PT1781631E - Derivados de diarilmetilpiperazina, suas preparações e suas utilizações - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

"DERIVADOS DE DIARILMETILPIPERAZINA, SUAS PREPARAÇÕES E SUAS UTILIZAÇÕES"

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção é dirigida a novos compostos, a um processo para a sua preparação, sua utilização e a composições farmacêuticas compreendendo os novos compostos. Os novos compostos são úteis em terapia e, em particular, para o tratamento da dor, ansiedade e distúrbios gastrointestinais funcionais.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO 0 receptor delta ("δ") foi identificado como tendo um papel em muitas funções corporais, tais como nos sistemas circulatório e da dor. Os ligandos para o receptor δ podem, deste modo, ter potencial utilização como analgésicos e/ou como agentes anti-hipertensivos. Foi também demonstrado que os ligandos para o receptor δ têm actividades imunomoduladoras. A identificação de, pelo menos, três populações diferentes de receptores opióides (μ, δ e κ) está agora bem estabelecida e todas as três são notórias nos sistemas nervosos centrais e periféricos de muitas espécies, incluindo o homem. Foi observada analgesia em vários modelos animais quando um ou mais destes receptores foram activados. 1

Com poucas excepções, os ligandos δ opióides selectivos actualmente disponíveis são de natureza peptídica e são inadequados para administração através de vias sistémicas. Um exemplo de um agonista δ não peptídico é SNC80 (Bilsky E.J. et al., Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 273(1), pp. 359-366 (1995)).

Muitos compostos agonistas δ que foram identificados na técnica anterior têm muitas desvantagens, uma vez que apresentam farmacocinéticas reduzidas e não são analgésicos quando administrados através de vias sistémicas. Também foi documentado que muitos destes compostos agonistas δ apresentam efeitos convulsivos significativos quando administrados sistemicamente. A publicação PCT WO02/094794 descreve alguns agonistas δ.

Contudo, existe ainda uma necessidade para agonistas δ melhorados.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO A requerente verificou agora surpreendentemente que determinados compostos apresentam uma ou mais propriedades melhoradas, potência agonista δ, potência in vivo, farmacocinética, biodisponibilidade, estabilidade in vitro, estabilidade in vivo, penetração cerebral melhoradas e/ou toxicidade mais baixa.

Salvo indicação em contrário nesta descrição, a nomenclatura utilizada nesta descrição segue geralmente os exemplos e as regras referidas em Nomenclature of Organic Chemistry, Secções A, B, C, D, E, F e H, Pergamon Press, Oxford, 1979, a qual é 2 aqui incorporada por referência pelos seus nomes estruturais químicos exemplificativos e regras para a denominação de estruturas químicas. Opcionalmente, um nome de um composto pode ser gerado utilizando um programa de denominação química: ACD/ChemSketch, Versão 5.09/Setembro de 2001, Advanced Chemistry Development, Inc., Toronto, Canadá. "Enantiomericamente puro" refere-se a um composto contendo, pelo menos, 75% do enantiómero nomeado a partir da quantidade total dos dois enantiómeros possíveis aí contidos. Numa forma de realização particular, "enantiomericamente puro" refere-se a um composto contendo, pelo menos, 90% do enantiómero nomeado a partir da quantidade total dos dois enantiómeros possíveis aí contidos. Numa forma de realização mais particular, "enantiomericamente puro" refere-se a um composto contendo, pelo menos, 95% do enantiómero nomeado a partir da quantidade total dos dois enantiómeros possíveis aí contidos. O "animal de sangue quente" inclui humanos.

Num aspecto, fórmula I, os seus diastereómeros, um misturas: a invenção proporciona um composto de sais farmaceuticamente aceitáveis, os seus ou mais dos seus enantiómeros, e as suas 3

Numa a forma de realização adicional, o composto da presente invenção pode ser seleccionado de 4-{(R)-(3-aminofenil)[4-(4-f luorobenzil) piperazin-l-il ] metil} -N, IV-dietilbenzamida e dos seus sais farmaceuticamente aceitáveis.

Ainda numa forma de realização adicional, o composto da presente invenção pode ser seleccionado de 4-{(R)-(3-aminofenil)[4-(4-fluorobenzil)piperazin-l-il]metil}-N, IV-dietilbenzamida enantiomericamente pura,; e dos seus sais farmaceuticamente aceitáveis.

Será compreendido que quando os compostos da presente invenção contiverem um ou mais centros quirais, os compostos da invenção podem existir, e serem isolados, em formas enantioméricas ou diastereoméricas, ou como uma mistura racémica. A presente invenção inclui todos os possíveis enantiómeros, diastereómeros, racematos ou as suas misturas, de um composto de fórmula I. As formas opticamente activas do composto da invenção podem ser preparadas, por exemplo, através de separação cromatográfica quiral de um racemato, através de síntese a partir de materiais iniciais opticamente activos ou 4 através de síntese assimétrica baseada nos processos descritos posteriormente.

Será também compreendido que determinados compostos da presente invenção podem existir em formas solvatadas, por exemplo, hidratadas, assim como em formas não solvatadas. Será ainda compreendido que a presente invenção abrange todas essas formas solvatadas dos compostos de fórmula I.

Estão também no âmbito da invenção sais dos compostos de fórmula I. Geralmente, os sais farmaceuticamente aceitáveis dos compostos da presente invenção podem ser obtidos utilizando processos convencionais bem conhecidos na técnica, por exemplo, através de reacção de um composto suficientemente básico, por exemplo uma alquilamina com um ácido adequado, por exemplo HC1 ou ácido acético, para produzir um anião fisiologicamente aceitável. Pode também ser possível produzir um sal de metal alcalino (tais como sódio, potássio ou lítio) ou de metal alcalino-terroso (tal como um cálcio) correspondente por tratamento de um composto da presente invenção que tem um protão acídico apropriado, tais como um ácido carboxílico ou um fenol, com um equivalente de um alcóxido (tais como etóxido ou metóxido) ou hidróxido de metal alcalino ou alcalino-terroso, ou uma amina orgânica básica apropriada (tais como colina ou meglumina) num meio aquoso, seguido por técnicas convencionais de purificação.

Numa forma de realização, o composto de fórmula I acima, pode ser convertido num sal farmaceuticamente aceitável ou num seu solvato, particularmente, um sal de adição de ácido, tais como um cloridrato, bromidrato, fosfato, acetato, fumarato, maleato, tartarato, citrato, metanossulfonato ou p-toluenossulfonato. 5

Os novos compostos da presente invenção são úteis em terapia, especialmente para o tratamento de vários estados de dor, tais como dor crónica, dor neuropática, dor aguda, dor cancerosa, dor provocada por artrite reumatóide, enxaquecas, dor visceral etc. Contudo, esta lista não deve ser interpretada como exaustiva.

Os compostos da invenção são úteis para o tratamento de diarreia, depressão, ansiedade e/ou distúrbios relacionados com stress, tais como distúrbios de stress pós-traumático, distúrbios de pânico, distúrbio de ansiedade generalizada, fobia social e distúrbio obsessivo-compulsivo, incontinência urinária, ejaculação prematura, várias doenças mentais, tosse, edema pulmonar, vários distúrbios gastrointestinais, e. g., obstipação, distúrbios gastrointestinais funcionais, tais como síndrome do intestino irritável e dispepsia funcional, doença de Parkinson e outros distúrbios motores, lesão cerebral traumática, acidente vascular cerebral, cardioprotecção após enfarte do miocárdio, lesão na coluna e dependência de drogas, incluindo o tratamento do abuso de álcool, nicotina, opióides e outras drogas, e para distúrbios do sistema nervoso simpático, por exemplo a hipertensão.

Os compostos da invenção são úteis como imunomoduladores, especialmente para doenças auto-imunes, tais como artrite, para enxertos de pele, transplantes de órgãos e necessidades cirúrgicas semelhantes, para doenças do colagénio, várias alergias, para utilização como agentes antitumorais e agentes antivirais.

Os compostos da invenção são úteis em estados de doença em que a degeneração ou disfunção de receptores de opióides está presente ou implicada nesse paradigma. Isto pode envolver a 6 utilização de versões isotopicamente marcadas dos compostos da invenção em técnicas de diagnóstico e aplicações de imagiologia, tal como tomografia de emissão de positrões (PET).

Os compostos da invenção são úteis como um agente analgésico para utilização durante anestesia geral e em cuidados anestésicos monitorizados. As combinações de agentes com diferentes propriedades são utilizadas frequentemente para conseguir um equilíbrio de efeitos necessários para manter o estado anestésico (e. g., amnésia, analgesia, relaxação muscular e sedação). Estão Incluídos nesta combinação os anestésicos inalados, hipnóticos, ansiolíticos, bloqueadores neuromusculares e opióides.

Está no âmbito da invenção a utilização de qualquer composto de fórmula I como definido acima, para o fabrico de um medicamento.

Está também no âmbito da invenção, a utilização de qualquer composto da invenção para o fabrico de um medicamento para terapia da dor, incluindo, mas não limitada a: dor aguda, dor crónica, dor neuropática, dor nas costas, dor cancerosa e dor visceral.

Está também no âmbito da invenção a utilização de qualquer composto da invenção para o fabrico de um medicamento para terapia de ansiedade, incluindo, mas não limitada a: fobia social, distúrbio geral de ansiedade, ansiedade aguda.

Está também no âmbito da invenção a utilização de qualquer composto da invenção para o fabrico de um medicamento para terapia da depressão. 7

Está também no âmbito da invenção a utilização de qualquer composto da invenção para o fabrico de um medicamento para terapia da doença de Parkinson.

Está também no âmbito da invenção a utilização de quaisquer dos compostos da presente invenção, para o fabrico de um medicamento para tratamento de quaisquer dos estados discutidos acima.

