PT1905775E

PT1905775E - Compostos tetracíclicos, processo para a sua preparação, composições farmacêuticas que os contenham e a sua utilização a título de ligandos dos receptores dopaminérgicos

Info

Publication number: PT1905775E
Application number: PT07291135T
Authority: PT
Inventors: Jean-Louis Peglion; Mark Millan; Mauricette Brocco; Christophe Poitevin
Original assignee: Servier Lab
Priority date: 2006-09-26
Filing date: 2007-09-25
Publication date: 2010-11-17
Also published as: AU2007219281A1; KR100934315B1; WO2008037888A2; CY1110799T1; CN101153043B; EP1905775B1; US7470683B2; NO20074889L; NZ561905A; MA29371B1; RS51418B; GEP20104877B; EP1905775A1; ATE480544T1; BRPI0703655A2; KR20080028316A; DE602007009004D1; CA2603274C; SI1905775T1; CA2603274A1

Description

1 DESCRIÇÃO "Compostos tetracíclicos, processo para a sua preparação, composições farmacêuticas que os contenham e a sua utilização a título de ligandos dos receptores dopaminérgicos" A invenção presente tem como objecto novos compostos tetracíclicos, o processo para a sua preparação e as composições farmacêuticas que os contenham. A EP 0 773.223 e a EP 0 686.637 descrevem compostos tetracíclicos que actuam a título de ligandos dopaminérgicos e apresentam uma selectividade para com os receptores D3. A invenção presente diz respeito mais em especial aos compostos com a fórmula I, com uma configuração relativa trans:

na qual: 2 X represente um átomo de oxigénio ou um grupo NR2, Y represente um grupo seleccionado de entre -CH2-, -(CH2)2- e -CH=CH-,

Ri e R2, iguais ou diferentes, representem cada um deles um átomo de hidrogénio ou um grupo seleccionado entre alquilo C1-C6 linear ou ramificado, cicloalquilo C3-C8 e cicloalquilalquilo, no qual a parte alquilo seja em C1-C6 e seja linear ou ramificada, e a parte cicloalquilo seja em C3-C8, sob uma forma racémica ou a de isómeros ópticos, bem como os seus sais de adição a um ácido aceitável do ponto de vista farmacêutico, e os seus hidratos.

Por grupo cicloalquilo C3-C8, entende-se um grupo hidrocarboneto monociclico saturado com 3 a 8 membros.

Entre os ácidos aceitáveis do ponto de vista farmacêutico, podem citar-se a titulo não limitativo os ácidos clorídrico, bromidrico, sulfúrico, fosfórico, acético, trifluoroacético, láctico, pirúvico, malónico, succinico, glutárico, fumárico, tartárico, maleico, 3 cítrico, ascórbico, oxálico, metanossulfónico, benzenossulfónico, canfórico, dibenzoítartárico.

Um aspecto da invenção presente diz respeito aos compostos com a fórmula I para os quais Ri represente um grupo alquilo, em especial um grupo propilo.

Um outro aspecto da invenção presente diz respeito aos compostos com a fórmula I para os quais X represente um grupo NR2, em particular um grupo NH.

Um outro aspecto da invenção presente diz respeito aos compostos com a fórmula I para os quais Y represente um grupo 0¾.

Um outro aspecto da invenção presente diz respeito aos compostos com a fórmula I seguintes: • a (4aRS,llbRS)-4-propil-3,4,4a,5,6,8,9,11b- octahidroisoindolo[5, 6-h] [1,4]benzoxazin-10(2H)-ona, bem como os seus enantiómeros e os sais de adição a um ácido aceitável do ponto de vista farmacêutico; • a (4aR, llb.R)-4-propil-2,3, 4,4a, 5, 6, 8, llb-octahidro-10tf-furo[3',4':6,7]nafto[1,2-b] [1,4]oxazin-10-ona, bem como os seus sais de adição a um ácido aceitável do ponto de vista farmacêutico; • a (4a.R, 12bR)-4-propil-3,4,4a, 5, 6, 8, 9,12b-octahidro-2H, llff-pirano [4 ', 3' : 6,7] nafto [1,2-b] [1,4] oxazin-11- 4 ona, bem como os seus sais de adição a um ácido aceitável do ponto de vista farmacêutico; • a (4ai?, 12bi?)-4-propil-2,3,4,4a, 5, 6, 8, 9,10,12b- decahidro-llff-isoquino [6, Ί-h] [1,4]benzoxazin-ll-ona, bem como os seus sais de adição a um ácido aceitável do ponto de vista farmacêutico; e • a (4ai?, 12bi?)-4-propil-2,3, 4,4a, 5, 6,10,12b-octahidro-Ιΐϋ-isoquino[6,Ί-h] [1,4] benzoxazin-ll-ona, bem como os seus sais de adição a um ácido aceitável do ponto de vista farmacêutico.

Os compostos com a fórmula I agem como potentes ligandos dopaminérgicos.

Os derivados dopaminérgicos são largamente utilizados em terapêutica graças aos seus efeitos benéficos nas doenças psiquiátricas e neurológicas e na periferia em doenças cardiovasculares.

Estão hoje em dia clonados e caracterizados cinco subtipos de receptores dopaminérgicos (Di a Ds) . A grande maioria dos medicamentos desta classe, hoje em dia, age ao nivel do sistema dopaminérgico através da sua acção sobre o subtipo D2, quer se trate de bloqueadores (ou antagonistas), quer de activantes (ou agonistas). Estes medicamentos apresentam numerosos efeitos secundários: disquinésia, hiperprolactinémia, amenorreia para os primeiros, efeitos cardiovasculares e eméticos para os segundos. 5

Ao contrário dos receptores D2, a concentração dos receptores D3 é muito pequena no núcleo nigroestriado e as células lactotróficas (Pharmacol. Ther. 2001, 90(2-3), 231-59; CNS Neurol. Disord. Drug Targets 2006, 5(1), 25-43). Por outro lado, ao invés do que sucede com os receptores D2, a concentração dos receptores D3 é muito grande a nivel do sistema límbico (Pharmacol Ther. 2001, 90(2-3), 231-59; CNS Neurol. Disord. Drug Targets 2006, 5(1), 25-43). Esta diferença importante na localização destes dois subtipos de receptores encoraja a investigação de novos medicamentos com actuação preferencial a nivel do subtipo D3 e que se deverá traduzir por uma minimização dos efeitos secundários tipicamente ligados ao subtipo D2, como se mencionou acima (Pharmacol Ther. 2001, 90(2-3), 231-59; J. Pharmacol. Exp. Ther. 2004, 309(3), 936-50; J. Pharmacol. Exp. Ther. 2004, 309(3), 921-35; CNS Neurol. Disord. Drug Targets 2006, 5(1), 25-43).

Algumas trans-3, 4 , 4a, 5, 6,10b-hexahidro-2fí-naft [1,2-jb]-1,4-oxazinas dissubstituidas foram caracterizadas como ligandos dopaminérgicos na patente EP 0 899.267.

Os compostos da invenção presente comportam-se como ligandos preferidos dos receptores D3, apresentando uma menor afinidade para o receptor D2. 6

Esta característica confere um interesse muito especial aos compostos da invenção presente devido à fraca expressão de efeitos secundários a eles devida.

Diversos testes confirmam o mecanismo da sua actuação bem como o interesse da sua utilização no tratamento de numerosas doenças do sistema nervoso central.

Em especial, os compostos da invenção demonstram a sua actividade no teste de activação dos auto-receptores pré-sinápticos dopaminérgicos, no teste da natação forçada, no teste de vocalizações ultra-sónicas, e no teste de rotação, em ratos com lesões devidas à 6-hidroxidopamina.

