PT1773136E

PT1773136E - Antimicrobianos com fraco aroma derivados de aromas de fumo

Info

Publication number: PT1773136E
Application number: PT57055576T
Authority: PT
Inventors: Patrick W Moeller; Sreekumar Ramakrishnan
Original assignee: Mastertaste
Priority date: 2004-01-13
Filing date: 2005-01-12
Publication date: 2013-08-27
Also published as: AU2005206837B2; JP2015037420A; WO2005070181A2; JP2012065664A; CN104664552A; JP2016208982A; CA2553267A1; CN1929753B; US20150181922A1; ES2425815T3; BRPI0506847A; PL1773136T3; JP2007517526A; RU2006129170A; WO2005070181A3; AU2005206837A1; RU2390151C2; MXPA06008024A; EP1773136A2; KR101262895B1

Description

DESCRIÇÃO "ANTIMICROBIANOS COM FRACO AROMA DERIVADOS DE AROMAS DE FUMO"

PEDIDOS RELACIONADOS

Este pedido reivindica o beneficio do Pedido de Patente U.S. Provisório N° de Série 60/536160, apresentado em 13 de Janeiro de 2004, cuja divulgação é aqui incorporada por referência na sua totalidade.

CAMPO TÉCNICO A matéria presentemente divulgada refere-se a métodos e composições para tratamento antimicrobiano de produtos alimentares. Mais particularmente, a matéria presentemente divulgada refere-se a derivados de fumo liquido e métodos de tratamento de produtos alimentares com os derivados para inibir o crescimento de microrganismos sem transmitir aromas de fumo ao produto alimentar.

Tabela de Abreviaturas CFU - unidade formadora de colónia DLS - derivado de fumo liquido KSU - Universidade do Estado do Kansas LS - fumo liquido MEB _ Caldo de extracto de malte 1 (continuação) CFU — unidade formadora de colónia MIC - Concentração inibidora mínima MOX - Agar Oxford Modificado PDA - agar de dextrose de batata PW - Água de peptona RTE - Pronto a comer RTC - Pronto a cozinhar TSA - Agar de Soja Tríptica TSB - Caldo de Soja Tríptica

ANTECEDENTES A presença de microrganismos em produtos alimentares é uma considerável preocupação de saúde pública. Por exemplo, são frequentemente reportados suros de doenças alimentares e morte associada com várias estirpes de Escherichia coli. De facto, E. coli 0157:H7 é um reconhecido patogénico alimentar que se verificou ser contaminante de produtos de carne mal cozinhada, especialmente carne picada.

Outro destes patogénicos de origem alimentar é a Listeria monocytogenes que pode causar pneumonia, meningite e sépsia. A incidência de Listeria monocytogenes na indústria de processamento de carne provocou grande preocupação aos empacotadores e crê-se ser uma das principais e frequentes ameaças à saúde. A presença da bactéria Listeria monocytogenes em produtos de carne processada representa um perigo para o público na medida em que a bactéria pode crescer no alimento e aumentar até uma dose infecciosa sob condições refrigeradas. 2

Dada a importância de manter um fornecimento alimentar seguro, várias abordagens foram tomadas para tentar matar patogénicos que podem estar presentes no alimento. Uma abordagem tradicional é fumar o produto alimentar num fumeiro. Este é, no entanto, um processo que consome tempo necessitando de grandes quantidades de espaço e, deste modo, são desejáveis abordagens mais eficientes.

Actualmente, o tratamento de alimentos com fumo de lenha foi substancialmente substituído pela utilização de "fumo líquido" que é uma solução compreendendo condensados líquidos capazes de transmitir um tom fumado ou coloração e aroma a fumo a uma carne exposta a um líquido ou fase vapor da solução. Adicionalmente a estes atributos de fumo líquido, é também agora conhecido que preparações de fumo líquido que são aplicadas na preparação de produtos cárneos possuem actividade antimicrobiana contra bactérias, tal como Listeria monocytogenes.

Infelizmente, embora a aplicação de fumo líquido seja provavelmente bastante eficaz durante o processamento de carne para matar as bactérias Listeria monocytogenes, tornou-se recentemente óbvio que existe um perigo de que a re-inoculação ou recontaminação por bactérias Listeria monocytogenes possa ocorrer em algum instante entre a cozedura e o empacotamento final, durante a sequência de processamento de carne. Infelizmente, mesmo níveis muito baixos de contaminação bacteriana devido a re-inoculação pode resultar em níveis perigosamente elevados de bactérias na altura em que o produto cárneo está na prateleira da loja, durante um período de tempo.

Num esforço de responder a este problema, tem sido realizada pesquisa conduzida pela indústria de processamento de carne para 3 a utilização de uma aplicação de fumo liquido directamente no produto cárneo antes da embalagem de modo a evitar a re-inoculação e subsequente crescimento das bactérias Listeria monocytogenes no produto cárneo embalado. Ver Patente U.S. N° 5043174 de Lindner. Deste modo, as bactérias são inicialmente mortas ou minimizadas pelo fumo liquido e tratamento de calor que ocorre durante o ciclo de processamento de carne e antes da embalagem, outro tratamento de fumo liquido é aplicado directamente na superfície do produto alimentar processado para controlar a re-inoculação do produto cárneo com bactérias ou outros microrganismos.

Embora simples e eficiente, esta abordagem não é sempre aceitável, no entanto, uma vez que os produtos cárneos que possua uma aplicação de fumo líquido aplicado a estes subsequente ao processo convencional de embalagem de carne são adversamente afectadas no que respeita ao paladar. Os resultados adicionais de fumo líquido numa intensificação não desejável do aroma a fumo do produto cárneo e um produto geralmente não satisfatório comercialmente. De modo mais importante, o tratamento de um produto alimentar com fumo líquido é particularmente indesejável com alimentos de que não se pretende que tenham qualquer aroma a fumo. Deste modo, a pesquisa continuou para uma solução para o problema do crescimento de patogénicos perigosos em produtos alimentares que não tornam o produto cárneo substancialmente não comestível e consequentemente não comercializável. 0 documento WO 98/05216 AI divulga um método de processamento de carne para reduzir e inibir a infestação do organismo hospedeiro na carne e proporcionar a protecção da 4 carne contra a oxidação por aplicaçao de um fumo líquido derivado na carne. 0 documento WO 2004/077965 AI descreve uma preparação de produtos fumados, tais como peixe, carne, charcutaria e semelhantes, em que o método compreende, pelo menos, um passo aromatizante consistindo em proporcionar o produto alimentar com um aroma a fumo. O artigo de S. M. Vitt et al. : "Inhibition of Listeria innocua and L. monocytogenes in a laboratory médium e cold-smoked salmon containing liquid smoke", em Journal of Food Safety 21, 2001, páginas 111 -125 refere-se ao teste de cinco fumos líquidos comerciais no tratamento de amostras de salmão Keta para reduzir o crescimento de microrganismos.

Além disso, R. Estrada-Munoz et al. realizaram experiências para avaliar as propriedades antibacterianas do fumo líquido em sistemas de carne que são apresentados em "Liquid smoke effects on Escherichia coli 0157:H7, and its antioxidant properties in beef products", Journal of Food Science 63(1), 1998, páginas 150 -153. O documento US 4657765 A divulga um fumo líquido concentrado, empobrecido em alcatrão que tem capacidades superiores de aroma e coloração, teor fenólico baixo e um teor em ácido baixo.

Adicionalmente, o documento US 6214395 BI descreve uma solução de agente de escurecimento de fumo líquido possuindo uma boa tonalidade castanha mas com um aroma mínimo ou inexistente. 5 0 documento US 3806609 A refere-se a um método de produção de um fumo líquido compreendendo um passo de destilação de condensado de fumo aquoso pré-neutralizado com acidez total 4,0-4,5% como calculado para o ácido acético em duas fracções e um passo de tratamento da primeira fracção obtida para recuperação de componentes de cura adsorvidos e misturando-os com a sequnda fracção. H. Stankiewicz-Berqer e P. Kitzman investigaram a actividade bacteriostática do aroma a fumo em "Investigation of bacterial activity of rafined liquid smoke", Acta Alimentaria Polonica Vol. V N° 4, 1979, páginas 391 - 398. L. A. Brandt descreve em "Liquid smokes solve formulation problems", Prepared Foods 170 (2), 2001, página 59 que o fumo líquido transmite o aroma a fumo à carne, peixe e aves ou sempre que o toque do aroma a fumo é necessário e que os fumos líquidos funcionam como antimicrobianos, conferem cor, reduzem o sabor a requentado e adicionam textura. O documento US 4431032 A divulga que um fumo de lenha líquido aquoso contendo alcatrão é, pelo menos, parcialmente neutralizado sob temperatura controlada para formar uma fracção enriquecida em alcatrão e uma fracção de fumo líquido empobrecida em alcatrão e que o último é utilizado para tratamento de embalagem alimentar para facilitar coloração e aromatização de fumo de alimentos embalados durante o processamento.

