JP2008536496A - 日光曝露、前立腺癌および他の癌の検出用の診断ツールとしての、ミトコンドリアの突然変異および再配置 - Google Patents
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Abstract
Description
ミトコンドリアゲノムは、コンパクトながらも極めて重要な核酸の配列である。ミトコンドリアゲノムは、細胞呼吸に必要な酵素サブユニットをコードする。ミトコンドリアDNA、すなわち「mtDNA」は16,569塩基対(bp)の核酸の微小なゲノムであり( Anderson ら, 1981; Andrews ら, 1999)、これは33億bpの巨大な核ゲノムと対照的である。その遺伝性の実体物は、核にある細胞中の対比物のそれと比較して桁外れに小さい(0.0005%)。しかし、個々の細胞は、具体的な細胞性機能に応じて103〜104個のミトコンドリアを有する(Singh and Modica-Napolitano 2002)。核とミトコンドリアのゲノム間では、情報伝達または化学的シグナル伝達がルーチンに行われる(Sherratt ら, 1997)。その上、特定の核成分が、ミトコンドリア配列の維持と完全性に関与する(Croteau ら, 1999)。こうした核のエリアが潜在的疾患の兆候である核再配置により非機能的になると、mtDNA配列に突然変異が出現し始める。さらに、特定のミトコンドリアは、ミトコンドリアゲノム中の体細胞変異により促進される欠失による細胞内破壊ゆえに同定されうる。この理論的機構は迫り来る疾患の指標としての役割も果たしうる。1つのミトコンドリアを形成するのに約3,000個の遺伝子が必要であるが、このうち37個のみミトコンドリアゲノムによりコードされ、このことはミトコンドリアの核遺伝子座に対する強い依存を示す(Naviaux, 1997)。
MtDNA配列ダイナミクスは重要な診断ツールである。mtDNA中の突然変異は、多くの場合に疾患発症の予備的指標であり、多くの場合に核の突然変異と関連しており、疾患に特に関連するバイオマーカーとして振る舞うが、そうした疾患としては次のものが挙げられるがこれらに限らない。すなわち、喫煙および副流煙への曝露からの組織損傷および癌 (Lee ら, 1998; Wei, 1998); 20歳前後から始まりその後増大するミトコンドリアゲノム突然変異の蓄積に基づく長寿 (von Wurmb, 1998)、突然変異または発癌性物質、変異原性物質、紫外線放射への曝露により引き起こされる転移性疾患 (Birch-Machin, 2000)、変形性関節症; 心血管疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病 (Shoffner ら, 1993; Sherratt ら, 1997;Zhangら, 1998)、老化に伴う聴力損失(Seidman ら, 1997)、視神経変性および不整脈 (Brown ら, 1997; Wallaceら, 1988)、慢性進行性外眼眼球突出性眼筋麻痺(chronic progressive external exophthalmoplegia)(Taniikeら, 1992)、アテローム硬化症 (Boglioloら, 1999)、甲状腺乳頭状癌および甲状腺腫瘍(Yehら, 2000); およびその他の疾患(例えばNaviaux, 1997; Chinnery and Turnbull, 1999;)。
ヒト非黒色腫皮膚癌(NMSC)は多くの白人集団において最もありふれた癌である (Weinstock, 1998; Rees, 1998)。こうした腫瘍の大部分は基底細胞癌(BCC)および扁平上皮癌(SCC)である。BCCは局所浸潤性であり、著しい病的状態を引き起こしうるが転移は希である。SCCは有意な転移能を示し、免疫抑制患者における多数のNMSCの発生は重大な疾患管理問題を引き起こす(Rees, 1998)。BCCについては臨床的に同定された前悪性病巣は無いものの、一部のSCCは、前駆病巣、すなわち光線角化症(AK)またはボーエン病の領域 (in situ癌腫)(Rees, 1998)から生じると考えられている。
前立腺癌は頻繁に診断される固形癌であり、ほとんどの場合、前立腺上皮を起源とする (Huangら 1999)。1997には、ほぼ1千万人の米国人男性が、前立腺特異的抗原(PSA)(その存在は前立腺癌を示唆する)についてスクリーニングされた(Woodwell, 1999)。実に、このことは、より多くの数の男性が初期直腸指診(DRE)によりスクリーニングされることを示す。同じ年に、3千百万人の男性がDREを受けた(Woodwell, 1999)。その上、合衆国における新たに前立腺癌と診断される年間件数は179,000と推定される(Landisら, 1999)。前立腺癌は、カナダ人男性において2番目に多く診断される癌であり2番目に多い癌死亡率の原因である。1997に前立腺癌は、カナダ人男性の新たに診断される癌の19,800を占めた(28%) (National Cancer Institute of Canada)。四十九歳(49)を超える全ての男性の30%〜40%が何らかの癌性の前立腺細胞を有するものの、こうした男性のわずか20%〜25%が臨床的に顕在化した形態の前立腺癌を有すると推定されている (SpringNet - CE Connection, internet, www.springnet.com/ce/j803a.htm)。前立腺癌は広範な組織学的挙動を示し、それは内因性の(erogenous)および外因性の因子の両方、すなわち社会経済的状況、食事、地理学的、ホルモン失調、家族歴および遺伝的構成に関係する(Konishiら 1997; Haywardら 1998)。
老化は、分子レベルおよび細胞レベルの両方での経時的変化の蓄積からなる。しかしながら、老化プロセスの基礎をなす具体的な分子機構は依然として解明されていない。老化過程を説明する試みにおいて、高齢被験者中のミトコンドリアゲノムが同じ血統由来の若い被験者のゲノムと比較された。老化と関連している1つの欠失は、共通欠失、すなわち4977-bp欠失として知られている。これまで老化研究はこの共通欠失および制御領域における多型に限定されている。こうした突然変異の明確な理解のためには、ゲノム全体を分析する必要がある。Wei, 1992らから編集した他の欠失を表1に示す。
表1は老化に関連する突然変異をまとめたものである。
本発明の一の実施形態においては、mtDNA配列の比較をとおして、老化、日光曝露をモニタリングする、および前立腺癌や非黒色腫皮膚癌のような特定の疾患を診断する方法を提供する。核DNAではなくmtDNAを用いて、前立腺癌のような疾患を診断することにはいくつかの利点がある。第1に、複雑ではないゲノムのmtDNAは、個人レベルおよび集団レベルで容易に理解することができ、そのため正常ゲノムおよび疾患関連ゲノムの大規模mtDNA データベースから、個人診断が極めて正確なものとなる。したがって疾患に関連して、バリエーションが理解できる。第2に、mtDNAは、突然変異率が核DNAよりも10倍高い (Wallace 1992)。予備的疾患を示唆する核の再配置は、迅速にミトコンドリアに伝達され、そこで体細胞変異として現れる。第3に、mtDNAは母性遺伝パターンを有し、すべてのミトコンドリアは同じmtDNA配列から出発するという意味において本質的にクローン性であり、そのためこのクローン状態からの変化は容易に検知される。その上、mtDNAには組換えの有力な証拠がないことから、配列中のあらゆる変更は体細胞性のイベントである。1つのミトコンドリア当たりに多数のミトコンドリアゲノムがある(2〜10コピー)こと、および1つの細胞当たり多数のミトコンドリアがあること(500〜2,000)の結果として、突然変異を有する1つのミトコンドリアはある意味において「劣性」である。その上、ミトコンドリアゲノムは、非常に高いレベルの、損傷ゲノムを有するミトコンドリア(最大90%)に耐えることができる。このことは、残っている野生型mtDNAによる相補を介して起こる (Chomynら 1992)。しかしながら、変異したゲノムは、通常より小さいことから、野生型ゲノムに対して複製的には有利であり(Hayashiら 1991)、そのため変異したmtDNAのクローン性増殖が生じ (Brierleyら 1998)、このことは核遺伝子と異なり、mtDNA突然変異を保有する細胞に対する選択が少ないまたはないことを示唆する。この突然変異率上昇に起因して、mtDNA中に出現する突然変異および/または欠失は、細胞の一生にわたり維持され、種々の変異原性物質に対する曝露の記録として役立ちうる。mtDNAの完全性は、核の修復機構により維持され、こうした遺伝子座における欠陥は、複数のミトコンドリア欠失を伴う常染色体優性疾患をもたらすことが提唱されている(Zevianiら 1990)。結果的に、mtDNAは、種々の癌または他の疾患に関連する初期核イベントの早期警告前哨として機能しうる。最後に、ミトコンドリアゲノムは、個人レベルで、配列決定および突然変異についてモニタリングすることができる。
集団間および集団内バリエーションと比較するが、これには被験者からの非関連組織由来のミトコンドリアDNAとの、または母方の親類からのミトコンドリアDNAとの比較が含まれうる。ミトコンドリアゲノム全体を分析する必要はない。例えば、ミトコンドリアゲノム全体を配列決定する必要はなく、その選択部分だけ配列決定すればよい。したがって、ミトコンドリアDNAのサンプルは診断を提供しうる。
本発明の一の実施形態においては、ミトコンドリアDNA突然変異および再配置(例えば日光曝露の結果としての欠失)の早期検出用システムを提供する。特定の変更、例えば共通欠失、実施例13および14で同定された3895 bp欠失、それに関連する突然変異、およびmtDNA中の未だ特徴付けされていない欠失の発生率は、日光曝露の信頼できるバイオマーカーとして機能しうる。
本発明の好ましい実施形態において、非黒色腫皮膚癌 (NMSC)および黒色腫皮膚癌、ならびに固形癌発生を示唆するそれらの前駆病巣におけるmtDNA変化の早期診断用システムを提供する。特定の変更、例えば共通欠失、実施例13および14で同定された3895 bp欠失、それに関連する突然変異、およびmtDNA中の未だ特徴付けされていない欠失の発生率は日光曝露およびそれに関連する皮膚癌の信頼できるバイオマーカーとして機能しうる。特に非黒色腫皮膚癌は慢性的な生涯にわたる日光曝露と関連している。黒色腫皮膚癌は急性の熱傷症状に、より関連しているようである。ヒトNMSCおよびその前駆病巣におけるmtDNAゲノム全体の突然変異フィンガープリントを決定する。このことからmtDNA変化は、ヒト皮膚癌およびその前駆病巣の早期バイオマーカーとして確立される。次に変性HPLCを使用して、対象の配列について低レベルのヘテロプラズミーを評価することができる。このアプローチはまた、他のヒト腫瘍における早期変化の発達にも洞察をもたらしうる。
本発明の別の実施形態において、前立腺癌診断用のシステムを提供する。mtDNA不全の年齢に関連した蓄積は、個体において、前立腺癌のような中年および高齢の男性に広まっている特定の臨床障害が出現すやすくなる傾向を生じうる。好ましい実施形態において、ルーチンな前立腺癌スクリーニングは、前立腺マッサージ体液からのミトコンドリアゲノム配列決定を介して行われる。癌細胞に形質転換した上皮細胞の存在は、前立腺マッサージ体液由来のmtDNAの増幅を介して判定することができ、これは直腸指診やPSAなどといった現行の診断技術をしのぐものである。最近になってFlissら (2000)は、膀胱癌の患者の尿サンプル中から突然変異mtDNAを同定した。前立腺マッサージ体液における同じ様な検出事項は、前立腺癌用の非侵襲的な早期検出法を提供する。一まとめにした前立腺癌とは対照的に、種々の種類の前立腺癌を診断することができ、また患者における、攻撃的で、急成長する細胞を識別することもできる。例えば、出願人らの教示において同定された3.4 kb欠失は、前立腺癌の指標として使用することができる。
