PT1877559E - Mutações e rearranjos mitocondriais como ferramenta de diagnóstico para a detecção de exposição solar, cancro da próstata e outros cancros - Google Patents

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DESCRIÇÃO "MUTAÇÕES E REARRANJOS MITOCONDRIAIS COMO FERRAMENTA DE DIAGNÓSTICO PARA A DETECÇÃO DE EXPOSIÇÃO SOLAR, CANCRO DA PRÓSTATA E OUTROS CANCROS"

Domínio Técnico da Invenção

Esta invenção refere-se ao domínio da genómica mitocondrial. Em particular, refere-se a mutações e rearranjos no genoma mitocondrial e à sua utilidade como indicador de exposição solar, envelhecimento e a génese ou existência de doenças, por exemplo, detecção da presença de pré-neoplasia, neoplasia e progressão para malignidade potencial antes de serem evidentes sintomas clínicos comuns.

Contexto da Invenção A grande tendência actual nas ciências biológicas é o projecto do genoma humano e exploração comercial dos dados. No entanto, há uma limitação excepcional à utilização e implementação destas informações, pois os dados não são específicos ao nível do indivíduo. Incrivelmente, os dados provêm apenas de alguns indivíduos, escassamente representativos da variação presente em populações humanas, tornando os dados úteis somente em aplicações gerais. A complexidade extraordinária do genoma humano torna impraticável a aplicação numa base individual. Para sequenciar completamente um genoma nuclear humano, o Departamento de Energia dos Estados Unidos e o Instituto Nacional de Saúde investiram 2,5 mil milhões de dólares desde 1988 (http://www.oml.govlhgmis/project/budget.html).

Genoma Mitocondrial 2 0 genoma mitocondrial é uma sequência de ácido nucleico compacta mas critica. 0 genoma mitocondrial codifica para subunidades enzimáticas necessárias para a respiração celular. 0 DNA mitocondrial, ou "mtDNA", é um genoma minúsculo de ácido nucleico com 16 569 pares de bases (bp) Anderson et al., 1981; Andrews et al.f 1999), em contraste com o imenso genoma nuclear de 3,3 mil milhões bp. 0 seu complemento genético é astronomicamente menor do que o do seu correspondente celular nuclear (0,0005%). Todavia, células individuais contêm desde cerca de 1GJ até 10* mitocôndrias, dependendo da função celular especifica (Singb e Módica-Napolitano 2002) . A comunicação ou sinalização Química ocorrem de modo rotineiro entre os genomas nuclear e mitocondrial (Sherratt et al., 1997).

Além disso, componentes nucleares específicos são responsáveis pela manutenção e integridade da sequência mitocondrial (Croteau et al., 1999). Quando estas áreas nucleares são tornadas não funcionais por rearranjos nucleares indicadores de doença potencial, começam a aparecer mutações em sequências de mtDNA. Adicionalmente, podem ser identificadas mitocôndrias específicas quanto a destruição intracelular por deieçôes induzidas por mutações somáticas no genoma mitocondrial. Este mecanismo teórico tambérn pode servir de indicação de doença iminente. São necessários cerca de 3 000 genes para produzir uma mitocôndria, em que apenas trinta e sete destes são codificados pelo genoma mitocondrial, o que indica uma dependência mitocondrial pesada de loci nucleares (Naviaux, 1997).

Todos os genoma s de DNA mitocondrial (mtDNA) num dado indivíduo são idênticos, dada a expansão cionai de mitocôndrias no ovo depois de ocorrida a fertilização. O 3 papel essencial do mtDNA é a geração do combustível celular, adenosina trifcsfato (ATF), que alimenta o metabolismo celular. De modo significativo, o genoma mitocondríal depende de setenta proteínas codificadas nucleares para efectuar as reacções de oxidação e redução necessárias à sua função vital, para além dos treze polipéptidos fornecidos pelo genoma mitocondríal (Leonard e Shapira, 1997). Diferentes tecidos e órgãos dependem da fosforilaçâo oxidativa em extensão variada. Doenças relacionadas com fosforilaçâo oxidativa defeituosa (OXPHOS) parecem estar intimamente ligadas a mutações do mtDNA (Byme, 1992) . Consequentemente, á medida que OXPHOS diminui devido a gravidade aumentada de mutações de mtDNA, são excedidos limites energéticos específicos de órgãos, o que origina uma variedade de fenótipos clínicos. Além disso, mutações no genoma. mitocondríal estão associadas a uma variedade de doenças degenerativas crónicas (Gattermann ei al„, 1995). E bem conhecido que o envelhecimento e tipos específicos de patologias podem alterar ou mutar mtDNA, comprometendo a capacidade de produção de energia da célula, Isto resulta muitas vezes em. súper "-expressão de mitocôndrías defeituosas e/ou a célula suplementa a falta de ATP tornando-se mais glicolítíca (Carew e Huang, 2002); assim, alterações ou mutações no genoma mitocondríal podem ser usadas corno marcadores de génese de doença e/ou progressão de doença, quando monitorizadas em intervalos sucessivos,

Recentemente, Fliss et al. (2000) encontraram, em tumores primários de cancro do pulmão e bexiga, uma frequência elevada de mutações de mtDNA de natureza predornin.antem.ente homoplásmica, indicando que o mtDNA mutante era dominante nas células malignas. Mutações pontuais e deleções parecem 4 ser o efeito secundário não programado mas inevitável de danos provocados por radicais livres de oxigénio na membrana e genoma de raitocôndrias (Miquel et al., 1992) . Esta teoria é plausível náo só porque o genoma mitocondrial não tem nistonas protectoras mas também porque é vulnerável a danos oxidativos perto da membrana mitocondrial interna geradora de oxigénio. Além disso, uma vez que o mtDNA tem um genoma compacto e está desprovido de intrões, é provável que eventos prejudiciais afectem uma sequência codificadora, originando uma disfunção bioquímica, Esta disfunção irá aumentar adicionalmente o "stress" oxidatívo celular, que irá conduzir a danos nucleares e no mtDNA, desse modo aumentando o potencial de uma célula para entrar no processo cancerígeno (Penta et ai., 2001). A este respeito, a investigação indica que com o envelhecimento há um. aumento de danos no mtDNA (Cortopassi & Wang, 1995) e um declínio subsequente da função respiratória (Miquel et al,, 1992), conduzindo a eventual morte celular.

Petros et alPNAS, volume 102, páginas 719 - 724, descreveram que a disfunção mitocondrial causada por mutações/deleções está correlacionada com o aparecimento de carcinoma da próstata. Na coluna da direita da página 723, é considerado que mutações de mtDNA desempenham um papel importante na etiologia de cancro da próstata. O cancro é mesmo denominado de "doença mitocondrial". Em Cormier-Daire, Journal of Pediatrias, volume 124, páginas 63 - 70, os autores descobriram que essa deleçâo (deleçâo de 3379 bp, compreendendo genes principais do complexo respiratório do complexo I, ND4L, ND4, ND5, bem como 3 genes de ribonuclease de transferência (tRNAs para His, Ser e Leu)), ver coluna da direita na página 66, está correlacionada/ 5 associada a diarreia crónica e atrofia das vilosidades em C Γ α 11C cl. S . mtDMA como Ferramenta de Diagnóstico A dinâmica de sequências de mtDNA é uma ferramenta de diagnóstico importante. Mutações no mtDNA sác muitas vezes indicadores preliminares de desenvolvimento de doença, frequentemente associadas a mutações nucleares, e actuam como biomarcadores especificamente relacionados com doenças, tais como mas não se limitando às seguintes: danos em tecidos e cancro devido ao hábito de fumar e exposição passiva a fumo (Lee ei ai,, 1998; Wei, 1998); longevidade, com base na acumulação de mutações no çenoma raitocondrial que começam aos cerca de 20 anos de idade e aumentando em seguida (von Wurmb, 1998); doença meta st ática causada por mutação ou exposição a agentes carcinogéniccs, mutagénicos, radiação ultravioleta (Birch-Machin, 2000); osteoartrite; doença cardiovascular, de Alzl íei. raer, de Par kl ..nson (S hoftner et aJ . , 1993; Sherratt ei al, / 1997; Zhang et al„, 1998) ; per da de audição associada à. idade (Seidman et al., 1997); degene rescência do nervo óptic :,o e disritmia c ::ardiaca (Brown et al ., 1997; Wallace et al ., 1988); í ;xoftalm oplegia extern a progressiva crónica (Taniike et al -, 1992); ateros clerose (Bogiiolo et ai, • ! 1999); carcir romãs pa o i. i cí i. e s da tiróide e tumores da tiróide (Yeh et al., 2000), bem como outras (por exemplo, Naviaux, 1997; Chinnery e Turnbull, 1999)„

Mutações em sítios específicos do genoma raitocondrial podem estar associadas a certas doenças. Por exemplo, mutações em 8216, 4217 e 4917 estão associadas a Neuropatia Óptica Hereditária de Leber (LHON) (Mitocbondrial Research Society; Huoponen (2001); MitoMap). Verificou-se que uma 6 mutação em 15452 em 5/5 pacientes está associada a deficiência em ubiquinol-citocromo c redutase (complexo III) (Valnot et al., 1999). Contudo, não se verificou que mutações nestes sitios estivessem associadas a cancro da próstata.

Especificamente, estas alterações incluem mutações pontuais (transições, transversões), deteções (uma base para milhares de bases), inversões, duplicações (uma base para milhares de bases), recombínações e inserções (uma base para milhares de bases). Adicionalmente, alterações, deteções ou combinações especificas de pares de bases estão associadas a surgimento precoce de cancro da próstata, pele e pulmão, bem como envelhecimento (por exemplo, Polyak ei al., 1998), envelhecimento prematuro, exposição a agentes carcinogénicos (Lee et s.l., 1998), etc.

Uma vez que o mtDNA passa para a progenitura exclusivamente através do ovo, é imperativo compreender sequências mitocondríaís através deste meio de hereditariedade. A sequência de mtDNA varia muito entre linhagens maternas (Ward et al., 1991) e, assim, mutações associadas a doença devem ser claramente compreendidas em comparação com esta variação. Por exemplo, uma transição específica T para C da na seqi ên cia de vár los ri ndivíduos , assoe 01303 3 3Í especif ico, pode de facto ser uma variaç ão natura) 1 ma 3p3Í hada numa dada área geográfí Cí ic uJ.ci.ir 03 3 ssociad; a a etni .cidade, Por ei remplo, oí Oi —. americanos nativos exp. T Θ 3 S 3 Γί! uma frequência Ig armente cLj- ta de diabetes com. surg imento no estadí Í" Λ , Adicio na.' imente, tod os os norte-ar nerican· os nativo; são geneticamente caracterizados por cinco linhagens maternas básicas, designadas A, B, C, D e X (Schurr et al., 7 1990; Stone e Stoneking, 1993; Smitn et ai., 1999), A linhagem A distingue-se por uma simples mutação pontual, originando um sitio Hae III em bp 663 no genoma mitocondrial, mas não há nenhuma relação causa-efeito entre esta mutação e o surgimento de diabetes no estado adulto. Adrcionalmente, mesmo dentro de aglomerados de linhagens há variação de secruênoras.

Fora dos marcadores específicos associados a uma linhagem particular há roais variação intra-populações do que variação de sequências inter-populações (Easton ei al., 1996; Ward et al ., 1991, 1' 993). Esta divergência QOVO SGI compreendida ]Jcí.a'cí U] ! Lei A. d.G Π t 1. T. 1. C cl· Ç cl· 0 óptiraa de mutações associadas a doenças, por tanto deve ser utili sada uma abordagem de estudo de 11; ihas matem as (Parsons et ei., 1997), imitando as po têncías de u ima concepção longitudinal (isto é, seguim· ente d c sujeito du rante um período de tempo substancial), para identificar mutações directamente associadas a do· onça, f;Pl ΟΌΟ S i cão a mutações sem associação a doença. Além disso, substâncias particulares, como fumo passivo, níveis baixos de amianto, chumbo, todos agentes mutagénicos conhecidos e era níveis baixos era muitos ambientes, podem ser a causa de mutações pontuais específicas mas não necessariamente ura marcador específico de doença. Assim, uma base de dados de sequências de mtDNA substanciais é um pré-requisito claro para uma previsão rigorosa de doença potencial como processo natural ou por exposiç mo lécul. lo a agentes causadores. Além disso, a totalidade da deve ser sequen ciada quanto ao seu teor íloba O conjunto completo de mutações siç :ões, transversões) , del.eções íuma base le bases), inversões, duplicações (uma base de bases), recombinai ções e insei :ções (uma rnformstivc oara milha: base para milhares de bases) deve ser caracterisado como um todo na totalidade do genoma mitocondrial. Isto assegura que são capturadas todas as informações poss íveis disponíveis no genoma mitocondrial. Apesar de o geno: ta de mitocôndrias citopla, smáticas (16 569 bp) i ser sido sequenciaao ao niv; 2l inarvicuai f tal como 0 seu correspondente nuciea r, o genoma mitocondrial não foi sequenciado ao nível populacional para utilizé :LÇaO como ferramenta de diagnóst ' Γ' -L- O ’-J »

Recentemente, mitocôndrias foram implicadas no processo carcinogénico devido ao seu papel na apoptose e outros aspectos da biologia tumoral (Green & Reed, 1998, Penta st al., 2001), em particular foram observadas mutações somáticas de mtDNA (mtDNA) nalguns tumores humanos (Habano 31 < 1998; Polyal ãl , 2000) . Est p al. 1998; Tamura et al „ 1999; Eliss, últimas descobertas tornaram-se ma is interessantes pelas reivindicações de que as mutações de mt DMA pa rt i CUi are s a par enta r am ser homo pl.ásrr i.i.cas () faban o ei al . 199 8; Po lys k θ t 3.1 e '1 c 98; Eli S Cf / et al 20 00) . Ad iciona ime nte > -1 .nvest: .gador :es de SI eobr iram. que a radi 3. Ç â O u ] f.ravi o 1 eta (u\ 1 ) Θ i mpo rta· nte no des snvo1 vi mento e pa togéne se de can cro da pele não-m.e lano ma (K ÍMSC) (v 'Jeins f- c") C1 ]r 1 9 98; Rees, 1 9 98) β uv 1 nduz ; dt ) nos no : mtDNA em peJ ..e hu mana (B ircb-M achin, 20 i) 3 3.) » A.i. ΟΓί t disso, ao 1 ongo do te; ifipO, a sequência mitocondrí .al perc le integri dac le . Por exernp' 1.0, a frequência da deleçâo de 4 9 7 7 bp aumer: 1 Lci (p om a . η.(Ϊ3(1θ (Fal m et al., 1996). Começar do 3.0 3 20 anos de Lda.de, esta de ieção começa a ocorrer em pequenos números de mitocôndrias. Aos 80 anos de idade foi deletado um número substanciai de moléculas. Esta deleçâo caracteriza o processo de envelhecimento normal e, como 9 9 oci-L / S Θ L v/ Θ de biomarcador par; quantificação deste processo de permitir inter vençao medica, c cu ou processo este processo. A envelhecimento pode ras, para abrandar o

Esta aplicação da genómica mitocondrial à medicina tem sido subestimada porque o mtDNA tem sido utilizado principalmente como ferramenta em genética populacional e ma is recentemente na < ciência fore ;nse; todavi Cl ; é cada vez ma i s evide nte que o teor de i nfor: mações do mtDNA tem aplicação sub; s t a n c i a ± no domínic ) do diaanó oo ..co médico. Além disso, a sequencd .ação da tot alid ade do < com plemento do mtDNA foi uma tarefa laboriosa antes do advento recente de sistemas robóticos de sequenciação de DNA de alta capacidade e alto rendimento. Adicionalmente, os çeneticistas populacionais conseguiram. reunir dados significativos de duas áreas altamente variáveis na região de controlo; no entanto, estas pequenas regiões representam uma pequena porção do genoma global, menos de 10%, signifiçando que 90% c lo poder O c- distinção dos dados não S50 usados. De modo s í gn 1. f icat ivc, muitas altera C· 0 Gi >d associadas a doenças es stào fora i. cia região de controlo. Deve ser considerada a caracterlstica de todo o genoma, de modo a incluir todas as informações de sequências, para um diagnóstico rigoroso e com alta capacidade de distinção.

Cancro da Pele Hão-Melanosaa O cancro de peie não-melanoma comum em muitas populações humano ÍNMSC) é o cancro ma is aucasianas (Weinstock, 1998;

Rees, 1998) de células (SCO . Os morbidez si . A maioria destes tumores consiste em carcinoma basais (BCC) e carcinoma de células escamosas BCCs são .iocai.m.ente invasivos e podem causar gnificativa, mas raramente metástases. Os SCCs 10 10 exibem potencial metastático significativo, e a ocorrência de múltíp] .os NMSCs em pacientes cora imunossupres; sáo causa problemas de gestáo importantes (Rees, 1998). Não obstante não haver lesões pré-malignas clinicamente iden tificadas para ECC, pensa-se que algun s SCCs surgem d e lesões precursora s, nomeadamente quere rtoses actínicas (AKs) ou áreas de doença de Bowen (carcinoma in síiu) (Rees, 1998}. Os SSCs exibem perda de heterozigosidade que afecta vários su g· p y p o en volvimento ; de vários genes s n "Λ seu de se nvolvimento. , E íntere ssante é obser vado um grau igr sal ou ma ior de . d. S 1 P C'. ,ρ c. . s pr: scursoras enr comparaç ão com • e t .1 Q04 . Reh man et ai., 1996), Isto é perda genética m SCCs (Rebman et importante para a invenção proposta, pois sugere ser provável que outros mecanismos, para além da ínactivação de genes supressores tumorais, estejam envolvidos no desenvolvimento de SCCs.

Originalmente pôs-se a hipótese de um. papel desempenhado por mitocôndr ias na turno ϊ :í génese qu ando se ver. 1ficou Q ue c é I ulas tumor,: ais têm um. si stema re soi ratór io enfr aσυeeido e θ.ΐ.θ vada aatividade < jl ico litiea (St : o. y « Werbi .n, 1987 ) , Des cobertas r ecentes que elucidam 0 pape) ί. de rai. .tooôndri 3. S na apoptose ( Green 1 Reed , 1998) jm itarner ite cora 3 eleva da inc idência de mutaçoe S d Θ mtDNA. homo plásm: loas em cancro do cól on (Habano et al,, 1998 ; Polyak 0Γ âl./ 1998, revisto 0ÍU Pen ta et ai,, 2001) , turno res primár: L.OS d 3 ΟΘΧ iQ a, tumor Θ S do pescoço e pu Iruâo (F1 iss et o. 1 2( 200) e gástric O S (Ta mura et al,, 19 99) corrobor srara adi cionalmente es ta hipótese. Além disso, foi proposto que estas mutações mitocondriais podem afectar os níveis de espéoies reactivas 11 de oxigénio (ROS) que se verificou serem altamente mitogénicas ÍPoiyak et al., 1998; Li et al,, 1997).

Estudos anteriores efectuacos pelos inventores e outros mostraram que mutações em mtDNA e a disfunção mitocondrial associada constituem contribuições importantes para doenças degenerativas humanas (Birch-Machin et al,, 199 3; Chinnery t al., 1999; Birch-Machin et

, Isto deve-se ao facto de o genoma mitocondrial ser particularmente susceptível a mutações devido ás elevadas quantidades de ROS produzidas neste organelo, acopladas à ausência de histonas protectoras e uma taxa baixa de reparação do mtDNA (tascucci ec ; Sawyer S van Houten; LeDoux et

De facto, a taxa de vezes ma is elevada do A ma.ror part 1999) em comparação com o núcleo mutações para mtDNA é cerca de de: que a do DNA nuclear (Wallace, mutações de mtDNA identificad; nos estudos namora is humanos recentes indi cou possivei ex posição a. agent es mutagénicos derivados de ϊ 108. Isto é importan- Γ ι-Ά par a a investigação de mutaç .ões de mt DNA e m NMSC oorque há evidências recentes do envolvimento directo de; B fh O .vA ,J induzidas por UV na ger 3 Ç 30 de deleçoes de mtDNA em. célul as et al., 2002) . de NMSC em. ρ r e cl .1 s p o s içâ o 8). As lesões se encontram. de pele humana (Bemeburg et al., 1999, Lowes Adicionalmente, o principal determinante indivíduos sem pigmentação protectora ou genética consiste em UV (Weinstock, 199 precursoras putativas de SCCs também predominantemente em sítios expostos a luz solar constante. Isto é importante, pois o trabalho do laboratório de Birch-Machin revelou diferenças distintas entre a incidência de danos de DNA mitocondrial em pele recolhida de diferentes sítios do corpo expostos ao sol. A grande maioria das 12 12 .ar constante lesões encontra-se em sities expostos a luz (Krishanan et ai., 2002). um dos rnv ‘entores 01 0 p nmeirc : a mo s rrar quan tita tívamer rte que ci. Gi- iposi çáo U V induz danos n o m ADNA (Bir ch-M aenín 0 t G 1 , 1 998) 0 ntDNA, como it aro ador mole cuia r, foi utilizi ado para Θ31 ud. ar a r ' Θ1 cl Ç cl 0 ‘ ant j :e o enve lhec imento cronolc ;,gicc i e roto “0Ϊ avelhec imento * sm pele huma na, Utilizou-se un ti mé todo dG PC R quantitativa íq ;PCR) com ?> "r )r imers para v astuc a 3.1' 3.3 3 1 t- ç.< trações na razâ o e ntre mt DM A d e .]. & L 8.0.0 em 4977 bp e de tip· 0 i selvage m rela.ti vam .ente «xposição solar e idade cronológica de pele humana,

Observo u-se um a umen t- Γ\ signí ficat a τ 7 Τ' niveis elev ados (i sto 3 ·- f > 1%) do mt DM b\ d· em. siti (•Λ O. C.'. xpostos sol (3 l-óf [27/ 1 0 0] ) sítios proi regidos do sol L (.1,1 % [1/ /0( j , } Pisbers , P - η η \ \ n G W p \J t’ \J .1. / t Em conseq uênoi d. f d ca. de mt D !NA podem ser út eis como ma rc • 3o curau la t ÍV3 a radia câo ult rav.ío.l et a„ na incidência Cí 0 0 X Ό O S 1. Ç 8.0

Além. disso, um estudo utilizando uma abordagem de Coloração "South-Western", envolvendo anticorpos monoclonais contra dímeros de timina, proporcionou evidências directas da presença de canos induzidos por IJV em mtDNA purificado (Ray et a 1, , 1998) .

Traba lho T ecente dc ) grupo de invés >tig açâo oos i n vent o ro s empre gou ur na técn ic,: a de PG R de exten .330 foi nga (I v„ τι CR) para atírol i fio ar a. to za .idade do genoma m íto condn í. ai, 00 m. a final. ida de de det .en ninar o espectro comi pleto de dei eçõe s de mtDNA se CU ndário d exposi ção UV (F (ay ãl , f 20; 'J ) r, Foi ef eot uad a uma an; áii se de 1 ?CR lo na a de 71 amo st ras de pele secar ada o 0 f em que í a G epiderme é sep arada di a d erme 13 13 subjacente, reiativament€ aumento significativo do à exposição sola: número de delecc

Observou-se um com exposição crescente Tjv na epiderme (teste de Kruskal-Wallis, p = 0, 0015) . As descobertas na epiderme não são confundidas por quaisquer aumentos dependentes da idade em deleções de mtDNA também detectadas peia técnica de PCR longa. O largo espec tro de deleções identificadas salienta a natureza ubiqu a e a e rievada ca rga mutacionai de mtDNA associada a expos ição UV Em com} paração com a detecção de deleções isola das uti lisando Pí IR competitiva, o estudo mostra que PCR longa é i ima técnica sensível e, em coi asequência, pode proporcionar um indice ma is abram gente, apesar de não quantitativo, de lesões de mtDNA global. .s na pele. Os estudos efectuados por um dos inventores descritos acima mostram claramente que mtDNA é ura alvo importante de UV; este assunto, em conjunto com o papel de mítocondrial em doença da pele, foi recentemente revisto (Birch-Machin, U ;

Dor inv estigada a pigx nentação do cabei o e pele huíx isnos, q ;ue Θ 8. iTi.cil or co-· variante de sensibilidade 5 UV e cai n c r o de pe le humano, Estas investi aaooes centraram -se na ar o SO 0.13. Ç â O de varíant es do gene receptor da mel.anocoí :ti: na ]. β sensibi 1 idade solar c le indivíduos e popu.laçôe s (Smith et ai. 19 9 0 f ΗΘ3..J. V bt a..1 . 1999; Flanagan et ai. 20 Healy et ai. 2 0 í 10; Rarding e: t al. 2000; Fia nagan et ã. 7.., 200 2) ^ r" ί C'> naaas com sus ceptib.il idade a cancro c u 3. pere, No entanto , estes estude >s não abordaram a variaç ã o ao nív el populacional em sequências de mtDNA em associação com tipos de pele e/ou cor do cabelo particulares.

Uma das questões que permanece amplamente sem resposta pelos estudos recentes de mutações de mtDNA em tumores 14 humanos é a incidência de deleções do genoraa mitocondrial relativamente a estes tumores. É importante responder a esta questão, pois um estudo preliminar de peie humana num único paciente mostrou diferenças na incidência da deleçâo comum de mtDNA entre vários tumores (AKs e SCCs) e pele normal (Pang et al., 1994) . De igual modo, os dados preliminares dos próprios inventores mostram um número aumentado de deleções de mtDNA em tumores comparado com pele normal. Por fim, Birch-Machin e outros mostraram que a incidência de deleções de mtDNA, bem como dupl ic. ações, aumenta com exposição crescente UV (Bem.ebu.rg et al. 1999; Birch-Machin et ai. 1998; Eay et ai. 1998; Ray et a 1. 1999;

Ray et ai. 2000), Lindsey et ai., 2001; Birch-Machin et al., 2001; Lowes et al., 2002, Krishnsn et al., 2002) .

Aparte as questões relacionadas com a progressão tumoral., outras questões vitais permanecem amplamente sem resposta pelos estudos recentes de mtDNA em tumores humanos (Habano et al., 1998; Fiiss et al., 2000). Em primeiro lugar, devido a limitações técnicas, não é claro se as mutações de mtDNA são verdade! ra.rn.ente homoplásmicas, pois níveis variáveis de heteroplasmia também podem indicar transições importantes para doença (Habano et al. 1998; Polyak et al. 1998; Fiiss et al. 2000); em segundo lugar, aparte um estudo (Tamura et al.. 1999), não foi investigada a incidência de deleções de mtDNA e 0 seu papei como potenciais bíomarcadores para NMSC. Os investigadores centraram-se na deteção comum e ignoraram o restante das cento e tal deleções. De igual modo, os investigadores centraram-se na identificação de mutações e não na sua quantificação. É importante avaliar rigorosamente, de um modo quantitativo, a incidência de deleções devido ao efeito limite de lesões de mtDNA na produção de ATP e, 15 consequentemente, na tunçác celular, Adicionalmente, e dificil caracterizar deleções. É tipicamente utilizada PCR longa que produz uma cascata de deleções, que então é necessário caracterizar. 0 diagnóstico actual de NMSC consiste na avaliação patológica de tecido excisado. Sm conformidade, é necessário um marcador precoce de danos de DEA induzidos por UV que predisponham um indivíduo a NMSC. Também é necessária uma ferramenta de diagnóstico de base genética que permita a detecção precoce e que seja rigorosa do ponto de vista do diagnóstico.

Cancro da Próstata 0 cancro da próstata é um tumor sólido frequentemente diagnosticado que muito provavelmente tem origem no epitèlio da próstata (Huang et ai. 1.999} , um 1997, quase 10 milhões de homens americanos foram rastreados quanto ao antigene específico da próstata (PSA), cuja presença sugere cancro da próstata (Wooduell, 1999). De facto, isto indica um número ainda maior de homens rastreados com um exame rectal digital (DRE) inicial. No mesmo ano, 31 milhões de homens fizeram um DRE (Wcodwell, 1999) . Além disso, o número anual de casos diagnosticados de novo de cancro da próstata nos Estados Unidos é estimado em 179 000 (Landis et sl, f 1999), E o segundo cancro msís habitualmente diagnosticado e a segunda causa principal de mortalidade por cancro em homens canadianos. Em 1997, o cancro da próstata foi responsável por 19 800 cancros diagnosticados de novo em homens canadianos (28%) (Instituto Nacional de Cancro do Canadá) . Estima-se que 30% a 90% de todos os homens com mais de quarenta e nove (49) anos de idade 16 tenham algumas células da próstata cancerosas, mas somente 20% a 25% destes homens têm uma forma clinicamente significativa de cancro da próstata (SpringNet - CE Connection, "internet”, www,springnet.com/ce/j803a.ntm) . O cancro da próstata exibe uma grande variedade de comportamento histológico, envolvendo factores erógenos e exógenos, isto é, situações socioeconómicas, dieta, geografia, desequilíbrio hormonal, historial familiar e constituição genética (Konishi et ai. 1997; Hayward et ai. 1998).

Do ponto de vista do risco, cancros da próstata familiares e hereditários não são considerados termos sinónimos. Cancros familiares referem-se às incidências numa família, mas não são herdados. Esta forma é responsável por até 25% dos cancros da próstata (Walsh & Partiu, 1997). Hereditariedade refere-se a um subtipo de cancro da próstata com uma hereditariedade Mendeliana de gene(s) de predisposição e é responsável por aproximadamente 9% dos casos relatados. Um historial familiar positivo de cancro da próstata para esta doença sugere que este (s) gene (s) de predisposição desempenha (m) um papel importante no desenvolvimento e progressão de cancro da próstata. Recentemente foram identificados genes de sus cept ibi1i da de nos cromossomas 1 e X como agentes de predisposição de homens a cancro da próstata, proporcionando um maior entendimento da etiologia de cancro hereditário (Berton et a.l, 1998; Xu et al. 1998), O prognóstico de cancro da próstata depende principalmente da fase e tipo tumorais no diagnóstico. Somente cancros da próstata localizados podem ser curados por tratamento radical, A detecçâo comum ainda se baseia no exame recuai 17 17 1, teste de PSA e exame histopatológico de tecidos ticos submet idos a biopsic i. A biopsia de uma massa é ada para cor ífirmar a mali gnidade, nâo é uma técnica ecção precoc e. Infelízment e, é impossível identificar digital, alguns tumores precoces durante os exames rectais. Os testes de PSA têm uma especificidade de 60 a 70% e uma sensibilidade de 7Q até 80% (comunicação pessoal, Dr. Sunil Gulavita, Centro de Cancro do Ontário do Noroeste). Uma técnica mais recente que refina o diagnóstico de tumores de tipo histológico comum é a análise de ploidía de DNA, que emprega citometria de fluxo (Shankey et al. 1995); no entanto, esta técnica mede alterações cromossómicas que só são claras em fases mais tardias do desenvolvimento de cancro e nâo é ' suficienten: lente se nsivel para a det ecçâo de pequenas alte rações da estrutur ra do DNA ou i nversões cromossó: micas, ou transi .ocaçôes reciprocas em cancros precoces A 7 ΤΊ venção centr a-se na detecção pre ;coce, uma vez que o prognóstico depende fortemente da fase da doença na altura do diagnóstico. A nossa compreensão de anormalidades genéticas em cancros da próstata é escassa, A investigação de cancro da próstata tem-se centrado no desenvolvimento do conhecimento nas seguintes áreas: 1) protc-cncogenes (Buttyan et al. 1987); 2) genes supressores turnorais (p53, p78, KAII e MMACI/PTEN;

Dong et al. 1995; Caírns et a. i - 9 y ‘) , e 3; activi da de de ta d. orne rase ; em t ò- S13 S Θ c: posítí va de telome rase e a mol i.f i C ci Ç ci 0 G Θ D. dA t célula s da ] oróstat a podem propor: rcionar mar C G G G para c líagnostico. Além dis C to fA C ^ ·-' f <..> telómeros pod< sítio pa ra terap.i .ei í Ozer ; et al. 1998), Al propor cíonai :am ev idências de um "gene de proseara’ no braço curro e 3) telómeros/ regulação :ancro da e t Λ1, do cromossoma 1 (Eerthon 18 1S96). E necessário realizar mais trabalho para identificar o locus específico nesta região. Foi sugerido que este marcador é apenas um de vários genes possíveis de predisposição de homens a cancro da próstata familiar. Outros estudos mostraram possíveis lo cl de marcadores no cromossoma X (Xu et al , 1998) . Se alguns cancros da próstata forem poligénicos, então 0 mtDNA torna-se numa ferramenta de diagnóstico importante, pois pode ser difícil identificar e compreender a interligação entre todos os genes nucleares associados nesses casos.

