PT1765388E - Terapia de combinação para evitar ou tratar a doença de alzheimer e estojo ( kit ) para esse fim - Google Patents

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ΡΕ1765388 1 DESCRIÇÃO "TERAPIA DE COMBINAÇÃO PARA EVITAR OU TRATAR A DOENÇA DE ALZHEIMER E ESTOJO ("KIT") PARA ESSE FIM" A invenção diz respeito a uma terapia de combinação para prevenção ou tratamento de doença de Alzheimer e um estojo ("kit") para realização desta terapia de combinação. 0 péptido β-amilóide (Αβ) desempenha um papel central na neuropatologia da doença de Alzheimer (Roher et al., 1993: "β-Amyloid-(1-42) is a major componente of cerebrovascular amyloid deposits: Implications for the pathology of Alzheimer's disease [0 β-Amilóide-(1-42) é um componente principal de depósitos amilóides cerebrovas-culares: Implicações para a patologia da doença de

Alzheimer]" PNAS 90:10836). Formas familiares da doença foram relacionadas com mutações na proteína precursora amilóide (amyloid precursor protein, APP) e com os genes da presenilina. As mutações nestes genes ligadas a esta doença, conduzem a uma produção aumentada da forma de 42 aminoácidos do péptido (Αβ42) que é a forma principal encontrada nas placas amilóides da doença de Alzheimer. Um modelo animal da doença está disponível comercialmente. O ratinho transgénico PDAPP que exprime APP mutante humana (em que o aminoácido na posição 717 é F em vez de V) , 2 ΡΕ1765388 desenvolve progressivamente muitos dos sinais neuropato-lógicos da doença de Alzheimer de foram dependente da idade e do cérebro (Games et ai., 1995: "Alzheimer-type neuropathology in transgenic mice overexpressing V717F β-amyloid precursor protein [Neuropatologia do tipo doença de Alzheimer em ratinhos transgénicos que sobreexpressam a proteína precursora β-amilóide V717F] , Nature 373: 523). Já foram realizados estudos de vacinação com uma vacina "normal" não baseada num mimotopo. Animais transgénicos foram imunizados com Αβ42 agregado, antes do início das neuropatologias típicas da doença de Alzheimer (6 semanas) ou em idade avançada (11 meses): a imunização dos animais jovens evita o desenvolvimento da formação de plaquetas, distrofia neurítica e astrogliose. 0 tratamento de animais mais velhos reduziu claramente as neuropatologias do tipo da doença de Alzheimer. Esta aproximação experimental com vacina provocou o desenvolvimento de anticorpos contra Αβ42 que eram capazes de atravessar a barreira hematoencefálica e quebrar as placas amilóides (Schenk et al., 1999: "Immunization with amyloid-β attenuates Alzheimer-disease-like pathology in the PDAPP mouse [A imunização com amilóide-β atenua a patologia tipo Alzheimer no ratinho PDAPP]", Nature 400:173). As placas são, em seguida, removidas através de vários mecanismos inclusive através de fagocitose mediada por receptor Fc (Bard et al., 2000:"Peripherally administrated antibodies against amyloid β-peptide enter the central nervous System and reduce pathology in a mouse model of Alzheimer disease 3 ΡΕ1765388 [Anticorpos contra o péptido β-amilóide, administrados perifericamente, entram no sistema nervosos central e reduzem a patologia num modelo de ratinho de doença de Alzheimer], Nature Med. 6:916). Esta vacina também foi capaz de adiar défices de memória (Janus et al., 2000: "Αβ peptide ummunization reduces behavioural impairment and plaques in a model of Alzheimer's disease [Imunização com péptido Αβ reduz a deterioração de comportamento e placas num modelo da doença de Alzheimer]", Nature 408: 979).

Desde o fim de 1999 está em fase de teste clínico uma terapia de imunização para doença de Alzheimer extremamente promissora. Supõe-se que a imunização leva o sistema imunitário a atacar as placas e remover esta deposição do cérebro humano afectado, embora ainda seja necessário caracterizar mais em detalhe o mecanismo exacto na base deste processo.

Estes ensaios clínicos foram realizados pela empresa farmacêutica Elan em conjunto com a sua empresa parceira American Home Products (vacina terapêutica ΝΆ-1792, QS21 cmo adjuvante) . Os ensaios de fase I foram concluídos com sucesso no ano de 2000. Por volta do fim de 2001 foi iniciado um ensaio de fase II, para testar a eficácia num grupo de doentes com doença de Alzheimer fraca a moderada.

