrência natural situado entre o fim da ORF M e o sinal de terminação da transcrição do gene M, esta construção compreendeu uma sequência (CCAAGACAGAAAAAAATGGCAC; SEQ ID NO: 1) que consiste no local de terminação da transcrição/poliadenilação previsto do gene M de IHNV (CCAAGACAGAAAAAAA, SEQ ID NO: 2) seguido pelo dinucleótido intergénico não transcrito TG e pela sequência de iniciação de transcrição GCAC, sendo a referida sequência imediatamente seguida pela ORF da IL-1-β flanqueada em 5' por um local de restrição Spel, e em 3' por um local de restrição Smal. 0 virus recombinante (IHNV-IL-1) assim obtido foi capaz de se multiplicar normalmente em cultura de células e foi tão patogénico em trutas arco-íris juvenis como o tipo selvagem IHNV. No entanto, apenas se detectou o mARN de IL-1 -β, mas não a proteína IL-1-β nas células infectadas. Por outro lado, um IHNV recombinante semelhante, contendo um gene que codifica para a proteína verde fluorescente (GFP), acompanhado pelo mesmo sinal de iniciação da transcrição e o mesmo sinal de terminação da transcrição/poliadenilação da foi capaz de expressar a GFP em células infectadas (Bremont, Current Topics in Microbiology and Immunology 292: 119-141, 2005) .

Os inventores descobriram agora que quando a 5 ΡΕ2032708 sequência de iniciação de transcrição GCAC divulgado por BIACCHESI ou BREMONT é substituído pela sequência GCACTTTTGTGC (SEQ ID NO: 3), o gene adicional é não só transcrito mas também traduzido, independentemente da sua natureza, permitindo a expressão de uma ampla gama de proteínas estranhas. A presente invenção proporciona, assim, novirha-bdovirus recombinantes tendo uma ou mais unidades de transcrição adicionais inseridos em, pelo menos, uma das regiões intergénicas do genoma de um hospedeiro novirhabdovirus. A invenção também proporciona construções de ADN recombinante que permitem a obtenção dos referidos novirhabdovirus recombinantes.

Uma "unidade de transcrição" (também aqui designada por um "cistrão") é aqui definida como uma construção de ADN que compreende um sinal de iniciação da transcrição, seguido por uma ORF que codifica para uma proteína de interesse, e por um sinal de terminação da transcrição/poliadenilaçâo. A invenção refere-se a uma construção de ADN recombinante que compreende: a) uma região que compreende uma sequência de terminação da transcrição/poliadenilação de um gene M de novirhabdovirus, sendo a referida região definida pela sequência seguinte: VHHAGAYAGAAAAAAA (SEQ ID NO: 4), em que A, T, G, V, H, e Y têm os seus significados usuais no código de nucleótidos da IUPAC; 6 ΡΕ2032708 b) uma região que compreende uma sequência de iniciação da transcrição de um gene G de novirhabdovirus, sendo a referida região definida pela sequência seguinte: GCACDWKWGTGY (SEQ ID NO: 5), em que A, T, G, C, D, W, K e Y têm os seus significados usuais no código de nucleótidos da IUPAC; em que a referida região a) é seguida ou a referida região b) é precedida por um dinucleótido não transcrito intergénico de um novirhabdovirus, c) uma zona que compreende uma grelha de leitura aberta que codifica para uma proteína de interesse. A sequência de terminação/poliadenilação da região a) e a sequência de iniciação da região b) podem ser derivadas de um mesmo gene ou a partir de dois genes diferentes de um novirhabdovirus. De preferência, são derivadas de um ou dois gene(s) dos novirhabdovirus em que se pretende inserir a construção. 0 dinucleótido intergénico não transcrito é de preferência escolhido entre TG e CG.

De acordo com uma realização preferida, a sequência de terminação/poliadenilação da região a) e a sequência de iniciação da região b) são derivadas dos novirhabdovirus em que se pretende inserir a construção, e de preferência são, respectivamente, derivados do gene M e G do referido novirhabdovirus. 7 ΡΕ2032708

Por exemplo, se se pretende inserir a construção em IHNV, a sequência de terminação/poliadenilação será CCAAGACAGAAAAAAA (SEQ ID NO: 2), e a sequência de iniciação de transcrição será GCACTTTTGTGC (SEQ ID NO: 3).

Da mesma forma, se se pretender inserir a construção em VHSV, a sequência de terminação/poliadenilação será ATTAGATAGAAAAAAA (SEQ ID NO: 6), e a sequência de iniciação de transcrição será GCACATTTGTGT (SEQ ID NO: 7); se se pretende inserir a construção em HRV, a sequência de terminação/poliadenilação será ATCAGATAGAAAAAAA (SEQ ID NO: 8), e a sequência de iniciação de transcrição será GCACATTTGTGT (SEQ ID NO: 7); se se pretende inserir a construção em SKRV, a sequência de terminação/poliadenilação será GAAAGACAGAAAAAAA (SEQ ID NO: 9), e a sequência de iniciação da transcrição será GCACGAGAGTGC (SEQ ID NO: 10).

Na região c) a grelha de leitura aberta que codifica para o polipéptido de interesse pode ser opcionalmente fundida com uma grelha de leitura aberta que codifica para uma proteína de estrutura de novirhabdovirus (isto é N, P, M, ou G) , de preferência a proteína N. A fusão permite a incorporação do polipéptido de interesse na partícula de novirhabdovirus. De preferência, a extremidade N do polipéptido de interesse é fundida com a extremidade C da referida proteína de estrutura de novirhabdovirus.

No entanto, quando a proteína de interesse, que é ΡΕ2032708 expressa num novirhabdovirus da invenção é uma proteína de membrana, tal como uma glicoproteína de membrana de um vírus com envelope, pode ser incorporada na partícula virai, sem necessidade de fundi-la a uma proteína de estrutura de novirhabdovirus. A ordem das regiões a) b) e c) na construção de ADN depende da posição em que se pretende inserir na referida construção a região intergénica do novirhabdovirus hospedeiro.

Se se pretende inserir a construção entre a extremidade de uma ORF endógena e o sinal de terminação da transcrição/poliadenilação do gene endógeno correspondente, a ordem será a-b-c. Neste caso, a transcrição do gene endógeno irá ser terminada na sequência de terminação/po-liadenilação da região a) da construção, e a transcrição da ORF que codifica para a proteína de interesse será iniciada na sequência de iniciação da região b) da construção e terminada no sinal de terminação/poliadenilação endógeno do gene endógeno.