Certamente, uma questão chave na investigação de cancro da próstata consiste em identificar marcadores moleculares que possam determinar e distinguir efectivamente a progressão turnoral. Marcadores moleculares podem conseguir distinguir entre os casos de neoplasmia da próstata que progredirão rapidamente para doença meta stática e aqueles com poucas probabilidades de originar desenvolvimento tumorai. A comparação de marcadores moleculares ou mutações pode determinar se a via tumorai é latente ou agressiva. Até â data, a investigação tem-se centrado principalmente nos segredos escondidos no genoma nuclear; contudo, o genoma do mtDNA muito menor parece actuar como barómetro para eventos no núcleo e, como tal, proporciona um meio para a detecçâo precoce de cancro da próstata humano (Zeviani et al, 1990), É importante notar, a este respeito, que mitocôndrias foram implicadas no processo carcinogénico devido ao seu papel na apoptose e outros aspectos da biologia tumorai (Green & Reed 1998). Em particular, foram observadas mutações somáticas de mtDNA nalguns tumores humanos (Polyak et al. 1998, Tamura et al. 1999, Fliss et al. 2000) . No entanto, estudos anteriores foram, exclusivamente transversais, pois não consideraram a natureza clonal do mtDNA em linhas 19 maternas. Estes estudos transversais limitados mostram meramente a mutação num instante temporal. Isto pode ou não proporcionar uma ligação rigorosa entre uma mutação e o correspondente estado de doença, Estudos transversais empregando uma linha materna têm a vantagem de seguir uma mutação em mtDNA ao longo do tempo e, assim, de imitar a potência de uma concepção longitudinal. Podem ser identificadas mutações que são variantes populacionais comuns em oposição a mutações associadas a doença.

Envelhecimento 0 envelhecimento consiste numa acumulação de alterações ao longo do tempo aos níveis molecular e celular; todavia, os mecanismos moleculares específicos subjacentes ac processo de envelhecimento continuam sem ser elucidados. Numa ;pl icar o p roce S S 0 de envel .he icimen +- /-- ^ \-· / .1 3... i. s em s uj ei. tos ma is i; IÍ0I Ç Γ’ o são genoraas d' u j ei tos ΙΊΪ3.1 S : IGV0 s da me: sma ima deieçâ o a. ssoc iada ao enve.1 r iec iment ,--N p, -eç ão comi jm, ou deli sção de 1 9 ! 7 bp, i\ ~! V C~' lhecíme nto tem. si do limitada p C.\ sta li; norfismos na reoiã o de cont ro Io, P a ra mt e estas mu: tacões é necessárl .0 anali s a .a 3. Θ Π L 3.0 1. V ci p 3. T.' 3. qenomas mítocoí todo o genoraa. Outras deleçôes estão apresentadas na Tabela 1 adaptada de Kei, 1992, 20

Tabela 1

Dimensão das delecões (bp! Referências 4 977 Cortopassi e Arnbeim, 1990; Ikebe et al., .1 990; Línnane et al., 1990; Corral-Debrinski et al., 1991; Yen et al., 1991; Tor.ii et al., 1992; 2hang et al., .1992 74 36 Corral-Debrinski et al., 1991; Hattori et al., 1991; Rsieh e Wei, 1992 3610 Katayama et al., 1991 b 0 ò 3 flsieh e dei, 1992; Yen et al., 1992 5827 Zhar.ç et al,, 1992 6335 Zhang et al., 1392 7 635 Zhsng et al., 1992 7737 Zhang et al., 1992 7856 Zhang· et al., 1992 8041 Zhar.ç et al,, 1992 8044 Zhang et al., 1392 57 56 Zhang et al., 1992

Radicais livres de oxigénio, um produto secundário normal, da produção de ATP, são uma causa provável desta deteção, cuja frequência aumenta com a idade. A literatura existente demonstra uma associação forte entre mutações de mtDNA (mtDNA), idade cronológica e processo global de envelhecimento em tecidos pós-mitóticos, como músculo e cérebro; contudo, são necessários estudos comparativos de linhas maternas para distinguir entre eventos mutacionais associados ao envelhecimento e aquelas mutações sem uma associação ao envelhecimento.

Em anos recentes foi mostrado que uma variedade de doenças degenerativas crónicas resulta de mutações no mtDNA (Gatterman et ai. 1995) . Doenças relacionadas com OXPHOS defeituosa parecem estar intimamente ligadas a mutações de mtDNA (Byrne, 1992) . Além disso, foi mostrado que estas miopatias estão muitas vezes associadas à tíeieção comum de 4977 bp do genoma mitocondrial íLiu et ai. 1997) . Esta grande deleçâo também foi encontrada, em níveis heteroplásmicos, em vários tecidos de pessoas com 21 envelhecimento normal e é consistente com a "Mitochondrial Theory of Aging" (Harman, 1981) . Isto manifesta-se por um aumento da frequência da deleção (Cortopassi & Wang, 1995) e um declínio subsequente da função respiratória ÍMiquel et al. 1992), originando eventual morte celular em idades avançadas. A detecção precoce de uma predisposição para uma doença ou perturbação é a melhor oportunidade de intervenção médica, pois o diagnóstico genético precoce pode melhorar o prognóstico para um paciente.

Estudos anteriores empregando uma concepção transversal estabeleceram uma associação ou relação causa-efeito entre mutações e deteções de mtDNA e/ou combinações dessas e envelhecimento; no entanto, para se obterem dados rigorosos é necessário determinar de forma concisa a taxa da deleção e/ou mutação especifica da idade. A atribuição de mutações ao processo de envelhecimento, em oposição a uma doença particular, ao nível populacional é vital. Esta informação é imperativa para compreender como danos em mtDNA decorrem ao longo do tempo. Além disso, devem ser conhecidas as consequências destas mutações particulares, suas frequências e associações nos aspectos temporais do envelhecimento para prever e eventualmente abrandar o envelhecimento ao nível molecular. Os investigadores ainda não determinaram esta taxa, que requer a avaliação de dados populacionais ao longo de linhas maternas. Em conformidade, é necessário um biomarcador que siga o processo de envelhecimento.

Em conformidade, é necessário um sistema simples e directo para monitorizar o genoma mitocondrial quanto a mutações que indiquem cancro em fase precoce, envelhecimento ou outras doenças humanas com um componente de DNA. Também é 22 necessário ura sistema de diagnóstico simples para exposição solar, cancro da pele nâo-rrielanoma, cancro da próstata, cancro do pulmão e envelhecimento ligados a defeitos no genoma mitocondrial. É necessário um sistema de diagnóstico que diferencie entre mutações em mtDNA que causam doença e aquelas que simplesmente representam variações dentro de uma população e entre populações.

Resumo da Invenção

Aspectos da presente invenção estão listados nas reivindicações. A invenção refere-se a um método para a detecção de uma predisposição para cancro, detecção precoce de cancro, génese de cancro, presença de cancro, progressão de cancro, ausência de cancro numa amostra biológica contendo mtDNA, que compreende (a) proporcionar uma amostra biológica compreendendo mtDNA e (b) detectar uma deleção no mtDNA, em que o cancro é cancro da próstata.

Especi fi cament e, um aspecto da invenção consiste em proporcionar um método de detecção de uma deleção abrangendo aproximadamente os nucleótidos 10744 até 14124 do genoma do mtDNA., em que a referida deleção está associada a cancro da próstata, num sujeito com mtDNA, que compreende (a) proporcionar uma amostra biológica do sujeito e (b) detectar a presença da deleção no mtDNA, A deleção pode situar-se na gama de 3000 até 4000 bp. A deleção pode ter aproxímadamente 3379 bp. A deleção pode detetar a totalidade ou parte dos pares de bases entre 10744 e 14124, compreendendo substancialmente genes que codificam a subunida.de da NADR desidrogenase 4L, subunidade 23 da NADH desidrogenase 4, subunid ade da N ADR desidrogenase (Jn ΓΤ t-y* nistidina, tRNA serina2 e tRNA ler :cina2 „ Outro a specto da invenção cons iste em proporcionar um "primer" de ácido nucleico 3. ,4 direc :to compreendendo TASACTAD3TAC ATACTA ACCCTAGTGGTA (SEQ ID NO: 139) e um "primer" de ácido nucleico 3.4 reverso compreendendo saggtagga TTGâTGCTGT (SEQ ID NO: 140) .

Outro aspecto da invenção consiste em proporcionar uma série compreendendo uma pluralidade de membros de ácidos nucleicos e um substrato sólido, em que um dos membros de ácido nucleico está associado à deleção do mtDNA em aproximadamente 10744 até 14124, em que o membro de ácido nucleico tem uma posição única nessa série e está associado de modo estável ao substrato sólido.

Os métodos e séries da invenção podem ser utilizados para a monitorização de uma pessoa quanto à progressão para cancro da próstata ou progressão de cancro da próstata numa amostra biológica de um sujeito, que compreende: proporcionar uma amostra biológica do sujeito; extrair DNA da amostra biológica; detectar a ausência ou presença de deleções do mtDNA; determinar se as deleções estão associadas a variações normais inter-populações ou intra-populações, ou se as deleções estão associadas à ausência ou presença de uma predisposição para cancro da próstata, progressão para cancro da próstata, cancro da próstata ou progressão de cancro da próstata, e repetir os passos.

Outro aspecto da invenção consiste em proporcionar uma utilização de uma deleção entre aproximadamente 10744 e 14124 do mtDNA compreendendo a totalidade ou parte da 24 24 ubunidade da NADH desidrogenc ise 4L, subunidade da NADH .esidrogenase 4, subunidade da NADH desidrogenase 5, tRNA Istidina, tRN Ά serinaf e tRNA leucinai, para dete estar uma predisp Ό o íção para cancro da próstatc i, detecçâo precoce de cancro da prc >stata, génese de cancro da próstata, presença de canc ::ro da próstata ou progressão de cancro da próstata num sujeito cora ratDNA.

Os métodos e séries da invenção também podem ser utilizados para confirmar ou refutar um teste de biopsia de cancro da próstat a d 0 uru5. amo 311. a oe bi opsia , que compre ende: ob t- c. ·. Y tecido no] :rm al de un \3. 8 mos t ra de biopsia, C.\ detecta; : a ausênci a 01 i preser de uma deleção de mtD NA de aproxim adame nte 3379 bp no tecido normal, bem i como p ara mapeame nto tumoral tr idi mer isiona .1 da próstata, que compree nde obter ; amos- t U3 i s de b Ίopsia com agulha em sextant ·- t p detectar a 3 use 71 f-' - . a o a presença de uma dele çâO de mtD NA d1 e aproxi ] i.ls da. .men "l G1 3379 bp em Ia uma das amo s t r a s em s e x t a n t e. e em proporcionar aproximadamente genoraa do ratDNA da próstata. uma os para

Outro aspecto da invenção consist deteção mitocondrial abrangendo nucleótidos 10744 até 14124 do utilização no diagnóstico de cancro A Figura 1 é um histograma que mostra o número de mutações era posições de nucleótidos em DNA mitocondrial de pacientes oro 3“ com canoro A Figura 2 mostra a primeira metade dos agregados não utilizando sinónimos produzidos utilizando Hierarchal Ciustering Explorer ÍHCE). 25 25 segunda metade dos agregados não A rigura o mosura sinónimos produzidos utilizando Hierarchal Ciustering Explorer ÍHCE) . A Figura 4 é uma cópia da Figura importante está sombreado. em que o agregado 7\ Figura 5 é um dia grama esquemátici q que most Lei cl concep 0 C·!. 0 e sequên cia . de um ' ’primer” útil par a a detec Ç Q .* la dele çào de 3, 4 kJ G A Figura r é um erá fico que mostra i .ima compar ação do lím íte de cie] 0 CI entre participantes malrgnos e benignos o g ntomát ice s no est u d o de 3,4 kb. A Figura I é um gri ifico que mostra o limite de ci .cios c omo latado no ]. 2. A Figura Q C a) é um gel de agarose corado c :om b remeto ΟΘ et ídio r ep^ lesentat: .vo que mostra r ima frequê ϊ Π C λ. 3. maior da de leçào de; 3895 tq > em peie habita lalraente e i.xposta. ao sol G 0 raparad, d C om peie ocasionalmente e> íposta ao sol. A Figura Q] q) é um histograma da frequência da d eleção de 38 95 bp em 104 am ostras de pele separadas reco Ihidas de di f erenta 0 8 sítios do corpo expostos ao sol, Figura 0, é uni ge i que mostra o a umento in* dutív ei por UV da delec 8 0 de 3895 bp observado apó •s 17 dose S T. BpB L 1. d.d. 3 de 26 A Figura 10 é uma representação esquemática cia localização de "primers" de FCR e sondas TaqMan em rntDNA utilizados no Exemplo 14 para detestar a deteção de 3895 bp.

?\ Figura 11 cons iste em dois g. ráf icos que mo st rara a rela çáo ir near en tre a c '.oncentração do modelo e ; s número de : cic los ir mite (C T) para a deleção de 3895 bp (A padr ão inte rno de txpo 3 elvagem (B) . A figura 12 e u rua fotograf i. 3. de um gel cie agar ose , ri γ' 3 GO co m brome to de e tldio que most: a incide nc..í a da. de’ ! pi r\ ,¾ r·. - να ^ de 38 95 bp em ti ;mor (T) e der me (D) 0 epí derme (E) pe rilesio naís ní stologicarne: ite no ma is de BC v_. S Θ Q r r -.,. V corados com iim exemplos de 3895 bp de amostras s ao sol de A Figura 13 é uma fotografia de géis de agarose brometo de etidio representativos que mostra típicos do seu nivel correspondente de deieçáo detectado por PCR em tempo real de três pares expostas ao sol e três pares de amostras exposta modo intermitente. A Figura 14 é um gráfico de dispersão que mostra os níveis da deleção de 3895 bp expressos em percentagem em derme e epiderme expostas ao sol e expostas de modo intermitente ao sol, determinados por PCR em tempo real. A Figura 1 o e uru diagrama que mostra a relação entre resultado ? s de biops iaS Θ a .π a.]. r 8 θ de ! rntDNA no diagnóstico de tumor da P: róstata. A Tabela 1 envelhecimento. e uru resumo de mutações associada O. d. 'o 27 27 A :] tabela J. cl é u: ma cl Π ci mut ações em mt] DNA de pro teínas em teci .do de adj acente r· v tb i malíg no. A r: ta. i 'abeia Ib é ur sa anái mtDNA de set r< y r< ,· tú d. tb ·. jiõe Γ* de contro lo, beni gno di: A r tabela 1c >r> um res sin ónimas present _ Θ S em mit ocôndr i â 3 de 0 Ί pac T éh r·; ido d; 3 p] sós ta ta ben ma 1 igno. A T 'abela 1 d έ un: (S a nál do ιν, maj-igno. ND1, ND2, s sinónimas e nâo )XI e CYTB das > de yui quadra ao de mutações em DNA mitocontírial em tecido benigno distante de glândulas malignas versus tecido da próstata de sujeitos sintomáticos ma s n ã o m a 1 í g η o s . A Tabela 2 é um resumo do número médio de deleções em tumores da epiderme e tecidos normais adjacentes. A Tabela 3 é um resumo do método padrão de DHPLC. A Tabela 4 é um resumo de mutações mitocondriais (incluindo laço D) de biopsias com agulha da próstata e mutações no genoma completo de glândulas da próstata malignas, benignas adjacentes e distantes de pacientes com cancro da próstata. A Tabela 5 é uma lista de "primers" utilizados para amplificação do genoma mitocondrial completo para tecidos fixados com formalina e normais do sanaue. 28 A Tabela 6 é uma lista de "priraers” de amplificação para utilização com o Exemplo 12, A Tabela 7 apresenta os Componentes de qPCR do Exemplo 12. A Tabela 8 apresenta os parâmetros de aplicação de cicloí para o Exemplo 12. A Tabela 9 é uma lista de sondas utilizadas no Exemplo 14 0 método da presente invenção pode ser utilizado para diagnosticar doenças ligadas ao mtDNA. 0 método da presente invenção proporciona a análise do genoma md.tocond.rial de um indivíduo a partir de uma amostra biológica, por exemplo, por amplificação do genoma mitocondrial, sequenciação de uma porção do genoma mitocondrial, preferivelmente todo o genoma mitocondrial do indivíduo, utilizando quaisquer meios conhecidos. Também pode ser utilizada cromatografia líquida de alto desempenho desnaturante (DHPLC) para rastrear rapidamente muitas amostras. A DHPLC pode centrar-se em regiões importantes de mutações. A DHPLC é ma is sensível do que a sequenciação automática em termos da detecção de mutações, e pode mesmo detectar 2% de heteroplasmia, em comparação com 20-25% para sequenciação comum. Também podem ser desenvolvidos métodos de detecção de níveis menores de heteroplasmia (< 2%).

Como usado aqui, "queratoses actínicas" significa lesão epidérmica precursora proposta de um carcinoma de células escamosas„ 29

Como usado aqui, "'envelhecimento" refere-se a uma acumulação de alterações ao longo do tempo, aos níveis molecular e celular.

Como usado aqui, "c ; Ί a 1 o *' ; j- v. _/ o significa uma c íe várias formas alternativas de uma i dada sequência de Dl IA que ocupa um local especifico nurr i cromos soma.

Como usado aqui, "rede neural artificial (ANN) ’’ significa um dispositivo virtual no qual vários elementos interligados processam informação simultaneamente, adaptando e aprendendo de padrões passados,

Como usado aqui, "fixação" ou "disposição em manchas" refere-se a um processo de deposição de um ácido nucleico sobre um. substrato ο 3 o -i. j-. d o pa t. a t. o t. rei a t. uma série de ácidos nucleicos, de modo que o áol .do nucieico fí ca irreversivelmente ligado ao substrato só 11 .do via 1 igacoes ;ova lentes, ligações de hidrogénio ou interacçí ionicas

Como usado aqui, "ati pico" 1 ou "ano: rmal" significa uma aparência celular que aparenta ser maliana. nâo é normal. mas que também nâo

Como usado aqui, "carcinoma de células basais" significa um tipo de cancro de células da pele.

Como usado aqui, "benigno" significa sem. riscos para a saúde; não recorrente nem progressivo; não maligno.

Como usado aqui, "doenç mas não está limitada prostática benigna" pode incluir hiperplasia, inflamação, atrofia, 30 prostatite, metaplasia e neopiasia intraepitelial prostática.

Como usado aqui, "doença de Bowen" significa carcinoma epidérmico in situ.

Como usado aqui, "limite de ciclos" (CT) é o ponto em que a amplificação do alvo sobe acima do fundo, indicado por um sinal, como um sinal de fluorescência.

Como usado aqui, "diagnóstico" ou "diagnosticar" significa utilizar a presença ou ausência de uma mutação, ou combinação de mutações, como factor no diagnóstico ou gestão de uma doença, A detecção da(s) mutação(mutações) pode ser um passo do diagnóstico do estado de doença.

Como usado aqui, "doença" incluí uma perturbação ou outro estado fisico anormal.

Como usado aqui, "genoraas mitocondriais associados a doença" significa genoraas que contêm mutações indicadoras ou associadas a uma doença particular.

Como usado aqui, "base de dados" significa um sistema de armazenamento electrónico (de base computacional, empregando "software" industrial comum) que terá capacidade para armazenar e fornecer informações recuperáveis que permitirão aos investigadores determinar rapidamente a estrutura das sequências de nucleótidos. A base de dados também irá armazenar informações descritivas sobre os indivíduos que forneceram as amostras biológicas. Estas informações descritivas incluirão o estado de saúde e 31 outros Índices pertinentes que podem estar correlacionados com a amostra biológica.

Como usado aqui, "deleções" significa remoção de uma região de DNA de uma sequência contígua de ácidos nucieicos em que, depois de ocorrida uma deleção, o hiato é reparado por reunião das extremidades. A dimensão das deleções pode variar desde uma base até milhares de bases ou mais. quando uma ida por trás es ou noutra

Como usado aguí, "duplicações” significa sequência específica de DNA é copiada e inse ou à frente da cópia originai uma ou mais ve parte do genoraa.

Como usado aqui, "heteroplasmia" é definida pela razão de mut c\ Ç- 0 G'; nas sequências mitocondriais num órgão ou Mut ^ C' õ Θ S heteroplásmícas são aquelas mu ta ções que em. algumas mas não todas as copias do genon ?.a mitoco

Como usado aqui, "homoplasmia” significa que todas as sequências mitocondriais são idênticas.

Como usado aqui, "hipermutação" significa taxa acelerada de mutações que não pode ser explicada por processos celulares normais ou princípios evolutivos comuns.

Como usado aqui, "inversões” refere-se a quando um comprimento de DMA é excisado e inserido de novo em orientação reversa. materna" refere-se a do citoplasma oo ovo.

Como usado aqui, "hereditariedade mitocôndrias que são herdadas atravéf 32

Como usado aqui, "linha materna" refere-se à sequência cional de DNA raitoeondrial que é herdada por gerações sucessivas da mãe.

Como usado aqui, "mitocôndrías" significa um orçando citoplasmático eucariótrco que gera ATP para processos celulares.

usadc 3. ϋ U. d_ r "mutação" abrang r-ι ,¾ rç numa secruência de DNA sequência de tipo selvagem, incluindo sem limitação mutações ponti aais, transições, inserções , transversões, translocaçôes, deieções, inversões, duplicações, recombinaçôes ou combinações destas. A modificação ou alteração da sequência pode estender-se desde alteração de uma única base até à adição ou eliminação de um fragmento completo de DNA ou RNA.

Como usado aqui, "carga mutacional" refere-se a um aumento de mutações em mt DNA que podem, acabar por conduzi fur ição comp rometic ia do gen e envolvido ou de todo o ou que pode a curau 1 ar-se em regiões não codificadora

Como usado aqui, "neoplasia" significa um. processo patológico que pode originar transformação para um estado ma ligno,

Como usado aqui, "tecido não envolvido" significa tecido de uma parte do corpo que nâo está associado à doença em quesuao, 33

Como usado aqui, uma mutação "não sinónima" de um polinucleótido é uma mutação que origina um aminoãcido codificado diferente.

Como usado aqui, "tecido normal" significa tecido sem manifestações visíveis de doença, determinado por histologia.

Como definido aqui, uma "série de ácidos nacleicos" refere-se a uma pluralidade de ácidos nucleícos únicos fixados numa superfície de ura suporte sólido numa densidade que excede 20 ácidos nucleícos diferentes/crré, em que cada um dos ácidos nucleícos está fixado na superfície do suporte sólido numa região pré-seleccionada não idêntica. Numa forma de realização, o ácido nucleico fixado na superfície do suporte sólido é DNA„ Numa forma de realização preferida, o ácido nucleico fixado na superfície do suporte sólido é cDNA, Noutra forma de realização preferida, o ácido nucleico fixado na superfície do suporte sólido é cDNA. sintetizado por reacção em cadeia de polimerase (PCR) . Preferivelmente, uma série de ácidos nucleícos de acordo com a invenção compreende ácidos nucleícos com pelo menos 15G nucleótidos de comprimento. Preferivelmente, uma série de ácidos nucleícos compreende ácidos nucleícos com menos de 6 000 nucleótidos de comprimento. Mais preferivelmente, uma série de ácidos nucleícos compreende ácidos nucleícos com menos de 500 nucleótidos de comprimento. Numa forma de realização, a série compreende pelo menos 500 ácidos nucleícos diferentes fixados numa superfície do suporte sólido. Noutra forma de realização, a série compreende pelo menos 10 ácidos nucleícos diferentes fixados numa superfície do suporte sólido. Ainda noutra forma de realização, a série compreende pelo menos 10 000 ácidos 34 34 cie do suporte usad .0 aqui, é nucleicos diferentes fixados numa superfície do suporte sólido, Q termo "ácido nucleico", come intermutável com o termo "polinacieótido".

Como usado aqui, um "alvo de ácido nucleico" ou "um ácido nucleico alvo” é definido como um ácido nucleico capaz de se ligar a um membro de ácido nucleico de sequência químicas •itar através de um ou mais tipos de iigaç ões , habitualmente por emparei hamento de ba ses -[tares, habitualmente po r forma çào de ligações GO Lo, Como usado aqui ., um a Ivo de: 5. C.Í.0.0 Π uclerco p ode bases naturais (isto p A O h? ; ou T) ou mo dl ficadas (7 'de sasaguanosi na, inosina, etc .) . Adro ionalmente, cl S .03 ses num; sc nda de ácido nucleico po d.em o (tn y reunidas p “\ um 3. l.i.CjOÇâO dif erente de uma liga Çâ0 fosf odiéster, c es<. íe que na o ; .nte: :fíra na hibridizaç /-· As si m, alvos de 3 C1 ido s nucie; .cos poc em ser ácidos nuclei COS pept ídicos nos qn sis 3s bases cons tituintes são reuni o.a s por ligações pe Pt i.dii :as em ve z de ligaçoes fosfodiést •Ο ν' Pref erivelmente, 0 s a l.vos de á cr dos nucleicos são deriva dos de extractos de -.ecidos 01 f luidos humanos. M 3 1S pref erivelmente, o O o l.vos de a cr ..GOS nucleicos consistem em DMA, FiMA ou híbríc os de DMA- RN,A de filamentação simples ou dupl a sintetiza do; 3 partii de e> ;tractos de tecidos ou flui dos humanos. Como usado aqi r* --- f n núcleo" s. -cni fica o oraaneio m a i. s cons pícuo na oé.l .Ui 3 Θ ucariót i o a que contém a totalidade GO DMA cromossómico. Como usado aqui, N 7 V d (Valor c ie P revi são Negativa) signif í ca a percentagem de pacientes com testes negativos que na.o têm a doença ou esuado a ser restado. Estabelece a fiabilidade 35 de um resultado de teste negativo. 0 cálculo é NPV -(Negativo verdadeiro)/(negativos verdadeiros e falsos).

Como usado aqi X -C f "pele ocasionalmente expC: st a ao sol" significa pele que é ocasionalmente ou por v Θ Z Θ S exposta num indivíduo. Por exemplo, dependendo ·: do intí .ívidi ;o, pode incluir ombros, costas e peito.

Como usado aqui, PPV (Valor de Previsão Positiva) significa a percentagem de pacientes com resultado de teste positivo que têm a doença ou estado a ser testado. Estabelece a fiabilidade de um resultado de teste positivo. 0 cálculo é PPV :::: (Positivo verdadeiro) / (Positivos verdadeiros -l· (a 1 s o S ! .

Como usado aqui, "Teste de PSA" teste do antígene especí fico d a próstata; um anti gene enconts: :ado no sangue que po de ser indicador de cancro da próstata.

Como usado aqui, "mutação pontual” significa a alteração de um único nucleótido em DNA.

Como usado aqui, "polimorfismo" significa variação de sequência numa população de alelos ou çenomas de mtDNA. aqui, "lesões precursoras" significa uma mutação suas combinações, indicando potencial associação

Como usado de DNA, ou a doença.

Como usado aqui, "predisposto a uma doença" ou uma "predisposição a uma doença" significa que indivíduos têm um risco mais elevado de desenvolver a doença ou perturbação ou que têm um risco mais elevado de surgimento 36 precoce da doença cu perturbação do que o indivíduo comum, devido à presença ou ausência de mutações que estão associadas à doença ou perturbação.

Como usado aqui, "pré-neoplasía" sígniiica indicações, ao nível celular ou de DNA, de que uma célula pode estar no limite de se tornar neoplástica.

Como usado aqui, "região pré-seieccionada", "região pré-definida" ou "posição única" refere-se a uma área localizada num substrato que é, foi ou está destinada a ser utilizada para o depósito de um. ácido nucleico, e também é alternativamente referida aqui de uma "região seieccionada" ou simplesmente uma "'regíâo". A região pré-seieccionada pode ter qualquer formato conveniente, por exemplo, circular, rectançular, elíptico, em. forma de cunha, etc. Nalgumas formas de realização, uma região pré-seieccionada é menor do que cerca de 1 cmp maís preferivelmente menor do que 1 mm2, ainda maís preferivelmente menor do que 0,5 mmé e, nalgumas formas de realização, cerca de 0,125 até 0,5 mm.2.

Como usado aqui, a "presença" de uma mutação em mtDNA inclui mutações heteroplásmi ca s; em consequência, é contemplado que possa adicionalmente estar presente algum mtDNA normal numa amostra onde está presente o DNA mutado.

Como usado aqui, "peie raramente exposta ao sol" significa pele que raramente ou quase nunca está exposta num indivíduo. Por exemplo, dependendo do indivíduo, pode incluir nádegas e calcanhar. Também pode ser denominada de pele "protegida do sol". 37

Como usado aqui, '"limite de ciclos de PCR em tempo real CT" é o ponto (cicio) em que a fluorescência atravessa a linha limite,

Como usado aqui, "mutação somática" significa uma alteração numa sequência de E )NA após a ft írtilizs ,ção. Como usado aqui, "substrato sólido" ou "suporte sólido refere-se a um mat :erial que t em uma superfície rígida o semí-rigida. Os te mos "substi :ato" e "suporte" são usado aqui de modo interr mutável com os term os "substrato sólido e "suporte sólido" . 0 suporte sói ido pode ser biológico não b.í .ol c gico, orgãn íco, 1 mor gâ ini c 0, ou uma comb.i p ;r; r> .1 Λ Cl Vç 1 r'i ΟΘ qua isquer destes, existi ndo na forma de par • ή C' ul Cl C· / fi 1 ame nto s, precipit ados, gói Ci / folhas, tubagem, esf er Cl C: / ipi ent es, capilar es, ai mof ac l.a s, t -Ί. i- d. S , filmes, pl. L> \^· Cl / Iam ela O / etc. Muitas vezes, 0 Sl íost rato è uma súper :fí c ie ΟΘ q ç | í cí O ou vidro. (pol -i \ ... / C- ' et raf.' luoroet ileno, ( pol -i \ ... / di- flucretc de vinilideno, poliestireno, policarbonato, uma membrana com carga, como nylon 66 ou nitrocelulose, ou combinações destes. Numa forma de realização preferida, o suporte sólido consiste em vidro. Preferivelmente, pelo menos uma superfície do substrato será substancialmente plana. Preferivelmente, a superfície do suporte sólido conterá grupos reactivos, incluindo mas não se limitando a carbozilo, amino, hidroxilo, tiol ou afins. Numa forma de realização, a superfície é opticamente transparente.

Como usado aqui, "pele exposta ao sol" significa pele que é "habitualmente" ou "ocasionalmente" exoosta ao sol. significa pele que

Como usado aqui, "pele protegida do raramente é exposta ao sol. 38 38 aniiica como usaac aqui, carcinoma oe cernias escamosas um tipo de cancro de células da peie.

Como usado aqui, "associado de modo estável" refere-se a um ácido nucleico que está irreversivelmente ligado a um covalentes, ligações de hidrogénio ou interacções iónicas, de modo que o ácido nucleico retém a sua posição pré-seleccionada única relativamente a todos os outros ácidos nucleicos que estão associados de modo estável a uma série, ou a todas as outras regiões pré-seleccionadas no substrato sólido em condições em que uma série é analisada (isto é, hibridização e varrimento).

Um numero "estatisticamente significativo" de sequências de DNA mitocondrial é determinado através de, ou utilizando, algoritmos estatísticos padrão de qui-quadrado, usando ou determinando valores observados versus esperados.

Como usado aqui, "mutação subtil" significa um nível baixo de mutação no limite da detecção.

Como usado aqui, "benignos sintomáticos" significa pacientes que exibem um ou mais sintomas associados a malignidade da próstata, incluindo mas não se limitando a PSA elevado, pontuação anormal do exame rectal digital (DRE), dificuldade em urinar, sangue e/ou pus na urina, dores lombares, pélvicas e na parte superior das coxas, ou ej acul açâo dolorosa, mas foram diagn ostieados como benignos por en rame de tecido de biopsia fe ito cor u; m patologista qualifiçado. 39

Como usado aqui, uma mutação "sinónima" é uma mutação num polinucleótido que não tem efeito no aminoácido codificado.

Como usado aqui, "transições" significa substituição de bases nitrogenadas afins, pirimidina em pirimidina, purina em purina. Uma mutação em que uma pirimidina é substituída pela outra ou em que uma purina é substituída pela outra.

Como usado aqui, "transversões" significa substituição de bases nitrogenadas distintas, purina em pirimidina, pirimidina em purina. Uma mutação em que uma purina é substituída ou trocada por uma pirimidina ou vice-versa.

Como usado aqui, "'pele habitualmente exposta ao sol." significa pele que é habitualmente ou muitas vezes exposta num indivíduo. Por exemplo, dependendo do indivíduo, pode incluir couro cabeludo, face, pescoço e orelhas.