Agora estes ensaios de Fase II foram constantemente interrompidos, devido a nevrite em vários 4 ΡΕ1765388 doentes (Editorial 2002, "Insoluble Proplem? [Problema insolúvel?]", Nature Med. 8:191). Os sintomas incluem Meningoencefalite asséptica, que conduziram a uma imediata interrupção destes ensaios mundiais. Na pior das hipóteses mostrar-se-á que os doentes atingidos desenvolveram uma resposta auto-imune- um risco acarretado por muitas imunoterapias. Complicações auto-imunes poderiam ter sido previstas, devido à ubiquidade de APP que é naturalmente portadora de determinantes antigénicos, que tem em comum com o seu produto proteolitico. Desde então estudos adicionais concentraram-se nas caracteristicas de anticorpos induzidos por imunização com Αβ42 (em humanos e ratinhos) e descobriram que a maioria dos anticorpos reconhecem um pequeno dominio entre os aminoácidos 4 e 10 de Αβ42 (Αβ4-10) . Os anticorpos de ratinham eram capazes de bloquear a fibrilogénese de Αβ e destroem fibras de Αβ já existentes (McLaurin et al., 2002: "Therapeutically effective antibodies against amyloid-β peptide target amyloid-β residues 4-10 and inhibit cytotoxicity and fibrillogenesis [Anticorpos terapeuticamente eficazes contra o péptido amilóide-β têm como alvo os residuos 4-10 de amilóide-β e inibem a citotoxicidade e fibrilogénese]", Nature Med. 8:1263). Interessante que os anticorpos humanos não reagem com a APP expressa à superfície de células, ou outro produto proteolitico não agregado do precursor (Hock et al., 2002:"Generation of antibodies specific for β-amyloid by vaccination of patients with Alzheimer disease [Geração de anticorpos específicos para β-amilóide por vacinação de doentes com doença de Alzheimer]", Nature Med. 8:1270). Foi 5 ΡΕ1765388 observada uma diferença nítida entre o soro de humanos e ratinhos: ao contrário dos anticorpos humanos os anticorpos de ratinho reconhecem Αβ na forma monomérica, oligomérica e fibrilar. Isto é significativo e pode ser um pré-requesito para a eficácia terapêutica, já que há cada vez mais sinais de que pequenos oligómeros de Αβ, que não são reconhecidos por anti-Αβ humanos, são os actores tóxicos principais na doença (Walsh et al., 2002: "Naturally secreted oligomers of amyloid β protein potently inhibit hippocampal long-term potentiation in vivo [Oligómeros naturalmente secretados de proteína β-amilóide inibem eficazmente a potenciação a longo-prazo do hipocampo in vivo]", Nature 416:535). Por isso existe uma nova estratégia potencial na imunização com uma vacina que contem os aminoácidos de β-amilóide 4-10 8em vez de Αβ42 agregado. Apesar da eficácia ainda não conhecida, esta estratégia pode também confrontar-se com problemas auto-imunes já que os doentes seriam imunizados com um epitopo-"próprio" (células da linha B).

Apesar destes desenvolvimentos decepcionantes nas estratégias de vacinação mais recentes uma vacina Αβ é ainda considerada como o método mais promissor na luta contra a doença de Alzheimer. No entanto são requeridas melhorias urgentes e novas estratégias na vacinação contra Alzheimer. Principalmente uma vacina deste tipo não deve estimular células-T e/ou B reactivas.

Também vão sendo desenvolvidos outros agentes terapêuticos destinados a evitar a produção de amilóide-β, 6 ΡΕ1765388 a agregação β-amilóide ou as ocorrências neurotóxicas originadas por estes agregados. Uma apresentação resumida das estratégias terapêuticas adoptadas até agora para a doença de Alzheimer está dada num artigo de revisão de Wolfe (Nature Reviews Drug Discovery 1 (2002) 859-866).

As placas β-amilóides formam-se a partir da chamada proteina precursora β-amilóide (APP), que é uma proteina transmembranar integral (para a qual não está documentada uma função fisiológica conhecida; no entanto resultados experimentais mais recentes deixam suspeitar que APP actua como receptor-cargo membranar para Quinesina I). APP é clivada proteoliticamente através das chamadas secretases em que é formado principalmente um péptido Αβ de 40 aminoácidos (Αβ 40) . Também se formam outras formas de Αβ mais curtas e mais longas principalmente uma versão de 42 aminoácidos (Αβ42), que apresenta uma elevada capacidade de agregação. Esta forma Αβ42 é por isso a forma predominante em placas amilóides. As secretases responsáveis por estas diferentes clivagens (secreatses α, β e principalmente gama) formam assim alvos primários de uma possivel estratégia de tratamento de AE. Tentou-se por isso usar moduladores ou inibidores desta enzima no tratamento de AE (como por exemplo Benzodiazepina, sulfonamida, benzocapro-lactam).

Um outro gene, associado com a doença de Alzheimer é a apolipoproteína E, para o qual existem três variantes de alelos (APOE2, APOE3, e APOE4). Mostrou-se que 7 ΡΕ1765388 pessoas com uma ou duas cópias de AP0E4 apresentam uma risco mais elevado para AE, enquanto portadores de AP0E2 apresentam um risco menor em comparação com a população total. Também se mostrou que pessoas que tomam Estatinas, ou seja medicamentos que inibem a biossintese de coles-terina, apresentam um risco claramente mais baixo para doença de Alzheimer. Outra estratégia para tratamento de doença de Alzheimer concentra-se por isso em inibidores da biossintese de colesterinas por exemplo com Estatinas.

Ainda uma outra abordagem para o tratamento de doença de Alzheimer diz respeito à inibição da agregação amilóide em placas cerebrais, que entre outras também poderia ser levada a cabo através de inibidores da secre-tase. Além disso foi também sugerido diminuir o conteúdo em zinco, já que o zinco, em concentrações fisiologicamente relevantes pode induzir a agregação de Αβ.