Se se pretende inserir a construção entre o sinal de iniciação da transcrição e o codão de iniciação de um gene endógeno, a ordem será c-a-b. Neste caso, a transcrição da ORF que codifica para a proteína de interesse será iniciada no sinal de iniciação do gene endógeno, e terminado na sequência de terminação/poliadenilação da região a) , e a transcrição do gene endógeno irá ser iniciada na sequência de iniciação da região b) da construção. 9 ΡΕ2032708

Se se pretende inserir a construção entre o sinal de terminação da transcrição/poliadenilação de um primeiro gene endógeno, e o sinal de iniciação da transcrição de um segundo gene endógeno, a ordem será b-c-a. Neste caso, a transcrição da ORF que codifica para a proteína de interesse será iniciada na sequência de iniciação da região b), e terminada com a sequência de terminaçâo/poli-adenilação da região a) da construção. A presente invenção também proporciona um cADN antigenómico do genoma de um novirhabdovirus, caracterizado pelo facto de conter uma ou mais construções de ADN recombinantes da invenção inseridas numa porção do referido cADN compreendida entre o codão de paragem de uma primeira ORF endógena e o codão de iniciação de uma segunda ORF endógena de um novirhabdovirus hospedeiro.

De acordo com uma realização preferida, r 0 referido cADN antigenómico contém duas construções da invenção inseridas numa porção do referido cADN compreendida entre o codão de paragem de uma primeira ORF endógena e o codão de iniciação de uma segundo ORF endógena; de acordo com ainda uma outra realização preferida, o referido cADN antigenómico contém três construções da invenção inseridas numa porção do referido cADN compreendida entre o codão de paragem de uma primeira ORF endógena e o codão de iniciação de uma segunda ORF endógena. 10 PE2032708

De preferência, a primeira ORF endógena é a ORF M, e a segunda ORF endógena é a ORF G. A presente invenção também proporciona um novirhabdovirus recombinante contendo um genoma de ARN complementar a um ADN antigenómico da invenção. A invenção também se refere ao uso de novirhabdovirus recombinantes tendo uma ou mais unidades de transcrição inseridas em pelo menos uma das regiões intergénicas do genoma de um novirhabdovirus hospedeiro, para produzir proteínas de interesse em células de vertebrados (de preferência células de peixes) em cultura, e/ou para a obtenção de vacinas.

Os inventores descobriram que, quando contendo uma construção, os novirhabdovirus da invenção são capazes de se multiplicar normalmente em células de peixe em cultura e de manter a sua capacidade patogénica. Quando uma segunda construção é adicionada, a capacidade de se multiplicar em culturas de células é conservada, ao passo que a patogenicidade é diminuída. A adição de uma terceira construção não tem nenhum efeito significativo sobre a capacidade de multiplicação em cultura de células; tipicamente, o novirhabdovirus recombinante da invenção, compreendendo uma, duas, ou três construções, pode ser produzido em culturas de células em títulos > 108 ufp/mL. Por outro lado, os novirhabdovirus recombinantes da inven- 11 ΡΕ2032708 ção, compreendendo três construções têm uma patogenicidade consideravelmente reduzida.

Para a produção de proteínas de interesse em células em cultura, pode-se utilizar um novirhabdovirus contendo uma ou mais construções, de preferência duas ou três construções. A utilização de um novirhabdovirus da invenção com duas ou mais construções é de particular interesse quando se deseja expressar simultaneamente vários polipéptidos, por exemplo, subunidades de uma mesma enzima, ou um precursor inactivo de uma proteína activa, e uma segunda proteína capaz para converter o referido precursor na forma activa. No desenvolvimento de vacinas alguns epitopos protectores são formados apenas quando dois ou mais polipéptidos são expressos simultaneamente. A utilização de um novirhabdovirus da invenção irá permitir a expressão de tais polipéptidos de modo a formar os epitopos protectores.

Além disso, tal como divulgado acima, o facto das proteínas expressas poderem ser incorporadas na partícula virai, é de especial interesse para a produção de vacinas.

Novirhabdovirus da invenção contendo três ou mais construções podem ser utilizados como vacinas vivas atenuadas, para a vacinação de peixes, para salmonídeos exemplo no caso de IHNV e VHSV. podem ser com vantagem 12 ΡΕ2032708 administrados por balneação, ou seja, por simples adição da vacina à água no tanque de reprodução contendo os animais a serem imunizados.

Alternativamente, os novirhabdovirus recombinan-tes ou as células que produzem o virus podem ser utilizados como vacina inactivada em peixes.

Os novirhabdovirus recombinantes da invenção, e em particular aqueles que se replicam a baixas temperaturas, tais como de IHNV e VHSV, podem também ser usados como sistema de administração de antigénio não replicativo para a vacinação de animais vertebrados superiores, tais como aves e mamíferos. Os inventores, de facto, observaram que quando um IHNV recombinante da invenção que expressa um antigénio estranho é injectado num mamífero, o referido vírus é completamente incapaz de se replicar no referido mamífero, e, por outro lado, uma resposta imune forte é gerada contra o antigénio estranho incorporado na partícula virai, em completa ausência de adjuvantes adicionais.

Os inventores também descobriram que novirhabdovirus que se replicam a temperaturas baixas (14 a 20 °C), tal como de IHNV e VHSV, são particularmente adequados para a produção de proteínas termossensíveis que são difíceis de produzir em hospedeiros de expressão clássicos, tais como E. coli, baculovírus, levedura, que geralmente requerem temperaturas de pelo menos 25-30 °C durante o seu 13 ΡΕ2032708 crescimento. São, por exemplo, de especial interesse para a produção de proteínas imunoprotectoras in vitro, úteis como componentes de vacinas. Muitas destas proteínas, especialmente aquelas que originadas a partir de organismos patogé-nicos de peixe, não podem ser expressas ou enroladas para a estrutura correcta à temperatura convencional da maioria dos sistemas de expressão baseados em bactérias, leveduras, eucariotas e baculovírus.

Assim, um objecto da invenção é a utilização de um IHNV ou VHSV recombinante que compreende uma sequência heteróloga que codifica para uma proteína antigénica de interesse, para expressar a referida proteína in vitro num sistema de expressão a baixa temperatura. A invenção proporciona, assim, um sistema de expressão in vitro a baixa temperatura, caracterizado pelo facto do referido sistema de expressão compreender um IHNV ou VHSV recombinante que compreende pelo menos uma sequência heteróloga que codifica para uma proteína antigénica de interesse de acordo com a invenção, e uma célula de vertebrado susceptível de infecção pelo referido vírus recombinante e capaz de crescimento a uma temperatura baixa. A invenção também fornece um método para a expressão in vitro de uma proteína antigénica de interesse, compreendendo o referido método: - infectar uma célula de vertebrado susceptível de infecção por IHNV ou VHSV e capaz de crescimento a uma temperatura 14 ΡΕ2032708 baixa com um IHNV ou VHSV recombinante que compreende pelo menos uma sequência heteróloqa que codifica para uma proteína antigénica de interesse de acordo com a invenção; - cultivar a referida célula a uma temperatura de cerca de 14 °C a cerca de 20 °C; - recuperar a proteína antigénica de interesse produzida pela referida célula.