Numa forma de realização da presente invenção são proporcionados métodos de diagnóstico de cancro da próstata através de comparações de sequências de mtDNA., 0 diagnóstico de doenças, como cancro da próstata, com mtDNA em vez de DNA nuclear tem várias vantagens. Em primeiro lugar, o mtDNA, um genoma menos complexo, é facilmente entendido ao nível individual e populacional e, assim, uma grande base de dados de mtDNA com genomas normais e associados a doenças torna o diagnóstico individual extremamente rigoroso. Em conformidade, a variação relacionada com doenças é compreendida. Em segundo logar, o mtDNA tem uma taxa de mutações 10 vezes mais elevada do que o DNA nuclear (Wailace 1992) . Os rearranjos nucleares, que sugerem doença preliminar, são rapidamente comunicados a 40 mitocôndrías, onde aparecem na forma de mutações somáticas. Em terceiro lugar, o rntDKA tem um padrão de hereditariedade materna e é essencialmente clonai, pelo facto de todas as mitocôndrías começarem com a mesma sequência de mtDNA, sendo portanto facilmente detectada uma variação desta condição clonai. Adicionalmente, o rntDKA não exibe evidências convincentes de recombinação e, assim, quaisquer alterações da sequência são um evento somático. Qualquer mitocôndria que albergue mutação (mutações) está, num certo sentido, "recessiva", em consequência de haver muitos genomas mitocondriais (2-IO cópias) por mitocôndria e muitas mitocôndrías por célula (500-2 000) . Além. disso, os Genomas mitocondrlais podem tolerar níveis muito elevados (até 90%) de mitocôndrías com genomas danificados. Isto ocorre por complementaçáo pelo rntDKA de tipo selvagem remanescente (Chorayn et al. 1992). No entanto, os genomas mutados têm uma vantagem replicativa relativamente aos genomas de tipo selvagem porque habitualmente são ma is pequenos (Hayashi et al. 1991) e, assim, ocorre expansão clonai de rntDKA mutado (Brierly et al. 1998), sugerindo que, ao contrário dos genes nucleares, ocorre pouca ou nenhuma seiecção contra células albergando mutações de mtDNA, Devido a esta elevada taxa de mutações, as mutações e/ου deteções que aparecem em mtDNA são mantidas ao longo da vida da célula e podem servir de registe de exposições a vários mutagenes, A integridade do mtDNA é mantida por mecanismos de reparação nuclear, e foi sugerido que um defeito nestes loci origina uma perturbação dominante autossómica associada a múltiplas deieções mitocondriais (Seviani et al. 1990).

Consequentemente, o mtDNA pede funcionar como uma sentinela de aviso precoce de eventos nucleares precoces relacionados 41 com uma variedade de cancros ou outras doenças. Por fim, o genoma mitocondrial pode ser sequenciado e monitorizado quanto a mutações numa base individual.

Os métodos e produtos da presente invenção detectam mutações heteroplásmicas e homoplásmicas. De facto, mutações heteroplásmicas podem ser a chave para a detecçâo da génese precoce de doença, perturbação ou envelhecimento. Adicionalmente, apesar de sítios de mutações especificas poderem indicar um estado de doença ou perturbação particular ou processo de envelhecimento, a carga mutacíonal total também é importante na determinação da génese, presença e progressão de uma doença, uma perturbação ou envelhecimento. A presente invenção permite a capacidade de examinar tecido ou fluidos corporais benignos ou normais para determinar a génese e/ou presença de cancro da próstata. Por exemplo, a presente invenção permite a capacidade de examinar tecido ou fluidos corporais benignos quanto à presença de pré-neoplasia, neoplasia, progressão para malignidade e malígnidade.

As mutações mitocondriais detectadas pelos métodos da invenção são comparadas a variações inter e intra-populações em DNA mitocondrial, e podem incluir comparação com DNA mitocondrial de tecido não envolvido do sujeito, ou com DNA mitocondrial de ura parente materno. Não é necessário analisar todo o genoma mitocondrial. Por exemplo, não é necessário sequenciar todo o genoma mitocondrial, apenas uma porção seleccionada daquele. Em conformidade, uma amostra de DNA mitocondrial pode proporcionar um diagnóstico. 42

Noutra forma de realização da invenção é proporcionado um sistema de diagnóstico de cancro da próstata. A acumulação relacionada com a idade de defeitos de mtDNA pode predispor um indivíduo ao aparecimento de certas perturbações clinicas, como cancro da próstata, que predominam em homens rearr de meia-idade e mais idosos. Numa forma preferida, o rastreio de rotina de cancro da próstata é efectuado por sequenciação do genoma mitocondrial de fluído de massagem prostática. A presença de células epiteliais transformadas em células cancerígenas pode ser determinada por amplificação de mtDNA. de fluído de massagem prostática, eclipsando técnicas c rectal dic fitai e PS identifica ram mtDNA pacientes com cancro fluido de massagem } rnvasivo d e detecçâc diagnóstico correntes, como o exame Recentemente, Fiíss et ai. (2000) lutado em amostras de urina de i bexiga. Descobertas semelhantes em stática proporcionam um método não recoce de cancro da próstata. Podem ser diagnosticados diferentes tipos de cancro da próstata, e podem ser diferenciados entre células agressivas de crescimento rápido em pacientes em contraste com cancro da próstata como um todo. Por exemplo, a deteção de 3,4 kb identificada nos ensinamentos do requerente pode ser utilizada como indicação de cancro da próstata. 0 sistema e método ds a present uti1izados para detectar cancro, í próstata, r JUÍU3. T. 3.3Θ p 1?Θ00 ce e antes presente invenção podem ser particular cancro da anormalidades histológicas. Por exemplo, o sistema e método da presente invenção podem ser utilizados para detectar pré-neoplasia em tecido prostático. O sistema pode ser 43 utilizado para detectar a génese e progressão de cancro da próstata. Mutações, incluindo mutações subtis e hipermutaçoes (Chen et ai. 2002; Chen et ai. 2003), em DNA mitocondrial de tecido prostático humano ou fluido associado à próstata (por exemplo, fluido de massagem prostática ou urina), podem ser testadas quanto à presença de neopiasra e testadas de novo em intervalos definidos para seguir a transformação em cancro, diagnosticar malignidade ou confirmar o estado benigno continuado.

Estas mutações podem ser determinadas por comparação com mitocôndrías extraídas de tecido não envolvido, tais como mas não se limitando a estes: sangue, urina, cabelos e esfregaços bucais. Esta comparação directa elimina polimorfismos, fundo materno ou variação normal de haplótipos não associados a doença. As mutações também podem ser comparadas com sequências mitocondriais associadas a variações inter e intra-populações. Uma ou mais mutações de fluído ou tecido do órgão ou sistema corporal em questão indicam, possível génese de doença. A pessoa é então monitorizada, em. intervalos su cessivos, quanto a um aumento de mutações noutros sitios e/ou um aumento do número de genomas mitocondriais mutados, indicando progressão de doença. Tecido benigno da próstata nem sempre pode ser considerado não envolvido. De facto, como pode observar-se no Exemplo 9 abaixo, o que aparenta ser tecido benigno pode conter mutações mitocondriais associadas a pré-neoplasía, neoplasia, progressão para malignidade ou malignidade. Adi ci onaImente, a carga Riutacional e não mutações especificas pode ser um. instrumento na determinação de doença e progressão de doença, O sistema e método da presente invenção detectam mutações heterooiásmicas e homoplásmicas. 44

44 A glândula prcstáti· ca é monito: rizada quanto a mutações no genoma mitocondria 1 através de fluido de massagem prostática (PMF) rei colhido dura .nte im [ exame rectai digital (DRE) inicial da próstata. A / íélulas do PMF são concentradas, espal liadas numa lameL a e coradas com PSA

imunoperoxidase para a identificação de células epiteliais da próstata. Estas células da próstata sáo seiectivamente recuperadas por microdissecção por captura laser. 0 DNA mitocondrial destas células é analisado e comparado com DNA

mito condrial de te· eido n: ao en’ volvido e/ ;ou com seq uên oras de vari ações ínter e rntr a popul ações. Po r e xemplo, a. anál.i. o. ,o de E )NA pode compr eend •p\ V' seqi jenciar o mt DNA. DN A total. extr aído destas céli ;.las e u t í li z a m-se "P i: rmer C: mitocondríaí s espe ci j: i CQ s, concebidos pau rá util: Lza; ç a o c :om mate rial de biopsi a t ,c at ado c :om. formal i:na (Tabel. 3 ir. ) , Ρ3 ra ampl ificar 10 0 0 r-, jenoma do rutDM \ com. piu odu 10 s de am.pl i z ii. cação sobre T\ pet \>J C- 0 s , Est es produt· os de PCR são depe : 1.8 sequ &nciado3 por m ,p j- \ ri .“\ Q bem conhecido s d .os prof í ss iona.i. v , incluindo sé ries d' a no1 :j a sequenciação de E )NA. Os c· ultac .0 S da sequenciação são rastreados quanto a heter •oplasmias e mut ações e são compa rados com uma base de dados de mutações cie mtDNA conhecida .s associadas a tecidos prostáticos malignos e benignos. Com base nestas comparações regressa uma designação quanto ao estado da próstata relativamente mas não limitado aos seguintes: benigna (sem mutações); pré-neoplasia ou neoplasia (baixo nível de mutações), ou malignidade {alto nível de mutações). Na situação benigna, de pré-neoplasia e neoplasia, a próstata pode ser monitorizada quanto a progressão através de rastreíos regulares de PMF, como descrito.

Aiternativamente, material de biopsia que como benigno, atípico, anormal pode ser foi diagnosticado su i e i 1. o a r e s l. e s 45 semelhantes empregando microdissecção por captura laser da biopsia, ou o tecido pode ser raspado das lamelas ou podem ser utilizadas secções montadas de tecido, seguido de extracção de DNA, amplificação, análise de sequências e comparação com bases de dados.

Em alternati va à sequencração e comp dados, pode ser utilizada tecnologia identificar um padrão esp •ecífíco de mutacíonal baseada em qualquer número ou combinação das mutações listadas na Tabela ã, através da construção de oligonucleót idos, ou um conjunto específico de oligonucleótidos. progreí ç 3 â 0 de doença p •ode ser mor íitori mutaçi ./ vi' O de mt DNA em intervalos suce dados de mutações em genomas mi tocon pré-neoplasia, neoplasia e cancro da próstata, incluindo o cálculo da carga mutacíonal total. Tecido de biopsia da próstata pode ser testado quanto a pré-neoplasia» neoplasia e/ou progressão maligna em células ciinicamente descritas como benignas» normais» atípicas ou anormais por um método histológico/patológico comum ou outros métodos clínicos.

De modo semelhante, o DNA pode ser analisado quanto a deieções especificas que se sabe estarem associadas a doença, por exemplo, cancro da próstata. Isto pode ser efectuado empregando tecnologias baseadas era PCR para rastrear essas deieções. hidas por qualquer meio truir uma base de dados

Amostras biológicas podem, ser recc: conhecido, com a finalidade de cor 46 de sequências de mtDNA ou de efectuar um teste de diagnóstico num indivíduo. Amostras destinadas à geração da base de dados incluem mas nâo estão limitadas às seguintes: bancos tumorais, estudos de linhagens maternas envolvendo indivíduos afectados e náo afectados da mesma linhagem materna, bem como estudos de linhagens maternas de grupos ou populações com frequências elevadas de doenças específicas, tais como mas não se limitando às seguintes: cancro da pele e próstata, avaliação do estado de saúde e envelhecimento. Por exemplo, podem ser utilizados FTA® Gene Carde© para recolher e arquivar amostras biológicas. Amostras adequadas incluem qualquer tecido ou fluido corporal derivado do mesotélio, epitélio ou endotélio. Esses tecidos e fluidos incluem mas não se limitam a sangue, expeetoração, células bucais, saliva, fluido de massagem. prostátíca, sudação, osso, cabelo, tecido linfático, esfregaços cervicais, aspirado do peito, matéria fecal, ejaculado, fluxo menstrual, urina e tecido de biopsia. Preferivelmente são submetidos a amostragem aproxima damen te 100 uL de sangue, 100 ug até 25 mg de tecido sólido. No caso de suspeita de cancro de pele, células ou tecido da pele (de normal, NMSC e lesões precursoras) são recolhidos de biopsia da pele ou por uma técnica de rotina de vesículas de sucção. No caso de suspeita de uma doença, médicos de cuidados primários, oncologistas ou outros profissionais podem extrair do paciente tecido normal e com doença suspeitada. Com a finalidade de analisar a exposição solar, tecido pode ser recolhido da derme ou epiderme, ou uma combinação de ambas.

Para amostras de tumores, como da próstata ou pele, secções transversais duplicadas (5 ntícrones) de tecidos embutidos em parafina sujeitos a microdissecção são desparafinizados 47 antes de uma lamela ser corada com hematoxilina e eosina (HE), com o duplicado oorado com verde de metíio (MG), como é comum na área. As colorações de HE são classificadas por um patologista quanto a tipos normais, precursores e aplicáveis de progressão tumoral. As lamelas de MG duplicadas são utilizadas para captura laser, de acordo com recomendações dos fabricantes (Arcturus) de células classificadas.

Extraeção de mtDMA A extraeção de DNA pode ser efectuada utilizando qualquer método conhecido na área, seguida de amplificação da totalidade ou de uma região do genoma mitocondrial, e pode incluir sequenciaçáo do genoma mitocondrial, como descrito em "Current Protocols in Molecular Bíology".

Análise do ratDMA 0 passo de detecção da. presença de mutações no mtDNA pode ser seleccionado de qualquer técnica, como é conhecido dos profissionais. Por exemplo, a análise de mtDNA pode compreender sequenciação do mtDNA, amplificação do mtDNA por PCR, hibridizações de colorações "Southern”, "Northern", "Western" "South-Western", HPLC desnaturante, hibridizaçào para microsséries, "biochíps" ou "chips" genéticos, análise de marcadores moleculares, biossensores, perfil de temperaturas de fusão ou uma combinação de quaisquer dos acima. Adicionalmente podem ser utilizadas técnicas estatísticas, como Extraeção de Regras Indutivas e Modelos de Redes Neurais.

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Sequências polinucieotídicas da invenção podem ser amplificadas peia reacçâo em cadeia de polimerase (PCR), Qs métodos de PCR sâo bem conhecidos dos profissionais. PCR requer a presença de um ácido nucleico a ser amplificado, dois "primeis1" oligonucieotidicos de fílamentaçáo simples que flanqueiam a sequência a ser amplificada, uma DNA polimerase, desoxirribonucleósido trifosfatos, um tampão e sais, 0 método de PCR é bem conhecido na área. PCR é efectuado como descrito em Mullis e Faloona, 1987, Methocís Enzymol., 155: 335. P _;R 0 ΒΤΛ ;;Ct'Jad.0 UScL ndo Dl· ΪΑ moc leio ( pelo me mos 1 >dO ma i s ii til 1-1000 ng) e pelo me no s 2 5 pm pi de cl l igonuci· eotidicos. Uma mi st ura reaccional t aipi ca li! .1 de DNA , 25 pmol d e "pri mer" ol.ígo; lucieot: .dico, .OX tamp ão de PCR 1 (Pei zkm-El .mer, Foster 4 , 7 '·-· >· ^ V / p.L de dNTI ? 1,25 jj.M, jL (ou 2,5 unidade ic 1 r] ;r> DNA polimerase Taq (Perkin Elmer, Foster City, CA) e água desionizada para um volume total de 25 pL. Recobre-se com óleo mineral e a PCR é realizada utilizando ura dispositivo de aplicação de ciclos térmicos programável. 0 comprimento e temperatura de cada passo de ura ciclo de PCR, bem como o número de cicios, são ajustados de acordo com os requisitos de restrição aplicáveis. A temperatura e caiendarização da hibridizaçáo são determinadas pela esperada da hicrid.i .zaçao de um "primer" para um o grau de emparei .hamentos defeituosos a s ;er A capacidac ie de optimizar a restrição c ias tolerado condições de hibridizaçáo de "primers” pertence ao âmbito do técnico. Utiliza-se uma temperatura de hibridizaçáo entre 40°C e 72°C. Em geral, a desnaturação inicial das moléculas do modelo ocorre normalmente a uma temperatura 49 entre S2°C e 9S°C durante 4 minutos, seguida de 20-40 ciclos consistindo em desnaturação (94-99°C durante 15 segundos até 1 minuto/kb), hibridização (temperatura determinada como discutido acima; 1-2 minutos) e extensão (72°C durante 1 minuto). Q passo de extensão tinai é geralmente etectuadc durante 4 minutos a 72°C, e pode ser seguido de um passo por tempo indefinido (0-24 horas) a 4°C.

Seguenciação de DNA

Pode ser utilizado qualquer meio conhecido para sequenciar o genoma mitocondrial. Preferivelmente, mtDNA é amplificado por PCR antes da sequenciaçâo. Os produtos de PCR podem ser sequenciados directamente ou cion ados num vector , que então é colocado n um hospedeiro bactei :iano. Exemplos de métodos de sequenciaç :ã.o de DNA ene ontram- se em. Brumley, R. Ii. Jr. e Smith, L.M., 1991, "Rapi d DNA sequencing by horizontal uitrathin gel eiectrophoresis", Nucleic Acíds Res. 19: 41214126, e Luckey, J.A„, et ai., 1993, "High speed DNA sequencing by capiliary gel eiectrophoresis", Methods Enzymol. 218: 154-172. A utilização combinada de PCR e sequenciaçâo de mtDNA é descrita em Hopgood, R., et ai., 1992, "Strategies for automated sequencing of human mtDNA directly from PCR Products", Bíotecimiques 13: 82-92, e

Tanaka, M. et al,, 1996, "Automated sequencing of mtDNA", Methods Enzymol. 264: 407-421.

Analise e Detecção tía DslsçÕes

Uma abordagem preferível é a técnica de PCR de extensão longa (LX-PCR) utilizando o sistema de PCR Expand Long Template (Boehringer Mannheim). Utilizando a técnica de LX-PCR, que foi estabelecida e validada no laboratório de Birch-Machin (Ray et ai. 2000), tem-se a oportunidade de 50 rastrear rapidamente todo o espectro de deleções de mtDNA, em oposição à incidência de uma única deleção.

Pode ser utilizado um método de PCR semi-quantitativo (Corral-Debrinski et al. 1991) para estimar a proporção da deleção de mtDNA49" no mtDNA total.

Adicionalmente, Coloração "Southern" e tecnologia de sondagem etiquetada com isótopos, ou qualquer outra técnica comum na área, também podem ser utilizadas para a detecçâo de deleções.

Pode ser utilizada PCR quantitativa para quantificar a quantidade de qualquer alvo de deleção específica utilizando um "primer" que faz a ponte na junção de sequência formada de novo. A quantidade de moléculas de mtDNA deietadas pode ser comparada com a quantidade de mtDNA do tipo selvagem, para determinar a proporção de moléculas de mtDNA deietadas.

Soqusnclsção de produtos do PCR

Pode ser utilizado qualquer meio conhecido para sequenciar os produtos de PCR. Preferivelmente, toda a sequência de DNA é caracterizada por sequenciação didesoxi utilizando tecnologia ABI Big Dye Terminator™ e uma série de 72 "primers" sobrepostos, cada um para filamentos pesados e leves. A sequenciação ocorre em uma, várias ou uma combinação de plataformas ABI, como 310, 3100 ou 3700. As reacções de sequenciação são realizadas de acordo com as recomendações do fabricante. 51

Análise mutacienai do genoma miiocondriai utilizando cromacografia liquida de alto desempenho desnaturante (DHPLC}

Antes da sequenciação do genoma mitocondrial e identificação de regiões mutacionais importantes, pode utilizar-se DHPLC para rastrear rapidamente mutações em muitas amostras. Esta técnica proporciona maior sensibilidade na identificação de níveis baixos de heteroplasmia. Não consegue detectar alterações homoplásmicas, mas irá complementar a sequenciação tradicional. Para além das mutações homoplásmicas recentemente identificadas em tumores, a vasta maioria das mutações de mtDNA relatadas são heteropiásroicas (Chinnery et al. 1939). Estas alterações heteroplásmicas de mtDNA originam, a formação de heterodu.plexes após amplificação do mtDNA por PCR. 0 rastreio rápido de mutações heteroplásmicas de mtDNA é determinado utilizando a técnica relativamente nova de cromatografia líquida de alto desempenho desnaturante (DHPLC) (Oefner & [Jnderhi.il, 1998) . Esta técnica foi recentemente utilizada para rastrear rapidamente e identificar genornas completos de mtDNA quanto a mutações pontuais heteroplásmicas até níveis < 5% (Van den Bosch et al. 2000), A DHPLC pode ser realizada no Sistema de Análise de Fragmentos de DNA WAVE™ (Transgenomic, Omaha, E.U.A,), que proporciona um procedimento de rastreio completamente automático. A mesma tecnologia pode ser utilizada para rastrear mutações heteroplásmicas de mtDNA, Preferivelmente, a totalidade do genoma de mtDNA é amplificado por PCR em 13 fragmentos sobrepostos, utilizando duas condições diferentes de PCR, como descrito 52 52 por van den Bosch et ai. (2000), Os produt os de PCR de 1-2 kb são digeridos e m fragmente 3s de 90 “600 bp e são res olvidos à sua terrç :;eratura de fusão opt. ima. As mutações são representadas na forma de d; sis picos, e mutações com Oci. xas percentagens, como <2% c ie neterop. lasmia, na forma de ura "ombro” no pico. A sequenciação de DNA também pode ser efectuada utilizando uma microssérie, como é conhecido na área (Chee et al„ 1996),

Análise de Dados

Depois de sequenc: .adas, seguêncu. as de mtDKA normais e associadas a doença são arquivadas numa base de dados para comparação, , Dispôs! ti vos de nova sequenciação, tecnologia de microssénes, sistemas de amplificação e análise microfluidicos integrados, métodos de alta velocidade, alto rendimento, de detecção de mutações e outros podem ser utilizados com os métodos da presente invenção.

Dadc :S obtido s da se qu a -p; a -j a 3' ão do genoma mi. tocondr.i. al inolí vi dual sa. o compara do. s com dados a o nível ρορ ulaciona 1. Os dados são obtid .03 por obten ção de an icstras Θ sequ en criação de mt DNA, descrito acim Pref er ivelmerv te , a ba 30 de c lados c ontém infor mações de estu dos de li ni ias matern as. Os dados de nível po pulacíon al 5 α O mantidos numa base de dados, Pode ser utiliza da qual CjOG.S foclSG ei Θ dadOS 3.(. lequadí a. uma base de dados de muitidimensional de dados roporciona a infraestrutura a recolha, processamento e

Preferivelmente é utilizada investigação de ava.;. laçao clínicos e biológicos, que ρ bioinformática necessária para 53 disseminação de informações reunid envolvidos nesta colaboração. A base sistema electrónico centralizado que recursos dinâmicos e poderosos. ; o pelos dados labor consi v on tórios te num inando A base de dados pode ser acedida por qualquer meio conhecido, preferivelmente por uma via de "internet" segura. Preferivelmente, a base de dados é desenvolvida utilizando um algoritmo de comércio electrónico, construído num servidor e desdobrado usando um servidor de aplicações que suporta ura volume elevado de utiliza r\ .-λ ν' ,ο ο. cid j- A- srmuitaneos, através de caracterí sticas optimizadas de desempenho e capacidade de escalonamento. Ura servidor "web" separado pode proporcionar as bases da arquitectura do sítio "web", pois pode servir de ponto central através do qual devera passar todos os conteúdos, aplicações e transacções antes de chegarem aos utilizadores.

Algoritmos de prospecção de dados conhecidos na área são utilizados para descobrir padrões, agregados e modelos a partir de dados (3A3 2000). Além disso, serão desenvolvidos algoritmos e métodos inteligentes para os seguintes: ocorrência de mutações e taxas de mutações, padrões de mutações para detenção de doenças, recolha de informações e outro "software" complexo de análise de sequências.

Membros & Sondas de Acídos Mucleicos A invenção proporciona membros e sondas de ácidos nucleicos que S Θ i. rgam esp ecrf icamente a uma sequênci; a de ácido nuc leico a ivo. A seqr lência de ácido nucleico alvo é um áci do nuc leico ou uma região de um ácido nuc] .eíco a ser det ectada como i ndíc adora de doença, como canc ro da próstata, cancro da pele não-meianoma e afins. As 54 sequências de ácidos nucleicos alvo a serem analisadas utilizando uma microssérie da invenção são preferivelmente derivadas de amostras de tecido ou iluido humano, A invenção proporciona sequências de ácidos nucleicos alvo compreendendo RN A ou ácido nucleico cor re spondente a RNA (isto é, cDNA) ou DNA. Membros de ácidos nucleicos são

asso ciado 3 de modo ;:i c· t :ável cl um s £ o ΓΤ ($ sólido p ara cons titui rei n uma série d·; ; aco: rdo com a invenção . Os memt ·' L 0 S de ácido s 11U. tí ΰΐ 3 0 3 po dem ter filan tentação simples ou dupl a, e po< íem consist ir num : fraç imento de POR a raplificad lo a part ir de c.) !)NA. A i. n : tenção também proj -·, 0 ν' ciona i. se quênci as poliu ucleotidi . C cl S compreendendo uma sonda. Como usado aqui, o termo "sonda" y (Cl j-- γ· -se a um oligou ucleótido que forma uma estrutura em hélice du ipia com uma sequência do ácido nu cleico al 3 0 / devido â complementar idade de oelo menos uma sequência da sonda com uma sequenc ia da região alvo. A so nda pode ,3 & 1. etique tada de acordo com métodos conhecidos : na área , Uma sond.a de acordo com a invenção pode ter filamenta ção simples ou dupla. 0 -J . A. —IJ ί —V * _ J vi. - J- U _, , Λ XyJ m tj-fl - J - Ji A »n vt „ -ί. V ,? A invenção inclui dispositivos de diagnóstico, como "biochips", " ch.ips ” genéticos ou mícrosséries, utilizados para diagnosticar doenças especificas ou identificar mutações especificas. Todos os genomas mitocondriais sequenciados são avaliados, para criar uma estrutura de consenso do arranjo de pares de bases, e é-Ihes atribuído um índice de proibição, para a proporção de deleções e mutações de pares de bases associadas a uma doença ou perturbação particular. 0 arranjo de diagnóstico é então 55 utilizado para criar "biochips”, "chips'' genéticos ou microsséries.

Depois de identificadas sequências associadas a doenças, estados de doença ou perturbações particulares, pode utilizar-se nibridização de mtDNA para uma série de oligonucleótidos com a finalidade de identificar mutações particulares. Pode ser utilizado qualquer método conhecido de hibridização. Preferivelmente utiliza-se uma série, que tem sondas oligonucleotidicas correspondentes à região de tipo selvagem ou mutada, e uma sonda de contr olo. Séries comercialmente disponíveis, com .0 microsséries ou "chips" genéticos, são adequadas, E S13. S séries contêm milhares de pares de sondas corresponde ntes e de controlo numa lamela ou "microchip", Θ SciO CcfpclZ es de sequencíar to do o genoma muito rapidamer ite. Artigos de revisão que c áescrevem a utilização de microsséries em análise de sequências genómicas e de DNA estão disponíveis em www.gene-chips.com. M±c£Qg§éri&

As séries de polinucleótidos proporcionam uma técnica de alto rendimento que consegue testar um grande número de polinucleótidos numa amostra compreendendo uma ou ma is sequências de ácidos nucleicos alvo. As séries da invenção são úteis para análise da expressão genética, diagnóstico de doença e prognóstico de doença (por exemplo, monitorização da resposta de um paciente a terapia, rastreio de fármacos e afins).

Para a construção de uma mi ti 1 i70 0 a qual que combinação das secruências polinucleoti .dicas de mtDNA indicadoras de doença, envelhecimento ou outras mutações relacionadas com o estado de saúde. 56

As amostras de ácidos nucleicos alvo a serem analisadas utilizando uma microssérie são derivadas de qualquer tecido ou fluido humano que contenha quantidades adequadas de rntDNA, como previamente descrito, preferivelmente fluido de massagem prostática, tumores sólidos, tecido benigno, sangue ou urina. As amostras de ácidos nucleicos alvo sáo contactadas oom membros polinucleotídicos em condições de hibridizaçao suficientes para produzir um padrão de hibridizaçáo de complexos de membros de ácidos nucleicos/alvos complementares.

Construção de uma microssérie A microssérie compreende uma pluralidade de polinucleótidos únicos fixados numa superfície de um suporte sólido, em que cada um dos polinucleótidos é fixado na superfície do suporte sólido numa região pré-seleccicnada não idêntica. Cada amostra associada na série compreende uma composição polinucleotídica, de identidade conhecida, habitualmente de sequência conhecida, como descrito mais pormenorizadamente abaixo. Na invenção pode ser empregue qualquer substrato concebível. A série é construída utilizando quaisquer meios conhecidos Os membros de ácidos nucleicos podem ser produzidos utilizando técnicas estabelecidas, como reacção em cadeia de polimerase (PCR) e transcrição reversa (RT). Estes métodos são semelhantes aos presentemente conhecidos na área (ver, por exemplo, "PCR Strategi.es”, Michael A, Innis (Editor), et al. (1995) e "PCR: Introduction to Biotechniques Series", C. R. Newton, A, Graham (1997)) . Polinucleótidos amplificados são purificados por métodos bem conhecidos na área (por exemplo, purificação em coluna) . Um poiinucleótido é considerado puro quando foi 57 isolado de modo a estar substancialmente desprovido de "primers” e produtos incompletos produzidos durante a síntese do polinucleótido desejado. Preferivelmente, um polinucleótido purificado também estará substancialmente desprovido de contaminantes que podem obstar ou mascarar a aotividade de iiaaoáo da molécula.

Nas séries da invenção, as composições polínucieotidicas estão associadas de modo estável à superfície de um suporte sólido, em que o suporte pode ser um suporte sólido flexível ou rígido.

Na invenção pode ser utilizado qualquer suporte sólido ao qual possa ser fixado um membro de ácido nucleico. Exemplos de materiais de suportes sólidos adequados incluem mas não estão limitados a siiicatos, como vidro e silica gel, papéis de celulose e nitrocelulose, nylon, poliestireno, polímetacrilato, látex, borracha e resinas fluorocarbonadas, como TEFLON™. rn ’ s, As la .melai 5 proporo ionam vá ri as "iai . s e, a s s ‘ i.m, o A o uma. forma. pref1 er ida de De VI .do 3 8 U 3 snpe: rficie pia na, ; sondas e ib V z di: zaçSo s Ao ' Td.nimizado; S l; l. iIi zan do rt. r-. Ia: meias também ΟΘΓΤΠ.ΐ. GÍU 0 8.p.i A- c a ç a 0 oe ia:. O selecti ..vos >, é fácil man S 3 0 ma e, L· i :áci .1 lavá-las e faci I itam a ! bT í- a de RNA e/cr u DNA .. imobiliza do no supor te 0 material de suporte sólido pode ser utilizado numa grande variedade de formas, incluindo mas não se limitando a ramelas e e s r e w i a reagenr.es em temperatura sólido, A remoção de RNA e/ou DNA imobilizado no suporte sólido também é facilitada utilizando lamelas. 58 58 enç; ao, c ::estí .e que prop os que ímp iement .arem mar o :r lelh; cr mat eria^ em co; -isid orações e •equ ·; cp, ·; r , os da ap iica;: 0 material particular seleccionado como suporte sólido nâo é essencial para a inv descrita. Normalmente, invenção irão seleccic disponível com base em considerações económicas e de disponibilidade, os produto final e os requisitos do processo global de fabrico.

Utilizam-se numerosos métodos para a fixação dos membros de ácidos nucleicos da invenção no substrato (um processo denominado de deposição em manchas). Por exemplo, polinucleótidos são fixados utilizando as técnicas, per exemplo, da Patente U.S. N° 5,807,522. Alternativamente, a deposição em manchas ê efectuada utilizando tecnologia de impressão por contacto. A quantidade de polinucleótido presente em cada composição será suficiente para proporcionar hibrídização e detecçâo adequadas de sequências de polinucleótidos alvo durante o ensaio no qual é empregue a série. Sm geral, a quantidade de cada membro de ácido nucleico associado de modo estável ao suporte sólido c í 3. 3 érie é pelo me nos cerca de 0,1 ng, pre íerivelmente ; pe.' | O menos cerca de 0,5 ng e ma i. s pre ferivelmente r ie J ..O menos cerca d e 1 ng, em qu e a qua ntidade pode s er tã G 3. .1. ΤΓ-3 quanto 1000 ng α u miais, ΓΡ.3.3 hab ítuaimente nâo >ccec ierá cei roa de 2í '3 ng, Quan ido o me mbro de ácido nucleico ά "de posítad o em man chas” sobre o suporte S L ido numa manch .3. GOÍf: preende ndo uma dimensão aiobalm ente circular, o diâmetro da "mancha" irá geralmente variar desde cerca de 10 até 5 000 ym, habitualmente desde cerca de 20 até 2 000 pm e ma is habitualmente desde cerca de 50 até 1000 um. 59

Polinucleótidos de controlo podem ser depositados em manchas sobre a série e utilizados como polinucleótidos de controlo da expressão alvo e nucleótídos de controlo de emparelhamentos defeituosos, para monitorizar ligação inespecifica ou hibridização cruzada para um polinucieótido presente na amostra diferente do alvo ao qual é dirigida a sor rda. Assim, sondas ; de emparelhamento defeituoso O; uma hibridização é específica ou não . Por exemp al\ /0 estiver presente, as sondas perfeit amente empa ínaucis ma 1. s br rilhantes d< o que 3. S :30. ádr .cionalmentí , se jfn q j- defe; Ltu iosos centr 3 i c ΟΛ ... V-1 ; as devem ser consistentemente mais brilhantes do que as sondas com emparelhamento detetor presentes empare1hamentos com emparelhamento defeituoso são utilizadas para detectar uma mutação.

