CN1993338B - 二芳基甲基哌嗪衍生物及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

制备下列式的化合物，和其盐，对映异构体，以及包含该化合物的药物组合物。它们用于治疗，尤其用于治疗疼痛，抑郁和焦虑。

Description

二芳基甲基哌嗪衍生物及其制备方法和用途
本申请要求2004年8月18日申请的美国临时申请60/602,363的权利，其全文引入此处作为参考，并根据35 U.S.C.§119(a)-(d)要求2004年8月2日申请的瑞典申请No.0401968-3的优先权。
技术领域
本发明涉及新化合物，其制备方法，其用途以及包括该新化合物的药物组合物。所述的新化合物可用于治疗，尤其可用于治疗疼痛、焦虑症和功能性胃肠道病症(functional gastrointestinal disorder)。
背景技术
已经确证δ受体在许多身体机能如循环以及疼痛体系中发挥作用。因此δ受体配体具有可用作镇痛药，和/或以及作为抗高血压药的潜在用途。也已经证实δ受体配体具有免疫调节活性。
目前已经充分确证了至少三种不同的阿片受体(μ、δ和κ)，并且所有这三种明显存在于许多物种(包括人)的中枢以及外周神经系统中。当一或多种这些受体被激活时，已经在许多动物模型中观察到痛觉消失。
除了少数例外，目前已有的选择性阿片δ配体本质上是肽类物质，并且不适合经全身路径给药。非肽类δ-激动剂的一个实例为SNC80(Bilsky E.J.等，Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics，273(1)，pp.359-366(1995))。
现有技术中已经证实的许多δ激动剂化合物具有许多缺点，药代动力学差并且当全身路径给药时不具有镇痛作用。此外，已有记载，当全身给药时，许多δ激动剂化合物显示显著的惊厥作用。
PCT公开文本WO02/094794描述了一些δ-激动剂。
因此，仍然存在改善的δ-激动剂的需求。
发明内容
我们现已意料不到发现某些化合物显示一种或多种改善的性质，即，改善的δ激动效力、体内效力、药动学、生物利用度、体外稳定性、体内稳定性、脑渗透性和/或低毒性。
在本说明书中除非另有说明，本发明书中的命名法通常遵循在Nomenclature of Organic Chemistry，Sections A，B，C，D，E，F，and H，PergamonPress，Oxford，1979中表述的实例以及规则，其示例性化学结构名称以及命名化学结构的规则这里引入作为参考。任选地，化合物名称可根据可使用化学命名程序产生：ACD/ChemSketch，Version 5.09/September 2001，Advanced Chemistry Development，Inc.，Toronto，Canada。
“对映异构体纯(enantiomerically pure)”是指化合物在其所包含的两种可能的对映异构体总量中含有至少占75％的指定对映异构体。在具体的实施方式中，“对映异构体纯”是指化合物在其所包含的两种可能的对映异构体总量中含有至少占90％的指定对映异构体。在更具体的实施方式中，“对映异构体纯”是指化合物在其所包含的两种可能的对映异构体总量中含有至少占95％的指定对映异构体。
“温血动物”包括人。
一方面，本发明提供式I化合物，其药学上可接受的盐、其溶剂化物、其前药、其非对映异构体、其一种或多种对映异构体以及它们的混合物：
在一个实施方式中，本发明化合物可选自：
其药学上可接受的盐、其一种或多种分离的对映异构体及其混合物。
在另一个实施方式中，本发明化合物选自：
及其药学上可接受的盐。
在另一个实施方案中，本发明化合物可选自：
Figure A20058002627400083
及其药学上可接受的盐。
在另一个实施方案中，本发明化合物可选自：
Figure A20058002627400084
及其药学上可接受的盐。
在另一个实施方案中，本发明化合物可选自：
及其药学上可接受的盐。
在另一个实施方案中，本发明化合物可选自4-{(S)-(3-氨基苯基)[4-(4-氟苄基)哌嗪-1-基]甲基}-N，N-二乙基苯甲酰胺；4-{(R)-(3-氨基苯基)[4-(4-氟苄基)哌嗪-1-基]甲基}-N，N-二乙基苯甲酰胺；4-[(R)-(3-氨基苯基)[4-[(2-氟苯基)甲基]-1-哌嗪基]甲基]-N，N-二乙基苯甲酰胺；4-[(R)-(3-氨基苯基)[4-[(3-氟苯基)甲基]-1-哌嗪基]甲基]-N，N-二乙基苯甲酰胺及其药学上可接受的盐。
在另一个实施方式中，本发明化合物可选自对映异构体纯的4-{(S)-(3-氨基苯基)[4-(4-氟苄基)哌嗪-1-基]甲基}-N，N-二乙基苯甲酰胺；对映异构体纯的4-{(R)-(3-氨基苯基)[4-(4-氟苄基)哌嗪-1-基]甲基}-N，N-二乙基苯甲酰胺；对映异构体纯的4-[(R)-(3-氨基苯基)[4-[(2-氟苯基)甲基]-1-哌嗪基]甲基]-N，N-二乙基苯甲酰胺；对映异构体纯的4-[(R)-(3-氨基苯基)[4-[(3-氟苯基)甲基]-1-哌嗪基]甲基]-N，N-二乙基苯甲酰胺及其药学上可接受的盐。
应该理解，当本发明的化合物含有一个或多个手性中心时，本发明的化合物可以以对映或非对映形式存在或分离成对映或非对映形式，或者作为外消旋混合物存在。本发明包括式I化合物的任何可能的对映异构体、非对映异构体、外消旋物或它们的混合物。本发明化合物的光学活性形式可以通过如下方式制备：例如外消旋物的手性色谱分离、从光学活性原料合成，或者基于下面所描述的不对称合成。
还可以理解，本发明的某些化合物可以以溶剂化形式，例如水合形式或者非溶剂化的形式存在。还可以理解，本发明包含式I化合物的所有这些溶剂化形式。
式I化合物的盐也在本发明的范围内。本发明化合物的药学可接受的盐通常可以使用本领域已知的标准操作获得，例如通过使足够碱性的化合物(例如烷基胺)与合适的酸(例如，HCl或乙酸)反应，得到生理学可接受的阴离子。也可以通过在含水介质中，用一当量碱金属或碱土金属氢氧化物或烷氧化物(例如乙氧化物或甲氧化物)或合适的碱性有机胺(例如胆碱或甲葡胺)处理具有合适酸性质子(例如羧酸或苯酚)的本发明化合物，接着通过常规纯化技术处理以制备相应的碱金属(例如钠、钾或锂)盐或碱土金属(例如钙)盐。
在一个实施方式中，上述式I的化合物可以被转化为药学可接受的盐或其溶剂化物，特别是酸加成盐例如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、乙酸盐、甲酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、甲磺酸盐或对甲苯磺酸盐。