De acordo com uma forma de realização preferida da invenção, a referida célula de vertebrado é uma célula de peixe, por exemplo, uma célula de EPC.

Pode-se utilizar um IHNV ou VHSV recombinante em que a sequência heteróloga inserida em substituição de uma sequência endógena dos novirhabdovirus hospedeiros; no entanto, de preferência, usa-se um IHNV ou VHSV recombinante em que a sequência heteróloga é inserida para além das sequências endógenas dos novirhabdovirus hospedeiros. Ainda mais preferencialmente, utiliza-se um novirhabdovirus recombinante da invenção, em que a sequência heteróloga é uma parte de uma unidade de transcrição adicional inserida numa das regiões intergénicas do novirhabdovirus hospedeiro. Um novirhabdovirus preferido é IHNV. A presente invenção será mais completamente entendida a partir da descrição mais detalhada que se segue, que se refere a exemplos não limitativos de construção e de utilização de novirhabdovirus recombinantes de acordo com a invenção. 15 ΡΕ2032708 EXEMPLO 1: CONSTRUÇÃO DE NOVIRHABDOVIRUS RECOMBINANTES COMPREENDENDO UM, DOIS, OU TRÊS CISTRÕES ADICIONAIS NA REGIÃO INTERGÉNICA M-G. A Figura 1 representa, esquematicamente, as diferentes construções descritas abaixo.

Legenda da Figura 1: A: é a construção inicial pIHN contendo o comprimento total do genoma de cADN de IHNV. Os seguintes elementos são representados para esta construção e serão omitidos nos esquemas que mostram as outras construções: T7 prom = promotor da ARN polimerase de T7, δ: sequência de ribozima hepatite delta, T7t = sequência de terminação da ARN polimerase de T7. B: pIHN-LUC. C: pIHN-X.

D: pIHN-LUC- G E: inserção gerada através da restrição de pIHN-X com EagI F: pIHN-X-LUC-AG.

G: inserção gerada através da digestão de pIHN-LUC por SpeI/ NsiI H: pIHN-X-LUC

I: inserção EagI/EagI gerada através da digestão de pIHN-Y. J: pIHN-X-Y-LUC 16 ΡΕ2032708

Construção dos cADN recombinantes:

As construções foram realizadas usando o plasmídeo pIHNV descrito por BIACCHESI et ai. (2000, citado acima. Este plasmídeo contém o cADN completo do genoma do vírus NHI, clonado a jusante do promotor da ARN polimerase do fago T7 e a montante de uma sequência de ribozima do

vírus da hepatite δ e do terminador de transcrição da ARN polimerase do fago T7, no vector pBluescript SK (Stratagene). o genoma cADN de pIHNV contém um local de restrição EagI único, localizado na região intergénica M-G. Este local de restrição é usado para inserir um cistrão adicional, que codifica para um gene de interesse, tal como esquematizado na Figura 1. No início e no fim do gene de interesse introduziram-se locais de enzimas de restrição SpeI e Smal, respectivamente, para permitir a substituição do gene de interesse por um outro gene. O plasmídeo pIHNV é esquematizado na Figura IA.

Construção de cADNs antigenómicos recombinantes com um cistrão adicional pIHN-LUC (Figura 1B): pIHN-LUC resulta da inserção do gene da cassete de expressão de luciferase de Renilla no local EagI de pIHNV. É obtido da seguinte forma: 17 ΡΕ2032708

Do gene da luciferase de Renilla foi amplificado por PCR a partir do vector pBind (Promega GenBank, número de acesso AF264722) utilizando os seguintes oligonucleótidos:

EagI Spel RnLuc: ggggCGGCCGCCAAGACAGAAAAAAATGGCACTTTTGTGCACTAGTATGACTTCGAAAGT TTATGATCCA (SEQ ID NO: 11) .

Este oligonucleótido contém o local de restrição EagI (CGGCCG), seguido pela sequência de terminação da transcrição/poliadenilação do gene M (CCAAGACAGAAAAAAA; SEQ ID NO: 2), pelo dinucleótido TG e pela sequência de iniciação de transcrição do gene L (GCACTTTTGTGC; SEQ ID NO: 3) seguido pelos últimos 24 nucleótidos a luciferase de Renilla.

EagI SmaI RnLuc: ggggCGGCCGCCCGGGTTATTGTTCATTTTTGAGAACTCG (SEQ ID NO: 12).

Este oligonucleótido contém um local de restrição EagI (CGGCCG). 0 produto de PCR foi digerido com a enzima EagI e inserido no local EagI de pIHNV, conduzindo à construção pIHN-LUC, como mostrado na Figura 2. 0 plasmideo final foi sequenciado para verificar a orientação e a sequência do fragmento EagI inserido. 18 PE2032708

Todos estes plasmídeos foram sequenciados para verificar a orientação e ou a sequência dos fragmentos inseridos. pIHN-X ou pIHN-Z (Figura 1C)

Estas construções resultam da substituição do gene da luciferase por qualquer outro gene de interesse (exemplificado por X ou Z) . São obtidas por amplificação por PCR do gene de interesse, com um conjunto de iniciadores contendo o local SpeI num lado (ou um local de restrição compatível como Nhe I) e no outro lado o local Sma I (ou um local de restrição de extremidade lisa compatível).

Para pIHN-X, o fragmento Spel/Smal contendo a grelha de leitura aberta de luciferase é substituído por um fragmento de PCR iVhel/EcoRV compatível contendo o gene de interesse X. A construção pIHN-X resultante perdeu o SpeI e os locais de restrição SmaI.

Da mesma forma a construção pIHN-Z é obtida a partir de pIHN-Luc por substituição do fragmento Spel/Smal contendo o gene Luc pelo fragmento de PCR Spel/Smal contendo o gene Z. Esta construção é denominada pIHN-Z.

Construção de cADNs antigenómicos recombinantes com dois cistrões adicionais pIHN-X-LUC (Figura 1D para 1H) 19 ΡΕ2032708 0 fragmento Smal/Agel é removido do plasmídeo pIHN-LUC, o que resulta na eliminação de um dos dois locais EagI e a deleção do gene G. A construção intermediária assim obtida é chamada pIHN-LUC-AG (Figura 1D). A cassete de expressão X é obtida por digestão com enzimas de restrição EagI de pIHN-X (Figura 1E).