Preparação dos slvos

Os alvoí cara microsséries são derivados de amostras de tinidos ou tecidos humanos. Pode ser desejável amplificar a amostra de ácido nucleico alvo antes da hibridização. 0 profissional apreciará qr ;e, qualquer que seja c ) método de am,ρ .1. i. t. i. c a ç a o utrlizado, se for desejado um resu.lt a do quantitativo deve ter-se o cuidado de empregar • urr:. mét O O 0 que mantenha ou contro.l le as frequências rei ativas dos polinucleótidos amplificados. Métodos de amplificação "quantitativa" são bem conhecidos dos profissionais. Por exemplo, PCR quantitativa envolve simultaneamente a eo-amplificação de uma quantidade conhecida de uma sequência de controlo utilizando os mesmos "priraers". Isto proporciona um padrão interno que pode ser utilizado para calibrar a reacção de PCR. A série de alta densidade pode então incluir sondas específicas para o padrão interno, para a quar itificação do pol: inucleótido amor i.ficado - Protocolos c )ormenorizados de PCR ouanti .tativa são 60 proporcionados em "PCR Protocole, A Guide to Methods and Applications’", Innis et ai., Academic Press, Inc. N.I., (1990). Outros métodos de amplificação adequados incluem mas não se limitam à reacção em cadeia de polimerase (PCR) (Innis, et al., "PCR Protocols. A guide to Methods and rea

Gen lication" Academic Press, Inc. San Diego, (1 990) ) cção em cadeia de ligase (LCR) (ver Wu e Wa llace omics, 4 : 5b0 (1989), Landegren, et al., Science , 241 7 (1988) , e Barringer, et ai., Αι'ίη-Γΐ íc- f 8 (v í Li. i \ 199 0) .]. 1. T. 1. C0.ÇcíO da transcrição (Kwoh, et al., Proc. Natl

Acad, Sei. USA, 86: 1173 (1989)) , e replicação de sequência

Pr Cu Kí,~

Acad. Sei auto-sustentada (Guatelli, et USA, 87: 1874 (1990)). A invenção proporciona um alvo etiquetado ou sonda etiquetada. Na invenção pode ser utilizado qualquer marcador analiticament e detectável que seja fixado σ incorporad o numa moli icula. Um marcador analiti cament· detectável refere-se a qualquer molécula, fraeção ou átom· que seja analiticamente detectado e quantificado. Etiquetas detectáveis adequadas para utilização na presente invenção incluem qualquer composição detectável por meios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, imunoquímícos, eléctricos, ópticos ou químicos. Etiquetas úteis na presente invenção incluem bíotina para coloração com conjugado de estreptavidina etiquetado, esférulas magnéticas (por exemplo, Dynabeads5*), corantes fluorescentes (por exemplo, fluoresceína, Vermelho Texas, rodamina, proteína verde fluorescente e afins), etiquetas radioactivas (por exemplo, áH, UoI, íyS, i4C ou 3iP), enzimas (por exemplo, peroxidase de rábano bravo, fosfatase alcalina e outras habitualmente utilizadas num ensaio ELISA) e etiquetas colorimétricas, como ouro coloidal ou 61 esférulas coloridas de vidro ou plástico (por exemplo, poliestireno, polipropileno, látex, etc.). Patentes que ensinam a utilização dessas etiquetas incluem as Patentes u s N°S 3,817,837; 3,850,752; 3,939,350; 3,9S6,345; 4,277, 437; 4,275,149, e 4,366,241.

Meros de deteoção dessas etiquetas são bem conhecidos dos profissionais. Assim, por exemplo, etiquetas radioactivas podem ser detectadas utilizando filme fotográfico ou contadores de cintilações, marcadores fluorescentes podem ser detectados utilizando um fotodetector para detectar luz emitida. Etiquetas enzimáticas são tipicamente detectadas dotando a enzima de um substrato e detectando o produto reaccional originado peia acçáo da enzima no substrato, e etiquetas coiorimétricas são detectadas por simples visualização da etiqueta colorida.

As etiquetas pedem ser incorporadas por qualquer de alguns meios bem conhecidos dos profissionais. No entanto, numa forma de realização preferida, a etiqueta é simultaneamente incorporada durante o passo de amplificação na preparação dos polinucleótidos da amostra. Assim, por exemplo, reacçào em cadeia de polimerase (PCR) com "primers" etiquetados ou nucleótidos etiquetados dará origem a um produto de amplificação etiquetado. Numa forma de realização preferida, amplificação da transcrição, como descrito acima, utilizando um nucieótido etiquetado (por exemplo, UTP e/ou CTP etiquetado com fluoresceína), incorpora uma etiqueta nos poiinucleótidos transcritos, Alternativamente, uma etiqueta pode ser adicionada directamente à amostra polinucleotídica original (por exemplo, ruRNA, poliA de mRNA, cDNA, etc.) ou ao produto de amplificação depois de completada a amplificação. Meios de fixação de etiquetas em 62 polinucleótidos são bem conhecidos dos profissionais e incluem, por exemplo, tradução por cortes ou etiquetagem das extremidades (por exemplo, com um RNA etiquetado) por tratamento do poirnucleótido catalisado por qurnase e subsequente fixação (ligação) de um agente de ligação polinucleotidico que reúne o poirnucleótido da amostra a uma etiqueta (por exemplo, um fluoróforo).

Numa forma de realização preferida, o alvo incluirá uma ou Riais moléculas de controlo que hibridizam para sondas de controlo presentes na microssérie, para normalizar sinais gerados a partir da microssérie. Alvos de normalização etiquetados são sequências polinucleotídicas que são perfeitamente complementares a oligonucleótidos de controlo que são dispostos em manchas na microssérie, como descrito acima. Os sinais obtidos dos controlos de normalização após a hibridízação proporcionam um controlo de variações das condições de hibridízação, intensidade das etiquetas, eficiência da "leitura" e outros factores que podem causar a variação, entre séries, do sinal de uma hibridízação perfeita .

Condíçô&s de hlbrídízãçâo A hibridízação de polinucleótidos envolve proporcionar uma sonda desnaturada ou membro de ácido nucleico alvo e polinucleotído alvo em condições em que a sonda ou membro de ácido nucleico alvo e seu alvo complementar podem formar hélices duplas híbridas estáveis por erapareihamento de bases complementares. Os polinucleótidos que não formam hélices duplas híbridas são depois removidos por lavagem, deixando os polinucleótidos hibridizados a serem detectadcs, tipicamente por detecçâo de uma etiqueta detestável fixada. É geralmente reconhecido que 63 polinucleótidos são desnaturados por aumento da temperatura ou decréscimo da concentração de sai do tampão que contém os polinucleótidos. Em condições de baixa restrição (por exemplo, baixa temperatura e/ou alta concentração de sal) formar-se-ão hélices duplas híbridas (por exemplo, DNA:DNA, RNA:RNA, RNArDNA, cDNAiRKA e cDNA:DNA) mesmo quando as sequências hibridizadas não forem perfeitamente complementares. Assim, a especificidade da hibrídízação é reduzida sob restrição menor. Inversamente, sob restrição maior (por exemplo, temperatura roais elevada ou menor concentração de sal), uma hibrídízação com êxito requer menor emparelhamentos defeituosos. Métodos de optimizaçâc de condições de hibrídízação são bem conhecidos dos profissionais (ver, por exeroplo, "Laboratory Techniques in Biochemístry and Molecular Biology", volume 24: "Hybrídízatíon With Polynucieotide Probes”, P. Tyssen, editor, Plsevíer, N.I., (1993)),

Após a hibrídízação, polinucleótido etiquetado não hibridizado ou não etiquetado é removido da superfície do suporte, convenientemente por lavagem, desse modo gerando um padrão de polinucleótido alvo hibridizado na superfície do substrato. Uma variedade de condições de lavagem é conhecida dos profissionais e pode ser utilizada. Os padrões de hibrídízação resultantes de oligonucieótidos e/ou polinucleótidos etiquetados e hibridizados podem ser visualizados ou detectados de uma variedade de modos, em que o modo de detecção particular é escolhido com base na etiqueta particular do polinucleótido de teste, em que meios de detecção representativos incluem contagem de cintilações, autorradiografia, medição da fluorescência, medição calorimétrrca, medição da emissão de luz e afins. 64

Aquisição de Imagens e Análíaa de Dados

Após a hibrídizaçáo e qualquer(quaisquer) passo(s) de lavagem e/ou tratamentos subsequentes, como descrito acima, o padrão de hibridização resultante é detectado. Na detecçâo ou visualização do padrão de hibridização, a intensidade ou valor do sinal da etiqueta será não só detectado mas quantificado, pretendendo-se significar que o sinal de cada mancha da hibridização será medido e comparado com um valor unitário correspondente ao sinal emitido por ura número conhecido de polinucleótidos alvo etiquetados nas extremidades, para se obter uma contagem ou valor absoluto do número de cópias de cada alvo etiquetado nas extremidades que é híbridizado para uma mancha particular na série no padrão de hibridização. Métodos de análise dos dados recolhidos de hibridização para séries são bem conhecidos na área, Por exemplo, quando a detecçâo da hibridização envolver uraa etiqueta fluorescente, a análise de dados pode incluir os passos de determinação da intensidade fluorescente em função da posição dos dados recolhidos no substrato, remoção de valores extremos, isto é, dados que se desviam de uma distribuição estatística predeterminada, e cálculo da afinidade de ligação relativa dos polinucleótidos de teste a partir dos dados restantes. Os dados resultantes são representados na forma de uraa imagem, em que a intensidade em cada região varia de acordo cora a afinidade de ligação entre oligonucieótidos e/ou polinucieótidos associados e os polinucleótidos de teste.

Após a detecçâo ou visualização, o padrão de hibridização é utilizado para determinar informações quantitativas sobre o perfil genético da amostra de poiinucieórido alvo 65 etiquetado que foi contactada com a série para gerar c padrão de hibridização, bem como a fonte fisiológica de onde foi derivada a amostra de polinucieótido alvo etiquetado. Por perfil genético pretende-se designar informação respeitante aos tipos de poiinucleótidos presentes na amostra, por exemplo, em termos dos tipos de genes aos quais são complementares, bem como o número de cópias de cada polinucieótido particular na amostra.

Testes de Diagnóstico ou Prognóstico A invenção proporciona testes de diagnóstico para detectar doenças. A invenção também proporciona testes de prognóstico para monitorizar a resposta de um paciente a terapia. De acordo com o método da invenção, a presença de doença ou a resposta de um paciente à terapia é detectada obtendo uma amostra de fluido ou tecido de um paciente. Uma amostra compreendendo ácido nucleico é preparada a partir da amostra de fluido ou tecido. 0 ácido nucleico extraído da amostra é hibridizado para uma série compreendendo um substrato sólido e uma pluralidade de membros de ácidos nucleicos, em que cada membro é indicador da presença de doença ou de uma predisposição para uma doença ou perturbação. De acordo com este teste de diagnóstico, a hibridização da amostra compreendendo ácido nucleico para um ou ma is membros de ácidos nucleicos da série é indicadora de doença, de uma predisposição para uma doença ou perturbação ou então, no caso de um teste de prognóstico, indicadora da resposta de um paciente a terapia, São proporcionados estojos contendo reagentes e instruções para implementar os métodos da presente invenção. Por 66 ο, ο estojo pode compreender reagentes e instruções para a detecção de deleções, mutações, heteroplasmias e homoplasmias mitocondríaís em amostras específicas de tecidos e fluidos associados a tecidos. Os estoios também pod em coi apreender a m ou ma i C; "pmimers que hibndi zam p >ara o g enoma mitocondri. ai, i i p: reparar i m pro dato de exten isão de "prim ers". Os e S CO j £ -\ Cj j o tam Obérn pode mi inc iluir um sapo m te sói ido, como um "c hrp" de soa rtável, me ios para s· sgura. SUp orle sólido, me ios de ex tracção de mt :DNA e r seios de ace S S 0 3 uma base d< e dac los GG seguêncd .as de mt DNA.

Por exemplo, um estoje > para detectar u ma deleção de mtbNA asse yC.Í-3.d.cl 3 cancro da oróstata tode i neluir os "pri meu: s" 3.4 directo e : reverso. reagentes e inst: rucôes.

De modo semelhante, um estojo para detectar uma deleçãc de mtDNA associada a exposição solar ou NMSC pode incluir o "prímer" 14 04, "primei:’' H4676, a sonda 3895, reagentes e

Outras utilidades da presente invenção, como as descritas acima e nos exemplos seguintes, serão claras para os profissionais. A presente invenção é descrita de modo mais particular nos exemplos seguintes apresentados apenas a título ilustrativo, uma vez que numerosas modificações e variações serão claras para os profissionais.

Exemplo 1: Tumores da Próstata

Após a aquisição de fluido prostático ou cirurgia para remover tumores da próstata preparam-se lamelas de biopsia para identificar células transformantes ou cancerosas. 67

Utiliza-se raicroscopia de Microdissecção por Captura laser ÍLCM) para . isolar da secção de tecido células que são normais, ben ignas ou malignas. É possível obtei : células doentes de ir rteresse, como células pré-cancerosas ou grupos invasores de a células cancerosas, de entre as células heterogéneas envoivent C'j o ·— o <. .A w ui L L Cl C C di O de DNA total de cada uma destas cé( lulas foi purificada de acordo com ama modificação do protocolo apresentado peia Arcturus Engineerrng Inc, DNA foi extraído de células com um volume de 50 yL de 1 mg/mL de proteinase K (PK) em Tris 10 mM pH 8,0, EDTA 0,1 mM pH 8,0 e 0,1% Tween 20, a 12 °C durante a noite, Após incubação durante a norte a 42°C, os tubos fo ram .i zemov idos do forno de incuba Γ' ,¾ Γ\ , As amost ras for am mi cro centr ifugadas durante Γ, minuto s a. 6 ‘10 0 rpm (2000 x g) , 0 C apSure™ for i :emovido do o ,-Q -P> ; de scartado, 0 tubo foi . inct ibado 8. 9 o J C durante 10 minuto s ( PK é rnaot ivada) e c iepoís foi arrefec ido para a temper atui :a ambiente . Utíl.i zar, am-se 5-50 y.L da amostra pa ira amplificação por PCR.

Após a purificação, amostras individuais são amplificadas por LX-PCR utilizando os "primers" apropriados para a região rtípervariávei 1 (HV1), região hipervariável 2 (HV2) e toda a região 12S. Estes produtos de PCR são então sequencíados utilizando métodos de alto rendimento, como é bem conhecido na área.

Alternativamente, genornas mitocondriais completos podem ser amplificados utilizando os "primers" da Tabela 5. A captura e amplificação especificas de DNA derivado de células tumorais malignas com qualquer Grau de Geason, células de uma glândula benigna adjacente e células de uma glândula 68 68 incluem: benigna "distante" podem ser amplificadas. Gutrc prostáticos cue oodem ser e sáo amplificados neoplasia intraepiteiial prostática (PIN), hiperplasia prostática benigna ÍBPH), hiperplasia de vários tipos, estrema e cérulas com alterações indeterminadas. Este trabalho for realizado em tecidos prostáticos de 31 indivíduos eleitos para uma prostatectomia devido a um diagnóstico de cancro da próstata. Foram capturados três tipos de tecidos: maligno, benigno adjacente e benigno distante O r> >r> cada indivíduo.

Jtiiizou-se sanaue de cada paciente como controlo positivo de tecido não doente. A amplificação e sequenciação destas amostras originaram as novas mutações observadas na Tabela 4. As mutações da

EcLO ela 4 tambén: Ί 6Γ1 ~\ tão £ ror e sent. a da s na ; 3ΕΌ ID NO • 1 n? . .L \j f que i i t3 3.3 3LIL·St a. tuições, SEQ ID NOs : 103 ate L ICO - .*.\J J f que lis' tam as deteções, e O f Q ID t,λ, 0 1 d f; 0 mm .1. W até 138 , que 1rstam as ins erções. Pol írnoi rfismc js e posi ções de mutaç :ões foram det erminados pc •| Y' Q ompar 3. Ç 3. 0 COrCl 3 i. Sequ ene ia de Relerên cia de Cambridge R> 9 ViS > L 5. ( 200.1), mas a numer 3Ç30 Γ ii stológí ca foi mantida, de r no do que a del ..eção na posiç ao 3106 P des ignad.a de h: ..ato 0 o polimorfismo ra Y r\ 7SOA f oí reti' do. Um subconjunto destes dados (7 reqioe 18 codif :b 33(1θ]Γ3 3 de pro teínas) foi de; pois sujeito a. anál í se : de c :omponerr tes pri ncipais, como é C omum na 3 -C Θ 3. / cc: )m o s seguia ι.β 3 res ultad.08 apre sent cados na Tabela J. 3 -

Tabela la

Sangue oenigno dietanue benigno adjacente maligno Desconhecido 100.00% 0, 00% 0,00% 0,00% 0,00% 16. .1.3 % 3 5,4 8 % 9,68% 29,03% 16,13% 12,9% 12,90% 45,16% 3,2 2 2 25,81% 3,2 2 2 0,00% O O o 96,78% 0,00% 69

Os resultados demonstre •m um padrão claro d Θ X, cl Π S i 0 £. íHcí. ç cl 0 maligna. Tecido normal (sangue) e tecido maligno exibem frequências eievadas de agregaçã o (1, 0 0 e 0,96 7) . É interessante notar que benigno adja utente e distante. ambos os quais parecem normais num sentido histológ j Q Q p patológico, exibem níveis de transformação com mais de 50% das amostras ficando fora das intersecções de benigno distante e benigno adjacente. Além disso, os mesmos dados foram analisados com uma rede neurai, como é comum na área, com os seguintes resultados apresentados na Tabela lb:

Sangue L'0í1JLGIiϋ íl-L b cci11 0Θ benigno adjacente Maligno 100,00% 0, 00% 0, 00% 0,00% 6^ 4 5% 0,00% 0,00% 93,55% 19,35% 0, 00% 0,00% 77,14% 3, 22% 0,00% 0,00% 96,78%

Esta tabela mostra que, na presença de tumor, todo o tecido prostático é considerado maligno ao nível molecular, mesmo apesar de a aparência anatómica do tecido poder ser normal”.

70 Tabela 1c: REGIÕES DE MUTAÇÕES - HDl, MD2, COX1 Θ CYTB benigno benigno 1 maligno s distante adjacente •ΐ. 1S50B 10SA3- 1Q6ML- | •sos? 4ÈSS 4®, | 4B?7( | 7497 | 2. 288DB m*B« 2»L* | 4517, 47E3, | 5174, em | S&8& 7828 | 87¾ | 3.. S4§DB S4MB 1 mm \ 4. S77QB 377AB mui* \ -473», 4317, 1 S984, sem 1 ¢¢12 7028, \ 7497, | 154¾ | 15697 ! s S. 37SDB 87MB - SHM.» | 97 78, 4793 | 1SD48 \ \ 3. 388SB 3S3AB - 3&DML - { MS& 4817, mm\ .8597, 4851, 1S218, 8448, \ \ 8® I 387AB - mm | *8397, 4718, 8147, | im> »312. 6681, \ 74ô?, S37t 7178. | ími, 1S182, 15623 | ím?, 15323, 1S607 15-3.24 \ ...............................\ §. 3S4DB 3S4A» · 384ML - | ' 4733, 8218, 4733, { 7028 16452, im \ 1S&D7 \ â.. mm 385AB - mm., i 71 (continuação) — benigno ji benigno distante ji adjacente maligno ΐ *16877 | mu, I isasi, I 164SS, I ISSO?, | miQ \ \ 10, 416SB \ 418A8 •4661, [ i§m, | tgsts | 4'18$$L' | 4064 \ ..........................í 11. 4Ι1ΦΒ | 4 i ?MS 4i m·' i 40:17 \ •2. 41$:Dfl | 41SA8-I 7lS§ 4im- j rm, | 7407 \ iS, 426DE | 4SSAB 42SML \ 4863, | 5102, | 5218 | 14.. 4430B | 448A8 404$, | 4817 [ sm, | 5047, | 7407 | um. \ \ \ | 15, 4550B | mm -iS3gs| mt, | sm | 15023 450ML· \ m$, | 5147, | 500?, | 15823 | .........................s 15, 4S1S& \ mm- [ 4217 451 ML | 17. mm | 4S2ÀB -- 401$, | $m 8667, \ §480, | 3&&4, | 3M, | 3635, | S03Ó, [ se<s, \ sm I SS&L | 65.¾. | 882?, | w, | 7055, 1 714$, 452ML ·- | $480, | 4681, \ mm, | 71SS, | 7407 \ \ \ | | \ \ 72 (continuação) benigno distante benigno adjacente malignoi 72SÊ, 7 m, 13115 ;8 mm 465A.8 463121. * 7150 : 13. 46BDB 450AB 45«. 3S89, 4216, 47S7, 42? 8. 4707, m?% 130;. 4217, 7®, &Sâ4. 7407, 1S303 6041. 18343, 70? 3.. 16432, 7487, im? U084. 1&SS2 : 2·’> 4670S 467A8 4t«; 21. 4S8QB OAB 4S342L -5188, 746? 22, 4S3DB 400.48 450ML SI 47 .........................^ 23, 461 m 4S1A8 - 4618?L- 7028, 3834, 7154 7184 71M, ?«S 24 463DB 4SSAB - 4Ê34ÍL- -14963 14303 nm :2¾. 4Ê4DB 464A8 mm.- 8S14, 6Ê4S:, 6^7;, 7628, 7tm. 7407, wm 26. 4BSDB 466AB - 466¾¾. - • 8307. 5308. 8382,. 7326 3888. 8776, 3(¾ mss? 4017, 4136. «m 7028 27. 4K7DB 467AÍ3 - 4$m 4017. ..........................i 73 (continuação)

benigno j; benigno distante ) adjacente maligno | Íl-V S8. 4S80B [ 4S3-XÇ - \ :4£MS um \ uma, | 1S3SS f ©m aa sssDií [ mm --4588, | ms, «, \ em mA, | 7007 [ SO-m- mo,. 4317.. 15S78 89. 5840B | SÍM8 • 3507 | sm«L 31. 3SSSS-1 m?: 1·δδ26 \ eOSAB - 4216. 4317, 1 §458,877^3353, 7ÍS®8, j 7437, 5S43S

JtoáliSfê dê âÇjT®€j!S,dOS

As mutações identificadas nos 31 indivíduos diagnosticados com cancro da próstata foram analisadas utilizando o Hierarchical Ciustering Explorer (HCE) (www.cs.umd.edu/hcil /multi-cluster; Seo et ai., 2002; Seo et al. 2003; Zriao et al. 2003; Seo e Shneiderman; Seo et ai, 2004a; Seo et ai, 2 0 0 d b / Seo ei al. 2005a; Seo et ai. 2004c; Seo et ai, 2005b). Adicionalmente, também, se analisaram os gencmas mitocondriais de tecido de biopsia prostática com agulha de 12 indivíduos do sexo masculino ciinicamente sintomáticos para cancro da próstata mas em que os resultados da patologia indicaram que o tecido prostático não era maligno. As figuras 2 e 3 mostram a análise de agregados das mutações mitocondriais não sinónimas identificadas. A Figura 2 ê a primeira metade da análise de agregados e a Figura 3 έ a segunda metade da análise de agregados. O eixo y lista os números dos pacientes para os 31 indivíduos com cancro da próstata (105, 208, 349, 377, 378, 380, 382, 384, 38b, 816, 417, 418, 826, 489, 450, 851, 452, 455, 856, 457, 74 74 501, 504, 505) e os sos mas que não têm 4 58, 4 60, 4 61, 4 63, 4 64, 4 66, 4 6 /, 498, 12 indivíduos que exibem sintomas ciini;

malignidac ie determii :iada por pa toiogi a (2 0"P pr δ n Q ç rí 3 536, — r r\ '3 r\ ; : V w V f 858) . Q e a fonte 0« o tecido (isto é, be migno disi adj acente (ab) , mc iligno (mi; e ( b) glandular beniano d< s tecido si ntomát ICO ixo y tarnbé ;m indica tante (db) , benigno sangue). ( ) tecido mas não mal -igno dos 0 eixo x lista o s 12 indivíduos está indicado por "gl”. sítios das mutações. A Fig ura 4 é uma cópia d. a Figura 3 qr ie mostra um de rui; ΤΓΡi 5es não sinón i: mas associa O. cl· 3 a cancro c) próst na área : sombr eada . As mi it.3Çí ces ocorrem específicos. Ambas as mutações nas posições 4216 e 4217 ocorrem no gene ND1 (subunidade da NADH desidrogenase 1) . A mutação na posição 4917 ocorre no gene ND2 (subunidade da NADH desidrogenase 2). A mutação na posição 7407 ocorre no gen e COXI (su bunidade da citocrc )mo c : ox :.idas e 1) . Por fí: m, a mut ação na p 0 SI. Ç ã 0 J. 5 4 0 2 ocorre no c iene C vt j. B (cítocromo b) . As m.utaçôe r-i í' 216 e 4217 invocam uma mut ação não sinónim a no mes mo ami.n oác ido e, tal como 494 / c .. > > 1 Ϊ mutações secundá rias ass ociadas 3. Neuropatia Optíca Her& ditâria de Beber (LHON) (Mi tochond ria 1 Research Socíety ; Hu· opo’ nen, 2001; MitoM ap) . Uma assoei ..ação para 74 0 7 difer ente de car: icro da prós ta ta arn da não foi esclareo ida. Er icont rou -se uma mutação i em 154 52 em 5 / 5 paciente s com def i n -j cu ncia em ubiqui nol- Ai > 3“ y-sr·' C T ΘO Li 13.3 Θ [ C O; mplexo 1 :n) (va Inot et al. 1999 No coorte de 31 homens submet idos a uros l -ò. Í,ecr.oínía para can oro da pr róstata, es- tas mut açõe; d·- f uma ou ma is, f 0Γ3ΓΙ1 not adas em 2C i dos sujeitos (64, t , Co: mo m encionado ac ima, em PCitiri. 0 m i iestes indi viduos obti. ver 3í!. O 1 e sequências i G O gen orna rai toc ondnal total de se C Ç õ1 Cs V- >--> transversais da 75 próstata para três tipos de tecidos associados: maligno, tecido benigno adjacente a tecido maligno e tecido benigno "distante", removido de qualquer patologia tecidual envolvente. Os tecidos foram submetidos a microdissecçâo por captura laser (LCM) efectuada por um patologista clínico qualificado. As sequências foram comparadas com DNA mitocondrial (mtDNA) extraído e sequenciado do sangue do paciente. Os resultados da sequencíaçao indicam que mutaç ões mitocon ί 0, L í cl J_ 3 f muitas vezes apare cem í sm todos os três tipos de tecido cí. a n. a li se de Alon so et ãl . (2005), encont s heteropiásmicas, ..dos, Contrariamente em DNA mitocondrial de tecido maligno, benigno adjacente e benigno distante em comparação com sequências de mtDKA do sangue do paciente, fíeteroplasmia, genomas mitocondriais mutantes e normais no mesmo indivíduo, é considerada evidência de mutação recente (fíuoponen, 2001). A maior parte das mutações não permanece em comum entre os três C x-p o c· de te eidos do rm esmo indi .vidão . De facto, f a 3 cargas mut Γ' .onaís comparativ p.cj ypj cada t ipo de tec do são apr O.X.i .madame >nte as mes: na s, índi c a n d o que mutações d< s mtDNA são 3. C t .1 V3 is na pi :óstata .o. a presença de tumor, ind epí índentemente do t.i .po de te? rido p rostátíco. Aié m disso, t- Θ c ido que apa renta ser hist elogie. aamente bei ii.gr: ;G exibe mu i taj $ vezes mutaçoe rV -· το genoma mitocondr ial - Estas mut r~' r ies nã· o estão as soei adas a. s a ( guências mi .toc :o: ndrlais embut.i .das no núcleo, ou NUt :TS ( sequências nu / 1 leares/ mit occ vidri ai •s) (Lopez, 199 „ r nu-se um es tud o y y cg χχ de clonagem e sequenci. ação de f IUMTS humanas uti diz a i ndo uma lin ha de células Rho O f ΟΘΓίι. como comparação com NUMTS con hec Ί1. d.B S c irquivadas r ia bí ase ob a dado S d.O b C O J. f e n Si o foram det ect na d. a s mutações pa ra pseud ogenes mi .toc o: ndrlais con hec :id.os 3.1Γ Q l j η. V 3 d O S em base. s d θ dados pua ί η.cas , para ssegurar dados sem pontos de pseuaogenes. 76

Nos 12 in .dividi ,;os do sexo mas calino clinicam iente srn temáticos para car icro da próstata, GiU UU.í δ os result ados da patologia indi car :am que o tecido pros' tático não era maligno, tecido glandular benigno foi recuperado por LCM e os genomas mitocondriais foram amplificados e sequenciados a partir de tecidos de biopsia prostática com agulha. Os resultados indicaram uma ausência completa de mutações de mtDNA em quatro pacientes, mutações apenas na região de controlo não codificadora em quatro pacientes, ou mutações na região de controlo e regiões codificadoras de genes em quatro pacientes. No entanto, as localizações das mutações foram significativamente diferentes das do coorte maligno (P > 0,01). Adicionalme nte, for observada somente uma mutação na re gião codific: adora nestes indivíduos e, des L cl·3 mutações, uma caiu nas re igiões mencionadas acima (isto ò. ν-- / NDi, NP2, CCó (1 e CytB) i o r 74~ ;;; .p y L u 0.0 pcíCd.G ΠΤ>3 3/5 Π5. pOSl. çao 15081),

Quando for am ut: Liizac ias mutações sinónimas e não sinónima k-: / inclusivam iente da s qua t: ro regiões codificadoras de proteínas, como marc adores de doença maligna, 30/31 (97 %) do grupo de c, ancro da p róstata foram identificados. A Tabela 1c list m ci o mutaç ôes sinónimas e não sinónim .3.8 presentes em ND1, ND2, COXi e CytB em amostras de tecidos dos 31 indivíduos com cancro da próstata. Mutações em ND1, ND2, COXi e CytB estão claramente associadas a cancro da próstata. Apesar de a presente invenção ter identificado as mutações listadas na Tabela lo e Figuras 2 até 4, a invenção inclui quaisquer mutações em ND1, ND2, COXI e

CytB, Naz > IT1 β 8 ΓΙ. íH 8 3. Π 3. .j. -1 ses, 1 dos 12 pacientes sintomã ticos benignos foi incluído no grupo maligno; no entanto, este paciente tinha uma n nutação em CytB, que pode in dicar 77 progressão para cancro precoce, 0 restante deste grupo for agregado com o controlo de sangue, ou normal,

Foi efectuada uma análise estatística de benigno distante de sujeitos malignos em comparação com as glândulas benignas dos 12 pacientes sintomáticos mas não malignos. Uma vez que havia 31 pacientes malignos e 12 sujeitos sintomáticos mas não malignos, amostras aleatórias de 6 grupos de 12 dos pacientes malignos foram processadas contra os 12 sujeitos sintomáticos mas não malignos. Efectuou-se uma análise de qui quadrado para cada um dos 6 grupos, Os resultados estão listados na Tabela ld. Em cada caso, as diferenças foram significativas ao nível de 0,01, significando que a diferença entre sequências mitocondriais de tecido benigno distante em sujeitos malignos e sequências mitocondriais de sujeitos sintomáticos mas não malignos não se deveu ao acaso 99% do tempo. A análise baseou-se no número de mutações presentes nas quatro regiões codificadoras discutidas acima.

Tabela ld. Teste de Qui quadrado m, 4M. 4S0,44S, 38», S8Í, 388.468,468,378.467, 534 377, m. 461,417,581,488,426, 488, 382,481 ,»4,484 467, 208,466,836,482,488,138,488,383,488,268,37? 416, 604,467,466,362,482,460, «> 498,396,418, Si 486,482,461,838,464,4§3, m, m, 41 f, m, 44». 343 Tecidos ND1 UD2 COT ΟΥ to Qui quadrado Sintomático G 0 0 1 Primeiro conjunto 10 8 12 7 35, 14 Segundo conjunto d 6 14 9 30,11 Terceiro congunto 4 2 7 8 19,12 Quarto conjunto d; 4 7 11 23,OS Quinto conjunto 4 5 10 3 25,12 Sexto conjunto 4 1 0 9 17,11 Pacientes Sintomáticos aleatórios de 12 cada 12; Benigno Distante 6 conjuntos

1) Primeiro conjunto de DE

2) Segundo conjunto de DB

3) Terceiro conjunto de DB

4) Quarto conjunto de DB

5) Quinto conjunto de DB

6) Sexto connunto de DB na regaao nao de pele exposta ao sol 78

Extraiu-se DMA de amostras de tecidos como descrito no Exemplo 1, utilizando o estojo DNeasy™ fornecido pela Qiagen, Utilizou-se uma metodologia de "primers" "costas com costas" para investigar a incidência de duplicações em série na região não codificadora (NCR) relativamente à exposição solar . Investigaram-se 32 amostras de peie humana separadas de idades correspondentes de sitios corporais expostos ao sol (n = 24) e protegidos do sol (n - 10). Uti1izaram -se os seguintes "primers” de duplicação de Brockington et ai. 1993, e Lee et a.l, 1994 : C 1236 MO ACA TCT CTfâ OCA AAC CG aOmstos SCQ)DNO::1 0 H3SS TM GTQ CTS TQG OCA SM GO Sírnsios SEQIDNO:? E 146'/ oco Am cta cm atc tca tc 2&mws SEQ)CNO.:3 F H4M AGTOGG AGfí GOA AM TM IS 20rwos SEQ(ONO:;4

Os pares de "primers” C/D e E/F estão "costas com costas" no sitio de dois conjuntos separados de repetições directas na região não codificadora, Em resultado, só geram um produto se estiver presente uma duplicação nestes pontos. Os produtos gerados são variantes de 260 bp e/ou menos comum 200 bp. As condições de PCR modificada são: 100 ng de DNA celular total, dNTPs 200 μΜ, 2,5 U de Taq polimerase HotStar e tampão de PCR (Qiagen, R.U.), 25 pmoles de "primers": ura cicio de 94°C durante 4 minutos, 36 cicios de 94 °C x 1 minuto, 55°C x 1 minuto, 72°C x 1 minuto e um ciclo de 72°C x 7 minutos.