本发明的新化合物可用于治疗，尤其是用于治疗各种疼痛病症如慢性疼痛、神经性疼痛(neuropathic pain)、急性疼痛、癌症疼痛、由类风湿性关节炎引起的疼痛、偏头痛、内脏疼痛等。然而，这种列举不能被解释为是穷举性的。本发明化合物用于治疗腹泻、抑郁、焦虑和应激相关的病症例如创伤后的应激障碍、惊恐性障碍、泛化性焦虑症、社交恐怖症和强迫症、尿失禁、早泄、各种精神疾病、咳嗽、肺水肿、各种胃-肠病，例如便秘、功能性胃肠道病症例如过敏性肠综合征和机能性消化不良，帕金森疾病和其它运动障碍、创伤性脑损伤、中风、心肌梗塞后的心脏保护(cardioprotection)、脊椎伤损和药瘾，包括治疗酒精、尼古丁、阿片样物质及其它药物滥用，和交感神经系统疾病例如高血压。
本发明化合物可用作免疫调节剂，特别是用于自身免疫性疾病，例如关节炎，用于皮肤移植、器官移植和类似的手术需要，用于胶原疾病、各种变态反应，用作抗肿瘤剂和抗病毒剂。
本发明化合物可用于存在或牵涉在范例中的阿片受体退化或功能紊乱的那些病症。这包括在诊断技术和影像应用例如正电子发射层析成象(PET)中使用本发明化合物的同位素标记形式。
本发明化合物可在全身麻醉和监视麻醉护理期间用作镇痛剂。往往可使用具有不同性质药物的联合药物以获得需要维持麻醉状态(例如遗忘、痛觉消失、肌肉放松和镇静)的平衡效果。在联合药物中包括吸入麻醉剂、安眠药、抗焦虑药、神经肌肉阻断剂和阿片样物质。
在本发明范围内包括上述式I的任何化合物在制备药物中的用途。
在本发明范围内还包括，本发明的任何化合物在制备用于治疗疼痛病症的药物中的用途，包括但不局限于：急性疼痛、慢性疼痛、神经性疼痛、背痛、癌症疼痛和内脏疼痛。
在本发明范围内还包括，本发明的任何化合物在制备用于治疗焦虑的药物中的用途，包括但不限于，社交恐怖症、泛化性焦虑症、急性焦虑。
在本发明范围内还包括，本发明的任何化合物在制备用于治疗抑郁的药物中的用途。
在本发明范围内还包括，本发明的任何化合物在制备用于治疗帕金森病的药物中的用途。
在本发明范围内包括，本发明的任何化合物在制备用于治疗上述任何疾病的药物中的用途。
本发明的另一方面是提供治疗患有上述任何病症的患者的方法，其中对需要这种治疗的患者给药有效量的本发明化合物。
因此，本发明提供用于治疗的上述式I化合物或其药学上可接受的盐或其溶剂化物。
除非另有相反说明，在说明书中，术语“治疗”还包括“预防”。术语“治疗的”和“治疗地”也应该相应理解。本发明中的术语″治疗″还包括给药有效量的本发明化合物，以减轻预先存在的急性或慢性疾病状况或复发病症。该定义还包括用于防止复发病症的预防性治疗和用于慢性疾病的持续治疗。
在用于治疗温血动物例如人时，本发明的化合物可以以常规的药物组合物的形式通过各种路径给药，包括口服、肌内、皮下、局部地、鼻内、腹腔内、胸内(intrathoracially)、静脉内、硬膜外、鞘内、脑室内(intracerebroventricularly)和注入关节。
在本发明的一个实施方式中，给药路径可以为口服、静脉内或肌内。
当确定对于特定患者最适合的个用药法和剂量水平时，剂量将取决于给药路径、疾病的严重性、患者的年龄和体重以及主治医师通常考虑的其它因素。
此外，还提供一种药物组合物，其包含本发明化合物、其溶剂化物或其药学上可接受的盐，以及结合有药学上可接受载体。
特别地，提供用于治疗，更具体用于治疗疼痛和焦虑的药物组合物，包含本发明化合物、其溶剂化物或其药学上可接受的盐，以及结合有药学上可接受载体。
此外，提供用于治疗上述任何病症的药物组合物，包含本发明化合物、其溶剂化物或其药学上可接受的盐，以及结合有药学上可接受载体。
为了从本发明的化合物制备药物组合物，惰性、药学可接受的载体可以是固体或液体。固体形式的制剂包括粉剂、片剂、可分散颗粒剂、胶囊剂、扁囊剂和栓剂。
固体载体可以为一种或多种物质，其可以作为稀释剂、调味剂、增溶剂、润滑剂、悬浮剂、粘合剂或片状崩解剂(table disintegrating agents)；其也可以是包封材料。
在粉剂中，载体为微细粉碎固体，其可以为与本发明微细粉碎的化合物或者活性组分的混合物。在片剂中，活性组分与具有必要粘合性质的载体以合适的比例混合，并压制成所需的形状和尺寸。
为了制备栓剂组合物，首先熔化低熔点蜡(例如脂肪酸甘油酯和可可脂的混合物)，然后例如通过搅拌，在其内分散活性组分。然后将熔化的均匀混合物倒入适当尺寸的模具中并使之冷却和硬化。
合适的载体可以为碳酸镁、硬脂酸镁、滑石、乳糖、蔗糖、果胶、糊精、淀粉、黄蓍胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、低熔点蜡、可可脂等。
术语 “组合物”还意图包括活性组分与作为载体并提供胶囊的包封材料的制剂，其中活性组分(有或没有其它载体)由此被与之结合的载体包裹着。相似地，还包括扁囊剂。
片剂、粉剂、扁囊剂和胶囊剂可以用作适合口服的固体剂型。
液体形式的组合物包括溶液剂、混悬剂和乳剂。例如，活性组分的无菌水或水丙二醇溶液可以为适合肠胃外给药的液体制剂。液体组合物也可以配制为聚乙二醇水溶液的形式。
口服用水溶液可以通过将活性组分溶解在水中并根据需要加入合适的着色剂、调味剂、增溶剂和增稠剂来制备。口服用的含水混悬剂可以通过将微细粉碎的活性组分和粘性材料分散在水中来制备，所述粘性材料例如天然合成胶、树脂、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和药物配制领域已知的其它悬浮剂。
基于给药的方式，药物组合物优选地包括0.05％至99w％(重量％)，更优选0.10至50w％的本发明化合物，所有百分比都是基于组合物总重。
本领域普通技术人员可以利用已知的标准来确定实践本发明的治疗有效量，所述标准包括单个患者的年龄、体重和反应，并可以在正在被治疗或预防的疾病的范围内解释。
另一方面，本发明提供制备本发明化合物的方法。
在一个实施方式中，发明人提供制备式I化合物的方法，包括：
将N，N-二乙基-4-[(3-硝基苯基)(1-哌嗪基)甲基]苯甲酰胺与R-CH2X或R-CHO反应，形成硝基中间体；
用合适的还原剂还原所述中间体。
其中，
R选自2-氟苯基，3-氟苯基和4-氟苯基；并且X选自Cl、I、Br、-OTs(甲苯磺酰基)和-OMs(甲磺酰基，mesylate)。
在一个实施方式中，所述还原剂可选自氢、锌或铁。