Esta inserção é ligada com pIHN-LUC-AG digerido com EagI, resultando na construção pIHN-X-LUC-AG (Figura 1F) . Incidentalmente, após a ligação dos dois fragmentos EagI que conduziram à construção pIHN-X-LUC-AG, é gerado um local de restrição único Notl entre as unidades de expressão X e Luc.

Finalmente, o fragmento Spel/Nsil da construção pIHN-X-LUC-AG é substituído pelo fragmento correspondente contendo o gene G obtido da construção pIHN-LUC, por digestão com Spel/Nsil (Figura 1G). A construção resultante é denominada pIHN-X-LUC (Figura 1H) .

Construção de cADNs antigenómicos recombinantes com três cistrões adicionais pIHN-XY-LUC (Figura II e 1J) 0 plasmídeo pIHN-Y é obtido como descrito para pIHN-X. 20 ΡΕ2032708 pIHN-Y é digerido com EagI e a inserção EagI/EagI é recuperada (Figura II), e inserida em pIHN-X-LUC previamente digerido com NotI. A construção assim obtida é denominada pIHN-XY-LUC (Figura 1J).

pIHN-X-Y-Z

Esta construção é obtida por substituição do fragmento Spel/Smal de pIHN-XY-LUC contendo o gene Luc pelo fragmento Spel/Smal contendo o gene Z recuperado de pIHN-Z

Produção de vírus recombinantes:

Três plasmideos de expressão que compreendem, respectivamente, os genes que codificam para a nucleopro-teína N, a fosfoproteina P, e a ARN-polimerase dependente de L de NHI foram construídos, tal como descrito por BIACCHESI et al. (2000, publicação mencionada acima). Estas construções são respectivamente chamadas pT7-N, pT7-P e pT7-L.

Os três plasmideos pT7-N, pT7-P e pT7-L (nas doses respectivas de 0,25 pg; 0,2 pg e 0,2 pg, e qualquer dos plasmideos ρΙΗΝ-LUC, pIHN-X ou Z, pIHN-X-LUC, pIHN-X-Y-LUC, ou pIHN-X-Y-Z na dose de 1 pg são introduzidos, por transfecção na presença de lipofectamina (GIBCO-BRL), em células EPC (epitelioma papiloso da carpa) previamente infectadas com um vírus vaccinia recombinante expressando a 21 ΡΕ2032708 polimerase de ARN do fago T7 (vTF7-3, FUERST et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 92, 4477-4481, 1986).

Após a transfecção, as células são incubadas durante 5 horas a 37 °C e, em seguida, lavadas com meio de cultura MEM (sem soro) e incubadas durante 7 dias a 14 °C em meio de cultura MEM contendo 2% de soro fetal de vitelo. As células e o sobrenadante são congelados/descongelados, e clarificados por centrifugação durante 10 minutos a 10 000 rpm. O sobrenadante é utilizado a uma diluição de 1/10 para infectar uma camada de células EPC. Os virus são produzidos no sobrenadante 3-4 dias após a infecção.

Diferentes virus recombinantes INH, possuindo um, dois, ou três cistrões adicionais foram produzidos. Eles são, respectivamente, indicados nas Tabelas I, II e III abaixo.

TABELA I

rlHNV Cassete Obj ectivo CAP CAP Protecção SDV 6KE1 6KE1 Protecção SDV CAP-E3E2 CAP-E3E2 Protecção SDV E3E2 E3E2 Protecção SDV E3E2-6KE1 E3E2-6kEl Protecção SDV IL 1β IL 1β Imuno estimulação Gvhsv Gvhsv Protecção VHSV 22 ΡΕ2032708 (continuação)

rlHNV Cassete Obj ectivo AG-Gvhsv Gvhsv Protecção VHSV LUCff LUCff Bioluminescência LUCrn LUCrn Bioluminescência EGFP EGFP Proteína repórter N-LUCi N-LUC Incorporação proteína estranha N-EGFP N-EGFP Incorporação proteína estranha P-Luci P-Luci Incorporação proteína estranha P-EGFP P-EGFP Incorporação proteína estranha M-Luci M-Luci Incorporação proteína estranha M-EGFP M-EGFP Incorporação proteína estranha Gvhsv-LUC Vvhsv“LUC Incorporação proteína estranha Gvhsv-EGFP VVhsv-EGFP Incorporação proteína estranha NV-EGFP NV-EGFP Incorporação proteína estranha NVmyc NV myc Papel NV HAISav HA ISAV Protecção ISAV F5isav F5 ISAV Protecção ISAV VP2ipnv VP2 IPNV Protecção IPNV VP2ibdv VP2 IBDV Protecção IBDV

TABELA II

rlHNV Ia cassete 2a cassete Objectivo 2C Gvhsv/LUC Gvhsv LUC Protecção VHSV/Bioluminescência 2C VP2/LUC VP2 IPNV LUC Protecção IPNV/Bioluminescência 2CHA/LUC HA ISAV LUC Protecção ISAV/Bioluminescência 2C HA/CAP-E3E2 HA ISAV CAP-E3E2 Protecção SDV/ISAV 2C HA/E3E2-6KE1 HA ISAV E3E2-6KE1 Protecção SDV/ISAV ΡΕ2032708 23

