CN104062294A - 一种支气管/肺上皮细胞线粒体损伤的检测方法 - Google Patents

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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N21/77—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator
    • G01N21/78—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator producing a change of colour

Abstract

本发明提供的支气管/肺上皮细胞线粒体损伤的检测方法，包括以下检测步骤：取痰液，加入内预置有样本液的样本瓶中，混匀；其中，痰液量为5~10ml；样本瓶内预置的样本液为乙二胺四乙酸二钠标准液，液体量为5ml；乙二胺四乙酸二钠标准液浓度为0.02mol/L；在样本瓶内顺序加入试剂A1ml，试剂B1ml；混匀，2分钟内观察颜色变化，与比色板比对检测结果；本发明提供的检测方法，简单、快速、实用，灵敏度极高。

Description

一种支气管/肺上皮细胞线粒体损伤的检测方法
技术领域
本发明涉及一种检测方法，具体涉及一种支气管/肺上皮细胞线粒体损伤的检测方法。
背景技术
线粒体是人体细胞中最重要的细胞器，是细胞的“动力工厂”。对受损支气管、肺上皮细胞线粒体的检测包括对线粒体渗透转换孔(mitochon2dria permeability transition pore , MPTP)的检测、膜磷脂的检测、膜电位的检测、2mtDNA损伤检测、细胞内钙离子浓度检测等。此类检测操作十分复杂，需要精密的仪器设备，一般实验室很难完成，使支气管、肺上皮细胞线粒体损伤检测受到极大限制。在如上高难度检测之前，使用一种操作简单、成本低廉的方法，对支气管、肺上皮细胞线粒体是否损伤进行初步筛查，会对支气管、肺上皮细胞线粒体是否损伤起到启示作用，对是否需要进一步进行如上高难度检测起到指示作用。因此，研究发明一种支气管、肺上皮细胞线粒体损伤检测技术具有很重要的意义。
发明内容
为了解决现有技术中检测支气管、肺上皮细胞线粒体损伤的方法操作复杂、设备昂贵、难以实施的问题，本发明提供了一种通过检测痰液细胞中的游离亚铁原卟啉、进而定性确定支气管、肺上皮细胞线粒体有否损伤的检测方法，本发明提供的方法简单易行，成本低廉，可快速地筛查支气管、肺上皮细胞线粒体有否损伤。
技术方案
本发明提供的支气管/肺上皮细胞线粒体损伤的检测方法，包括以下检测步骤：
（1）取痰液，加入内预置有样本液的样本瓶中，混匀；其中，痰液量为5~10ml；样本瓶内预置的样本液为乙二胺四乙酸二钠（Na2H2Y·2H2O EDTA）标准液，液体量为5ml；优选的，乙二胺四乙酸二钠标准液浓度为0.02mol/L。
（2）在样本瓶内顺序加入试剂A 1ml，试剂B 1ml；混匀，2分钟内观察颜色变化，与比色板比对检测结果；
所述试剂A为二（4.二甲氨基苯基）甲烷溶液；优选的，二（4.二甲氨基苯基）甲烷溶液浓度为0.002mol/L的甲醇溶液；
所述试剂B为过氧化氢溶液；优选的，过氧化氢溶液为1.5%。
样本液若显蓝色或深蓝色，说明样本中含有游离亚铁原卟啉，线粒体有损伤。