Assim, a invenção proporciona um composto de fórmula I, ou um seu sal ou solvato f armaceut icamente aceitável, como aqui definido anteriormente para utilização em terapia.

No contexto da presente descrição, o termo "terapia" também inclui "profilaxia", salvo indicação em contrário. 0 termo "terapêutico" e "terapeuticamente" devem ser interpretados de modo adequado. 0 termo "terapia" no contexto da presente invenção abrange ainda a administração de uma quantidade eficaz de um composto da presente invenção, para mitigar um estado de doença pré-existente, agudo ou crónico, ou um estado recorrente. Esta definição abrange também terapias profilácticas para prevenção de estados recorrentes e terapia continuada para distúrbios crónicos.

Em utilização para terapia num animal de sangue quente, tal como um humano, o composto da invenção pode ser administrado na forma de uma composição farmacêutica convencional através de qualquer via, incluindo oralmente, intramuscularmente, subcutaneamente, topicamente, intranasalmente, intracerebroventricularmente e intraperitonealmente, intratoracicamente, intravenosamente, epiduralmente, intratecalmente, por injecção nas articulações.

Numa forma de realização da invenção, a via de administraçao pode ser oralmente, intravenosamente ou intramuscularmente. A dosagem irá depender da via de administração, da gravidade da doença, da idade e peso do doente e de outros factores considerados normalmente pelo médico assistente, ao determinar o regime individual e o nível de dosagem mais apropriados para um doente particular.

Adicionalmente, é proporcionada uma composição farmacêutica compreendendo um composto da presente invenção, seus solvatos, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, em associação com um veículo farmaceuticamente aceitável.

Particularmente, é proporcionada uma composição farmacêutica compreendendo um composto da presente invenção, seus solvatos, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, em associação com um veículo farmaceuticamente aceitável para terapia, mais particularmente, para terapia da dor e da ansiedade.

Além disso, é proporcionada uma composição farmacêutica compreendendo um composto da presente invenção, seus solvatos, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, em associação com um veículo farmaceuticamente aceitável para utilização em qualquer dos estados discutidos acima.

Para preparar composições farmacêuticas a partir dos compostos desta invenção, os veículos farmaceuticamente aceitáveis inertes podem ser sólidos e líquidos. As preparações de forma sólida incluem pós, comprimidos, grânulos dispersíveis, cápsulas, hóstias e supositórios. 9

Um veículo sólido pode ser uma ou mais substâncias, as quais podem também actuar como diluentes, agentes aromatizantes, solubilizantes, lubrificantes, agentes de suspensão, aglutinantes ou agentes de desintegração de comprimidos; pode também ser um material encapsulante.

Nos pós, o veículo é um sólido finamente dividido, o qual está numa mistura com o composto da invenção finamente dividido, ou o componente activo. Nos comprimidos, o componente activo é misturado com o veículo que tem as necessárias propriedades de ligação, em proporções adequadas, e compactado na formas e tamanhos desejados.

Para preparar composições de supositório, uma cera de baixo ponto de fusão, tal como uma mistura de glicéridos de ácidos gordos e manteiga de cacau, é primeiro derretida e o ingrediente activo é aí disperso através, por exemplo, de agitação. A mistura homogénea derretida é depois vertida em moldes de tamanhos convenientes e deixada a arrefecer e solidificar.

Os veículos adequados são carbonato de magnésio, estearato de magnésio, talco, lactose, açúcar, pectina, dextrina, amido, tragacanto, metilcelulose, carboximetilcelulose de sódio, uma cera de baixo ponto de fusão, manteiga de cacau e semelhantes. 0 termo composição pretende também incluir a formulação do componente activo com material encapsulante, como um veículo que proporciona uma cápsula na qual o componente activo (com ou sem outros veículos) é rodeado por um veículo que está, assim, em associação com este. De modo semelhante, estão incluídas hóstias. 10

Os comprimidos, pós, hóstias e cápsulas podem ser utilizados como formas de dosagem sólida adequadas para administração oral.

As composições em forma liquida incluem soluções, suspensões e emulsões. Por exemplo, as soluções de água estéril ou de propilenoglicol aquoso dos compostos activos podem ser preparações liquidas adequadas para administração parentérica. As composições liquidas podem também ser formuladas em solução na forma de solução aquosa de polietilenoglicol.

As soluções aquosas para administração oral podem ser preparadas por dissolução do componente activo em água e adição de corantes, agentes aromatizantes, estabilizadores e agentes espessantes adequados, como desejado. As suspensões aquosas para utilização oral podem ser preparadas por dispersão do componente activo finamente dividido em água, conjuntamente com um material viscoso, tais como gomas sintéticas naturais, resinas, metilcelulose, carboximetilcelulose de sódio e outros agentes de suspensão conhecidos na técnica de formulação farmacêutica.

Dependendo do modo de administração, a composição farmacêutica incluirá, de um modo preferido, desde 0,05% a 99% em peso (percentagem em peso) , de um modo mais preferido, desde 0,10 a 50% em peso, do composto da invenção, sendo todas as percentagens em peso baseadas na composição total.

Uma quantidade terapeuticamente eficaz para a prática da presente invenção pode ser determinada através da utilização de critérios conhecidos, incluindo idade, peso e resposta do doente individual, e interpretada no contexto da doença que está a ser tratada ou que está a ser prevenida, por um técnico com conhecimento geral na matéria. 11

Num aspecto adicional, a presente invenção proporciona um método de preparação de compostos da presente invenção.

Numa forma de realização, a invenção proporciona um processo para preparar um composto de fórmula I, compreendendo:

NH,

NO, "intermediário nitro” fazer reagir iV, iV-dietil-4-[ (3-nitrof enil) (1- piperazinil)metil]-benzamida com R-CH2X ou R-CHO para formar um composto intermediário nitro; reduzir o referido composto intermediário com um agente redutor adequado, em que R é seleccionado de 2-fluorofenilo, 3-fluorofenilo e 4-f luorofenilo; e X é seleccionado de Cl, I, Br, -OTs (tosilo) e -OMs (mesilato).

Numa forma de realização, o referido agente redutor pode ser seleccionado de hidrogénio, zinco e ferro.

Noutra forma de realizaçao, a referida N,N-dietil-4-[(3-nitrofenil)(1-piperazinil)metil]benzamida pode ser seleccionada 12 de N, IV-diet il-4 - [(S)-(3-nitrofenil) (1-piperazinil) met il ] benzamida e N,N-dietil-4-[(R)-(3-nitrofenil)(1-piperazinil)- metil]benzamida.

Numa forma de realização adicional, R pode ser 4-fluorofenilo; e o composto de fórmula I pode ser 4-[(3-aminofenil) [4 —[(4-fluorofenil)metil]-1-piperazinil] metil]-N, IV-diet ilbenzamida.

Mais particularmente, os compostos da presente invenção e os intermediários utilizados para a sua preparação podem ser preparados de acordo com as vias sintéticas como exemplificadas nos Esquemas 1 e 2. 13 ο ο NHEtj, NEtj, CH2CI2

Cl (í

I

Intermediário t NO,

O

Esquema 1

1. BuLi, THF, tolueno, -78 “C

1. SOBrj.CHjClj 2. piperazina, MeCN

Intermediário 2 Ácido di-p-tolui I-L-tartãrico

Intermediário 4a: enatíómero (S)

Intermediário 4b: enatíómero (R) 14

Esquema 2 ο

intermediário 4a: enatiómero (S) O

intermediário 4b: enatiómero (R)

1) R1-CHO NaBH(OAc)3 1,2-Dicloroetano 2) Ferro NH4CI Etano! THF Água ou H2Pd/C Etarol

Enantiómero (S):

Composto 1: R1 = 4-fluorofenilo;

Enantiómeros (R):

Composto 2: R1 = 4-fluorofenilo; Composto 3: R1 = 2-fluorofenilo; Composto 4: R1 = 3-fluorofenilo.

AVALIAÇÃO BIOLÓGICA E PROPRIEDADES

Verificou-se que os compostos da invenção são activos relativamente a receptores δ em animais de sangue quente, e. g., humanos. Particularmente, verificou-se que os compostos da invenção são ligandos eficazes do receptor δ. Ensaios in vitro, infra, demonstraram estas actividades surpreendentes, especialmente relativamente à potência agonista e eficácia como demonstrado no ensaio funcional de cérebro de rato e/ou no ensaio funcional do receptor δ humano (baixo). Esta caracteristica pode ser relacionada com a actividade in vivo e não pode ser correlacionada linearmente com a afinidade de ligação. Nestes ensaios in vitro, um composto é testado para a 15 sua actividade relativamente a receptores δ e a IC50 é obtida para determinar a actividade selectiva para um composto particular relativamente a receptores δ. No contexto actual, a IC50 refere-se geralmente à concentração do composto na qual é observada 50% de substituição de um ligando radioactivo convencional do receptor δ.

As actividades do composto relativamente a receptores κ e μ são também medidas num ensaio semelhante.

Modelos in vitro

Cultura de células

As células 293S humanas que expressam os receptores κ, δ e μ humanos clonados e a resistência à neomicina foram cultivadas em suspensão a 37 °C e 5% de C02, em balões de agitação contendo DMEM sem cálcio com 10% de FBS, 5% de BCS, 0,1% de Pluronic F-68 e 600 pg/mL de geneticina.