本発明のシステムおよび方法は、癌、特に前立腺癌を、早期段階に、および何らかの組織学的異常が見られる前に、検出するために使用することができる。例えば、本発明のシステムと方法は、前立腺組織における前新形成を検出するために使用することができる。このシステムは前立腺癌の発生と進行を検出するために使用することができる。ヒト前立腺組織または前立腺に関係する体液(例えば前立腺マッサージ体液または尿)由来のミトコンドリアDNA中の、わずかな突然変異および超変異を含む突然変異(Chenら 2002; Chenら 2003)を、新形成の存在のために検査することができ、そして癌転換の追跡、悪性腫瘍の診断または継続する良性状態の確認のために間隔をおいて再検査することができる。
本発明のシステムと方法は、突然変異、例えば4977-bpの「共通欠失」(Liuら 1997)およびミトコンドリアゲノムの他の突然変異の発生率の増加に基づき老化を評価するために使用することができる。この情報は、健康調査データと併せて、同じ突然変異/欠失を生じる別々の原因の間の極めて重要な統計的識別を可能にする。幸いにもmtDNAは、卵子を介して排他的に遺伝し、天然では本質的にクローン性である(Van De Graaff & Fox, 1995)。このことは、複数の世代に渡る母系内の突然変異/欠失の注意深く管理された研究により、信頼できる年齢に相関する欠失頻度の決定を可能にする。この情報は、老化過程を鈍らせる処置方法を開発するために使用することができる。
生物学的サンプルは、どのような既知の手段により収集してもよく、それはmtDNA配列データベースの構築を目的としたものであっても、個体に対して診断検査を行うためのものであってもよい。データベース作製のためのサンプルとしては、腫瘍バンク、同じ母方の血統からの罹患および非罹患個体に関する母方の血統の調査、ならびに高頻度で特定の疾患(例えば限定するものではないが、皮膚および前立腺癌)を有する群または集団からの母方の血統調査、健康状態および老化の評価が挙げられるがこれに限らない。例えば、FTA(登録商標) Gene Cards(登録商標)を用いて生物学的サンプルを収集しアーカイブに保管することができる。適当なサンプルとしては、中皮、上皮または内皮に由来するあらゆる組織または体液が挙げられる。かかる組織および体液としては、血液、唾、口腔細胞、唾液、前立腺マッサージ体液、汗、骨、毛髪、リンパ組織、子宮頸部スメア、胸部吸引物、糞便物、射精物、月経出血、尿および生検組織が挙げられるがこれに限らない。好ましくは、約100 μlの血液、100μg〜25 mgの固形組織をサンプリングする。皮膚癌の疑いがある場合には、(正常、NMSCおよび前駆病巣からの)皮膚細胞または組織を、皮膚生検またはルーチンな吸引式水疱形成法により採取する。疾患が疑われるときには、一次診療医、癌専門医、または他の医師が、患者から、正常組織と疾患の疑いのある組織の両方を摘出してもよい。日光曝露を分析するためには、組織を真皮もしくは表皮、またはその両方の組み合わせから採取してもよい。
DNA抽出は、当技術分野で既知のどのような方法を用いて行ってもよく、その後、ミトコンドリアゲノム全体またはそのある領域を増幅することもでき、これにはミトコンドリアゲノムの配列決定も含まれうるが、これはCurrent Protocols in Molecular Biologyに記載のとおりに行うことができる。
mtDNA中の突然変異の存在を検出するステップは、当業者に既知のどのような技術から選択して行ってもよい。例えば、mtDNA分析は、mtDNAを配列決定すること、PCRによりmtDNAを増幅すること、サザン、ノーザン、ウェスタン、サウス-ウェスタンブロットハイブリダイゼーション、変性HPLC、ハイブリダイゼーション、マイクロアレイ、バイオチップもしくは遺伝子チップ、分子マーカー分析、バイオセンサー、融解温度プロファイリングまたはこれらの任意の組み合わせを含みうる。その上、帰納的規則抽出やニューラルネットワーク形成のような統計的手法を用いることもできる。
PCR
本発明のポリヌクレオチド配列は、ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR)により増幅することができる。PCR法は当業者に周知である。PCRには、増幅すべき核酸、増幅すべき配列に隣接する2種の一本鎖オリゴヌクレオチドプライマー、DNAポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、バッファーおよび塩の存在が必要である。PCRの方法は当技術分野で周知である。PCRはMullis and Faloona, 1987, Methods Enzymol., 155: 335(参照により本明細書に組み入れる)に記載のように行われる。
ミトコンドリアゲノムを配列決定するためにはどのような既知の手段を使用してもよい。好ましくは、配列決定前にmtDNAをPCRにより増幅する。PCR産物は直接配列決定してもよく、またはベクターにクローニングして次いでそれを細菌宿主に導入することもできる。DNA配列決定法の例は、Brumley, R. L. Jr. and Smith, L.M., 1991, Rapid DNA sequencing by horizontal ultrathin gel electrophoresis, Nucleic Acids Res. 19:4121-4126 およびLuckey, J.A.,ら, 1993, High speed DNA sequencing by capillary gel electrophoresis, Methods Enzymol. 218: 154-172に見出される。mtDNAのPCRと配列決定の併用は、Hopgood, R.,ら, 1992, Strategies for automated sequencing of human mtDNA directly from PCR products, Biotechniques 13:82-92およびTanaka, M.ら, 1996, Automated sequencing of mtDNA, Methods Enzymol. 264: 407-421に記載されている。
好ましい手法は、Expand Long Template PCRシステム(Boehringer Mannheim社)を用いた、長型伸長PCR (LX-PCR)法である。Birch-Machin 研究室において開発され有効性の確認されたLX-PCR法(Rayら 2000)を用いると、単一の欠失の発生とは対照的に、mtDNA欠失のスペクトル全体を迅速にスクリーニングする機会がもたらされる。
PCR産物を配列決定するためにはどのような公知の方法を用いてもよい。好ましくは、DNA配列全体を、ジデオキシ配列決定法により特徴付けするが、これにはABI Big Dye TerminatorTM 技術と一連の72の重なり合うプライマー(それぞれが重鎖および軽鎖用)を使用する。配列決定は、1つ、複数、または組み合わせとしてのABIプラットフォーム(310、3100、または3700など)上で行われる。配列決定反応は、製造者の推奨に従い行う。
ミトコンドリアゲノムの配列決定および突然変異ホットスポットの同定の前に、DHPLCを使用して、多数のサンプル中の突然変異について迅速にスクリーニングを行うことができる。この技術は、低レベルのヘテロプラズミーの同定においてより高い感度を提供する。この技術は、ホモプラズミックな変化を検出することはできないが、従来の配列決定を補完する。最近になって腫瘍中に同定されたホモプラズミック突然変異は別として、報告されたmtDNA突然変異の大部分はヘテロプラズミックである(Chinneryら 1999)。こうしたヘテロプラズミックmtDNA変化は、mtDNAのPCR増幅後のヘテロ二本鎖の形成をもたらす。ヘテロプラズミックmtDNA突然変異の迅速なスクリーニングは、比較的新しい技術である変性高速液体クロマトグラフィー (DHPLC) (Oefner & Underhill, 1998)を用いて決定する。この技術は最近、全mtDNAゲノムを、<5%のレベルに至るまでのヘテロプラズミック点突然変異について迅速にスクリーニングし同定するために使用された(Van den Boschら 2000)。
配列決定後、正常および疾患関連mtDNA配列を、データベース中での比較のためにアーカイブに保管する。再配列決定デバイス、マイクロアレイ技術、統合されたマイクロ流体増幅および分析システム、高速で高スループットの突然変異検出、および他の方法のいずれもが、本発明の方法と共に使用可能である。
本発明は、標的核酸配列に特異的に結合する核酸メンバーおよびプローブを提供する。この標的核酸配列は、前立腺癌、非黒色腫皮膚癌などの疾患を示唆する、検出されるべき核酸または核酸の領域である。本発明のマイクロアレイを用いて分析される標的核酸配列は、好ましくはヒト組織または体液サンプルに由来する。本発明は、RNAまたはRNAに対応する核酸(すなわちcDNA)またはDNAを含む標的核酸配列を提供する。核酸メンバーは、固相支持体と安定的に結合し、本発明のアレイを構成する。前記核酸メンバーは、一本鎖または二本鎖であってもよく、cDNAから増幅されたPCR断片でありうる。
本発明には、特定の疾患を診断するまたは特定の突然変異を同定するために使用される、診断デバイス、例えばバイオチップ、遺伝子チップまたはマイクロアレイが含まれる。すべての配列決定されたミトコンドリアゲノムを評価して、塩基対配置のコンセンサス構造を創出し、それに対して、特定の疾患または障害に関連する塩基対欠失および突然変異の部分に関する禁制指標を割り当てる。次に、バイオチップ、遺伝子チップまたはマイクロアレイを創出するために診断用配置を使用する。
ポリヌクレオチドアレイは、1以上の標的核酸配列を含むサンプル中における、多数のポリヌクレオチドをアッセイすることのできる、高スループット技術を提供する。本発明のアレイは、遺伝子発現解析、疾患の診断および疾患の予後診断(例えば、治療に対する患者の応答のモニタリング、薬剤スクリーニングなど)に有用である。
前記マイクロアレイは、固相支持体の1つの表面に結合した固有のポリヌクレオチドを複数種有し、このとき各ポリヌクレオチドは固相支持体の表面の同一ではないあらかじめ選択された領域に結合されている。アレイ上の結合した各サンプルは、正体が既知の、通常は配列が既知のポリヌクレオチド組成を有するが、このことは下記にてより詳細に説明する。あらゆる想定可能な基盤が本発明に利用可能である。
マイクロアレイ用の標的は、ヒト体液または組織サンプルから誘導される。ハイブリダイゼーション前に標的核酸サンプルを増幅することが望ましい場合がある。当業者であれば、どのような増幅方法を使用するにせよ、定量的結果を所望であれば、増幅されるポリヌクレオチドの相対的頻度を維持または制御する方法を用いることに注意する必要があると理解するであろう。「定量的」増幅の方法は、当業者によく知られている。例えば、定量的PCRは、同じプライマーを用いて既知量の対照配列を同時に共増幅することに関する。このことは、PCR反応をキャリブレーションするために用することのできる内部標準を提供する。次いで高密度アレイに、増幅ポリヌクレオチドの定量のための内部標準に特異的なプローブを追加することができる。定量PCRのための詳細なプロトコルは、PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Innisら, Academic Press, Inc. N.Y., (1990)に提供されている。他の適当な方法としては、限定するものではないが、ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) (Innis,ら, PCR Protocols. A guide to Methods and Application. Academic Press, Inc. San Diego, (1990))、リガーゼ連鎖反応(LCR) (Wu and Wallace, Genomics, 4: 560 (1989), Landegren,ら, Science, 241: 1077 (1988)およびBarringer,ら, Gene, 89: 117 (1990)を参照)、転写増幅(Kwoh,ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 1173 (1989))、および自己持続型配列複製(Guatelli,ら, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 87: 1874 (1990))が挙げられる。
ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションは、変性させたプローブまたは標的核酸メンバーと標的ポリヌクレオチドを、前記プローブまたは標的核酸メンバーとその相補的標的が相補性塩基対形成により安定なハイブリッド二本鎖を形成することのできる条件下に置くことを要する。次に、ハイブリッド二本鎖を形成しないポリヌクレオチドを洗い流し、ハイブリダイゼーションしたポリヌクレオチドを、典型的には付加された検出可能標識を介して、検出できるようにする。ポリヌクレオチドは、温度を上げることにより、または前記ポリヌクレオチドを含有するバッファーの塩濃度を減少させることにより変性すると一般的に理解されている。低ストリンジェンシー条件下(例えば低温および/または高塩濃度)では、例えアニーリングする配列が完全に相補的ではない場合でも、ハイブリッド二本鎖(例えばDNA:DNA、RNA:RNA、RNA:DNA、cDNA:RNAおよびDNA:DNA )が形成される。したがって、ハイブリダイゼーションの特異性は、低ストリンジェンシー条件では低下する。逆に、高ストリンジェンシー(例えば高温または低塩)では、ハイブリダイゼーションが成功するには、ミスマッチが少なければならない。ハイブリダイゼーション条件の最適化方法は、当業者に周知である(例えばLaboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 24: Hybridization With Polynucleotide Probes, P. Tijssen, 編 Elsevier, N.Y., (1993)を参照されたい)。
上記のような、ハイブリダイゼーションおよび任意の洗浄工程および/またはその後の処理の後に、得られるハイブリダイゼーションパターンを検出する。ハイブリダイゼーションパターンを検出または視覚化する際には、標識の強度またはシグナル値を検出するのみならず定量するが、これは、ハイブリダイゼーションの各スポットからのシグナルを測定し、かつそれを既知数の末端標識化標的ポリヌクレオチドにより放射されるシグナルに対応する単位値と比較することにより、ハイブリダイゼーションパターンにおけるアレイ上の特定のスポットとハイブリダイゼーションする各末端標識化標的のコピー数のカウントまたは絶対値を得る、という意味である。
本発明は疾患検出用の診断検査を提供する。本発明はまた、患者の治療に対する応答をモニタリングする予後検査を提供する。本発明の方法によると、疾患の存在または患者の治療に対する応答は、患者からの体液または組織サンプルを用意して検知する。この体液または組織サンプルから、核酸を含むサンプルを調製する。前記サンプルから抽出された核酸を、固相基盤と複数の核酸メンバーを有するアレイとハイブリダイゼーションさせるが、このとき、各メンバーは、疾患の存在または疾患もしくは障害への傾向を示すものである。この診断検査によると、前記核酸を含むサンプルがアレイ上の核酸メンバーの1以上とハイブリダイゼーションすることは、疾患の存在、または疾患もしくは障害への傾向を示すか、あるいは予後検査の場合には患者の治療に対する応答を示す。
本発明の方法を実施するための説明書および試薬を含むキットを提供する。例えば、このキットは、組織特異的サンプルおよび組織関連体液中の、ミトコンドリア欠失、突然変異、ヘテロプラズミー、ホモプラズミーを検出するための試薬と説明書を含みうる。このキットはまた、プライマー伸長産物を作製するための、ミトコンドリアゲノムにハイブリダイズするプライマーを1以上含みうる。キットにはまた、固相支持体、例えば使い捨てチップ、前記固相支持体の固定手段、mtDNAの抽出手段、およびmtDNA配列のデータベースへのアクセス手段が含まれうる。
前立腺体液の採取または前立腺腫瘍除去のための手術の後に、形質転換している細胞または癌性の細胞を同定するために、生検材料のスライドを調製する。レーザーキャプチャーマイクロダイセクション (LCM)顕微鏡検査を使用して、組織切片から正常、良性または悪性の細胞を単離する。周囲の異種細胞の中から、対象の疾患細胞(前癌性細胞または癌細胞の侵襲グループなど)を採取することができる。
前立腺癌と診断された31人の個体から同定された突然変異を、Hierarchical Clustering Explorer (HCE) (www.cs.umd.edu/hcil/multi-cluster; Seoら, 2002; Seoら 2003; Zhaoら 2003; Seo and Shneiderman; Seoら; 2004a; Seoら 2004b; Seoら 2005a; Seoら 2004c; Seoら 2005b)を用いて解析した。さらに、臨床的には前立腺癌の症状があるものの、病理学的結果はその前立腺組織が悪性ではないことを示した12人の男性の前立腺針生検組織からのミトコンドリアゲノムも解析した。図2および3は、同定された非同義的ミトコンドリア突然変異のクラスター解析を示す。図2はクラスター解析の最初の半分であり、図3はクラスター解析の残り半分である。Y軸に、前立腺癌を有する31人の個体(105, 208, 349, 377, 378, 380, 382, 384, 386, 416, 417, 418, 426, 449, 450, 451, 452, 455, 456, 457, 458, 460, 461, 463, 464, 466, 467, 498, 501, 504, 505)および臨床症状を示すものの病理検査からは悪性なしと判定された12人の個体 (2, 35, 51, 209, 270, 278, 375, 480, 503, 536, 560, 858)の患者番号を示す。Y軸には、組織の供給源も示した(すなわち遠位良性(db)、隣接良性(ab)、悪性(ml)および(b)血液)。12人の個体の、症状はあるものの悪性ではない組織由来の良性腺組織は「gl」と表示した。X軸は突然変異の部位を示す。
DNAは、Qiagen社からのDNeasyTMキットを用いて、実施例1に記載のように組織サンプルから抽出した。「背中合わせ」プライマー手法を用いて、日光曝露に関連した非コード領域(NCR)中のタンデム重複の発生率を調べた。32の年齢マッチングされた、日光曝露された(n=24)および日光保護された身体部位(n=10)からの分割ヒト皮膚サンプルを調べた。
C L336 AAC ACA TCT CTG CCA AAC CC 20 mer 配列番号1
D H335 TAA GTG CTG TGG CCA GAA GC 20 mer 配列番号2
E L467 CCC ATA CTA CTA ATC TCA TC 20 mer 配列番号3
F H466 AGT GGG AGG GGA AAA TAA TG 20 mer 配列番号4
DNAは、Qiagen社からのDNeasyTMを用いて、実施例1に記載のようにヒト皮膚組織サンプルから抽出した。特異的プライマーを用いて、PCRによりmtDNAを増幅し、次いでDNAサンプル調製(Qiagen)の後に、突然変異を自動配列決定(PE Applied Biosystems)によりBigDyeTM Terminator Cycle配列決定を用いて同定した。この方法論はHealyら 2000; Hardingら 2000に記載されている。16,569bpヒトミトコンドリアゲノム全体を、偽遺伝子や他の核遺伝子座を増幅しないことの知られている、確立されたPCRプライマー対を用いて配列決定した。あらゆる推定上のDNA変化は、改訂された「ケンブリッジ」ヒトmtDNA参照(Andrewsら 1999) との比較により確認した。腫瘍mtDNAから得られた配列を、最初に既知の多型(Andrewsら 1999; MITOMAP)について比較し、次いで正常病変部近傍皮膚からのmtDNA配列と比較して、本物の体細胞変異を同定した。
扁平上皮細胞癌(SCCS)、基底細胞癌(BCCS)およびボーエン病や光線性角化症(As)のような推定上の前駆病巣におけるMtDNA損傷を、種々の日光曝露された身体部位から採取された隣接病変部近傍の皮膚と比較した。長型伸長PCR技術 (LX-PCR) (Rayら 1998)を用いてミトコンドリアゲノム全体を増幅することにより、mtDNAの欠失スペクトル全体を決定した。無数の具体的な欠失がミトコンドリアゲノム中に生じることが観察された。全ての欠失が非黒色腫皮膚癌と相関するわけではないが、しかし、正確な診断方法のためには、この疾患と実際に関連する欠失を知っておく必要がある。
DIAF: (336-363) 5' AACACATCTCTGCCAAACCCCAAAAACA 3' 配列番号5
OLBR: (5745-5721) 5' CCGGCGGCGGGAGAAGTAGATTGAA 3' 配列番号6
OLAF: (5756-5781) 5' GGGAGAAGCCCCGGCAGGTTTGAAGC 3' 配列番号7
DIBR: (282-255) 5' ATGATGTCTGTGTGGAAAGTGGCTGTGC 3' 配列番号8
時間的な母系比較(すなわちひ孫から曾祖母まで)を用いて、所定の組織から抽出されたmtDNAの配列全体を、迅速にそして正確に配列決定し、そのことにより、その具体的分子のヌクレオチド塩基対の並びおよび時間と共に生じた可能性のある変化を、断定的に記載する。こうした特徴付けを、健康状態、および老化指標について、ならびにより大きな集団中の特定の母系の間で比較する。この組み合わさった情報は、同じ突然変異/欠失をもたらす別の原因同士の極めて重要な統計的識別を可能にし、また、バイオマーカーとして使用されるmtDNA配列が、その有効性を確立するための特異性と感度の必要な指標を有することを証明する。さらに、塩基対欠失および突然変異の比率を、4代の母系世代に渡る種々の組織における整合性について比較する。最近の方法論的発展は、血液サンプルにおける老化に関係する塩基対欠失の検出を可能にし(Bassamら 1991)、mtDNAを検査するために骨格筋のかわりに血液サンプルを使用する可能性を高めた(von Wurmbら1998)。mtDNA欠失および/または突然変異を代表するものとして、筋組織の代わりに白血球を用いる有効性を確立した後に、次のステップでは白血球中のmtDNAのみを測定する。次いでMtDNA欠失/突然変異を先に記載したように決定する。
12ST1: (1257-1279) 5' TATACCGCCATCTTCAGCAAAC 3' 配列番号9
12ST2: (1433-1411) 5' TACTGCTAAATCCACCTTCGAC 3' 配列番号10
D1F: 5' CCTTACACTATTCCTCATCACC 3' 配列番号11
D1R: 5' TGTGGTCTTTGGAGTAGAAACC 3' 配列番号12
適当な場合には、共通欠失の発生率は、1〜5%より大きいレベルを検出する3-プライマーPCR法、または1 %未満から10-4%未満のレベルを検出する希釈PCR法により定量的な様式で決定する(実施例7を参照されたい)。実施例1に記載のようにサンプルを取得し、DNAを抽出する。DNAサンプル中の欠失型および野生型(wt)mtDNAの両方を同時に検出しその比率を定量するためには、3-プライマーPCR法を用いる(Birch-Machinら1998に記載)。プライマーAおよびCは、それぞれ重鎖位置13720〜13705および9028〜9008に対応する (Andersonら, 1981);プライマーBは軽鎖位置8273〜8289に対応する。プライマーCは、共通欠失内のmtDNA領域にマッピングされ、これに対してプライマーAおよびBは欠失領域に隣接する。したがってプライマーBとCはwt-mtDNAのみを増幅し、プライマーAとBは欠失型mtDNAのみを増幅する(欠失が不在の場合の2つのプライマーの間の距離は約5.5kbであり、以下に記載のここでのPCR条件下で増幅されるには長すぎる)。