De acordo com o documento WO 01/05255 Al, os produtos alimentares, tal como carnes pré-cozinhadas, carne crua e as 6 aves sao tratadas com uma solução descontaminante para remover a contaminação de microrganismos à superfície. 0 documento US 5637339 A divulga um fumo líquido empobrecido em alcatrão possuindo miscibilidade total em água. 0 documento WO 90/12514 AI descreve ainda composições de fumo líquido com elevado escurecimento, fenol reduzido e constituinte básico que são úteis para a coloração e aromatização de alimentos comestíveis. J. N. Sofos et al. pesquisaram a actividade microbiana de fumos líquidos de 20 diferentes madeiras, resultados que apresentaram em "Effect of ether extracts from condensed wood smokes on the growth of Aeromonas hydrophila e Staphylococcus aureus", Journal of Food Science 53 (6), 1988, páginas 1840 - 1843. O documento US 4112133 A descreve composições de fumo líquido melhoradas que não formam sólidos não desejáveis durante a utilização ou armazenamento.

Além disso, o documento US 6541053 B2 divulga um método de processamento de colagénio para espessamento ou endurecimento do colagénio suficientemente por aplicação de uma fracção de fumo líquido obtida a partir de um derivado de fumo líquido.

Finalmente, o documento US 5043174 refere-se a um produto derivado de fumo líquido contendo um mínimo de carbonilo e fenol e não possuindo índice de coloração e acidez elevada. 7 0 que é necessário, então, é um derivado de fumo liquido que retenha a actividade antimicrobiana mas não confira aromas de fumo ao produto alimentar. Para preencher esta necessidade, a matéria presentemente divulgada proporciona derivados de fumo liquido e métodos de tratamento de produtos alimentares com derivados de fumo liquido para inibir o crescimento de microrganismos sem alterar o aroma do produto alimentar.

SUMÁRIO A matéria presentemente divulgada proporciona métodos para inibir o crescimento de um microrganismo num produto alimentar. Em algumas formas de realização, o método compreende o tratamento do produto alimentar com um derivado de fumo líquido que não confere aroma a fumo ao produto alimentar de acordo com a reivindicação 1, enquanto o crescimento de um microrganismo é inibido. Em algumas formas de realização, o microrganismo é seleccionado do grupo consistindo numa bactéria, uma levedura e um fungo. Em algumas formas de realização, a bactéria é seleccionada do grupo consistindo numa estirpe de Streptococcus, Shigella, Hafnia, Enterobacter, Serratia, Staphylococcus, Pseudomonas, Citrobacter, Klebsiella, Escherichia coli, Listeria e Salmonella. Em algumas formas de realização, a levedura é uma estirpe de Saccharomyces. Em algumas formas de realização, o fungo é uma estirpe de Aspergillus.

Em algumas formas de realização da matéria presentemente divulgada, o produto alimentar é um produto pronto a comer (RTE) alimentar. Em algumas formas de realização, o produto alimentar pronto a comer compreende aves, porco ou vaca. Em algumas formas de realização, os alimentos RTE incluem carnes (e. g. peru, carne de vaca assada, fiambre, galinha, salames, bolonhesa, etc.) e cachorros.

Em algumas formas de realização da matéria presentemente divulgada, o produto alimentar é um produto alimentar pronto a cozinhar (RTC). Em algumas formas de realização, o produto alimentar pronto a cozinhar compreende aves, porco, vaca ou um produto de massa pré-cozido. Em algumas formas de realização, o produto alimentar pronto a cozinhar compreende carne picada ou produtos de massa pré-cozida, tais como pão e pãezinhos. 0 derivado de fumo liquido compreende: (a) acidez titulável numa concentração de 0 a cerca de 6% em peso por unidade de volume (p/v); (b), pelo menos, 10% em peso por unidade de volume (p/v) de carbonilo; (c) fenólicos numa concentração de inferior a cerca de 0,5% em peso por unidade de volume (p/v); (d) água numa concentração inferior a cerca 97% em peso por unidade de volume (p/v); e possui (e) um pH de, pelo menos, 3,0. Em algumas formas de realização, o derivado de fumo líquido compreende carbonilo numa concentração de cerca de 12,0% em peso por unidade de volume (p/v) e um pH de cerca de 5,0 a cerca de 6,0. Também é descrito que o derivado de fumo liquido compreende carbonilo numa concentração de cerca 3,0 a cerca de 8,0% em peso por unidade de volume (p/v), fenol numa concentração de cerca 0,01 a 0,5% em peso por unidade de volume (p/v) e um pH de cerca de 5,0 a cerca de 6,0. 0 derivado de fumo liquido possui um pH de, pelo menos, cerca de 3,0. Em algumas formas de realização, o pH está entre cerca de 4,5 e 6,5. O derivado de fumo líquido compreende carbonilo em, pelo menos, 10% em peso por unidade de volume (p/v). 9

Em algumas formas de realização, um derivado de fumo líquido é produzido processando fumo líquido através de um evaporador para separar e condensar os seus elementos de baixa ebulição para produzir o derivado de fumo líquido. Em algumas formas de realização, a serradura é deslinhifiçada antes da pirólise para produzir produtos de baixo paladar. Vários destes produtos e derivados podem ser misturados em conjunto para produzir um gama nos níveis de carbonilo. Estes podem ser tratados com carbono para reduzir substancialmente os fenóis. Estes podem também ser tratados com agentes neutralizantes para ajustar pH/acidez. Em algumas formas de realização, o derivado de fumo líquido é aspergido no produto alimentar. Em algumas formas de realização, 0 produto alimentar é mergulhado num banho do derivado de fumo líquido. Em algumas formas de realização, o derivado de fumo líquido compreende um agente de humedecimento adicional. Em algumas formas de realização, o agente de humedecimento adicional compreende polissorbato.

Em algumas formas de realização, a matéria presentemente divulgada compreende ainda o aquecimento do produto alimentar a, pelo menos, 73,9 °C (165 °F) durante, pelo menos, cerca de 1 minuto. Em algumas formas de realização, o passo de aquecimento é realizado após o passo de tratamento.

A matéria presentemente divulgada também proporciona derivados de fumo líquido antimicrobiano. 0 derivado de fumo líquido: (i) compreende (a) acidez titulável numa concentração de 0 a 6% em peso por unidade de volume (p/v); (b) carbonilo de, pelo menos, 10% em peso por unidade de volume (p/v); (c) fenólicos numa concentração de inferior a 0,5 % em peso por unidade de volume (p/v); (d) água numa concentração de inferior a 97% em peso por unidade de volume (p/v) ; e possui (e) um pH 10 de, pelo menos, 3,0; (ii) não confere aroma de fumo líquido a um produto alimentar quando o produto alimentar é tratado com o derivado de fumo líquido; e (iii) inibe o crescimento num produto alimentar de um microrganismo seleccionado do grupo consistindo em Streptococcus, Shigella, Hafnia, Enterobacter, Serratia, Staphylococcus, Pseudomonas, Citrobacter, Klebsiella, Escherichia coli, Listeria, Salmonella, Saccharomyces e

Aspergillus quando o produto alimentar é tratado com o derivado de fumo líquido. O derivado de fumo líquido possui um pH de cerca de 3,0 ou mais. Em algumas formas de realização, o pH está entre cerca de 4,5 e 6,5. O derivado de fumo liquido compreende carbonilo em, pelo menos, 10% em peso por unidade de volume (p/v).

Em algumas formas de realização, o derivado de fumo liquido compreende: (a) acidez titulável numa concentração de 0 a cerca de 6% em peso por unidade de volume (p/v); (b) , pelo menos, cerca 10% em peso de carbonilo por unidade de volume (p/v) ; (c) fenol numa concentração inferior a cerca de 0,5% em peso por unidade de volume (p/v); e (d) água numa concentração inferior a cerca de 97% em peso por unidade de volume (p/v) . Em algumas formas de realização, o derivado de fumo líquido compreende carbonilo numa concentração a cerca de 12,0% em peso por unidade de volume (p/v) e um pH de cerca de 5,0 a cerca de 6,0. Também é descrito um derivado de fumo líquido compreendendo carbonilo numa concentração de cerca 5,0 a cerca de 8,0% em peso por unidade de volume (p/v), fenólicos numa concentração de cerca de 0,01 a 0,5% em peso por unidade de volume (p/v) e um pH de cerca de 5,0 a cerca de 6,0. 11

Em algumas formas de realização da matéria presentemente divulgada, o produto alimentar é um produto alimentar pronto a comer.