在另一个实施方式中，所述N，N-二乙基-4-[(3-硝基苯基)(1-哌嗪基)甲基]苯甲酰胺可选自N，N-二乙基-4-[(S)-(3-硝基苯基)(1-哌嗪基)甲基]苯甲酰胺和N，N-二乙基-4-[(R)-(3-硝基苯基)(1-哌嗪基)甲基]苯甲酰胺。
在另一个实施方式中，R可以是2-氟苯基；式I化合物可以是4-[(3-氨基苯基)[4-[(2-氟苯基)甲基]-1-哌嗪基]甲基]-N，N-二乙基苯甲酰胺。
在另一个实施方式中，R可以是3-氟苯基；式I化合物可以是4-[(3-氨基苯基)[4-[(3-氟苯基)甲基]-1-哌嗪基]甲基]-N，N-二乙基苯甲酰胺。
在另一个实施方式中，R可以是4-氟苯基；式I化合物可以是4-[(3-氨基苯基)[4-[(4-氟苯基)甲基]-1-哌嗪基]甲基]-N，N-二乙基苯甲酰胺。
更特别地，本发明化合物和用于制备其的中间体可按照下图1和2中所示的合成路线制备。
方案1
Figure A20058002627400141
方案2
生物学评价和性质
发现本发明的化合物对温血动物例如人的δ受体具有活性。特别是发现了本发明的化合物为有效的δ受体配体。下文中的体外测定、红外证明了这些意料不到的活性，尤其是如在大鼠脑功能测定和/或人δ受体功能测定(low)中所证明的有关激动剂效力和功效。该特征可能与体内活性有关并且可能与结合亲和力不呈线性关系。在这些体外测定中，测试了化合物对δ受体的活性，并且获得了IC50，以确定特定化合物对δ受体选择性活性。在目前的上下文中，IC50通常指观察到50％的标准放射性δ受体配体被替换的化合物浓度。
化合物对κ和μ受体的活性也以类似的试验测定。
体外模型
细胞培养
将表达克隆的人κ、δ和μ受体和耐新霉素的人293S细胞在37℃和5％的CO2下，在含有无钙DMEM 10％FBS、5％BCS、0.1％Pluronic F-68和600μg/ml遗传霉素的摇瓶中悬浮生长。
将大鼠脑称重并且用冰冷却的PBS(含有2.5mM EDTA，pH 7.4)冲洗。将脑在用冰冷却的溶解缓冲液(50mM Tris，pH 7.0，2.5mM EDTA，临用前将苯基甲磺酰氟从0.5M的DMSO：乙醇储液加至0.5mM)中用polytron匀化30秒(大鼠)。
膜制备
将细胞沉淀并且再悬浮在溶解缓冲液(50mM Tris，pH 7.0，2.5mMEDTA，临用前将PMSF用0.1M乙醇储液加至0.1mM)中，在冰上培育15分钟，然后用polytron匀化30秒。在4℃，以1000克(max)离心该悬浮液10分钟，将上清液保留在冰上并且将沉淀如前面再悬浮并且离心。合并两次离心的上清液并且以46,000克(max)离心30分钟。将沉淀再次悬浮在冷Tris缓冲液(50mM Tris/Cl，pH 7.0)中并且再次离心。将最终的沉淀再次悬浮在膜缓冲液(50mM Tris，0.32M蔗糖，pH 7.0)中。在干冰/乙醇中冷冻聚丙烯试管中的等分试样(1ml)并且在-70℃储存直到使用时。用十二烷基磺酸钠改进的Lowry试验确定蛋白质的浓度。
结合测定
在37℃将膜解冻，在冰上冷却，(或者如果不立刻使用，将其保存在冰上)从25-号针头中通过3次，并且稀释至结合缓冲液(50mM Tris，3mMMgCl2，1mg/ml BSA(Sigma A-7888)，pH 7.4中，用0.22m过滤器过滤之后在4℃储存，并且其中新加入5μ克/毫升的抑肽酶、10μM苯丁抑制素、10μM diprotin A如果膜来源于组织(大鼠、小鼠、猴子，无DTT)。将100μl等分试样加入到含有100μl合适的放射性配体和100μl各种浓度被测试的化合物、冰冻的12×75mm聚丙烯的试管中。分别在没有纳洛酮和存在10μM纳洛酮下确定总结合(TB)和非特异性结合(NS)。将试管涡旋并且在25℃培养60-75分钟，之后将试管中的物质快速地真空过滤并且在0.1％的聚乙烯亚胺中至少预浸2小时的GF/B过滤器(Whatman)，用约12ml/试管冰冻的洗涤缓冲液(50mM Tris，pH 7.0，3mM MgCl2)洗涤。将过滤器浸在含有6-7ml闪烁液的小管形瓶中至少12小时后，用β计数器测量保留在过滤器上的放射性(dpm)。如果该测定在96-位深孔板上进行，则通过96-位PEI-浸过的单一过滤器过滤，用3×1ml洗涤缓冲液洗涤，并且在55℃烘箱中干燥2小时。加入50μl MS-20闪烁液/孔之后，滤板在TopCount(Packard)上计数。如果测定在96深孔的孔板上进行，用10-点δ置换曲线，和5-点μ和κ置换曲线计算化合物的IC50。该测定在含有适量的膜蛋白(2μg、35μg和1μg，如果分别采用δ、μ和κ)和50000-80000dpm/孔适当的示踪物(125I-Deltorphin II，125I-FK33824和125I-DPDYN分别用于Delta，Mu，和Kappa)的300μl液体中进行。总结合和非特异性结合在10μM纳洛酮存在与不存在的情况下测定。
功能测定
通过确定化合物受体复合物激活受体偶合的G-蛋白与GTP的结合程度，测定化合物的激动剂活性。在GTP结合测定中，将GTP[γ]35S与被测试的化合物及表达克隆的人的阿片受体的HEK-293S细胞膜或匀化大鼠和小鼠的脑膜混合。激动剂在这些膜中刺激GTP[γ]35S结合。由剂量-反应曲线确定化合物的EC50和Emax值。用由δ拮抗剂纳屈吲哚(naltrindole)产生的剂量反应曲线右移来验证激动剂活性通过δ受体介导。对于人类δ受体功能测定，当测定中所用的人类δ受体的表达比那些用于测定EC50(high)更低时，测量EC50(low)。Emax值确定与标准δ激动剂SNC80有关，即高于100％为比SNC80更有效的化合物。
大鼠脑GTP测定方法
在37℃将大鼠脑膜解冻，从25-号平端针中通过3次并且在GTPγS结合液(50mM Hepes、20mM NaOH、100mM NaCl、1mM EDTA、5mM MgCl2，pH 7.4，新鲜加入：1mM DTT，0.1％BSA)中稀释。向膜稀释液中加入最终的120μM GDP。由在300μl、用适量的膜蛋白(20μg/孔)和每孔100000-130000dpm的GTPγ35S(0.11-0.14nM)完成的10-点剂量-反应曲线，计算化合物的EC50和Emax值。在无和存在3μM SNC80下确定基础和最大刺激结合。该测定在稳定表达克隆Delta受体的HEK293S细胞上进行，所用的缓冲液有少许不同(50mM Hepes、20mM NaOH、200mM NaCl、1mMEDTA、5mM MgCl2、pH 7.4、新加入：0.5％BSA，无DTT)以及3μM最终浓度的GDP。