Estes resultados permitem propor os produtos da invenção para a neuroprotecção e para o tratamento das doenças do sistema nervoso central nas quais o sistema dopaminérgico esteja envolvido, tais como a doença de Parkinson (Pharmacol Ther. 2001, 90(2-3), 231-59; J. Pharmacol. Exp. Ther. 2004, 309(3), 936-50; CNS Neurol. Disord. Drug Targets 2006, 5(1), 25-43), na hiperprolactinémia (Pharmacol. Ther. 2001, 90(2-3), 231-59; Curr. Opin. Obstet. Gynecol. 1993, 5(3), 360-7), na disfunção sexual (Physiol. Behav. 2004, 83, 291-307; J. Neurosci. 1999, 19, 456-463), na depressão (Pharmacol. Ther. 2006, 110(2), 135-370; J. Pharmacol. Exp. Ther. 2004, 309(3), 936-50), na ansiedade (Prog. Neurobiol. 2003, 70(2), 83-244; J. Pharmacol. Exp. Ther. 2004, 309(3), 936— 50) , na doença de Alzheimer e noutras doenças de 7 degeneração neurológica tais como os ataques cerebrais (Eur. J. Neurosci. 2005, 22(10), 2422-30; Glia. 2005, 52(4), 336-43; J. Neurosci. 2006, 26(27), 7272-80; Brain 1999, 122(Pt8), 1449-68); J. Neurosci. Res. 2002, 67(4), 494-500) . A invenção presente tem igualmente como objecto o processo de preparação dos compostos com a fórmula I, a partir de um composto com a fórmula II, cuja configuração relativa seja trans:

na qual Ri seja tal como foi definido para a fórmula I, que se faz reagir com anidrido tríflico em presença de piridina, para se obter um composto com a fórmula III:

m na qual Ri seja tal como foi definido anteriormente, que se faz reagir com cianeto de zinco e com tetraquis(trifenilfosfina)paládio (0) em dimetilformamida a quente, para se obter o composto com a fórmula IV:

na qual Ri seja tal como foi definido anteriormente, que se trata com uma mistura de ácido clorídrico com ácido acético ao refluxo, para se obter um composto com a fórmula V:

V na qual Ri seja tal como foi definido anteriormente, que em seguida se transforma num composto com a fórmula I, por reacções clássicas da quimica orgânica. 9 A título de exemplo, podem obter-se os compostos com a fórmula I nos quais X represente NH e Y represente CH2, por reacção de um composto com a fórmula V com dietilamina, nas condições clássicas de formação de amidas, para se obter um composto com a fórmula VI:

na qual Ri seja tal como foi definido anteriormente, que se faz reagir com cianato de fenilo sob condições de ortometalação, para se obter um composto com a fórmula VII:

na qual Ri seja tal como foi definido anteriormente, que se reduz utilizando um agente redutor clássico tal como por exemplo o níquel de Raney, para se obter um composto com a fórmula VIII: 10

vm na qual Ri seja tal como foi definido anteriormente, que se cicliza em presença de um derivado orgânico de litio tal como o terc-butil-litio, para se obterem os compostos com a fórmula Ia, caso particular dos compostos com a fórmula I:

na qual Ri seja tal como foi definido anteriormente.

Podem obter-se os compostos com a fórmula I para os quais X represente O e Y represente CH2, por reacção de um composto com a fórmula VI com dimetilformamida, sob condições de ortometalação, para se obter um composto com a fórmula IX: 11

na qual Ri seja tal como foi definido anteriormente, que se reduz por intermédio de um agente redutor selectivo tal como o borohidreto de sódio, para se obter um composto com a fórmula X:

X na qual Ri seja tal como foi definido anteriormente, que se cicliza em presença de um ácido orgânico ou inorgânico, tal como o ácido clorídrico, para se obterem os compostos com a fórmula Ib, caso particular dos compostos com a fórmula I: 12

na qual Ri seja tal como foi definido anteriormente.

Podem obter-se os compostos com a fórmula I nos quais X represente um grupo NR'2, em que R'2 represente um grupo seleccionado de entre alquilo C1-C6 linear ou ramificado, cicloalquilo C3-C8 e cicloalquilalquilo, cuja parte alquilo seja em Ci-Cê e seja linear ou ramificada, e cuja parte cicloalquilo seja em C3-C8, e Y represente um grupo CH2, por reacção de um composto com a fórmula Ib com uma amina primária com a fórmula NH2R'2, para se obterem os compostos com a fórmula Ic, caso particular dos compostos com a fórmula I:

na qual Ri e R'2 sejam tais como se definiram anteriormente.

Podem obter-se os compostos com a fórmula I para os quais X represente NH e Y represente -(CH2)2-, por 13 reacção de um composto com a fórmula X com agente de halogenação tal como o cloreto ou o brometo de tionilo, ou com um composto com a fórmula CG4, em presença de PPI13, em que G represente um átomo de cloro, de bromo ou de iodo, para se obter um composto com a fórmula XI:

na qual Ri seja tal como foi definido anteriormente, e G represente um átomo de cloro, de bromo ou de iodo, que se faz reagir com um agente de cianação tal como o cianeto de tetrametilamónio ou o cianeto de sódio ou de potássio, para se obter um composto com a fórmula XII:

ΧΠ na qual Ri seja tal como foi definido anteriormente, 14 que se reduz utilizando um agente redutor clássico tal como o niquel de Raney, para se obter um composto com a fórmula XIII:

xm na qual Ri seja tal como foi definido anteriormente, que se cicliza utilizando um derivado orgânico de litio, tal como o terc-butil-litio, para se obter um composto com a fórmula Id, caso particular dos compostos com a fórmula I:

Id na qual Ri seja tal como foi definido anteriormente. 15

Podem obter-se os compostos com a fórmula 1 para os quais X represente 0 e Y represente -(0¾) 2- por reacção de um composto com a fórmula VI com bromoetanol em presença de n-butil-lítio e sob condições de ortometalação, para se obter um composto com a fórmula XIV:

na qual Ri seja tal como foi definido anteriormente, que se cicliza utilizando-se um ácido orgânico ou inorgânico, tal como o ácido clorídrico, para se obterem os compostos com a fórmula Ie, caso particular dos compostos com a fórmula I:

na qual Ri seja tal como foi definido anteriormente. 16

Podem obter-se os compostos com a fórmula I para os quais X represente um grupo NR'2, em que R'2 represente um grupo seleccionado de entre alquilo C1-C6 linear ou ramificado, cicloalquilo C3-C8 e cicloalquilalquilo, em que a parte alquilo seja em C1-C6 e seja linear ou ramificada, e a parte cicloalquilo seja em C3-C8, e Y represente um grupo - (CH2) 2~r por reacção de um composto com a fórmula Ie com uma amina primária com a fórmula NH2R'2f para se obterem os compostos com a fórmula If, caso particular dos compostos com a fórmula I:

If na qual Ri seja tal como foi definido anteriormente.

Podem obter-se os compostos com a fórmula 1 para os quais X represente NH e Y represente CH=CH por reacção de um composto com a fórmula V com uma agente de cloraçâo tal como o cloreto de tionilo, para se obter um composto com a fórmula XV: 17

na qual Ri seja tal como foi definido anteriormente, que se faz reagir com cloridrato de metoxilamina na presença de uma base tal como o carbonato de potássio ou de sódio, para se obter um composto com a fórmula XVI:

seja tal na qual Ri anteriormente, como foi definido que se faz reagir com iodeto de metilo sob condições de ortometalação, para se obter um composto com a fórmula XVII:

xvn 18 na qual Ri seja tal como foi definido anteriormente, que se faz reagir como dimetilformamida na presença de um derivado orgânico de litio, tal como o sec-butil-lítio, para se obter um composto com a fórmula XVIII:

na qual Ri seja tal como foi definido anteriormente, que se faz reagir com cloreto de titânio (III), para se obterem os compostos com a fórmula Ig, caso particular dos compostos com a fórmula I:

na qual Ri seja tal como foi definido anteriormente. 19

As matérias-primas com a fórmula II são preparadas de acordo com processos descritos na literatura, a partir de substâncias conhecidas.

Entende-se por isómero (4a.RS, llbRS) ou (4a.RS, 10b-RS) , uma mistura racémica dos enantiómeros com as configurações absolutas respectivamente (4af?, llbf?) e (4aS, llbSj, ou (4ai3,10b.R) e (4aS, lObSj.

As formas opticamente activas dos compostos com a fórmula I são obtidas quer a partir de formas opticamente activas das matérias-primas com a fórmula II, quer por resolução das formas racémicas dos compostos com a fórmula I, recorrendo a métodos conhecidos da literatura.

Os compostos da invenção presente são ligandos dopaminérgicos. Eles são úteis, a titulo de medicamentos, para o tratamento de doenças do sistema nervoso central nas quais esteja implicado o sistema dopaminérgico, tais como a doença de Parkinson, a hiperprolactinémia, a disfunção sexual, a depressão, a ansiedade, a doença de Alzheimer e outras doenças neurológicas degenerativas tais como os ataques cerebrais. A invenção presente tem igualmente como objecto as composições farmacêuticas contendo a título de princípio activo um composto com a fórmula I, ou um seu sal de adição a um ácido aceitável do ponto de vista farmacêutico, combinados com um ou diversos excipientes ou veículos 20 inertes, não tóxicos, aceitáveis do ponto de vista farmacêutico.

Entre as composições farmacêuticas de acordo com a invenção, citar-se-ão mais em particular as que convêm para a administração oral, parenteral (endovenosa, intramuscular ou subcutânea), percutânea ou transcutânea, nasal, rectal, perlingual, ocular ou respiratória, e nomeadamente os comprimidos simples ou drageifiçados, os comprimidos sublinguais, as gélulas, as cápsulas, os supositórios, os cremes, as pomadas, os geles dérmicos, as preparações injectáveis ou bebíveis, os aerossóis, as gotas oculares ou nasais. A posologia útil varia de acordo com a idade e o peso do paciente, a via de administração, a natureza e a severidade da afecção, e caso estejam a ser tomados eventualmente outros tratamento associados, e escalona-se entre 0,5 mg e 500 mg, numa ou em diversas administrações ao dia.