Em algumas formas de realização, o produto alimentar pronto a comer compreende aves, porco, vaca ou um produto de massa cozida. Em algumas formas de realização, os alimentos RTE incluem carnes cozinhadas (e. g. peru, carne de vaca assada, fiambre, galinha, salame, bolonhesa, etc.) ou cachorros.

Em algumas formas de realização, o produto alimentar é um produto alimentar pronto a cozinhar. Em algumas formas de realização, o produto alimentar pronto a cozinhar compreende aves, porco ou vaca. Em algumas formas de realização, o produto alimentar pronto a cozinhar compreende carne picada. Em algumas formas de realização, o alimento RTC compreende produtos de massas pré-cozidas, tais como pães e pãezinhos.

Em algumas formas de realização, o derivado de fumo liquido compreende um agente de humedecimento adicional. Em algumas formas de realização, o agente de humedecimento adicional compreende polissorbato.

Tendo um objectivo da matéria presentemente divulgada sido apresentado acima, outros objectos e vantagens da matéria presentemente divulgada serão óbvios para o especialista com conhecimentos na técnica após um estudo da descrição e Exemplos não limitantes que se seguem. 12

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura 1 apresenta as curvas de crescimento de Escherichia coli 8677 em caldo Triptico de Soja (TSB) suplementado com diluições de Fumos 1 (0,75%), 2 (1,00%), 3 (1,00%) ou 8 (2,00%). As diluições foram seleccionadas para ficarem abaixo das Concentrações Inibitórias Minimas (MIC) para cada derivado de fumo liquido individual (DLS). A Figura 2 apresenta curvas de crescimento de Escherichia coli 8677 em caldo Triptico de Soja (TSB) suplementado com concentrações de Fumo 1 entre 0,00% e 0,75%. A Figura 3 apresenta curvas de crescimento de Salmonella seftenberg em caldo Triptico de Soja (TSB) suplementado com diluições dos Fumos 1 (0,50%), 2 (1,00%), 3 (1,00%) e 8 (2,00%) . A Figura 4 apresenta as curvas de crescimento de Salmonella seftenberg em caldo Triptico de Soja (TSB) suplementado com concentrações de Fumo 1 entre 0,00% e 0,50%. A Figura 5 apresenta as curvas de crescimento de histeria innocua Ml em caldo Triptico de Soja (TSB) suplementado com diluições de Fumos 1 (0,50%), 2 (0,40%), 3 (0,50%) e 8 (2,00%). A Figura 6 apresenta as curvas de crescimento de histeria innocua Ml em caldo Triptico de Soja (TSB) suplementado com concentrações de Fumo 1 entre 0,00% e 0,75%. 13 A Figura 7 apresenta as curvas de crescimento de Saccharomyces cerevisiae em caldo de extracto de malte (MEB) suplementado com 0,50% de diluições dos Fumos 1, 2, 3 e 8. A Figura 8 apresenta as curvas de crescimento de Saccharomyces cerevisiae em caldo de extracto de malte (MEB) suplementado com concentrações de Fumo 1 entre 0,00% e 0,75%. A Figura 9 apresenta a circunferência média de esporos de Aspergillus niger cultivados em agar de dextrose de batata (PDA) na presença de diluições dos Fumos 1 (0,75%), 2 (1,25%), 3 (1,25%) e 8 (5,00%) nos dias 1, 3, 4 e 7. A Figura 10 apresenta os efeitos do tratamento combinado da superfície de peito de peru reestruturado, com derivados de fumo líquido (Fumo 2 ou Fumo 3) e pasteurização à superfície à base de vapor saturado (0, 1, 2 e 3 minutos) no crescimento de Listeria monocytogenes enumeradas em agar Tríptico de Soja. Os números de colónias são apresentados como logio CFU/cm2. A Figura 11 apresenta os efeitos do tratamento combinado da superfície de peito de peru reestruturado com derivados de fumo líquido (Fumo 2 ou Fumo 3) e pasteurização à superfície à base de vapor saturado (0, 1, 2 e 3 minutos) no crescimento de Listeria monocytogenes enumerada em Agar de Oxford Modificado (MOX). Os números de colónias são apresentados como logio CFU/cm2. A Figura 12 apresenta as reduções nos números de colónias (apresentadas como logio CFU/cm2) resultante do tratamento 14 combinado à superfície de peito de peru reestruturado com derivados de fumo líquido (Fumo 2 ou Fumo 3) e pasteurização à superfície à base de vapor saturado (0, 1, 2 e 3 minutos) no crescimento de Listeria monocytogenes enumerada em agar Tríptico de Soja. A Figura 13 apresenta as reduções nos números de colónias (apresentadas como logio CFU/cm2) resultantes do tratamento combinado da superfície de peito de peru reestruturado com derivados de fumo líquido (Fumo 2 ou Fumo 3) e pasteurização à superfície à base de vapor saturado (0, 1, 2 e 3 minutos) no crescimento de Listeria monocytogenes enumerada em Agar de Oxford Modificado (MOX).

As Figuras 14A-14E apresentam os resultados de tratamento de pãezinhos pré-cozinhados com Fumo 1. Os pãezinhos pré-cozinhados foram adquiridos 2 dias antes da data de validade na embalagem. No dia antes da validade, estes foram aspergidos suavemente com uma solução de DLS a 30%, embalada e mantida à temperatura ambiente. O nível de recolha foi de 1,5 a 2,0% para assegurar cobertura. As fotos foram tiradas no começo das 24 horas após da data limite de validade. A Figura 14A apresenta fotografias dos pãezinhos pré-cozinhados 1 dia após tratamento com um DLS (dois painéis superiores). O painel inferior apresenta um controlo negativo não tratado. A Figura 14B apresenta fotografias dos pãezinhos pré-cozinhados 2 dias após tratamento com uma DLS (dois painéis superiores). O painel inferior apresenta um controlo negativo não tratado. A Figura 14C apresenta fotografias dos pãezinhos pré-cozinhados 3 dias após tratamento com uma DLS (dois painéis superiores). O painel 15 inferior apresenta um controlo negativo não tratado. A Figura 14D apresenta fotografias dos pãezinhos pré-cozinhados 4 dias após tratamento com uma DLS (dois painéis superiores). 0 painel inferior apresenta um controlo negativo não tratado. A Figura 14E apresenta fotografias dos pãezinhos pré-cozinhados 1 semana após tratamento com uma DLS. Todos os 12 pãezinhos foram da mesma embalagem como adquiridos. Os 8 pãezinhos tratados (dois painéis superiores em cada Figura) foram todas tratadas igualmente com a mesma DLS e embalados separadamente. Os 4 pãezinhos de controlo (painel inferior nas Figuras 14A-14D) foram deixados sem tratamento e colocados num saco de plástico fechado. As Figuras 15-18 apresentam os resultados de baixo nivel de inoculação (ΙΟ3 —104 CFU) com Listeria monocytogenes. A Figura 15 apresenta os resultados do tratamento de cachorros que foram inoculados com cerca 3500 CFU de Listeria monocytogenes com Fumo 8 e Fumo 3. A Figura 16 apresenta os resultados do tratamento de carne de vaca assada que foi inoculada com cerca 1700 CFU de Listeria monocytogenes com Fumo 8 e Fumo 3. A Figura 17 apresenta os resultados do tratamento de fiambre que foi inoculado com cerca 1700 CFU de Listeria monocytogenes com Fumo 8 e Fumo 3. A Figura 18 apresenta os resultados de tratamento de peru que foi inoculado com cerca 7500 CFU de Listeria monocytogenes com Fumo 8 e Fumo 3.

As Figuras 19-23 apresentam os resultados de nivel elevado de inoculação (105-107 CFU) com Listeria monocytogenes. A Figura 19 apresenta os resultados de tratamento de cachorros que foram inoculados com cerca 1,6 x 105 CFU de Listeria monocytogenes com Fumo 8 e Fumo 3. A Figura 20 apresenta os resultados do tratamento de carne de vaca assada que foi 16 inoculada com cerca 2,4 x 101 2 3 4 5 6 CFU de Listeria monocytogenes com Fumo 8 e Fumo 3. A Figura 21 apresenta os resultados de tratamento de fiambre que foi inoculado com cerca 3,8 x 106 CFU de Listeria monocytogenes com Fumo 8 e Fumo 3. A Figura 22 apresenta os resultados do tratamento de peru que foi inoculado com cerca 1,2 x 106 CFU de Listeria monocytogenes com Fumo 8 e Fumo 3. A Figura 23 apresenta o efeito do Fumo 2 e/ou tratamento por calor (1 minuto a 165 °F) no crescimento de Listeria monocytogenes durante o tempo de armazenamento dos cachorros inoculados.

