ES2509350T3 - Novirhabdovirus recombinantes y usos de los mismos - Google Patents

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Abstract

Una construcción de ADN recombinante que comprende: a) una región que comprende una secuencia de terminación de la transcripción/poliadenilación del gen M de novirhabdovirus, estando definida dicha región por la siguiente secuencia: VHHAGAYAGAAAAAAA (SEC ID Nº: 4), en la que A, T, G, V, H e Y tienen su significado habitual en el código de nucleótidos de IUPAC; b) una región que comprende una secuencia de inicio de la transcripción del gen G de novirhabdovirus, definiéndose dicha región por la siguiente secuencia: GCACDWKWGTGY (SEC ID Nº: 5), en la que A, T, G, C, D, W, K e Y tienen su significado habitual en el código de nucleótidos de IUPAC; en la que dicha región a) está seguida o dicha región b) está precedida por un dinucleótido intergénico no transgénico de un novirhabdovirus, c) una región que comprende una fase abierta de lectura que codifica una proteína de interés; en la que las regiones a), b) y c) se disponen en un orden seleccionado del grupo que consiste en: a-b-c y b-c-a.

Description

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SDV: Virus de la Enfermedad del Sueño ISAV: Virus de la Anemia Infecciosa del Salmón VHSV: Virus de la Septicemia Hemorrágica Viral IBDV: Virus de la Bursitis Infecciosa IPNV: Virus de la necrosis pancreática infecciosa 6KE1: gen de la glucoproteína E1 de SDV CAP: gen de la cápsida de SDV E3E2: gen de la glucoproteína E2 de SDV EGFP: Proteína verde fluorescente potenciada F5: gen F de ISAV GVHSV: gen de glucoproteína G de VHSV HA: gen de HA de ISAV IL1β: Interleucina 1 de la trucha arco iris LUCFF: Luciferasa de luciérnaga LUCRR: luciferasa de Renilla VP2: gen de VP2 de IPNV ΔG: supresión del gen G de IHNV
Ejemplo 2: multiplicación en cultivo celular de novirhabdovirus recombinantes que comprenden uno, dos o tres cistrones adicionales.
Las reservas virales de cada uno de los virus producidos están constituidas por pases sucesivos en cultivo de células (EPC) del sobrenadante tomado 7 días después de la transfección (sobrenadante PO). Las células se infectan con dilución 1/100 del sobrenadante clarificado. Después de 3 pases, se retiran los sobrenadantes cuando la capa de células se destruye por el efecto citopático del virus; esto sucede habitualmente de 3 a 6 días después de la infección. Las reservas virales se titulan después por dilución limitante.
La Figura 3 muestra ejemplos de título viral de diversos virus recombinantes en cultivo de células EPC. Aunque el título viral para todos los virus recombinantes está en el mismo intervalo (108 UFP/ml), los virus recombinantes que comprenden tres unidades de expresión adicionales tienen un crecimiento más lento en comparación con el virus de tipo silvestre. En general se tarda seis días en obtener un efecto citopático completo en células EPC en lugar de tres días para el IHNV de tipo silvestre.
Ejemplo 3: expresión de proteínas de interés en novirhabdovirus recombinantes de la invención
Se produjeron proteínas de interés usando los IHNV recombinantes enumerados en las Tablas I, II y III.
IHNV recombinante que expresa las proteínas estructurales del virus de la enfermedad del sueño
Se infectan células EPC con IHNV de tipo silvestre, IHNV-6KE1, IHNV-CapE3E2 o IHNV-E3E26KE1 a una MOI (multiplicación de infección) de 0,02 (0,02 UFP/célula). Las células se lisan 48 horas después de la infección, y los lisados se analizan por transferencia de Western usando un anticuerpo monoclonal dirigido contra la glucoproteína E1 de SDV.
Los resultados se muestran en la Figura 4: Carril 1: IHNV-E3E26KE1; Carril 2: IHNV-CapE3E2; Carril 3: IHNV-6KE1; Carril 4: IHNV de tipo silvestre.
IHNV recombinante que expresa la glucoproteína hemaglutinina (HA) de virus de la anemia infecciosa del salmón (ISAV)
Se infectan células EPC con IHNV de tipo silvestre o IHNV-HAISAV, como se ha descrito anteriormente. Las células se lisan 2 días después de la infección, y los lisados se inmunoprecipitan con anticuerpo monoclonal anti-HA y se analizan por transferencia de Western usando un anticuerpo policlonal dirigido contra la glucoproteína HA de ISAV.
Los resultados se muestran en la Figura 5: Carril 1: IHNV de tipo silvestre; Carril 2: IHNV-ISAV HA.
INHV recombinante que expresa la glucoproteína G del virus de la septicemia hemorrágica viral (VHSV) fusionada con una proteína indicadora
Se infectan células EPC, como se ha descrito anteriormente, con IHNV de tipo silvestre, IHNV-GVHSV, IHNV-GVHSV/LUCRR, IHNVGVHSV/EGFP, o con el sobrenadante de células EPC no infectadas (infectadas con simulación). Las células se lisan 2 días después de la infección, y los lisados se analizan por transferencia de Western usando un anticuerpo monoclonal dirigido contra la glucoproteína G de VHSV.
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