Os exemplos seguintes ilustram a invenção presente. As estruturas dos compostos descritos nos exemplos foram determinadas de acordo com as técnicas espectrofotométricas habituais (infravermelho, ressonância magnética nuclear, espectrometria de massa). 21 EXEMPLO_1: (4aRS, llbRS) -4-Propil 3,4,4a,5,6,8,9,llb-octahidroisoindolo[5,6-h][1,4]benzoxazin-10(2fí)-ona e o seu cloridrato

Passo_Aj_ (4aRS, lObRS) -N, N-Dietil-4-propil 3, 4, 4a, 5, 6,10b-hexahidro-2H-nafto [1, 2-b] [1,4] oxazina-9-carboxamida

Adicionam-se sucessivamente a 51 g (163 mmol) do cloridrato do ácido trans-(4aRS,lObRS)-4-propil-3, 4, 4a, 5,6,10b-hexahidro-2fí-nafto [1,2-b] [1,4] oxazina-9-carboxílico (preparado de acordo com o modo operatório descrito na patente EP 0 899.267), em suspensão em cloreto de metileno (815 mL), dietilamina (18,3 mL, 177 mmol, 1,09 eq.), tetrafluoroborato de O-benzotriazol-l-il-N,N,N',N'-tetrametilurónio (TBTU) (57 g, 177 mmol, 1,07 eq.), e em seguida trietilamina (56 mL, 402 mmol, 2,4 eq.). Agita-se a solução resultante à temperatura ambiente durante 20 horas e em seguida trata-se a mistura reaccional com uma solução de soda 1 N (425 mL) . Decanta-se a fase orgânica, lava-se com uma solução saturada de NaCl, seca-se sobre sulfato de magnésio e depois concentra-se em vazio. Purifica-se o resíduo obtido por cromatografia rápida sobre silicagel utilizando uma mistura de cloreto de metileno com etanol (a 90/5) como eluente. Recupera-se o produto pretendido sob a forma de um óleo. IV: 1629 cm-1 22 R.M.N. de ^ 300 MHz (CPC13) : 7,60 ; 7,25 ; 7,10 ; 4,30 ; 4,10 ; 3,95 ; 3,7-3,15 ; 3,00-2,75 ; 2,50 ; 2,4-2,2 ; 1,7-1,4 ; 1,35-1,00 ; 0,95.

Passo B: (4aRS,lObRS)-N, N-Dietil 8-ciano-4-propil 3, 4, 4a, 5, 6,10b-hexahídro-2H-nafto [1, 2-b] [1,4] oxazina-9-carboxamida

Adiciona-se a amida obtida no passo precedente (12 g, 36 mmol) dissolvida em tetrahidrofurano (220 mL), a uma solução de s-BuLi, 1,3 M em hexano (40 mL) e de N,N,N',N'-tetrametiletilenodiamina (TMEDA) (8,2 mL) em tetrahidrofurano (240 mL), arrefecida a -78°C, mantendo a temperatura interna inferior a -65°C. Agita-se a mistura resultante durante hora e meia a uma temperatura de -70°C. Adiciona-se cianato de fenilo (φΟΟΝ) (12 g) mantendo a temperatura interna inferior a -65°C. Agita-se a mistura durante 5 minutos a -65°C, e depois aquece-se a mistura reaccional até à temperatura ambiente ao longo de hora e meia e depois agita-se à temperatura ambiente durante 1 hora. Hidrolisa-se com uma solução de tetrahidrofurano / água a 90/10, extrai-se com éter etílico, seca-se e concentra-se. Purifica-se o resíduo obtido por cromatografia rápida sobre silicagel, utilizando uma mistura de cloreto de metileno / etanol (a 95/5) como eluente. Obtém-se o produto pretendido sob a forma de um óleo. IV: 2228 cm1; 1632 cm1. 23 R.M.N. de 300MHz (CPC13) : 7,65; 7,40; 4,30; 4,05; 3,90; 3,60; 3,25; 3, 05-2,75; 2,50-2,15; 1,8-1,4,- 1,15; 0,95.

Passo C: (4aRS,lObRS)-8-(Aminometil)-N, N-dietil-4-prop±l-3, 4, 4a, 5, 6,10b-hexahidro-2H-nafto[1,2-b][1, 4]oxazina-9-carboxamida

Trata-se o nitrilo obtido no passo precedente (0,61 g, 1,7 mmol) dissolvido em metanol (60 mL), com hidrogénio a uma pressão de 4 bar, na presença de Ni de Raney (1 g) , a 60°C e durante 4 h. Depois de arrefecer até à temperatura ambiente, separa-se o catalisador por filtração e concentra-se o filtrado. Purifica-se o resíduo obtido por cromatografia rápida sobre silicagel utilizando uma mistura eluente de cloreto de metileno/etanol/amoníaco (a 90/10/1). Obtém-se o produto pretendido sob a forma de um sólido amorfo. IV: 3388-3314 cm'1, 1626 cm'1. R.. M.N. de 1H (CDC13) : 7,35, s, 1H; 7,10, s, 1H; 4,30, d, 1H; 4,05, dd, 1H; 3,90, dt, 1H; 3 ,75, s, 2H) r 3, .55, q, 2H; • 3, ,20, q, 1H; 2, 85, m, 1H; 2,90, m, 2H; 2,80, m, 1H; 2,30, m, 1H; 2,30, m, 1H; 1, 55,m, , 1H; 1,50 , m, 2H; 1, ,30, . t, 3H; 1, .05, t, 3H; 0,90, t, 3H. 24

Passo_Dj_ (4aRS, llbRS) -4-Propil- 3, 4, 4a, 5, 6, 8, 9, llb-octahidroisoindolo[5, 6-h] [1, 4] benzoxazin-10(2H)-ona e o seu cloridrato

Adiciona-se uma solução de terc-butil-litio (1,5 M em pentano) (10 mL) a uma solução da amina obtida no passo precedente (1,8 g) em tetrahidrofurano (200 mL). Agita-se a mistura resultante durante 15 minutos a -75°C, 20 minutos a -40°C, e depois hidrolisa-se com uma solução de tetrahidrofurano / água a 90/10. Depois de uma decantação na presença de cloreto de metileno, secagem e concentração sob pressão reduzida, isola-se o produto pretendido sob a forma de um sólido branco cujo cloridrato se cristaliza a partir de metanol. IV: 1691 cm-1; 3183 cm’1. r.m.n. de 300 MHz (CDC13) : CO 0 s; 1H; 7,16; s; 1H; ' 6, 68; largo; 1H ; 4, 38; m .; 1H; 4, 35; d; 1H ; 4,09; m; 1H ; 3, 95; td; 1H; 3( ,00 ; m; 2H; 2,89; d; 1H; 2 , 82 ; m; 1H; 2, 4 6; td; 1H; 2,29; m; 3H; 1, 64 ; m; 1H; 1,53; m; 2H; 0,92; t; 3H. EXEMPLO 2: (4aRr llbJ?) 4-Propil-3, 4,4a, 5, 6,8,9, llb-octahidroisoindolo [5, 6-h] [1, 4]benzoxazin-10 (2H)-ona e o seu cloridrato

Depositam-se 700 mg do produto obtido no passo D do exemplo 1 sobre uma coluna de Chiralcel® OD e separa-se 25 por HPLC, utilizando a titulo de fase móvel uma mistura a 200 para 1 de isopropanol e ácido trifluoroacético. O produto pretendido é o primeiro a eluir. Depois de um tratamento com soda, e em seguida com uma solução 2 M de ácido clorídrico em éter, obtém-se o cloridrato do produto pretendido.

Ponto de fusão: 287-291°C Poder rotatório: solvente = metanol conc. = 1 % temp. = 20°C λ. = 589 nm D = +52,4° EXEMPLO 3: (4aS, llbS)4-Propil-3,4,4a,5,6,8,9,11b-octahidroisoindolo[5,6-h][1,4]benzoxazin-10(2H)-ona e o seu cloridrato O segundo produto a ser eluido no exemplo 2 corresponde ao produto pretendido. Depois de um tratamento com soda, e em seguida com uma solução 2 M de ácido clorídrico em éter, obtém-se o cloridrato do produto pretendido.

Ponto de fusão: 302-308°C 26

Poder rotatório: solvente = metanol cone. = 1 % temp. = 20°C λ. = 589 nm D = -53,9° EXEMPLO_4: {iaR, llbJ?) -4-Propil 2,3,4,4a, 5, 6, 8, llb-octahidro-lOff-furo[3', 4' : 6,7]nafto[1,2-Jb] [1,4]oxazin-10-ona e o seu cloridrato

Passo_A: (4aR, 1 ObR) -N, N-Díetí 14-propi 1 3, 4, 4a, 5, 6,10b-hexahidro-2H-nafto [1,2-b] [1, 4]oxazine-9- carboxamida

Trata-se o cloridrato do ácido (4af?, lObf?)-N,N-dietil-4-propil-3,4,4a,5,6,10b-hexahidro-2H-nafto[1,2— b][1,4]oxazina-9-carboxílico (aD= + 90,6, a 20°C, a 1 % em metanol) tal como no passo A do exemplo 1, para se obter o produto pretendido.