Observou--se uma incidência aumentada de duplicações com exposição solar crescente, cora duplicações identificadas em 10/24 mas 0/10 amostras de pele exposta ao sol e protegida do sol, respectivamente (teste exacto de Fisher, p ^ 0,01 5) (Birch-Machin e Krishnan 2001) . Os tamanhos das duplicações mais frequentes foram 200 e 260 pares de bases. É interessante notar que estas mesmas amostras também 79 continham niveís altos (> 1%) da deleçác comum de mtDNA de 4S77 bp, determinado por um ensaio de PCR com 3 "primers" quantitativo estabelecido, descrito no Exemplo 6.

Exemplo 3: Impressões digitais de mutações de mtDNA em NMSC humano e suas lesões precursoras

Extraiu-se DNA de amostras de tecidos de pele humana como descrito no Exemplo 1, utilizando DNeasy™ da Qiagen. Utilizando "primers” específicos, mtDNA é amplificado por PCR e, após a preparação de amostras de DNA (Qiagen), identificam-se mutações por sequenciação automática (PE Applied Biosystems) utilizando sequenciação com Ciclo de Terminação BigDye™. Esta metodologia é descrita em fíealy et ai. 2000; Harding et al. 2000. Todo o genoma raitocondrial humano de 16 569 bp é sequenciado utilizando pares de "primers” de PCR estabelecidos que se sabe não amplificarem pseudogenes nem outros loci nucleares. Quaisquer alterações de DNA putativas são confirmadas por comparação com a referência de mtDNA humano de "Cambridge” revista (Andrews et al. 1999) . As sequências obtidas do mtDNA tumorai são primeiramente comparadas quanto a polimorfismos conhecidos (Andrews et al. 1999; MITOMAP) e depois são comparadas com a sequência de mtDNA da pele perilesional normal, para identificar mutações somáticas genuínas.

Realiza-se DHPLC no Sistema de Análise de Fragmentos de DNA WAVE™ (Trsnsgenomic, Omaha, E.U.A.), que proporciona um procedimento de rastreio totaimente automático. Utiliza-se a mesma tecnologia para rastrear mutações heteropiásmicas no mtDNA de tumor da pele.

Utilizando a metodologia de "primers" costas com costas descrita no Exemplo 2, o padrão de mutações de tamanho de 80 DMA (isto é, duplicações em série) é rapidamente rastreado nos segmentos hipervariáveis da região não codificadora (NCR) .

Exemplo 4: Espectro de deleções da totalidade do genoma mitocondríal em MMSC humano e suas lesões precursoras

Danos de mtDNA em carcinomas de células escamosas (SCCs), Carcinomas de células basais (BCCs) e lesões precursoras putativas, como doença de Bowen e querateses actinicas (As), foram comparados com pele perilesionai adjacente recolhida de diferentes sítios corporais expostos ao so 1. Utilizou-se uma técnica de PCR de extensão longa (LX-PCR) (Ray et al „ 1398) para amplificar todo o genoma mitocondríal, com a finalidade de determinar todo o espectro de deleções de mtDNA. Foi observada a ocorrência de uma miríade de deleções específicas no genoma mitocondríal, Nem todas as deleções estarão correiacionadas com cancro de pele não-melanoma; no entanto, para um método de diagnóstico rigoroso, as deleções que estão associadas à doença devem ser conhecidas.

Extraí-se DNA utilizando um estojo comercial (Qiagen) de acordo com as recomendações do fabricante. A totalidade do genoma mitocondrial ê amplificada em duas reacções separadas utilizando o Expand TM Long Tempiate PCR System5** (Boehringer Manheim, Suiça). Os "primers" de PCR utilizados são os descritos por Kleinle et al. (1997), abrangendo as regiões seguintes da sequência de Cambridge (Andrews et al. 1999) : DIA (nucleótidos (nt) 336-363), DIB (nt 282-255), OLA (nt 5756-5781) e OLB (nt 5745-5781). Estes produtos grandes eliminam a amplificação de pseudogenes nucleares. As sequências dos "primers" são as seguintes: 81 CMF;: w $ m m* & oiiB; r $ $m m m; e

Oiáfí tmm-mn r QssASÁASccocíiáOAósiTm^so s1 seo íd m ? dibrí m-zm w M&tmmmmmmmòmmm $ seo m m: s

Efectuam-se amplificações em reacções de 50 microlitros contendo 16 pmoi de cada "priraer", 500 utnol de dNTPs, 10 x tampão de PCR com MgCl? 22,5 tnM e detergentes (estojo), 0,75 ç.L de enzima (3,5 x Hf unidades/mL) e 50-200 ng de DNA total. Uma reacção gera segmentos de 11 095 bp do genoma, ao passo que a outra origina comprimentos de 5 409 bp (por exemplo, Kleinle et ai, 1997). As condições de amplificação por PCR consistem numa fase de desnaturação a S3°C durante 1 minuto e 30 segundos, seguida de 10 ciclos de 93°C durante 30 segundos, 60°C durante 30 segundos e 68°C durante 12 minutos, seguido de mais 20 ciclos do mesmo perfil com mais 5 segundos adicionados ao tempo de alongamento em. cada ciclo. Há um ciclo final de 93°C durante 30 segundos, 60°C durante 30 segundos e um tempo de alongamento de 68°C durante 26 minutos. Para assegurar a reprodutibilidade, uma quantidade conhecida de DNA é separada num gel de agarose 1%, e incluem-se na análise somente amostras que têm pelo menos a mesma quantidade de DNA,

Nas amostras turnorais observa-se um número médio maior de deieçôes com exposição UV crescente, como mostrado na Tabela 2.

Tabela 2, Comparação do número médio de deleções observadas no LX-PCR de mtDNA entre pele normal e tumoral recolhida de

diferentes sítios corporais expostos a UV

Exposição a UV Kúmaro médio da deleções em epiderme normal adjacente ftámaro raádío da deleções ssn temor epidérmico Constante (n = 5) 1,0 3,6 Intermitente {n 2) 0 1,5 Protegida do sol (n - 2) 0 Γ) 82

Exemplo 5: Envelhecimento o mfcBííA

Utilizando comparações temporais de linhas maternas (isto é, bisneto até bisavós), toda a sequência de rntDNA extraído de um dado tecido é sequenoiada de modo rápido e rigoroso, para estabelecer definitivamente a disposição de pares de bases nucieotídicas para essa molécula especifica e possíveis alterações ao longo do tempo. Estas caracterizações são comparadas com o estado de saúde, indicadores de envelhecimento e entre linhas maternas especificas em populações maiores. Estas informações combinadas permitem fazer a distinção estatística crucial entre causas separadas que originam a mesma mutação/deleçâc e estabelecem que as sequências de rntDNA, utilizadas como biomarcadores, têm o índice requerido de especificidade e sensibilidade para estabelecer a sua validade. Adicionalmente, as proporções de deleções e mutações de pares de bases são comparadas, para fins de consistência, em vários tecidos através das 4 gerações maternas. Desenvolvimentos metodológicos recentes permitiram a detecção em amostras de sangue de deleções de pares de bases implicadas no envelhecimento (Bassam et al. 1991) e fizeram surgir a possibilidade de amostras de sangue poderem ser utilizadas para estudar rntDNA em vez de músculo-esquelético (Von Wurmb et al. 1998) . Depois de estabelecer a eficácia de empregar leucócitos em vez de tecido muscular como representativo de deleções e/ou mutações de rntDNA, o passo seguinte mede apenas rntDNA em leucócitos. As deleções/mutações de rntDNA são então determinadas corno previamente descrito. Músculo-esquelético ou leucócitos são obtidos de um paciente. Extrai-se DNA como apresentado no Exemplo 1. Utilizaram-se os "primers" seguintes: 83 ígsTi: {mMzm f seo íd no: í lit: :(1435-1411) 1’ TÁCTUCTêMTODáCOTO^AO 3! $£Õ ID NO: 10 01F:: S* OOTftóAGTATFSCTGÁTmôC 3' SEÔ ÍD NO: 11 01R: S* TG:TOOTCTTTOOAOTAOÂAAOO: 3' SEO !D NO: 12

Efectuaram-se amplificações em reacções de 50 microlitros contendo 2,0 gmoi de cada "primer", 250 umol de dNTPs, 10 x tampão de PCR (Tampão de Reacçáo Thermopol), albumina do soro bovino, 0,5 unidades de poliraerase Deep vent e 50-200

ng de DNA total. As condições de amplificação por PCR consistem numa fase de desnaturação a 95°C durante 5

minutos (inicio a quente), seguida de 30 ciclos de 91°C

durante 30 segundos, 60°C durante 60 segundos e 72°C durante 30 segundos, com uma extensão final a 72°C durante 10 minutos. Efectuou-se electroforese em gel num gel de agarose 2% a 125 Volts durante 60 minutos, corado com brometo de etídio e visualizado sob luz UV. Para assegurar reprodutíbílídade, uma quantidade conhecida de DNA foi separada num gel de agarose 2%, e incluíram-se na análise somente amostras que têm a mesma quantidade de DNA. de 4977 bp por PCR com 3 "primers"

Quando apropriado, determina-se a incidência da deleção comum de um modo quantitativo por um método de PCR com 3 "primers", que detecta níveis superiores a 1-5%, ou um método de PCR com diluições, que detecta níveis menores do que 1% até 10”"% (ver Exemplo 7), Obtêm-se amostras e extrai-se DNA como descrito no Exemplo 1. Para detectar e quantificar simultaneamente as razões de mtDNAs deletados e de tipo selvagem (ts) nas amostras de DNA utiliza-se um procedimento de PCR com 3 "primers" (como descrito em Birch-Machin et ai. 1998). Os "primers" A e C correspondem às posições de filamentos pesados 13720-13705 e 9028-9008, 84 respectiví amente (A nderson et ai., 1981); o "primer" corresponc ie às pos ições de f iiamentos leves 8273-8289, "primer” C mapeia p 3. Γ 3. uma região de mtBNA na deleç comum, ao passo que a os "prime: rs" A e B flanqueiam a regi deietada, Em conseq [uencia, os "primers" B e C só amplific ts-mtDNAs, e os "primers" A e B só amplificam mtDNAs detetados (a distância entre os dois '"primers" na ausência da deteção, aproximadamente 5,5 kb, έ demasiado ionga para ser amplificada nas nossas condições de PCR, como descrito abaixo).

A ut.íl.í zacão de três ”pr. imers" j aemitiu a detecção simultân ea de G U GS 0 3. Π d 3 8 ? 3. maior (7 55 bp) corre espondente ao ts-mi :.DNA. e i a menor (470 bp) correspondent e a mtDdA detetado alber gando a "deleçâo comum". A. mistura da reacçâo de PCR (vol.um .e total de 25 y.L) con tinha 100 ng de DNA celular total, dNTPs 200 μΜ, Tr i.s-HC.1 10 mM (pfí 8,8), KC1 50 raM, MgCi.2 1,5 mM, Tritoi X--100 0,1%, 2,5 [J de; DNA polímerase Taq (BioTaq, BiolineUK Limited, Londres), 25 pmoles de "primers” A e B, 6,25 pmoles de "primer" C e 3 p.Ci de [a-"2Pj -dATP, As condições de PCB. foram 25 ciclos de 94°C a 1 minuto, 55°C a 1 minuto, 72°C a 2 minutos, incluindo uma extensão final de 15 minutos a 72°C. Estes

produtos 5 de PCR foram, depc is submeto dos a e lectr oforese num gel de ] ooliacrilamida não desnaturante 6%, e os fragmentos de PCR radioactivos fora im quantificados por análise de f os.for in tagem utilizando o "software" ImageQ uantTÍ< (M.O A. Θ CU J. 3 U

Dynamics, Chesham R.U.).

Exemplo 7; Método de PCR cqh diluições em série para detecfcar guantitâtivamente níveis baixos (< 1%) da deleçâo comum de mtDMA 85

Utiliza-se um método de PCR semi-quantitativo (Corral-Debrinski et ai. 1991) para estimar a proporção da deleçâo comum no mtDNA total extraído das amostras de tecidos/ células. Obtêm-se amostras biológicas e extrai-se DNA como descrito no Exemplo 1. A amostra de DNA é inicialmente linearizada utilizando a enzima de restrição Bam Hl (1 uL 85 ondicõ es reaccron as seg de ens íima e é 1 iL de t ;ampão forn ecido comercia) Imente) a 3 dur ant ;e 30 mi .nu tos. Realizam- -se diluições em série Oiti. pciS sos de duas ve ;zes (para mtDl IA total fez-sí 5 uma dilui çâo rnr Cie 1 de 10 ve: 7es) e PCR e s ifectuada para cada dilui ção (1 1-dl) util ÍZ3T ido os "primers” seguintes: if r> ÍxlK ' 7' 5’ 3 .Γ cl mt DNÂ total : A ] 08 (n t 3 .10 8 k '} 21) H37 17 (n t 3 717- -37 Q1 ) if r> j.xiK ;r,s " p 3. Γ cl cl ,υθ 1 ·: ição Comum L82 8 2! {n t 8 282 83 n e \ w ·.· /

Hl3851 (nt 13851-13832)

Um ciclo 94°C dura nte 2 minutos, 34 ciclos de 99 95 segundos, 51/C durante 30 segundt as (mtDNA to durante 30 segundo s (deteção comum)f 72°C durant e um ciclo final de 72°c durante 8 minutos. 1 durante i 1), b 6 0 C 1 minuto ryi ... ,-J — ^

.1. O '·.·> CÍ iD ci O submetida a autoclavagem e esterilizada |"pç ^ o Óórt c 5 de PCR são rea lizadas DNA de amostra 1 μ.Ρ, "primer reverso 0,6 μΜ, dNTP's 0,2 mM, GeneAmpe D ÍPerkir; Elmer) , 0,2 μΐ, (Perkí n Elmer), 35/75 μ.Ρ de a mistura seguinte (50 pL): directo 0,6 μΜ, "prímer" 5 μΐ.ι de 10 x tampão de PCR de DNA poliraerase Amplítaq© água duplamente destilada 86

Após a electroforese, os produtos de PCR são visualizados num transiluminador UV (TMW-2Q, Flowgen Ltd., Lichfield, R.U.) e uma imagem digitai do gei é obtida utilizando um aparato de aquisição de imagens (Alpha Imager 2000, Alpha Innotech Corporation, fornecido peia Flowgen Ltd,,

Lichfield, R.U.}. O "software" associado de análise de imagens (Alpha Ease versão 3.3, Alpha Innotech Corp.) permite calcular a densidade óptrca integrada (ICD) para cada produto de PCR numa série de diluições. A banda em que é obtido um valor de 101) zero para mtDNA total e mtDNA deletado, e os valores de diluição cor respondentes são utilizados para calcular a percentagem da deleção comum na amo s u r a., a s s i m : faetor de diluição de mtDNA total(I0B Zsxc> x 100 factor de diluição da deleção comum11011 2ero/

Cromatoarafia líquida de alfeo desempenho

Obtêm-se amostras e exnrai-se DNA como no Exemplo 1. PCR em 13 fragmentos sobrepostos utilizando duas condições de PCR diferentes como descrito por van den Bosch et al. (2000) . Os seguintes três pares de "primers" específicos para mtDNA para PCR:

Sequência Olígo

ÍS11SF mmn Mmmf

mmm fct14S87R SÊQfD MO; 13 rBAGSÃSTÃSSAOtâl TQS SfcQ lONO; 14 CC€áTC€TOTÂOMITMTTCC SEQ 0 W. i Li momimmm sa 10 nó;: i§ CCCAT^CCTCâ^ATACTC^TC I1QID NO: 1? seq id no: ib 87 87 Os produtos de PCR de 1-2 kb são digeridos em fraçment .os de 90' “60 0 bp 1 e são resolvi dos à sua temperatura de fusão óp cima, As mutações são representadas na forma de dois picos, e mutações com baixas percentagens, como ; um "orn brc 3" r •H Q-i q 30 fase m .CVí el ’ que c ;ons: iste em do is tampão A contf ám acetato interag e ( ;om os g: rapo s fosf ato de como c( jm. a s :uper j :.í ci e da c :o.lun 3. e com 25 '6 do agen Τ' íti desnat urante >3 e.liilr 3. ]TL con 3 um. ; çrad lente l.íne 3. .TI :a de fl .ux O onsta .nte , Au me i ί 13 Y- a tio irá de : S Γ: 3. tarai : os fragmento s „ ϊ xem.pl o de un: i mét O Cb O padrâ' o pa ra heteroplasmia, na forma de um (· PC R g r< e \ pi C. : V-· O / j\Ac\ -h /-·. do .. DHPLC de uma reacção de PCR gerada utilizando o "software' WAVEMAKER (Transgenomics) de acordo com as instruções do fabricante.

bela. o; Método Padrão para DHPLC

Pam>o Tempo %A (tarrçpão) %B ('Lonprio) ML/iriinuto (taxa de. fluxo) C α r 9 d 0,0 52 4δ 0,90 Iniciar Gradiente 0,1 47 5 3 Parar Gradiente r, q “ f 39 61 Iniciar Limpeza 4,2 0 r» r» Parar Liupeza. Λ 'l 0 '! Γ> 9 I n i c i a r E q a 111 b r a ç ã o Λ 9 -3 ; O 52 4S Parar Equilibração 6,8 52 4 8 da Tabela

As temperaturas para resolução com êxito dos vários het erodupl exe s estão pormenorizadas abaixo e podem, ser simplesmente substituídas nos sítios relevantes 88

Fragmento Temperatura de fusão Mt.3118F 59

Mt8207F 58

Mtl4427F 56 Í°C; Gradiente de % Tampão 3 51-59 50-58 60 -68

Exemplo 9

Uma pesquisa extensa de sequências em laços D de mtDNA de 49 pacientes de biopsia prostática com agulha (46 diagnosticados cora malignidade) deraonstrou mutações de mtDNA. em todos os tecidos prostáticos, inclusive hiperplasia prostática benigna ÍBPH), graus de Gleason disponíveis e estroma, em comparação com o DNA mitocondrial do sangue dos pacientes. Além disso, um estudo expandido de genomas mitocondriais de 31 pacientes com prcstatectomia demonstra cargas de hipermutações equívocas (Chen et al. 2002; Chen et al, 2003) em glândulas malignas correspondentes, glândulas benignas adjacentes (perto das glândulas malignas) e glândulas benignas discais (localizadas em tecido sem patologia maligna removido de qualquer patologia maligna), como mostrado na Tabela 4. As mutações da Tabela 4 também estão apresentadas na SEQ ID NO: 102, que lista as substituições, SEQ ID NOs: 103 acé 109, que listam as deleções, e SEQ ID NOs: 110 até 138, que listam as inserções. Polimorfismos e posições de mutações foram determinados por comparação com a Sequência de Referência de Carabridge Revista (2001), mas a numeração histológica foi mantida, de modo que a deleçãe na posição 310 6 é designada de hiato e o polimorfismo raro 750A foi retido, A numeração das bases baseia-se na Sequência de Referência de Carabridge Revista, com um total de 16569 posições de bases. Apresenta-se na Figura 1 um histograma que mostra o número de mutações por localização do genoma 89 mitoconclríal, Como pode observar-se na Figura 1, encontraram-se mutações em todo o genoma de mtDNA e em todas as próstatas doentes. No entanto, certas "regiões cruciais'" também foram claras, por exemplo, na região do laço D e na região 16s, Estes conjuntos de dados implicam que a designação de tecido maligno ou benigno, atnbuida por um patologista qualificado utilizando métodos histológicos e padrões de graus de rotina, não identifica progressão de doença precoce, Isto sugere fortemente que a transformação maligna começa ao nivel celular antes da alteração das características morfológicas de uma célula. É importante notar que os padrões de mutações são completamente inconsistentes para tecido prostático correspondente de um paciente individual, ou em comparação com outro paciente, talvez indicando possíveis sítios tecíduaís onde pode ocorrer expansão clonal de células malignas. Alem disso, biopsias com agulha separadas com o mesmo grau de Gleason do mesmo indivíduo quase sempre exibem, padrões alternativos de mutações de mtDNA. Isto indica que a carga mutacional total, em vez de sítios específicos de mutações, pode ser maís representativa da doença e progressão da doença.

Uma vez que estes dados foram reunidos de indivíduos com canoro da próstata conhecido e no grupo de prostatectomia com estágio avançado conhecido, é provável que tecido histologicamente benigno tenha sofrido alguma(s) transformação(transformações) intracelular(es) associada ís) a neoplasia e possível progressão para malignidade. Tecido benigno albergando mutações de mtDNA serve de "biossensor", que pode ser monitorizado quanto a mutações crescentes indicadoras da velocidade de progressão da doença. Esta velocidade também pode indicar agressão tumoral. Além 90 90 também pode ser deste padrão especifica alterações disso, a eficácia de uma terapia monitorizada com base nas mutacional.

Esta técnica pode ser utilizada como teste de confirmação para biopsias com agulha benignas. Actualmente, quando um paciente é submetido a uma biopsia com agulha efectuada na próstata e o tecido aparenta ser histclcgicamente benigno, é enviado para casa e normalmente é caiendarízado para biopsias com agulha de seguimento em seis meses, A utilização do método acima permite examinar o tecido da biopsia com agulha já recolhido e confirmar que o tecido é benigno também ao nível molecular ou então encontrar evidências de que há, de facto, uma malignidade na próstata que geograficamente passou despercebida pela técnica de biopsia com agulha, ou então que o tecido é pré-neoplásticc ou neoplástico ao nível molecular. Potenciaimente, isto pode evitar que muitas pessoas sejam submetidas a múltiplas cirurgias ou pode permitir o tratamento preventivo precoce.

Mutações de Bases: Mutações observadas de lujmoplásmica em homoplàsifâca, hoinoplásmica em heteraplásmlca e heteroplasmca em horaplasmica

Numeração Histórica de BP++ BP (jue eliminam Mato posicionai mim li i Km·· i M«-to | H» Nem» Numeração Histórica de BP** BP (£ue eliminam Mato posicionai em 3106 i | ÍA*HM ! I Ί . 1 1 Mmtbm 10 15 T-C j m 208 m A-8 m .............................j ..............................! 35 31 \ C-OT 234 204 τ·ς m | j ..........................li.......................... m ! 1.............................1 41 41 CT 1 C-CJ 285 295 MB | | SS ss " 1 207 20? A-A/& | 57 si AT li ..........................i.......................... m 1 ’ 1............................^............................. 01 61 | &c/r 200 206 m I í 64 34 CT I 2:4 214 m 1 i: 11 72 C-T | CC/T | Si? 217 CT 1 t-c | m m 12 CT ! ra 73 mi \ m m 225 AG m | «»1 IU m \ ..........................:.......................... : W m CT W j ' m I m» \ m m ATI Im ) _í_ m 54 \ m i mk m 11)4 \ vvT i 21 m <3-7 m 113 | m 254 m m s i i m 113 | j m m j .............................i m SÀ CT ! -:............................ ! m \ \ m 143 ct | m | 833 m u ! ! τ-c | *-s 247 247 m | i m ÍS CT | CvT | 348 246 SEU ·: T-C | 7T& 1 882 m CGíT

Mações de Bases: Mações observadas de homufllásmica en homoplósmica, homoplásmica en heteroplásmica e heteroplásmica en lumuplásmica

Numeração Histórica de BP** BP tjue eli-; minai hiatd posicionai j em 3101! \ Hw»- jtaft \ | HoiTfí | mm to- Numeração Histórica de BP** __ minam hiato posicionai em 3106 — tefM-Nfifftô > : | ld VAtiuti. liLÚ^iMA 1 | | Ntòtev-itofffi | 152 c<t \ C<Cíí m 263 m | p ......................... m j m ...>.......................... A-G m \ \ m m j ·: .κι 1 m \ m 204 K \ \ i .........................L„ u | G-GíA m ffl m \ \ m m | I wt m m C-C" | m m C·? ! ccrr .......................... m m TC j m w | u ! » w $7 to m j | .........................1.........................!.......™........ 50:,· m,· INSS ............................1.............................! | | m 303,2 mp IfcSC .......................................................1 m is i A-S \ m 305 s | ·: U \ mh \ m 338 m | m 188 | A"C | A-AíG c-cíít I ! | O-A j G-GÍÃ í m 303 DEL € ............................|.............................! m m \ _u K Ϊ ____Λ,__________________________ mj. mc ; i m m | T-Ç | m mj. w$ j ! j.........st.........i.......................... Μβί ms 1 | m is | C-T \ C-fi/T 310 m DEL C m \ m j :.......................................... .........................í..........................\................. rja.T .........κ........i............................] m M T-C ! tri 311 I cot í i m m | | dc/f 311,1 311,1 ! IN8C ...........................1.............................1 m m \ .........................L.. | m ...j.......................... 312 312 | wt I 1 ............................!..............................! \ ! m _í_S_ S1S 313 | m \ i 93 (Continuação)

Mutações de Bases: Mutações observadas de hamoplásmica em Immpplásmica, hanoplásiáca em heteroplásmica e heteroplásmica em homoplásmica

Mumeração Histórica de BP** BP (fie eliminam Mato posicionai em 3106 ta' ta H®ux> ta Heta* Noríto Numeração Histórica i de BP** ! BP φΐβ eliminam Mato pnsirinnal em 3106 ta-ta KfiM-mro i ta-ta !· m m — mk i \ Μ, 315,1 r | 1 1719 9719 m \ 1 m-k W 3«; !' mi 1781 | m-k m 333 | m 17« 17Ê6 | CíT-T m li CT | c-ct I 13]] m Ú QM | m m g-t \ __________________________L__________________________ m | mk m m j W/í i m ...........................i............ ........... m | m | 41S,: 41 SM mm \ i i m m U (1-¾ | j tm 418 m m ; ________________________J____________ I «.A m m ................... [.......................... m m 1 CK-C 1 1 ™ m m | m \ m tc l ..........................s.......................... •m·. 2288,1 INSA ffl m ) 1¾ m m \ mr m m | m LL\? m | wc m ffl CT j 1 i,H ...........................i m ! m* \ m m ,«T í .........r..........! c-a zv m k : m m cr j m m\ oe/r ! m m kJlJ j O-CT m ........................ 1 m m ffl TC I 7« m ffl ; m \ m m .AG | m. 2352 CTí Ϊ | sot m | m : m UtO i sôs m | cot | 2SS m I ^ 1 94 (continuação)

Mutações de Bases: Mutações observadas de hnmQplásmica em homnplásmica, homplasmca em Merojjlásmica e heteroplasuáca em homoplásmica

Numeração Histórica de BP** BP pe eliminam Mato posicionai em 3106 tem- ; Híw·· •iwrfv » MvKPv te» | Hftera Hieto- Hemo ÕPpeeli- ^ j minam Mato Histórica i . . . : posicionai "" ! em 3106 tenoto NtMfaw 508 505 CíK ...........................!........................... 23B3 i 22S2 C/TC m m u \ m \ m mk m Vii Mi j \ r&! \ m? | &$k m §13 ilU j m 3557 | o-T 514,1 mtí MO j | Μ 1 2333 G-QT SiS m 1 m ! 2® | m C-wí ..........5':S.......... .........315......... m.À \ m m A-S m 6!5,1 515,1 mu \ m C-T SÍ7 617 ΠίΓ" m 2857 C-OT 823 m 1 m /.η·.·.·.·.·,.·.·.·.·.·.·.·.·.·.·.·.·.·.·.·.·.·.:.·.·.·.·.·.·.·.·.·.·.·.·.·.·.·.·.·.·.·.·.·.·.·.·.·.· 3333 m C-GT .............................i ! 623 m DELA j m mi frT | 523,1 523,5 MC 2843 2S48 ΰ·τ : m m. i m \ ..........................;.......................... m 1 2232 GfT-T 523,3 MC j <&* j m á-Q m 323,4 Wk \ \ \ s;s m A-G ; km m | m M/A m m m \ m m AG-G $7,1 m 1 m$ \ m \ 2040 .« mti | m \ | M j 3040 C/i'C m,2 | MC ! I 700 St 1 3303 | W! m | j mk \ m 333? m 95 (continuação)

Kutações de Bases: Mações observadas de lurnuplásiiiica em homopláanica, lumuplásmica em heteroplásmica e heteroplásmica em homoplasmica Numeração Histórica de BP++ BP pe eli-j j minam hiato ; posicionai | Hw»· j N» ΐ iJ' »V|Vf| M ' em3106 | ™ I ..... (J AM. JU πνΠΊν Histórica de BP** BP pe eliminam hiato posicionai .emJlM.......... Hwne-Hemô Hôítío-Ttsícfo Η .A. o. ... y m m | j m 33® m tm 857 «57 1 G-G \ M m C-T m m | j mk m mi T-C m ™ | | c-or 1 M,í m,’ mi w m | m m m g-A | ............................:............................ m 1431 | | « m m m m m | c-t m m W ! ............................ m | m m 3533 I C-CíT m 1713 1 I _________________________i_________________________i__________________________ A-C-G m m I c-C7r mi m c-t | m m i c-ς/τ m m u li _!_ i mi ........................ :............................ « C-T j : m mi | m m i &sr 5093 3® m. ! S8§? ...................... i.......................... m ! C-&T ............................i............................ m, i ma mi ! _i_ i m m ag \ m m mi C-T j \ m 3034 \ m 3033 m 1 COT \ » m c-t | M m C-T . ! m ...........................;............................ m ! c-cít ...........................;............................ m m Ç-T 1 m m | Mi.fi fyV. ν' m 4313 ot | m m G-Gí m 41 u \ «S41 6040 m m m t-c j m m 6043 ..........H.......... :........................... mi 4Í16 \ m m m 8 g-c/í 96 (continuação)

Mações de Bases: Mações observadas de hamoplágmica em lumtylásmica, homoplasmica em Jieteroplásnica e heteroplásiáca em lunoplásmica

Uma;» Histórica de BP** SP çue eli-áitM Mate posicionai em SIDA taro·· taro Honro··· Mm mn-H ma Numeração Histórica de BP** __ minam Mato pnai ritmai em 3106 tòfflfrfeffti tafrtòte6 nfiwíírfivjliw m m .........£.........|.......................... 8147 8148 C-T m 441? | m fêie O-ÇíT m m ot | m m m m m | m m 8223 m m m \ h-m \ m : m _i m I_ m\ 410 | to ; « m C-C;T m m C"T j m M ! m 4®4 | m j 6S4S m I Cv7 m 4702 \ m ..................................................... m m ô-CíT m 4715 j m mi m O-OT m 4721 | m m U 4733 4732 j c-e/r 8643 « TO 471 m j m iM? 6888 OCíT 478? 4788 MA m S6SS T£ 4ffi 48$ } I 0ΌΤ m 810 G-Â 4664 I c-ot m& m GT CO.íT 411 ! m ............................i \............................ ..........£...........i !.................. .........48Í7......... 4816 m m m 881 TO | j 112 111 I sa m m \ m ! 6317,1 6318,1 mi \ m m | m .....!......... m m m | MA | m m m

Mutações de Bases: Mutações observadas de homoplósmica em lumoplásmica, homoplásmica em heteroplásmica e heteruplásiáca em lumuplásmicd

Numeração Histórica de BP** 3P pe eii-j minam Mato posicionai pfi smfi i HwW’ Mm | Home-j Nrirn Hutera» Hemo Numeraçao Histórica de BP** j BP pe eii-i minam hiato; posicionai ; i em 3106 ! Hm4Íom \ \ i NáewHm» Mí 51131 | m m 7f)DB ! W j ...........................i 5147 SM ! .........................[... u 1.......m....... im i 701.5 ; :...........................i m \ ............................! ! | m 7\3 W e-7 GCíT i : 5174 m 1 .........................L j m j 1 ...........................L...........................1........................... T-E m mi \ | g m ,.,.ψ......................... 7055 7Õ54 j h-m j m 5-:1-: \ | oc/t 551! MS I | | m m Γ | c^r 7145 ! m | ........m.........|............................| m :SSÍ! | j C-DT ms i m i 4...........................L f i ........77:........1...........................1 sarc 5I37D i | cot 7154 : ....... ! i iM ; u GGí \ j 5424 5428 | 1 C-C/T ....'l.......................... 7858 i 7255 ! CG-T :............................i 544:;; ” 1 j c-or TM t ;;;;;;t i 1 m \ : 1 m S455 j | m 7555 i TM | m 1 j ........................................................; m ................l j m 7408,1 ........................... i 74«,1 | mo \ 1 ...........................jl............................! m | I m M? i Mis ! J_L K ™ 1 ! S6SQ 5648 1 1 G-GA 7412 L-u ________________________ » | | TM 74?« i ?*?$ Tg i 1 m m \ a-g 1 Α-ΑΛ3 7S21 ÍS2D i mk j \ m ??55 l | G-OT 1« i m m\ \ m m | _________________________;,m 1 WA 1« 1ÔS44 ! ^___________________________ ™ 1 í-ííG ; ; 1* [ m mi j u 1 m „j__________________________ 15555 I 15354 I ca ; ; m 7514 1 | C-GT m | 10433 ! ............................}.. m \ \ Mí ?ÍÉ \ 1 Cí/í m | m j .........gg.......j_1

Mações de Bases: Mações observadas de horaplásmica m lumpplásmica, horajplásmica em heteroplásmica e heteroplasmca en horroplasmca Numeração Histórica de BP+* IP pe elii minam hiato posicionai I mm" m 311( ! "" Hoiw- Mm mm- LU. IMA NOmv Numeração Histórica de BP** BP pe eliminam Mato posicionai em 3106 i Hofflo^Hcmo i | ! 1 N«w4tete | Hflfero4tm i :j m | íM | ím * TC T® | mi TO | U | m m \ : i ' tm \m 10548 | 8Γ7 6116 I ii m ..........................j..........................A.......................... 10879 15078 [ $4 m 6182 | | o-gt 1W 15684 j $ m m \ j m ..........................i..........................I.......................... 1í« 1683? | &3A m m j o-r | <$t 10754 m | a-ç mt\ 8«:,i m j iam 108» j K ............................i............................J FITO í........................ I 8« »87 | c«t 1CB1S ! 15878 í _j_i_ ΘΦΑ | MM 1........................... Wlfi | m i«?s | í« ] ώτ i ffi4 \ m ----------------------------1 1 κ í-i'C ! 8697 :........................... m u | fra/A M •5881 \ Ô-T _;_ «780 | m 108» i m í c-r m 971? Αΰ | m 10943 | c^r »17 1 ** m 10055 | X-C/í tm »82 at | vm mn | u m m 1 m 169/4 | m j .............................I.............................. m§ m r 0977 m 1 m m \........................... S4M m m | u .............................i.............................. i m fISi I M ..........................>,.......................... «5 i........................... 963b i OT | ......................................................... m íK'.: h-m m m j g-t c-cít 1 ......................................................... 93' s »12 ! ..........................í........................... m ris 37! 5 | CT | .............................k..............................