半定量的PCR法(Corral-Debrinskiら 1991)を用いて、組織/細胞サンプルから抽出された全mtDNA中の共通欠失の割合を推算する。実施例1に記載のように、生物学的サンプルを用意しDNAを抽出する。DNAサンプルは、最初に、制限酵素Bam HI (1μl酵素および1μlの市販バッファー)を37℃にて90分用いて線状化する。連続希釈は2倍にするステップとして行い(全mtDNAについては最初の10倍希釈が行われた)、その後、各希釈物(1μl)についてPCRを次のプライマーを用いて行った:
全mtDNA用のプライマー
L3108 (nt3108-3127)
H3717 (nt3717-3701)
共通欠失用のプライマー
L8282 (nt8282〜8305)
H13851(nt13851〜13832)
共通欠失%= 全mtDNA希釈係数 (IOD Zero) × 100
共通欠失希釈係数(IOD Zero)
実施例1に記載のようにして、サンプルを取得しDNAを抽出する。2種類の異なるPCR条件を用いた13の重なり合う断片のPCRはvan den Boschら(2000)に記載のとおりであった。PCRには次の3つのmtDNA特異的プライマー対を用いた:
オリゴ配列
Mt3118F CCCTGTACGAAAGGACAAGAG 配列番号13
Mt3334R TGAGGAGTAGGAGGTTGG 配列番号14
Mt8207F CCCATCGTCCTAGAATTAATTCC 配列番号15
Mt8400R ATGGTGGGCCATACGGTAG 配列番号16
Mt14427F CCCATGCCTCAGGATACTCCTC 配列番号17
Mt14997R GCGTGAAGGTAGCGGATG 配列番号18
断片 融解温度(℃) バッファーB%の勾配
Mt3118F 59 51〜59
Mt8207F 58 50〜58
Mt14427F 56 60〜68
49の前立腺針生検患者(46人は悪性腫瘍と診断された)からのmtDNA D-ループ配列の広範囲な調査から、患者血液のミトコンドリアDNAと比較して、良性前立腺肥大(BPH)、入手可能なグリーソンのグレードおよびストロマを含む全ての前立腺組織においてmtDNA突然変異が存在することが実証された。さらに、31人の前立腺切除術を受けた患者からのミトコンドリアゲノムの拡張研究は、マッチングさせた悪性腺、隣接良性腺(悪性腺のそば)、および遠位良性腺(あらゆる悪性病理を除去した、悪性病理を含まない組織中に位置する)における、あいまいな超変異量(Chenら 2002; Chenら 2003)を実証するが、これは表4に示すとおりである。表4の突然変異はまた、置換を記載した配列番号102、欠失を記載した配列番号103〜109、および挿入を記載した配列番号110〜138において提供される。多型および突然変異位置は、改訂されたケンブリッジ参照配列(Revised Cambridge Reference Sequence)(2001)との比較により決定したが、しかしながら歴史的ナンバリングを維持し、そのため位置3106における欠失はギャップとして表され、レアな多型750Aは保持された。塩基のナンバリングは、合計16569の塩基位置を有する改訂されたケンブリッジ参照配列(Revised Cambridge Reference Sequence)に基づく。図1に、ミトコンドリアゲノムの位置についての突然変異の数を表すヒストグラムを示す。図1に見られるとおり、突然変異はmtDNAゲノム全体に渡り、および、全ての疾患前立腺に存在する。しかしながら、特定の「ホットスポット」も明確であり、例えばD-ループ領域および16s領域において認められた。これらのデータセットは、資格のある病理学者がルーチンな組織学的方法および等級付け標準を用いて割り当てた悪性または良性組織との指定が、早期疾患進行を同定するものではないことを示す。このことは、細胞の形態学的特性が変更される前から、細胞レベルで悪性形質転換が始まっていることを強く示唆する。重要なこととして、突然変異パターンは、個別の患者からのマッチングさせた前立腺組織について、または別の患者との比較においてまったく一貫せず、このことは悪性細胞のクローン性増殖が生じうるあり得る組織部位を示している可能性がある。その上、同じ個体からのグリーソンスコアが同じである別の針生検材料は、ほとんど必ず別のmtDNA突然変異パターンを示す。このことは、特定の突然変異部位ではなく合計突然変異量が、この疾患および疾患の進行をより表していることを示す。
約3.4キロベース(kb)の欠失は、新鮮な凍結前立腺組織の完全ミトコンドリアゲノム増幅を介して同定された。線形回帰法を用いることにより、この欠失の大きさは、3000塩基対(bp)〜3500 bpと推定された。2つのありうる候補欠失、すなわち9574〜12972における3397 bp欠失、および10744〜14124における3379 bp欠失が、Mitomap (Brandon, M. C., Lott, M. T., Nguyen, K. C., Spolim, S., Navathe, S. B., Baldi, P. & Wallace, D. C. MITOMAP: a human mitochondiral genome database--2004 update. Nucleic Acid Research 33 (Database Issue):D611-613, 2005; www.mitomap.org)を用いることにより同定された。2つの欠失のうちのいずれかが正しいとすれば、そのどちらが正しいのかを決定するために、欠失接合部にまたがるフォワードプライマーを各2つの候補について作製し、それによりプライマーが欠失に隣接する反復領域よりも遠くまで伸長することを保証した。図5は、プライマーの設計と配列を示す概略図である。10744〜14124における3379 bp欠失(3.4 kb欠失と呼ぶ)に対応する増幅産物(amplicon)についての陽性の増幅結果が得られた。
実施例10に記載の調査の後に、追加の21サンプルを選択したが、そのうちの10は良性でありそのうちの11は悪性であった。病理学的状態は、資格のある病理学者が行う針生検により決定された。サンプルを盲検化して、本調査者らがこの検査を行うときにサンプルの病理学的状態を知らないようにした。本調査者らは、サイクル閾値を調べることにより、症例の81%において正しい病理学的状態を予測することができた。4つの正しくなかった予測のうち、2つは良性と判定された悪性サンプルであり、2つは悪性と判定された良性サンプルであった。後者の症例において臨床医が2人の個体の追跡臨床情報を要求し、それを用いてこの2人の個体がこの調査に使用された針生検結果の後に前立腺癌と診断されたかを調べた。元は良性サンプルをもたらすがこの研究により悪性腫瘍を有すると予測された個体の1人は、その後悪性サンプルをもたらした。その結果として、偽陽性のうちの1つは真の陽性となった。したがって、病理学的状態は、この調査に置いて検査された86%の症例において正しく予測された。この調査の最終的な陽性的中率(PPV、ここでPPV=真の陽性/(真の陽性+偽陽性))は91%であり、そして陰性的中率(NPV、ここでNPV=真の陰性/(真の陰性+偽陰性))は80%であった。
アーカイブ保管サンプル
この研究では76の前立腺組織を3.4 kb欠失について検査した。すべての組織サンプルをホルマリン固定し、25が悪性、12が正常、および39が良性前立腺疾患を有すると組織学的には示された。後者の群ついては半分以上が過形成を有した。すべての標本は、調査される者の組織アーカイブから得られた針生検材料であった。
各スライドについて、テープリフトを、Arcturus Bioscience Inc.社からのPrep-Strips (カタログ番号LCM0207)を用いて行った。このことにより、DNA抽出前にスライドからあらゆる粒状物質または非付着性組織を除去することができた。組織がスライド上にある状態で、スライドをPBS (リン酸緩衝生理食塩水溶液)で洗浄して、可能な限り固定剤を除去した。スライド上の1〜2針生検切片を、個別に包装された滅菌された外科用カミソリ刃を用いて擦り取り、滅菌マイクロ遠心分離チューブに入れた。次に、製造者の説明書に従ってQIAamp(登録商標) DNA Mini Kit (Qiagen社、カタログ番号51304)を用いて、DNAを単離し精製した。品質保証チェックポイントとしての陰性抽出対照を、スライド抽出物と並行して処理した。DNAの合計濃度と各サンプルについての純度比を分光光度法(Nano-Drop ND-1000)により測定し、定量的ポリメラーゼ連鎖反応 (qPCR)のために2ng/μlの希釈物を調製した。
精製オリゴヌクレオチドプライマーは、Invitrogen社(California, USA)により化学的に合成された。プライマーの配列および増幅されるPCR産物の期待される大きさを表6に列記した。さらに、mtDNA欠失のためのPCR分析には、陽性対照(突然変異mtDNAを有することの知られている供給源からのDNA)も追加された。TNFを除き、各プライマーセットをミトコンドリア非含有rho 0 細胞株に対して確認し、偽遺伝子の共増幅の不在を確認した。
各サンプルに対して、3つの別のPCRを行った。各反応は、25μl合計容積であり、テンプレートDNA、1対のプライマー(12sまたは3.4欠失またはTNF用プライマー)、iQTM SYBR Green Supermixキット(カタログ番号170-8882, Bio-Rad Laboratories Inc.社)および蒸留脱イオン水(ddH2O)を含むものであった。TNF (腫瘍壊死因子)用は単一コピーの核遺伝子プライマーを含み、12s用は全ミトコンドリアゲノムプライマーを含むものであった。テンプレートDNA、プライマー、および反応バッファーの容積と濃度を以下に記載する。
熱サイクリング、リアルタイム検出および反応の分析は、Intuitive Opticon MonitorTM ソフトウェア (MJ Research Inc.)を備えたDNA Engine Opticon(登録商標) 2 Continuous Fluorescence Detection Systemを用いて行った。DNA定量のためには、標準曲線法を利用した。本発明者らは、1セットの連続希釈 (106, 105, 104, 103, 102, 101)を、3種の精製PCR生成テンプレート(すなわち1つの産物は3.4欠失について、1つの産物は12s プライマーについて、および1つの産物はTNFについて)に対して行った。ここから、3種の異なる標準曲線が作製され、それらは、全mtDNA (12s 増幅産物−合計ミトコンドリアゲノムプライマー)、3.4欠失または全核DNA (TNF−単一コピー核遺伝子プライマー)のコピー数を示した。次にサンプルCTを標準のそれと比較することにより、サンプルのCT値をDNAコピー数に変換することができる。3.4欠失は、それが37サイクル以内に検出されなかったときには、存在しないまたは低レベルであると見なされた。
データが類似しておりその範囲が小さいことから、クラスタリングは正規化せず、対数関数も使用しなかった。
管理学習は、システムが既知サンプルについて結果を予測しようとすることに基づく。データの半分を用いて教育を行い、残り半分を用いてアルゴリズムを試した。管理学習は、自身の予測を標的回答と比較して、自身の間違いから「学習」する。しかし、予測された結果がデータの実際の結果よりも高いまたは低い場合には、エラーをシステムに戻して伝え、重みを適切に調節する。
データセット: 5%〜35% -良性
35%〜65% - 過形成
65%〜95% - 悪性
ANNアルゴリズム (下に図式的に示す):
データセットの半分をANNの教育に使用