TABELA III

rlHNV Ia cassete 2a cassete 3a cassete Cbjectivo 3C2 G^/HA/LUC GOev VP2 IHSIV LUC Protecção IHNV/VHS/IENV 3C GVhsv/IL Ιβ/LUC Gwbv IL 1β LUC Imunostimul. IHNV/VHS 3C1 HA/F5/LUC HA ISAV F5 ISAV LUC Protecção IHNV/ISAV 3C3 HA/VP2/LUC HA ISAV VP2 IPNV LUC Protecção IENV, IHNV/ISAV 3C20 HA ILIB/LUC HA ISAV ILlfi LUC Imuno-estimulação e protecção IHNV/ISAV. 3C14 HA/VP2/CAP-E3E2 HA ISAV VP2 IPNV CAP-E3E2 Protecção IHNV/ISAV/IENV/SDV 3C15 HA/VP2/E3E2-6KE1 HA ISAV VP2 IPNV E3E2-6KE1 Protecção IHNV/ISAV/IENV/SDV 3C10 HA/F5/CAP-E3E2 HA ISAV F5 ISAV CAP-E3E2 Protecção IHNV/ISAV/VHSV legenda das tabelas SDV: Vírus da doença do sono ISAV: Vírus da Anemia Infecciosa do Salmão VHSV: Vírus da Septicemia Hemorrágica Virai tptiv· vírus Doença de Gmboco IENV: Vírus da necrose pancreática infecciosa 6KE1: gene da glicoproteína SDV EI CAP: gene da cápside SDV E3E2: gene da glicoproteína SDV E2 EGFP: Proteína fluorescente verde reforçada F5: gene F de ISAV Gvesy: Gene da glicoproteína G de VHSV HA: gene HA de ISAV IL 1β: Interleucina 1 da truta arco-íris LUCW: Luciferase do pirilampo 1110«: luciferase Renilla VP2: gene VP2 de IENV AG: deleção do gene G de IHNV 24 ΡΕ2032708 EXEMPLO 2: MULTIPLICAÇÃO EM CULTURA DE CÉLULAS DE NOVIRHABDOVIRUS RECOMBINANTES, COMPREENDENDO UM, DOIS, OU TRÊS CISTRÕES ADICIONAIS. São constituídos lotes virais de cada um dos vírus produzidos através de passagens sucessivas em cultura de células (EPC) do sobrenadante tomado 7 dias após a transfecção (PO sobrenadante). As células são infectadas com 1/100 diluição do sobrenadante clarificado. Após três passagens, os sobrenadantes são removidos, quando a camada de células é destruída pelo efeito citopático do vírus; o que geralmente ocorre 3-6 dias pós-infecção. Os lotes virais são então titulados por diluição limitante. A Figura 3 mostra exemplos do título virai de vários vírus recombinantes em cultura de células EPC. Embora o título virai para todos os vírus recombinantes estar na mesma gama (108 UFP/mL), os vírus recombinantes que compreendem três unidades de expressão adicionais têm um crescimento mais lento em comparação com o vírus nativo. Em geral leva seis dias para obter um efeito citopático completo em células EPC em vez do três dias para o tipo nativo IHNV. EXEMPLO 3: EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES DE INTERESSE NO NOVIRHABDOVIRUSES DA INVENÇÃO.

Proteínas de interesse foram produzidas utilizando as IHNVs recombinantes compreendidas nas Tabelas I, II, e III. 25 ΡΕ2032708 IHNV Recombinante que expressa as proteínas estruturais do Vírus da Doença do Sono Células EPC são infectadas com IHNV nativo, IHNV-6KE1, IHNV-CapE3E2, ou IHNV-E3E26KE1, a uma MOI (multiplicidade de infecção) de 0,02 (0,02 UFP/célula). As células são lisadas 48 horas após a infecção, e os lisados são analisados por "Western blot" utilizando um anticorpo monoclonal dirigido contra a glicoproteina SDV-El.

Os resultados são apresentados na Figura 4: Pista 1: IHNV-E3E26KE1; Pista 2: IHNV-CapE3E2; Pista 3: IHNV-6KE1; Pista 4: IHNV nativo. IHNV Recombinants que expressa a glicoproteina hemaglu-tinina (HA) do Vírus da Anemia Infecciosa do Salmão

As células EPC são infectadas com IHNV nativo, ou com IHNV-HAisav, como descrito acima. As células são lisadas 2 dias após a infecção, e os lisados são imunoprecipitados com anticorpo monoclonal anti HA e analisadas por "Western blot" utilizando um anticorpo policlonal dirigido contra a glicoproteina ISAV-HA.

Os resultados são na Figura 5: Pista 1: IHNV nativo; Pista 2: IHNV-ISAV HA. 26 ΡΕ2032708 IHNV Recombinante que expressa a glicoproteína G do Vírus da Septicemia Hemorrágica Virai (VHSV) fundida a uma proteína repórter

As células EPC são infectadas, como descrito acima, com IHNV nativo, IHNV-GVhsvj IHNV-GVhsv/LUCrr, IHNV-Gvhsv/EGFP, ou com o sobrenadante de células EPC não infectadas (infecção simulada) . As células são Usadas 2 dias após a infecção, e os lisados são analisados por "Western blot" utilizando um anticorpo monoclonal dirigido contra a glicoproteína G de VHSV.

Os resultados são apresentados na Figura 6: Pista 1: IHNV nativo; Pista 2: IHNV-GVHsv; Pista 3: IHNV-

Gvhsv/LUCrr; Pista 4; IHNV-Gvhsv/EGFP . As bandas observadas são consistentes com o tamanho esperado para a glicoproteína G de VHSV e para as proteínas de fusão Gvhsv/LUCrr e Gvhsv/EGFP, respectivamente. IHNV Recombinante que expressa VP2 do Vírus da Doença de Bursite Infecciosa (IBDV) EPC células são infectadas, tal como descrito acima, com IHNV-VP2iBdv ou com IHNV nativo. 24 horas após a infecção, a expressão de VP2 IBDV é detectada através de reacção de imunofluorescência indirecta. As células são fixadas e permeabilizadas num banho de -20 °C 50% de metanol 50% de acetona, durante 15 minutos, num congelador. As células fixadas são então incubadas durante uma hora com uma diluição 1:400 de um anticorpo monoclonal dirigido 27 ΡΕ2032708 contra a proteína VP2 de IBDV após um passo de lavagem, as células são incubadas durante 45 minutos com um anticorpo IgG anti-rato conjugado com fluoresceína (FITC). Após um passo de lavagem para eliminar os anticorpos não ligados, as células são examinadas relativamente a coloração com fluoresceína com um microscópio de luz UV e fotografados com uma câmara acoplada a computador (Nikon). A Figura 7 mostra a marcação específica da proteína VP2 no citoplasma das células infectadas com IHNV-VP2ibdv ·

Nenhuma fluorescência pode ser detectada nas células infectadas com IHNV.

IHNV recombinante que expressa a proteína F de ISAV Células EPC são infectados, como descrito acima, com IHNV-F5isa· 36 horas pós-infecção, as células são tratadas para imunofluorescência indirecta tal como descrito acima, utilizando um anticorpo dirigido contra a proteína F de ISAV.

Os resultados apresentados na Figura 8 demonstram a expressão da proteína F de ISAV em células infectadas com IHNV-F5iSAV.

IHNV Recombinante que expressa HA de ISAV e VP2 de IPNV Células EPC são infectadas, tal como descrito 28 ΡΕ2032708 acima, com IHNV-3C3 (HA/VP2/LUC) 36 horas após a infecção, as células são tratadas como descrito acima, utilizando um anticorpo policlonal dirigido contra a proteína HA de ISAV e um anticorpo monoclonal dirigido contra a proteína VP2 de IPNV. 0 anticorpo monoclonal primário é revelado com fluoresceína (FITC) , o anticorpo anti-IgG de ratinho conjugado e o anticorpo policlonal de coelho contra a proteína HA primária é revelado com anticorpo anti-coelho conjugado com TRITC.