DESCRIÇÃO DETALHADA

Todas as referências citadas na descrição, incluindo patentes, publicações de pedidos de patentes e literatura de não patente, são aqui incorporados por referência na medida em que estes suplementam, explicam, proporcionam uma base para, ou ensinam metodologia, técnicas e/ou composições aqui empregues. Estão também incluídas por referência as Patentes U.S. de Moeller e/ou Moeller et al.: 5637339; 6214395; 6261623; 6541053. 17 1

Definições 2

Todos os termos científicos e técnicos aqui utilizados, a menos que definidos de outro modo a seguir, pretendem ter o mesmo significado do normalmente entendido por um especialista 3 com conhecimento geral na técnica. As referências a técnicas 4 aqui empregues pretendem referir-se às técnicas conforme 5 normalmente entendido na técnica, incluindo variações nestas 6 técnicas ou substituições de técnicas equivalentes que podem ser óbvias para um especialista na técnica. Embora se creia que os termos que se seguem são bem entendidos por um especialista na técnica, as definições que se seguem são apresentadas para facilitar a explicação da matéria presentemente divulgada.

Seguindo a antiga convenção de leis de patentes, os termos "um", "uma" e "o" significam "um ou mais" quando utilizados neste pedido, incluindo as reivindicações.

Como aqui utilizado, a menos que especificamente indicado de outro modo, a palavra "ou" é utilizada no sentido "inclusivo" de "e/ou" e não no sentido "exclusivo" de "se/ou".

Como aqui utilizado, a frase "fumo líquido (LS)" refere-se a uma solução compreendendo reagentes líquidos capaz de transmitir um matiz ou coloração de fumo e aroma a fumo a um produto alimentar exposto a um líquido ou fase de vapor da solução. A utilização de fumo líquido proporciona muitas vantagens no processamento de carne incluindo a capacidade para utilizar processamento contínuo enquanto a carne é fumada assim como um paladar a fumo mais uniforme e coloração de fumo aos produtos cárneos tratadas com este. A utilização de fumo liquido em vez de fumo de lenha é agora convencional no processamento de carne e pode ser mais valorizado com referência às Patentes U.S. N° 3873741; 4250199; 4298435; e 5043174 representativas.

Também se verificou que o LS possui atividade antimicrobiana. Por exemplo, a Patente U.S. N° 5043174 divulga que o tratamento de cachorros com LS (ZESTI-SMOKE (Código 10), disponível em Mastertaste of Crossville, Tennessee, Estados Unidos da América) pode evitar a re-inoculação pós-processamento com Listeria monocytogenes. No entanto, o LS utilizado confere 18 um significativo aroma a fumo no alimento tratado que pode não ser desejável sob certas circunstâncias. Deste modo, deve ser vantajoso para produzir derivados de fumo liquido que retenham actividade antimicrobiana embora não conferindo aroma a fumo aos produtos alimentares durante a fase de tratamento. Esse é o inesperado e surpreendente resultado dos métodos e composições descobertos e aqui descritos e reivindicados.

Como aqui utilizado, a frase "actividade antimicrobiana" refere-se geralmente a uma actividade de um fumo liquido ou derivado de fumo liquido que resulta na morte de um microrganismo (incluindo, mas não se limitando a actividades microbicidas e microbióticas) ou a inibição do crescimento de um microrganismo (incluindo, mas não se limitando a uma actividade microbiostática). No que respeita a uma inibição do crescimento microbiano, o termo "actividade antimicrobiana" pretende incluir a inibição total (i. e. o microrganismo não cresce de todo ou a uma taxa não detectável na presença do DLS) e parcial inibição, sendo o último caracterizado pro um atraso na iniciação do crescimento do microrganismo ou uma redução na taxa a que o microrganismo cresce, ou ambos.

Como aqui utilizada, a frase "derivado de fumo liquido (DLS)" refere-se a um derivado de fumo liquido que possui caracteristicas que são apropriadas para uma determinada utilização. Os DLS são tipicamente fracções de um fumo liquido que são preparadas, por exemplo, processando um fumo liquido convencional através de um evaporador que separa e condensa os elementos de baixa ebulição do fumo liquido para produzir a solução de derivado de fumo liquido. De acordo com o exposto, as frases "derivado de fumo liquido", "derivado", "fracção de fumo liquido" e "fracção" são aqui utilizadas indiscriminadamente e 19 referem-se a um componente de um fumo líquido que foi isolado do próprio fumo líquido, com ou sem subsequente preparação adicional e/ou passos de modificação. Em algumas formas de realização, o DLS é caracterizado pela actividade antimicrobiana e não confere aromas de fumo a um produto alimentar quando o produto alimentar é tratado com o DLS.

Como aqui utilizada, a frase "pronto a comer (RTE)" refere-se a produtos alimentares que são preparados de modo a que estes possam ser consumidos imediatamente ou após reaquecimento. Os alimentos RTE exemplificativos incluem carnes cozinhadas (e. g. peru, carne de vaca assada, fiambre, galinha, salame, bolonhesa, etc.) e cachorros.

Os produtos alimentares RTE podem ser contrastados com produtos alimentares prontos a cozinhar. Os produtos alimentares prontos a cozinhar incluem tipicamente alimentos crus, não cozinhados, tais como aves, porco e vaca e alimentos parcialmente cozinhados/cozidos, tais como produtos de massas pré-cozidas. Produtos alimentares prontos a cozinhar exemplificativos são aves, porco e vaca (e. g. carne picada) e produtos de massas pré-cozidas, tais como pães e pãezinhos. Os produtos alimentares RTC podem também incluir marisco, vegetais e outros alimentos minimamente processados. II. Preparação de Fumo Líquido Derivado a partir de Fumo Líquido

Como é bem conhecido dos especialistas na técnica, as composições de fumo líquido obtidas a partir da pirólise de serragem de madeira contêm constituintes primariamente a partir 20 da degradação térmica da celulose, hemicelulose e lenhina. Mais particularmente, as composições de fumo liquido contêm um vasto conjunto de mais de 400 compostos químicos e, deste modo, as composições de fumo líquido são caracterizadas pelo seu teor em certas classes de compostos, nomeadamente, ácidos (% de acidez titulável, determinada utilizando o método revelada na Patente U.S. N° 6214395), fenólicos e carbonilos.

Os ácidos são conservantes e agentes de controlo de pH. As composições comerciais de fumo líquido possuem tipicamente um pH abaixo de cerca de 2,5 e, mais tipicamente, abaixo de cerca de 2,3 e uma % de acidez titulável por volume desde cerca de 3% a cerca de 18%. Os fenólicos dão um sabor a fumo e, também, aroma, a composições de fumo líquido que tipicamente possuem um teor de fenólicos desde cerca de 10 a cerca de 45 e mais tipicamente, desde cerca de 14 a cerca de 30 mg/mL. Os carbonilos conferem a capacidade de formação de cor castanha a composições de fumo líquido. Os fenólicos e os carbonilos podem ser medidos como descrito na Patente U.S. N° 4431032 que descreve técnicas para a remoção de um componente de alcatrão não desejável das composições de fumo líquido. É de referir que os ácidos e carbonilos são secundários na contribuição para o aroma a fumo das composições de fumo líquido.

Mastertaste of Crossville, Tennessee é um fabricante de vários fumos líquidos. Fumos líquidos exemplificativos incluem ZESTI-SMOKE Código 10 e ZESTI-SMOKE Código V. As especificações destes fumos líquidos são como se segue: 21

Acidez (% p/v) índice de Coloração Nível de carbonilo (g/100 mL) Nível fenólico (mg/mL) Gravidade específica (25 °C) Densidade (lbs/gal) pH Cor Código 10 10,5-11,0 69-80

Código V 6,8-7,8

None 15-25 12-22 1,068-1,079 8,90-8,99 2-3 Âmbar 2.0- 7,0 1.0- 4,0 1,005-1,015 8,37-8,46 2,0-2,4 Âmbar A fracção de ZESTI-SMOKE Código V utilizada como um material de partida pelo assunto presentemente revelado pode ser produzida como um derivado ou produto secundário de ZESTI-SMOKE Código 10. 0 Código 10 pode ser processado através de um separador (por exemplo, um evaporador AVP) alimentando o Código 10 como um armazenador de alimento que é primeiro aquecido para remover ácidos de baixa ebulição a partir do topo do evaporador e depois é condensado no Código V como um produto secundário. Este processo também produz um fumo líquido concentrado que possui uma percentagem de ácido, índice de coloração, níveis de carbonilo e fenólico, gravidade específica, densidade mais elevados e cor mais escura do que o fumo líquido convencional e que é vendido com o nome comercial de SUPERSMOKE™ por Mastertaste of Crossville, Tennessee para uma variedade de utilizações finais. O derivado Código V é um produto de pH baixo, baixo sabor, baixa ou nenhuma coloração. Em algumas formas de realização, o Código V é depois tratado com um agente de ajuste de pH adequado, tais como bicarbonato de sódio, carbonato de sódio, hidróxido de sódio ou hidróxido de potássio, de modo a trazer o 22 pH até, pelo menos, cerca de 5,0. O pH pode ser trazido para um valor tão elevado como cerca de 7,0. Em algumas formas de realização, o pH varia desde cerca de 5,0 até cerca de 6,0. Este material com pH-ajustado pode ser ainda modificado para produzir um derivado de fumo liquido como aqui divulgado.