数据分析
特异性结合(SB)以TB-NS计算，并且在各种受试化合物存在下的SB用对照SB的百分比表示。对于替换特异性结合放射性配体的配体，IC50和Hill系数(nH)值由logit图或曲线拟合程序如Ligand、GraphPad Prism、SigmaPlot或ReceptorFit计算。由Cheng-Prussoff方程计算Ki值。报告了在至少三个替换曲线中测试的配体IC50、Ki和nH的平均值±S.E.M.。
表1显示本发明化合物用上述测定方法测量的生物学数据。
Figure A20058002627400181
N/A：无法测得
受体饱和实验
在细胞膜上用合适的放射性配体，以估计Kδ值的0.2到5倍的浓度范围(如果所需放射性配体的量可行，最高可达10倍)进行结合测定，确定放射性配体的Kδ值。特异性放射性配体结合表示为pmole/mg膜蛋白。根据一点(one-site)模型由特异性结合(B)对nM游离(F)放射性配体的非线性拟合，获得每个实验的Kδ值和Bmax值。
用Von Frey实验确定机械性-异常性疼痛(allodynia)
用Chaplan等(1994)描述的方法、在08:00和16:00小时之间进行实验。将大鼠置于有机玻璃(Plexiglas)笼内，在允许爪子进入的丝网底部之上，并使其习惯10-15分钟。受试区域为左后爪底中部，避免较不敏感的足垫。将爪与一系列具有对数递增坚度(stiffness)(0.41、0.69、1.20、2.04、3.63、5.50、8.51和15.14克；Stoelting，Ill，USA)的8Von Frey毛发接触。将VonFrey毛发从与跖面垂直的网底下面，以足够的力量轻轻扣住爪，并保持大约6-8秒。如果爪急促地缩回，表示为阳性反应。对移开毛发立即产生退缩也认为是阳性反应。移动被认为是不明确的反应，并且在这种情况下重复刺激。
实验方案
对FCA-处理组在手术后的1天测试动物。用Dixon(1980)的升降(up-down)方法确定50％的收缩阈值。测试以该系列的中间值2.04克毛发开始。不论递增或递减，刺激始终以连续方式存在。在爪对最初选择的毛发无缩回反应的情况下，进行更强的刺激；如果发生爪缩回反应，下次选择较弱的刺激。用该方法在最接近50％阈值的反应中计算最佳阈值需要6次，并且当第一次反应变化出现例如阈值首次交叉时开始记录这6次反应。当阈值在刺激范围外时，分别指定15.14(正常敏感性)或0.41(最大异常性疼痛)两值。按惯例将所得阳性和阴性反应的模式列表，X＝无缩回；O＝缩回，50％缩回阈值用下式计算：
50％g阈值＝10(Xf+kδ)/10,000
其中Xf＝最后所用的von Frey毛发的值(对数单位)；k＝阳性/阴性反应模式的列表值(自Chaplan等(1994))；δ＝刺激之间的平均差(对数单位)。在此δ＝0.224。
根据Chaplan等1994，将von Frey阈值转换成最大可能效应的百分比(％MPE)。下列方程用于计算％MPE：
Figure A20058002627400191
受试物质的给药
在进行von Frey测试前给大鼠注射(皮下、腹膜内、静脉内或经口)受试物质，给予受试化合物和von Frey测试之间的时间取决于该受试化合物的性质而变化。
扭曲试验(writhing test)
当在小鼠经腹膜内给予乙酸时将引起腹部收缩。然后这些反应将以典型模式扩展到其身体。当给予止痛药时，观察到所述活动较不频繁，并且将该药选为潜在的好候选药。
仅当下列因素存在时才认为是完全并且典型的扭曲反射：该动物不活动；下背轻微降低；两爪底面可观察到。在该试验中，经口给药1-100μmol/kg后，本发明化合物显示出显著的扭曲反应抑制作用。
(i)溶液制备
乙酸(AcOH)：将120μL乙酸加入到19.88ml蒸馏水中以获得最终体积为20ml、最终浓度为0.6％AcOH。然后将该溶液混合(涡旋)并等待注射。
化合物(药物)：根据标准方法，在最合适的载体中制备并溶解各化合物。
(ii)溶液给药
将化合物(药物)以10ml/kg(考虑小鼠平均体重)，在测试前20、30或40分钟(根据化合物的类别及其性质)经口、腹膜内(i.p.)、皮下(s.c.)或静脉内(i.v.)给药。当化合物中枢释放时：脑室内(i.c.v.)或鞘内(i.t.)给予5μL体积。
在测试前，以10ml/kg(考虑小鼠的平均体重)立即在两个部位经腹膜内(i.p.)给予AcOH。
(iii)测试
观察动物(小鼠)20分钟并记录出现(扭曲反射)的次数，并且在实验结束时汇总。将小鼠置于单独的并且具有接触基床的“鞋盒(shoe box)”笼中。通常同时共观察4只小鼠：一只对照和三只给药。
对焦虑症和焦虑样适应征，用大鼠geller-seifter冲突实验确定有效性。
对功能性胃肠道病症，通过Coutinho SV等在American Journal ofPhysiology-Gastrointestinal & Liver Physiology.282(2)：G307-16，2002年2月所描述的试验用大鼠确定有效性。
另外的体内试验方案
受试动物和饲养环境
将首次接受试验的雄性Sprague Dawley大鼠(175-200克)以5只一组，饲养在温度控制室(22℃，40-70％湿度，12小时光照/黑暗)。实验在循环的光照阶段进行。动物自由进食和水且在获得数据后立即被处死。
样品
化合物(药物)测试包括未接受任何处理的大鼠组以及用大肠杆菌(E.coli)脂多糖(LPS)处理的其他组。对于LPS-处理的实验，四组用LPS注射，然后四组之一用载体处理而其他三组注射药物及其载体。进行第二批实验，涉及五组大鼠；所有大鼠均没有接受LPS处理。首次接受试验的组(
Figure A20058002627400211
group)不接受化合物(药物)或载体；其他四组用有或无药物的载体处理。进行这些实验以确定药物抗焦虑或镇静作用，可将其归因于USV的减少。
LPS给药
在处理前使大鼠在实验室中习惯15-20分钟。通过给予LPS(革兰氏阴性大肠杆菌血清型内毒素0111：B4，Sigma)诱发炎症。在异氟烷麻醉下、用标准立体定位手术技术，经脑室内(i.c.v.)以10μl体积注射LPS(2.4μg)。将耳之间的皮肤以喙状推开并纵向切开约1cm的切口使头盖骨表面暴露。穿刺位置由下列坐标确定：前囱后O.8mm，人字点(矢状缝)侧面(左侧)1.5mm及侧脑室内、头盖骨(垂直)表面下5mm。用消毒的5mm长并且由聚乙烯管(PE20；10-15cm)接至100-μl Hamilton注射器上的不锈钢针(26-G 3/8)注射LPS。将由穿刺针(20-G)制备的4mm的塞子放置在其上并通过硅树脂胶固定至26-G针以产生所需的5mm深度。