Passo B: (4aR,1ObR)-N,N-Dietil-8-formil-4-propil-3, 4, 4a, 5, 6,10b-hexahidro-2H-nafto [1, 2-b] [1, 4] oxazina-9-carboxamida A amida obtida no passo precedente (2 g, 6,05 mmol), dissolvida em tetrahidrofurano (10 mL) é adicionada a uma solução de s-BuLi 1,3 M (7,86 mL) e de Ν,Ν,Ν',Ν'- 27 tetrametiletilenodiamina (TMEDA) (1,2 mL, 7,9 mmol) em tetrahidrofurano (25 mL) arrefecida a - 78°C, mantendo a temperatura sempre menor do que -65°C. Agita-se a mistura resultante durante hora e meia e adiciona-se-lhe N,N-dimetilformamida (1 mL) mantendo a temperatura interna inferior a -65°C. Agita-se a mistura durante 5 minutos a -65°C, e depois aquece-se a mistura reaccional até à temperatura ambiente ao longo de hora e meia e agita-se durante 1 hora a esta temperatura.

Depois de uma hidrólise com uma solução de água a 10 % em tetrahidrofurano, de uma extracção com éter etilico, de uma secagem e uma concentração, purifica-se o resíduo obtido por cromatografia rápida sobre silicagel utilizando uma mistura eluente (cloreto de metileno/etanol a 95/5). Recupera-se o produto pretendido sob a forma de um óleo. IV: 2940-1696 cm1; 1628 cm1. R.M.N. de Ji? 300 MHz (CPC13) : 9,90, S, 1H; 7,70, s, 1H; 6,30, s, 1H; 4,25, d, 1H; 4,00, m, 1H; 3,80, m, 1H; 3,45, q, 2H; 3,00, q, 2H; 3,00-2,70, m, 4H; 2,35-2,05, m, 4H; 1,45, m, 3H; 1,20, t, 3H; 0,90, t, 3H; 0,85, t, 3H.

Passo C: (4aR, llbR) -4-Propil-2, 3, 4, 4a, 5, 6, 8,11b-octahidro-lOH-furo [3 ', 4 ' :6, 7]nafto [1,2-b] [1,4] oxazin-10-ona e o seu cloridrato 28

Dissolve-se o aldeído obtido no passo precedente (3,5 g) em metanol (35 mL) . Trata-se esta solução arrefecida a 0°C com borohidreto de sódio (0,45 g). Agita-se a mistura reaccional durante 20 horas deixando-a aquecer até à temperatura ambiente. Arrefece-se a mistura a 0°C, e adiciona-se-lhe uma solução de ácido clorídrico 6 N (7 mL) . Aquece-se a mistura reaccional ao refluxo durante 20 horas. Depois de voltar à temperatura ambiente, isola-se o cloridrato do produto pretendido e recristaliza-se a partir de metanol.

Ponto de fusão: 268-271°C IV: 2780 cm-1, 2140 cm-1, 1746 cm-1. R.M.N. de 1H 300 MHz (DMSQ-d6) : 1,190, m, i—1 7,80, s, 1H; 7,50, s, 1H; 5,40, s, 2H; 5,10, d, 1H; 4, 25, m, 2H; 3,60, m, 1H; 3,45-3,15, m, PO 3,15-2,95, m, 3H; 2,55, m, 1H; 2,10, m, 1H; 1,75 (sext), 2H; 0,95 (t), 3H. EXEMPLO_5 : (4ai*, 12bJ?) -4-Propil- 3,4,4a,5, 6,8, 9,12b-octahidro-2H, llH^pirano[4',3' : 6,7]-nafto[l,2-Jb] [1,4]oxazin-ll-ona e o seu cloridrato

Passo A: (4aR , lObR) 8-(2-Hidroxyetil) N,N-dietil-4-propil-3, 4, 4a, 5, 6,10b-hexahidro-2H-nafto [1,2-b] [1, 4]oxazina-9-carboxamida 29

Dissolve-se a amida obtida no passo A do exemplo 4 (5 g, 15 mM), em tetrahidrofurano (60 mL), e adiciona-se a uma solução de s-BuLi 1,3 M em hexano (14,7 mL) e de Ν,Ν,Ν',Ν'-tetrametiletilenodiamina (TMEDA) (3 mL) em tetrahidrofurano (65 mL) , arrefecida a -78°C, mantendo a temperatura interna inferior a -65°C. Agita-se a mistura resultante durante 30 minutos a uma temperatura de -70°C. Adiciona-se-lhe uma solução de litioetanol bromado [preparada a partir de bromoetanol e de n-BuLi (2,5 M em hexano) em tetrahidrofurano], a transferência d a qual é feita por intermédio de uma cânula e mantendo a temperatura interna inferior a -65°C. Agita-se a mistura durante 5 minutos a -65°C, e depois deixa-se aquecer a mistura reaccional até à temperatura ambiente ao longo de hora e meia, e mantém-se a agitação durante mais 1 hora. Hidrolisa-se por adição de uma solução a 10 % de água em tetrahidrofurano, extrai-se com cloreto de metileno, seca-se e concentra-se. Purifica-se o resíduo obtido por cromatografia rápida sobre silicagel utilizando uma mistura eluente de cloreto de metileno/etanol (a 90/10). Isola-se o produto pretendido sob a forma de um óleo. IV: 3600-3090 cm'1; 1621 cm'1. R.M .N. . de 1R 300 MHz (DMSO· -d6) : 7,10, s, 1H, 7, 00, S, 1H, 4, 60, t, 1H, 4, 15, ai τ—1 T3 3, 95, d, 1H, 3, ,75, t, 1H, 3,50, m, 2H, 3,40, m, 2H, 3, 05, m, 2H, B o co CM 2H, 30 2,60, m, 2H, 2,30-2,00, m, 5H, 1,55-1,35, m, 4H, 1,15, t, 3H, 0,95, t, 3H, 0,85, t, 3H.

Passo B: (4aR, 12bR) -4-Propil-3, 4, 4a, 5, 6, 8, 9,12b-octâhidro-2H, llH-pirano [4 ', 3': 6, 7] nafto [1,2-b ] [1,4] oxazin-11-ona e o seu cloridrato

Adiciona-se uma solução de ácido clorídrico 6 N (2,1 mL) , à temperatura ambiente, a uma solução do produto obtido no passo precedente (1,08 g, 2,88 mmol) em metanol (9 mL) . Aquece-se a mistura resultante ao refluxo durante 20 horas. Depois de arrefecer até à temperatura ambiente, separa-se por filtração o precipitado que se formou para se obter o cloridrato do produto pretendido.

Ponto de fusão: 275-279°C IV: 2401 cm-1, 1712 cm'1, 1620 cm-1. R.M.N. de 1R 300M Hz (DMS0~d6) : 11,50, m, 1H; co o o Ui 1H; 7,21, s, 1H; 4,95, dd, 1H; 4, o LO t, 2H; 4, 25, d, 2H; 3, 60, m, 1H; 3 ,28, m, 3H; 3,05, m, 5H; 2,50, m, 1H; 2,00, m, 1H; 1,75, m, 2H; ET! CO -P O 0 1 1 EXEMPLO_6_i (4aR, 12bR) -4-Propil- 2,3,4,4a, 5, 6, 8, 9,10,12b-décahidro-llH-isoquino[6, 7-h][1,4]benzoxazin-ll-ona e o seu cloridrato 31

Passo A: (4aR, lObR)-8-Hidroximetil N, N-dietil-4-propil 3, 4, 4a, 5, 6,10b-hexahidro-2H-nafto [1,2- b][1, 4]oxazina-9-carboxamida

Dissolve-se o aldeído obtido no passo B do exemplo 4 (0,85 g, 2,4 mmol) em metanol (10 mL). Trata-se a solução arrefecida a 0°C com borohidreto de sódio (0,16 g, 4,23 mmol). Agita-se a mistura reaccional durante 20 horas deixando-a aquecer até à temperatura ambiente. Evapora-se o metanol em vazio. Retoma-se o resíduo em água e cloreto de metileno. Depois de uma decantação, uma secagem e uma concentração, purifica-se o resíduo obtido por cromatografia rápida sobre silicagel utilizando como eluente uma mistura de cloreto de metileno/etanol (a 95/5) . Obtém-se o produto pretendido sob a forma de um óleo. IV: 3600-3070 cm-1; 1627 cm"1. R.M.N. de 2Η 300 MHz (DMSO-dg) : 7,20, s, 1H; ' f 1H; 5,10, t, 1H; 4 ,35, d, 1H; 4,20, d, 1H ; 4, ,00, 3, 80, m, 1H; 3,40, q, 2H; 3,10, q, 2H; 2,80, m, 4H; 00 , m, 4H; 1,45, m, 3H; 1,10, t, 3H; 0,95, t, 3H; m, 0,85, t, 3H,

Passo B: (4aR,1ObR)-8-Clorometil-N, N-dietil-4- propil-3,4,4a,5, 6,10b-hexahidro-2H-nafto[1,2-b][1, 4]oxazina-9-carboxamida 32

Trata-se uma solução do álcool obtido no passo precedente em tolueno com cloreto de tionilo (0,4 mL). Agita-se a mistura à temperatura ambiente durante 20 horas. Evapora-se o tolueno em vazio. Retoma-se o resíduo em água e cloreto de metileno. Depois de se decantar, lava-se com uma solução aquosa de bicarbonato de sódio, seca-se, e obtém-se o composto pretendido sob a forma de um óleo. IV: 1627 cm'1. R.M.N. de 300 MHz (DMSO- ~d6): 7,25, s, 1H; 7, 20, s, 1H; 4,65 , d, 1H; 4 ,20, d, , 1H; 4,00, dd, 1H; 3, ,80, td 1H; 3,45, q, 2H; 3, 10, q, 2H; 2, 90· -2,70, m, 4H; 2, ,40- 2, 05, m, 4H; 1,6- -1,35, m, 3H; 1, 25, t , 3H; 1,00, t, 3H; o, 90, t, 3H.