残り半分を正確性を比較するために使用
正確性=期待データセットを得られたデータセットと比較→86.6%
3つの分類:
良性
過形成
悪性
リアルタイムPCR サイクル閾値 CTに基づいて各分類のための3つの変動物を用いる:
腫瘍壊死因子 (TNF) - 核コピー対照
全ミトコンドリア-ミトコンドリアコピー対照
欠失 −欠失状態のミトコンドリア
結果:
データセットの半分を用いてANNを教育し、残り半分を用いて正確性を比較する。
3つの分類の正確性= 86.6%
陽性的中率 (PPV);
良性から悪性= 88.2%
陰性的中率 (NPV)
良性から悪性= 76.5%
Harbottleら, 2004およびDurhamら, 2003により報告された、3895bp欠失と日光曝露とのあり得る関連性の最初の発見を受けて、その後、さらなる研究からそのような関連性が存在することを確認した。その上、今回のさらなる研究は、完全に定量的な様式で欠失および配列再配置の新規検出方法を発明することにより、日光曝露または皮膚癌検出のための診断検査のためのこの欠失の使用を実施可能にした。この方法は、プライマーまたはプローブと、再配置に関連する欠失もしくは挿入により生じた新たに形成された配列とのアニーリングを提供し、そのことにより検出手段としてのリアルタイム定量PCR(qPCR)の使用を可能にする。qPCRプラットフォームの使用は、単純な存在と不在のシナリオの代わりに、欠失の定量的検出を実施可能にする。日光曝露のレベルまたは悪性腫瘍の特性を測定するのが、以前に報告された単純な存在または不在の半定量ではなく、欠失の相対量であることから、この定量は検査の基礎である。その上、qPCRプラットフォームは、検出感度が従来のPCRおよび臭化エチジウム検出よりも大幅に高いことから、見かけ上は疾患にかかっていないまたは曝露されていない組織の使用を可能にする。
非黒色腫皮膚癌(NMSC)の発生率は、欧州が起源の集団において増大している(Severi and English, 2004)。例えば、米国では毎年100万の新規症例が診断されており(Wesson and Silverberg, 2003)、また英国では65,000が診断されている(数はCancer Research. UKの提供)。NMSCは皮膚癌のほぼ90%を占め、基底細胞および扁平上皮細胞癌(それぞれBCCおよびSCC)からなる。BCCは、NMSCの最も一般的な形態であり、表皮の基底ケラチノサイトから主に発生するが、毛包および脂腺の細胞からも発生する。これらは局所的には浸潤性であるが転移性であることは希である。SCCもまたケラチノサイトから誘導されるが、しかしながらBCCとは対照的に、SCCは転移しうる。BCCに比べて、SCCは、年齢とともに最も大きな増加を示し、高齢者に集中している(Severi and English, 2004)。NMSCの相対的密度は、外出時に「日常的に」日光曝露される身体部位(Armstrong (2004)によって定義された頭皮、顔、首および耳など)において最も高い。しかしながらSCCは、「時折」日光曝露される身体部位、例えばArmstrong (2004)により定義された肩、背中および胸部などにおいてずっと低い密度である点において、BCCとは感知できる程度に異なる。したがって、NMSCの主要な決定因子は、DNA損傷を誘発する日光の紫外線放射(UVR)成分である。重要なこととして、NMSCの発生に影響を及ぼすのは、日光曝露のパターン(より継続的対断続的)とその累積量の両方である(Armstrong and Kricker, 2001)。ヒト皮膚における累積UVR曝露の信頼できるマーカーを決定するために、本発明者らおよび他の者達は、UV-誘発DNA損傷のバイオマーカーとして、核DNAではなく、ミトコンドリアDNA (mtDNA)を用いるとの新規な着想を検討した(Pangら, 1994; Berneburgら, 1997; Birch-Machinら, 1998; Birch-Machin, 2000;)。p53のような核DNA遺伝子の突然変異スクリーニングと比較して、日光曝露された皮膚におけるmtDNA損傷を調べることには特定の利点がある。第1に、ミトコンドリアにおける酸化損傷の塩基除去修復の証拠はあるものの、mtDNA 中のDNA光分解産物(例えばシクロブタンピリミジンダイマー)の修復のための核除去修復の証拠はない(LeDouxら, 1993; Croteau and Bohr, 1997; Pascucciら, 1997; Sawyer and Van Houten, 1999)。第2に、各細胞は最大で数千コピーものmtDNAゲノムを保有することができ、したがってミトコンドリアは、残りの野生型による相補を介して非常に高レベル(最大90%)の損傷mtDNAに耐えることができる(Chomynら, 1992; Sciaccoら, 1994)。一緒になると、こうした要因は、細胞機能が損なわれることなくmtDNA中の光損傷の蓄積をもたらす。
日光中の紫外線放射(UVR)は、白人個体における非黒色腫皮膚癌 (NMSC)の主要な原因因子として広く認識されている。本発明者らおよび他の者達による以前の研究では、ヒト皮膚における累積日光曝露のバイオマーカーとしてのミトコンドリアDNA (mtDNA)損傷の使用が検討された。こうした研究は、日光保護されたおよび日光曝露された皮膚の間でmtDNA損傷を比較した。NMSCは、外出時に「時折」日光曝露される身体部位と対照的に、「日常的」に日光曝露される身体部位において主に形成されること、およびこのためこれらはその累積UV曝露が異なることから、この手法は制限されたものである。この制限に対処する試みとして、本実施例は、104の年齢マッチングさせた、日常的に、時折、および希に日光曝露される身体部位から採取されたヒト皮膚サンプル中のほとんど報告されていない3895 bp mtDNA欠失の発生の頻度を調べた。UV曝露の増大と共に欠失頻度は有意に増大し(p<0.0001)、興味深いことに、「時折」日光曝露される身体部位と比較して、「日常的に」日光曝露される身体部位においては、著しく高い欠失頻度が、真皮(p=0.0018)および表皮(p<0.0001)の両方において見られた。4977 bp共通欠失の以前の研究に使用された同一のNMSCサンプルにおける3895 bp欠失の調査からは、比較的高い3895欠失の発生頻度が示された(それぞれ8/10 対 4/10)が、ただしこの差異は統計的に有意なものではなかった。その上、本実施例は、UVA+UVB光源の反復的な致死量未満の照射量を用いて3895 bp欠失をin vitroにて誘発させることにより、3895 bp欠失と日光のUVR成分との病因論の間の関連性を助成する。ヒト皮膚における3895 bp欠失の頻度は累積UV曝露の可能性のあるバイオマーカーを提供し、また、NMSC発生の早期検出ツールを提供すると共に、臨床UV光線療法レジメンの長期安全性をモニタリングする方法を提供する。
外出時に「日常的に」日光曝露される身体部位(頭皮、顔、首および耳など)からの臨床的に正常な病変部近傍の皮膚(表皮n=21、真皮n=21、平均年齢±SEM=69.4±2.6)ならびに「時折」日光曝露される身体部位(肩、背中および胸部)(表皮n=21、真皮n=21、平均年齢±SEM=63.1±3.6)を、Royal Victoria Infirmary, Newcastle, UKの皮膚癌切除診療所にかかっている42人のNMSC患者からインフォームドコンセントのもとで採取した。日常的におよび時折日光曝露された群の間には特に有意な年齢差はなかった (p=0.158: 両側t検定(Welch相関))。さらに、42人の患者のうち、女性:男性のパーセンテージはほぼ同じであり(すなわち、それぞれ52%: 48%)、またBCCとSCCのパーセンテージもほぼ同じであり、患者の57%がBCCを有した。希に日光曝露される身体部位からの正常皮膚サンプル(臀部やかかとなど)は、以前に得られた死体解剖サンプル(表皮n=10、真皮n=10、平均年齢=73歳)から採取された。0.25% ディスパーゼを4℃にて一晩使用して表皮と真皮を分離し(Durhamら, 2003)、DNAをQiagen社のDNeasy組織抽出キットを用いて抽出した。表皮腫瘍、BCC (n=5)、SCC (n=5)は、癌切除のために通院している患者から採取された。この調査に使用された患者はいずれもmtDNA不全を有しなかった。
自然発生的に不死化されたケラチノサイト細胞株(HaCaT) (Boukampら, 1988)を、10% ウシ胎仔血清、1mL 当たり5 IUのペニシリン、および1mL 当たり5gのストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地中で増殖させた。細胞を、直径9 cmの組織培養処理されたペトリ皿中で70%〜90%コンフルエント状態まで増殖させ、PBSで洗浄し、その後、致死量未満の照射量(1cm2当たり0.5 J、これは1 SEDに相当する)のUVRを、Helarium(登録商標) 40 Wランプ(Wolff B1.01、290〜400 nm、ピーク発光325 nmにて)を用いて、隔日的に照射した。適当な時点で、付着細胞から、Qiagen社のDNeasy組織抽出キットを用いて全細胞性DNAを抽出した。
PCRは、200 ng ゲノムDNA、600 nMの各プライマー、250 μM dNTP、反応当たり0.6 UのAmplitaq Gold DNAポリメラーゼ(Applied Biosystems)、GeneAmpバッファー(100 mM Tris-HCl、pH 8.3、500 mM KCl、15 mM MgClおよび0.01% (wt/vol)ゼラチンを含む)を含む25 μl反応にて行った。使用したPCRプライマーは、L404 (5' CTT TTG GCG GTA TGC ACT TT 3') (404-423nt) (配列番号145)およびH4676 (5' GAT TAT GGA TGC GGT TGC TT 3') (4676-4657nt) (配列番号146)であった。プライマーL404およびH4676は、3895 bp欠失の外側にアニーリングするように設計した。DNA増幅において、短い(30秒)ポリメラーゼ伸長時間は、野生型PCR産物の増幅をもたらさず、欠失型mtDNA種を表す小さい375 bp産物の増幅のみが可能であった。PCR条件は、94℃にて10分、35サイクルの94℃にて30秒、56℃にて30秒、72℃にて30秒、および最終伸長として72℃にて7分というものであった。増幅産物は1%アガロースゲル中で臭化エチジウム(1ml 当たり0.25μg)を用いて染色して可視化した。
375 bp PCR産物をゲルから切り出し、QIAquickゲル抽出キット(Qiagen社, Germany)を用いて精製し、pCR(登録商標)4-TOPO(登録商標)ベクター中にTOPO(登録商標)TA Cloningキット(Invitrogen社, UK)を用いてクローニングした。この375 bp PCR産物の正体を確認するために、自動化DNA配列決定 (MWG Biotech, Ebersberg, Germany)を用いてDNAを配列決定した。
UVRにより生じた低レベルの欠失を検出するために、PCRを上記のように行ったが、ここでは3 μCiの[α-32P]-dCTP (Amersham, Buckinghamshire, UK)を添加した。次にPCR産物を6%非変性ポリアクリルアミドゲルに通して電気泳動し、約24時間に渡り、ホスホルイメージスクリーンに曝露した。放射性PCR断片を、PhosphorimagerによりImageQuant ソフトウェア (Molecular Dynamics, UK)を用いてスキャニングし視覚化した。
統計分析は、StatCalc (Epi-info. CDC, Alberta, Georgia)を使用し、χ2、ピアソンのχ2, フィッシャーの直接確率検定および両側t検定を用いて行った。
3895 bp欠失の正体の確認