Outras estratégias de tratamento da doença de Alzheimer que foram sugeridas no estado da técnica, dizem respeito à prevenção da expressão de APP e ao aumento da Clearance de Αβ, em que para a primeira foram procuradas substâncias que interagem com a região promotora de APP. No que diz respeito à clearance de Αβ, foi sugerido um aumento da actividade de determinadas proteases tal como a enzima de decomposição da insulina e neprolisina ou a aplicação periférica de anticorpos anti-Αβ (De Mattos et al., PNAS 98 (15)(2001), 8850-8855). Experiências deste tipo trouxeram no entanto já no modelo de ratinho resultados contradi- ΡΕ1765388 tórios (Wolfe (2002)). Ultimamente também foi tentado dissolver placas amilóides já existentes por exemplo através da redução dos niveis de amilóide-β no soro de doentes com doença de Alzheimer. Neste contexto também foi sugerido reduzir o depósito de placa de proteínas β-amilóides no cérebro através de procedimentos de aférese (US 6 551 266, no qual é sugerida a remoção de macro- moléculas com um peso molecular de mais de 500 kD através de aférese), sem que isso tenha sido mostrado realmente também para doença de Alzheimer. A solução através de placas já existentes em células de cérebro não é possível directamente através de procedimentos de aférese (a barreira hemato-encefálica não é ultrapassável por placas ou também moléculas com >500 kD).

Como mencionado, a característica patológica da doença de Alzheimer que salta mais aos olhos é a presença de placas de amilóide-β (Αβ40 e Αβ42) . A redução de Αβ é assim encarada como o objectivo farmacêutico primário na profilaxia e terapia da doença de Alzheimer. Apesar da remoção amilóide através de indução de anticorpos anti-Αβ através de imunização activa, os ensaios clínicos ficaram sem sucesso devido aos efeitos secundários graves, que levaram à interrupção do tratamento. Resultados pré-clínicos mais recentes mostraram que os anticorpos (também) podem conduzir a redução periférica de Αβ e assim, possivelmente, modificar a dinâmica Αβ-periferia-cérebro.

Foi ainda mostrado que o tratamento periférico com uma substância com uma elevada afinidade para Αβ (como 9 ΡΕ1765388 por exemplo Gelsolina ou GM1), diminui a quantidade de Αβ no cérebro (Masouka et ai, Journal of Neuroscience 2003:29-33) . De acordo com isso foi sugerido, como abordagem geral, compostos que podem reduzir a concentração em Αβ no plasma, reduzem a amiloidose no cérebro ou podem reduzir. Assim poderiam ser desenvolvidas substâncias terapêuticas novas cujo efeito não depende da superação da barreira hemato-encefálica.

Para este efluxo de Αβ do cérebro, induzido por sequestro de Αβ do plasma, foi mostrado um efeito no conteúdo em Αβ no plasma, dependente do procedimento: O conteúdo em Αβ no plasma não foi reduzido através de Gelsolina; A administração de gelsolina e imunização passiva com anticorpos monoclonais anti-Αβ conduziu, em vez disso, a um concentração mais elevado de Αβ no plasma. A sobrecarga de Αβ no cérebro só foi reduzida, no entanto, com a utilização nas experiências de ratinhos transgénicos APP relativamente jovens; com a utilização de ratinhos com mais de 6 meses de idade, o tratamento demonstrou não ter efeito. Isto pode ser atribuído à mais elevada insolubilidade de Αβ no cérebro de ratinhos mais velhos. Por outro lado um tratamento mais prolongado poderia possivelmente ter sucesso, no entanto nem a administração de gelsolina ou GM1, nem a imunização passiva são adequados para uma administração a longo prazo. A WO 2004/056318 descreve terapias para tratamento de doença de Alzheimer, entre elas a 10 ΡΕ1765388 administração de substâncias que se ligam a Αβ, assim como diálise, inclusivamente hemodiálise e perfusão plasmática.

Era assim tarefa da presente invenção a dispo-nibilização de uma nova estratégia de tratamento e prevenção para a doença de Alzheimer, principalmente de uma estratégia que se baseia numa imunização bem sucedida.

De acordo com isto é disponibilizado, com a presente invenção um estojo ("kit") como definido na reivindicação 1. Ai de acordo com a invenção é induzido o efluxo de Αβ (através de substâncias, como por exemplo gelsolina, GM1, uma vacina especifica para Αβ activa ou passiva) e este efluxo mantido através de aférese Αβ. Neste contexto é até suficiente uma imunização activa uma ou duas vezes com uma vacina contendo Αβ, derivados de Αβ ou Αβ-mimotopo, para induzir um sequestro de Αβ plasmático, mediado por IgM e/ou IgG.

Preferencialmente utiliza-se no estojo ("kit"), como suporte de aférese uma coluna estéril e isenta de pirogénios.