注射LPS之后，再保留针10秒使化合物扩散，然后撤去。封闭切口，将该大鼠返回到原先的笼中并使其在测试前休息最少3.5小时。
建立喷气刺激实验
注射LPS后大鼠保留在实验室中并给予化合物(药物)。在测试时，所有大鼠移开并置于实验室外。将大鼠一次一只带进测试实验室并且置于干净的盒(9×9×18cm)中，然后将该盒置于大小为62(w)×35(d)×46(h)cm(BRS/LVE，Div.Tech-Serv Inc)的消音并且通风的小室中。通过0.32cm的空气输出喷嘴输送喷气，由能够输送固定持续时间(0.2秒)和固定强度的空气喷气系统(AirStim，San Diego Intruments)以每10秒喷1次的频率控制。最多喷10次或直到开始发声，总是首先开始发声。第一次空气喷气标志着记录的开始。
建立超声记录实验
用放置在各个小室内并且用LMS(LMS CADA-X 3.5B，Data AcquisitionMonitor，Troy，Michigan)软件控制的麦克风(G.R.A.s.声音和振动，Vedbaek，Denmark)记录发声10分钟。记录0至32000Hz之间的频率，保存并用相同的软件分析(LMS CADA-X 3.5B，Time Data Processing Monitor andUPA(用户程序设计和分析))。
化合物(药物)
将所有化合物(药物)均调节pH为6.5至7.5并且以体积为4ml/kg给药。给予化合物(药物)后，将动物返回其原先的笼中直到测试时间。
分析
将记录进行一系列的统计和Fourier分析以筛选(在20-24kHz之间)和计算目标参数。数据以平均值±SEM表示。用T-检验比较首次接受试验的大鼠和LPS处理大鼠来评价统计学意义，并用单侧ANOVA，接着用Dunnett的多重比较检验(post-hoc)来评价药物的有效性。最小p值≤0.05，则认为组间差异显著。实验重复最少两次。
用Hargreaves跖肌试验测定热刺激痛觉过敏
给药FCA或角叉菜胶
Freund’s完全佐剂(FCA)：SIGMA cat.#F 5881，Mycabacteriumtuberculosis(H37Ra，ATCC 25177)，1mg/ml，加热杀灭，干燥，0.85ml石蜡，0.15ml二缩甘露醇单油酸酯。或角叉菜胶Lambda型IV(Cg)：SIGMA cat.#C-3889，(明胶，植物的；Irish moss)，(1.0％溶液)于NaCl中。
用装备26G5/8”号的灭菌针头的Hamilton注射器注射。捉持大鼠并放置在室中用异氟烷麻醉。当达到期望效果时，移开大鼠并使其处于腹卧位(胸骨位置)。抓紧左后爪，将针头插入皮下，腹面，在#2和#3爪指的足垫之间，到达爪子的中部(跖骨部分)。最后，慢慢向爪子注射100μl FCA，或100μl角叉菜胶溶液，除去针头后，轻轻压迫3-4秒。
如果动物在操作中醒来，将其放回吸入室直到到达期望效果。跖肌内(intraplantar)注射后，动物其笼子中醒来待观察。
用FCA处理后，等待48小时大鼠发展炎症。用角叉菜胶处理后，等待3小时大鼠发展炎症。在测试初期，大鼠被放置在实验室(在其笼子里)。使它们有至少30分钟熟悉场所。
测试点
热刺激作用于跖面的中心，在足垫之间。测试点必须与玻璃接触，其间没有尿液或粪便，使保持从玻璃到皮肤的正常热传递性质。
跖肌装置(plantar apparatus)包括一个有玻璃顶部/平台的盒子，玻璃表面通过内部的反馈机制维持在30℃。在该玻璃平台下面，电灯泡安装在可移动臂上，其下面放置一面镜子，使灯光照射在大鼠爪子下面。当灯光打开时，其通过一个直径为～2mm的孔照射。试验者打开灯光，当爪子移开时，自动感应器会关掉灯光；关闭20.48秒保证不会发生组织损伤，使大鼠不能移动爪子。试验者也可以在任何时间关掉灯光。计时器将纪录灯光打开的持续时间。
流量计：测量灯光打开时的流量/cm2。应维持在～97-98；流量可通过调整跖肌装置进行更改，但不能在试验中间改变。
时间过程
本试验可在诱导炎症之后不同时间长度时进行。在FCA注射后48h或角叉菜胶注射后3h测量痛觉过敏。
试验方案
首次接受试验的大鼠(naive rats)：为建立剂量响应曲线，将一组7只大鼠用作对照组；它们与其他的28只大鼠被麻醉，但不接受任何注射。首次接受试验的组测试可在试验开始之前或之后立刻进行，尽可能减小大鼠的紧张状态，将其放在跖肌装置顶部单独的有机玻璃盒(Plexiglas boxes)(14×21×9cm)中；使它们适应环境30分钟。当动物可用于测试，将灯直接放置在测试点下方并打开，纪录爪子回缩前的等待时间。5-8分钟后，待皮肤温度恢复到正常，进行第二次读数，然后将大鼠放回笼子中。
基线值：将已经注射过FCA(或角叉菜胶)的28只大鼠(分为4组)分别放于机器上的单独盒子中，并让其适应环境30分钟。试验者验证爪子炎症的程度，并察看是否褪色。将热刺激放置于测试点下方，纪录爪子回缩前的等待时间；如上读取两次。将这些基线值与首次接受试验的动物的基线值相比较，确定是否痛觉过敏。
给药后测试：一旦证实痛觉过敏，向这些大鼠注射所研究的化合物。根据标准操作制备每个化合物，并溶解于最合适的载体中。给药路径、剂量、体积、以及注射后测试的时间对该化合物(或该类化合物)是特定的。当在注射后20-30分钟测试化合物，例如i.v.或s.c.注射，将大鼠放置在跖肌装置中并让其适应环境，同时等待开始发挥药效。当在注射后60分钟或更久测试化合物，将大鼠与其室友放回其原先的笼子中。大鼠通常放于其原先的笼子中与其原先的室友在一起，以使在一组大鼠中重新建立社会结构的紧张压力最小。30分钟后，将大鼠放置于跖肌装置上，并等待30分钟让其适应跖肌机器。测试如上进行。读取两次数据。
测试标准：
试验动物应是镇静和安静的，然而是警觉的，并处于正确位置，爪子的皮肤与机器的玻璃表面之间没有尿液或粪便。如果有以下状况，不能测试动物：
-动物在运动中，包括在嗅闻、理毛和探查。
-动物在睡眠中。
-动物明显表现出紧张的体征(紧张性不动、发声、耳朵变平)，除非这些可能是药物的副作用且无法避免。
-动物放置的方法使爪子不能直接接触玻璃(爪子静止放在尾巴端上)；
-注射失败时动物的爪子呈现蓝色。在该情况中，该动物完全不能参加试验(在初期)。