Os cérebros de rato são pesados e lavados com PBS gelado (contendo 2,5 mM de EDTA, pH 7,4). Os cérebros são homogeneizados com um polytron durante 30 segundos (rato) em tampão de lise gelado (50 mM de Tris, pH 7,0, 2,5 mM de EDTA, sendo adicionado fenilmetilsulfonilfluoreto imediatamente antes da utilização a 0,5 MmM, a partir de um stock a 0,5 M em DMSO:etanol). 16

Preparaçao de membrana

As células são sedimentadas e ressuspensas em tampão de lise (50 mM de Tris, pH 7,0, 2,5 mM de EDTA, sendo adicionado PMSF imediatamente antes da utilização a 0,1 mM, a partir de um stock de 0,1 M em etanol), incubadas em gelo durante 15 minutos, depois homogeneizadas com um polytron durante 30 segundos. A suspensão é centrifugada a 1000 g (máx) durante 10 minutos a 4 °C. O sobrenadante é mantido em gelo e os sedimentos ressuspensos e centrifugados como anteriormente. Os sobrenadantes de ambas as centrifugações são combinados e centrifugados a 46000 g (máx) durante 30 minutos. Os sedimentos são ressuspensos em tampão Tris frio (50 mM de Tris/Cl, pH 7,0) e centrifugados novamente. Os sedimentos finais são ressuspensos em tampão de membranas (50 mM de Tris, 0,32 M de sacarose, pH 7,0). Fracções (1 mL) em tubos de polipropileno são congeladas em gelo seco/etanol e armazenadas a -70 °C até utilização. As concentrações de proteína são determinadas através de um ensaio modificado de Lowry com dodecilsulfato de sódio.

Ensaios de ligação

As membranas são descongeladas a 37 °C, arrefecidas em gelo (ou mantidas em gelo se não forem utilizadas imediatamente) , passadas 3 vezes através de uma agulha de calibre 25 e diluídas em tampão de ligação (50 mM de Tris, 3 mM de MgCl2, 1 mg/mL de BSA (sigma A-7888), pH 7,4, o qual é armazenado a 4 °C após filtração através de um filtro de 0,22 m, e ao qual foram adicionados de fresco 5 pg/mL de aprotinina, 10 μΜ de bestatina, 10 μΜ de diprotina A se as membranas forem derivadas de tecido (rato, murganho, macaco, sem DTT). Fracções de 100 pL são 17 adicionadas a tubos de polipropileno gelados de 12x75 mm contendo 100 pL do radioligando apropriado e 100 pL de composto de teste a várias concentrações. A ligação total (TB) e não especifica (NS) são determinadas na ausência e presença de 10 pM de naloxona, respectivamente. Os tubos são submetidos a vórtice e incubados a 25 °C durante 60-75 minutos, após este tempo os conteúdos são rapidamente filtrados em vácuo e lavados com cerca de 12 mL/tubo de tampão de lavagem gelado (50 mM de Tris, pH 7,0, 3 mM de MgCl2) através de filtros GF/B (Whatman) pré-embebidos durante, pelo menos, 2 h em 0,1% de polietilenoimina. A radioactividade (dpm) retida nos filtros é medida com um contador beta após embeber os filtros durante, pelo menos, 12 h em mini-frasquinhos contendo 6-7 mL de liquido de cintilação. Se o ensaio for estabelecido em placas de 96 poços fundos, a filtração é através de unifiltros embebidos com PEI de 96 lugares que são lavados com tampão de lavagem 3 x 1 mL e secos numa estufa a 55 °C durante 2 h. As placas de filtração são contadas num TopCount (Packard) após adição de 50 pL/poço de líquido de cintilação MS-20. No caso de ensaios realizados em placas de 96 poços fundos, as IC50 dos compostos são avaliadas a partir de curvas de substituição de 10 pontos no caso de Delta e curvas de substituição de 5 pontos no caso de Miú e Capa. O ensaio é realizado em 300 pL com a quantidade apropriada de proteína membranar (2 pg, 35 pg e 1 pg, no caso de Delta, Miú e Capa, respectivamente) e 50000-80000 dpm/poço do marcador apropriado (1251-Deltorphin II, 125I-FK33824 e 125I-DPDYN para Delta, Miú e Capa, respectivamente). A ligação total e a ligação não especifica são determinadas na ausência e presença de 10 pM de Naloxona. 18

Ensaios Funcionais A actividade agonista dos compostos é medida por determinação do nível a que o complexo compostos receptor activa a ligação de GTP a proteínas G, às quais os receptores estão acoplados. No ensaio de ligação a GTP, o GTP[y]35S é combinado com os compostos de teste e as membranas de células HEK-293S que expressam os receptores opióides humanos clonados ou a partir de o cérebro homogeneizado de rato ou murganho. Os agonistas estimulam a ligação de GTP[y]35S nestas membranas. Os valores de EC50 e Emax dos compostos são determinados a partir de curvas de resposta à dose. Desvios para a direita da curva de resposta à dose pelo antagonista de delta naltrindole são realizados para verificar que a actividade agonista é mediada através de receptores delta. Para ensaios funcionais do receptor δ humano, o EC50 (baixo) é medido quando os receptores δ humanos utilizados no ensaio foram expressos a níveis mais baixos comparativamente com aqueles utilizados na determinação de EC50 (alto). Os valores de Emax foram determinados em relação ao agonista δ padrão SNC80, i. e., maior que 100% é um composto que tem melhor eficácia do que SNC80.

Processo para GTP de cérebro de rato

As membranas de cérebro de rato são descongeladas a 3 7 °C, passadas 3 vezes através de uma agulha romba de calibre 25 e diluídas em GTPyS de ligação (50 mM de Hepes, 20 mM de NaOH, 100 mM de NaCl, 1 mM de EDTA, 5 mM de MgCÍ2, pH 7,4, adicionados de fresco: 1 mM de DTT, 0,1% de BSA). É adicionado 120 μΜ de GDP final às diluições das membranas. Os EC50 e Emax dos compostos são avaliados a partir de curvas de resposta à dose com 10 pontos, realizados em 300 pL com a quantidade apropriada da proteína 19 membranar (20 pg/poço) e 100000-130000 dpm de GTPy35S por poço (0,11-0,14 nM) . A ligação basal e máxima estimulada são determinadas na ausência e presença de 3 μΜ de SNC80. 0 ensaio realizado em células HEK-293S que expressam estavelmente receptores delta clonados é feito num tampão ligeiramente diferente (50 mM de Hepes, 20 mM de NaOH, 200 mM de NaCl, 1 mM de EDTA, 5 mM de MgCÍ2, pH 7,4, adicionados de fresco: 0,5% de BSA, sem DTT) e com uma conc. final de GDP de 3 μΜ.

Análise de dados A ligação especifica (SB) foi calculada como TB-NS e a SB na presença de vários compostos de teste foi expressa como percentagem de controlo SB. Os valores de IC50 e do coeficiente de Hill (nH) para ligandos na substituição especifica de radioligando ligado foram calculados a partir de representações gráficas logit ou programas de ajuste de curva, tais como Ligand, GraphPad Prism, SigmaPlot ou ReceptorFit. Os valores de Ki foram calculados a partir da equação de Cheng-Prussoff. Foram descritos valores médios ± S.E.M. de IC50, Ki e nH para ligandos testados em, pelo menos, três curvas de substituição. A Tabela I mostra alguns dos dados biológicos de determinados compostos da invenção medidos utilizando os ensaios descritos acima. 20

Estrutura IC50hd H O IC50hm EC50h (baixo) EC50h (baixo) Emax ECsoh (alto) EC50h (alto) Emax ECsorb ECsorb Emax ^/CçCX, 0 & 0, 587 5524 715 20,63 95,3 4,18 103,8 22,82 130, 3 ú N 8, 80 >10000 3316 N/D N/D 100, 3 89, 09 465, 9 66,32 ΥθψΟι„ 0 oj 0, 717 7258 2262 48,10 89,96 N/D N/D N/D N/D VofOç ó N tf t 1, 08 5767 2736 77, 42 84, 44 N/D N/D N/D N/D N/D: não disponível

Experiências de Saturaçao de Receptor

Os valores Κδ de radioligando são determinados através da realização de ensaios de ligação em membranas celulares com os radioligandos apropriados a concentrações que variam desde 0,2 a 5 vezes o Kõ estimado (até 10 vezes, se as quantidades requeridas de radioligando forem praticáveis). A ligação especifica de radioligando é expressa como pmole/mg de proteína membranar. Os valores de Κδ e Bmax de experiências individuais são obtidos a partir de ajustes não-lineares de radioligando especificamente ligado (B) versus nM livre (F) a partir de individuais de acordo com um modelo de um local. 21

Determinação de Mecano-Alodínia Utilizando o Teste de Von Frey 0 teste é realizado entre as 08:00 e 16:00 h utilizando o método descrito por Chaplan et al. (1994). Os ratos são colocados em gaiolas de Plexiglas sobre um fundo de malha de arame que permite o acesso às patas e são deixados a ambientar durante 10-15 minutos. A área testada é a área central da pata traseira esquerda, evitando as almofadas menos sensíveis da pata. A pata é tocada com uma série de 8 pêlos de von Frey com rigidez crescente logaritmicamente (0,41, 0,69, 1,20, 2,04, 3,63, 5,50, 8,51 e 15,14 gramas; Stoelting, III, EUA). O pêlo de von Frey é aplicado a partir debaixo do fundo de malha, perpendicularmente à superfície da pata, com força suficiente para causar uma ligeira deformação contra a pata e mantido durante aproximadamente 6-8 segundos. Uma resposta positiva é assinalada se a pata for retirada rapidamente. O estremecimento imediatamente após remoção do pêlo também é considerada uma resposta positiva. A deambulação é considerada uma resposta ambígua e, nesses casos, o estímulo é repetido.