No estojo ("kit") está contida a substância para induzir um sequestro de β amilóide (Αβ) no plasma de preferência escolhido de entre substâncias com uma elevada afinidade para Αβ, isto é, gelsolina ou GM1, uma vacina especifica para Αβ activa ou passiva ou anticorpos monoclonais humanizados específicos para Αβ. 11 ΡΕ1765388 A vacina activa especifica para Αβ é ai preferencialmente um péptido de acordo com a reivindicação 3, também chamado mimotopo.

Epitopos especialmente adequados são escolhidos de pelo menos um dos seguintes epitopos:

EIDYHR, ELDYHR, EVDYHR, DIDYHR, DLDYHR, DVDYHR, DIDYRR DLDYRR, DVDYRR, DKELRI, DWELRI, YREFFI, YREFRI, YAEFRG EAEFRG, DYEFRG, ELEFRG, DRELRI, DKELKI, DRELKI, GREFRN EYEFRG, DWEFRDA, SWEFRT, DKELR, SFEFRG, DAEFRWP, DNEFRSP GSEFRDY, GAEFRFT, SAEFRTQ, SAEFRAT, SWEFRNP, SWEFRLY, SWELRQA, SVEFRYH, SYEFRHH, SQEFRTP, SSEFRVS, DWEFRD, DAELRY, DWELRQ, SLEFRF, GPEFRW, GKEFRT, AYEFRH, DKE(Nle)R, DKE(Nva)R oder DKE (Cha)R.

De acordo com a invenção é utilizado um mimotopo Αβ42 para vacinação contra doença de Alzheimer: o mimotopo desencadeia a produção de anticorpos contra Αβ42, mas não contra APP nativa. 0 mimotopo pode ser identificado com um anticorpo (monoclonal) e com bibliotecas peptidicas (disponíveis comercialmente) (por exemplo de acordo com Reineke et al., 2002: "Identification of distinct antibody epitopes ans mimotopes from a peptide array of 5520 randomly generated sequences [Identificação de epitopos de anticorpos e mimotopos distintos de uma colecção de 5520 sequências geradas ao acaso]", J. Immunol. Methods 267:37). Utiliza-se um anticorpo (monoclonal) que não reconhece APP, 12 ΡΕ1765388 contudo reconhece diferentes espécies Αβ com ácido aspártico amino-terminal (um exemplo para um destes anticorpos está descrito em Johnson-Wood et al., 1997 :

Amyloid precursor protein Processing and Αβ42 deposition in a transgenic mouse model of Alzheimer disease [0 processamento da proteína precursora amilóide e deposição de Αβ42 num modelo em ratinho transgénico de doença de Alzheimer], PNAS 94: 1550). Um anticorpo deste tipo revelou-se no decurso da presente invenção como uma ferramenta ideal para identificação de mimotopos adequados para a vacinação. Embora se tenha mostrado que um anticorpo monoclonal deste tipo tem um efeito positivo num modelo em ratinho de Alzheimer, quando administrados directamente aos ratinhos (Barde t al., 2000; "Peripherally administered antibodies against amyloid β-peptide enter the central nervous system and reduce pathology in a mouse model of Alzheimer disease [Anticorpos administrados por via periférica contra péptido β amilóide entram no sistema nervoso central e reduzem a patologia num modelo em ratinho de doença de Alzheimer]", Nature Med. 6:916), ainda nunca tinha sido sugerido utilizar este anticorpo como mimotopo-ferramenta de pesquiza para isolar compostos de vacinação para doença de Alzheimer.

No estado da técnica até agora, todos os esforços se concentram no péptido Αβ que ocorre naturalmente. Como mencionado acima, os ensaios clínicos com vacinas contra o péptido-Αβ foram parados devido à ocorrência de nevrites. Efectivamente programas de previsão de epitopos de 13 ΡΕ1765388 células-T (BIMAS para anticorpos limitados a MHC-classe I e TEPITOPE para epitopos limitados a MHC-classe II) um grande número de (auto)epitopos no interior da sequência. Isto poderia implicar que as ocorrências de nevrite tenham sido desencadeadas através de reacções auto-imunes, o que tornaria uma vacina deste tipo inadequada para utilização geral.

Ao contrário destas vacinas para Αβ, que foram sugeridas até agora na área, não se espera a ocorrência de reacções auto-imunes, durante o tratamento com uma vacina que contêm o mimotopo de acordo com a presente invenção, já que o anticorpo (monoclonal), de acordo com a invenção, utilizado para a identificação de mimotopos, não reconhece APP e é diferente das auto-sequências derivadas de Αβ42, que foram utilizadas até agora nas experiências ou seriam utilizadas em experiências futuras. 0 anticorpo, de acordo com a invenção, utilizado para a identificação de mimotopos, não reconhece contudo a sequência de aminácidos derivada de Αβ DAEFRH (epitopo original), com um ácido aspártico amino-erminal, APP nativa. 0 anticorpo pode ser um preparado de anticorpo monoclonal ou policlonal ou qualquer parte de anticorpo ou derivado deste, a única condição é que a molécula de anticorpo reconheça especificamente o epitopo DAEFRH, isto é que não se ligue à forma natural, com prolongamento N-terminal da proteína precursora amilóide, o que significa que a capacidede de ligação ao epitopo DAEFRH é pelo menos 14 ΡΕ1765388 100 vezes, preferencialmente 1000 vezes, ainda mais preferido pelo menos 105 vezes mais elevada do que a molécula APP. O anticorpo pode ser um anticorpo que apresenta a mesma capacidade de ligação à sequência DAEFR H do que o anticorpo descrito por Johnson-Wood et al. 1997, ou mais elevada. Naturalmente podem também ser utilizados outros anticorpos com uma capacidade de ligação mas baixa (>10%, >50% ou >80% da capacidade de ligação do anticorpo de Johnson-Wood et al.), embora uma capacidade de ligação mais elevada seja preferida.