在某些因素的作用下，支气管、肺上皮细胞稳态失调，出现能量代谢重编程。支气管、肺上皮细胞代谢出现瓦博格氏效应，导致细胞内低氧和还原态微环境，激活氧感受器和缺氧信号传导通路，促使缺氧特异性转录因子-低氧诱导因子和第二信使-活性氧族活性增高，改变细胞色素等细胞蛋白（HP）的极性量值，使位居蛋白疏水核中的细胞游离亚铁原卟啉（Cells Free Ferrous Protoporphyrin ）析出。细胞游离亚铁原卟啉催生多种自由基，引起细胞膜脂质、脂蛋白、细胞骨架、DNA等的氧化损伤，可使线粒体出现线粒体单价电子渗漏（univalent leak）；胞内Ca2+超载，触发线粒体摄取Ca2+并使Ca2+在线粒体内积聚；抑制线粒体内脱氢酶的功能；以上改变可使线粒体肿胀、嵴断裂崩解、钙盐沉积、外膜破裂和基质外溢。细胞游离亚铁原卟啉析出量与支气管、肺上皮细胞线粒体损伤程度呈正相关。细胞游离亚铁原卟啉析出后可在痰液中测及。作为检测手段，测定痰液中细胞游离亚铁原卟啉含量，即可提示支气管、肺上皮细胞线粒体是否损伤。
本发明提供的筛查方法，简单实用，成本低廉，可快速的筛查出支气管、肺上皮细胞中不含游离亚铁原卟啉的样本、含游离亚铁原卟啉的的样本和可能含有游离亚铁原卟啉的的样本，进而了解支气管、肺上皮细胞线粒体有否损伤，为进一步检查做准备；本发明可检测出的最低游离亚铁原卟啉的浓度可达5ng/ml，灵敏度高。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明。
实施例1
（1）取痰液，加入内预置有样本液的样本瓶中，混匀；其中，痰液量为5~10ml；样本瓶内预置的样本液为乙二胺四乙酸二钠（Na2H2Y·2H2O EDTA）标准液，液体量为5ml；优选的，乙二胺四乙酸二钠标准液浓度为0.02mol/L。
（2）在样本瓶内顺序加入试剂A 1ml，试剂B 1ml；混匀，2分钟内观察颜色变化，与比色板比对检测结果；
所述试剂A为二（4.二甲氨基苯基）甲烷溶液；优选的，二（4.二甲氨基苯基）甲烷溶液浓度为0.002mol/L的甲醇溶液；
所述试剂B为1.5%过氧化氢溶液。
判定标准
样本瓶内液体不显色或显微蓝色 （一） 阴性
蓝色 （+） 阳性
深蓝色 （++） 强阳性
显深蓝色后即刻转为深黄色或棕红色 （+++） 强阳性 显示样本内可能混有血液。若出现泡沫样物，显示标本内可能混有血液较多。
验证实验
分别取检测为不显色、显示蓝色和深蓝色的样品各三例，用质谱分析仪进行细胞游离亚铁原卟啉检测，检测结果如下：不显色均未测及细胞游离亚铁原卟啉；蓝色为5 ng/ml ，22ng/ml 、131ng/ml；深蓝色为 207ng/ml、0.12 μg/ml、0.37μg/ml 。
通过以上数据可以看出，对细胞游离亚铁原卟啉含量在5ng/ml以上的样本，本筛查方法就可以初步的判断，含量在20ng/L以上的样本本检测方法就可以确定为痰液中含有细胞游离亚铁原卟啉，提示支气管、肺上皮细胞线粒体损伤，所以本筛查方法的实用性强。

Claims (3)

1.一种支气管/肺上皮细胞线粒体损伤的检测方法，包括以下检测步骤：
（1）取痰液，加入内预置有样本液的样本瓶中，混匀；其中，痰液量为5~10ml；样本瓶内预置的样本液为乙二胺四乙酸二钠标准液，液体量为5ml；乙二胺四乙酸二钠标准液浓度为0.02mol/L；
（2）在样本瓶内顺序加入试剂A 1ml，试剂B 1ml；混匀，2分钟内观察颜色变化，与比色板比对检测结果；
所述试剂A为二（4.二甲氨基苯基）甲烷溶液；
所述试剂B为过氧化氢溶液。
2.根据权利要求1所述的检查方法，其特征在于，所述的二（4.二甲氨基苯基）甲烷溶液浓度为0.002mol/L的甲醇溶液。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的过氧化氢溶液的浓度为1.5%。
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