Os resultados são apresentados na Figura 9: painel da esquerda: mAB anti VP2 de IPNV; painel da direita: Policlonal anti HA de ISAV.

Esta coloração de imunofluorescência dupla mostra que células infectadas por IHNV-3C3 expressam simultaneamente o HA de ISAV e o IPNV de VP2. EXEMPLO 4: INCORPORAÇÃO DE UMA GLICOPROTEÍNA DE MEMBRANA ESTRANHA NA PARTÍCULA VIRAL RECOMBINANT DE IHNV. Células EPC são infectadas, tal como descrito no Exemplo 3, com IHNV-F5iSa/ ou com falsa infecção. 3 dias após a infecção, o sobrenadante isento de células foi recuperado, e o vírus recombinante é purificado do referido sobrenadante, utilizando um gradiente de sacarose. 0 vírus purificado é carregado num gel de SDS-PAGE. As proteínas virais são analisadas por "Western blot" utilizando um anticorpo policlonal dirigido contra a 29 ΡΕ2032708 glicoproteína F de ISAV. Células infectadas com ISAV foram utilizadas como um controlo positivo.

Os resultados são mostrados na apresentados 10. Estes resultados demonstram que a proteína F de ISAV é incorporada nas partículas virais recombinantes de IHNV.

Resultados semelhantes foram obtidos quando as análises de incorporação foram levadas a cabo com glicoproteína HA de ISAV e G de VSHS, respectivamente em vírus recombinantes IHNV-ISAV HA e IHNV-VSHV G purificados. EXEMPLO 5: INCORPORAÇÃO DE UMA PROTEÍNA ESTRANHA NÃO MEMBRANAR PARA A PARTÍCULA VIRAL DE IHNV RECOMBINANTE. A possibilidade de incorporar fisicamente uma proteína não-membranar para a partícula virai de IHNV é avaliada utilizando duas proteínas não membranares repórter: a EGFP e a luciferase de Renilla. São construídos genes quiméricos que codificam para qualquer uma das proteínas estruturais do vírus IHNV (N, P, M, G) ou a proteína não estrutural NV, fundida pela sua extremidade C-terminal à extremidade N-terminal da EGFP ou da luciferase Renilla.

Um local de enzima de restrição Spe I foi introduzido em ambas as extremidades de cada gene quimérico para permitir a sua inserção no local de restrição Spel único das construções pIHNV LUC ou pIHNV EGFP. 30 ΡΕ2032708

As construções seguintes foram obtidas: pIHNV N-EGFP, pIHNV G-EGFP, pIHNV M-EGFP, ou pIHNV NV-EGFP pIHNV N-LUC, pIHNV G-LUC, pIHNV P-LUC, pIHNV M-LUC, OU pIHNV NV-LUC IHNVs recombinantes são obtidos a partir destas construções, conforme descrito no Exemplo 1 acima.

IHNV recombinante que expressa a proteína N, G, M, ou NV em fusão com a parte N-terminal N de EGFP Células EPC são infectadas com IHNV N-EGFP, IHNV G-EGFP, IHNV M-EGFP, ou IHNV NV-EGFP. 24 horas após a infecção, as células são examinadas directamente para a expressão das proteínas de fusão de EGFP utilizando um microscópio confocal de varrimento laser (CLSM).

Os resultados são mostrados na Figura 11: A: N-EGFP de IHNV; B: G-EGFP de IHNV; C: M-EGFP de IHNV; D: NV-EGFP de IHNV. G-EGFP e M-EGFP têm localização de membrana de acordo com a localização esperada das proteínas G e M, ao passo que a NV-EGFP parece acumular-se no núcleo das células infectadas e a N-EGFP é considerada citossólica. IHNV recombinante que expressa a proteína N, G, M, ou NV em fusão com a parte N-terminal da luciferase Células EPC são infectadas com IHNV Luc, IHNV N-LUC, IHNV G-LUC, IHNV M-LUC, OU IHNV NV-LUC. 4 dias após a 31 ΡΕ2032708 infecção, o sobrenadante isento de células foi recuperado, e o vírus recombinante é purificado a partir do referido sobrenadante, utilizando um gradiente de sacarose. A concentração de proteína total de cada vírus purificado foi medida utilizando um ensaio de ligação de corante colorimétrico (Bradford). Em seguida, um micrograma de cada vírus purificado foi testado para a actividade de luciferase de modo a determinar qual a proteína estrutural mais adequada para a incorporação da luciferase na partícula virai. 0 resultado na Figura 12 mostra que a fusão de uma proteína não-membranar externa (de luciferase, neste caso) à proteína N é a melhor estratégia para a incorporação desta proteína na partícula virai IHNV.

EXEMPLO 5: EXPRESSÃO DE UMA. PROTEÍNA DE INTERESSE EM TRUTAS VIVAS

Os peixes são infectados por imersão em banho com rlHNVLUC, de acordo com o protocolo seguinte: os peixes jovens são colocados em tanques de criação num pequeno volume de água (3 litros de água por 100 peixes jovens, de peso médio de 1 g). Adiciona-se o rlHNVLUC à água do tanque a uma concentração final de 5 x 104 UFP/mL (UFP = unidades formadoras de placas). Após incubação durante 2 horas, os reservatórios são cheios e a circulação da água é reestabelecida.

Aos 4 dias pós-infecção, os peixes são imersos 32 ΡΕ2032708 num banho que contém um substrato de luciferase (EnduRen™ Live Cell Substrate, Promega) e submetido a imagem CCD depois de terem sido anestesiados, de modo a avaliar a actividade da luciferase.

Os resultados são apresentados na Figura 13. A: i: peixes infectados com rlHNVLUC, banho de substrato de luciferase; 1: peixe com infecção falsa, sem banheira substrato luciferase; 2: peixe com infecção falsa, banho de substrato de luciferase; 3: peixe infectado com rlHNV, banho de substrato de luciferase; 4: peixe infectado com rlHNVLUC, sem banheira substrato de luciferase. B: imagem original da luz produzida pela oxidação pela luciferase de Renilla do seu substrato coelenterazina. A intensidade da luz emitida está directamente relacionada com o nivel de expressão de luciferase Renilla e com a replicação virai IHNV-IUC na truta viva. C: Sinais de bioluminescência sobrepostos na imagem A. EXEMPLO 6: PATOGENICIDADE DOS NOVIRHABDOVIRUS RECOMBINANTES COMPREENDENDO UM OU TRÊS CISTRONS ADICIONAIS. A patogenicidade de novirhabdovirus obtida como descrito no Exemplo 1 acima, é avaliada por infecções experimentais em truta arco-íris (Oncorhyncus mykiss) .

