JP2009539396A - 組換えノビラブドウイルスおよびその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
3’−N−P−M−G−NV−L−5’
と表すことができる。
なお式中、NはウイルスRNAと会合した核タンパク質をコードする遺伝子を表し、Pはウイルスポリメラーゼと会合したリンタンパク質をコードする遺伝子を表し、Mはマトリクスタンパク質をコードする遺伝子を表し、Gはエンベロープ糖タンパク質Gをコードする遺伝子を表し、NVはNVタンパク質をコードする遺伝子を表し、LはRNA依存性ウイルスRNAポリメラーゼをコードする遺伝子を表す。
a) ノビラブドウイルス遺伝子の転写終結/ポリアデニル化配列を含む領域、
b) ノビラブドウイルス遺伝子の転写開始配列を含む領域、
c) 目的のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む領域
を含む組換えDNA構築物であって、
前記領域a)の後または前記領域b)の前にノビラブドウイルスの遺伝子間の非転写ジヌクレオチドがある、組換えDNA構築物に関する。
a) ノビラブドウイルスのM遺伝子に由来する転写終結/ポリアデニル化配列を含み、VHHAGAYAGAAAAAAA(配列番号4)という配列により定義される(A、T、G、V、HおよびYは、IUPACヌクレオチドコードにおけるそれらの通常の意味を有している)領域、
b) ノビラブドウイルスのG遺伝子に由来する転写開始配列を含み、GCACDWKWGTGY(配列番号5)という配列により定義される(A、T、G、C、D、W、KおよびYは、IUPACヌクレオチドコードにおけるそれらの通常の意味を有している)領域、
c) 目的のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む領域、
を含む組換えDNA構築物であって、前記領域a)の後および/または前記領域b)の前にジヌクレオチドTGがある組換えDNA構築物である。
− 目的の抗原タンパク質をコードする少なくとも一つの異種配列を含む組換えIHNVまたはVHSVを用いて、IHNVまたはVHSVに感染しやすくかつ低温で成長し得る脊椎動物細胞を感染させる段階、
− 約14℃〜約20℃の温度で前記細胞を培養する段階、
− 前記細胞により生産された目的の抗原タンパク質を回収する段階
を含む該方法をも提供する。
図1は、以下で記載される、異なる構築物を概略的に表している。
A:IHNVの完全長cDNAゲノムを含む最初のpIHV構築物である。以下のエレメントは、この構築物では表示され、その他の構築物を示す概略図の中では省略される。T7prom=T7RNAポリメラーゼプロモーター、δ=デルタ肝炎ウイルスのリボザイム配列、T7t=T7RNAポリメラーゼターミネーター配列。
B:pIHN−LUC
C:pIHN−X
D:pIHN−LUC−ΔG
E:EagIでのpIHN−Xの制限を通して生成されるインサート
F:pIHN−X−LUC−ΔG
G:SpeI/NsiIによるpIHN−LUCの消化を通して生成されるインサート
H:pIHN−X−LUC
I:pIHN−Yの消化を通して生成されるインサートEagI/EagI
J:pIHN−X−Y−LUC
構築は、BIACCHESIら(2000年、上述)により記載されているプラスミドpIHNVを用いて実施した。このプラスミドは、pBlueScript SKベクター(Stratagene)中で、T7ファージRNAポリメラーゼプロモーターの下流側そしてδ肝炎ウイルスのリボザイム配列およびT7ファージRNAポリメラーゼ転写ターミネーターの上流側でクローニングされた、IHNウイルスゲノムの完全長cDNAを含む。
pIHN−LUC(図1B):
ウミシイタケルシフェラーゼ発現カセット遺伝子をpIHNVのEagI部位に挿入した結果、pIHN−LUCが得られる。
ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子を、以下のオリゴヌクレオチドを用いてpBindベクター(Promega GenBank、登録番号AF264722)からPCR増幅させた。
ggggCGGCCGCCAAGACAGAAAAAAATGGCACTTTTGTGCACTAGTATGACTTCGAAAGTTTATGATCCA(配列番号11)