Os compostos de acordo com a presente invenção ligam-se aquele anticorpo com especificidade comparável à sequência DAEFRH. 0 mimotopo para ser utilizado de acordo com a presente invenção pode existir na vacina na forma isolada (peptidica) ou pode estar acoplada ou complexada com outra molécula, como uma substância veiculo farmacêutica ou outras estruturas polipeptidicas, lipídicas ou de hidratos de carbono. Os mimotopos podem entretanto estar acoplados (covalentemente ou não covalentemente) a linkers não específicos ou veículos, especialmente linkers polipeptí-dicos ou proteicos. Além disso os linkers peptídicos ou veículos proteicos podem consistir em epitopos de células-T-helper ou contê-los.

Preferencialmente o veículo farmaceuticamente aceitável é KLH, toxóide tetânico, proteína de ligação à 15 ΡΕ1765388 albumina, albumina bovina sérica, um dendrimero (MAP; Biol.Chem. 358:581) assim como substâncias adjuvantes descritas em Singh et al., Nat.Biotech.17 (1999), 1075-1081 (especialmente as na tabela 1 deste documento) e 0'Hagan et al., Nature Reviews, Drug Discovery 2 (9) (2003), 727-735 (especialmente os compostos endógenos imuno-potenciantes e os sistemas de distribuição ou misturas destes. Além disso a composição da vacina pode conter hidróxido de aluminio.

Uma vacina que compreende o composto presente (Mimotop) e o veiculo aceitável do ponto de vista farmacêutico pode ser administrado por qualquer método de aplicação apropriado, por exemplo i.v., i.p., i.m., intra-nasal, oral, subcutâneo, etc e em qualquer aparelho de distribuição (0'Hagan et al., Nature Revews, Drug Discovery 2 (9), (2003), 727-735). Tipicamente a vacina contem o composto de acordo com a invenção numa quantidade de 0,1 ng a 10 mg, preferivelmente 10 ng a 1 mg, especialmente 100 ng a 100 yg ou alternativamente, por exemplo 100 fMol, preferencialmente 10 pMol a 1 yMol, especialmente 100 pMol a 100 nMol. A vacina pode também conter adjuvantes típicos, p.ex. tampões, estabilizadores, etc.

De acordo com a presente invenção é providenciado um aparelho de aférese, para manter o efluxo Αβ após iniciação, durante a terapia de combinação, compreendendo um suporte fixo que pode ser posto em contacto com o fluxo sanguíneo ou de plasma, que apresenta um receptor que se liga à proteína precursora β-amilóide (APP). Com o presente 16 ΡΕ1765388 aparelho de aférese pode planear-se uma clearance de APP ou produtos de degradação de APP, particularmente Αβ40 ou Αβ42, dirigida a doentes com doença de Alzheimer ou pessoas em risco de doença de Alzheimer, e assim manter o efeito do sequestro de Αβ. É conhecido que existe um equilíbrio dinâmico de Αβ42 entre o sistema nervoso central e o plasma. Pôde -como mencionado- ser mostrado num modelo de ratinho (DeMattos PNAS 2001, ver acima), que a aplicação periférica de anticorpos anti-Αβ influencia a clearance de Αβ42 no sistema nervoso central e no plasma e reduz a carga de Αβ42 no cérebro, sem que os anticorpos anti-Αβ ultrapassem a barreira hemato-encefálica. Estes resultados foram confirmados por Matsuoka et al (Journal of Neuroscience 2003:29-33) através da aplicação periférica de outras moléculas que se ligam a Αβ42 (Gelsolina e GM1). Assim pode ser inibido o processo de formação de placas no cérebro num local bem acessível, nomeadamente já no sangue, isto é, esta proteína ou péptido de decomposição já não podem atingir o cérebro e aí agregar. O processo de formação de placas no cérebro pode também ser inibido através de captura de Αβ42 no sangue. Neste contexto não é crítico se os receptores, no aparelho de aférese que serão postos em contacto com o sangue ou plasma dos doentes, são específicos para Αβ42 ou outras formas de degradação de APP, o que é importante é que com esta absorção específica de APP e dos seus produtos de degradação (proteolíticos) , principalmente Αβ42, sejam eliminados do sangue de modo a uma degradação de proteínas errada (nomeadamente para Αβ42) ou chegue à formação de placas. Com isso a presente 17 ΡΕ1765388 invenção baseia-se numa aproximação completamente diferente para a aférese do que a em US 6 551 2 66, nomeadamente na eliminação dos potenciais componentes das placas e não só as placas. A propósito, a eliminação de placas através de aférese não é considerada à priori efectiva no tratamento da doença de Alzheimer, já que aférese do sangue não pode atingir as regiões de formação de placas no cérebro.