Passo C: (4aR,1ObR)-8-Cianometil-N, N-dietil-4- propil-3, 4, 4a, 5, 6,10b-hexahidro-2H-nafto [1,2-b] [1, 4]oxazina-9-carboxamida

Trata-se uma solução do composto obtido no passo precedente (0,64 g, 1,68 mmol) em tetrahidrofurano (15 mL) com cianeto de tetra-butilamónio (0,8 g, 2,98 mmol) durante 20 horas. Concentra-se a mistura reaccional em vazio. Retoma-se o resíduo em água e cloreto de metileno. Depois de uma decantação, uma secagem e uma concentração, obtém-se o nitrilo pretendido sob a forma de um óleo. IV: 1628 cm'1. 33 R.M.N. de 300 MHz (DMSO~d6) : 7,20, 2s, 2H; 4, 20, d, 1H; O O dd, 1H; 3,80, m+s, 3H; 3, 45, q, 2H 3, 10, q, 2H; 2,90-2, .70, m , 4H; 2,35-2,05, m, 4H; 1,55-1, ,35 m, 3H; ' 1,15, t, 3H; 1,00, t, 3H; 0,85, t, 3H.

Passo D: (4aR,lObR)-8- (2-Aminoetil)-N, N-dietil 4-propil-3, 4, 4a, 5, 6,10b-hexahidro-2H-nafto [1,2-b] [1, 4]oxazina-9-carboxamida

Trata-se uma solução do composto obtido no passo precedente (2,7 g, 7,3 mmol) , em metanol (250 mL), com hidrogénio a uma pressão de 4 bar, em presença de Ni de Raney (1 g), a 60°C, durante 4 h. Depois de arrefecer até à temperatura ambiente, separa-se o catalisador por filtração, concentra-se então o filtrado. Purifica-se o resíduo obtido por cromatografia rápida sobre silicagel utilizando uma mistura eluente de cloreto de metileno/etanol/amoníaco (a 90/10/1). Isola-se o produto pretendido sob a forma de um sólido amorfo. IV: 3360-3310 cm-1, 1626 cm"1. R.M.N. de 2H 300 MHz (DMS0~d6) : 7,10, s, 1H; 7, 00, s, 1H; 4, 20, d, 1H; 4, 00, m, 1H; 3, 80, m, 1H; 3,45 q/ 2H; 3,10, q> 2H; 2,9-2,7, m, 4H; 2,50, m, 2H; 2,4-2,05 m, 4H; 1,6-1, 3, m, 3H; 1,20, t, 3H; 1,00, t, 3H; 0,90, t 3H. 34

Passo_Ej_ (4aR, 12bR)-4-Propil- 2, 3, 4, 4a, 5, 6, 8, 9,10,12b-decahidro-llH-isoquino[6, 7-h][1, 4]benzoxazin-ll-ona e o seu cloridrato

Adiciona-se uma solução de terc-butil-lítio, 1,5 M em pentano (1,9 mL, 3,21 mmol) a uma solução da amina obtida no passo precedente (0,40 g) em tetrahidrofurano (45 mL) . Agita-se a mistura reaccional durante 10 minutos a -78°C, e em seguida durante 20 minutos a -40°C. Hidrolisa-se a mistura com uma solução de água a 10 % em tetrahidrofurano. Depois de uma decantação em presença de cloreto de metileno, uma secagem e uma concentração sob pressão reduzida, purifica-se o resíduo obtido por cromatografia rápida sobre silicagel, utilizando uma mistura eluente de cloreto de metileno/etanol (a 90/10). Isola-se o produto pretendido sob a forma de um sólido amorfo cujo cloridrato se cristaliza a partir de acetato etilo.

Ponto de fusão: 263-265°C IV: 1666 cm 1. R.M.N. de ^ (DMSO-de) : 7,90, S, 1H; 7,10, s, 1H; LO O O d, 1H; 4,25, m, 2H; 3,60, m, 1H; 3,4- 3,15, m, 5H; 3, 00, m, 3H; 2,85, m, 2H; 2,50, m, 2H; 2,00, m, 1H; 1,75, m, 2H; O O T-1 t, 3H. 35 EXEMPLO_7: (4ai?, liba)-9-Metil-4-propil- 3,4,4a,5,6,8,9,llb-octahidroisoindolo[5,6-h][1,4]benzoxazin-10(2H)-ona e o seu cloridrato

Aquece-se uma solução do produto do exemplo 4 (1 g, 3,08 mmol) numa solução aquosa de metilamina a 40 % (10 mL) , durante 16 horas, num autoclave, a 120°C. Depois de arrefecer até à temperatura ambiente, extrai-se a mistura com cloreto de metileno, seca-se a fase orgânica sobre MgS04. Por concentração obtém-se um resíduo que se purifica por cromatografia rápida sobre silicagel utilizando uma mistura eluente de cloreto de metileno/etanol (a 95/5).

Obtém-se o produto pretendido sob a forma de um sólido branco cujo cloridrato se cristaliza a partir de acetonitrilo.

Ponto de fusão: 240-245°C IV: 1692 cm 1. R.M.N. de 2H 300 MHz (DMSQ-de) : 8,00, s, 1H; 7,10, s, 1H; 4,35, d, 1H; 4,30, s ; 2H; 4,10, m, 1H; 3,95, m, 1H; 3,20, s, 3H; 3,00, m, 2H; 2,90, m, 1H; 2,85, m, 1H; 2,50, m,1H; 2,30, m, 3H; 1,7-1,4 ; m, 3H; 0,90, t, 3H. EXEMPLO_8: (4aJ?, 12bJ?) -4-Propil- 2,3,4,4a,5,6,10,12b-octahidro-llH-isoquino[6, 7-h][1,4]benzoxazin-ll-ona e o seu cloridrato 36

Passo A: Cloreto do ácido (4aR,lObR)-9- (4-propil 3, 4, 4a, 5, 6,1 Ob-hexahidro-2H-nafto [1, 2-b] [1, 4] oxazina) -carboxilico

Adicionam-se gota a gota 3,6 mL (41,7 mmol) de cloreto de tionilo a uma suspensão do ácido (4aA, 10b-R) -4-propil-3,4,4a,5,6,10b-hexahidro-2H-nafto[1,2-b][1,4]oxazina-9-carboxílico (10 g, 32 mmol) em tolueno anidro (100 mL) e dimetilformamide (0,15 mL) . Aquece-se a mistura resultante ao refluxo durante 1 hora. Depois de arrefecer até à temperatura ambiente, filtra-se a mistura reaccional, lava-se o resíduo sólido com tolueno. Seca-se o sólido numa estufa de vácuo em presença de P2O5 até peso constante, para se obter 0 produto pretendido. IV: 2457 cm'1; 1753 cm'1 ; 814-775 cm'1. R.M.N. de 300 MHz (DMSO~d6) : 8,05 (s) 1H, 7,80 (dd) 1H, 7,30 (d) 1H, 5,05 (d) 1H, 4,30 (m) 2H, 3,60 (d) 1H, 3,50 (NH) 1H, 3,30 (m) 3H, 3,00 (m) 3H, 2,50 (m) 1H, 2,10 (m) 1H, 1,75 (m) 2H, 0,95 (t) 3H.

Passo B Metoximetilamida do ácido (4aR,lObR)-9-(4-propil-3, 4, 4a, 5, 6,10b-hexahidro~2H-nafto [1,2-b] [1, 4]oxazina)-carboxilico

Adicionam-se 2,62 g (31,3 mmol) de cloridrato de metoxilamina a uma mistura de carbonato de potássio (13 g, 94 mmol) em água (31 mL) e acetato de etilo (62 mL) . 37

Adiciona-se em porções, à mistura arrefecida a 0°C, o cloreto de acilo do passo A (10,35 g, 31,3 mmol), mantendo a temperatura inferior a 5°C. Agita-se a mistura reaccional durante 2 horas a 0°C. Depois de se lhe adicionar acetato de etilo e água à temperatura ambiente, decanta-se a mistura reaccional, lava-se a fase orgânica com água, seca-se sobre sulfato de magnésio, e depois concentra-se em vazio, para se obter o produto pretendido sob a forma de um sólido.