Mutações de Bases: Mutações observadas de homoplásmica em Immplásiiãca^ hnrnplásmica em heteroplásmica e heteroplásmica em homoplásmica

Numeração Histórica de BP** uuuuuuuaaaaaaaaaaa. 3P pe eli-Énam hiato posicionai em 3106 ·Λ·Λ·Λ^Λ^Λ^Λ^Λ·Λ·Λ·Λ·Λ·Λ·ΛΙ,·Λ·Λ·Λ·Λ·Λ·Λ·Λ·Λ^Λ^Λ^Λ^Λ^Λ \ Hw»' | N» Hoffie ;l ΗΛΰ ffetew- Ηβη» Numeração Histórica de BP** BP pe eli-i minam hiato! posicionai j em 3106 ! ,UUUUUUUUUUAAAAAAAA.· H»4teit!to ^LÍÍÍÍÍÍÍÍÍÍÍÍÍÍÍÍÍÍÍ>L>L>L>L>L>L>L>Llj Hetefo^Nomo | kM m m ! ct 1____________________________ | m «836 ] m 9778 977? j mk ! m 8881 m 139 9S0& CvT m m m 151¾ 10142 A-G m m m » ! ;............................: S-OíA 8418 GO/! i m 10344. ! 1___________________________i : T-T7G :........................... í S445 9444 .......................... s$-WA .......................... 10385 13354 | ............................:............................: í 0-&T m u i Mk 1S43& 19436 i w m ®1 G-À ;j 19455 10484. 6‘ôíA i m « m m 184$ TO 7T£ .............................i ,...........................j m 984? | i 9554 8553 j G-GíA 1 m 10549 úsâ w m ! C-CíT .................£......................... m 18878 u m m | mk « 18634 m m m | OT 1«®# 10667 m m m | Ô-Ô/C m 18753 AO m m I S4â?A ΊΰδΊό 18809 K m m m ®* 1 15313 10818 \ m m | corr m 18572 ϋ·θίΐ \.........E......... m ót i ; m !.......................... K m m c-r !.......................... m 10831 c-7 m CT | 1 m 10» CT 1 100 :ontin;jação)

Mações de Bases: Mações observadas de hflmoplásmica em horaplasMca, hflmoplàsmica em heteroplásmica i 1 heteroplasmica em homoplasmica Numeração Histórica SP pe eli-j ninam hiatof I .-,.1-, H m- Hetaro· Numeração Histórica j BP pe eliminam hiato de BP** posicionail posicionai em 3106 \ Hííffle Mm Mm de BP** «3106 tae-ltoi Μ.\λν>ν.\ CI^va.v n™íO*™M 977B m | — 13344 13943 C-CT m i G-T ......................i 1« | 13955 x-or Ϊ0143 \m \ í aá; vm 13971 Cr A « j 0 -ar 1 m 13397 m « \m | ! í A-Ai 1243- 13430 G-GT um m ! m j 13435 m irn 1151? | ......................τΐ m mi 13457 m m m | \ _______________________j m 134?« 134/5 m I j c-crr 13454 13483 i'-TG m m | \ m 13497 m G-CíT ím 1« | m « 13S0S GGT nm 11112 j t-c | m 13530 ............................ 13529 C-&T mjj | ·! ......................\ m « ! m : oer 111/3 \ .......................5 m- 1» 15562 m .......................... 11134 | \ mh 13573 13573 C-CfT mi 1121« l í \ cc/r 135/3 13573 U ÍÍ2SÍ 1« | .......................... « | m 136® : 1SS0S i...........7................ GÕT ......................... m \ mh | /Ti im 11232 | ·! ct I m 1381/ :36i6 C-T C-&T 11331 | m | U m mt 1lS f .......................; ím 15659 m/a Ϊ35: 11350 | !Síí | 13643 C-CíT

Mações de Bases: Mações observadas de homoplásiáca em hamoplásinica, homoplásiáca em heteroplásiáca e heteroplásmica et luMplásnica

Numeração Histórica de BP** BP que eli-j j Énam hiatoí j posicionai í \ rnm \ 1 ^ 11 Numeração Histórica de BP** BP que eliminam hiato posicionai em 3106 i i H «Morna! m íib | | m S321 13620 ---------------, wc 11377 um | | m 13831 Í363Q m vM ii4i» ; IMS? 1SB30 Mk m iim | 0-T m 13637 m m 1171» u 0-0/A m 136S0 m 11 »11 A4 m •m í®4 m ........m m m m 13P C-T i í Wk M cac -1 i wm 11B _Li" 15686 \m m -1 j m 1Ί$83 | C-T | v-CTT m m m m ii® | | C4/r m m m i 1:907 lis» | | m } m 13707 kM m* 11Í1S j | mk m mz 12011 ! ! CC/T :M11 1S?Í0 S4/A ............................j m «12 j 1 m-k m i»m c-ai' m » j í S-GíA _í_;_ m m C-wf ! m m] \ ! mi .........................Λ.................................................. m m m i 1 § m 13738 C£TT .............................j .............................1 m 1881 i í T'T/A ___I_i_ m 1S742 m i nm 12S2S I C-T | •m 13747 m -j i •íggss 1B? A-f, | A-.C 13JB8 i 12® : .........................1.......................... km ! 102 (continuação)

Mações de Bases: Mações observadas de hflmoplásmica em homoplásmica, homoplásmica em heteroplásiáca e heteroplásmica em horaplasnica

Numeração Histórica de BP** 3P pe eli-inam hiato rnsirinnal ΐπι 3106 Hw»- Hamo li 11 Numeração Histórica de BP** BP pe eliminam hiato pnsirinnal em 3106 JTUiHuv[]vf{KJ Í í 1 ! | I NofflfrHateBi *' ' j: ; \m 13768 1376$ C.C7: | I m j C-OT 1371 !tt7 C-wT I mm mn ffi-A wm 13788 t-t/c | ot \m u \ 13805 m c-ííT | ___________________________A____________________________ um 13104 } km 13041 13M τ-Ttô | mn isriís K \ 1310 m m \ 13211 \ 0-ΟΪ 13888 um X-T m | 1» 1 tw 13811 um .........s:«.....1 '.m 13833 \ Km _____________ 15932 Km i 1_l____________________________ í m \m | mk ! 1« ...........................;........................... 14084 wr | n m 1» u ! 3 4ÍÂ : 14544 14043 | A4â j km 1411 :4134 m | m 1411 1 g m .................... I 1586» 18888 m | mi 14136 | Vht | mu 15903 K m \ | ·: um 14177 \ 7-T/G ! i i G-AíG !: i m 14161 TG 1 m | m 15906 ÔG/A 1 | < ' m 1¾ j m \ m \m m jj m US1$ n | m \ 1 m 1S27 KG m ; um 14332 m ' AM': ; rt*rV« ; u <mi 1« u j UG 158BB 15897 r/í-Â j m w®,\ my mi um m \ SííA m mi ft ftià ; UTMÍn 103 (continuação)

Mações de Bases: Mações observadas de homplásiáca em homoplasmica, hamplásiáca em heteraplásmica e heteroplasmica em hfmuplásinica

Hneração Histórica de BP** SP pe eliminam Mato [insiriniial em 3106 V \^m- itano li If Huraeração Histórica de BP** BP pe eliminam Mato [insirimtal em 3106 Uiiik.V Í].v«Ui ΓΜί1ϋΑηθ™ NuuwnKwív | Mmhkm \ i m .........“......... ΪΜ 18551 13350 hm ............................1 m 14517 | Q-CVÂ C&A íSW 1» | ca isi íKfê ça 15114 \ m 18087 180Θ8 ca ............................j m 15181 \ m .........................i...................... m 18036 m 1521? ca m 16302 K m m 1$$ í m .........................i......................... Ç-7 m ............................Ί m 1Í4 j ca ira íSÒ4 C-T ca m& 15285 í ca __________________________;_________________________ 15111 16110 m -, j m\ ira \ m 181¾ 18125 T-C T-T;Q m 15301 ......................... \ ca t.........................$.......................... 0'CíT | Ϊ5307 ira \ ca 16¾¾ :6128 í1'A ca m m 1 1 i_; 1 m 18134 16133 ca ! ;; ca 16148 1614? ca má 15333 | ca 13153 18152 A-fVG ! m 15343 | xi m 15153 16181! ca m m \.........“.......... ik mn W\ ca \m 15370 m 13134 16133 C-" ca i ÍS384 ira _ X-G m T-C -j tra 15426 ! hm 13186 18185 j m m 15451 .........................! 1.........«......... C-CíA 18153 16188 T-C m ! i « hm α ca | 104 icontinuacao,

Mações de Bases: Mações observadas de Implasmica en Immoplásmica, homofllásmica em heteroplmca e heteroplàsulca em homoplásmica

Numeração Histórica de BP++ ÍP pe eli-lin.am Mato posicionai emílflfi M9· tom Momo- tj V(L .1 L' \ M&bAJlítí rntm- í^,,, v Mwmtí Numeração Histórica deBP** BP pe eli-ninam Mato posicionai em 3106 !............................ ίΑ.ΧύίΛΧ. í jiiaí iVbWi nUíWnSSM 15S23 m m 181Ô0 161SS K ÍS5SS 15® MA 16191 m issíb 1½¾ m | κ 'MIC m | ! v v.t m ™ | MT 1565'/ .......i m \ %-m \ ............................ | m 'm \ ( | m 1SÍS3 \m \_ rm | 1S807 15806 k m ! C-T .............................] u 1 í.......................... m m ...... [..... C-T C-CíT :5δ70 »3 I c-cn L_________________________í__________________________ j \ im m m. \ i frT 1 C“0íT m m r C-T m i m \.........................: I ! c«c/r t.......................... 'm 15234 | a m isra wm I | C-CíA 18238 16238 r í..... ÊT MT 15708 m? i 1 MT i X-C :· mi m\ | 1.........................; í í : i Mk 1ΜΪ | ΰ'ΰ/Α irn 15511 | I |.........................j \ m m 16355 j T-T/Ç ; \mt\ \ i m :.......................... | ; ............................i............................ i___________________________ C-CíT \m \ \ i____________________1 | m 18270 » ! C-T MT mo 15864 j 1 | a-a® β 16391 | C-QT m TÍTI “ J \ G'SG i.......................... m 15293 | i_ C-T c-c/r I I Á«Afâ m 16BSS \ \..... m mo w ; Cliili ! ttjc 1......................... 15544 m i m | | m I ----------------------------1---------------------------- _s_ (continuação)

Mações de Bases: Mações observadas de lurnuplasmica em lumuplásmica, homoplásnica em heteroplásmica e heteroplásmica em hmNplásmica Nureração Histórica de BP** P que eli-ninam Mato posicionai em 3106 II 11 i I Humeraçao i Histórica Hm | de BP** BP que eli-i * i itiraMata posicionai i em 3106 ^ te^emo j 1 | HítoúCtoitio 1S27S mi u | ...........................+........................... i ............................i............................i............................i _[__]_ m i m 1 m km \ j i m 1« | cm \ ...........................1...........................:............................ í ! 1 m j i m, ; | c-c/r > | ---------------------------^---------------------------i í ifâi ! _________________________\ \ \ m | j wm 1 m : ( WG j m m : | mc : \ | | i ! \ ct i cm l ϊ : ____________________________i___________________________1____________________________ m m- ! cm ..........................Λ......................... ............................!--------------------------- ! j m i® ct | cm \ | • ...........................r........................... j \ m ; | » m | \ ct | cm j ! .......... \m 16332 : 1 m j«Λ 18304 18333 : ; ; | t-t/c ; m ! cm' ! ----------------------------f i j ! 163"!!: 16313 ct | c-c/r ! i t-c 1 mc 18319 18318 i u | cm } ...........................:............................ j 1 ™ 1 ____________________________i,____________________________ i | m .........................s..........................\.......................... j ............................L........................... ! tm IfôtS j \ vm ;_L·__ I ; 106 (continuação)

Mações de Bases: Mações observadas de hflmoplásmica em hflmoplásmica, hflmoplásmica em heteroplásmica e heteroplásmica em homoplásiáca taração Histórica de BP** BP (jue eliminam hiato posicionai em 3106 li» Honro Home* Mm Numeração Histórica de BP** BP pe eliminam hiato posicionai em 3101) Hô»ifók'fô Mmtím m \m m im \m G-B >m iro COT m. m\ C-T m 16361 \ • iro 1«SS2 \ m ; m íro ; ™ i iro iro í ™ ............................1 : iro,i sKSô | . m iro I O-OT m 18861 i 0C/T ί | m m iro \ 04Ά 5 : i iro I S&A j • m m x-s i .........................i ! m 1......................... 1 i \M i m « 1 &A-G i • m 1 m CvA | sm : ___j \m iro 1 X-T(C j ,...... nm •ΙΒΛώΛ &? | G--&T i « 1 I m i m iro 1 T-T/C .............................: i mu 1861S 1 O-C/F i

Mutações de Bases: Mutações observadas de homoplásmica em hflmjplásmica, lum^lásmlca em heteroplásndca e heteroiilásmca em homoplasmica Numeração Histórica de BP** 3P (fue eli-mnan hiato losicional ;m 3106 \ Hmio’ | H«ro* Hm | Mm Hm Numeração Histórica de BP** BP pe eliminai hiato posicionai em 3106 Hausto Utuvuv ÍL\bifr\ nUnRWrrowFv r tj i\< .V.VV 1SS19 ifiSIB t-c | Ç-T j C-DT m W 1 i m ........................................ m m j m m m t-c m * 0 pmeiro aucleótído represeata o mleótido aoíaal, seguido do aucleótido autado; separados por ω "Λ * todo aio esta presente sangTje/ é desi^ado mo u T. u iteração histórica ei que a deleção &i PP JÍOó é desi^ada coto hiato e o poliiorfisio raro 7iM foi retido 108

Tabela b "Primers" em laço D (usados para tecido fixado com formalina e sangue para biopsias de agulha)

SEQSONO; "Priner Com)r .{#&&$£$) 5V3' IS l twnf | £3 7TMC7CCACCA7TAGCACC w l ?Sí i 28 CAGCCWTMCGACTGACâ J:................ i; iKEHf i £2 CACCft4\^C:,"'i\\s5 “*AV '8-<>ίΥ ; Ί 9 S AOOA: b:U=: 00Ί L-AÃtíiGtí AL> ....... 23 l mr i 88 CCTMCACCAGCCTMCCAG 24 \ 42b- i 13 OT 00.¾ ?! ÂOCOGC&AAAG A \ 711 r ; 5'·$ MbGGaaATQCTTfôÇATttTGT "Primers" para Tecido Fixado com Formalina (usados para 31 prostatectomias) SEQSDHO-: "Primer 'Con|)r. (i tosses) S'4' ss 1- i 25 TA^TTr^TCCTAíSCorrrG £7 l 10S1Í j 26 ACAATAGC7MGA.CCGMACTGGGAT 28 | 1247: ί 88 23 | wm? : j 22 GSATMTAACTASTATGSSSAT 35 l 8614? ! 22 CCAACWGTATAAACCTAaOC 3? i 19 GceC4t0A6:CCC?AAC4$$ 32 i; USSSí ! 2? CGGA“G,V\GCAG4TAGTGAG£ 33 l 8711? j 88 dtâdâTôTemmTAceerco 34 i 5«3f I 13 TCTTTQGCSGGTGCQAAS SS | 'C?86r [ ?5 36 | v.mr j 88 QTASAGTITGAAGTGCTnàAGAQAGG â? l 11828? j 23 MIGAGODACÂTASGCCTCSTÃS 38 1 i87íi3r i 88 GGAAâATâAGTAGATATn'aAMftACTG 36 i £2 GAACT GACACT GAGCCACAACC m | IffilSr i 83 (J 'f "h^AC- 41'AMCCTGTG 4? { £3 "ΓΛ C’---f 42 l i638ir : 23 „ò „,ί«Α„·,Μ 43 l '6144? 8« 44 \ 6:43? X_v 24 CAGTTsjCCAAAGCCTCCSATTATQ 48 1 6687? 86 GMT GC1TCAÇ7 Ç AGCG A TTTTACÇ 46 f %m7r £8 CTAGATAGGGGATTGTGCGGTG. 4? l imm :! S3 OCCTAGACCTCMCTAGCTAACC 48 f 16(®Sr * S^SATMAGMTATITMSG 46 i i4S37f 2:2 GA !· CAA ? CSOO^AbA : CAC: :Kl l 1836? 8:4 A>AGk ί,'ν/'ι7 4^1 4 1 M Si \ sm? j_________________ £3 TACAAGGGGÂTiTAGAGGGTTCTBTG 109 (continuação) "Primers" para Tecido Fixado com Fomalina (usados para 31 prostatectamias) «EOI&SOí "Priner 'ÍiCor®r.|# bases) $-? [ S2 \ 29231 | 24 TASQSTTTAOaftCXrTCQATGTTSa \ sa ii amir jí_ 1 j_ 34 TAaMACCeÃOCTÊeATTACTCSÔ | i 37281 22 CAWQAASTCAOGfiTASGOATÇ f SS | 3323? 1 23 gttcg^ggtctctgctagtst | 5« ·! mm : T 5 37 CMreAWACCAMTCTOTCOOTCAC j S? \ 50SS? ·: í 2S CA^·'WG'SS S WHtó A GGAGT [ sé i ssat 33 TGâAGT CGTAÊGCACAÕGT C2AA \ 6â : δ'ΐ^-ί' ,j................ í 24 SSMCTAGTCAQTTGCCAA4QCCT | ©3 | 8911? ]:.......... 24 TGCAQTGCT GT GASCCGTASGATT | | 7m? || 28 SAAQCCTCCTATSATaaCAMTftCAS | S2 1 m$f. í 2S CQCÂTCGTTTACATMCAGAOGAQG \ a 1 mm? ; J_ 34 GmnçmçQmmmmrm j "Primers 1 para Sangue (prostatectamia) i mmm "Priner 1 rM s r-y [ m l 1848Sf 1 24 aAA^TSTAH?CQACATCTSSTTCC | m $} $f 1 22 TTSSQTTAATCGTSTQAGCQOS | «8 \ 56441 33 CTCCTAASTâTAASTTSSaTfêSTTO | S7 \ms< í 1 24 ATCTTTÃs3AC8S3SiCTCSC4TCACC f Ê3 1 um 24 COTC^WTOTCMQTÃTACTrC \ 'm \ mis? ii 23 GQMCAAw" CAÇf Ai CC~ ACC ΓΓΤ GC AG | n j 24171 1 Ji_ 23 CAC''G1CA4GCCAACAÇaGGÇ4T [ -h | 3644- 23 SCTAQQÇTÃeAGGmSOTASÁtT \ 72 \ 32331 23 STTAASAJSSCASAGCCCSGTAA \ T$ \ 441/2 ‘1 •i 23 TTmSCTSAOÇnACnTAeSATÇÇQ \ ?4 “í- 54 AT8AGAATCGAAC0CATCCCTQAG f 7$ 1 24 os; " fc í vo ça [ m ii:JL : i 23 ΛΑχ, GGC ÇTGCCAT MG ÃA-Yf AG f 77 ‘5.......... II 23 C ΐ ii (MCAAAGJTA: S AAA: GS Π s 1! 0IMTA \ n \ imm 22 CCCACCCTACCACACATTCGAA \ n \ 34·]': 3________________ i__________ 28 STTafâOTQAmASSAATASTSTAAGQ | m j j_ 23 CAACACCTCTrTACAQTâAAATâC€C j m l 9413? j 24 SCCTrGGTATQTGCTTTCTGGJGT | S2 \ mm i............... í .5.......... 21 GGTAGGGGTAAMGâAGGGCA ) sã 1*?5Í ϋ 21 TCASCCOTCCTMTOACCTOC | 34 | IDlSSf ii iã COCfâCGTCCGTTTCTGQAT f as \ 11438(-4_ J_ 2:3 ÔÔAGTCATAASTââAGTGCÔTAAAS | 110 (continuação)

11 Priners" para Sangue (prostatectomia) 'Prirner'^ Com® r .{íí iísssês) s!-r SÊ il | 24 TTOTAC^CCCTASTÂQGCTTCCCTT s? l rnie \ 13 STTASCAOTTCTTdTaAdtTnCTCS m 1 12íM: \ 23 ibçmrcccTCAAcabCdACÃT m l ímmr \ ..i.................s............ 26 CAACTATAGTGCTTGAGTGGAGTASG m \ tmv i 96 CATOCTCOOOTTÃOCATGATrTATOG l 5SUSP | 24 GTTQAGQTCTASS-S-CTQTTASAAG m i hímf \ .....3............ 94 MiAfiz^cmQmcccmmm 33 ' | 55781!- | 23 CTAQQAGTGAATAAAGTGATTGÍ3CTTAG 94 l 5S347f l i.................5............ 23 CACGAAAGGGGATCAAACAAOCC 36 24 aiTAoorrr^TâCTAATsoT^ m |SS44f | 2? CACGCTACmCCTACGT.ATGTG 37 l ms? \ 96 GACTGCTSTSAT^AGGAOSâ 33 l \ 23 ITTATQTSCTCC^aaTtCATCAT 33 | «** | 23 ÇATGãCTAnSASaAGTATCCT 130 \ 143:991 \ 2i ACAC TCAÕC AAGA'XTÇA AC v 101 \ IBSSSr \ ATCGGAíàMTTG7G7AGGG3AAT

Exemplo 10: Deleção de 3,4 kb no mtDMA de Tecido Prostático

Foi identificada uma deleção de aproximadamente 3,4 quilobases (kb) por amplificação do genoma mitocondrial completo de tecido prostático fresco congelado. Utilizando regressão linear estimou-se a dimensão da deleção entre 3000 pares de bases (bp) e 3500 bp. Foram identificadas duas deieções candidatas possíveis utilizando Mitomap (Brandon, M. C, Lott, M. ?., Nguyen, K. C, Spolirn, s., Navathe, S. B., Balai, P. & Kailace, D. C. "MITOMAP: a human mitochondrial genome database - 2004 update". Nucleic Acids Research 3_3 (Edição da Base de Bados) : D611-613, 2005; www.mitomap.org), a deleção de 3397 bp em 9574-12972 e a deleção de 3379 bp em 10744-14124. Para determinar qual das duas deieções era a correcta, se alguma, desenvolveu-se para cada uma das duas candidatas um "prirner” directo que fez a ponte na junção da deleção, assegurando que o "prirner” se estendia para além das regiões de repetição que 111 111 diagrama

3379 bp flanqueiam as deleções, A Figura 5 é um esquemático que mostra a concepção e sequência do " Obtiveram-se resultados de amplificação positiva produto de amplificação correspondente à deleçâo de (referida como deleçâo de 3,4 kb) em 10744-14124. A deleçâo remove ; a to talidade ou parte dos seguir ites (i) subunidade da NAD H desidrogenase 4L, (11) sub );J. li _L NADH desidrogen. Ti C' O _ 4, (iii) subunidade da desidrogenase 5, (iv; í tRNA histidina, (v) tRNA sei

NADH (vi) tRNA leucinai.

Determino: j-se quf e a deleçâo de : 3,4 k.b está prese: de 3 3 an íostras prostáticas frescas congeladas "prímers" de de! leção especifi cos, os tecidos fi formalina foram testados por ordem crescente do v< rte em 91% Com os .xados com alor n.

Previamente, os presentes investigadores sequenciaram genomas mitocondriais completos de 32 amostras de tecidos submetidas a microdissecção por LCM. e 12 biopsias com agulha de próstatas histologicamente normais. Secções de tecidos arquivadas de cada uma destas amostras foram utilizadas no estudo seguinte. Removeram-se de cada amostra 1-2 secções em série. Extraiu-se DNA. de cada amostra na sua totalidade, e não como uma microdissecção. Assim, cada amostra consistiu numa mistura de tecido prostático glandular e tecido prostático do estroma. Esta extracçào foi efectuada utilizando o QIAamp DNA Mini Kit da Qíagen ç,,3.L.aioqo 1 1 r o o 4} , Atos a exuraccao, as amosuras zoram quantificadas utilizando um espectrofotómetro Nano-Drop e as concentrações foram subsequentemente normalizadas para 2 ng/uL, Cada amostra foi amplificada utilizando 20 ng de DNA de entrada e um estojo iQ™ SYBR Green Supermix (Bio-Rad 112

Laboratories Inc.). As reacções foram conduzidas num Opticon® 2 (MJ Research).

Como mostrado na Figura 6, observou-se uma diferença distinta no limite de ciclos e, por extensão, na quantidade da deieção entre as amostras prostáticas malignas e as amostras prostáticas benignas sintomáticas. As amostras malignas exibiram um limite de ciclos consistentemente anterior relativamente âs amostras benignas.

Exemplo 11: Estudo Cego da Deieção de 3,4 kb - Comparação do Limite de Ciclos

Após o estudo descrito no Exemplo 10 seleccionaram-se 21 amostras adicionais, 10 das quais eram benignas e 11 malignas. Determinou-se o estado patológico por biopsias com agulha efectuadas por um patologista qualificado. As amostras foram combinadas de modo cego, de modo que os presentes investigadores não sabiam qual o seu estado patológico quando realizaram este teste. Os presentes investigadores conseguiram prever correctamente o estado patológico em 81% dos casos por exame do limite de ciclos. Das 4 previsões incorrectas, duas eram amostras malignas que haviam sido determinadas benignas e 2 eram amostras benignas que haviam sido determinadas malignas. O médico pediu informações clinicas de seguimento para os 2 indivíduos no último cenário, para determinar se tinham sido diagnosticados com cancro da próstata subsequentemente aos resultados de biopsia com agulha utilizados para este estudo. Um dos indivíduos que originalmente produziram uma amostra benigna mas que este estudo previu terem uma malignidade produziu subsequentemente uma amostra maligna. Em resultado, um dos falsos positivos tornou-se num. positivo verdadeiro. Em consequência, o estado patológico 113

foi previsto correclamente em 86% dos casos examinados neste estudo. 0 valor de previsão positiva (PPV, em que PPV - positie 'OS verdade iros/(positivos veraaaeiros + positivos falsos) ) final para a este estude 5 foi 91%, e •V valor de previsão negativa (NPY, em que NPY negativos verdadeir os/(negati\ /os verdadeiros 4· negativos fai sos)) foi

Exemplo 12: Estudo da Seleção de 3,4 kb ~ Métodos {n - 76)

Setenta c s seis tecidf estudo quanto â dele tecidos foram fixad. malignas, 12 eram nc benigna, mostrado hií de metade tinha hiperi em biops/i .as com agui dos inves tigadores. Espécimes Prostáticos 39 tinham doença prostática n.ente. Do último grupo, ma is

Efectuou-se um procedimento de pressão e retirada de fita adesiva ("tapelift") em cada lamela utilizando Prep-Strips (Número do Catálogo LCM0207) da Arcturus Bioscience Inc. Isto permitiu a remoção de qualquer matéria em partículas ou tecido não aderente da lamela antes da extracção de DNA. Com o tecido ainda nas lamelas, as lamelas foram enxaguadas com PBS (Solução Salina Tamponada com Fosfato), para remover tanto fixador quanto possível. As 1-2 secções de biopsias com agulha das lamelas foram raspadas para tubos microcentrífuga esterilizados utilizando navalhas cirúrgicas esterilizadas e embaladas individualmente. 0 DNA foi isolado e purificado utilizando um QIAamp© DNA Mini Kit 114 (Qiagen, Catálogo # 513Q4) de acordo com as especificações do fabricante. Um controlo de extracto negativo foi processado em paralelo com as extracções das lamelas, como verificação do controlo de qualidade. A concentração total de DNA e a razão de pureza para cada amostra foram determinadas por espectro!otometria (Nane-Drop ND-1000) e prepararam-se diluições de 2 ng/pL para a Reacção em Cadeia de Polimerase Quantitativa (qPCR). "Primeis” oligonucleotidicos purificados foram sintetizados quimicamente pela Invitrogen (Califórnia, E.U.A.). As sequências dos "primers” e as dimensões esperadas dos produtos de PCR amplificados estão listadas na Tabela 6. Adicionalmente, a análise de PCR para deleções de mtDNA incluiu controlos positivos (DNA de uma fonte que se sabe conter o mtDNA mutante). Cada conjunto de "primers”, com a excepçâo do TNF, foi verificado contra uma linha de células rho 0 sem mitocôndrías, para confirmar a ausência de co~ amplificação de pseudogenes. •rr^AQTACaTAQATAOTAAOCCTACTOCTA^ S£Q >D NO; 1SS 3.4 reverso (14361-14379) δ'··δΑάάΤΑαάΑΠ«3ΤβϋΤάτ>2!seoion&. i*d 12s directo (708-728) δ!·οοττοοΑ.στδΑοπ€Αεοοτο-^S£Q®no:14? IZs reverso (323-345) stQidnomíí? TNF directo (3756-3775) a*·οετ^οοοΑΑταχπτΑΤΓ4'se?oώnocm TNF reverso (3866-3886) S-SGTTTCGAAGTSCTOSTOCTC-StEQ ÍDNO· 144

Para "primers" TNF, Referência de "Primers” Aplicação N° 1 de Sppendorf® HotMaster™

Tabela 6, "Primers” de Amplificação

Par de "Primers" Posição Amplificada 5'-3' Comprimento do produto amplificado (pares de bases) Deleção 3.4 10729-14379 (senos 273 Tempo Real 3379 bp a 10744-14124) 12s ffitDHA 7 0 8 - 9 4 5 238 TNF 3756-3886 131 3.4 d .i r e c t. o (1Q 7 2 1-10743 - 14125-14139) 115

HotMaísfcer - Uma tecnologia inovadora Inicio a Quonte/Final a Frio para melhores resultados de PCR*

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Reaeçâo em Cadeia de Polimerase em Tempo Real

Realizaram-se ta PCRs separadas em. cada amostra, ;aaa reaeçâo consistiu num volume total de 25 yL e incluiu DNA modelo, um par de "primeis" (12s ou Dsleçâo 3.4 ou TNF), um estojo iÇf* SYBR Green Superou x (Kún aero do Catálogo 170- 8882, Bio- Rad Laboratories Inc.} c.‘. agua desionizada destilada (ddípC >) . 0 TNF (factor de necrose tumora1)

compreendeu "primers" para genes nucleares de cópia única, e 12s compreendeu "primers" para o genoma mitocondríal total, 0 volume e concentrações do DNA modelo, "primers" e tampão reaccionai estão lista 003 303.J. XO

Reagente Concentração por Reaeçâo Voltuae por Reaeçâo Tampão Reaccionai IX 12,5 yL "Prúner" (directo 25(5 nM 0,0625 yL de cada e reverso) lote de 100 ummole ddHjO N/A 2,375 yL DNA Modelo 20 ng 10,0 yL Total 25 yL

Os parâmetros de aplicação de cicios para cada produto amplificação estão listados na Tabela 8. 116

Tabela. S Pa ramal* wa Âolícacão da Ciclos rtr Tirftr V inf> \σ Λ ÍJy rwir xJVriKtNm' Λ» v %rr*xx» ft irw» nrr χχκ^τν» 'ofrv Vo* rr* V·* ιη V·* ^ϊτ

Passo Temperatura (°C) Duração 1 95 3 mm 2 95 30 s 3 66 ("primers" de deleção 3.4) ou 61.5 ("primers" 12s) ou 61.5 ("primers" TíJF) 30 s 4 7 2 30 s 5 Leitura da Placa 6 72 Í0 min 7 Curva de Fusão 50°C--ii0°C leitura a cada 1°C O © o Repetir passos 2-5, 44 veres para um total de 45 ciclos

Análise? A aplicação de cicios térmicos, detecção em tempo real e análise das reacções foram efectuadas utilizando um Sistema de Detecção de Fluorescência Continuo DNA Engine Optrcon© 2 equipado com "software" Intuitive Opticon Monitor™ (MJ Research Inc.). Utiiizou-se o método de curva padrão para a quantificação de DNA, Efectuámos um conjunto de diluições em sé: rie (1 p, Ό 'J t 10% 10% ] Ai '1 - O f 1 de t. rês mo ;del 03 gerad .0 s por PCJR ourif: 1 ca do; s, um produti i par :a a c ielecão O •J » 4, um pr :a os "pr ir ners" 12s e um para T NE, iJ3 CíU .0 gerar am- se j- γ·ρ c· c uiva s pad.r ão di f eren tes m ostrand 0 0 número de c :ópi a s de mt .D NA. tot ,al. ( "pr.ím ers" de pr oduto c ie air iplifi r< p γί ^ /*“ .12 s genom .5. mitO' condrial total), dí ileção 3,4 ou ] jNA nu c.le ar total ("pr inr mc s" TNF - gen es nu oleares de cópia única ) . O o valor G1 S %·% das cirno s t mas podem então ser com vertidos no núm.er 0 de có pias de d: NA po r comparação do c % da amostr p Cl om 0 do s padrõe us, A dele ção 3 \A fo 1 cons.1 .dera da au sente ou em n ivei S baixe >s se a et ílecác 5 não tiver sido dete ctada em % 7 j ! 117 A determinação de malignidade baseia-se na quantidade da deleção de 3,4 kb presente na amostra normalizada, indicada pela localização do limite de cicios. Esta localização pode ser absoluta, como em maís de 25 ciclos mas menos de 35 c ·’ £·< lo s, o: u maís provavelmente uma ra zão entn e o DNA rnit oc ondrii ai totc il presente como indicad .0 pi elo pi roduto de amp 11 f icaçi ão de 1 L2s e a dei 0: ç a o de 3,4 kb. isto pode £ :> /p, y· exp re S S 0 Θ λ a perce ntagem do Dl 3A mi .tocondri al t .otai. 0 nurm: 'J O de 0 ilulas , repr esentado pe lo p roduto d e a: mpiifi .cação de TN ET y pode ο .o y ç -n corporado p >ara refinar a d istinção ent - ν'-Γί T (Ώ Q id os be; n.í gnos e malignos.