Em algumas formas de realização, o derivado de Código V é primeiro tratado com carbono de acordo com o método divulgados na Patente U.S. N° 5637339 atribuída a Moeller. Isto remove fenólicos. O resultante é então tratado com o agente de ajuste de pH adequado. Opcionalmente, o ajuste de pH pode ser realizado antes do tratamento com carbono. Este material tratado com carbono, ajustado para pH pode também ser utilizado como um material de partida para produzir um derivado de fumo líquido como aqui utilizado.

Em algumas formas de realização, a serradura é deslinhifiçada antes da pirólise para produzir produtos de baixo sabor. Vários destes produtos e derivados podem ser misturados conjuntamente para produzir uma variedade de níveis de carbonilo. Eles podem ser tratados com carbono para reduzir substancialmente os fenólicos. Eles também podem ser tratados com agentes neutralizantes para ajustar o pH/acidez.

Nos Exemplos apresentadas abaixo, foram utilizados vários derivados de fumo líquido para testar a actividade antimicrobiana de DLS versus bactérias, levedura e bolor. 23

EXEMPLOS

Os Exemplos seguintes foram incluídos para ilustrar os modos da matéria presentemente divulgada. Certos aspectos dos Exemplos seguintes são descritos em termos de técnicas e processos encontrados ou contemplados pela presente requerente para trabalhar bem na prática da matéria presentemente divulgada. Estes Exemplos ilustram práticas convencionais da requerente. À luz da presente divulgação e o nível geral dos especialistas na técnica, os especialistas entenderão que os Exemplos seguintes pretendem ser apenas exemplificativos e que podem ser empregues numerosas mudanças, modificações e alterações sem nos afastarmos do âmbito da matéria presentemente divulgada.

Exemplo 1

Preparação de Derivados de Fumo líquido

Os Fumos 1, 2 e 5 foram derivados de condensados primários de fumos que foram substancialmente destituídos do seu teor fenólico através de várias combinações de deslinhificação e desf enolização como aqui descrito. 0 Fumo 3 era uma versão convencional de um condensado de fumo primário possuindo o complemento total de ácidos, carbonilos e fenólicos. A sua força foi ajustada por diluição para possuir uma acidez titulável semelhante a algumas das outras fracções de LS/DLS para uma comparação mais fácil. 0 Fumo 4 (comparativo) foi um extracto da fracção de alcatrão insolúvel que assentou de um condensado de fumo primário típico. Foi predominantemente uma fracção fenólica elevada com quantidades menores de acidez titulável e compostos carbonilo. Foi tornado solúvel em água através da adição de 24

Polissorbato 80. A preparação dos Fumos 6, 7, 8 e 9 envolveu várias manipulações do condensado a partir da evaporação de uma LS primária. Estas manipulações ajustaram os produtos para possuírem níveis variáveis de acidez titulável, pH e fenólicos com pouco ou nenhum impacto nas composições de carbonilo.

Foram criados nove derivados, no total, de fumo líquido com as características sumarizadas na Tabela 1:

Tabela 1

Fumo Acidez* PH Teor Fenólico Teor de Carbonilo N° (mg/mL)** (mg/mL)*** 1 4,5-5,9 2-3, 0 0-5 151-200,9 2 0-1,4 6,1-7,0 0-5 101-150,9 3 6,0-7, 4 2-3,0 0-5 101-150,9 4 3,0-4,4 4,1-5,0 20,1-25,0 0-50,9 5 6,0-7, 4 2-3,0 0-5 101-150,9 6 6,0-7, 4 2-3,0 0-5 51-100,9 7 1,5-2,9 5,1-6,0 0-5 51-100,9 8 0-1,4 6,1-7,0 0-5 101-150,9 9 0-1,4 6,1-7,0 0-5 51-100,9 * Quantificado como ácido acético ** Quantificado como 2,6-dimetoxi fenol *** Quantificado como 2-butanona 25

Exemplo 2

Valores de MIC Contra Bactérias Gram-Negativas

Derivados de fumo líquido 1-9 do Exemplo 1 foram utilizados em métodos de diluição em caldo ou agar contra um cocktail de bactérias Gram-negativas. 0 cocktail incluiu Salmonella muenster, Salmonella seftenberg, Salmonella typhimurium e E. coli 8677. Foram utilizadas 1000 células de cada espécie bacteriana para inocular várias diluições (as diluições são apresentadas como v/v%) das fracções de fumo.

De modo a determinar as concentrações mínimas com efeito inibidor para cada uma das fracções, foram então realizadas inoculações apropriadas para TSB contendo diferentes percentagens de derivados de fumo líquido num tubo de ensaio. Os tubos de ensaio foram incubados a 37 °C durante 24 e 48 horas e classificados para crescimento/sem crescimento. Os valores de MIC foram realizados em triplicado e repetidos três vezes para cada um. Os valores de MIC são apresentados na Tabela 2.

Tabela 2

Valores de MIC Contra Cocktail Gram-Negativo Número de Fumo Valor de MIC 1 1,5% 2 >2,00% 3 2,00% 4 3,00% 5 2,00% 6 2,00% 7 5, 00% 8 >2,00% 9 9, 00% 26

As curvas de crescimento foram construídos abaixo dos níveis predeterminados de MIC para derivados seleccionados de fumo líquido (DLS) para várias estirpes bacterianas individualmente. As curvas de crescimento apresentadas nas Figuras 1-4 representam a média de três réplicas.

Exemplo 3

Valores de MIC contra Bactérias Gram-Positivas

Os derivados de fumo líquido 1-9 foram também testados contra uma bactéria Gram-positiva (Listeria innocua Ml) utilizando as técnicas descritas no Exemplo 2. Os valores de MIC são apresentadas na Tabela 3.

Tabela 3

Valores de MIC Contra Listeria innocua Ml Número de Fumo Valor de MIC 1 1,5% 2 2, 00% 3 >2,00% 4 2, 00% 5 2,00% 6 2, 00% 7 4, 00% 8 2, 00% 9 6,00% 27

As curvas de crescimento foram construídas abaixo dos níveis predeterminados de MIC para derivados seleccionados de fumo líquido (DLS) para Listeria innocua Ml. As curvas de crescimento apresentadas nas Figuras 5-6 representam cada uma a média de três réplicas.

Exemplo 4

Valores de MIC Contra Leveduras

Os derivados de fumo líquido (DLS) 1, 2, 3 e 8 foram também testados contra Saccharomyces cerevisiae utilizando as técnicas descritas no Exemplo 2, excepto que foi utilizado caldo de extracto de malte (MEB) em vez de TSB. Os valores de MIC foram 1,5% para cada DLS.

As curvas de crescimento foram construídas para DLS 1, 2, 3 e 8 a 0,50% e para DLS 1 a 0,25%, 0,5% e 0,75% para Saccharomyces cerevisiae. As curvas de crescimento apresentadas nas Figuras 7-8 representam cada uma a média de três réplicas.

Exemplo 5

Valores de MIC contra um Fungo Representativo

Também foram testados derivados de fumo líquido 1, 2, 3 e 8 contra Aspergíllus niger utilizando as técnicas descritas no Exemplo 2, excepto que em vez de inocular 1000 células para cada diluição de DLS, foi adicionado um volume igual de esporos de 28 A. niger ao agar de dextrose de batata (PDA) . Os valores de MIC são apresentados na Tabela 4.

Tabela 4

Valores de MIC de Fumos líquidos Contra A. niger 1 1,50% 2 2,50% 3 2,50% 8 >5,00%

Como uma medida para as curvas de crescimento, a circunferência dos esporos de A. niger foi medida a 37 °C para DLS 1 a 0,75%, DLS 2 a 1,25%, DLS 3 a 1,25% e DLS 8 a 5,0%, aos dias 1, 3, 4 e 7 de tratamento. Os dados são apresentados na Figura 9.