Protocolo de Teste

Os animais são testados no dia 1 pós-operatório para o grupo tratado com FCA. O limite de 50% de retirada é determinado utilizando o método cima-abaixo de Dixon (1980) . O teste é iniciado com o pêlo de 2,04 g, no meio da série. Os estímulos são sempre apresentados de uma forma consecutiva, crescente ou decrescente. Na ausência de uma resposta de retirada da pata ao pêlo inicialmente seleccionado, é apresentado um estímulo mais forte; no caso de retirada da pata, é escolhido o estímulo mais fraco seguinte. O cálculo do limite óptimo por este método 22 requer 6 respostas na vizinhança imediata do limite de 50% e a contagem destas 6 respostas começa quando ocorre a primeira alteração na resposta, e. g., o limite é cruzado pela primeira vez. Nos casos em que os limites caem fora da gama de estímulos, são atribuídos valores de 15,14 (sensibilidade normal) ou 0,41 (alodínia máxima), respectivamente. O perfil resultante de respostas positivas e negativas é tabulado utilizando a convenção, X = sem retirada; O = retirada e o limite de retirada de 50% é interpolado utilizando a fórmula:

Limite 50% g = l0<xr+kS) / 10 000 em que Xf = o valor do último pêlo de von Frey utilizado (unidades log); k = valor tabulado (de Chaplan et al. (1994)) para o perfil de respostas positivas/negativas; e δ = diferença média entre estímulos (unidades log). Aqui δ = 0,224.

Os limites de von Frey são convertidos em percentagem de efeito máximo possível (% de MPE) de acordo com Chaplan et al. 1994. A seguinte equação é utilizada para calcular a % de MPE: % de MPE — Limite tratado com fármaco (g) - limite de alodínia (g^ X 100 Limite de controlo (g) · limite de alodínia (g)

Administração da Substância de Teste

Os ratos são injectados (subcutaneamente, intraperitonealmente, intravenosamente ou oralmente) com uma substância de teste antes do teste de von Frey e o tempo entre a 23 administração do composto de teste e o teste de von Frey varia dependendo da natureza do composto de teste.

Teste de Contorção 0 ácido acético irá provocar contracções abdominais quando administrado intraperitonealmente em murganhos. Estas estender-se-ão depois ao corpo num perfil típico. Quando os fármacos analgésicos são administrados, este movimento descrito é observado menos frequentemente e o fármaco é seleccionado como um potencial bom candidato.

Um reflexo de contorção completo e típico é considerado apenas quando os seguintes elementos estão presentes: o animal não está em movimento; a parte traseira inferior está ligeiramente comprimida; é observável o aspecto plano de ambas as patas. Neste ensaio, os compostos da presente invenção demonstram uma inibição significativa de respostas de contorção após uma dosagem oral de 1-100 pmol/kg. (i) Preparaçao de soluções Ácido acético (AcOH) : 120 pL de ácido acético são adicionados a 19,88 mL de água destilada de modo a obter um volume final de 20 mL com uma concentração final de 0,6% de AcOH. A solução é depois misturada (vórtice) e está pronta para injecção.

Composto (fármaco): Cada composto é preparado e dissolvido no veículo mais adequado de acordo com processos convencionais. 24 (ii) Administração de soluções 0 composto (fármaco) é administrado oralmente, intraperitonealmente (i.p.), subcutaneamente (s.c.) ou intravenosamente (i.v.) a 10 mL/kg (considerando o peso corporal médio dos murganhos) 20, 30 ou 40 minutos antes do teste (de acordo com a classe do composto e das suas caracteristicas) . Quando o composto for distribuído centralmente: é administrado intraventricularmente (i.c.v.) ou intratecalmente (i.t.) um volume de 5 pL. O AcOH é administrado intraperitonealmente (i.p.) em dois locais a 10 mL/kg (considerando o peso corporal médio dos murganhos) imediatamente antes do teste. (iii) Teste O animal (murganho) é observado durante um período de 20 minutos e o número de ocasiões (reflexo de contorção) anotado e compilado no final da experiência. Os murganhos são mantidos em gaiolas individuais de tipo "caixa de sapato" em contacto com a cama da mesma. É geralmente observado ao mesmo tempo um total de 4 murganhos: um controlo e três doses de fármaco.

Para as indicações de ansiedade e de tipo ansiedade, a eficácia foi estabelecida no teste de conflito do Geller-Seifter em ratos.

Para a indicação de distúrbio gastrointestinal funcional nos ratos, a eficácia pode ser estabelecida no ensaio descrito por Coutinho SV et al., no American Journal of 25

Physiology - Gastrointestinal & Liver Physiology. 282(2):G307-16, Fevereiro de 2002.

PROTOCOLOS ADICIONAIS DE TESTE IN VIVO

Indivíduos e alojamento

Ratos Sprague-Dawley machos naives (175-200 g) são alojados em grupos de 5 numa sala com a temperatura controlada (22 °C, 40-70% de humidade, 12 h de luz/escuro). As experiências são realizadas durante a fase clara do ciclo. Os animais têm alimento e água ad libitum e são sacrificados imediatamente após a aquisição de dados.

Amostra O teste dos compostos (Fármacos) inclui grupos de ratos que não recebem qualquer tratamento e outros que são tratados com lipopolissacárido (LPS) de E. coli. Para a experiência com tratamento com LPS, quatro grupos são injectados com LPS, um dos quatro grupos é depois tratado com veículo, enquanto os outros três grupos são injectados com fármaco e o seu veículo. Um segundo conjunto de experiências é realizado envolvendo cinco grupos de ratos; todos eles não recebem qualquer tratamento com LPS. O grupo nafve não recebe qualquer composto (fármaco) ou veículo; os outros quatro grupos são tratados com veículo, com ou sem fármaco. Estes testes são realizados para determinar os efeitos ansiolíticos ou sedativos dos fármacos que podem contribuir para uma redução em USV. 26

Administração de LPS

Os ratos são deixados a ambientarem-se ao laboratório experimental durante 15-20 minutos antes do tratamento. A inflamação é induzida por administração de LPS (endotoxina da bactéria gram-negativa E. coli, serotipo 0111:B4, Sigma). O LPS (2,4 pg) é injectado intracerebroventricularmente (i.c.v.), num volume de 10 pL, utilizando técnicas estereotáxicas cirúrgicas convencionais sob anestesia com isoflurano. A pele entre as orelhas é agarrada de forma rostral e é feita uma incisão longitudinal de cerca de 1 cm para expor a superfície do crânio. O local da punção é determinado através das coordenadas: 0,8 mm posteriormente à bregma, 1,5 mm lateralmente (esquerda) à lambda (sutura sagital) e 5 mm abaixo da superfície do crânio (vertical) no ventrículo lateral. O LPS é injectado através de uma agulha de aço inoxidável estéril (26-G 3/8) de 5 mm de comprimento ligada a uma seringa Hamilton de 100 pL através de um tubo de polietileno (PE20; 10-15 cm) . Um travamento de 4 mm feito de uma agulha cortada (20—G) é colocado e preso à agulha de 26-G através de cola de silicone, de modo a criar a profundidade desejada de 5 mm.

Depois da injecção de LPS, a agulha permanece no lugar durante mais 10 s para permitir a difusão do composto, depois é removida. A incisão é fechada, o rato é retornado à sua gaiola original e deixado a descansar durante um mínimo de 3,5 h antes do teste.

Esquema experimental para estimulação com baforadas de ar

Os ratos permanecem no laboratório experimental após injecção com LPS e da administração do composto (fármaco). No 27 momento do teste, todos os ratos são removidos e colocados fora do laboratório. De cada vez é trazido um rato para o laboratório de teste e colocado numa caixa transparente (9 x 9 x 18 cm) que é depois colocada num cubículo ventilado com atenuação de som que mede 62(1) x 35(c) x 46(a) cm (BRS/LVE, Div. Tech-Serv Inc). A distribuição de baforadas de ar, através de um bocal de saída de ar de 0,32 cm, é controlada através de um sistema (AirStim, San Diego Intruments) capaz de distribuir baforadas de ar de duração fixa (0,2 s) e de intensidade fixa com uma frequência de 1 baforada por 10 s. É administrado um máximo de 10 baforadas, ou até ao início de vocalizações, aquele que for primeiro. A primeira baforada de ar marca o início do registo.

Esquema experimental para registo de ultrassons

As vocalizações são registadas durante 10 minutos utilizando microfones (G.R.A.S. sound and vibrations, Vedbaek, Dinamarca) colocados dentro de cada cubículo e controlados por software LMS (LMS CADA-X 3.5B, Data Acquisition Monitor, Troy, Michigan). As frequências entre 0 e 32000 Hz são registadas, guardadas e analisadas pelo mesmo software (LMS CADA-X 3.5B, Time Data Processing Monitor and UPA (User Programming and Analysis)).

Compostos (fármacos)

Todos os compostos (fármacos) têm o pH ajustado entre 6,5 e 7,5 e são administrados num volume de 4 mL/kg. Após a administração do composto (fármaco), os animais são retornados às suas gaiolas originais até ao momento do teste. 28

Análise 0 registo é submetido a uma série de análises estatísticas e de Fourier para filtrar (entre 20-24 kHz) e para calcular os parâmetros de interesse. Os dados são expressos como a média ± SEM. O significado estatístico é avaliado utilizando o teste T para comparação entre ratos naive e tratados com LPS, e ANOVA unidireccional seguida por teste de comparação múltipla de Dunnett (pós-hoc) para a eficácia do fármaco. Uma diferença entre grupos é considerada significativa com um valor de p mínimo <0,05. As experiências são repetidas um mínimo de duas vezes.

Determinação da hiperalgesia térmica utilizando o teste plantar de Hargreaves

Administração de FCA ou carragenina

Adjuvante Completo de Freund (FCA): SIGMA N° de cat. F 5881, Mycobacterium tuberculosis (H37Ra, ATCC 25177), 1 mg/mL, mortos pelo calor, secos, 0,85 mL de parafina, 0,15 mL de monooleato de manida, ou carragenina Lambda tipo IV (Cg): SIGMA N° de cat. C-3889, (gelatina, vegetal; Musgo-da-Irlanda), (solução a 1,0%) em NaCl.