このオリゴヌクレオチドは、EagI制限部位(CGGCCG)と、それに続くM遺伝子の転写終結/ポリアデニル化配列(CCAAGACAGAAAAAAA、配列番号2)、ジヌクレオチドTG、およびG遺伝子の転写開始配列(GCACTTTTGTGC、配列番号3)と、それに続くウミシイタケルシフェラーゼの最後の24個のヌクレオチドとを含む。
ggggCGGCCGCCCGGGTTATTGTTCATTTTTGAGAACTCG(配列番号12)
このオリゴヌクレオチドはEagI制限部位(CGGCCG)を含む。
これらの構築物は、その他のあらゆる目的の遺伝子でルシフェラーゼ遺伝子を置換した結果として得られる(XまたはZにより例証)。これらは、一方の側にSpeI部位を(またはNheIといったような適合性を有する制限部位)、そして他方の側にSmaI部位(または適合性を有する平滑末端制限部位)を含む一組のプライマーセットを用いた目的の遺伝子のPCR増幅によって得られる。
pIHN−X−LUC(図1D〜1H)
SmaI/AgeIフラグメントがpIHN−LUCプラスミドから除去され、結果として二つのEagI部位のうちの一つが削除され、G遺伝子が欠失する。このようにして得られた中間構築物をpIHN−LUC−ΔGと命名する(図1D)。
pIHN−X−Y−LUC(図1Iおよび図1J)
プラスミドpIHN−Yは、pIHN−Xについて記載したようにして得られる。
この構築物は、pIHN−Zから回収したZ遺伝子を含むSpeI/SmaIフラグメントで、Luc遺伝子を含むpIHN−X−Y−LUCのSpeI/SmaIフラグメントを置換することにより得られる。
それぞれが、IHNの核タンパク質Nをコードする遺伝子、リンタンパク質Pをコードする遺伝子、およびRNA依存性RNAポリメラーゼLをコードする遺伝子を含む、三つの発現プラスミドを、BIACCHESIら(2000年、先に言及した刊行物)により記載されている通りに構築した。これらの構築物をそれぞれpT7−N、pT7−P、およびpT7−Lと呼ぶ。
SDV:睡眠病ウイルス
ISAV:伝染性サケ貧血ウイルス
VHSV:ウイルス性出血性敗血症ウイルス
IBDV:伝染性ファブリーキウス嚢病ウイルス、
IPNV:伝染性膵臓壊死症ウイルス
6KE1:SDVのE1糖タンパク質遺伝子
CAP:SDVカプシド遺伝子
E3E2:SDVのE2糖タンパク質遺伝子
EGFP:増強型緑色蛍光タンパク質
F5:ISAVのF遺伝子
GVHSV:VHSVのG糖タンパク質遺伝子
HA:ISAVのHA遺伝子
IL1β:ニジマス由来のインターロイキン1
LUCFF:ホタルルシフェラーゼ LUCRR:ウミシイタケルシフェラーゼ
VP2:IPNVのVP2遺伝子
ΔG:IHNVのG遺伝子の欠失
生産されたウイルスの各々のウイルスストックは、トランスフェクションから7日目に取った上清(上清PO)の(EPC)細胞培養物における連続継代により構成される。細胞は、清澄した上清の1/100希釈で感染させる。3回の継代後、ウイルスの細胞変性効果により細胞層が破壊された時点で、上清を取り出す。この破壊は、通常、感染後3〜6日目に発生する。ウイルスストックを次に、限界希釈法により滴定する。
目的のタンパク質を、表1、2および3に列挙する組換えIHNVを用いて生産した。
EPC細胞を、0.02のMOI(感染多重度)(0.02PFU/細胞)で、野生型IHNV、IHNV−6KE1、IHNV−CapE3E2、またはIHNV−E3E26KE1で感染させる。細胞を感染から48時間後に溶解し、溶解物を、SDV−E1の糖タンパク質に対するモノクローナル抗体を用いてウェスタンブロット法により分析する。
EPC細胞を、上述の通り、野生型IHNVまたはIHNV−HAISAVで感染させる。感染から2日後に細胞を溶解し、溶解物を抗HAモノクローナル抗体で免疫沈降させ、ISAV−HA糖タンパク質に対するポリクローナル抗体を用いてウェスタンブロット法により分析する。
EPC細胞を、上述の通り、野生型IHNV、IHNV−GVHSV、IHNV−GVHSV/LUCRR、IHNV−GVHSV/EGFP、または非感染の(偽感染)EPC細胞の上清で感染させる。細胞を感染から2日後に溶解し、溶解物を、VHSVのG糖タンパク質に対するモノクローナル抗体を用いてウェスタンブロット法によって分析する。