Ponto de fusão: 147-152°C IV: 3194 cm"1, 2870 cm"1, 2803-2767 cm"1,1650 cm"1, 1272- -1126 cm"1 , 834- -760 cm 1. R.M. . N. de 1H 300 MHz (DMSO-de) : 11 ,60 (s) 1H, 7,82 (s) 1H, 7, 55 (dd) 1H, 7,18 (d) 1H, 4, 20 (d) 1H, 4,00 (dd) 1H, 3,80 (td) 1H, 2,7 a 3,00 (m) 3H, 2 ,30 (m) 2H, 2, 05 a 2,2 (m) 2H, 1,45 (m) 3H, 0,88 (t) 3H.

Passo_Cj_ (4aR, 12bR)-10-Metoxi-4-propil- 2, 3, 4, 4a, 5, 6,10,12b-octaahidro-llH-isoquino [6, 7-h] [1, 4]benzoxazin-ll-ona

Adiciona-se uma solução da amida obtida no passo B (4 g, 13,14 mmol) em tetrahidrofurano (40 mL) a uma solução de s-BuLi (24 mL, 31,53 mM) e de Ν,Ν,Ν',Ν'-tetrametiletilenodiamina (TMEDA) (4,8 mL, 31,53 mmol) em tetrahidrofurano (90 mL), arrefecida a -78°C, mantendo uma 38 temperatura inferior a -70°C. Aquece-se a mistura reaccional a uma temperatura de -20°C, e depois agita-se durante 45 minutos a uma temperatura média de -10°C. Arrefece-se de novo a mistura reaccional a -78°C e adiciona-se-lhe iodeto de metilo (0,9 mL, 14,45 mmol). Aumenta-se a temperatura até 0°C e depois até à temperatura ambiente. Leva-se a cabo a hidrólise com uma solução saturada de cloreto de amónio. Adiciona-se éter etílico, decanta-se a mistura, lava-se a fase orgânica com água, seca-se sobre sulfato de magnésio, e depois concentra-se em vazio. Adiciona-se uma solução de s-BuLi (21,4 mL, 27,8 mmol) a uma solução do resíduo obtido (4,04 g) em tetrahidrofurano (83 mL) . Arrefece-se a -78°C e agita-se durante 2 horas a esta temperatura. Adiciona-se dimetilformamide (1,13 mL, 14,6 mmol) à mistura reaccional, mantendo-se uma temperatura inferior a -70°C, agitando-se durante 10 minutos a esta temperatura antes de se aquecer até a temperatura ambiente. Leva-se a cabo a hidrólise com uma solução saturada de cloreto de amónio. Depois de se adicionar éter etílico, decanta-se a mistura, lava-se a fase orgânica com água, seca-se sobre sulfato de magnésio, e depois concentra-se em vazio. Retoma-se o resíduo em tetrahidrofurano (330 mL) , adiciona-se-lhe ácido clorídrico concentrado (13,5 mL) e agita-se a mistura durante 1 hora à temperatura ambiente. Depois de um tratamento com uma solução concentrada d soda cáustica, de uma extracção com acetato de etilo, lavagens com água e com uma solução de cloreto de sódio, seca-se a fase orgânica sobre sulfato de magnésio, e depois concentra-se em vazio. Purifica-se o 39 resíduo obtido por cromatografia rápida sobre silicagel utilizando uma mistura eluente de cloreto de metileno/etanol (a 95/5). Isola-se o produto pretendido sob a forma de um sólido bege.

Ponto de fusão: 142-145°C R.M.N. de ^ 400 MHz (CPC13) : 8,65, 7,25, 7,22, 6,35, 4,47, 4,12-4,03, 4,05, 3,00 ppm.

Passo D: (4aR, 12bR) -4-Propil-2, 3, 4, 4ar 5, 6,10,12b-octahidro-llH-isoquino[6, 7-h][1, 4]benzoxazin-ll-ona e o seu cloridrato

Adiciona-se uma solução de T1CI3 a 15 % de água (7,6 mL), a uma solução do composto do passo C (1,1 g, 3,35 mmol) em etanol (3,3 mL) . Aquece-se a mistura reaccional durante 24 horas a 45°C. Continua a aquecer-se durante mais 6 dias adicionando-se quotidianamente uma solução de T1CI3 a 15 % (3,5 mL) . Depois de arrefecer até à temperatura ambiente, trata-se a mistura reaccional com água (30 mL) e com gelo (30 g), e depois torna-se alcalina, pH 13-14, por adição de soda cáustica a 35 %. Trata-se a suspensão negra com uma corrente de ar comprimido até decorar por completo. Extrai-se com cloreto de metileno, seca-se a concentra-se, purifica-se o resíduo obtido por cromatografia rápida sobre silicagel utilizando uma mistura eluente de cloreto de metileno/etanol (a 95/5). Isola-se o produto pretendido sob 40 a forma de um sólido branco cujo cloridrato se cristaliza a partir de acetonitrilo.

Ponto de fusão: 200-203°C IV: 3457 cm"1, 3162 cm"1, 1632 cm"1. R.M.N. de 400 MHz (DMSO~d6) : 11,10 (m) 2H, 8,25 (s) 1H, 7,40 (s) 1H, 7,10 (t) 1H, 6,40 (d) 1H, 4,95 (d) 1H, 4,25 (m) 2H, 3,60 (d) 1H, 3,3-3,0 (2m) 2H, 3,05-2,00 (2m) 4H, 1,70 (m) 2H, 0,95 (t) 3H.

ESTUDO FARMACOLÓGICO EXEMPLO 9: Estudo da ligação aos receptores humanos D2 e D3

Cultura de células

Transfectaram-se as células CHO (de Ovário de Hamster Chinês) de um modo estável através do gene que codifica para o receptor humano da dopamina D2 ou D3, de acordo com os métodos conhecidos na literatura. As células nativas são deficientes em enzima DHFR (DiHidroFolato Reductase). Cultivam-se estas células numa estufa a 37°C sob uma atmosfera húmida com 5 % de C02, 95 % de ar.

Levaram-se a cabo as transfecções utilizando a Lipofectina (Gibco). Seleccionaram-se as células CHO cotransfectadas com o receptor D2 humano e o gene de resistência à 41 fleomicina pela sua resistência à presença deste antibiótico no meio de cultura. Seleccionaram-se as células transfectadas com o receptor D3 humano num meio desprovido de hipoxantina/timidina, em presença de metotrexato. Composições dos meios de cultura utilizados para as células CHO-D2: DMEM (Meio Eagle Modificado da Dulbecco) com um suplemento de 10 % de soro fetal de vitelo e de hipoxantina/timidina; para as células CHO-D3: DMEM com um suplemento a 10 % de soro fetal de vitelo dialisador.

Recolheram-se as células quando atingiram a confluência e prepararam-se então as membranas.

Preparação de membranas:

Passados alguns minutos em presença de tripsina a 0,2 %, recuperam-se as células e centrifugam-se a 2.000 g durante 5 minutos. Suspende-se de novo a pastilha de células em tampão Tris-HCl 10 mM, a pH 7,5, contendo MgSCu 5 mM , e depois passa-se por Polytron®. Centrifuga-se em seguida o homogenado a 50.000 g durante 15 minutos, e volta a suspender-se a pastilha com sonicação suave, em tampão de incubação com a composição seguinte: 50 mM em tris-HCl, pH 7,5, contendo NaCl 120 mM, KC1 5 mM, CaCl2 2 mM, MgCl2 5 mM. Distribuem-se em seguida as membranas por aliquotas, e conservam-se a -80°C até ao dia da experiência.

Experiências de ligação 42

Levam-se a cabo as incubações em tubos em polipropileno com um volume final de 400 pL, contendo: 100 pL de [125I]-iodossulprido (Amersham) a 0,1 e a 0,2 nM, respectivamente para os receptores D2 e D3. 100 pL de tampão (tubos totais) ou 100 pL de racloprido 10 pM (ligação não especifica) ou 100 pL de composto 200 pL de preparação de membranas contendo os receptores D2 ou D3, em tampão a que se adicionou 0,2 % de BSA (Albumina de soro de Bovino).

As gamas de concentração de cada composto comportam pelo menos sete pontos determinados em triplicado. Cada experiência é repetida pelo menos duas vezes. A incubação dura trinta minutos a 30°C e termina-se por uma filtração rápida num equipamento Brandle, seguindo-se três lavagens do bolo com tampão de Tris-HCl a pH 7,4 contendo NaCl 120 mM. Recuperam-se os filtros e em seguida contam-se com um contador gama.