Discussão dos Exemplos 1-5

Como é aqui divulgado acima e nas Figuras, os componentes de fumo possuem propriedades antimicrobianas. Embora os condensados de fumo diferentes se comportem algo diferentemente contra diferentes microrganismos, com algumas excepções, os dados apresentados sugerem uma correlação geral entre acidez e pH nos valores de MIC. Curiosamente, Estes dados também sugerem que os carbonilos contribuem para a eficácia antimicrobiana contra bactérias Gram-negativas, bactérias Gram-positivas, leveduras e fungos. Os valores de MIC também podem ser influenciados pela compensação de uma variável sobre a outra (e.g. carbonilos vs. fenólicos e vice-versa). 29

Exemplo 6

Inibição de Bolores em Produtos de Massa Cozida

Os pãezinhos pré-cozidos foram adquiridos dois dias antes da data de limite de validade na embalagem. No dia antes de expirar, estes foram aspergidos suavemente com uma solução a 30% de Fumo 1, embalados e mantidos à temperatura ambiente. O nível de amostragem foi de 1,5% a 2% para assegurar a cobertura. Os pãezinhos começaram a ser observados 24 horas após tratamento (i. e., na data limite de validade).

Os resultados são apresentados nas Figuras 14A-14E. os pontos a negro mostram o crescimento de colónias de fungos. O tratamento resultou num aumento de uma semana de tempo de vida.

Exemplo 7

Validação de Produtos Cárneos Prontos a Comer (RTE) Tratados com Fumo Líquido para Controlo de Listeria innocua Ml A extremidade superior de RTE (em que partes do peito foram preparados para ter não mais do que 40% de ligantes e caldo adicionado) e a extremidade inferior de rolos de peru (partes de peito de peru picadas que podem ter até 60% de ligantes e caldo adicionado antes da formação e cozedura) e cortes de carne de vaca assada de um fabricante comercial foram utilizados para testar a capacidade de fracções de fumo controlarem a infecção de L. innocua Ml ao longo de 4 semanas. Os produtos de peru variaram de 3,5 a 4,5 kg e foram cozinhados em água quente em sacos de cozedura que encolhem a uma temperatura interna de 30 71 °C seguidos de arrefecimento em água a uma temperatura interna de 7 °C. Cada pedaço da carne de vaca assada tinha cerca de 1 kg e estava em embalagens de película que encolhe e foi utilizado como uma unidade. Os rolos de peru foram cada um cortados em 4 secções, com cada secção considerada uma unidade.

Quatro diferentes derivados de fumo líquido (DLS) foram obtidos de Mastertaste of Crossville, Tennessee, Estados Unidos da América. Cada carne foi mergulhada em DLS a 100% e permaneceu submergida durante, pelo menos, 60 segundos. Após remoção, as carnes foram deixadas secar ao ar sobre uma tela à temperatura ambiente por não menos do que 5 minutos antes de serem inoculados com L. innocua Ml (obtida de Dr. P. M. Foegeding,

North Carolina State University, Raleigh, Carolina do Norte, Estados Unidos da América).

Para cada pedaço de carne, duas áreas de 25 cm2 na superfície (marcada com tinta de grau alimentar utilizando um molde estéril) foram inoculadas com 100 CFU de L. innocua Ml em 50 pL de uma cultura em crescimento activo (18 horas) para obter um inoculo total de 100 CFU/2 5 cm2. Cada pedaço foi então colocado num saco de barreira CRYOVAC® (disponível de CRYOVAC® Food Packaging de Duncan, Carolina do Sul, Estados Unidos da América), selado a vácuo e colocado a 4 °C. 31 L. innocua Ml viáveis foram avaliadas a 0, 2 e 4 semanas a 4 °C. A área marcada foi assepticamente excisada e transferidas para um saco digestor. Foram adicionados 100 mL de 0,1% de água peptonada estéril (PW) e a mistura foi digerida durante 2 minutos. Foram removidas fracções e directamente plaqueadas ou prepararam-se diluições e foram contadas. A contagem de células de L. innocua Ml foi efectuada através de métodos de plaqueamento em espiral directos num AUTOPLATE® 4000 (disponível de Spiral Biotech, Inc. de Norwood, Massachusetts, Estados Unidos da América) utilizando DIFCO™ TSA (disponível de Difco Laboratories, Inc. de Detroit, Michigan, Estados Unidos da América) suplementado com 250 mg/L de estreptomicina e 50 mg/mL de rifampicina. Existiam três lotes de cada produto RTE (extremidade superior e extremidade inferior de peru e corte de carne de vaca assada) com 15 testes conduzidos em cada lote. Três amostras de cada lote serviram como controlos positivos (sem tratamento de DLS) , um para cada tempo de amostragem. Os dados são apresentados como uma média de CFU de duas concebidas em cada produto e duas amostras de purga

Tabelas 5-7. 32

Tabela 5 Células viáveis na Extremidade Inferior do Rolo de Peru

Tratamento Purga (CFU/mL) Logio (CFU/25 cm') tempo = 0 semanas Controlo - 2,06 ± 0,13 DLS 1 - 2,06 ± 0,16 DLS 1 - 2,02 ± 0,12 DLS 2 - 2,18 ± 0,15 DLS 8 - 2,19 ± 0,08 tempo = 2 semanas Controlo 7,90 ± 0,65* 3,60 ± 0,32* DLS 1 ND ND DLS 1 ND ND DLS 2 ND ND DLS 8 ND 1,65 ± 0,18* tempo = 4 semanas Controlo 7,80 ± 0,66* 4, 71 ± 0,48* DLS 1 ND ND DLS 1 ND ND DLS 2 ND ND DLS 8 ND* ND *Indica uma identificação positiva de Listeria innocua Ml após enriquecimento como no procedimento do United States Department of Agriculture Secção 36,512 de enriquecimento para o isolamento de L. monocytogenes, Todos os outros testes foram negativos após enriquecimento, (testes não realizados no tempo 0 = semanas), ND: não detectável (inferior a 10 CFU/mL) 33

Tabela 6 Células viáveis na Extremidade Superior do Rolo de Peru

Tratamento Purga (CFU/mL) Logio (CFU/25 cm^) tempo = 0 semanas Controlo - 2,13 ± 0,18 DLS 1 - 2,24 ± 0,15 DLS 1 - 2,13 ± 0,17 DLS 2 - 2,08 ± 0,12 DLS 8 - 2,22 ± 0,15 tempo = 2 semanas Controlo 5,54 ± 0,45* 3,81 ± 0,31* DLS 1 ND ND DLS 1 ND ND DLS 2 ND ND DLS 8 ND ND* tempo = 4 semanas Controlo 6,26 ± 0,45* 4, 57 ± 0,45* DLS 1 ND ND DLS 1 ND ND DLS 2 ND ND DLS 8 ND ND* *Indica uma identificação positiva de Listeria innocua Ml após enriquecimento como no procedimento do United States Department of Agriculture Secção 36,512 de enriquecimento para o isolamento de L. monocytogenes, Todos os outros testes foram negativos após enriquecimento: - não determinado (sem purga no dia 0); ND: não detectável (inferior a 10 CFU/mL). 34

Tabela 7 Células viáveis no topo Redondo da Carne de vaca assada

Tratamento Purga (CFU/mL) LoglO (CFU/25 cm*) tempo = 0 semanas Controlo - 2,07 ± 0,11 DLS 1 - 2,06 ± 0,11 DLS 1 - 2,08 ± 0,11 DLS 2 - 2,12 ± 0,16 DLS 8 - 2,10 ± 0,12 tempo = 2 semanas Controlo 6,99 ± 0,48* 4,33 ± 0,44* DLS 1 ND ND DLS 1 ND ND DLS 2 ND ND DLS 8 ND* ND tempo = 4 semanas Controlo 7,96 ± 0,68* 4,49 ± 0,45* DLS 1 ND ND DLS 1 ND ND DLS 2 ND ND DLS 8 ND* ND *Indica uma identificação positiva de Listeria innocua Ml após enriquecimento como no procedimento do United States Department of Agriculture Secção 36.512 de enriquecimento para o isolamento de L. monocytogenes. Todos os outros testes foram negativos após enriquecimento. ND: não detectável (inferior a 10 CFU/mL) 35

Exemplo 8

Efeitos Antimicrobianos de DLS Após um Baixo Nível de Inoculação de Carnes cozinhadas com Listeria Monocytogenes

Um compósito de bactérias contendo igual número de três estirpes de Listeria monocytogenes (SLR10, l/2a; SLR31, l/2b; e SLR1234, 4b Scott A; disponível de Silliker, Inc. de South Holland, Ilinois, Estados Unidos da América) foi empregue para testar a actividade antimicrobiana de DLS de Fumo 8 e Fumo 2 em produtos alimentares. Aproximadamente 1000-10000 CFU foram inoculados em amostras de fiambre, carne de vaca assada, cachorros e peru. O inoculo foi espalhado na superfície dos produtos alimentares utilizando uma ansa estéril e deixada a secar durante 15 minutos. As peças individuais de cada produto cárneo tipo cozinhado foram mergulhadas em Fumo 8 ou Fumo 2 durante 15 segundos e deixados a escorrer durante 1 minuto para remover o líquido em excesso. Os produtos foram então embalados numa embalagem selada a quente e armazenada a 4 °C. as amostras individuais foram analisadas aos dias 0, 1, 2, 5, 10, 30, 60, 90, e/ou 120 dias. A própria carne e qualquer exsudado serão testados. Os dados apresentados nas Figuras 15-18 representam a media de três replicados em cada ponto de tempo.