以前の研究からのNMSCおよび日光曝露された皮膚からのmtDNA欠失スペクトル(Durhamら, 2003)を、再度分析した。多くのサンプルが大きさ約4 kbの欠失を有することが見出された。MITOMAP (Mitomap, 2004) データベースの検索により、この欠失は、ヌクレオチド 547〜4443に渡るマイナーアーク中に報告された、3895 bp種であると同定された。この欠失は以前に、キーンズ・セイアー症候群および慢性進行性外眼筋麻痺症と関連する(Moraesら, 1995)とされた。この欠失の正体を確認するために、欠失特異的PCRアッセイを方法の章で説明したように設計した。このPCRからの375 bp産物を配列決定して、それが、3895 bp欠失に特徴的な欠失接合部配列、すなわち5' CTAACC 536 bp/4430 bpccataccccgaa548 bp/4442 AATGTT 3'(配列番号147)を有することを確認した。特徴として、この配列は、野生型 mtDNA中で3895 bp欠失に隣接する2つの12 bp反復のうちの1つのみを有した(小文字)。
3895 bp欠失は、そもそも、日光曝露された部位から採取されたNMSCサンプルにおいて観察されたことから、本発明者らは、この欠失の頻度が累積日光曝露の増大のマーカーであるか否かという疑問に取り組んだ。欠失特異的PCRアッセイ(材料および方法を参照)を用いて、日常的に、時折および希に日光曝露された身体部位から採取された104の年齢マッチングさせた、分割ヒト皮膚サンプルにおける発生頻度を分析した。表皮(p<0.0001、χ2=31.36、2df; ピアソンχ2 検定)および真皮(p<0.0001、χ2=28.68、2df)の両方において、増加するUV曝露と共に欠失頻度は有意に増加した。図8は、日光曝露の増加と共に観察される、3895bp欠失の発生頻度の増加を示す。図8aに示す代表的な臭化エチジウム染色されたアガロースゲルは、外出時に日常的に日光曝露される身体部位における3895 bp欠失の頻度(上のパネル)が、時折日光曝露された身体部位のそれ(下のパネル)と比較して、より大きいことを示す(Dは真皮でありEは表皮である)。陽性対照は、配列決定により確認された3895 bp欠失を有するサンプルを表す。両方のパネル中のレーン1は分子量マーカー(Hyperladder IV- 範囲1000 〜100 bp、Bioline社、London UK) を表す。同じ量のテンプレートDNAを各PCR反応に添加した。図8bは、種々の日光曝露された身体部位から採取された104の分割皮膚サンプル中の3895 bp欠失の頻度を示すヒストグラムである。
以前に行われた4977 bp 共通欠失の研究(Durhamら, 2003)において使用されたのと同一のNMSCサンプル中の3895 bp欠失の調査からは、3895欠失の発生頻度が比較的大きい(それぞれ8/10対4/10)ことが示されたが、この違いは統計的に有意なものではなかった。こうした腫瘍は日常的に日光曝露される身体部位から摘出されたことから、この3895 bp欠失が共通欠失よりも累積日光曝露の高感度なマーカーでありうると推測することは興味深い。
3895 bp欠失は、以前に疾患筋肉において報告された(Moraesら, 1992)のみである。皮膚についての本研究は別として、他の組織におけるその発生頻度は未知である。本発明者らは、血液におけるこの欠失の頻度を、皮膚サンプルのそれと類似する年齢群の患者から採血された16の血液サンプルに対して欠失特異的PCRを行うことにより調べた。これらの血液サンプルのいずれも、欠失の保有を示さなかった(データ未掲載)。
日光曝露の累積量と3895 bp欠失の発生頻度の相関関係を評価するためには、in vitroでの日光の影響を調べる必要があった。日光は、UVAとUVBの両方を含むことから、helariumランプ (Diffey, 2002)を用いて、反復的な致死量未満のUVR照射レジメンの広範な系列を用意し、ヒト表皮由来(HaCaT)細胞株における3895 bp欠失を生成させることを試みた。最適UVR反復照射方法は、かなりの程度の細胞死を伴わずにこの欠失を生じるものであった。放射性PCRに基づくアッセイを用いて、本発明者らは、17の隔日的な1cm2当たり0.5 J(すなわち, 1 SED)の量のUVRの照射後に、付着細胞において3895 bp欠失が誘発される最初の兆候が観察されることを実証した。
3895 bp欠失において欠失される領域は、D-ループ中のmtTF1結合部位からtRNAメチオニンまでである。欠失された遺伝子としては、12s rRNA、16s rRNA、ND1ならびにHおよびL鎖の両方の転写のためのプロモーターが挙げられる。ミトコンドリアの呼吸機能不全が観察される前に、野生型:欠失型mtDNAのある特定の閾値が達成される必要がある(Sciaccoら, 1994)。タンパク質をコードするmtDNA遺伝子(3895 bp欠失により除去されたものなど)についての、ミトコンドリア呼吸鎖機能不全の閾値は、約65%以上である (Hayashiら, 1991; Chomynら, 1992)。例えば、以前の研究は、<25%の4977 bp mtDNA共通欠失を有するヒト皮膚サンプルがミトコンドリア機能の欠損を示さないことを、シトクロムオキシダーゼおよびコハク酸デヒドロゲナーゼ活性の二重組織化学的染色により決定した(Durhamら, 2002)。3895 bp欠失については組織化学的染色が存在しないことから、この欠失は、サザン分析を用いて患者サンプルにおいて定量した。適当な対照の存在下で、この分析は3895 bp欠失の存在を検出することができなかったことから、この欠失のレベルは2%〜5%未満であることが示唆された(結果は未掲載)。したがって共通欠失を用いた以前の研究に基づくと、患者サンプル中の3895 bp欠失のレベルが、真皮または表皮全体に渡る何らかの機能的効果を引き起こす可能性は低いが、ただし小さい限局的な効果は除外できない。
共通欠失の生成機構は、スリップした鎖の誤対合を介したゲノム内組換えイベントが関わっており、共通欠失に隣接する13 bp反復DNA配列において生じうると以前に提唱された(Schonら, 1989; Shoffnerら, 1989; Mitaら, 1990; Degoulら, 1001)。3895 bp欠失には12 bp反復が隣接することから、その欠失の生成は類似の機構により生じる可能性がある。共通欠失の生成機構は、前記13 bp反復がDNA屈曲され易く、そのため一本鎖DNAの小領域または「泡」が開くことができるようにする、と提唱されている(Schonら, 1989)。本実施例の結果は、3895 bp欠失の生成においてUVRが寄与因子である可能性を示唆する。この欠失の機構は、組換えイベントを促進しうる一本鎖DNAの「泡」を開くことを介して、12 bp反復中の構造的に不安定な部位に、直接または間接的に影響を及ぼすことにより生じうる。
まとめると、本実施例は、ほとんど報告されていない3895 bp-mtDNAの出現頻度が、外出時に「日常的に」日光曝露される身体部位と「時折」日光曝露される身体部位とで、有意に異なることを示した。4977 bp 共通欠失の以前の研究に使用されたのと同一のNMSCサンプルにおける3895 bp欠失の調査は、比較すると、3895 bp欠失の発生頻度がより大きいことを示した。その上、3895 bp欠失の病因と日光のUVR成分との間の関連性が、反復的な致死量未満の照射量のUVA+UVB光源を用いてin vitroにて3895 bp欠失を誘発させたことにより証明された。ヒト皮膚における3895 bp欠失の頻度は、ヒト皮膚における累積UV曝露の潜在的バイオマーカーを提供し、次いでそれがNMSC発症の早期検出ツールを提供し、また、臨床UV光線療法レジメンの長期安全性のモニタリング方法を提供しうる。
材料および方法
ヒト皮膚サンプル
腫瘍およびマッチングさせた病変部近傍の皮膚サンプルは、Out-Patients Clinic, Royal Victoria Infirmary, Newcastle, UKにて、NMSC、すなわち基底細胞癌 (BCC) (n=5, 年齢範囲55〜89歳、平均78歳)または扁平上皮細胞癌(SCC) (n=5, 年齢範囲70〜87歳、平均78歳)の切除を受けている患者からインフォームドコンセントのもとで摘出された。日光曝露研究のためには、臨床的に正常な病変部近傍の皮膚は、外出時に「日常的に」日光曝露される身体部位(頭皮、顔、首および耳など)(表皮n=30、真皮n=30、平均年齢±SEM=70.45±2.161)、ならびに「時折」日光曝露される身体部位(肩、背中および胸部)(表皮n=22、真皮n=22、平均年齢± SEM=63.77±3.501)から採取した。日常的におよび時折日光曝露された群の間に有意の年齢差はなかった(p=0.1134):両側t検定(Welch相関)。すべての病変部近傍の皮膚サンプルについて、0.25% ディスパーゼを4℃にて一晩使用して表皮と真皮を分割し(Durhamら, 2003)、次いでDNAをQiagen社のDNeasy組織抽出キットを用いて抽出した。この研究に用いた患者はいずれもmtDNA不全を有しなかった。
PCRは、200 ng ゲノムDNA、600 nMの各プライマー、250 μM dNTP、0.6 u/反応Amplitaq Gold DNAポリメラーゼ(Applied Biosystems社)、GeneAmpバッファー(100 mM Tris-HCl、pH 8.3、500 mM KCl、15mM MgClおよび0.01%(w/v)ゼラチンを含有)を含んでなる25 μl反応にて行った。PCRプライマーL404およびH4676(表9および図10)は、3895 bp欠失の外側にアニーリングするように設計した。DNA増幅において、短い(30秒)ポリメラーゼ伸長時間からは野生型PCR産物は増幅されず、より短くかつ欠失型のmtDNA断片のみの増幅が可能であった。PCR条件は、94℃にて10分、35サイクルの94℃にて30秒、56℃にて30秒、72℃にて30秒、および最終伸長として72℃にて7分というものであった。増幅産物は、臭化エチジウム (0.25μg/ml)を用いて染色した1%アガロースゲル中で視覚化された。
3895 bp欠失の定量のための、信頼できるTaqMan-PCRアッセイを開発した。この定量的TaqMan-PCR法は、二重標識されたプローブを介するPCR蓄積として、標的投入量のリアルタイム測定を提供する。プローブはフォワードプライマーとリバースプライマーとの間にアニーリングし、PCR伸長段階中にTaqポリメラーゼの5'-3' エキソヌクレアーゼ活性により切断される。したがってプローブに結合している5'末端レポーター色素FAM(6-カルボキシフルオレセイン)またはVICと3'末端消去剤色素TAMRA (6-カルボキシ-N,N,N',N'-テトラメチルローダミン)が分離され、レポーター色素の蛍光発光をもたらす。このプローブは、3'末端側がリン酸基でブロックされていることから、それ自体ではプライマーとして機能することができない。この方法は、ゲノムのシトクロムb領域に相当する内部標準プローブ(IS-プローブ、表1および図10)(Kochら, 2001)を使用して、mtDNAの総コピー数(すなわち欠失型および野生型)を推定する。3895 bp欠失のレベルは、欠失のブレークポイントにまたがるプローブ(3895-プローブ、表9および図10)により測定され、これはその欠失が存在するときにのみ増幅されることを保証する。欠失レベルの定量は、内部標準と3895 bp欠失との比率の比較により測定される。
制御領域および3895欠失の両方のクローニングは、TOPO TA Cloningキット(Invitrogen, UK)を製造者の説明書に従い使用して行った。TOPO TAクローニングは、PCR産物の3'末端に単一のデオキシアデノシン(A)を付加するという、Taqポリメラーゼのテンプレート非依存性末端トランスフェラーゼ活性を利用する。キットに付随する線状化されたベクターは、単一のオーバーハングする3'デオキシチミジン(T)残基を有し、PCR産物とベクターの効率的なライゲーションを可能にする。ベクターpCR4-TOPO中の正しい大きさの挿入物の存在は、EcoR1制限断片分析により確認された。