As injecções são realizadas com uma seringa de Hamilton com uma agulha estéril de tamanho 26G5/8". Os ratos são manipulados e colocados na câmara para anestesia com isoflurano. Quando o efeito desejado for alcançado, os ratos são removidos e colocados em decúbito ventral (posição esternal). A pata traseira esquerda é agarrada e a agulha é introduzida subcutaneamente, aspecto ventral, entre a almofada do dedo N° 2 29 e N° 3, de modo a alcançar o meio da pata (área metatársica) . Por último, um volume de 100 pL de FCA ou de 100 pL de solução de carragenina é injectado lentamente na pata e é aplicada uma pequena pressão durante 3-4 segundos, após a remoção das agulhas.

Se os animais acordarem durante o processo, estes são então retornados à câmara de inalação até ser alcançado o efeito desejado.

Após a injecção intraplantar, os animais são deixados a acordar na sua gaiola sob observação.

Para o tratamento com FCA, os ratos são deixados 48 horas para o desenvolvimento do processo inflamatório. Para o tratamento com carragenina, os ratos são deixados 3 horas para o desenvolvimento do processo inflamatório. Na manhã do teste, os ratos são colocados no laboratório (nas suas gaiolas). São deixados a ambientarem-se à sala durante, pelo menos, 30 minutos.

Local de Teste O estimulo de calor é aplicado ao centro da superfície plantar, entre as almofadas. O local de teste deve estar em contacto com o vidro, sem urina ou fezes pelo meio, de modo a manter as correctas propriedades de transferência de calor do vidro para a pele. O dispositivo plantar consiste numa caixa com um topo/plataforma de vidro, sendo a superfície de vidro mantida a 30 °C através de um mecanismo interno de retroalimentação. 30

Debaixo desta plataforma de vidro está uma lâmpada montada num braço móvel, sendo um espelho colocado por baixo para permitir que a luz seja posicionada sob a pata de rato. Quando a luz é activada, esta passa através de uma abertura de ~2 mm de diâmetro. 0 experimentador activa a luz e os sensores automáticos desligam a luz quando a pata é removida; um limite de 20,48 segundos garante que não vai ocorrer lesão do tecido se o rato não remover a sua pata. O experimentador pode também desligar a luz em qualquer momento. Um temporizador irá registar a duração de tempo que a luz está activada.

Medidor de fluxo: mede o fluxo/cm2 quando a luz está activada. Este deve ser mantido a -97-98; o fluxo pode ser modificado por ajuste do dispositivo plantar, mas não deve ser alterado no meio de uma experiência.

Decurso no Tempo A experiência pode ser realizada após períodos variados de tempo no seguimento da indução de inflamação. A hiperalgesia é medida 48 h após injecção com FCA ou 3 h após injecção com carragenina.

Processo de teste

Ratos naive; Para o processo de estabelecimento de uma Curva de Resposta à Dose, um grupo de 7 ratos é utilizado como um grupo de controlo; são anestesiados com os 28 ratos restantes, mas não lhes é administrada qualquer injecção. O teste do grupo naive pode ser realizado antes do início da experiência ou imediatamente após, com o mínimo possível de stress, sendo os 31 ratos colocados em caixas individuais de Plexiglas (14 x 21 x 9 cm) no topo do dispositivo plantar; são deixados a ambientarem-se durante um período de 30 minutos. Quando os animais estão prontos para o teste, a luz é colocada directamente sob o local de teste e activada, e é registada a latência da retirada. Após um período de 5-8 minutos, para permitir que a temperatura da pele retorne ao normal, é realizada uma segunda leitura e os ratos são depois removidos e recolocados nas suas gaiolas.

Valores de linha de base: Os 28 ratos restantes (divididos em 4 grupos) que foram injectados com FCA (ou carragenina) são colocados em caixas individuais na máquina e deixados para se ambientarem durante 30 minutos. O experimentador deve verificar o grau de inflamação da pata e verificar se existe descoloração. O estímulo de calor é colocado sob o local de teste e é registada a latência da retirada; são realizadas duas leituras, como acima. É a comparação destes valores de linha de base com aqueles dos animais naives que estabelece se a hiperalgesia está presente.

Teste pós-fármaco: Uma vez estabelecida a hiperalgesia, os ratos são injectados com o composto de interesse. Cada composto é preparado e dissolvido no veículo mais adequado de acordo com processos convencionais. A via de administração, doses, volumes e tempo de teste após injecção, são específicos para esse composto (ou classe de compostos). Quando se testa compostos a 20-30 minutos pós injecção, tais como para injecções i.v. ou s.c., os ratos são colocados e deixados a ambientarem-se no dispositivo plantar enquanto o fármaco produz o seu efeito. Ao testar compostos a 60 minutos ou mais após a injecção, os ratos são colocados de volta às suas gaiolas originais com os seus companheiros de gaiola. Os ratos são sempre recolocados nas suas 32 gaiolas originais com os seus companheiros de gaiola originais para minimizar o stress do restabelecimento de uma estrutura social dentro de um grupo de ratos. Após 30 minutos, os ratos são colocados no dispositivo plantar e deixados 30 minutos para se ambientarem à máguina. O teste é realizado como descrito acima. São realizadas duas leituras.

Critérios para o Teste: O animal deve estra calmo e sossegado, contudo alerta, e na posição correcta, sem urina ou fezes entre a pele da pata e a superfície de vidro da máguina. Um animal não deverá ser testado se: 0 animal estiver em movimento, incluindo a cheirar, a limpar e a explorar. 0 animal estiver a dormir. O animal estiver a mostrar sinais óbvios de stress (imobilidade, vocalizações, orelhas caídas), a menos que estes sejam o resultado possível de um efeito secundário do composto e não puderem ser evitados. 0 animal estiver posicionado de tal modo que a pata não esteja em contacto directo com o vidro (a pata pousada sobre a cauda); A pata do animal apresentar coloração azulada como resultado de uma má injecção. Neste caso, o animal é totalmente rejeitado da experiência (no início).

Quando estiverem presentes urina e fezes, o animal é removido, a superfície do vidro é limpa e depois o animal é recolocado. Quando o animal estiver a dormir ou apresentar imobilidade tónica, o experimentador pode mover cuidadosamente a 33 caixa ou mover a sua mão em frente da caixa para induzir a curto prazo um comportamento de atenção. Deve ser realizada uma observação cuidada do comportamento do animal durante todo o teste.

Testar Novamente:

Em qualquer altura durante a experiência, se o experimentador não estiver certo que a resposta de retirada da pata não foi uma resposta ao estimulo de calor, o animal pode ser testado novamente após 5-8 minutos. Isto pode ser devido ao animal se mover repentinamente ou urinar ou defecar quando o estimulo estiver a ser aplicado.

Respostas aceitáveis:

Qualquer uma das seguintes é considerada como resposta ao estimulo de calor

Movimento de retirada da pata fora do vidro (frequentemente seguida por lambidela da pata)

Movimento lateral do corpo (contra-lateralmente à pata estimulada)

Os dedos do pé a afastarem-se do vidro 0 aspecto centroplanar (pata média) da pata inflamada é removida do vidro. 34

Análise

Os dados são expressos como média ± SEM. 0 significado estatístico é avaliado utilizando o teste T para comparação entre ratos naíve e inflamados, e ANOVA unidireccional seguida por teste de comparação múltipla de Dunnett (pós-hoc) para a eficácia do fármaco. Uma diferença entre grupos é considerada significativa com um valor de p mínimo ^0,05.

METABOLISMO FARMACOLÓGICO E PROPRIEDADES FARMACOCINÉTICAS

Verificou-se surpreendentemente que uma ou mais propriedades metabólicas farmacológicas e farmacocinéticas dos compostos são melhoradas devido à fluoro-substituição no benzilo inferior da unidade benzil-piperazinilo da fórmula I. Numa forma de realização, verificou-se que determinados metabolitos reactivos são reduzidos ou eliminados para os compostos da presente invenção. Numa outra forma de realização, determinados compostos da presente invenção proporcionam biodisponibilidade melhorada que pode ser resultado da sua fraca afinidade para 2D6 e 3A4 do citocromo P450. Os seguintes ensaios demonstraram uma ou mais destas propriedades surpreendentes destes compostos.

Incubações Microssomais

Um composto da presente invenção (concentração inicial nominal de 10 μΜ) foi incubado individualmente com microssomas de fígado de rato (0,5 mg/mL de proteína) em 0,1 M de tampão KH2PO4 (pH 7,4) com 5 mM de MgCl2 e 5 mM de reagente de captura (glutationo (GSH), N-acetilcisteína (NAC) ou CH3ONH2) durante 60 minutos a 37 °C. As reacções foram iniciadas por adição de 35 NADPH (1 mM) e terminadas por adição de um volume igual de acetonitrilo acidificado (0,1% de ácido fórmico) à mistura de incubação.

Incubações de Hepatócitos

Um composto da presente invenção (uma concentração inicial nominal de 10 μΜ) foi individualmente incubado com hepatócitos de rato (Sprague-Dawley) isolados de fresco e de cão criopreservados (Beagle) (1 x 106 células/mL) a pH 7,4, a 37 °C durante 1 hora. As misturas de incubação de hepatócitos continham meio E de Williams suplementado com 25 mM de HEPES, 1% de solução ITS-G (Life Technologies, N° de cat. 41400-045), 10 mM de HEPES (pH 7,4) e 2 mM de L-glutamina. As incubações foram terminadas pela adição de igual volume de acetonitrilo acidificado (0,1% de ácido fórmico) à mistura de incubação.