Como apresentado na Figura 15, o Fumo 8 e Fumo 2 inibiram o crescimento de Listeria em cachorros, com as amostras tratadas com Fumo 2 a mostrar a não detecção de Listeria após o dia 2 até ao e incluindo o dia 90. O título de Listeria nos cachorros tratados com Fumo 8 decresceu até ao dia 30. 36

Como apresentado na Figura 16, o Fumo 8 e o Fumo 2 resultaram na inibição do crescimento de Listeria em carne de vaca assada até ao e incluindo o dia 10. O Fumo 8 e Fumo 2 também inibiu o crescimento de Listeria em fiambre. Como apresentado na Figura 17, para o fiambre tratado com Fumo 8, o título bacteriano geralmente diminuiu até ao dia 10. O tratamento com Fumo 2 resultou em níveis de Listeria não detectáveis até ao e incluindo o dia 10. A Figura 18 mostra os resultados do tratamento de peru com Fumo 8 e Fumo 2. De novo, o tratamento com cada produto resultou em níveis bacterianos reduzidos ou não detectáveis até ao dia 10.

Resumidamente, o tratamento destes produtos alimentares RTE com fracções DLS de Fumo 8 e Fumo 2 resultou num tempo de vida aumentado em, pelo menos, 10 dias.

Exemplo 9

Efeitos Antimicrobianos de DLS Após Elevado Nível de Inoculação de Carnes cozinhadas com Listeria Monocytogenes

As experiências descritas no Exemplo 8 foram repetidas, mas nesta vez, o tempo inicial de inoculação esteve entre 105 e 107 CFU para cada produto alimentar. Os produtos de teste foram inoculados com Listeria monocytogenes. O cocktail de Listeria foi preparado combinando iguais porções de cinco estirpes de Listeria reconhecidas pela USDA que foram 12 a 18 horas de idade. Para inocular os produtos de teste, foram colocadas 0,1 37 mL de cocktail de Listeria nos produtos com uma micropipeta. Os dados apresentados nas Figuras 19-22 representam três replicados em cada ponto de tempo. A Figura 19 mostra os resultados da inoculação de cachorros com cerca 105 CFU de Listeria. 0 tratamento com Fumo 8 resultou numa diminuição de aproximadamente 1 log no titulo bacteriano cerca do dia 10 que foi mantido durante cerca de mais 6 semanas. O Fumo 2, por outro lado, resultou em bactérias não detectáveis no dia 2 que permaneceram abaixo do nivel de detecção até ao dia 60 . A Figura 20 mostra os resultados do tratamento de carne de vaca assada que foi inoculada com cerca 106 CFU de Listeria com Fumo 8 e Fumo 2. O tratamento com Fumo 8 resultou numa inibição de crescimento até ao dia 60. O tratamento com Fumo 2 resultou numa redução maior do que 1 log no titulo bacteriano no dia 1 e uma redução maior do que 2 log no dia 22 que persistiu até ao dia 60. A Figura 21 mostra os resultados do tratamento de fiambre que foi inoculado com cerca 5 x 106 CFU de Listeria com Fumo 8 e Fumo 2. O tratamento com Fumo 8 resultou numa inibição do crescimento até ao dia 5. O tratamento com Fumo 2 resultou numa redução maior do que 1 log no titulo bacteriano no dia 1 que persistiu até ao dia 45. A Figura 22 mostra os resultados do tratamento de peru que foi inoculado com cerca de 106 CFU de Listeria com Fumo 8 e Fumo 2. O tratamento com Fumo 8 resultou numa redução de aproximadamente 1 log ao dia 2. O tratamento com Fumo resultou 38 numa redução maior do que 2 log no título bacteriano no dia 1 que persistiu até ao dia 10.

Exemplo 10

Detalhes Antimicrobianos de Fumo líquido a 100% e Condensados de Pirólise

Os cachorros adquiridos a uma fonte comercial foram tratados com fumo líquido a 100% (Fumo 2; Mastertaste) e/ou vapor pasteurizado (1 minuto a 165 °F). Os cachorros foram mergulhados em Fumo 2 durante 2 minutos e deixados a escorrer durante 60 segundos para remover o líquido em excesso. Um segundo controlo de cachorros foi colocado de lado sem tratamento. Estes foram então inoculados com um cocktail de quatro estirpes de Listeria monocytogenes. As amostras foram embaladas em vácuo em películas de plástico adequadas. Uma porção dos cachorros de cada conjunto (tratado e não tratado) foi submetido a um passo de pasteurização por calor (1 minuto a 165 °F) . Os ensaios foram efectuados em triplicado e as amostras foram mantidas a 50 °F (temperatura de abuso). Os resultados apresentados na Figura 23 mostraram que o calor isolado resultou numa redução de 2,8-log de Listeria monocytogenes que recuperou rapidamente para níveis elevados. Isto foi interessante, mas não inesperado uma vez que a manutenção à temperatura de 50 °F foi um abuso excessivo. No entanto, foi mais notável que apesar de elevada temperatura a que foi mantido, o Fumo 2 isolado foi capaz de provocar uma redução de aproximadamente 2-log de L. monocytogenes que manteve durante o período de teste de 6 semanas. 39 0 tratamento de combinação com fumo líquido e calor teve um efeito inicial que foi semelhante ao observado apenas com calor. No entanto, o tratamento com fumo líquido evitou a recuperação rápida da bactéria observada apenas com calor. Adicionalmente, o título bacteriano continuou a diminuir ao longo de cerca de 3 semanas, atingindo uma redução final de cerca de 7 logs e permaneceu nesse nível durante a duração do período de teste.

Materiais e Métodos para o Exemplo 11

Preparação de Inoculo. Um cocktail de quatro estirpes de Listeria monocytogenes ( 109, 108M, serotipo 4c, serotipo 3) foi utilizado para inoculação da superfície de peito de peru sem pele, reestruturado. 0 inoculo foi preparado a partir de rampas após duas transferências consecutivas para frascos de TSB (disponível em Difco Laboratories, Inc.) em tubos de 5 mL e subsequentemente para frascos de centrifugação de 100 mL de TSB. As culturas de fase estacionária (20 horas) foram centrifugadas a 10 000 g numa centrífuga Beckman J2-21 M/E utilizando um rotor JA-14 (disponível de Beckman Coulter Inc. de Fullerton, Califórnia, Estados Unidos da América) a 4 °C durante 10 minutos, lavados com água peptonada estéril a 0,1% (PW) e as quatro estirpes (cerca 109 CFU/mL) foram combinadas em volumes iguais (50 mL cada) e utilizadas para inoculação em nuvem. Os níveis de inoculo foram determinados por plaqueamento directo em Agar de Oxford Modificado (MOX, disponível de Oxoid Ltd., de Basingstoke, Hampshire, Inglaterra) utilizando um plaqueador em espiral Whitley (disponível de Don Whitley Scientific Ltd., de Shipley, West Yorkshire, Inglaterra) e incubada a 37 °C durante 24 horas. Após incubação, as típicas colónias pretas foram contadas e registadas como logio CFU/mL para o nível de inoculo. 40

Inoculação do Produto e Tratamento. Os invólucros do produto foram removidos assepticamente e os produtos foram colocados num tabuleiro e inoculados em nuvem com o cocktail de quatro estirpes numa câmara de bio-confinamento. Os produtos foram mantidos durante 15 minutos para permitir a ligação da L. monocytogenes. Os tratamentos que requerem as aplicações de DLS foram aspergidos com os DLS (50 mL/peito de peru) utilizando um aspersor de jardim. O produto inoculado, tratado foi então embalado em vácuo e pasteurizado no Kansas State University Aseptic Processing Laboratory (Manhattan, Kansas, Estados Unidos da América) num pasteurizador pós-processo de Townsend (disponível de Townsend of Des Moines, Iowa, Estados Unidos da América) a 96 °C durante 1, 2, ou 3 minutos. Os produtos pasteurizados foram depois refrigerados num banho de água e gelo durante 15 minutos e amostrados utilizando um dispositivo de perfuração da superfície.