Os vírus testados são como se segue: rlHNV: nativo

rlHNV: 6K-E1 SDV 33 ΡΕ2032708 rlHNV: E3-E2 SDV rlHNV: Cap-E3-E2 SDV rlHNV: E3-E2-6K-E1 SDV rlHNV: LUCRN rlHNV: G-VSHV rlHNV 3C1: HA/F5/LUCRN; rlHNV 3C20: HA/ILB/LUCRN; rlHNV 3C14: HA/VP2/Cap-E3-E2; rlHNV 3C15: HA/VP2/E3-E26KE1.

Trutas jovens são infectadas por balneação com 5xl04 UFP/mL de qualquer um destes vírus, de acordo com o protocolo descrito no Exemplo 5 acima, e a mortalidade é monitorizada.

Os resultados são mostrados na Figura 14.

Estes resultados mostram que a patogenicidade dos vírus está ligada ao número de cistrões adicionais. Embora a presença de um cistrão adicional apenas induz, na maioria dos casos, uma ligeira ou moderada redução na patogenicidade, a presença de três cistrões adicionais induz uma drástica atenuação da capacidade patogénica. EXEMPLO 7: PROPRIEDADES DE VACINA EM PEIXES DOS NOVIRHA-BDOVIRUS RECOMBINANTES DA INVENÇÃO.

De modo a determinar se os vírus recombinantes atenuados pela presença de três cistrões adicionais podem 34 ΡΕ2032708 ser utilizados para a preparação de vacinas, a sua capacidade de proteger peixes jovens contra um teste subsequente com o isolado virai patogénico IHNV 32/87 foi aferida .

Numa primeira experiência, trutas jovens imunizadas por balneação com rlHNV 3C1, 3C20, 3C14, ou 3C15, nas mesmas condições que nos ensaios de patogenicidade descritos no Exemplo 6, são testados com IHNV 32/87, quer por balneação 46 dias mais tarde, ou por injecção intraperitoneal, dois meses mais tarde. A mortalidade é controlada ao longo de um período de 58 dias.

Teste por balneação: 4 6 dias após terem recebido qualquer um de IHNV 3C1, 3C20, 3C14, ou 3C15, ou nada, os peixes são infectados por balneação com 105 ufc/mL de IHNV 32/87.

Teste por injecção:

Dois meses depois de ter recebido ou IHNV 3C1, ou uma imunização simulada, lotes de 20 jovens trutas são testadas com a vacina recombinante candidata por injecção intraperitoneal com o IHNV isolado virai patogénica 32/87 (106 UFP/peixe).

Os resultados são mostrados na Figura 15. 35 ΡΕ2032708

No caso do teste por balneação, 100% das trutas testadas imunizadas com IHNV 3C1, 3C20, 3C14, ou 3C15 e 98% daquelas imunizadas com IHNV 3C20 sobrevivem ao teste, enquanto que apenas 20% das trutas com imunização simulada sobrevivem.

No caso de o desafio por injecção, 100% das trutas testadas imunizados com IHNV 3C1 sobrevivem, enquanto que apenas 6% das trutas com imunização simulada sobrevivem . EXEMPLO 8: USO DO SISREMA IHNV RECOMBINANTE COMO UM VECTOR DE VACINA EM ESPECIES DE MAMÍFEROS.

Replicação de IHNV recombinante em células cultivadas de várias espécies Células EPC, bem como células de várias espécies de vertebrados superiores (células epiteliais do pulmão humano A549; células do rim suino PK15; células do rim de coelho RK13; fibroblastos de rato 3T3, células intestinais de embrião de pinto CEV-I (ATCC CRL10495) são infectadas com o IHNV-LUC recombinante a uma elevada multiplicidade de infecção (5 UFP/célula). As células são incubadas a 14 e 28°C durante três dias.

No final do tempo de incubação a expressão da luciferase é medida utilizando um luminómetro e o sistema de ensaio de luciferase de Renilla (Promega) seguindo o protocolo do fabricante. 36 ΡΕ2032708

Os resultados são mostrados na Figura 16. A intensidade da luz, que é representada no eixo dos Y em unidades de luciferase (RLU), é proporcional à concentração de luciferase no lisado celular e, assim, à replicação virai. A luminescência detectada nas células não-infectadas corresponde à luminescência de fundo causada pela oxidação não enzimática do substrato de Renilla coelenterazina.

Estes resultados mostram que a replicação significativa de IHNV-LUC recombinante ocorre em várias linhas de células a 14°C em comparação com a replicação nas células de peixe EPC. No entanto, a 28°C as células testadas, incluindo as células EPC, são incapazes de replicar o vírus IHNV-LUC.

Administração de IHNV recombinante in vivo em ratinhos

Para testar a replicação de IHNV em mamíferos vivos, os ratinhos são inoculados com uma grande quantidade de vírus recombinante IHNV-LUC (5.108 ufp/ratinho). 28 dias após a inoculação, a actividade de luciferase nos soros de ratinhos é verificada. Não se detectou qualquer actividade de luciferase, confirmando os resultados obtidos nas culturas de células. 37 ΡΕ2032708

Assim, IHNV é de fato um vírus naturalmente inac-tivado em vertebrados superiores.

Numa segunda experiência, 15 ratinhos foram inoculados por via intradérmica com o IHNV 3C1 recombinante (HA/F5/LUC) (1 g de vírus purificado/ratinho) 5 ratinhos de controlo receberam o tampão TNE. Quatro semanas após a inoculação o soro dos ratinhos inoculados foi testado para a presença da resposta de anticorpos contra o vírus IHN nativo utilizando o teste ELISA, com uma placa revestida com o vírus purificado IHN. 15 dos 15 ratinhos inoculados com IHNV 3C1 recombinante, e nenhum dos 5 ratinhos no grupo de controlo tiveram serologia positiva para IHNV.

Além disso, o soro de um dos ratinhos inoculados com IHNV 3C1 recombinante diluído a 1/500 foi testado em "Western blot" contra um lisado de células infectadas com ISAV, um lisado de células com infecção simulada, e um extracto de proteína total de IHNV-HA recombinante.

Como um controlo, um anticorpo policlonal dirigido contra a glicoproteína HA de ISAV diluído a 1/500 foi testado em "Western blot" contra os mesmos antigénios.

Os resultados são mostrados na Figura 17. 38 ΡΕ2032708 A: "Western blot" com o anticorpo policlonal dirigido contra a glicoproteina HA de ISAV; B: "Western blot" com o soro de ratinhos inoculados com IHNV 3C1 recombinante.