当出现尿液或粪便，移开动物，将玻璃表面擦干净，再重新放置动物。当动物在睡眠，或表现出紧张性不动，试验者可轻轻地移动盒子，或用手在盒子前面轻轻移动，引起大鼠短暂的注意。在整个试验中都应密切观察动物的行为。
再测试：
在试验的任何时间，如果试验者不确定爪子回缩是对热刺激的反应，可在5-8分钟后对动物进行再测试。这可能归因于动物突然活动，或在刺激作用时排尿或排便。
可接受的反应：
下列的任何表现被认为是对热刺激的反应：
-爪子从玻璃上回缩(之后常常出现舔爪)
-身体的侧方运动(被刺激爪的对侧)
-脚趾从玻璃上移开
-发炎爪子的中心面(中爪)从玻璃上移开
分析
数据以平均数±SEM表达。用T-检验评价首次接受试验组和发炎大鼠组的统计学意义，并用单侧ANOVA，接着用Dunnett的多重比较检验(post-hoc)来评价药物的有效性。最小p值≤0.05，则认为组间差异显著。
药物代谢和药物动力学性质
申请人意料不到发现化合物中一种或多种药物代谢和药物动力学性质得到改进，归因于式I中苄基-哌嗪部分中下部的苄基的氟取代。在一个实施方式中，发现由于本发明的化合物，某些反应代谢产物减少或消除。在另一个实施方式中，本发明的一些化合物由于其对2D6和3A4细胞色素P450弱亲和力而提供改善的生物利用度。下列测定方法证明这些化合物的一个或多个意料不到的性质。
微粒体培养
将本发明的化合物(10μM标称起始浓度)独立地与大鼠肝脏微粒体(0.5mg/ml蛋白)在0.1M KH2PO4缓冲液(pH 7.4)，以及5mM MgCl2和5mM捕集试剂(谷胱甘肽(GSH)、N-乙酰半胱氨酸(NAC)，或者CH3ONH2)中，在37℃下培养60分钟。向培养混合物加入NADPH(1mM)使反应开始，加入等量酸化(0.1％甲酸的乙腈溶液)使反应终止。
肝细胞培养
将本发明的化合物(10μM标称起始浓度)独立地与新鲜分离的大鼠(Sprague Dawley)肝细胞和冷藏保存的狗(Beagle)肝细胞(1×106细胞/mL)在pH 7.4，37℃下培养1小时。肝细胞培养混合物包含的Williams E介质，补无有25mM HEPES、1％ITS-G溶液(Life Technologies，Cat.No.41400-045)、10mM HEPES(pH 7.4)和2mM L-谷氨酰胺。向培养混合物中加入等量酸化(0.1％甲酸的乙腈溶液)使反应终止。
LS-MS分析
蛋白沉淀后，用LC-MS完全扫描测定样品上清液的代谢产物。获得每种被检测的代谢产物的分子量信息。从附加的LC-MS/MS试验获得的裂解谱帮助确定初级代谢产物的结构。
仪器
Figure G05826274720070206D000211
试验结果
用于观测化合物的主要生物转化路径是N-脱乙烷化，N-脱烷烃化和羟基化。对于具有氟取代的苄基-哌嗪基部分的本发明化合物，在大鼠肝细胞培养物中没有检测到苯上的谷胱甘肽加合物。相反的，对于没有氟取代的苄基环的类似化合物，在大鼠肝细胞培养物中检测到所述环上的一些谷胱甘肽加合物。
体内微量渗析方法
步骤
把大鼠随机分成八个处理组：载体安静，载体应激，药物安静，药物应激。在试验前2小时把微透析探针(CMA/12，对mPFC，4mm膜长度)植入脑中，并且使用流速为1.1mL/min的人工CSF(aCSF，CMA MicrodialysisAB)灌注2小时以稳定基线。采集三个20分钟样本以定义基线，经由腹膜内对动物注射载体或化合物，并且在随后的5小时内进行样本采集。在化合物给药后20分钟开始应激反应范例程序。立即(在线)在HPLC系统上对样本进行注射以分析一元胺的浓度。将在给药化合物/载体前采集的三个样本中的神经传递素浓度进行平均，定义为基线(100％)。然后，随后的微透析法中的神经传递素浓度表示为基线水平的百分比形式。
应激反应操作
在应激反应操作中，使用配有光，紧张和震动器的标准被动避免盒(MedAssociates，Inc)。盒子放置在消音室中。应激反应范例在一天内发生。动物在2小时内适应该室，然后在6分钟内，暴露在一系列的闪光中，随后是电足击(持续时间0.5秒，强度1.5mA，总共10次电击)。“安静”组是指暴露于带有光的室中，但是没有进行震动。40分钟后继续重复动物的光刺激，但是不进行震动。
给药
所有化合物均溶解于无菌蒸馏水(载体)并在应激反应操作前20分钟向腹膜内(IP)给药。
HPLC和电化学检测
HPLC系统包括5041泵，Model 5200A Coulochem II监测器，MD-150 3×150mm柱，model 5041安培计单元(都来自ESA Inc)以及在线注射器(来自BAS Inc)。流动相是：75mM Na2HPO4，25mM EDTA，1.7mM 1-辛烷硫酸，100μl/L三乙胺，10％乙腈，pH 3.0。电位设置为+0.65V，流速持续在0.3ml/min。使用基于PC的采集/分析系统(501 Computer and A/D Software，ESA，Inc)收集数据，积分并传送到试算表/图解软件进行进一步分析。
对6-8只大鼠一组，将大脑内微量渗析探针放置在内侧的额前皮质(此处神经化学物质信号最强)，对大鼠进行上述的条件反射规范，在用载体处理的动物中观察到去甲肾上腺素(NE)和多巴胺增加。本发明化合物阻断NE和多巴胺的持续增加。
Geller-Siefter-焦虑模型方法
在冲突试验中，饥饿的动物在标准操作室中，被训练成在两种条件下压迫杠杆得到食物。第一个条件，是非压迫性部分，当平均17次压迫杠杆后，食物被运送到(也称为VR17强化方案)。第二个条件，压迫性部分，其通过在操作室内的闪光发出信号，当平均17次压迫杠杆后，食物也被运送，但在单独的VR17方案内，还另外对笼子底进行电击。每日试验包括5个交替出现的每个部分：压迫性(持续3分钟)以及非压迫性(持续3分钟)。压迫性部分中的压迫杠杆的次数明显比非压迫性部分中的低。抗焦虑药，例如地西泮，在一定剂量范围内能增加动物在压迫性部分压迫杠杆的次数，而不会改变在非压迫性部分压迫杠杆的次数。本发明的化合物在该试验中表现出抗焦虑作用。
实施例
本发明将通过下列实施例进一步详细描述，这些实施例将描述本发明化合物如何制备、纯化、分析以及生物学检测，并且不应理解为对本发明的限制。
中间体1：4-碘-N，N-二乙基苯甲酰胺
在0℃下向4-碘-苯酰氯(75g)在500mL CH2Cl2中的混合物中加入Et3N(50mL)和Et2NH(100mL)的混合物。加入后，所得反应混合物在1小时内回温至室温，并用饱和氯化铵洗涤。有机萃取物经干燥(Na2SO4)、过滤并浓缩。残余物从热己烷中重结晶，得到80g中间体1。
中间体2：4-[羟基(3-硝基苯基)甲基]-N，N-二乙基苯甲酰胺