上述の通りに、EPC細胞をIHNV−F5ISAで感染させる。感染から36時間後に、ISAVのタンパク質Fに対する抗体を用いて、上述の通り、間接的免疫蛍光のために細胞を処理する。
上述の通りに、EPC細胞をIHNC−3C3(HA/VP2/LUC)で感染させる。感染から36時間後に、細胞を、ISAVのタンパク質HAに対するポリクローナル抗体およびIPNVのタンパク質VP2に対するモノクローナル抗体を用いて、上述の通りに処理する。一次モノクローナル抗体は、フルオレセイン(FITC)と結合した抗マウスIgG抗体で明らかにし、タンパク質HAに対する一次ウサギポリクローナル抗体は、TRITCと結合した抗ウサギ抗体で明らかにする。
実施例3に記載した通り、EPC細胞をIHNV−F5ISAで感染させるか、または偽感染させる。
IHNVウイルス粒子内に非膜タンパク質を物理的に組み込む可能性を、EGFPおよびウミシイタケルシフェラーゼという二つのレポーター非膜タンパク質を用いて評価する。
EPC細胞を、IHNV N−EGFP、IHNV G−EGFP、IHNV M−EGFP、またはIHNV NV−EGFPで感染させる。感染から24時間後に、細胞を、共焦点レーザー走査顕微鏡(CLSM)を用いてEGFP融合タンパク質の発現について直接検査する。
EPC細胞を、IHNV Luc、IHNV N−LUC、IHNV G−LUC、IHNV M−LUC、またはIHNV NV−LUCで感染させる。感染から4日後に、無細胞上清を回収し、組換えウイルスを、ショ糖勾配を用いて前記上清から精製する。各々の精製したウイルスの総タンパク質濃度を、比色色素結合分析(Bradford)を用いて測定した。その後、各々の精製したウイルス1マイクログラムをルシフェラーゼ活性について試験して、ウイルス粒子内へのルシフェラーゼの組み込みに最も適した構造タンパク質がどれであるかを決定した。
以下の手順に従って、rIHNVLUCを用いた浴浸漬により、魚を感染させる。繁殖槽内で少量の水中に(平均体重1gの100匹の稚魚につき水3リットル)稚魚を入れる。5×104PFU/ml(PFU=プラーク形成単位)の最終濃度で槽の水にrIHNVLUCを添加する。2時間インキュベートした後、槽を満杯にし、水循環を再度確立する。
A:i:rIHNVLUC感染魚、ルシフェラーゼ基質浴、1:偽感染した魚、ルシフェラーゼ基質を含まない浴、2:偽感染した魚、ルシフェラーゼ基質浴、3:rIHNV感染魚、ルシフェラーゼ基質浴、4:rIHNVLUC感染魚、ルシフェラーゼ基質を含まない浴。
B:ウミシイタケルシフェラーゼ基質セレンテラジンによるウミシイタケルシフェラーゼの酸化により生成される光の原画像。発光の強度は、生きたマスの体内におけるウミシイタケルシフェラーゼの発現レベルおよびIHNV−LUCウイルスの複製と直接的に相関する。
C:画像A上に重ね合わされた生物発光シグナル。
上記の実施例1で記載した通りに得られたノビラブドウイルスの病原性を、ニジマス(Oncorhyncus mykiss)における実験的感染によって評価する。
rIHNV: wt
rIHNV: 6K−E1 SDV
rIHNV: E3−E2 SDV
rIHNV: Cap−E3−E2 SDV
rIHNV: E3−E2−6K−E1 SDV
rIHNV: LUCRN
rIHNV: G−VSHV
rIHNV 3C1: HA/F5/LUCRN;
rIHNV 3C20: HA/ILB/LUCRN;
rIHNV 3C14: HA/VP2/Cap−E3−E2;
rIHNV 3C15: HA/VP2/E3−E26KE1。
三つの付加的なシストロンの存在により弱毒化した組換えウイルスをワクチン調製のために使用できるか否かを立証するために、病原性IHNVウイルス分離株32/87を用いたその後の攻撃誘発(challenge)に対し稚魚を防御するそれらの能力を試験した。
IHNV 3C1、3C20、3C14または3C15を付与した後、または何も付与することなく、46日後に魚を浴療法によって105pfu/mlのIHNV32/87で感染させる。
IHNV 3C1または偽免疫のいずれかを付与してから2ヵ月後に、ワクチン候補の組換え体である20匹のマス稚魚のバッチを、腹腔内注射により病原性IHNVウイルス分離株32/87(魚一匹あたり106pfu)で攻撃誘発する。