Amostragem para L._monocytogenes residual. Após pasteurização e refrigeração, o produto inoculado foi amostrado por remoção asséptica do produto da embalagem e tirando a parte central das superfícies de cima e inferiores (2 por lado). As amostras do núcleo à superfície foram então misturadas com 50 mL de 0,1% PW num saco digestor e homogeneizado (Tekmar Co. de Cincinnati, Ohio, estados Unidos da América) durante 2 minutos. As amostras homogeneizadas foram então diluídas em série em 0,1% de PW e plaqueadas em MOX e TSA. As placas foram incubadas a 37 °C durante 245 horas. A enumeração foi realizada por contagem de colónias pretas típicas em MOX e TSA (utilizadas para recuperação de células lesionadas pelo calor). As contagens foram reportadas como logio CFU/cm2. 41

Exemplo 11

Tratamento de Combinação DLS/Calor de Carnes RTE

Para avaliar a destruição de Listeria monocytogenes inoculada à superfície por apenas a DLS ou em combinação com vapor saturado, uma concepção experimental três-por-quatro foi empregue. Três tratamentos de DLS (controlo, Fumo 1 e Fumo 2) foram utilizados e quatro tratamentos por calor (0, 1, 2 e 3 minutos) como descrito na secção acima intitulada "Materiais e Métodos para o Exemplo 11 ". A inoculação por aspersão de produtos de peito de peru reestruturados resultou em populações de L. monocytogenes à superfície de 4,17 logio CFU/cm2 (Figuras 10 e 11). A exposição a vapor saturado durante 1, 2, ou 3 minutos num pasteurizador de superfície pós-processo de Townsend resultou em reduções de 1,08, 2,01 e 2,92 logio CFU/cm2, respectivamente. O tratamento de aspersão de peito de peru inoculado com DLS resultou em reduções de 0,94 e 0,41 logio CFU/cm2 para o Fumo 1 e Fumo 2 respectivamente, do controlo. O tratamento de aspersão do produto de peito de peru inoculado com Fumo 1 e subsequente exposição ao vapor saturado resultou em maiores reduções à superfície de populações de L. monocytogenes com 2,17, 2,37 e 3,57 logio CFU/cm2 de reduções (1, 2 e 3 minutos de exposição a vapor, respectivamente). Reduções semelhantes (2,30, 3,11 e 3,54 logio CFU/cm2) foram observadas com Fumo 2 mais tratamentos com vapor. 42

Discussão do Exemplo 11

Enquanto o tratamento de aspersão à superfície do produto de peito de peru processado resultou em reduções de L. monocytogenes, a combinação da aplicação de fumo à superfície e tratamento à superfície por calor proporcionou maiores reduções do que o tratamento isolado (Fiquras 12 e 13). Enquanto os tratamentos de combinação proporcionaram maiores reduções, as reduções médias foram maiores para o produto tratado com DLS e pasteurizado durante 1 minuto.

Deve ser entendido que vários detalhes da matéria presentemente divulgada podem ser alterados sem afastamento do âmbito da matéria presentemente divulgada. Além disso, a descrição anterior é apenas para fins e ilustração e não para fins de limitação.

Lisboa, 9 de Agosto de 2013 43

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Método para inibir o crescimento de um microrganismo num produto alimentar, compreendendo o método o tratamento do produto alimentar com um derivado de fumo líquido que não confere aroma a fumo ao produto alimentar, em que o derivado de fumo líquido compreende: (a) acidez titulável numa concentração de 0 a 6% em peso por unidade de volume (p/v); (b) , pelo menos, 10% em peso por unidade de volume (p/v) de carbonilo; (c) fenólicos numa concentração inferior a 0,5% em peso por unidade de volume (p/v); (d) água numa concentração inferior a 97% em peso por unidade de volume (p/v); e possui (e) um pH de, pelo menos, 3,0, em que o crescimento de um microrganismo é inibido.
2. Método da reivindicação 1, em que o microrganismo é seleccionado do grupo consistindo em uma bactéria, uma levedura e um fungo.
3. Método da reivindicação 2, em que a bactéria é uma estirpe de Streptococcus, Shigella, Hafnia, Enterobacter, Serratia, 1 Staphylococcus, Pseudomonas, Citrobacter, Klebsiella, Escherichia coli, Listeria ou Salmonella.
4. Método da reivindicação 2, em que a levedura é uma estirpe de Saccharomyces.
5. Método da reivindicação 2, em que o funqo é uma estirpe de Aspergillus.
6. Método da reivindicação 1, em que o produto alimentar é um produto alimentar pronto a comer.
7. Método da reivindicação 6, em que o produto alimentar pronto a comer compreende aves, porco, vaca, marisco ou um produto de massa cozida.
8. Método da reivindicação 1, em que o produto alimentar é um produto alimentar pronto a cozinhar.
9. 0 método da reivindicação 8, em que o produto alimentar pronto a cozinhar compreende aves, porco, vaca, marisco, veqetais frescos ou um produto de massa pré-cozida.
10. Método da reivindicação 1, em que o derivado de fumo liquido compreende carbonilo numa concentração de 12% em peso por unidade de volume (p/v) e um pH de 5,0 a 6,0.
11. Método da reivindicação 1, em que o pH está entre 4,5 e 6,5.
12. Método da reivindicação 1, em que o derivado de fumo liquido é produzido processando fumo liquido através de um 2 evaporador para separar e condensar os seus elementos de baixa ebulição para produzir o derivado de fumo líquido.
13. Método da reivindicação 1, em que o derivado de fumo líquido é aspergido no produto alimentar.
14. Método da reivindicação 1, em que o produto alimentar é mergulhado num banho do derivado de fumo líquido.
15. Método da reivindicação 1, compreendendo ainda o aquecimento do produto alimentar a, pelo menos, 73,9 °C (165 °F) durante, pelo menos, 1 minuto.
16. Método da reivindicação 15, em que o passo de aquecimento é realizado após o passo de tratamento.
17. Método da reivindicação 1, em que o derivado de fumo líquido compreende ainda um agente de humedecimento adicional.
18. Método da reivindicação 17, em que o agente de humedecimento adicional compreende polissorbato.
19. Antimicrobiano derivado de fumo líquido, em que o derivado de fumo líquido: (i) compreende (a) acidez titulável numa concentração de 0 a 6% em peso por unidade de volume (p/v); (b) carbonilo de, pelo menos, 10% em peso por unidade de volume (p/v); 3 (c) fenólicos numa concentração inferior a 0,5 % em peso por unidade de volume (p/v); (d) água numa concentração inferior a 97% em peso por unidade de volume (p/v); e possui (e) um pH de, pelo menos, 3,0; (ii) não confere sabor a fumo a um produto alimentar quando o produto alimentar é tratado com o derivado de fumo líquido; e (iii) inibe o crescimento num produto alimentar de um microrganismo seleccionado do grupo consistindo em Streptococcus, Shigella, Hafnia, Enterobacter, Serratia, Staphylococcus, Pseudomonas, Citrobacter, Klebsiella, Escherichia coli, Listeria, Salmonella, Saccharomyces e Aspergillus quando o produto alimentar é tratado com o derivado de fumo líquido.
20. Antimicrobiano derivado de fumo líquido da reivindicação 19, em que o pH está entre 4,5 e 6,5.
21. Antimicrobiano derivado de fumo líquido da reivindicação 19, em que o derivado de fumo líquido compreende carbonilo numa concentração de 12% em peso por unidade de volume (p/v) e um pH de 5,0 a 6,0.
22. Antimicrobiano derivado de fumo líquido da reivindicação 19, em que o produto alimentar é um produto alimentar pronto a comer. 4
23. Antimicrobiano derivado de fumo líquido da reivindicação 22, em que o produto alimentar pronto a comer compreende aves, porco, vaca, marisco ou um produto de massa cozida.
24. Antimicrobiano derivado de fumo líquido da reivindicação 19, em que o produto alimentar é um produto alimentar pronto a cozinhar.
25. Antimicrobiano derivado de fumo líquido da reivindicação 24, em que o produto alimentar pronto a cozinhar compreende aves, porco ou vaca, marisco, ou um produto de massa pré-cozida.
26. Antimicrobiano derivado de fumo líquido da reivindicação 19, em que o derivado de fumo líquido compreende um agente de humedecimento adicional.
27. Antimicrobiano derivado de fumo líquido da reivindicação 26, em que o agente de humedecimento adicional compreende polissorbato. Lisboa, 9 de Agosto de 2013 5