将N，N-二乙基-4-碘苯甲酰胺(5.0g，16mmol)溶解于THF(150mL)并在氮气气氛下冷却至-78℃。在-65至-78℃下，在10min内逐滴加入n-BuLi(15mL，1.07M己烷中的溶液，16mmol)。在-78℃下将溶液通过导管加入到3-硝基苯甲醛(2.4g，16mmol)在甲苯/THF(约1∶1，100mL)的溶液中。30min后加入NH4Cl(水溶液)。有机相经真空浓缩，用EtOAc/water萃取，干燥(MgSO4)并蒸发，残余物经硅胶色谱(0-75％EtOAc/庚烷)纯化得到中间体2(2.6g，50％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δH 1.0-1.3(m，6H)，3.2(m，2H)，3.5(m，2H)，5.90(s，1H)，7.30-7.40(m，4H)，7.50(m，1H)，7.70(d，J＝8Hz，1H)，8.12(m，1H)，8.28(m，1H)。
中间体3：N，N-二乙基-4-[(3-硝基苯基)(1-哌嗪基)甲基]苯甲酰胺
向醇中间体2(10.01g，30.5mmol)在二氯甲烷(200mL)的溶液中加入亚硫酰溴(2.58mL，33.6mmol)。室温中1小时后，反应物用饱和碳酸氢钠水溶液(100mL)洗涤，并分离有机层。用二氯甲烷(3×100mL)洗涤水层，合并有机相并干燥(Na2SO4)，过滤并浓缩。
将粗制的苄基溴溶解于乙腈(350mL)，并加入哌嗪(10.5g，122mmol)。在65℃下加热反应物1小时后，用饱和氯化铵/乙酸乙酯洗涤并分离有机层。水层用乙酸乙酯(3×100mL)萃取，合并有机相经干燥(Na2SO4)，过滤和浓缩得到外消旋的中间体3。
中间体4b：N，N-二乙基-4-[(R)-(3-硝基苯基)(1-哌嗪基)甲基]苯甲酰胺
将外消旋的中间体3溶解于乙醇(150mL)，并加入二对甲苯酰-D-酒石酸(11.79g，1当量)。产品在12小时内析出。过滤收集固体，并重新溶解于回流的乙醇中，直到所有固体溶解(约1200mL乙醇)。固体冷却后，过滤收集并重复重结晶一次。过滤收集固体，并用氢氧化钠水溶液(2M)处理，用乙酸乙酯萃取。有机萃取物经干燥(Na2SO4)，过滤并浓缩得到1.986g中间体4b。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δH 1.11(br s，3H)，1.25(br s，3H)，2.37(br s，4H)，2.91(t，J＝5Hz，4H)，3.23(br s，2H)，3.52(br s，2H)，4.38(s，1H)，7.31-7.33(m，2H)，7.41-7.43(m，2H)，7.47(t，J＝8Hz，1H)，7.75-7.79(m，1H)，8.06-8.09(m，1H)，8.30-8.32(m，1H)。
在HPLC上用以下条件测定手性纯度：
Chiralpack AD柱(Daicel Chemical Industries)
低速1ml/分钟
25℃下洗脱30分钟
等度的15％乙醇(含有0.1％v/v二乙基胺)和85％己烷(含有0.1％v/v二乙基胺)
分子的停留时间＝20分钟
中间体4a：N，N-二乙基-4-[(S)-(3-硝基苯基)(1-哌嗪基)甲基]苯甲酰胺
(S)对映异构体中间体4a可通过上述拆分操作将上述溶液与二对甲苯酰-L-酒石酸反应获得。
化合物1：4-{(S)-(3-氨基苯基)[4-(4-氟苄基)哌嗪-1-基]甲基}-N，N-二乙基苯甲酰胺
Figure A20058002627400301
向中间体4a(467mg)在1，2-二氯乙烷(13ml)中的溶液中加入4-氟苯甲醛(252μL；2当量)以及三乙酰氧基硼氢化钠(498mg；2当量)。反应物在室温下于氮气氛中搅动18小时并浓缩。加入饱和碳酸氢钠，用三份二氯甲烷萃取水层，合并的有机层用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩。将化合物溶解于乙醇，四氢呋喃，水和饱和氯化铵(4ml；比例4∶2∶1∶1v/v)的混合物。加入纳米铁颗粒(3刮刀末端量)，所得溶液在微波炉中于150℃下加热10分钟。所得混合物冷却，用硅藻土过滤并浓缩。残余物通过硅胶快速色谱纯化，用1％至5％MeOH的二氯甲烷梯度溶液洗脱。获得的产品溶解于二氯甲烷中，其中已加入有1.2mL 1M HCl的乙醚溶液。除去溶剂分离出无色固体产品即化合物1的盐酸盐(164mg，30％产率)。纯度(HPLC)：＞99％；光学纯度(手性HPLC)：＞99％；1H NMR(400MHz，CD3OD)，1.08(t，J＝6.5Hz，3H)，1.21(t，J＝6.5Hz，3H)，3.20-3.26(m，4H)，3.51-3.54(m，6H)，4.43(s，2H)，7.19-7.23(m，2H)，7.34(d，J＝8.0Hz，1H)，7.40(d，J＝8.0Hz，2H)，7.54-7.63(m，3H)，7.70-7.82(m，4H).实验值：C，54.63；H，6.49；N，8.68.C29H36N4OF×4.1 HCl×0.8 H2O×0.1 C4H10O的理论值C，57.67；H，6.51；N，8.67％。
化合物2：4-{(R)-(3-氨基苯基)[4-(4-氟苄基)哌嗪-1-基]甲基}-N，N-二乙基苯甲酰胺
向中间体4b(5.790g，14.6mmol)在1，2-二氯乙烷(60mL)的溶液中加入4-氟苯甲醛(2.04mL，19.0mmol)以及三乙酰氧基硼氢化钠(4.02g，19.0mmol)。室温下20小时后，用碳酸氢钠水溶液中止反应，并分离有机相。水层用二氯甲烷(3×100mL)萃取，合并的有机萃取物经干燥(Na2SO4)，过滤和浓缩。残余物经快速色谱纯化，用30％至50％丙酮的己烷溶液洗脱，得到无色泡沫(5.285g，71％)，其为硝基中间体。将该硝基中间体(5.285g，10.4mmol)溶解于乙醇，四氢呋喃，水和饱和氯化铵水溶液(比例4∶2∶1∶1v/v)的混合物(100mL)中，并加入铁颗粒(0.63mg，11.5mmol)。反应物加热回流，定期加入更多的铁颗粒。回流(90℃)24小时后，反应物冷却至室温，用硅藻土过滤并浓缩。向残余物中加入碳酸氢钠溶液和二氯甲烷。分离有机层，用二氯甲烷(3×100mL)萃取水层，合并的有机相经干燥(Na2SO4)，过滤并浓缩。产品在硅胶上纯化，用1％至5％甲醇的二氯甲烷溶液洗脱得到浅黄色泡沫化合物2(3.505g)。从上述快速色谱中另外获得的不纯的物质，对其进行第二次快速色谱，以纯化，用100％乙酸乙酯至5％甲醇的乙酸乙酯溶液洗脱再得到0.949g化合物2。一共获得物质：4.454g(90％产率)。纯度(HPLC)：＞99％；光学纯度(手性HPLC)：＞99％；1H NMR(400MHz，CD3OD)，1.08(t，J＝6.5Hz，3H)，1.21(t，J＝6.5Hz，3H)，3.20-3.26(m，4H)，3.51-3.54(m，6H)，4.43(s，2H)，7.19-7.23(m，2H)，7.34(d，J＝8.0Hz，1H)，7.40(d，J＝8.0Hz，2H)，7.54-7.63(m，3H)，7.70-7.82(m，4H)。实验值：C，54.00；H，6.34；N，8.47.C29H35FN4O×4.7 HCl×0.2 C4H10O×0.1 H2O理论值C，54.02；H，6.37；N，8.46％。