さまざまな種に由来する培養細胞物における組換えIHNVの複製
EPC細胞ならびにさまざまな高等脊椎動物種由来の細胞(ヒト肺上皮細胞A549、ブタ腎細胞PK15、ウサギ腎細胞RK13、マウス線維芽細胞3T3、腸ニワトリ胚細胞CEV−I(ATCCCRL10495))を、高い感染多重度(5PFU/細胞)で組換えIHNV−LUCで感染させる。14℃および28℃で3日間細胞をインキュベートする。
生きた哺乳動物におけるIHNVの複製を試験するために、大量の組換えIHNV−LUCウイルス(5・108pfu/マウス)をマウスに接種する。
A:ISAVのHA糖タンパク質に対するポリクローナル抗体でのウェスタンブロット法、
B:組換えIHNV 3C1を接種したマウスの血清でのウェスタンブロット法。
Claims (14)
- a) ノビラブドウイルス遺伝子の転写終結/ポリアデニル化配列を含む領域、
b) ノビラブドウイルス遺伝子の転写開始配列を含む領域、
c) 目的のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む領域
を含む組換えDNA構築物であって、
前記領域a)の後または前記領域b)の前にノビラブドウイルスの遺伝子間の非転写ジヌクレオチドがある、組換えDNA構築物。 - 領域a)がノビラブドウイルスのM遺伝子に由来する転写終結/ポリアデニル化配列を含み、前記領域が、VHHAGAYAGAAAAAAA(配列番号4)という配列により定義され(A、T、G、V、HおよびYは、IUPACヌクレオチドコードにおけるそれらの通常の意味を有している)、領域b)がノビラブドウイルスのG遺伝子に由来する転写開始領域を含み、前記領域が、GCACDWKWGTGY(配列番号5)という配列により定義される(A、T、G、C、D、W、KおよびYは、IUPACヌクレオチドコードにおけるそれらの通常の意味を有している)、請求項1に記載の組換えDNA構築物。
- 宿主ノビラブドウイルスの第一の内在性ORFの停止コドンと第二の内在性ORFの開始コドンとの間に含まれたアンチゲノムcDNAの一部分の中に挿入された、請求項1または2に記載の一つ以上の組換えDNA構築物を含むことを特徴とする、ノビラブドウイルスのゲノムのアンチゲノムcDNA。
- 請求項1に記載の二つの構築物を含む、請求項3に記載のアンチゲノムcDNA。
- 請求項1に記載の三つの構築物を含む、請求項3に記載のアンチゲノムcDNA。
- 請求項3または5に記載のアンチゲノムcDNAに相補的なゲノムRNAを含む組換えノビラブドウイルス。
- 請求項5に記載のアンチゲノムcDNAに相補的なゲノムRNAを含む組換えノビラブドウイルス。
- 組換えIHNVである、請求項6または7に記載の組換えノビラブドウイルス。
- 培養中の魚の細胞中で目的のタンパク質を生産するための、請求項6〜8のいずれかに記載の組換えノビラブドウイルスの使用方法。
- 弱毒化生ワクチンとして使用するための、請求項7または8に記載の組換えノビラブドウイルス。
- トリまたは哺乳動物のワクチン接種のための抗原送達系として使用するための、請求項6〜8のいずれかに記載の組換えノビラブドウイルス。
- 低温の発現系においてインビトロで目的の抗原タンパク質を発現させるための、目的の抗原タンパク質をコードする異種配列を含む組換えIHNVまたはVHSVの使用方法。
- 目的の抗原タンパク質をコードする少なくとも一つの異種配列を含む組換えIHNVまたはVHSV、および前記組換えウイルスに感染しやすくかつ低温で成長し得る脊椎動物細胞を含むことを特徴とする、低温のインビトロでの発現系。
- 目的の抗原タンパク質をインビトロで発現させる方法であって、
− 目的の抗原タンパク質をコードする少なくとも一つの異種配列を含む組換えIHNVまたはVHSVを用いて、IHNVまたはVHSVに感染しやすくかつ低温で成長し得る脊椎動物細胞を感染させる段階、
− 約14℃〜約20℃の温度で前記細胞を培養する段階、
− 前記細胞により生産された目的の抗原タンパク質を回収する段階
を含む方法。
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