ç q μο q destas amostras erapi regaram-se .. C8. S » As t rês variáveis que são 3.Ώ3..1. a .ses sã o o limite de ciclos CA do Factor de Necrose Tumoral (TNT), espécies totais de mitocôndrías que contêm esses sítios de "primers" específicos e as mitocôndrías que albergam a deleção de interesse. A formação de agregados não foi normalizada nem se utilizaram funções logarítmicas, devido ao intervalo semelhante e pequeno de dados. A Figura 7 mostra o movimento real e tendências dos dados. 0 eixo x é o número dos pacientes e o eixo y é o limite de ciclos obtido de PCR em tempo real. È importante notar que quanto maior for o limite de ciclos menor é a quantidade presente da variável. 118 A principal tendência gerai mostrada na Figura 7 baseia-se nas diferenças/razões entre as variáveis de Deieção, Total e TNF. A deieção é baixa ou está ausente para as amostras benignas/normais (lado direito) e aumenta (para a esquerda) com amestras beniçnas anormais e malignas. As amostras benignas anormais e malignas começam a diferenciar-se entre si com base na razão do iimite de ciclos entre Deieção e TNF.

Aprendizagem vigiada baseia-se na tentativa do sistema para prever resultados p; ura amostras conhecidas. Metade dos dados foi U t -i. .1 a. Z 3 0.3 oara treinar e a outra metade para testar o a Igoritmo. A . aprendizagem vigiada compara as suas previsões com. a res: posta alvo e "aprende" com os seus erros. Mas se o resultado previsto for maior ou menor do que o resu Itado real Π03 0.3.0.OS ) 0 Ç: rro é propagado de novo no sistema e os pesos são ajustados em conformidade. O O íKTG de Dados: 5% até 35% Benigno 35% até 65% - Hiperplasia 65% até 95% - Maligno

Algoritmo ANIS {mostrado esquematicamente abaixo) :

Metade dos Dados usados para Treinar ANN

Outra metade usada para comparar a precisão Precisão ^ Comparar conjunto de dados esperados com conjunto de dados obtidos -> 86,6% 119 Algoritmo da Rede Heural Artificial

Benigno fíiperplasia

Maligno

Utilizam-se três variáveis para cada classificação com base no Limite de Ciclos Ct de PCR em Tempo Real:

Factor de Necrose Tumorai (TNf) - Controlo de cópias nucleares„ as de mitocôndrias ado.

Mitocôndrias Totai s - Controlo de cóp Delecao - Mitocôndrias no estado dele

Resultados:

Metade do conjunto de dados é utilizada para treinar ο ΆΝΝ e a metade restante é utilizada para comparar a precisão.

Precisão de Três Classificações = 86,6% Valor de Previsão Positiva (PPV); 120

Benigno para Maligno - 88,2%

Valor de Previsão Megativa {HPV)

Benigno para Maligno = 76,5%

Exemplo 13: Utilização de uma delação de DMA mitocondráal de 3895 bp como marcador de exposição solar em pele humana

Besde a descoberta inicial da possível associação da deleção de 3895 bp a exposição solar, relatada por fíarbottle et al,, 2004, e Durham et al,, 2003, trabalho adicional confirmou a presença da associação. Além disso, o trabalho adicional permitiu a utilização desta deleção para um. teste de diagnóstico de detecçâo de exposição solar ou cancro da pele através da invenção de um novo método de detecçâo de deleções e rearranjos de sequências de um modo totalmente quantitativo. Este método proporciona a hibr idi.zaçâo de um "primer" ou sonda para a sequência formada de novo criada pela deleção ou inserção envolvida no rearranjo e, desse modo, permite a utilização de PCR quantitativa em tempo real (qPCR) como meio de detecçâo. A utilização da plataforma de qPCR permite a detecçâo quantitativa da deleção, em vez de um simples cenário de presença e ausência. Esta quantificação é a base do teste, pois são as quantidades relativas de deleção que medem o nível de exposição solar ou o carácter da malignidade, e não a semi-quantificação da simples presença ou ausência previamente relatada. Como tal, a plataforma de qPCR permite a utilização de tecido aparentemente não afectado ou não exposto, pois a sensibilidade da detecçâo é substancialmente maior do que a da detecçâo convencional com PCR e brometo de etídio.

Contexto: 121 121 ncia de cancro da pele não-melanoma (NMSC) e em populações de origem europeia ÍSeveri e 2004) , Por exemplo, um milhão de novos casos são anualmente nos E.tj.a. (Wesson e S í iverbercf, 20 ίΊ O U .J ) Θ 6b 000 n o R.U. (númert os fornec idos p >er; i C diicer Re C; .ti arch , R. 0 .) . 0 NMSC é respon sável por cerca de 90 % dos ca nc ros da pele e consiste em ca rcinomas de céii ula s b asais e r-i lula scarm 03c 5 <*< (xir-r qpp ÍK_> \ —1 ^ respecti1 raments l ) , Os BCCs C; irj 0 a ic >rma mal s comum de NMSC e surgem predom. inante mente do O que rat.í nó c l to s basais da epiderme, ma s ta mbé m de > SCCs podem formar SCC exibe o maior do nos mais idosos células em fo.iicul.os pilosos e glândulas sebáceas. São localmente invasivos mas raramente formam metástases. Os SCCs também são derivados de queratinócitos basais; no entanto, em contraste com os BCCs, metástases. Em comparação com BCC,

(Severi e Eng lísh, 2004 ) . A densidadí 3 relativa de NMSC ^ P IÍ13 i. S úí.i-TT.S em. sítios do corpo "habitu laimente" expostos ao sol quando ao ar livre, p p, Γ)"; p, p p·, 1 p p p 1 beludo, face, pese •-Λ j^-« .-Λ e orelhas, con ao definido por Armstrom j (2004). No entan to, SCC difere ap^ :eciavelmente de BCC por exibir uma densid a GO muito menor em sítios do corpo que são "ocasionalmente" expostos ao sol, como ombros, costas e peito, como definido por Armstrcng (2004) . j p 80. .ar que mr trong Θ Kricker, 2 1 de 0 aposição UV t o r e s e outros exam

Em consequência, o principal determinante de NMSC é o componente de radiação ultravioleta (UVR) da luz solar, que induz danos no DMA. É importante notar que é o padrão (mais contínuo versus intermitente) e a quantidade cumulativa de expos (A.rms fiáve

ros examinaram a nova ideia de utilizar DNA 122 122 i 1 W. b, —* (7. »lé r COiílO )V (Pang et al., ; et ai. , 1998; >m o r estreio p53, há certas exposta ao sol. evidênc: ias em V O S b) O -L excisao O O >(•5 excisáo

mitoconclríal (ratDNA), em vez de DNA

Birch-Machin, 2000). Sm comparação mutacional cie genes de DNA nuclear, como p5( vantagens em estudar danos no mtDNA em pel mitocôndrias de reparação de danos oxídatív bases; não f ia e vidências ae Lear pai ::a. a repa ração de fo nplo, d. íraeros ΟΘ ciclobutano 9oux et al., 1 QQa Croteau e 1 007 - y .·. J / f Saxyer : e ' /an Houten, 1 •eparaç cada célula pede conter até vários milhares de cópias do çenoma do mtDNA e, em consequência, mitocôndrias podem tolera r nível .. s mu i to elevado s (até 9 0%) de mti: !NA dan ; im j : .i. c a do por co mplemer 113 Ç â O do tipo s elvagera remanes cente (Ch Ι.ΟΓ nyn ei al., 1992; Q P 0 rj /-p, vJ b, j.. CÍ v-· CO et al ,, 1991) Em cor i junto, ;tr c· tes factor es con· d.u z em δ. acumulação de fotodan os em mt DN rÀ sem compro metímer ito da fu ncão ce lular. A uti ; de dc mos er α mtDNA como bi orna .roa dor de exoosí r·' -q r\ .*g p, lar c umulativa em pele humana é uri '13. t a.r θα de porque NMSC forma-se que "habitu aimente" .r livre, em opo investigação relativamente nova, e trabalho anterior simplesmente comparou danos era mtDNA para distinguir entre peie protegida do sol e exposta ao sol (Pang et al., 1994; Berneburg et al., 1997; Birch-Machin et al. 1998). Esta abordagem é limitada por em sítios do corpo que sol quando ao ar livre, em oposição a sítios "ocasionalmente" expostos ao sol (Armstrong, 2004) . Numa tentativa para abordar esta limitação, o presente exemplo demonstra que a frequência da ocorrência de uma deleção de 123 mtDNA de 3895 bp raramente relatada (só previamente descrita em músculo doente (Moraes et al.f 1992)) é significativamente diferente entre sítios corporais "habitualmente” versus "ocasionalmente” expostos ao sol. Adicionalmente, o exemplo demonstra que a ligação entre a etiologia da deleção de 3895 bp e o componente tjvr da luz solar, por indução da deleção de 3895 bp ín vitro com doses subletais repetidas de uma fonte de luz de UVA + uvb. Métodos a Materiais A radiação ultravioleta (UVR) da luz solar è amplamente reconhecida como o principal determinante de cancro da pele não-melanoma (NMSC) em indivíduos caucasianos. Trabalhos anteriores desenvolvidos pelos presentes inventores e outros examinaram a utilização de danos em DNA mitocondrial (mtDNA) como biomarcador de exposição solar cumulativa em pele humana. Estes estudos compararam danos em mtDNA entre pele protegida do sol e exposta ao sol. Esta abordagem é limitada porque NMSC forma-se predominantemente em sítios do corpo "habitualmente" expostos ao sol quando ao ar livre, em oposição a sítios "ocasionalmente" expostos ao sol, e, como tal, diferem na sua exposição UV cumulativa. Numa tentativa para abordar esta limitação, este exemplo investigou a frequência da ocorrência de uma deleção de mtDNA de 3895 bp raramente relatada em 104 amostras de pele humana de idades correspondentes recolhidas de sítios do corpo habitualmente, ocasionalmente e raramente expostos ao sol. Observou-se um aumento significativo na frequência da deleção com. exposição UV crescente (p < 0,0001) e, de modo interessante, observou-se uma frequência da deleção significativamente maior em sítios do corpo "habitualmente" expostos ao sol em comparação com os "ocasionalmente" exposnos, tanto na derme (p = 0,0018) como na epiderme (p < 124 124 maior da Ο, 0001) . A inv amostras de KM; comum de 4 97? igação da deleção de 36 95 bp nas mesmas utilizadas num estudo anter. íor da deleção revelou uma frequênc ::ia co mpa: rati vamente rrência da deleção 3895 (8/10 versus 4/10, respectivamente), apesar de esta diferença não ter sido estatisticamente significativa. Adicionalmente, o exemplo estende a ligação entre a etiologia da deleção de 3895 bp e ο οοηρ :>onente uv: R da luz s oia r por 1: nduçã 0 da deleç ão de 3895 b P In vi tro com c loses 8 !J.O 0 L cí 2- s r 0p0t' 0 d as de í uma fonte de luz u VA "t 53, A f requ enc .1 3. d. ã d< sleçã' de 3895 bp em pele V iumana p: roporc iona um bion: i.cl· 1! : cado; ;; pot enc ia 1 de exposí Γ' ão [TV CU .mu Ia tá .V3 Θ pr •oporei .ΟΓ : a um a fer: ramen ta de detecç 3. o pre coc e de deser ivo.l ..viment ;o de K !0 Q (-1 ‘^ f e t nambém propor Γ' iona u m m etodo de mo nítorizaç ão da s e gurar Iç a a longo orazo d e regimes cl Ini cos d c.. fp ototer ap i. a c o m UV „

Amostras da pacientas

Rec olh eu - 3· e pele peri lesionai clín e normal de s ítí 0 3 do cor p 0 T? habitua lmen a fti:í mostos ao sol quando ao ar 1 iv ' ν' 0 (como cour o cabei ..udo, face, O 0 3 C· O \ - 0 C.. 0 'f ( slhas) (epide rme n :::: X ?1, QG ' Τ'! rie n ::: •:t A. f idade média ± EPM === 69,4 ± 2 f 6) 0 o ios d.O corpo " o c a s iona In nente” exposto s ao sol (om íbro O ? C O 8 tas e P1 eito) ( epid erme n - 21, de rme n - 21, idade méd .ia ± I 6 3,1 :!: 3, 6) , com consentimento informado, < de 12 nac ien 7.0 8 com Kl ·/ Ο r KJ '·. atendíi dos na clinica de excisa Í.0 de can cro s da s pele na Royai Vi ctor ia Inf.i . rmary, Newca stl F R.U ião há. difs ti g- Cl· r-, ( :as de idade s igni f icatívas entre O 3 grupos habitualmente e ocasionalmente expostos ao sol (p ^ 0,158: teste t de duas caudas (correoção de Welch)). Ad i c iona lmente, dos 42 pacientes, a percentagem de

Ivíduos do sex o feminino to é, 52 %;48%, respectiva tv.·., e SCC, em que 5 : masculino foi quase a mesma rente), bem como a percentagem '% dos pacientes tinha BCC. 125

Recolheram-se amostras de pele normal de sítios do corpo raramente expostos ao sol {como nádegas e calcanhares) de amostras postmortem previamente obtidas (epiderme n = 10, derme n = 10, idade média = 73 anos) , A epiderme e derme foram separadas utilizando 0,25% dispase a 4°C durante a 1" 0 (Durham et al. ., 2003) e extrai u-se DNA utilizando um ojo de extracção de tecido DNeasy da Qiag< sn. Obtiveram- tim aores epidérmi .cos, BCC (n = 5) , SCC (n - 5), de ien tes para excl Lsão de cancro. Nenhum oos pacientes utilizados para este estudo tinha mtDNA dereituoso.

irradiação uv da células HaCaT

Uma linha celular de queratinócitos imortalizados espontaneamente (HaCaT) (Boukamo et al,, 1988) cresceu em meio de Eagle modificado de Dulbecco contendo 10% de soro fetal, de bovino 5 IU por mL de penicilina e 5 g por mL de estreptomicina. As células cresceram até 70%-90% de confluência era placas de Petri de 9 cm. de diâmetro tratadas para cultura de tecidos, foram lavadas em PBS e depois foram irradiadas dia sim, dia não com. uma dose subletal (0,5 J por crrf, que é equivalente a 1 SSD) de UVR utilizando uma lâmpada de 40 W Helarium {Wolff B1.01, 290-400 nm, emissão do pico a 325 nm). Em instantes apropriados extraiu-se DNA celular total das células aderentes utilizando o estojo de extracção de tecidos DNeasy da Qiagen,

Análise de PCR

Efectuou-se PCR numa reacção de 25 uL contendo 200 ng de DNA genómico, cada "prímer" 600 nM, dNTPs 250 μΜ, 0,6 U por reacção de DNA poiimerase Amplitaq Gol d (Applied Biosystems), tampão GeneAmp (contendo Tris-HCl 100 mM, pH 8,3, KC1 500 mM, MgCl 15 mM e 0,01% (peso/volume) de 126 gelatina) . Os "primeis" de PCR utilizados foram L404 í'S'CTTttg GCfíGTATSC ACTrr.31 (nt 404-423) (SEQ ID NO: 145) e H4676 <m m TSC TSC TT fj (r;t 4676-4657) (SEQ ID NO: 146) . Os "primeis" L404 e R4676 foram concebidos para hibridizar fora da defeção de 3895 bp. Durante a amplificação do DNA.,, o tempo curto (30 s) de extensão de polímerase não permitiu a amplificação de produtos de PCR de tipo selvagem, permitindo somente a amplificação do produto menor de 375 bp que representa a espécie de mtBNA deletada. As condições

de PCR foram 94°C durante 10 minutos, 35 ciclos de 94°C durante 30 segundos, 56°C durante 30 segundos, ?2°C durante 30 segundos, e uma extensão final de 7 minutos a 72°C. Os produtos de amplificação foram visualizados num gei de agarose 1% corado com brometo de etídio (0,25 ug por mL) .

Análise de sequências de DMA O produto de PCR de 375 bp foi exeisado do gei e purificado utilizando o estojo de extracção de gel QIAquick (Qiagen, Alemanha) e foi cionadc num vector PCR®4-TOPQ® utilizando um estojo de Clonagem TOPOOTA (Invitrogen, R.U.). Para confirmar a identidade do produto de PCR de 375 bp, o DNA foi sequenciado utilizando sequenciaçáo automática de DNA (MWG Bictech, Ebersberg, Alemanha).

Análise de PCR Radioactiva

Para detectar níveis baixos da deleçâo gerada por UVR efectuou-se PCR como descrito acima mas com adição de 3 pCÍ de fce—j2P] -dCTP (Amersham, Buckinghamshire, R.U.) . Em seguida, os produtos de PCR foram submetidos a eiectroforese com um gel de poliacrilamida não desnaturando 6% e foram expostos a um monitor de fosforimagem durante aproximadamente 24 horas. Os fragmentos de PCR radioactivos foram submetidos a varrimento e visualizados com um 127 "Phosphorlmager", utilizando o "software"' ImageQuant (Molecular Dynamics, R.U.).

Análise estatística

Realizaram-se análises estatísticas utilizando StatCalc (Epi-info. CDC, Alberta, Geórgia) empregando χ% χ" de Pearson, teste exacto de Fisher e teste t emparelhado.

Resultados a Discussão

Confirmação da identidade da delação de 3835 bp 0 espectro de deleçôes de mtDNA de NM.SC e pele exposta ao sol de um estudo anterior (Durbam ei al,, 2003) foram analisados de novo. Verificou-se que muitas amostras albergavam uma deieção de dimensão aproximadamente 4 kb. Após uma pesquisa na base de dados MITOMAP (Mítomap, 2004), a deieção for identificada como sendo a espécie de 3895 bp relatada no pequeno arco abrangendo os nucleótidos 547-4443, Esta deieção havia sido previamente associada à Síndroma de Kearns Sayre e Oftalmoplegia Externa Progressiva Crónica (Moraes et ui., 1995). Para confirmar a identidade da deieção, concebeu-se um ensaio de PCR específico para deleçôes como explicado na secção de métodos, O produto de 375 bp deste PCR foi sequenciado para confirmar que continha a sequência deieção-junção que é caracteristica da deieção de 3895 bp, nomeadamente 5' (SEQ ID NO: 147) . De modo característico, esta sequência continha apenas uma das duas repetições de 12 bp que flanqueiam a deieção de 3895 bp em intDNA de tipo selvagem (letras minúsculas) .

Uma comparação da frequência da deieção de 3895 bp em sítios do corpo habitualmente expostos ao sol versas os ocasionalmente expostos 128

Uma vez que a deleçâo de 3895 bp foi oriçinalmente observada em amostras de NMSC recolhidas de sities expostos ao sol, os presentes inventores abordaram a questão de a frequência da deleçâo ser um marcador de exposição solar cumulativa crescente. Utilizando o ensaio de PCR especifico para deleções (ver Materiais e Métodos), analisou-se a frequência da ocorrência em 104 amestras de pele humana separadas e de idades correspondentes recolhidas de sitios do corpo habitualmente, ocasionalmente e raramente expostos ao sol. Observou-se um aumento significativo da frequência da deleçáo com exposição UV crescente na epiderme (p <: 0,0001, χζ 3.1,36, 2df; teste de χ" de Pearson) e derme (p < 0,0001, x2 ::: 28,68, 2df) . A Figura 8 mostra uma frequência aumentada da ocorrência da deleçâo de 3895 bp observada com exposição solar crescente. A. Figura 8a é um gel de agarose corado com. brometo de etidio representativo que mostra uma maior frequência da deleçâo de 3895 bp em sítios do corpo habitualmente expostos (painel superior) ao sol quando ao ar livre, em oposição aos ocasionalmente expostos ao sol (painel inferior) (D derme e E epiderme). O controlo positivo representa uma amostra com a deleçâo de 3895 bp que foi confirmada por sequenciação. A via 1 em ambos os painéis representa marcadores de peso molecular (Ripermarcador de tamanho escalonado IV --- intervalo 1000-100 bp, Bioline, Londres, R.U.). Adicionou-se a mesma quantidade de DNA modelo a cada reacção de PCR. A Figura 8b é o histograma que mostra a frequência da deleçâo de 3895 bp em 104 amostras de pele separadas recolhidas de diferentes sitios do corpo com exposição solar, É importante notar que se observou uma frequência da deleçâo significativamente maior em sitios do corpo "habitualmente" expostos ao soí em comparação com os 129 129 o na d .erme (p ^ 0,0C )18, χζ - 8 5 - lJ ; ·υ f teste de χζ) como na 9,72, razão de probabilidade 8,5; teste epiderme (p < 0,0001, y* =· 17,53, razão de probabilidade 40) (Figura 8b), A deieçâo não foi detectada nos sitios do corpo "raramente" expostos ao soi (Figura 8b), Uma vez que as médias de idades, razões entre sexos e tipos tumorais de onde foi recolhida a peie perilesional eram muito semelhantes entre os grupos habitualmente expostos ao sol e ocasiona lmente expostos (ver rmprováv el que as descot ;ertas factores . Adie: Lonalment e, n, estatíst ica nos valores médio; aibergav am (isto é, m.édi a :::: 6 fe (média ::: c o / 8 j. e n a v \ ^ ; '* ' ! a del lateriais e Métodos), é iam confundidas por estes se observou diferença ie idade das amostras que teste t (correcção de Welch)). A deieçâo de mtDSfA de 3895 bp em SfMSCs A investigação da deieçâo de 3895 bp nas mesmas amostras de NM.SC que foram utilizadas num estudo anterior da deieçâo comum de 4977 bp (Durham et ai,, 2003) revelou uma frequência comparativamente maior da ocorrência da deieçâo de 3895 bp (8/10 versus 4/10, respectívamente), apesar de esta diferença não ter sido estatisticamente significativa. Uma vez que estes tumores foram excisados de sítios do corpo habitualmente expostos ao sol, é interessante especular que a deieçâo de 3895 bp pode ser um marcador mais sensível de exposição solar cumulativa do que a delecão comum.

Historicamente foi presu itnido que a região de p equer io arco do genoma mitocondrial q ue contém a deieçâo de 3895 bp não alberga tantas defeções quanto o arco principal que contém a deieçâo comum (Wei et ai,, 1996; Mitomap, 2004) 130 130 resultado, a maior part centrar-se no espectrc dos estudos anteriores tenderam a de deleções na região do arco ão da a baixa amente, níveis principal. Pode dever-se a esta "polarizaç investigação" o facto de a deleção de 3895 bp ter um incidência relatada na literatura gerai. Alternativ a deleção de 38S5 bp pode ocorrer naturalmente em presentemente indetectáveis em tecidos normais, que enriquecida na peie por exposição a UV.

Ausência da deleção de mtDHA de 3895 top em sangue A deleção de 3895 bp só havia sido previamente relatada em músculo doente (Moraes ei al„, 1992), Para além do presente estudo em pele, a frequência da ocorrência noutros tecidos é desconhecida s. Os presí jntes inventores inv esticaram a frequência da deleção em sangue, realiza ndo a PCR específica pa ra deleçõe s em 16 amostras de sangue recolhidas de pacientes cl· δ um grupo de idades semelhantes aos das amost ras de: pe.u s. Verificou-se que : ΙΘ-: Ln.U]TLcí d.cl· 3 amostras de sai icue alberga a deleção (dados não mostrados).

Geração da deleção de 3895 bp em células HaCaT cultivadas πλυ' τ TT\7 ΓΑΠιώί* τ j A. . J- J- -t- -fc. i t w). tWnJ y . J. ^ -A wl- t_. J-

Para avaliar a relação causal entre a quantidade cumulativa de exposição solar e a frequência da ocorrência da deleção

cie ) <895 bp foi necessário investigar o efeito da luz solar ín viiro. Uma vez que a luz soj.u r contém UVA e UVB, utid .izou-se uir ia lâmpada Helaríum (Diffey, 2002) para Prol )orcionar ua a série extensa de re< gimes de coses oe UvR

subletais repetidos, numa tentativa para gerar a deleção de 3895 bp numa linha de células derivada de epiderme humana (HaCaT), A estratégia óptima de doses repetidas de UVR foi tal que a deleção foi gerada sem um grau significativo de morte celular. Utilizando um ensaio baseado em PCR 131 radioac t ivo, demon; strámos que c ) s p r i melros sina ·; cg de indução da deieção de 3895 bp em célul. as aderentes for am observa dos ap bs 17 doses diárias aitern adas de 0,5 J p ;or cnf (is' to é, 1 SED) de UVR. A Figura S mo stra Q ue a lâmpada IA aiarium l (UVA/UV3) induz 3. deieção cl·" 3 8 95 bp c un células HaCa T após 17 doses de UVR VJ ,~\ V-v _ 0,5 u p >or cm" a As C< êlulas HaCaT fc >ram ir radiadas com 0,5 J por cm2 (isto é, 1 £ >ED) de UVA/UVB dia sí .m, dia não para um total i de 1.9 doses DNA celular total foi extrai .do de células aderi antes ! e 100 ng fora m suje ritos a PCR, pa ra am.pl ifi C cl .T. 3. deleçàí o de 3895 bp. ( )s prím ieiros sinais GO um. aumento rndut :ivel. por UV da deieção de 3895 bp for am observa dos aq >ós 17 doses repeti da s de : UVR. 0 CO ntro lo positiv o cons. íste er: i DNA de uma amostra t rumoral que a l.ber ga a deleç ao de 3895 bp, ao passo qut ; o cor itrolo negati vo n ao contêm. DNA, Além disso, como foram utilizadas dos es subl&ta i s de [JVR, o nível da dele çâo f.o í mantido na .1 inha celular apos i duas doses subsequentes de UV, uma propr leda de que é importante s e a 3895 bp f ruder ; ser utilizada co mo biornarc a dor c umulat: Ivo putativo de GXpOS ição solar e m. pe le humana, Isto é int eressante, dad las as descobertas multo recente s de Bernebe urg et al, (20 04) (publicado dur; ante a revisão do m anu sor; ito), que dernc mstrar atn i a vi vo que a deieção comum induzi .da por UVA pode estar presente 16 mes Θ 3 depois de ces o a i. 3. .! . rradiação. As obse nrvaçoe 3 deso ritas acima sã o impo rtantes por vá ri motivos , Em p r irueirí s lugar, o esti ido emp regou uma fo nte de UVR em.i .tindo UVA e UVR, desse mo do rep. resentando mais de perto uma fonte so.' j. 3 r 0 β UV 3 r. ÍUU i. α d 3 do que os e stud .0 s anterio T. Θ S f Q ue ger aram a deieção comum usando apen. ri bi U V A (Eerneb urg et : al,, 1999; Koch et ai., 2001). Em s egun do 132 lugar, é a primeira vez que uma deleção diferente da defeção comum de 4S77 bp for gerada por doses repetidas de UVR. Além disso, em contraste com o estudo de Berneburg que empregou fíbrobiastos, as presentes experiências foram realizadas numa linha celular derivada de queratinócitos, e é este tipo de células que origina NMSC.

Importância funcional

As regiões deletadas na deleção de 3895 bp provêm do sitio de ligação de mtTFl no laço D a ORNA metionina. Os genes deletados incluem 12 s rRNA, 16s rRNA, ND1 e também os promotores da transcrição de ambos os filamentos H e L. Deve ser atingido um certo limite de mtDNA de tipo selvagem: deletado antes de ser observado um enfraquecimento da função respiratória mitocondrial (Sciacco et s.l,, 1994), Para genes de mtDNA codificadores de proteínas, como os removidos pela deleção de 3895 bp, o valor limite para disfunção da cadeia respiratória mitocondrial é cerca de 65% e superior (Hayashi et aJ., 1991; Chomyn et al „, 1992). Ror exemplo, trabalho anterior mostrou de amostras de pele humana albergando < 25% da deleção comum de mtDNA de 4 977 bp não exibem uma deficiência da função mitocondrial, determinado por coloração histoquímica dual das actividades de citocromo oxidase e succinato desidrogenase (Durham et al., 2002) . Uma vez que não há nenhuma coloração histoquímica funcional para a deleção de 3895 bp, a deleção foi quantificada nas amostras de pacientes utilizando análise "Southern”. Na presença de controlos apropriados, esta análise não conseguiu detectar a presença da deleção de 3895 bp, desse modo sugerindo que os níveis da deleção são inferiores a 2%~5% (resultados não mostrados). Em consequência, com base no trabalho anterior com a deleção comum, é improvável que 133 os níveis da deleção de 3895 bp nas amostras de pacientes causem qualq uer efeito funcione il em toda a derme ou epiderme, se bem que não possar π ser excluídos pequenos efeitos focais.

Mecanismo putativo

Foi previamente sugerido que o mecanismo da geração da defeção comum envolve um evento de recorabinaçao rntragenómica via emparelhamento defeituoso devido a escorregamento filamentar, e pode ocorrer nas sequências de DNA de repetição de 13 bp que flanqueiam a defeção comum (Schon et al., 1989; Shoffner ei al., 1989; Mi ta et al., 1990; Degoul ei al ., 1001) . Uma vez que a defeção de 3895 bp é flanqueada por repetições de 12 bp, a sua geração pode ocorrer por um mecanismo semelhante. O mecanismo da geração da defeção comum, propõe que as repetições de 13 bp são susceptíveis a flexão do DNA, desse modo permitindo a abertura de uma pequena região ou "bolha" de DNA de fientaçâo 5.1 mpl ,ο o (Sebo; a et ai., 1989Ί . Os presentes l. ta d. os su gei :em que UVR i :>ode ser um i factor que contribuí a geraç ãe da dei l.eçâo de 3895 ; ap. 0 mecanismo pode ocorrer de modo a afectar directa ou indirectamente os sítios estruturalmente frágeis das repetições de 12 bp por aoe.rr.ura de uma "bo.Í..ha * de íj^v. o.e fil.amentaçao simp.!..es, que iria reforçar o evento de recombinacão.