Por outro lado a terapia de combinação tem vantagem sobre procedimentos que conduzem no próprio organismo à diminuição de Αβ (como por exemplo De Mattos et al., PNAS 98 (15)(2001), 8850-8855 com anticorpos anti-Αβ periféricos) e que são levados a cabo durante mais tempo, na medida em que não podem ser desencadeadas respostas auto-imunes. Além disso, de acordo com a invenção não precisam de ser aplicados ao doente substâncias que só podem actuar no corpo (eventualmente só após terem sido transportados a um determinado local), mas o agente pato-génico é propositadamente removido, ou seja a causa da doença é retirada especificamente, extra-corporalmente, sem que os produtos de reacção tenham que ser eliminados no corpo.

No processo, de acordo com a invenção, os aparelhos de aférese conhecidos, em todas as formas de aplicação, podem ser adaptados à presente invenção.

Particularmente deve ter-se em atenção na escolha do suporte fixo (e do aparelho de aférese) se são adequados 18 ΡΕ1765388 do ponto de vista médico. Veículos, procedimentos ou aparelhos deste tipo estão descritos entre outros em US 5 476 715, 6 036 614, 5 817 528 ou 6 551 266. Aparelhos de aférese comerciais apropriados são vendidos entre outras pelas empresas Fresenius, Plasmaselect, ASAHI, Kaneka, Braun, etc., como, por exemplo, LDL-Therasorb®, Immuno-sorba®, Prosorba®, Globafin®, Ig-Therasorb®, Immusorba®, Liposorba®, HELP®, DALI®, Absorber Bilirubina-Ácido biliar BR-350, Desintoxicação Prometheus®, MARS®, sistema ADAsorb de Medicap ou o sistema Plasma FLO. Todos estes sistemas. Todos estes sistemas- embora na forma comercial não sejam primariamente dirigidos à eliminação especifica de uma proteína individual- podem ser adaptados à presente invenção por um perito em aférese, por exemplo como imuno-aférese e/ou com instalação do suporte fixo de acordo com a invenção (por exemplo como coluna) no aparelho de aférese. "Os receptores de ligação a APP" de acordo com a invenção são substâncias que apresentam afinidade para se ligar a APP e aos seu produtos biológicos, particularmente Αβ42 e são capazes de remover estes polipéptidos do sangue ou do plasma de doentes com doença de Alzheimer ou pessoas em risco para doença de Alzheimer.

Exemplos para anticorpos anti-APP são 3D6 (Αβί-5), 2H3 (Αβ1-12), 2G3 (Αβ33-40), 21F12 (Αβ33-42), 12Η7 (Αβ33-42) (Johnson-Wood et al, PNAS 1997: 1550-1555), 10D5, 16C11 (Barde t al, Nature Medicine 2000:916-919) o anticorpo descrito por De Mattos et al. (2001)(m266, m243) 19 ΡΕ1765388 assim como anticorpos da mesma especificidade. Anticorpos deste tipo são por exemplo obtidos por imunização de mamíferos com formulações de vacinas contendo ΑΡΡ, Αβ42 ou fragmentos ou variantes destes, quando necessário seguidas de fusão celular e protocolos de selecção de clones (no caso de anticorpos monoclonais).

Gelosolina (Matsuoka et al 2003, ver acima), apoJ e apoE (DeMattos et al 2001, ver acima) são mais exemplos de receptores proteicos de que se ligam a APP. GM1 é um exemplo para um receptor gagliosídico que se liga a APP (Matsuoka et al 2003, ver acima).

Além disso também podem ser utilizados receptores que se ligam a APP baseados em ácidos nucleicos ("Aptâmeros"; mas também "Decoy"-oligodesoxinucleotídeos (ds oligonucleotídeos, que pela sequência apresentam sítios de ligação para factores de transcrição) , em que estes podem ser encontrados com diferentes bibliotecas (de nucleótidos) (p.ex. com 2-180 resíduos de ácidos nucleicos) (por exemplo Burgstaller et al., Curr. Opin. Drug Discov. Dev. 5(5) (2002), 690-700; Famulok et al., Acc. Chem. Res. 33 (2000), 591-599; Mayer et al. , PNAS 98 (2001), 4961-4965, e muitos mais). 0 esqueleto de ácidos nucleicos pode ser encontrado através das ligações fosfodiéster naturais ou também através de fosforotioato ou combinações ou variações químicas (por exemplo como PNA), em que que como bases, de acordo com a invenção podem ser utilizadas sobretudo U, T, A, C, G, H e mC. Os resíduos 2' de nucleótidos, 20 ΡΕ1765388 que podem ser utilizados de acordo com a invenção, são preferencialmente H, OH ou outros grupos de protecção e modificações na posição 2' , em que os ácidos nucleicos também podem ser modificados, equipados por exemplo com grupos protectores como os que são utilizados normalmente na sintese de oligonucleótidos. Por "grupos protectores" entende-se uma eterificação do átomo de oxigénio, enquanto na modificação 2' o grupo OH é substituído por outra coisa. Para ambas variantes existem no estado da técnica possibilidades muito variadas, grupos protectores preferidos são aí metilo, alilo, propilo e afins (por exemplo 2'-OCH3, 2'-0-CH=CH2, etc.); modificações especialmente preferidas são 2'-desoxi, 2'-amino, 2'-fluoro, 2'-bromo, 2'-azido mas também metais, como selénio, etc... Além disso também podem ser utilizadas, de acordo com a invenção, as técnicas de estabilização que foram desenvolvidas para a tecnologia de antisense (ribozimas, RNAi, etc.) (ver por exemplo as empresas leader neste campo ISIS e Ribozyme Pharmaceuticals, especialmente os seus documentos de patente e homepage).