Análise LS-MS

Após precipitação proteica, os sobrenadantes das amostras foram analisados para metabolitos através de varrimento total com LC-MS. Foi obtida informação de peso molecular para cada metabolito detectado. Os padrões de fragmentação de experiências adicionais de LC-MS/MS foram analisados para ajudar a atribuir estruturas de metabolitos primários. 36

Instrumentos HPLC HP 1100 HPLC System (Hewlett Packard, D-76337 Waldbronn, Alemanha) MS LCQ (Finnigan Corporation, 355 River Oaks Parkway, San Jose, CA)

Condição de MS (LCQ)

Tensão da Fonte 4,5 Kv Temperatura Capilar 180 °C Fluxo de Gás da Manga 80 Fluxo de Gás Auxiliar 5 Tipo de Fonte EPI Modo de Ionização Positivo

Condições de HPLC

Coluna Phenomenex Synergi MAX-RP, 4 μ, 2,0 x 150 mm (Phenomenex, Torrance, CA) Fase móvel A = 0,1% de ácido fórmico em água, B = ACN Caudal 0,2 mL/min Temperatura 45 °C Detecção Espectrómetro de massa LCQ Método do gradiente

Tempo A B 0 90 10 30 40 60 30, 1 10 90 33 10 90 33, 1 90 10 40 90 10 37

Resultados do Teste

As vias primárias de biotransformação observadas para os compostos foram N-desetilação, N-desalquilação e hidroxilação. Para o composto da presente invenção, o qual tem a unidade benzil-piperazinilo fluoro-substituída, não foi detectado qualquer aducto do glutationo no benzeno em incubações com hepatócitos de rato. Pelo contrário, foram observados alguns aductos do glutationo no anel em incubações com hepatócitos de rato para compostos semelhantes sem o anel benzilo fluoro-substituído.

MÉTODOS DE MICRODIALISE IN VIVO

Processo

Os ratos são atribuídos aleatoriamente a oito grupos de tratamento: veículo-calmo, veículo-stress, fármaco-calmo, fármaco-stress. Sondas de microdiálise (CMA/12, comprimento de membrana de 4 mm para mPFC) são implantadas no cérebro 2 horas antes da experiência e são perfundidos com CSF artificial (aCSF, CMA Microdialysis AB) a um caudal de 1,1 mL/min durante 2 h para estabilizar a linha de base. São recolhidas três amostras de 20 minutos para definir a linha de base, os animais são injectados i.p. com veículo ou compostos e a recolha das amostras é mantida durante as 5 h seguintes. O programa do paradigma de stress é iniciado 20 minutos após a administração dos compostos. As amostras são imediatamente (em linha) injectadas nos sistemas de HPLC para análise das concentrações de monoamina. A média das concentrações dos neurotransmissores em 3 amostras recolhidas antes da administração de compostos/veículo é calculada e definida como linha de base 38 (100%) . As concentrações dos neurotransmissores nos microdialisados subsequentes são depois expressas como percentagem dos níveis de linha de base.

Processo de Stress

Para o processo de stress, são utilizadas caixas de esquiva passivas convencionais, equipadas com luzes, som e dispositivos de choques (Med Associates, Inc) . As caixas são colocadas em câmaras de atenuação de som. Ocorre paradigma de stress durante um dia. Os animais são aclimatados às câmaras durante 2 horas, depois expostos durante 6 minutos a uma série de flashes de luz, seguidos por choques eléctricos nas patas (0,5 segundos de duração, 1,5 mA de intensidade, total de 10 choques). O grupo "sossegado" é exposto a câmaras com luzes, mas não recebe choques. Após 40 minutos, a sequência de luzes é repetida, mas não são administrados choques aos animais.

Administração de fármaco

Todos os compostos são dissolvidos em água destilada estéril (veículo) e administrados intraperitonealmente (IP), 20 minutos antes do processo de stress do dia. HPLC e detecção electroquímica O sistema de HPLC consiste numa bomba 5041, detector Coulochem II modelo 5200A, coluna MD-150 de 3 x 150 mm, célula amperométrica modelo 5041 (tudo da ESA Inc) e injector em linha (da BAS Inc) . A fase móvel é: 75 mM de Na2HPC>4, 25 mM de EDTA, 39 1, 7 mM de ácido 1-octanossulfónico, 100 yL/L de trietilamina, 10% de acetonitrilo, pH 3,0. O potencial é definido a +0,65 V, o caudal é mantido a 0,3 mL/min. Os dados são recolhidos utilizando um sistema de aquisição/análise com base em PC (computador 501 e software A/D, ESA, Inc), integrados e transferidos para software de folha de cálculo/gráfico para análise adicional.

Quando grupos de 6-8 ratos, preparados com sondas intracerebrais de microdiálise colocadas no córtex pré-frontal mediano (onde o sinal neuroquimico é mais forte) são submetidos ao paradigma condicionamento descrito acima, são observados aumentos na norepinefrina (NE) e dopamina em animais tratados com veiculo. Determinados compostos da invenção bloqueiam o aumento sustido em NE e dopamina. Método do Modelo de Ansiedade de Geller-Siefter

No teste de conflito, os animais com fome são treinados a pressionarem uma alavanca para distribuição de alimento numa câmara operante convencional sob duas condições. Na primeira condição, referida como componente não reprimida, o alimento é distribuído, em média, após serem realizados 17 accionamentos da alavanca (também denominado um plano de reforço VR17). Na segunda condição, referida como componente reprimida e sinalizada com flashes de luz dentro da câmara operante, o alimento também é distribuído após uma média de 17 accionamentos da alavanca, mas é adicionalmente distribuído um choque eléctrico ao chão da gaiola sob um plano VR17 separado. As sessões diárias consistem em 5 apresentações alternadas de cada tipo de componente: reprimida (3 minutos de duração) e não reprimida (3 minutos de duração). O número de accionamentos de 40 alavanca emitidos na componente reprimida é obviamente baixo relativamente à componente não reprimida. Os agentes antiansiedade, tal como a diazepam, aumentam o número de accionamentos de alavanca que os animais irão efectuar na componente reprimida, dentro de algumas gamas de doses, sem alterarem o número de accionamentos de alavanca que são realizados na componente não reprimida. Determinados compostos da invenção têm um perfil de ansiolitico neste processo.

EXEMPLOS A invenção será ainda descrita em maior detalhe pelos seguintes Exemplos que descrevem métodos pelos quais os compostos da presente invenção podem ser preparados, purificados, analisados e testados biologicamente e que não são para serem interpretados como limitativos da invenção. INTERMEDIÁRIO 1: 4-Iodo-N,N-dietilbenzamida A uma mistura de cloreto de 4-iodo-benzoílo (75 g) em 500 mL de CH2CI2, foi adicionada uma mistura de Et3N (50 mL) e Et2NH (100 mL) a 0 °C. Após a adição, a mistura de reacção resultante foi aquecida até a temperatura ambiente durante 1 hora e foi depois lavada com cloreto de amónio saturado. O extracto orgânico foi seco (Na2SO<i) , filtrado e concentrado. O resíduo foi recristalizado a partir de hexano quente para produzir 80 g de INTERMEDIÁRIO 1. 41 2_i dietilbenzamida

INTERMEDIÁRIO 4-[hidroxi(3-nitrofenil)metil]-N, N- A N,N-dietil-4-iodobenzamida (5,0 g, 16 mmol) foi dissolvida em THF (150 mL) e arrefecida até -78 °C sob atmosfera do azoto.

Foi adicionado, gota a gota, n-BuLi (15 mL, solução a 1,07 M em hexano, 16 mmol) durante 10 minutos a -65 a -78 °C. A solução foi depois canulada em 3-nitrobenzaldeído (2,4 g, 16 mmol) em tolueno (aprox. 1:1, 100 mL) a -78 °C. Foi adicionado NH4C1 (aq.) após 30 minutos. Após concentração in vacuo, extracção com EtOAc/água, secagem (MgSCg) e evaporação da fase orgânica, o resíduo foi purificado através de cromatografia em sílica (0 - 75% EtOAc/heptano) para produzir o INTERMEDIÁRIO 2 (2,6 g, 50%). RMN de (400 MHz, CDC13) δΗ 1,0-1,3 (m, 6H), 3,2 (m, 2H), 3,5 (m, 2H), 5,90 (s, 1H), 7,30-7,40 (m, 4H), 7,50 (m, 1H), 7,70 (d, J = 8 Hz, 1H), 8,12 (m, 1H), 8,28 (m, 1H). INTERMEDIÁRIO 3: N,N-dietil-4-[(3-nitrofenil)(1-pipera- zinil)metil]benzamida A uma solução do álcool INTERMEDIÁRIO 2 (10,01 g, 30,5 mmol) em diclorometano (200 mL) foi adicionado brometo de tionilo (2,58 mL, 33,6 mmol) . Após uma hora à temperatura ambiente, a reacção foi lavada com bicarbonato de sódio aquoso saturado (100 mL) e a camada orgânica foi separada. A camada aquosa foi lavada com diclorometano (3 x 100 mL) e os extractos orgânicos combinados foram secos (Na2S04), filtrados e concentrados. O brometo de benzilo em bruto foi dissolvido em acetonitrilo (350 mL) e foi adicionada piperazina (10,5 g, 122 mmol). Após aquecimento da reacção durante uma hora a 65 °C, a reacção foi lavada com cloreto de amónio saturado/acetato de etilo e a 42 camada orgânica foi separada. A camada aquosa foi extraída com acetato de etilo (3 x 100 mL) e os extractos orgânicos combinados foram secos (Na2S04), filtrados e concentrados para produzir o INTERMEDIÁRIO 3 racémico. INTERMEDIÁRIO 4b: N, iV-dietil-4- [ (R) - (3-nitrofenil) (1-pipera-zinil)metil]benzamida O INTERMEDIÁRIO 3 racémico foi dissolvido em etanol (150 mL) e foi adicionado ácido di-p-toluoil-D-tartárico (11,79 g, 1 equivalente). O produto precipitou durante um período de 12 horas. O sólido foi recolhido por filtração e foi re-dissolvido em etanol ao refluxo até todo o sólido se dissolver (aproximadamente 1200 mL de etanol). Após arrefecimento, o sólido foi recolhido por filtração e a recristalização repetida uma segunda vez. O sólido foi recolhido por filtração e foi tratado com hidróxido de sódio aquoso (2 M) e foi extraído com acetato de etilo. O extracto orgânico foi depois seco (Na2S04) , filtrado e concentrado para produzir 1,986 g de INTERMEDIÁRIO 4b. RMN de ΤΗ (400 MHz, CDC13) δΗ 1,11 (br s, 3H) , 1,25 (br s, 2,37 (br s, 4H) , 2,91 (t, J = 5 Hz, 4H) , 3, 23 (br s, 2H) (br s , 2H) , 4,38 (s, 1H), 7,31 -7,33 (m, 2H) , 7, 41- 7, 43 (m 7, 47 (t, J = 8 Hz, 1H), 7, 75- 7, 79 (m, 1H) , 8, 06- 8,09 (m 1H), 8,30-8,32 (m, 1H). A pureza quiral foi determinada por HPLC utilizando as seguintes condições:

Coluna Chiralpack AD (Daicel Chemical Industries) Caudal de 1 mL/minuto 43

Tempo de funcionamento de 30 minutos a 25 °C 15% de etanol isocrático (contendo 0,1% v/v de dietilamina) 85% de hexanos (contendo 0,1% v/v de dietilamina)

Tempo de retenção da molécula = 20 minutos INTERMEDIÁRIO_4a :_N,N-dietil-4- [ (S) 3-nitrofenil) (1- piperazinil)metil]benzamida O enantiómero (S) do INTERMEDIÁRIO 4a pode ser obtido por realização do processo de resolução acima com ácido di-p-toluoil-L-tartárico. COMPOSTO_lj_4-{ (S) - (3-aminofenil) [4-(4-fluorobenzil)- piperazin-l-il ] metil} -N, iV-dietilbenzamida_(exemplo_de referência)

O

A uma solução de INTERMEDIÁRIO 4a (467 mg) em 1,2-dicloroetano (13 mL) foram adicionados 4-fluorobenzaldeido (252 pL; 2 eq) e triacetoxiboro-hidreto de sódio (498 mg; 2 eq). A reacção foi agitada à temperatura ambiente sob azoto durante 18 horas e concentrada. Foi adicionado bicarbonato de sódio saturado e a solução aquosa foi extraída com três porções de diclorometano e os orgânicos combinados foram secos sobre 44 sulfato de sódio anidro, filtrados e concentrados. 0 composto foi dissolvido numa mistura de etanol, tetra-hidrofurano, água e cloreto de amónio saturado (4 mL; razões 4:2:1:1 v/v). Foram adicionadas nanopartículas de ferro (3 pontas de espátula) e a solução foi aquecida a 150 °C durante 10 minutos no microondas. A mistura resultante foi arrefecida, filtrada através de celite e concentrada. O resíduo foi purificado através de cromatografia flash em sílica gel, eluíndo com um gradiente desde 1% a 5% de MeOH em diclorometano. O produto obtido foi dissolvido em diclorometano, no qual foi adicionado 1,2 mL de HC1 1 M em éter. O solvente foi removido e o produto foi isolado como o sal de cloridrato para produzir o COMPOSTO 1 (164 mg, rendimento de 30%) como um sólido incolor. Pureza (HPLC): >99%; Pureza óptica (HPLC Quir •al) : >99 0 φ ° t RMN de XH (400 MHz, CD3OD), 1,08 (t, J = 6,5 Hz, 3H) , 1, 21 (t, J = 6, 5 Hz, 3H) , 3,20-3,26 (m, 4H) , 3, 51-3, 54 (m, 6H) , 4, 43 (s, 2H), 7, 19 -7, 23 (m, 2H), 7,34 (d, J = 8,0 Hz, , ih: ) , 7, 40 (d, J = 8, 0 Hz, 2H) , 7,54-7,63 (m, 3H) , 7, 70-7, 82 (m, 4H) . Encontrado : c, 54, ,63; H, 6,49; N, 8 ,68. C29H36N4OF X 4,1 HC1 X 0,8 H20 x 0, 1 c4h10 0 tem C, 57,67; H, 6 ,51; N, 8,67 q, "0 · 45 COMPOSTO 2; 4-{(£)~(3-aminofenil) [4-(4-fluorobenzil) - piperazin-l-il ] metil} -N, iV-diet ilbenzamida

O

A uma solução de INTERMEDIÁRIO 4b (5, 790g, 14,6 mmol) em 1,2-dicloroetano (60 mL) foram adicionados 4-fluorobenzaldeído (2,04 mL, 19,0 mmol) e triacetoxiboro-hidreto de sódio (4,02 g, 19,0 mmol) . Após 20 horas à temperatura ambiente, a reacção foi terminada com bicarbonato de sódio aquoso e a camada orgânica foi separada. A camada aquosa foi extraída com diclorometano (3 x 100 mL) e os extractos orgânicos combinados foram secos (Na2S04), filtrados e concentrados. O resíduo foi purificado através de cromatografia flash, eluíndo com 30% a 50% de acetona em hexanos para produzir uma espuma incolor (5,285g, 71%) que é o intermediário nitro. O intermediário nitro (5,285 g, 10,4 mmol) foi dissolvido numa mistura de etanol, tetra-hidrofurano, água e cloreto de amónio aquoso saturado (razão 4:2:1:1 v/v) (100 mL) e foram adicionados grânulos de ferro (0,63 mg, 11,5 mmol). A reacção foi aquecida até ao refluxo e foram adicionados periodicamente mais grânulos de ferro. Após 24 horas sob refluxo (90 °C), a reacção foi arrefecida até à temperatura ambiente e filtrada através de celite e concentrada. Ao resíduo foi adicionado bicarbonato de sódio aquoso e diclorometano. A camada orgânica foi separada e a camada aquosa foi extraída com diclorometano (3 x 100 mL) e os extractos orgânicos combinados foram secos (Na2S04), filtrados e 46 concentrados. 0 produto foi purificado em sílica gel, eluíndo com 1% a 5% de metanol em diclorometano para produzir o COMPOSTO 2 (3,505 g) como uma espuma amarela pálida. O material impuro foi adicionalmente obtido a partir da cromatografia flash acima e este foi purificado novamente através de uma segunda cromatografia flash, eluíndo com 100% de acetato de etilo a 5% de metanol em acetato de etilo para produzir mais 0,949 g do COMPOSTO 2. O material combinado obtido: 4,454 g (rendimento de 90%) . Pureza (HPLC) : >99%; Pureza óptica (HPLC Quiral ) : >99%; RMN de ΤΗ (400 MHz, CD3OD) , 1,08 (t , J = 6,5 Hz, 3H) , 1,21 (t, J = 6,5 Hz, 3H), 3,20-3,26 (m, 4H) , 3,51-3,54 (m, 6H) , 4, 43 (s, 2H), 7,19-7,23 (m, 2H) , 7,34 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 7, 40 (d, N o OO II >~o 2 H) , 7,54- 7,63 (m, 3H) , 7,70-7,82 (m, 4H) . Encontrado: C, 54, 00; H, 6,34; N, 8,47 . C29H35FN4O X 4,7 HC1 x 0,2 C4H10O x 0,1 H20 tem C, 54, 02; H, 6,37; N, 8,46%. COMPOSTO 3: 4-[(R)-(3-aminofenil)[4[(2-fluorofenil)metil]-1-piperazinil]metil]-N,N-dietil-benzamida (exemplo de referência)

A uma solução de INTERMEDIÁRIO 4b (298 mg, 0, 752 iranol) em 1,2-dicloroetano (8,5 mL) foi adicionado 2-fluorobenzaldeído (160 mg, 1,503 mmol, 2 eq) e triacetoxiboro-hidreto de sódio (319 mg, 1,503 mmol, 2 eq). A reacção foi agitada à temperatura ambiente sob azoto durante 18 horas e concentrada. Foi adicionado bicarbonato de sódio saturado e a solução aquosa foi extraida com três porções de diclorometano e os orgânicos combinados foram secos sobre sulfato de sódio anidro, filtrados e concentrados. 0 composto foi dissolvido numa mistura de etanol, tetra-hidrofurano, água e cloreto de amónio saturado (3 mL; razões 4:2:1:1 v/v) . Foram adicionadas nanopartícuias de ferro (3 pontas de espátula) e a solução foi aquecida a 150 °C durante 10 minutos no microondas. A mistura resultante foi arrefecida, filtrada através de celite e concentrada. O produto bruto foi dissolvido em CH2CI2 e lavado com água. A camada orgânica foi separada e a camada aquosa foi extraida com diclorometano. Os extractos orgânicos combinados foram secos (Na2S04) , filtrados e concentrados. O produto foi purificado através de HPLC de fase reversa (gradiente de 5-50% de CH3CN em H2O contendo 0,1% de TFA) para produzir o COMPOSTO 3 (0,28 g, rendimento de 46%) como o sal de TFA. Este material foi liofilizado a partir de CH3CN/H20 para produzir um pó amarelo pálido. RMN de ΤΗ (400 MHz, CD3OD) 1,08 (t, J = 6,6 Hz, 3H), 1,22 (t, J = 6,6 Hz, 3H), 2,39 (br s, 2H), 3,02 (br s, 2H) , 3,18-3,38 (m, 4H) , 3,43 (br s, 2H) , 3,52 (q, J = 6,8 Hz, 2H) , 4,43 (s, 2H), 4,53 (s, 1H), 7,09 (dt, J = 2,3, 6,8 Hz, 1H), 7,24-7,30 (m, 1H) , 7,30-7,41 (m, 6H) , 7, 52-7, 60 (m, 4H) . Calcd. Anal. para C29H35FN40 x 2,8 TFA x 0,4 H20: C, 51,88; H, 4,86; N, 6,99.