Conclusões

Em resumo, o presente exemplo mostrou que a frequência de um rntDNA de 3895 bp raramente relatado é significativamente diferente entre sítios do corpo "habítuaimente” versus "ocasionalmente" expostos ao sol quando ao ar livre. A investigação da deleção de 3895 bp nas mesmas amostras de NMSC utilizadas num estudo anterior ca delecão comum de 134 4 9 ν 7 bp revelou uma frequência comparativamente maior da ocorrência da defeção de 3895 bp. Adicionalmente, a ligação entre a etiologia da defeção de 3895 bp com o componente UVR da luz solar foi estabelecida por indução da defeção de 3895 bp in vitro com doses subletais repetidas de uma fonte de luz UVA é UVB, A frequência da defeção de 3895 bp em pele humana proporciona um biomarcador potencial de exposição UV cumulativa em pele humana e pode, por sua vez, proporcionar uma ferramenta de detenção precoce de desenvolvimento de NMSC, bem como proporcionar um método de monitorização da segurança a longo prazo de regimes clínicos de fototerapia com UV.

Exemplo 14: Análise por PCR. em tempo real da deleção de DM& mitocondríal 3895 em MMSC e soa utilização como marcador quantitativo de exposição à luz solar em pele humana

Materiais e métodos

Amostras de Pele Humana

Amostras de pele perilesionai tumoral e correspondente foram recolhidas, com consentimento informado, de pacientes submetidos a excisão de um NMSC, nomeadamente Carcinoma de Células Basais (BCC) (n - 5, intervalo de idades 55-89 anos, média 78 anos) ou um Carcinoma de Células Escamosas (SCO) (n = 5, intervalo de idades 70-87 anos, média 78 anos) na Clínica de Consulta Externa, Royai Viotora Infirmary, Newcastie, R.U. Para os estudos de exposição solar, pele perilesional clinicamente normal foi recolhida cie sítios do corpo "habitualmente” expostos ao sol quando ao ar livre (como couro cabeludo, face, pescoço e orelhas) (epiderme n - 30, derme n - 30, idade média ± EPM - 70,45 i 2,161) e sítios do corpo "ocasionaimente" expostos ao sol 135 (ombros, costas e peito) (epiderme n ~ 22, derme n - 22, idade média ± EPM = 63,77 ± 3,501}. Não havia diferenças de idade significativas entre os grupos habitualmente e ocasionalmente expostos ao sol (p ^ 0,1134): teste t de duas caudas (correcção de Welch). Para todas as amostras de PSf p0r il Θ S. lona 1.' 3. epid ierme í ; derme foram separac ias Utl lizand .O di spase 0 ,25 t a i°C du rante a noite (Durham Q L ãl . , 200 3) e e xtro ÀÍU- - s e DNA u tilizand o um estojo de ext racçao de teci dos DNeasy Oci y j-ci. gen. Nen hum dos pacient _ Θ S uti 1 izad.o 3 pa ra e ste est :.udo tinha um mtDNA defeituoso.

Análise de PCR A PCR foi realizada numa reacoão de 25 uL contendo 200 ng de DNA genórai .00, cada "r )rimer" 600 n M, dNT : P c ' ... 10 ; μΜ, 0 } Ό u./ r eacção de d: NA pol: i.mer ase Am.pl ita q G( sld ( Appl.í ed Ei 0 Systems), t amp ao Gene/ imp (contendo Tr i s - HC :.l 1 . 'J \j mM, PH O W ) 3 , KCI 500 : niM, MgCl 15 mM. e 0,01% í p/v ) d ,p gel. ati na) . f \ cy V,' O "u h-1 rimers" de PCR L404 e \ 14 6 / 6 (Tabela 9 ! O í-"' íg ura 10 ) for am. n q n cabidos pa ira hibridiz : a r fora ca dei eçã •-Λ de c > 9 5 bp. Du r ante a am] sli f io í ϊ |\j íi O t mpo ci. .irto (30 3) de ex t ensão de pol: imerase não permitiu s : ampiif a. C 3 ção GG pr O dutos cie PCR de tipe .) selvagem. peri ait. η το do somente a am P J. 1. Γ 1. Gci.Çci.0 dos f ragmeni tos de mtDNA mer iores 0 , del etade As condições de PCR foram S4°C dur ant 10 m.inut • rh o , ·./ k.. f 35 / 1 -j / 1 los de 3' i°C durante 3( ) segundo ‘ 3 f Γ-' f' O O G' ura nte 30 segundos, 72°C durante 30 segundos, e uma extensão final de 7 minutos a 72°C, Os produtos de amplificação foram visualizados num gel de agarose 1% corado com brometo de etídio (0,25 pg por mL) .

Este procedimento foi melhorado duas vezes, primeiramente utilizando Deep Vent (New England Biolabs) e depois uma melhoria adicional da sensibilidade utilizando Faststart 136

Taq da Roche. Isto permitiu passar da medição da deteção em amostras expostas ao sol de pacientes envelhecidos para conseguir medir a deleçâo em pacientes jovens.

Análises de PCR em, Tempo Real

Estabeleceu-se um ensaio TaqMan-PCR fiável para a quantificação da deleçâo de 3895 bp. 0 método TaqMan-PCR quantitativo proporciona a medição em tempo real da entrada ai vo na forma de acumulaç; ão por PCR através de i ama sonda et iquetada dual . A sonda híbridiza entre "primers" directos e reversos e é clivada pele 3 actividade de 5'-3' ex onuclease de pofímerase Taq durante a fase de extensão de PCR. Em co nsequência, o corante repórter 5 1 -terminal FAM (6- carboxifluoresceina) ou VIC e o corante inibidor 3'-terminal TAMPA (6-carboxi-N,N,N',Ν'-tetrametilrodamina) ligados à sonda são separados, originando emissão de fluorescência do corante repórter . A própria sonda nãi —- >7> capaz de actu.í ir como "prim er” porca ;.e está bloqueada do 1 a do 3'-terminal c om um grupo Ϋ --Λ C f p f /“·, . 0 método empre ga uma sonda padrão interna (Sorn da 15 f T a bela. 1 e Figura i n ^ U' / na região do cif ocrorno b do genoma í (Koch et ai., 200] L) p ara estimar o número total de cópias para o mtDNA (isto é, deletado e de tipo selvagem). 0 nivel da deleçâo de 3895 bp é determinado ; por uma soi ida (sonda 33 95, Tabela 9 e .“.igura 10) que abrang e o ponto de ruptu ra da deleçâo, as segurando que só é amo. li ficada s e a deleçâo estiver presente. A quantificação do nível da deleçâo é determi: nado por comparação da razão entre o padrão interno e a deteção de 3895 bp.

Re a 1 i. z a r am s e triplicados de reacções de mtb reacçôes de amplificação na forma de 25 pL numa microplaca de 96 cavidades. As 3Ά total e mtDNA deletado foram amplificadas 137 137 ng de DHA, IX primer " padr áo 10) e sonda IS 300 nM (3895F Λ em tubos separados, cada um contendo 100 TaqMan Universal MasterMix (ABI), cada ” interno 300 nM (ISF e ISR, Tabela 9 e Figura 100 nM, ou cada "primer" da deleção 3895 bp 389 5R, T abe la 9) e sonda 3895 100 nM (Í ;mgura 10) . A aná lise de PCR 0 fi uorescência for reaiizadi s Utii ízando um A3I Pri sm 7 0 0 0 (Applied Bi< ssystems, R.U. ) . As condi ções ri r\ 1 clC amp lific cl Çá a foram as : segui 11 L Θ .8 · ri minuto s a 5 o°c, 10 min utos a 9 bL' C seguido de 5 40 i ziclos de 15 seg undos a 95 0 C r* é o sinal repórter alvo saror pa i-’ a a rerere sócia pas s iva, um cora i.nte ncl ui GO da r ea cção TacMa: „ Δ R r; ò. definido como a ntr e : RR (Rn c :3e um, a r eacçã .o conter ido todos 0 3 ncl .ui ndo o mede) ίο) 0 e ^ d ir, de um Γ' ontre d. O (!) n j n *] o onde é de , f- (Ώ r< ta do pel a pri meii .a VG: Z um. a ti sti ca mente signí f i C. ativo de έ den omína GO te (' Ct' v a c ; * b sir lai s de f luore scên oi ..a sao considerados significativos se a intensidade da fluorescência exceder 10 vezes do desvio padrão do valor Rn do fundo, para definir um limite. O método de PCR em tempo real é novo e não roí anteríormente publicado. O método tem sensibilidade aumentada e permite quantificação, em comparação com PCR padrão semi-quantitatívo. Este tipo de deteoção específica de pontos de ruptura é a mesma técnica utilizada para a detecçâo prostática e é nova. Mostrámos que é útil na detecçâo de rearranjos raitocondriais específicos de cancro da próstata e exposição solar, mas também pode ser utilizada para a detecçâo de outros rearranjos. A ” rqura 1.0 mostra a sondas TaqManf e é uma ocalízaçãc de "primers" epresentação esquemática de PCR e do genoma 138 de mtDNA contendo a deleçâo de 3895 bp. Os "primers" ISF/ISR e a sonda IS hibridizam para mtDKA de tipo selvagem e detetado. A detenção da deleçâo de 3895 bp foi efectuada 138 tom 'Drimers" 3895F./3895R e sonda 3693 sonda 58 85 específica só hibridiza para mtDNA deletado, pois liga-se através da junção da deleçâo. Adicionalmente, a ocorrência da deleçâo de 3895 bp reúne os "primers” específicos para a deleçâo (isto é, 3895F:3895R e L404:H4676) de modo suficientemente próximo para permitir a geração de um produto de amplificação nas condi coes dadas de PCR.

Clonagem TOPO TA A clonagem. da região de controlo C.\ da deleçâo ^ P Q R -f- r\ i efectuada util ízando um Estojo d< e clonagem TOPO TA (Invitrogen, R .U .} de acordo c om. as instru ções dos fabricantes. A clonagem Tí 5PO TA tira partido da a ictividade de transferese terminal i são depen dente do modei o da Taq polimerase, que adiciona uma única d esoxiadenosi: 13. (A} 3.3 extremidades 3' de produt :os de pc: R. 0 vector li nearizado fornecido com o estojo tem um único resíduo pendente 3’ desoxi itimidí na. (r; ?), que pe: ;:mite a ligação í sficiente entre produt to de P CR e o vector. A prese nça de ur na inserção com. dimensão correcta foi confirmada por análise de fragmentos de restrição EcoP.l no vector pCRá-TOPO.

Resultados

Estabelecimento de um ensaio de PCR em Tempo Real Quantitativo para a Deleçâo de 3895 bp aenoma mitocc

detei tminar aue era possível detectar Θ de mi odo fiável a percentagem de cópias do ondri; il albergando a deleçâo de mtDNA de 38 95 l“u0 C i linearidade das duas re accões de P CR 139 utilizando a sonda de padrão inte: rno (8 OflClcl IS) ou a sonda da deieção 3 8 S 5 (sonda 3895) n .uma g ama larga de concentrações do mo delo. Em ambos os casos, DNA modelo roí gerado por cl onagem do proouto ae PCR apropr lado num vector de cionagem (ver m étodos), A con ceni tração de cada modelo foi determinada cor via fiuorométric

d'RT R. U .) efeetuaram-se amplificações por PCR em tempo real ando e ntre 50 ng e 50 pg de DNA , modelo para c< ada (Figu ra 11) . A u elação entre o valor CT e a 0. T. 3 Ç â 0 do modelo foi linear para a. deieção de 3895 bp (r 0,9952) e p8 .dr áo i nterno (r ::: 0,9911), i ..Cl onalmente, 0 gra diente pa: ::a a amp.1. ificação oe cada mcdel i.o fo i o mesmo. I s T” o confirma qu p cada modelo é araplificac lo co m o mesmo gr au de efícíê no: 8 , Em. resultado. os valore s cr podem ser consequentemente utilizados como medida do DNA modelo e para quantificar a quantidade relativa entre a defeção de 3895 bp e mtDNA de tipo selvagem, A capacidade destas curvas padrão para prever com rigor a razão entre mtDNA deletado:de tipo selvagem foi confirmada utilizando uma gama das misturas de modelo clonado deletado:de tipo selvagem (resultados não mostrados). A Figura 11 mostra a sensibilidade de PCR em Tempo Real para o número de cópias do modelo, Apresentam-se o cicio limite (isto é, CT, eixo vertical ! "i p 3.8 3 C O 8 ϋ 0 Π i. rações decresc entes de Dl NA modelo (gama de cií. Luições desde 1/10- 1/10000 de lug/ ''ul de modelo) ou a. deli o de 3895 bo (A) ou 0 8 d T. 3 O interno Pav_. tipo se.lv agem! (B) , .03.8 uma relação linear entre a concentração do modelo e o número de ciclos limite (C?) para ambas as amplificações. Cada número representa a média ± DP para três observações independentes,

Quantificação da Defeção de 3395 bo em Tumores 140

Determinou-se o nível da deleção de 369b bp em NMSC e derme e epiderme perilesionais histologicamente normais por PCR taqman em tempo real e um ensaio de PCR padrão previamente est ab ele cid· 0 (Fi .gura 12) . Ver: Lficou-sí ; qu· •Ç\ 03 níve: ] 0; da dei ;'-ι Γ< V ciO d.·” 3895 bp quanti fica dos por PCR em tempo r eal con CO rda vara gene ricarr lente c om c ·, íZj C; trmr idos F 'ela , análi O A'· O ·_ de PCR P adr ao : náo q· uanti tativa A F rg ura .pi mo s t ra a quanti .fiem Lção por PCR Θ m te: mpo r ea a p amp li f i c ação ρo a PCR padrão da de.lt ?.ção 389 em tumor >7> c; ao apr· ;ti C· ent a 1. géis de a .garose eoi :ados C 0 í t br· 'Λ 7 teto de e ί í d. io que m .-“N C: Ί” ram a in< cidên cia da a c.. ί e ç a o de 3895 l )P em tumor (T) e derme (E) e epiderme (E) perilesionais histologicamente normais de BCCs e SCCs. Por baixo de cada via apresenta-se o nível da deieçào de 3895 bp ilustrada em percentagem em cada amostra, quantificado por PCR taqman em tempo real, As amostras marcadas com "ND" são determinadas como sendo c ^ r ·-' f pois 0 CT do PCR em 0 0' Tlp0 γ í n 3.1 fo 11. > 36, que é O ní V el observa pj rr\ n v.n ] q 3Θ m mode( 10 < V 'ia 1 em todos os pa nêi s :::: ma: coadores de pe so molecu lar (Ripei OTLâ I coador de 05 m anb o escal i.onado IV - í nte rva.lo 1000- -100 bp, Bi.olí ne T,r d ' r Londres , R.U,) . A ca d, a. :e eacção de pf :::r fo A. 3. ' diciona 03 a mesma ouantidade de DNA modelo. 0 padrão simp.I es de ocorrência da deleção de 3i 395 bp em BCCs foi geral .mente semelhante ao observado em SCCs. Em BCCs e BCCs, a deleção estava ρ v-030p. te em 3 de 5 P a c i. Θ r.i 0 s (apesar de não ser nos mesmos pacientes) , Na pele perilesional, a presença da deleção foi mais frequente na derme (4 de 5 para BCCs, 3 de 5 para SCCs) em comparação com a epiderme (2 de 5 BCCs e 1 de 5 SSCs) , No entanto, apesar de o número absoluto de amostras ser pequeno, há diferenças entre os resultados de BCC e SCC quando se 141 considera o nível real da deleção em vez do seu simples padrão de ocorrência. Por exemplo, para aquelas amostras onde a deleção estava presente era tumor e derme perilesional, o nível da deleção foi maior na derme para pacientes com SCC, ao passo que o inverso tendeu a ser verdade para os pacientes com BCG. Adicionalmente, roí interessante observar que amostras de BCC recolhidas de 2 áreas distintas da face exibiram níveis da deleção vastamente diferentes (isto é, 7,14% versus 0,02%), o que pode reflectir uma variação no grau de exposição solar cumulativa. Foi decidido investigar adicionalmente este aspecto por determinação do nível, em oposição ao padrão de ocorrência, da deleção num subconjunto relativamente grande de amostras perílesionais histologícamente normais recolhidas de diferentes sítios do corpo expostos ao sol.

Quantificação da deleção de 3895 bp num subconjunto maior de amostras de pele perilesional histologicamente normal recolhidas de diferentes sítios do corpo expostos ao sol

Escolheu-se pele perilesional histologicamente normal, em vez de amostras tunio.ra.is, de modo a evitar confundir factores que não o sitio da exposição solar cumulativa. Utilizando PCB taqman em. tempo real quantitativa, examinou-se o nível da deleção de 3895 bp em 104 amostras de pele humana separadas de idades correspondentes recolhidas de vários sítios expostos ao sol, definidos como habitual.rn.ente expostos ín = 60) e ocasionalmente expostos (n - 44) quando ao ar livre. A Figura 13 mostra um exemplo típico de um gel de agarose corado com brometo de etídio do produto de amplificação de 3895 bp e o nível correspondente da deleção de 3895 bp, detectado por PCR em tempo real em três pares de amostras habitualmente e ocasionalmente expostas ao sol. 142 A Figura 13 mostra a quantificação por PCR em tempo real e amplificação por PCR padrão da deleção 3895 em géis de agarose com brometo de etidio representativos de habitualmente exposto ao sol e ocasionalmente exposto ao sol, mostrando exemplos típicos do seu nivel correspondente da deleç ião 3 8 9 5 , detectado por P CR em ten ipo real de tr és Pci r es d< t c imo stn ias habítualmente expcsi ias ao sol ιΤΓ> tr 3 3 pcl r es de ar nostr as ocasionalmente expost 3.3 ao sol. o niv el da deleç âo esta representado em pr arcenta gerr Via 1 em amb os os painé is :::: marcadores de peso mc ilecula r ( Hipermar cad íor de Lc m anho •r> o. calon a do iv - intervc rio 101 30- 100 bp, Bi o 11 ne Lt d ,, Lo ndr ;esf í l.U.). A cada reac ção de PC R foi ad icl .ona da a mesma quantidade de DNA modelo. 0 controlo positivo em ambos os psiní -j c· ·γ> o DNA tumorai de onde 5 0 produto de PCB. foi clonado e sequ .enciado para produzir o n rodeio para PCR em tempo real. Uma comparação dos níveis da deleção de 3895 bp detectados por PCR em tempo real com os detectados por PCR padrão mostra de novo uma boa correlação entre as duas técnicas,

Consequente mente, de i c í diu-s e analisar todas as amostras uti1izando o ensaio de PCR em Tempo Re a 1 qua n111 a t ivo. 0 s resultados desta a n a 1 i s e m o s t r a r an claramente uma incidência aumentada ô.S. CÍe J. Θ Çd.0 ΟΘ ò 0 ^ )5 bp com exposição solar crescente. A Figura 14 é um gráfico de dispersão que mostra a quantificação da deleção de 38 95 bp em pele habítualmente exposta ao sol e ocasionalmente exposta ao sol. Os níveis da deleção de 3895 bp estão expressos em percentagem era derme e epiderme habitualmente expostas ao sol e ocasionalmente expostas ao sol, determinada por PCR taqman em tempo real. 0 nivel médio de deleção está indicado por uma linha horizontal para cada conjunto de amoscras. 143 Επί termos específicos, a análise de PCR sra Tempo Real quantitativa revelou um nível significativamenue maior aa deleçâo nas amostras habitualmente expostas ao sol em comparação com as amestras ocasionalmente expostas ao sol íp = 0,0009 para derme, p = 0,008 para epiderme; reste r de duas caudas). É interessante notar que as amostras de derme albergaram uma frequência maior da deleçâo do que a epiderme ;p = 0,0143 ocasionalmente exposta ao sol, p -0,0007 habitualmente exposta ao sol). Uma vez que as medias de idades, razões entre sexos e tipo de tumor de onae xoi recolhida a pele perilesionai foram muito semexftantes entre os grupos hab.ituslm.ente exposto ao sol e ocasionaimente exposto (ver métodos), é improvável que as descobertas sejam confundidas por estes factores.

Tabela 3

Nome C orante Posição Sequência •SF 5684246888 ff-GATTTS GGT AAC ACC CM GTATT6-3' SEQID HO: 148 SR w-m αττ μ éãr qgc im cm seq ® «· ^ Sonda Vis r- CAC COA TOA AOAASC SCT ATS TAT 'TO &TA CMtrmm iÒ m m 3S3SF .-iti-sas S'GAA CCGTCG CCC ATC CTA-â SEQ B fB: 5S1 38858 4518-4488 w-oor scã aas Am sm sas tas mg aoggeq sonda SSâS Fsm S£?s?44S3 SvracrAACCCCATACCCCGAMAmnSG-dTsi?nraSK3ÍDSG:ÍSS 4C4-âg3 r ctt tts sce gta rnc act rr seo id m i H467S 4ê7S-4SS? r GATTATSGAiaS <3GT TISCTT SJ SEQ S ífô: 548

Exemplo 15: Confirmação do teste de biopsia

Amostras de biopsias do núcleo com agulha previamente nâo usadas foram recuperadas dos arquivos de cancro da próstata: 62 benignas, 49 malignas, 30 biopsias próximas de tumor mas ainda não contendo células malignas. Globalmente foram, analisadas 141 amostras totais, bem como 7 amostras adicionais, 6 para a geração da curva padrão e 1 controlo 144 negativo (contaminação reagente/reacção) . Os ensaios completos foram repetidos três vezes, uma vez cada um por três indivíduos indeoendentes. A Rede Reural Artificial (ANN) foi carregada de forma cega com amostras benignas adjacentes ou próximas de um tumor. Adicionalmente, também se incluíram algumas amostras determinadas como sendo distais ao tumor (mapeadas para esta localização após prostatectomia). 0 resultado foi que tecido "normal" próximo do tumor tinha uma frequência ele vada da deleç ã o de 3, 4 ma 1 ígno vizinho, f ío enta .nto, ass inatu ra benígn a (Ei· gura con firma r malignidade com ba uma loc perto de inv estigaçàc da de ieçâo de 3, alt erações molecu lares em ] del eçâo) e que pre cedem alter no tecido. Assim, uma r; par a um. pat.oiog.is' t.3. pod. c.\ ,c; T·.; C» κΛ por obse rvação vis uai po· de te na via p cl 1Γ 3 3 ΓΠ c i lianid .3 de * com pl.eme nto para s ]. Ρ1Γ30-1 .ca ch kb, consistente cora tecido benigno distai reteve a sua .5). Este teste conseguirá em tecido normal obtido de «n tumor, e baseia-se na kb. Foi mostrado que ocorrem A mitocondrial (isto é, a ;ões morfológicas detectáveis ie tecido de uma amostra que entar ser normal, ou benigna começado a acumular mutações sta capacidade é um grande nica existente de biopsia da próstata e diaonóstico histolóoico efectuado por um patol ogi sta. A utri u.zacão do teste de PSA p '303 rast cancr 03 prósta ta or.iq.in a um grande X) jmero ρ T. 0 0 Θ dim .entos de foi· opsia, um. vai .or estima d 0 de 7 0 83 i. b 3 e m ex: ibir c fé lulas mal . ignas. E 8 L 3 3 l „).i 00 ) S 1.3 S dragn pX Cf 4“ -1.03 d. 3; s como benign 3 s e podem ser divic :ida s em categ or.i 3 3 l benígn; 33 V0] :dadeiros, isto é, 3 em t prese nte 33 p.' róstatô i.f e be. nignos fals os, com tf muoz : pres de sac na próstata mas em que o procedimento de biopsia com agulha não conseguiu efectuar a amostragem da malignidade. Por 145 ince rmédio d1 e testes r uoIgcu lares do tecido b enigno é poss ivel so s s ;egar os in dividi: io 3 da ca: tegoria de benignos verd adeiro 8 C ie que sáo, de f acto, ben iignos, de modo que pode m ser d íix guidos meno is de perto 003 m menos Ol : nenhuns proc edimentos de biopsia de se guimer i L.0 f ou prop >orc ionar uma de te C C o' 0 ] ire: zoce de um. a mal ignids ;de que es; tá a cau 8 d. lí sint ornas m lCÍ. S que ainda i ião é detec táve 1 peio pro oedime nto de b íopsía , i'1 egando a ne cessidade d e urr \a bioos ia adicio nal para dia gnó stico e propo rcions indo ao méd ico uma opor tunída 8Θ de comet ^ d .0 raai s ρ c.\ r j.o um c ratame nto prov avelme nte ma is ef icaz do paci .ente. Est ste proporcionará tranquilidade e confirmação da presente análise de biopsia que é manchada por números elevados de diagnósticos de negativos falsos.

Exemplo 16: Mapeamento de Tumores da Próstata

Um resultado potencial adicional da investigação conduzida para a descoberta de marcadores de comportamento tumoral é a capacidade de proporcionar um modelo tridimensional da localização do tumor na próstata com. base nos espécimes de biopsia com agulha em sextante. A capacidade da deleção de 3,4 kb para reflectir a presença de malignidade em tecido será critic.: a para este proced.im.ent o de mapa pode i proporcionar ao urologia 0.8 Θ delo virtual do tumor da próstata e pode auxiliar decisões de tratamento. l?aireréksciâs

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Xu et a 7 - « t Na L i art 2 Genet o j CN 1 : Ιΐ'5-lvS, 1998 Yam .agu chi ΚΪ, Θ t ' ai ,, Free Rã dicãl Res, Comirnu n. 16(3): 1 31 -L w / - 74, 1992 V a j / ;-i ei ai „, Oi icogene Jo urnal, 19: 2 0 6 0 - 2066, 200 0 Y ►Th f! Θ L cl 0 > !í t\ q p depender :t 1 6 kb dele tion i n human ]. ive r rfiit och ondí ria 1 DNi \ F? . Bioch e.m. int. 26, 4 57- 4 68 1992 Y ►Th f; et 3 i * Ϊ! :Agei ng -assoei . VA ;d. 5kb del etion : in human live r mit. och ondr ial DMA * ; Bi och em. Biophys. Res. Corrnon., 178 / 124 -13 1 19 91 Zev íani 11, et 3 1 . Ar v> 7 u IL , 1J , At um. Genet. 41 h 904- 914, 1990 Zha ng ei i si,, "Muitiple m íto chondrral DNA deletions .1 Π 3. n eld erl y rru man ind: í V i.dual", FR BS Lett, 2 :S7, 34 38 1992 Zha ng, C ^ ! et a 1., li ioChem. B í oPhy.s. Res ?, Comu n., 195: 1104 : '1 : o, 19 9 3 Zha Po e t a 1., ' ’’ h 1 vi vo fil tering of 7 π γη f ro MyoD t. arge t dat a: A ΤΊ approa ch for id.€ antificati on of biologi ca 11. V J. yp 1 nt ηοΊ cei d ownstream tci.ircie L-S of transcri ptíon fac tor O f "Cc napte s Eendus Bí oloaies", Volume : 326, Edíçõe 3 10~ 11, Outubr 0~NCv /er abro de 2003, página ί s 104 9 “1.065,

Lisboa, 11 de Janeiro de 2011

Claims (9)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Método para detectar uma deleção abrangendo aproximadamente os nucleótidos 10744 até 14124 do genoma do mtDNA humano, em que a referida deleção está associada a cancro da próstata, num sujeito com mtDNA, que compreende: (a) proporcionar uma amostra biológica obtida do sujeito, e (b) detectar a presença da deleção no mtDNA.

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Figura 3/15

Figura 3 4/15

Figura 5/15 Concepção de "Primers" para Deleção de 3,4 kb

" PRIMER" FIHA1: TAGACTAC6'TACATACTAACCCTACT-CCTA Figura 5 6/15 C{*>

Figura 6 7/15

ti u g Ή h 8/15 0 Habituaisients Espontas ao Sol

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Ιίνί,ϊ-vSHWSt.Í! (HNtSÍWtaííiWní.í' ««ÍU talwrftl* expostas Expostas Ejfpestas *0 Sal a« Sõt *1*5 Sol Figura Sí 9/15

Figurai: 10/15 Deleção de 3895 hp Λ// «feSRft fâF / / .// // A / »«F / S7/ Sonda 3895 AÀ // mm^ 1' I .# Sonda IS mm nrfOMA V / / Figura 1Q 11/15 ΑΓ 3695 FamíTaffiía ιο,οο $5/5» ·| %sfm -1S,0» - s,a» -ie,s» --· ί Ίφ 180 ÍSOQ y*1,*6Uís}+ 2,6131 | ##¢:9882 \ |...................... t............. ί«8Φβ 109090 100.9099 | Tipo selvagem vWsmra 30;oo ] 25.0020.00 ts,eo ío,eo soo f0,00 y = 't/KStkftíxj * S,S09y 8γ®0$·Η1 19 iso 1990 íímwb iseaoe 1000000 Figura y A) 8CCs 12/15 Pacientei Paciente^ FacienteS Faciente# Paciente®· T T 0 È T Ώ E T 0 Ê T D £ TOE

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PacientelQ τ ο e

2. Método da reivindicação 1, em que a deleção tem aproximadamente 3379 bp.

3. Método da reivindicação 1, em que a deleção compreende substancialmente genes que codificam a subunidade da NADH desidrogenase 4L, subunidade da NADH desidrogenase 4, subunidade da NADH desidrogenase 5, tRNA histidina, tRNA serina2 e tRNA leucina2.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o passo de detecção da presença da deleção no mtDNA compreende análise de PCR seleccionada do grupo que consiste em análise de PCR especifica para deleções, análise de PCR radioactiva, PCR quantitativa e análise de PCR em tempo real.

5¾ V» P* l* ** <9 Cs -w -jv O O s» o e ç s? éf ο ο ο1 o '5 SI s: *3 ε Figura jjí 13/15 A| Hahitualmeiite Expostas ao Sol

S) Dcasionalmeiite Expostas ao Sol

5. Método de acordo com a reivindicação 4, em que a análise de PCR é PCR quantitativa compreendendo a utilização de uma DNA polimerase Taq recombinante e termicamente estável.

6. Utilização de uma série para diagnóstico de cancro da próstata, em que a série compreende uma pluralidade de membros de ácidos nucleicos e um substrato sólido, em que 2 um dos membros de ácidos nucleicos está associado a uma deleção aproximadamente nos nucleótidos 10744 até 14124 do genoma do mtDNA humano, em que o membro de ácido nucleico tem uma posição única na referida série e está associado de modo estável ao substrato sólido.

7. Utilização de uma deleção de mtDNA abrangendo aproximadamente os nucleótidos 10744 até 14124 do genoma do mtDNA humano como biomarcador de cancro da próstata.

8. Utilização da reivindicação 7, em que a deleção tem aproximadamente 3379 bp.

9. Utilização da reivindicação 7, em que a deleção é detectada em tecido maligno, tecido benigno adjacente, tecido benigno distante, lesões precursoras, fluido de massagem prostática, urina, urina pós-DRE ou sangue, num sujeito com cancro da próstata ou em progressão para cancro da próstata ou um sujeito sem cancro da próstata.

10. Método de mapeamento tridimensional de tumor da próstata, que compreende: (a) proporciona uma amostra obtida de amostras de biopsia com agulha em sextante, e (b) detectar a ausência ou presença de uma deleção abrangendo aproximadamente os nucleótidos 10744 até 14124 do genoma do mtDNA humano em cada uma das amostras em sextante.

11. Utilização de um estojo para detectar uma deleção de mtDNA associada a cancro da próstata, em que o estojo compreende uma série incluindo um membro de ácido nucleico associado a uma deleção aproximadamente nos nucleótidos 3 10744 até 14124 do genoma do mtDNA humano e pelo menos um membro seleccionado do grupo que consiste nos seguintes: um "chip" descartável, meios para segurar do "chip" descartável, meios de extracção de mtDNA, "primers", reagentes e instruções.

12. Método de acordo com a reivindicação 4, em que um "primer" de PCR com uma sequência correspondente à SEQ ID NO: 139 é utilizado como "primer" directo.

13. Método da reivindicação 1, em que o método é utilizado para detectar cancro da próstata, uma predisposição para cancro da próstata ou a progressão de cancro da próstata.

14. Utilização de um estojo para detectar uma deleção de mtDNA associada a cancro da próstata, em que o estojo compreende: (a) um tampão, e (b) um "primer" com uma sequência correspondente à SEQ ID NO: 139. Lisboa, 11 de Janeiro de 2011 1/15 Espectro de Mutações de Cancro da Próstata

*9 © «Ϊ o tís ÊS ?*í o o O © f" o o θ' 0" o" o FiguraQ 14/15 Lfigfó. D eX e ç a.·:· 3 S 9 5

HaLitualmente Ocasionalm-ente Halitualmente Εκρόsta ao Sol (D) Eitpos ta ao Sol (D) Eitpos ta ao Sol (E) Ocasionalm-ente Euposta ao Sol (E) Figura 14 15/15

Figura 15