3895bp欠失用の定量的リアルタイムPCRアッセイの開発
3895bp mtDNA欠失を保有するミトコンドリアゲノムを確実に検出しそのコピーのパーセンテージを定量することができることを確定させた後に、内部標準プローブ(IS-プローブ)または3895欠失プローブ(3895-プローブ)のいずれかを広い範囲のテンプレート濃度に対して使用する2つのPCR反応の線形性を検討した。いずれの事例においても、テンプレートDNAは、適当なPCR産物をクローニングベクター中にクローニングすることにより作製した(方法を参照のこと)。各テンプレートの濃度を蛍光分析により測定し(GRI, UK)、次いで各プローブについて50ng〜50pgのテンプレートDNAを用いて、リアルタイムPCR増幅を行った(図11)。CT値とテンプレート濃度との関係は、3895bp欠失(r=0.9952)および内部標準(r=0.9941)の両方について線形であった。その上、各テンプレートの増幅の勾配も同じであった。このことから、各テンプレートが同じ程度の効率で増幅されることが確認された。したがって、結果として、CT値は、テンプレートDNAの測定指標として使用可能であり、また3895bp欠失型mtDNAの野生型mtDNAに対する相対量を定量するために使用可能である。欠失型:野生型mtDNAの比を正確に予測するこうした標準曲線の能力は、ある範囲のクローニングされた欠失型:野生型テンプレート混合物を使用することにより確認した(結果未掲載)。
NMSCならびに組織学的に正常な病変部近傍の真皮と表皮の両方における3895bp欠失のレベルを、リアルタイムtaqman PCRおよび以前に確立された標準PCRアッセイの両方により測定した(図12)。リアルタイムPCRにより定量された3895bp欠失のレベルは、標準的な非定量的PCR分析により推定されたレベルと概ね一致することが見出された。
累積日光曝露の部位以外の要因による混乱を回避するために、腫瘍サンプルではなく組織学的に正常な病変部近傍の皮膚を選択した。定量的リアルタイムtaqman PCRを用いて、外出時に日常的に曝露される(n=60)および時折曝露される(n=44)と定義される、種々の日光曝露された部位から得られた、104の年齢マッチングさせた分割ヒト皮膚サンプルにおける3895bp欠失のレベルを調べた。図13は、3つの対についての、日常的におよび時折日光曝露されるサンプルのリアルタイムPCRにより検出された、3895bp増幅産物および対応するレベルの3895bp欠失の、臭化エチジウム染色されたアガロースゲルの典型例を示す。図13は、日常的に日光曝露されたおよび時折日光曝露されるものにおける3895欠失のリアルタイムPCR定量および標準的PCR増幅を示しており、代表的臭化エチジウムアガロースゲルがその3895欠失の対応するレベルの典型例を示すが、これは3つの対の日常的に日光曝露されたおよび3つの対の時折日光曝露されるサンプルのリアルタイムPCRにより検出されたものである。欠失のレベルをパーセンテージとして表す。両方のパネルにおけるレーン1は分子量マーカーである(Hyperladder IV-範囲1000〜100bp, Bioline Ltd, London UK)。各PCR反応に、同じ量のテンプレートDNAを添加した。両方のパネルにおける陽性対照は、リアルタイムPCR用のテンプレートを作製するためにクローニングし配列決定したPCR産物の由来する腫瘍DNAである。リアルタイムPCRにより検出された3895bp欠失のレベルと標準PCRにより検出されたそれとの比較からも、やはりこの2つの技術の良好な相関が示された。
未使用の針コア生検サンプルを前立腺サンプルアーカイブから収集した: 62良性、49 悪性、30の腫瘍に隣接するがしかし悪性細胞を含まない生検材料。全体として、合計141のサンプル、ならびに7の追加サンプル(うち6つが標準曲線作成用であり、1つが陰性対照(試薬/反応汚染))を分析した。この完全アッセイを3回反復し、3人の別の個人がそれぞれ1回を行った。
腫瘍挙動マーカー発見のために行われた研究のさらなる潜在的結果は、六ヶ所針生検標本に基づく、前立腺内の腫瘍の位置の3次元モデルを提供する能力である。隣接良性組織中の悪性腫瘍の存在を反映する3.4kb欠失の機能は、このマッピング手法に極めて重要である。このマップは、泌尿器科医および癌専門医に対して、前立腺腫瘍のバーチャルモデルを提供し、治療判断を助けうる。
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Claims (90)
- ミトコンドリアDNA(mtDNA)を有する生物学的サンプル中の癌化傾向、癌の早期検出、癌の発生、癌の存在、癌の進行、癌の不在または日光曝露を検出する方法であって、
(a) mtDNAを含む生物学的サンプルを用意すること、
(b) 前記mtDNA中の欠失を検出すること、
を含んでなる前記方法。 - 前記欠失が、通常の集団間または集団内変化と関連しているか否か、あるいは前記欠失が癌化傾向、癌の早期検出、癌の発生、癌の存在、癌の進行、癌の不在、日光曝露または老化と関連しているか否かを判定することをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 生物学的サンプルのmtDNA中の突然変異量を決定すること、および生物学的サンプルのmtDNA中の欠失の正体を決定すること、の少なくとも1つをさらに含む、請求項1または2に記載の方法。
- 前記欠失が通常の集団間または集団内変化と関連しているか否か、あるいは前記欠失が癌化傾向、癌の早期検出、癌の発生、癌の存在、癌の進行、癌の不在、日光曝露または老化と関連しているか否かを判定するステップが、
(a) 生物学的サンプルのmtDNA をデータベースと比較すること、ここで該データベースは癌化傾向、癌の早期検出、癌の発生、癌の存在、癌の進行、癌の不在、日光曝露または老化と関連する欠失ならびに集団間および集団内の変化のデータを含む、
(b) 生物学的サンプルの合計突然変異量を決定すること、および
(c) 通常の集団間または集団内mtDNAおよび欠失を含んでいる可能性のあるmtDNAのサイクル閾値を比較すること、
の少なくとも1つを含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。 - 前記欠失が20〜60サイクルの範囲、より好ましくは25〜50サイクルの範囲、および最も好ましくは25〜35サイクルの範囲のサイクル閾値にて検出されるときに、前記悪性腫瘍または日光曝露と判定する、請求項4に記載の方法。
- 欠失の存在を検出するステップが、
(a) mtDNAを配列決定すること、
(b) PCR によりmtDNAを増幅すること、
(c) サザン、ノーザン、ウェスタンおよびサウス-ウェスタンブロットハイブリダイゼーション、
(d) 変性HPLC;
(e) マイクロアレイ、遺伝子チップまたはバイオチップへのハイブリダイゼーション、
(f) 分子マーカー分析、
(g) 増幅時における蛍光分量を検出すること、および
(h) 上記a)〜g)の任意の組み合わせ、
から選択される、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。 - 前記ミトコンドリアDNAが配列決定され、かつミトコンドリアゲノム全体を含む、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 診断が、癌化傾向、癌の早期検出、癌の発生、癌の存在、癌の進行、癌の不在、日光曝露または老化から選択される、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法の診断のための使用。
- 前記診断が、癌化傾向、癌の早期検出、癌の発生、癌の存在、癌の進行、癌の不在、日光曝露または老化の少なくとも1つの不在である、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法の診断のための使用。
- 複数の核酸メンバーと固相基盤を有するアレイであって、ここで各核酸メンバーが、癌化傾向、癌の早期検出、癌の発生、癌の存在、癌の進行、癌の不在、日光曝露または老化と関連する少なくとも1つの欠失と関連するものであり、かつミトコンドリアDNA、ミトコンドリアDNAから転写されるRNA、およびcDNAから選択され、ここで各核酸メンバーが前記アレイ上に固有の位置を有し、かつ固相基盤と安定的に結合している前記アレイ。
- 固相支持体、請求項10に記載のアレイ、前記固相支持体の固定手段、ミトコンドリアDNAの抽出手段、ミトコンドリアDNA配列のデータベースへのアクセス手段、プライマー、試薬および使用説明書からなる群より選択されるメンバーを少なくとも1つ含む、癌化傾向、癌の早期検出、癌の発生、癌の存在、癌の進行、癌の不在または日光曝露を診断するためのキット。
- 固相支持体が使い捨てチップである、請求項11に記載のキット。
- 非疾患状態と関連する正常な対照配列、集団間変化と関連する配列、集団内変化と関連する配列、あるいは癌化傾向、癌の早期検出、癌の発生、癌の存在、癌の進行、癌の不在、日光曝露または老化と関連する配列から選択されるミトコンドリアDNA配列を有するデータベース。
- 癌が前立腺癌である、請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法。
- mtDNAを有する被験体における、mtDNAゲノムの約ヌクレオチド10744〜14124に渡る欠失を検出する方法であって、
(a) 前記被験体からの生物学的サンプルを用意すること、
(b) 前記mtDNA中の前記欠失の存在を検出すること、
を含み、ここで前記欠失が前立腺癌と関連している、前記方法。 - 前記欠失が3000〜4000 bpの範囲にある、請求項14または15に記載の方法。
- 前記欠失が約3379 bpである、請求項16に記載の方法。
- 前記欠失が、10744〜14124の塩基対の全部または一部の欠失である、請求項1〜17のいずれか1項に記載の方法。
- 前記欠失が、NADHデヒドロゲナーゼサブユニット4L、NADHデヒドロゲナーゼサブユニット4、NADHデヒドロゲナーゼサブユニット5、tRNAヒスチジン、tRNA セリン2、およびtRNA ロイシン2をコードする遺伝子を実質的に含む、請求項18に記載の方法。
- mtDNA中の欠失の存在を検出するステップがPCR分析を含む、請求項14〜19のいずれか1項に記載の方法。
- 前記PCR分析が、欠失特異的PCR分析である、請求項20に記載の方法。
- 前記PCR分析が、放射性PCR分析を含む、請求項20に記載の方法。
- 前記PCRが、サイクル閾値により測定され、定量的である、請求項20に記載の方法。
- 前記PCRに蛍光標識プローブを使用する、請求項20に記載の方法。
- 前記PCRに蛍光色素を使用する、請求項20に記載の方法。
- 前記PCRがTaqMan-PCRTMである、請求項20に記載の方法。
- Roche Faststart TaqTMの使用をさらに含む、請求項23に記載の方法。
- TAG ACT ACG TAC ATA CTA ACC CTA CTC CTA (配列番号139)を含む3.4フォワード核酸プライマー。
- GAG GTA GGA TTG GTG CTG T (配列番号140)を含む3.4リバース核酸プライマー。
- 前記生物学的サンプルが、非関連組織、遠位良性組織、隣接良性組織、異型組織、前駆病巣、組織学的に異常な組織、および、悪性組織、前立腺マッサージ体液、尿または直腸指診後の尿から選択される、請求項14〜27のいずれか1項に記載の方法。
- 欠失を定量する、請求項30に記載の方法。
- 複数の核酸メンバーと固相基盤を有するアレイであって、ここで前記核酸メンバーの1つが約10744〜14124におけるmtDNA欠失と関連しており、ここで前記核酸メンバーが前記アレイ上に固有の位置を有し、かつ固相基盤と安定的に結合している前記アレイ。
- 使い捨てチップ、請求項31に記載のアレイ、前記使い捨てチップの固定手段、mtDNAの抽出手段、プライマー、試薬および使用説明書からなる群より選択される少なくとも1つのメンバーを有する、皮膚癌診断用キット。