Estes resultados mostram que o soro dos ratinhos inoculados contém anticorpos dirigidos contra diferentes proteínas de IHNV 3C1, e em particular, contém os anticorpos dirigidos contra a glicoproteina HA do vírus da ISA.

Assim, o sistema de IHNV oferece a possibilidade de produzir economicamente níveis elevados de antigénios que serão apresentados com segurança na sua forma nativa para a vacinação de espécies de mamíferos contra diferentes agentes patogénicos.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> INSTITUT NATIONAL DE LA RECHERCHE AGRONOMIQUE HARMACHE, Abdallah BREMONT, Michel <120> NOVIRHABDOVIRUS RECOMBINANT E SUAS UTILIZAÇÕES.

<130> MJP/mad-F539/132-WO <150> EP 290 982.5 <151> 2006-06-16 <160> 12 <170> Patentln versão 3.3

<210> 1 <211> 22 <212> ADN <213> Vírus da necrose hematopoiética infecciosa <4 0 0> 1 ccaagacaga aaaaaatggc ac 22 <210> 2 39 ΡΕ2032708

<211> 16 <212> ADNA <213> Vírus da necrose hematopoiética infecciosa <400> 2 ccaagacaga aaaaaa 16 <210> <211> 3 12 <212> <213> DNA Vírus da necrose hematopoiética infecciosa <4 0 0> 3 gcacttttgt gc 12 <210> <211> 4 16 <212> <213> ADN Artificial <22 0> <223> Consenso <4 0 0> 4 vhhagayaga aaaaaa 16 <210> <211> 5 12 <212> <213> ADN Artificial <22 0> <223> Consenso <4 0 0> 5 gcacdwkwgt gy 12 <210> <211> 6 16 <212> <213> ADN Vírus da septicemia hemorrágica virai <4 0 0> 6 attagataga aaaaaa 16 <210> <211> 7 12 <212> <213> ADN Vírus da septicemia hemorrágica virai <400> 7Dgcacatttgt gt 12

<210> 8 <211> 16 <212> ADN 40 ΡΕ2032708 <213> Rhabdovirus de hirame <400> 8 atcagataga aaaaaa 16

<210> 9 <211> 16 <212> ADN <213> Rhabdovirus do peixe cabeça-de-cobra <400> 9 gaaagacaga aaaaaa 16

<210> 10 <211> 12 <212> ADN <213> Rhabdovirus do peixe cabeça-de-cobra <4 0 0> 10 gcacgagagt gc 12 <210> 11 <211> 70 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Iniciador <4 0 0> 11 ggggcggccg ccaagacaga aaaaaatggc acttttgtgc actagtatga cttcgaaagt 60 ttatgatcca 70 <210> 12 <211> 40 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Iniciador <4 0 0> 12 ggggcggccg cccgggttat tgttcatttt tgagaactcg 40

Lisboa, 20 de outubro de 2014

Claims (14)

1 ΡΕ2032708 REIVINDICAÇÕES 1. Uma construção de ADN recombinante compreendendo : a) uma região que compreende uma sequência de terminação da transcrição/poliadenilação de um gene M de novirhabdovirus, sendo a referida região definida pela sequência seguinte: VHHAGAYAGAAAAAAA (SEQ ID NO: 4), em que A, T, G, V, H, e Y têm os seus significados usuais no código de nucleótidos da IUPAC; b) uma região que compreende uma sequência de iniciação da transcrição de um gene G de novirhabdovirus, sendo a referida região definida pela sequência seguinte: GCACDWKWGTGY (SEQ ID NO: 5), em que A, T, G, C, D, W, K e Y têm os seus significados usuais no código de nucleótidos da IUPAC; em que a referida região a) é seguida ou a referida região b) é precedida por um dinucleótido não transcrito intergénico de um novirhabdovirus, c) uma zona que compreende uma grelha de leitura aberta que codifica para uma proteína de interesse. em que as regiões a) , b) e c) são dispostas numa ordem seleccionado do grupo que consiste em: a-b-c e b-c-a.

2. Um cADN antigenómico do genoma de novirhabdovirus, caracterizado por conter uma ou mais construções de ADN recombinantes da reivindicação 1, inserida numa porção do referido cADN compreendido entre o codão de 2 ΡΕ2032708 terminação de uma primeira ORF endógena e o codão de iniciação de uma segunda ORF endógena do hospedeiro novirhabdovirus.

3. Um cADN antigenómico da reivindicação 2, que contém duas construções da reivindicação 1.

4. Um cADN antigenómico da reivindicação 2, que contém três construções da reivindicação 1.

5. Um novirhabdovirus recombinante contendo um ARN genómico complementar a um cADN antigenómico de qualquer uma das reivindicações 2 ou 4.

6. Um novirhabdovirus recombinante contendo um ARN genómico complementar ao cADN antigenómico da reivindicação 4.

7. Um novirhabdovirus de qualquer uma das reivindicações 5 ou 6, que é um IHNV recombinante.

8. A utilização de um novirhabdovirus recombinante de qualquer uma das reivindicações 5 a 7 para a produção de proteínas de interesse em células de peixe em cultura.

9. Um novirhabdovirus recombinante de qualquer uma das reivindicações 6 ou 7 para utilização como vacina viva atenuada. 3 ΡΕ2032708

10. Um novirhabdovirus recombinante de qualquer uma das reivindicações 5 a 7 para utilização como um sistema de administração para a vacinação de aves ou de mamíferos.

11. A utilização de um IHNV ou VHSV recombinante compreendendo uma construção de ADN recombinante da reivindicação 1, que codifica para uma proteína antigénica de interesse, para a expressão da referida proteína in vivo num sistema de expressão a baixa temperatura.

12. Um sistema de expressão a baixa temperatura, caracterizado pelo referido sistema de expressão compreender um IHNV ou VHSV recombinante compreendendo pelo menos uma construção de ADN da reivindicação 1, que codifica para uma proteína antigénica de interesse, e uma célula de vertebrado susceptível de infecção pelo referido vírus recombinante e capaz de crescer a baixa temperatura.

13. Um método para a expressão in vitro de uma proteína antigénica de interesse, compreendendo o referido método: a infecção de uma célula de vertebrado susceptível de infecção por IHNV ou VHSV e capaz de crescer a baixa temperatura com um IHNV ou VHSV recombinante compreendendo pelo menos uma construção de ADN recombinante da reivindicação 1, que codifica para uma proteína antigénica de interesse; 4 ΡΕ2032708 - cultivar a referida célula a uma temperatura de cerca de

14°C a cerca de 20°C; recuperando a proteína antigénica de interesse produzida pela referida célula. Lisboa, 20 de outubro de 2014