Aptâmeros que se ligam a APP (que de acordo com a invenção, como definido acima englobam também aptâmeros que se ligam a Αβ42) são por isso também receptores que se ligam a APP preferidos no contexto da presente invenção.

De acordo com a invenção são por isso utilizados receptores que se ligam a APP num material suporte para eliminação extracorporal de APP e dos seus produtos de decomposição em doentes de Alzheimer (ou em risco). 21 ΡΕ1765388

Para a utilização da presente invenção na prática medicinal de rotina é necessário que o suporte seja estéril e isento de pirogénios, de modo que cada substância suporte ou cada combinação receptor/suporte, que preenche estes critérios é preferido, de cordo com a invenção, (ver por exemplo US 6 030 614 ou US 5 476 715) . Entre os exemplos adequados encontram-se homopolímeros porosos, co ou terpo-límeros de monómeros contendo vinilo (por exemplo ácido acrílico, como por exemplo TSK Toyopearl, Fractogel TSK) , suportes com modificações (activações) compostos com Oxiran (por exemplo epiclorhidrina) e sendo caso disso, reacções adicionais com NH3, compostos contendo amino ou carboxilo, ou adsorventes CNBr ou CNC1 como descrito na EP 110 409 A e na DE 36 17 672 A

Materiais de adsorção particularmente preferidos para fins terapêuticos são convenientes para evitar perda de células sanguíneas, não activam, ou activam de forma insignificante o sistema complemento e preferivelmente evitam a formação de agregados na circulação extracorporal. Além disso os materiais suporte usados devem também ser suficiente estáveis, preferencialmente também na forma acoplada a receptor, a medidas de esterilização, particularmente a saturação por óxido de etileno, saturação por glutaraldeído, radiação-gama, tratamento por vapor, tratamento por UV, tratamento por solventes e/ou tratamento por detergentes, etc... 22 ΡΕ1765388

Também podem ser usados por exemplo produtos baseados em sepharose, agarose, acrilo, vinilo, dextran etc, que, de preferência, apresentam, já comercialmente, grupos funcionais para ligação dos receptores de ligação a APP. Outros suportes apropriados também incluem monólitos (suportes com base em polímeros reticulados de metacrilato de glicidilo-co-dimetacrilato de etilenoglicol.

Para acoplamento dos receptores ao suporte apropriado é utilizável a química conhecida dos peritos (por exemplo Bioconjugate Techniques, Greg T Hermanson, Ed., Academic Press, Inc, San Diego, CA, 1995, 785pp).

De acordo com um aspecto adicional a presente diz respeito à utilização do estojo ("kit"), de acordo com a presente invenção para disponibilização de um tratamento ou de um aparelho de tratamento da doença de Alzheimer ou para prevenção de uma doença deste tipo no âmbito da terapia de combinação de acordo com a presente invenção, na medida em que o aparelho é preparado para tratamento do respectivo doente. Na realização do tratamento o doente é conectado ao aparelho de aférese durante um tempo suficiente para eliminação efectiva de polipéptidos APP, em que o sangue ou o fluxo plasmático do doente é posto em contacto com o suporte fixo, abrangendo o receptor de ligação a APP, em_que são ligados APP e/ou os produtos de decomposição_proteolítica de APP, especialmente Αβ42. No decurso do tratamento de aférese é naturalmente de assegurar o acesso a veias periféricas ou centrais ou 23 ΡΕ1765388 fístulas arteriovenosas, assim como anti-coagulação suficiente, bem como o registo dos necessários dados de quantificação e medida. Além disso, para a maioria dos procedimentos de aférese, é necessária uma separação primária de plasma e células de sangue antes do tratamento de plasma propriamente dito. Pessoas específicas para as quais é necessário uma medida preventiva são pessoas com história familiar, pessoas idosas (>50, >60 ou >70 anos) ou pessoas com um outro factor de risco para doença de Alzheimer, particularmente factores genéticos. A invenção vai ser explicada com mais pormenor com a ajuda dos exemplos seguintes, mas obviamente sem estar limitada a eles. 1.Produção do suporte portador de receptor APP 1.1.Coluna monolítica