Análise dos resultados 43 0 valor de IC50 que representa a concentração com a qual resulta 50 % de inibição da ligação do radioligando é calculado por regressão não linear (método Prism Graph). O valor de Kd é derivado da fórmula Ki=IC5o/(1+L/Kd) , em que L é a concentração de [125I]-iodossulprido utilizada na experiência sendo Kd a sua constante de dissociação. Os resultados são exprimidos sob a forma de pKd (pKi= -log KJ .

Para os receptores humanos D2 e D3, os Kd são respectivamente iguais a 0,5 e a 1,31 nM.

Resultados pKi Composto 1 h°3 1 hD2 I Exemplo 1 JLidl 5,9 1 | Exemplo 2 | 8,4 | ............6,1..............[ | Exemplo 4 ! 8,1 ! 5,7 1 Exemplo 5 ! 6, 9 | 5,8 f í Exemplo 6 Àldà I Exemplo 8 1 7,7 1 5,9 1 EXEMPLO 10: Activação dos auto-receptores pré-sinápticos dopaminérgicos. Teste de registo da actividade eléctrica unitária, extra-celular, na área tegmental ventral do rato. 44

Princípio A administração de um agonista dopaminérgico diminui de um modo dependente da dose a frequência de descarga dos neurónios. Este efeito é invertido pelo haloperidol, antagonista dopaminérgico. Método

Anestesiam-se os ratos com hidrato de cloral (400 mg/kg, i.p.) e colocam-se num aparelho de estereotaxia (Unimécanique, França) depois de se haver colocado um cateter na veia femoral. O nível de anestesia é mantido por uma administração i.p. do hidrato de cloral de hora a hora; conserva-se a temperatura rectal a 37±1°C com um cobertor eléctrico termostatizado. Coloca-se um micro-eléctrodo em tungsténio (10 ΜΩ, 1 pm) ao nível da área tegmental ventral usando um aparelho electrónico para esta inserção (Unimécanique, França) (AP: -5,5 / bregma ; L: 0,7; H: 7,0-8,5/dura; atlas de Paxinos e Watson, 1986). Os potenciais das células dopaminérgicas são reconhecidos pela sua morfologia (potenciais trifásicos +/-/+, com uma duração superior a 3 mili-segundos), o seu ritmo de descarga, quer regular, quer em pulsações de amplitude decrescente, e a sua frequência de descarga compreendida entre 2 e 8 Hz. Regista-se uma célula por animal, apenas. 45

No final de um período > 5 minutos, (actividade de base) e de uma primeira injecção de veículo (água destilada à qual se adicionaram algumas gotas de ácido láctico diluído; pH ajustado a 5 com NaOH 1 N) , administram-se os produtos da invenção por via endovenosa em doses acumuladas crescentes, com um intervalo de 2-3 minutos.

Análise dos resultados

Faz-se a aquisição de dados utilizando o programa Spike2 (Cambridge Electronic Design, Inglaterra). A frequência de descarga é com no máximo um minuto de variação entre cada injecção, e é exprimida em percentagem de variação em relação à actividade de base (média dos 5 minutos anteriores ao primeiro tratamento), definida como sendo 100 %. Avalia-se estatisticamente o efeito dos produtos por uma análise de variância sobre medições repetidas seguida por um teste de Dunnett para comparação dos efeitos das diferentes doses com o efeito do veículo (água destilada).

Resultados A título de exemplo, a tabela seguinte mostra os efeitos do produto do exemplo 2. 46 ! Exemplo 2 - l Frequência de descarga 1 : dose pg/kg dos neurónios i. V . i veiculo (0) \ 102,6 ±0,9 | 1 0,125 91,8 ±5,2 1 i 0,25 | 79,9 ±5,9* | 1 0,5 | 66,3 ± 5,9* | |.................1, o................. j 42,0 ± 7,3* | I 2,0 [ 10,8 ± 8,7* | 1 4,0 I 2,3 ± 2,3* 1 8,0 ! 0,0 1 0,0* | tValores individuais (n = 5) = Médial f± erro padrão da média. 1 |* = p < 0,05 em relação ao veículo | EXEMPLO 11: Propriedades antidepressivas: teste da natação forçada no rato 0 teste da natação forçada (Porsolt R. et al., Eur. J. Pharmacol., 1978, 47, 379-91) é um teste comportamental que consiste em induzir no rato um estado de "desespero", colocando o animal néscio durante quinze minutos num local cheio de água, do qual ele não pode escapar-se. Durante os primeiros cinco a dez minutos, o rato debate-se vigorosamente e finalmente adopta uma 47 postura imóvel no final do ensaio. Colocado no dia seguinte no mesmo local, o animal permanece imóvel durante a maior parte do teste (duração de 5 minutos). Os antidepressivos diminuem a duração da imobilidade do rato, quando se leva a cabo o teste.

Experimentação A experiência é feita ao longo de dois dias, com 24 horas de intervalo, sobre ratos com um peso médio de 170 g, estabulados na véspera em jaulas individuais, com acesso livre a bebida e ao alimento.

No primeiro dia, coloca-se cada rato durante quinze minutos, num cilindro em vidro (20 cm de diâmetro x 40 cm de altura) cheio com água mantida a 25°C, até uma altura de 15 cm. No segundo dia, coloca-se o animal de novo num cilindro durante cinco minutos; mede-se o tempo total (em s) de imobilidade do rato. Administra-se ao animal o produto ou o solvente, trinta minutos antes do inicio do teste. Avalia-se estatisticamente o efeito dos produtos por uma análise de variância para medições repetidas, seguida por um teste de Dunnett para a comparação dos efeitos das diferentes doses com o efeito do veiculo (água destilada).

Resultados 48 A título de exemplo e para ilustrar a actividade dos produtos da invenção, listam-se os efeitos do produto do exemplo 2 na tabela que se segue:

Dose mg/kg Imobilidade (s) Produto s. c. média ± e.p.m. | Veiculo (água o 174,3 ± 9,1 i destilada)

Exemplo 2 f 0,02 1 159,4 ±7,9 0,04............. | 122,7 ± 21,2* 0,08 j 22,03 ± 5,8* * p<0,05 em relação a veículo - e.p.m. = erro padrão da média O produto do exemplo 2 diminui de um modo dependente da dose a duração de imobilidade do animal, e apresenta portanto um efeito antidepressivo excelente. EXEMPLO 12: Rotações induzidas pelos agonistas dopaminérgicos nos ratos com lesão unilateral da Substantia nigra

Princípio A injecçâo unilateral da neurotoxina 6-hidroxi- dopamina (6-OH-DA) na Substantia nigra produz uma degenerescência das vias ascendentes nigroestriadas, com hipersensibilidade dos receptores dopaminérgicos pós- 49 sinápticos do lado lesionado. Num rato submetido a uma tal lesão, a administração sistémica de produtos agonistas directos (apomorfina) induz rotações contralaterais (do lado oposto ao da lesão). Este teste permite demonstrar as propriedades dopaminérgicas agonistas de produtos com objectivos terapêuticos na doença de Parkinson. Métodos

Lesão: faz-se a lesão em ratos Wistar machos com 280 a 330 g, anestesiados com pentobarbital (40-50 mg/kg i.p.) e aos quais se administrara uma dose de 25 mg/kg i.p. de desipramina. Coloca-se o animal num aparelho estereotáxico KOPF, com o crânio orientado de acordo com o Atlas de Pellegrino e Cushman (1979). Injecta-se lentamente um volume de 4 pL de uma solução de 6-OH-DA (a 2 pg/pL) utilizando um dispositivo de microperfusâo, ao nivel da Substantiâ nigra do lado esquerdo, (A = 2,4 mm; L = 2,0 mm; V = 3,1 mm, em relação ao zero interneural) (U. Ungerstedt, Acta Physiol. Scandi. Suppl., 1971, 367, 69-93)

Material: o registo do número e do sentido das rotações é feito automaticamente no computador, graças ao sistema ROTACOUNT (Columbus Co, EUA). Coloca-se o animal num cilindro com fundo plano, de 30 cm de diâmetro e 50 cm de altura. Utiliza-se um cabo fino semi-rigido, para cintar o animal sob as patas dianteiras, o qual se liga à célula de contagem óptica situada por cima do cilindro, e ligada ao computador. 50

Selecção dos animais lesionados: um mês depois de se ter induzido a lesão pela 6-OH-DA, seleccionam-se os animais correctamente lesionados de acordo com um critério de pelo menos 150 rotações contralaterais efectuadas numa hora após administração do agonista dopaminérgico, apomorfina (a 0,04 mg/kg, s.c.).

Experimentação: testam-se os animais uma vez por semana, por administração dos produtos da invenção alternadamente com a do agonista dopaminérgico. O registo das rotações contralaterais inicia-se na altura da injecção do agonista dopaminérgico (To) e dura 1 hora. Avalia-se estatisticamente o efeito dos produtos por uma análise de variância para medições repetidas, seguida por um teste de Dunnett para comparar os efeitos das diferentes doses com o efeito do veiculo (água destilada).