Encontrado: C, 51,89; H, 4,89; N, 6,97%. M.S. (calcd): 475,3 (MH+), M.S. (encontrado): 475,2 (MH+). HPLC: k': 2,35; Pureza: >99% (215 nm) , >99% (254 nm) . >99% (280 nm) . Condições de HPLC: Zorbax C-18, gradiente 10-95% de B, caudal: 1 mL/min, 25 °C, A: 0,1% de TFA em H20, B: 0,1% de TFA em MeCN. Rotação: [a] 16D = -8,91 (c = 1,179, MeOH). 48 COMPOSTO 4; 4-[(R)-(3-aminofeni)[4-[(3-fluorofenil)metil]-1-piperazinil ] metil ] -N, iV-dietil-benzamida (exemplo de referência) 0

F A uma solução de INTERMEDIÁRIO 4b (281 mg, 0,709 mmol) em 1,2-dicloroetano (8 mL) foram adicionados 3-fluorobenzaldeído (180 mg, 1,417 mmol, 2 eq) e triacetoxiboro-hidreto de sódio (300 mg, 1,417 mmol, 2 eq). A reacção foi agitada à temperatura ambiente sob azoto durante 18 horas e concentrada. Foi adicionado bicarbonato de sódio saturado e a solução aquosa foi extraída com três porções de diclorometano e os orgânicos combinados foram secos sobre sulfato de sódio anidro, filtrados e concentrados. O produto foi dissolvido numa mistura de etanol, tetra-hidrofurano, água e cloreto de amónio saturado (3 mL; razões 4:2:1:1 v/v). Foram adicionadas nanopartículas de ferro (3 pontas de espátula) e a solução foi aquecida a 150 °C durante 10 minutos no microondas. A mistura resultante foi arrefecida, filtrada através de celite e concentrada. O produto resultante foi dissolvido em CH2CI2 e lavado com água. A camada orgânica foi separada e a camada aquosa foi extraída com diclorometano. Os extractos orgânicos combinados foram secos (Na2S04) , filtrados e concentrados. O produto foi purificado através de HPLC de fase reversa (gradiente 5-50% de CH3CN em H2O contendo 0,1% de TFA) para produzir o COMPOSTO 4 (0,375 g, rendimento de 65%) como o seu sal de TFA. Este material foi liofilizado a partir de CH3CN/H2O para produzir um pó amarelo pálido. RMN de ΤΗ (400 MHz,

CD3OD) 1,08 (t, J

6,4 Hz, 3H), 1,21 (t, J 6,8 Hz, 3H), 2,38 49 (br s, 2H), 3,00 (br s, 2H), 3,16-3,28 (m, 4H), 3,40 (br s, 2H), 3,51 (q, J = 6,8 Hz, 2H), 4,37 (s, 2H), 4,56 (s, 1H), 7,18 (ddd, J = 1,2, 2,3, 7,8 Hz, 1H), 7,24 (ddd, J = 1,0, 2,7, 8,8 Hz, 1H), 7,28-7,38 (m, 4H), 7,55 (d, J = 8,2 Hz, 2H). Calcd. Anal. para C29H35FN4O x 2,7 TFA x 1,1 H20: C, 51,50; H, 5,01; N, 6,98.

Encontrado: C, 51,52; H, 5,01; N, 6,87%. M.S. (calcd): 475,3 (MH+), M.S. (encontrado): 475,2 (MH+) . HPLC: k' : 2,43; Pureza: >99% (215 nm) , >99% (254 nm) , >99% (280 nm) . Condições de HPLC:

Zorbax C-18, gradiente 10-95% de B, caudal: 1 mL/min, 25 °C, A: 0,1% de TFA em H20, B: 0,1% de TFA em MeCN. Rotação: [a]16D = -8,94 (c = 1,04, MeOH) água. A camada orgânica foi separada e a camada aquosa foi extraída com diclorometano. Os extractos orgânicos combinados foram secos (Na2S04) , filtrados e concentrados. O produto foi purificado através de HPLC de fase reversa (gradiente de 5-50% de CH3CN em H20 contendo 0,1% de TFA) para produzir o COMPOSTO 3 (0,28 g, rendimento de 46%) como o sal de TFA. Este material foi liofilizado a partir de CH3CN/H20 para produzir um pó amarelo pálido. RMN de ΤΗ (400 MHz, CD3OD) 1,08 (t, J = 6,6 Hz, 3H), 1,22 (t, J = 6,6 Hz, 3H), 2,39 (br s, 2H) , 3,02 (br s, 2H) , 3,18-3,38 (m, 4H), 3, 43 (br s, 2H) , 3,52 (q. J = 6,8 Hz, 2H) , 4,43 (s, 2H) , 4, 53 (s, 1H), 7,09 (dt, j = 2,3, 6,8 Hz, 1H) , 7,24-7,30 (m, 1H) , 7,30-7,41 (m, 6H) , 7, 52-7, 60 (m, 4H) . Calcd. Anal. para C29H35FN4O x 2,8 TFA x 0,4 H20: C, 51,88; H, 4,86; N, 6,99. Encontrado: C, 51,89; H, 4,89; N, 6,97%. M.S. (calcd): 475,3 (MH+) , M.S. (encontrado): 475,2 (MH+). HPLC: k': 2,35; Pureza: >99% (215 nm), >99% (254 nm) . >99% (280 nm) . Condições de HPLC: Zorbax C-18, gradiente 10-95% de B, caudal: 1 mL/min, 25 °C, A: 0,1% de TFA em H20, B: 0,1% de TFA em MeCN. Rotação: [a]16D = -8,91 (c = 1,179, MeOH). 50 COMPOSTO 4; 4-[(R)-(3-aminofeni)[4-[(3-fluorofenil)metil]-1-piperazinil ] metil ] -N, iV-dietil-benzamida (exemplo de referência)

A uma solução de INTERMEDIÁRIO 4b (281 mg, 0,709 mmol) em 1,2-dicloroetano (8 mL) foram adicionados 3-fluorobenzaldeído (180 mg, 1,417 mmol, 2 eq) e triacetoxiboro-hidreto de sódio (300 mg, 1,417 mmol, 2 eq). A reacção foi agitada à temperatura ambiente sob azoto durante 18 horas e concentrada. Foi adicionado bicarbonato de sódio saturado e a solução aquosa foi extraída com três porções de diclorometano e os orgânicos combinados foram secos sobre sulfato de sódio anidro, filtrados e concentrados. O produto foi dissolvido numa mistura de etanol, tetra-hidrofurano, água e cloreto de amónio saturado (3 mL; razões 4:2:1:1 v/v). Foram adicionadas nanopartículas de ferro (3 pontas de espátula) e a solução foi aquecida a 150 °C durante 10 minutos no microondas. A mistura resultante foi arrefecida, filtrada através de celite e concentrada. O produto resultante foi dissolvido em CH2CI2 e lavado com água. A camada orgânica foi separada e a camada aquosa foi extraída com diclorometano. Os extractos orgânicos combinados foram secos (Na2S04) , filtrados e concentrados. O produto foi purificado através de HPLC de fase reversa (gradiente 5-50% de CH3CN em H2O contendo 0,1% de TFA) para produzir o COMPOSTO 4 (0,375 g, rendimento de 65%) como o seu sal de TFA. Este material foi liofilizado a partir de CH3CN/H2O para produzir um pó amarelo pálido. RMN de ΤΗ (400 MHz, CD3OD) 1,08 (t, J = 6,4 Hz, 3H), 1,21 (t, J = 6,8 Hz, 3H) , 2,38 51 (br s, 2H), 3,00 (br s, 2H), 3,16-3,28 (m, 4H), 3,40 (br s, 2H), 3,51 (q, J = 6,8 Hz, 2H), 4,37 (s, 2H), 4,56 (s, 1H), 7,18 (ddd, J = 1,2, 2,3, 7,8 Hz, 1H), 7,24 (ddd, J = 1,0, 2,7, 8,8 Hz, 1H), 7,28-7,38 (m, 4H), 7,55 (d, J = 8,2 Hz, 2H). Calcd. Anal. para C29H35FN4O x 2,7 TFA X 1,1 H20: C, 51,50; H, 5,01; N, 6,98. Encontrado: C, 51,52; H, 5,01; N, 6,87%. M.S. (calcd): 475,3 (MH+), M.S. (encontrado): 475,2 (MH+). HPLC: k': 2,43; Pureza: >99% (215 nm) , >99% (254 nm) , >99% (280 nm) . Condições de HPLC:

Zorbax C-18, gradiente 10-95% de B, caudal: 1 mL/min, 25 °C, A: 0,1% de TFA em H20, B: 0,1% de TFA em MeCN. Rotação: [a]16D = -8,94 (c = 1,04, MeOH).

Lisboa, 20 de Abril de 2012 52

Claims (10)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Composto da fórmula

   ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.
2. 2. Composto de acordo com a reivindicação 1, para utilização como um medicamento.
3. 3. Utilização de um composto de acordo com a reivindicação 1, no fabrico de um medicamento para o tratamento da dor.
4. 4. Utilização de um composto de acordo com a reivindicação 1, no fabrico de um medicamento para o tratamento da ansiedade.
5. 5. Utilização de um composto de acordo com a reivindicação 1, no fabrico de um medicamento para o tratamento da depressão.
6. 6. Composto de acordo com a reivindicação 1, para utilização no tratamento da dor.
7. 7. Composto de acordo com a reivindicação 1, para utilização no tratamento da ansiedade. 53
8. 8. Composto de acordo com a reivindicação 1, para utilização no tratamento da depressão.
9. 9. Composição farmacêutica compreendendo um composto de acordo com a reivindicação 1, em associação com um veiculo farmaceuticamente aceitável.
10. 10. 4-{(R)-(3-aminofenil)[ 4-(4-fluorobenzil)piperazin-l-il]-metil} -N, iV-dietilbenzamida enant iomericamente pura de acordo com a reivindicação 1 ou um seu sal f armaceuticamente aceitável. Lisboa, 20 de Abril de 2012 54