- 被験体からの生物学的サンプルにおける、前立腺癌に向かう進行または前立腺癌の進行について、個体をモニタリングする方法であって、
(a) 前記被験体からの生物学的サンプルを用意すること、
(b) 前記生物学的サンプルからDNAを抽出すること、
(c) mtDNAの欠失の存在または不在を検出すること、
(d) 前記欠失が通常の集団間または集団内変化と関連しているか否かを判定すること、あるいは前記欠失が前立腺癌化傾向、前立腺癌に向かう進行、前立腺癌、または前立腺癌の進行の存在もしくは不在と関連するか否かを判定すること、ならびに
(e) 前記(a)〜(d)の各ステップを繰り返すこと、
を含む前記方法。 - 前記生物学的サンプルが、正常組織、遠位良性組織、隣接良性組織、疾患組織および悪性組織から選択される組織由来である、請求項34に記載の方法。
- 前立腺癌と関連する欠失の存在または不在を検出するステップが、
(a) 前記生物学的サンプルのmtDNAを請求項13に記載のデータベースと比較すること、
(b) 前記生物学的サンプルのmtDNAを、被験体由来の非関連組織もしくは非関連体液由来のmtDNAサンプルと比較すること、
(c) 前記生物学的サンプルの突然変異量を決定すること、
(d) 前記欠失を同定すること、および
(e) 前記欠失を定量すること、
の少なくとも1つを含む、請求項34または35に記載の方法。 - 前立腺癌に関連する欠失の増加、または前立腺癌に関連する欠失を有するミトコンドリアゲノム数の増加について連続的な時間に渡り被験体をモニタリングすることをさらに含む、前立腺癌に向かう進行または前立腺癌の進行をモニタリングする請求項34〜36のいずれか1項に記載の方法。
- mtDNAを有する被験体における前立腺癌化傾向、前立腺癌の早期検出、前立腺癌の発生、前立腺癌の存在、または前立腺癌の進行を検出するための、NADHデヒドロゲナーゼサブユニット4L、NADHデヒドロゲナーゼサブユニット4、NADHデヒドロゲナーゼサブユニット5、tRNAヒスチジン、tRNA セリン2、およびtRNA ロイシン2の全部または一部を含むmtDNAの約10744〜14124の間の欠失の使用。
- mtDNAゲノムの約10744〜14124に渡るmtDNA欠失の、前立腺癌用のバイオマーカーとしての使用。
- 欠失が約3000〜4000 bpである、請求項38または39に記載の使用。
- 欠失が約3379 bpである、請求項40に記載の使用。
- 前記突然変異が、前立腺癌もしくは前立腺癌に向かう進行を有する被験体、または前立腺癌を有しない被験体における、悪性組織、隣接良性組織、遠位良性組織、前駆病巣、前立腺マッサージ体液、尿、直腸指診後の尿、または血液において検出される、請求項38〜41のいずれか1項に記載の使用。
- 生検サンプルからの前立腺癌生検検査を肯定または否定する方法であって、
(a) 生検サンプル由来の正常組織を用意すること、および
(b) 前記正常組織における約3379 bpのmtDNA欠失の存在または不在を検出すること
を含む前記方法。 - 前立腺腫瘍の三次元的なマッピング方法であって、
(a) 六ヶ所針生検サンプルを用意すること、および
(b) 各六ヶ所サンプル中の約3379 bpのmtDNA欠失の存在または不在を検出すること、
を含む前記方法。 - mtDNAゲノムの約ヌクレオチド10744〜14124に渡る欠失を使用することによる前立腺癌または日光曝露の診断用の患者サンプルの収集方法であって、
(a) 被験体由来の生物学的サンプルを用意すること、
を含む前記方法。 - 前立腺癌診断用の、mtDNAゲノムの約ヌクレオチド10744〜14124に渡るミトコンドリア欠失。
- 日光曝露または非黒色腫皮膚癌の検出のための、請求項1に記載の方法。
- mtDNAを有する被験体における、mtDNAゲノムのマイナーアーク中の約ヌクレオチド547〜4443に渡る欠失の検出方法であって、
(a) 前記被験体由来の生物学的サンプルを用意すること、および
(b) 前記mtDNA中の前記欠失の存在を検出すること、
を含み、ここで前記欠失は皮膚癌および/または日光曝露と関連している前記方法。 - mtDNAを有する被験体における、累積的UV曝露の決定方法であって、
(a) 前記被験体由来の生物学的サンプルを用意すること、および
(b) mtDNAゲノムのマイナーアーク中の約ヌクレオチド547〜4443に渡る欠失の存在を検出すること、
を含む前記方法。 - 臨床UV光線療法レジメンの長期安全性をモニタリングする方法であって、
(a) 前記被験体由来の生物学的サンプルを用意すること、および
(b) mtDNAゲノムのマイナーアーク中の約ヌクレオチド547〜4443に渡る欠失の存在を検出すること、
を含む前記方法。 - 前記欠失が3500〜4000 bpの範囲である、請求項47〜50のいずれか1項に記載の方法。
- 前記欠失が約3895 bpである、請求項51に記載の方法。
- 前記欠失が、おおよそDループ中のmtTF1結合部位からtRNAメチオニンに渡るmtDNA範囲を含む、請求項47〜50のいずれか1項に記載の方法。
- 前記欠失がmtDNAゲノムのマイナーアーク中の547〜4443の間の塩基対の全部または一部の欠失である、請求項47〜50のいずれか1項に記載の方法。
- 前記欠失が、12s rRNA遺伝子、16s rRNA遺伝子、ND1遺伝子ならびにHおよびL鎖の転写用のプロモーターを実質的に含む、請求項54に記載の方法。
- 前記mtDNA中の欠失の存在を検出するステップがPCR分析を含む、請求項47〜50のいずれか1項に記載の方法。
- PCR分析が欠失特異的PCR分析である、請求項56に記載の方法。
- PCR分析が放射性PCR分析を含む、請求項56に記載の方法。
- CTT TTG GCG GTA TGC ACT TT (配列番号145)を含む核酸プライマー L404。
- GAT TAT GGA TGC GGT TGC TT (配列番号146)を含む核酸プライマー H4676。
- Deep VentTMの使用をさらに含む、請求項56に記載の方法。
- PCRが定量的である、請求項56に記載の方法。
- PCRに蛍光標識プローブを使用する、請求項56に記載の方法。
- PCRがTaqMan-PCRTMである、請求項56に記載の方法。
- TGC TAA CCC CAT ACC CCG AAA ATG TTG G Tamra (配列番号153)を含む、3895−プローブである、核酸プローブ。
- Roche Faststart TaqTMの使用をさらに含む、請求項62に記載の方法。
- 前記生物学的サンプルが非病変性皮膚由来である、請求項47〜50のいずれか1項に記載の方法。
- 前記生物学的サンプルが被験体の真皮または表皮層からのものである、請求項47〜50のいずれか1項に記載の方法。
- 欠失を定量化する、請求項62に記載の方法。
- 複数の核酸メンバーと固相基盤を有するアレイであって、ここで前記核酸メンバーの1つが約547〜4443におけるmtDNA欠失と関連しており、ここで前記核酸メンバーが前記アレイ上に固有の位置を有し、かつ固相基盤と安定的に結合している前記アレイ。
- 使い捨てチップ、請求項68に記載のアレイ、前記使い捨てチップの固定手段、mtDNAの抽出手段、プライマー、試薬および使用説明書からなる群より選択されるメンバーを少なくとも1つ有する皮膚癌診断用キット。
- 前記生物学的サンプルが、時折日光曝露される、日常的に日光曝露されるまたは希に日光曝露される組織から選択される、請求項47〜50のいずれか1項に記載の方法。
- 希に日光曝露される、時折日光曝露される、または日常的に日光曝露される皮膚における3895欠失の存在または不在を比較するステップをさらに含む、請求項72に記載の方法。
- 被験体由来の生物学的サンプルにおける日光曝露および非黒色腫皮膚癌について個体をモニタリングする方法であって、
(a) 前記被験体由来の生物学的サンプルを用意すること、
(b) 前記生物学的サンプルからDNAを抽出すること、
(c) mtDNAの欠失の存在または不在を検出すること、
(d) 前記欠失が通常の集団間もしくは集団内変化に関連しているか否か、または前記欠失が日光曝露に関連しているか否かを判定すること、および
(e) ステップ(a)〜(d)を繰り返すこと、
を含む前記方法。 - 前記生物学的サンプルが、時折日光曝露される、日常的に日光曝露される、または希に日光曝露される組織から選択される組織からのものである、請求項74に記載の方法。
- 前記日光曝露または非黒色腫皮膚癌に関連する欠失の存在または不在を検出するステップが、
(a) 前記生物学的サンプルのmtDNAを、請求項13に記載のデータベースと比較すること、
(b) 前記生物学的サンプルのmtDNAを、被験体由来の非関連組織または非関連性体液由来のmtDNAのサンプルと比較すること、
(c) 前記生物学的サンプルのmtDNAを、被験体の母方の親類由来のmtDNAのサンプルと比較すること、
(d) 前記生物学的サンプルの総突然変異量を決定すること、および
(e) 欠失を同定すること、
の少なくとも1つを含む、請求項74または75に記載の方法。 - 日光曝露もしくは非黒色腫皮膚癌に関連する欠失の増加について、または日光曝露もしくは非黒色腫皮膚癌に関連する欠失を有するミトコンドリアゲノムの数の増加について、連続的な期間に渡り被験体をモニタリングすることを含む、日光曝露または非黒色腫皮膚癌の経時的なモニタリングのための請求項74または75に記載の方法。
- mtDNAを有する被験体におけるmtDNAゲノムのマイナーアーク中の約547〜4443の間の欠失の、日光曝露または非黒色腫皮膚癌を検出するための使用。
- mtDNAゲノムの約547〜4443に渡るmtDNA欠失の、NMSCのバイオマーカーとしての使用。
- 前記欠失が約3500〜4000 bpである、請求項78に記載の使用。
- 前記欠失が約3895 bpである、請求項80に記載の使用。
- 前記欠失が、日常的に日光曝露される、時折日光曝露される、または希に日光曝露される組織から検出される、請求項78〜81のいずれか1項に記載の使用。
- mtDNAゲノムのマイナーアーク中の約ヌクレオチド547〜4443に渡る欠失を使用することによる皮膚癌診断用の患者サンプルの収集方法であって、
(a) 前記被験体由来の生物学的サンプルを用意すること、
を含む前記方法。 - 日光曝露または皮膚癌の診断用の、mtDNAゲノムのマイナーアークの約ヌクレオチド547〜4443に渡るミトコンドリア欠失。
- 日光曝露またはNMSCに関連する3895bp mtDNA欠失の存在を確認するための、配列番号147の欠失接合部配列の使用。
- サンプル中のDNA配列において新たに形成される接合部を生じる再配置を前記DNAサンプル中から高感度で検出する方法であって、
(a) 再配置を含むまたは含むことが疑われるDNAサンプルを用意すること、
(b) 前記再配置により生じる、新たに形成される接合部にまたがるプライマーまたはプローブを用意すること、
(c) 前記接合部を増幅またはプロービングすることにより、前記再配置を検出すること、を含む前記方法。 - 前記再配置が欠失である、請求項86に記載の方法。
- mtDNAサンプル中の再配置の高感度検出方法であって、
(a) 再配置を含むまたは含むことが疑われるDNAサンプルを用意すること、
(b) 前記再配置により生じる、新たに形成される接合部にまたがるプライマーまたはプローブを用意すること、
(c) 前記接合部を増幅またはプロービングすることにより前記再配置を検出すること、
を含み、ここで前記再配置はサンプル中のmtDNA配列において新たに形成される接合部を生じるものであり、かつ前記再配置は癌、疾患または老化と関連する前記方法。 - 前記再配置が欠失である、請求項88に記載の方法。
- リアルタイムPCRを用いた、欠失のブレークポイント特異的検出を含む、請求項86〜89のいずれか1項に記載の方法。
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