Resultados A titulo de exemplo, a tabela seguinte mostra os efeitos do produto do exemplo 2 administrado por via s.c. |produto |Dose Is. c. mg/kgi! IVeiculo (água|0 rotações contralaterais 53,8 ± 12,8 (8) 51 rotações pose mg/kg: produto contralaterais fs.c. média ± e.p.m. (n) ídestilada) | lApomorfina 10,02 Ά9Ί,2 + 91,4 * (11) 1 jo,00063 157,4 ± 32,1 (5) lExernp 1 o 2 10,0025 337,3 ± 48,3 * (6) 10,01 ::553,8 + 138,3 * (5) * p<0,05 em relação ao veículo (n) = número de ratos e.p.m. = erro padrão da média O produto do exemplo 2 é activo neste teste para doses a partir de 0,0025 mg/kg. EXEMPLO 13: Propriedades ansiolíticas - Teste de vocalizações ultra-sónicas no rato.

Princípio

Quando se coloca um rato num ambiente anteriormente associado com uma experiência desagradável (choques eléctricos nas patas), a sua ansiedade traduz-se pela emissão de ruidos não audíveis (ou vocalizações ultra-sónicas) . A actividade ansiolítica de um produto manifesta-se por uma diminuição da duração destas vocalizações.

Aparelhagem 52

Equipam-se caixas padrão (Coulbourn Instruments), colocadas em recipientes insonorisantes, e ventiladas, com um chão constituído por barras metálicas electrifiçáveis (gerador de choques e scrambler da Med Associates Inc.) e com um microfone situado no centro do tecto. Transformam-se os ultrassons numa gama audível (detector de morcegos Buitenbedrijf). Filtram-se os sinais que desta forma se modificaram e depois tratam-se (programa RTS, Engineering Design). Registam-se os espectrogramas que desta forma se obtêm em bandas DAT. Método

Alojam-se ratos de estirpe Wistar machos pesando 180-200 g à chegada em jaulas para quatro, com livre acesso a água e a alimento, desde cinco dias antes do início do estudo até ao fim do estudo referido. O processo utilizado pode ser decomposto em três passos sucessivos, separados por 24 h, denominados treino, selecção e teste. Durante a sessão de treino, colocam-se os animais individualmente nas caixas, aonde recebem seis choques eléctricos (0,8 mA, 8 s) distribuídos aleatoriamente ao longo de um período de sete minutos. A selecção consiste em colocar-se cada a animal numa caixa durante dois minutos para receber um único choque, e colocar de novo o animal trinta minutos mais tarde para uma sessão de registo das vocalizações ultra-sónicas com a duração de dez minutos; os animais cujas vocalizações duram menos do que 90 segundos são desprezados 53 na sequência das operações da experiência. A fase de teste desenrola-se de um modo semelhante ao passo de selecção, sendo além disso administrados os produtos ou o veiculo no final da sessão de dois minutos. Avalia-se estatisticamente o efeito dos produtos por uma análise de variância para medições repetidas, seguida por um teste de Dunnett para a comparação dos efeitos das diferentes doses com o efeito de veiculo (água destilada)

Resultados A titulo de exemplo, a tabela seguinte mostra os efeitos do produto do exemplo 2 administrado por via s.c. a um volume de 1 mL/kg. :Dose de irnq/kg s.c. Duração das Exemplo 2. .sónicas Irnédia ± e.p.m vocalizações • (n) ultra-i! (s) jo (254,3 ± 42,1 (7)........................................ j0,0025 1.27.4,0 ±. 59,0 Γ') [0,04 128,0 ± 5,6 * (5)________________________________________ :0,63 :22,0 ± 3,2 * (5) \e.p.m. : erro padrão da média - n: número de rato st l* p < 0,05 em relação ao veículo A doses de 0,04 e de 0,63 mg/kg, este produto origina uma diminuição importante da duração das vocalizações, o que traduz a sua actividade ansiolitica. 54 EXEMPLO 14: Composição farmacêutica Fórmula de preparação para 1.000 comprimidos doseados a 10 mg :

Composto do exemplo 2 10 g Hidroxipropilcelulose 2 g Amido de trigo 10 g Lactose 100 g Estearato de magnésio 3 g Talco 3 g

Lisboa, 10 de Novembro de 2010.

Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. Compostos com a fórmula I, com a configuração relativa trans:

na qual: X represente um átomo de oxigénio ou um grupo nr2, Y represente um grupo seleccionado de entre -CH2-, -(CH2)2- e -CH=CH-, Ri e R2, iguais ou diferentes, representem cada um deles um átomo de hidrogénio ou um grupo seleccionado entre alquilo C1-C6 linear ou ramificado, cicloalquilo C3-C8 e cicloalquilalquilo, no qual a parte alquilo seja em C1-C6 e seja linear ou ramificada, e a parte cicloalquilo seja em C3-C8, sob uma forma racémica ou a de isómeros ópticos, 2 bem como os seus sais de adição com um ácido aceitável do ponto de vista farmacêutico, e os seus hidratos.

2. Compostos com a fórmula I de acordo com a reivindicação 1, em que Ri represente um grupo alquilo.

3. Compostos com a fórmula I de acordo com a reivindicação 1 ou a 2, em que X represente um grupo NR2.

4. Compostos com a fórmula I de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que Y represente um grupo CH2.

5. Composto com a fórmula I de acordo com a reivindicação 1 que seja seleccionado de entre: • a (4aRS, llb-RS) -4-propil-3, 4,4a, 5,6,8,9,11b-octahidroisoindolo[5,6-h] [1,4]benzoxazin-10(2fí)-ona, bem como os seus enantiómeros e os sais de adição a um ácido aceitável do ponto de vista farmacêutico; • a (4aR,llbR)-4-propil-2,3,4,4a,5,6,8,llb-octahidro-lOíí-furo [3',4' :6,7]nafto[l,2- b] [1,4]oxazin-10-ona, bem como os seus sais de adição a um ácido aceitável do ponto de vista farmacêutico; • a (4aR,12bR)-4-propil-3,4,4a,5,6,8,9,12b-octahidro-2H,llH-pirano[4',3':6,7]nafto[l,2- 3 b] [ 1,4]oxazin-ll-ona, bem como os seus sais de adição a um ácido aceitável do ponto de vista farmacêutico; • a (4a_R, 12b.R)-4-propil-2,3,4,4a, 5, 6, 8, 9,10,12b- decahidro-llH-isoquino[6,7-h] [1,4]benzoxazin-11-ona, bem como os seus sais de adição a um ácido aceitável do ponto de vista farmacêutico; e • a (4aJ?, 12bJ?) -4-propil-2,3, 4,4a, 5, 6,10,12b- octahidro-llH-isoquino[6, l-h] [1,4] benzoxazin-11-ona, bem como os seus sais de adição a um ácido aceitável do ponto de vista farmacêutico. fórmula composto trans:

6. Processo de preparação dos compostos com a de acordo com a reivindicação 1, a partir de um com a fórmula II, com a configuração relativa

Π na qual Ri seja tal como se definiu para a fórmula I 4 que se faz reagir com anidrido tríflico em presença de piridina, para se obter um composto com a fórmula III:

na qual Ri seja tal como foi definido anteriormente, que se faz reagir com cianeto de zinco e com tetraquis(trifenilfosfina)paládio (0) em dimetilformamida a quente, para se obter o composto com a fórmula IV:

na qual Ri seja tal como foi definido anteriormente, que se trata com uma mistura de ácido clorídrico com ácido acético ao refluxo, para se obter um composto com a fórmula V: 5

na qual Ri seja tal como foi definido anteriormente, que em seguida se transforma num composto com a fórmula I, por reacções clássicas da quimica orgânica.

7. Composição farmacêutica contendo a titulo de principio activo um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, combinado com um ou diversos excipientes ou veículos inertes, não tóxicos, aceitáveis do ponto de vista farmacêutico.

8. Utilização dos compostos com a fórmula I, de acordo com a reivindicação 1, para a preparação de medicamentos úteis no tratamento das doenças do sistema nervoso central nas quais o sistema dopaminérgico esteja implicado.

9. Utilização dos compostos com a fórmula I, de acordo com a reivindicação 1, para a preparação de medicamentos úteis na neuroprotecção ou no tratamento da doença de Parkinson, da hiperprolactinémia, da disfunção sexual, da depressão, da ansiedade, da doença de Alzheimer ou de outras doenças neurológicas degenerativas tais como 6 os ataques cerebrais.

10. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 7, útil para o tratamento das doenças do sistema nervoso central nas quais o sistema dopaminérgico esteja implicado.

11. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 7, útil para a neuroprotecção ou no tratamento da doença de Parkinson, da hiperprolactinémia, da disfunção sexual, da depressão, da ansiedade, da doença de Alzheimer ou de outras doenças neurológicas degenerativas tais como os ataques cerebrais. Lisboa, 10 de Novembro de 2010.