化合物3：4-[(R)-(3-氨基苯基)[4-[(2-氟苯基)甲基]-1-哌嗪基]甲基]-N，N-二乙基苯甲酰胺
向中间体4b(298mg，0.752mmol)在1，2-二氯乙烷(8.5ml)中的溶液中加入2-氟苯甲醛(160mg，1.503mmol，2当量)以及三乙酰氧基硼氢化钠(319mg，1.503mmol，2当量)。反应物在室温下于氮气氛中搅动18小时后，浓缩。加入饱和的碳酸氢钠，水溶液用三份二氯甲烷萃取，合并的有机相用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩。将化合物溶解于乙醇，四氢呋喃，水和饱和氯化铵(3ml；比例4∶2∶1∶1v/v)的混合物中。加入纳米铁颗粒(3刮刀末端量)，所得溶液在微波炉中150℃下加热10分钟。所得混合物冷却后，用硅藻土过滤并浓缩。将粗制品溶解于CH2Cl2并用水洗涤。分离有机层，水层用二氯甲烷萃取。合并的有机层经干燥(Na2SO4)，过滤并浓缩。产品经反相HPLC(5-50％CH3CN/H2O梯度溶液，包含0.1％TFA)纯化得到化合物3，为TFA盐(0.28g，46％产率)。该物质从CH3CN/H2O中冻干，形成浅黄色粉末。1H NMR(400MHz，CD3OD)1.08(t，J＝6.6Hz，3H)，1.22(t，J＝6.6Hz，3H)，2.39(br s，2H)，3.02(br s，2H)，3.18-3.38(m，4H)，3.43(br s，2H)，3.52(q，J＝6.8Hz，2H)，4.43(s，2H)，4.53(s，1H)，7.09(dt，J＝2.3，6.8Hz，1H)，7.24-7.30(m，1H)，7.30-7.41(m，6H)，7.52-7.60(m，4H).C29H35FN4O×2.8 TFA×0.4 H2O的理论值：C，51.88；H，4.86；N，6.99.实验值：C，51.89；H，4.89；N，6.97％.M.S.(理论值)：475.3(MH+)，M.S.(实验值)：475.2(MH+).HPLC：k’：2.35；纯度：＞99％(215nm)，＞99％(254nm)，＞99％(280nm).HPLC条件：Zorbax C-18，梯度10-95％B，流速：1mL/min，25℃，A：0.1％TFA的H2O溶液，B：0.1％TFA的MeCN溶液。旋转：[α]16 D＝-8.91(c＝1.179，MeOH)。
化合物4：4-[(R)-(3-氨基苯基)[4-[(3-氟苯基)甲基]-1-哌嗪基]甲基]-N，N-二乙基苯甲酰胺
Figure A20058002627400321
向中间体4b(281mg，0.709mmol)在1，2-二氯乙烷(8ml)中的溶液中加入3-氟苯甲醛(180mg，1.417mmol，2当量)以及三乙酰氧基硼氢化钠(300mg，1.417mmol，2当量)。反应物在室温下于氮气氛中搅动18小时，并浓缩。加入饱和的碳酸氢钠，水层用三份二氯甲烷萃取，合并的有机相用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩。将产品溶解于乙醇，四氢呋喃，水和饱和氯化铵(3ml；比例4∶2∶1∶1v/v)的混合物中。加入纳米铁颗粒(3刮刀末端量)，所得溶液在微波炉中150℃下加热10分钟。所得混合物冷却后，用硅藻土过滤并浓缩。将所得产品溶解于CH2Cl2并用水洗涤。分离有机层，水层用二氯甲烷萃取。合并的有机层经干燥(Na2SO4)，过滤并浓缩。产品经反相HPLC(5-50％CH3CN/H2O梯度溶液，包含0.1％TFA)纯化得到化合物4，为TFA盐(0.375g，65％产率)。该物质从CH3CN/H2O中冻干得到浅黄色固体。1H NMR(400MHz，CD3OD)1.08(t，J＝6.4Hz，3H)，1.21(t，J＝6.8Hz，3H)，2.38(br s，2H)，3.00(br s，2H)，3.16-3.28(m，4H)，3.40(br s，2H)，3.51(q，J＝6.8Hz，2H)，4.37(s，2H)，4.56(s，1H)，7.18(ddd，J＝1.2，2.3，7.8Hz，1H)，7.24(ddd，J＝1.0，2.7，8.8Hz，1H)，7.28-7.38(m，4H)，7.55(d，J＝8.2Hz，2H).C29H35FN4O×2.7TFA×1.1 H2O理论值：C，51.50；H，5.01；N，6.98.实验值：C，51.52；H，5.01；N，6.87％.M.S.(理论值)：475.3(MH+)，M.S.(实验值)：475.2(MH+).HPLC：k’：2.43；纯度：＞99％(215nm)，＞99％(254nm)，＞99％(280nm).HPLC条件：Zorbax C-18，梯度10-95％B，流速：1mL/min，25℃，A：0.1％TFA的H2O溶液，B：0.1％TFA的MeCN溶液.旋转：[α]16 D＝-8.94(c＝1.04，MeOH)。

Claims (4)

1.4-{(R)-(3-氨基苯基)[4-(4-氟苄基)哌嗪-1-基]甲基}-N，N-二乙基苯甲酰胺或其药学上可接受盐。
2.权利要求1所述的化合物在制备治疗疼痛，焦虑，抑郁或帕金森病的药物中的用途。
3.一种药物组合物，其包含权利要求1所述的化合物和药学上可接受载体。
4.一种化合物或其药学上可接受的盐，所述化合物选自：
对映异构体纯的4-{(R)-(3-氨基苯基)[4-(4-氟苄基)哌嗪-1-基]甲基}-N，N-二乙基苯甲酰胺。 
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