Uma coluna monolítica CIM® Epoxy (BIA Separa-tions, SI) é equilibrada de acordo com as intruções do fabricante com tampão Na-fosfato 0,5 M a pH 8,0 e um anticorpo monoclonal contra o péptido Αβ activado, também de acordo com as instruções do fabricante e acoplado à coluna CIM. A coluna é lavada várias vezes com tampão fosfato (+ 1M NaCl) e, sendo caso disso, ainda bloqueados os grupos epoxi em excesso. O controlo de qualidade é realizado através do 24 ΡΕ1765388 controlo no eluato de lavagem e de equilíbrio; somente as colunas sem grupos epoxi activos e sem "leakage" de anticorpos no eluato serão utilizados e montados num aparelho de aférese. 1.2.Coluna de Sepharose

Um recipiente estéril e isento de pirogénios é enchido com Material Agarose Bulk (Sepharose CL4B) de forma asséptica e o material lavado assepticamente, em que entre cada passo de lavagem o material gel é seco sob vácuo. A sepharose é em seguida esterilizado em autoclave a vapor, durante 30 minutos a 115°C.

Após a esterilização a Sepharose é retomada em 60% acetona/água num recipiente estéril e activada com CNBr e trietilamina (14 g CNBr por 96 96 ml Actona; 30 ml de trietilamina em 66,2 ml acetona 87%). Foi então adicionada uma solução acetona/HCl (392 ml de água estéril, isenta de pirogénios; 16,3 ml de HC1 5N, 408 ml de acetona) . A Sepharose activada é lavada e no intervalo de duas horas adicionada à reacção de acoplamento para evitar a hidrólise de grupos activados.

Uma solução de anticorpo (m266 ou m243) esterilizada por filtração é adicionado ao recipiente de reacção e agitado durante pelo menos 90 min. Em seguida a solução de reacção é lavada (com tampão fosfato isotónico) até que não sejam detectáveis produtos de reacção no 25 ΡΕ1765388 eluato, e a sepharose acoplada aos anticorpos enchida em colunas de vidro (com filtro de vidro sinterizado) estéreis e despirogenadas e submetidas a um controlo de qualidade final (análise de eluato no que diz respeito a produtos de reacção, metais pesados, etc.; análise de partículas, pirogenicidade; esterilidade). 2. Modelo animal para o tratamento de aférese de doentes com Alzheimer

Nos últimos anos foi desenvolvido, no instituto para diabetes "Gerhardt Katsch" em Karlsburg, Alemanha, um sistema especial extracorporal para aférese experimental em animais pequenos, livres. Com ele pode ser levado a cabo um tratamento de aférese repetidamente no mesmo animal. Os animais utilizados podem ainda ser retomados, em estudos posteriores, para a avaliação a longo prazo da terapia de aférese. A utilização destes sistemas de aférese experimentais foi demonstrada com sucesso em diversas estirpes de rato. Um tratamento de aférese repetido foi bem tolerado em ratos com diabetes-tipo 1 e artrite induzida por colagénio do tipo II, quando o seu peso corporal se encontrava acima de 250 g.

Antes do inicio da terapia de aférese experimental os animais são providos de cateteres arteriais e venosos. Num primeiro passo são, em primeiro lugar, separadas células sanguíneas e plasma por meio de um filtro. Enquanto as células sanguíneas são imediatamente 26 ΡΕ1765388 retornadas ao animal (pelo cateter venoso) o plasma separado é conduzido pelo meio de adsorção produzido no exemplo 1 (em que os ligandos são retirados do plasma por ligação a receptores imobilizados) , antes de ser retornado ao animal.

Alternativamente também pode ser realizada uma aférese de sangue total, análoga à efectuada na aférese-DALI para LDL. 3. Terapia de combinação, de acordo com a invenção em modelo animal: A terapia de combinação em modelo animal pode basicamente efectuar-se de tal modo que o efluxo de Αβ, ocorra antes, durante ou após a aférese. Além disso a frequência das aplicações de ambas as terapias juntas pode ser variada.

Lisboa, 20 de maio de 2013

Claims (3)

1. ΡΕ1765388 1 REIVINDICAÇÕES 1. Estojo ("Kit") para utilização na prevenção ou tratamento da doença de Alzheimer que compreende -um agente para induzir um sequestro de β amilóide (Αβ) no plasma, em que o agente para induzir o sequestro de Αβ no plasma é escolhido entre Gelsolina, GM1, anticorpos específicos para Αβ ou uma vacina activa ou passiva especifica para Αβ e -um aparelho para aférese, que compreende um suporte fixo contactável com o fluxo de sangue ou plasma, que apresenta um receptor que se liga à proteína-precursora de amilóide-β (Amyloid^-Precursor-Protein-APP) em que o receptor de ligação a APP é escolhido de anticorpos anti-APP, anticorpos anti-Αβ, particularmente anticorpos βη1ί-Αβ40 ou anticorpos βη1ί-Αβ42, a proteína de ligação a APP Gelsolina, apoJ ou apoE, gan-gliós idos de ligação a APP, particularmente GM1, aptâ-meros de ligação a APP ou misturas destes receptores, em que neste processo o agente para indução de um sequestro de β amilóide (Αβ) é administrado a uma pessoa, e a pessoa é tratada com o aparelho de aférese que abrange um suporte fixo, contactável com o fluxo sanguíneo ou plasmático, que apresenta um receptor de ligação à proteína precursora β- amilóide (APP), em circulação extra-corporal. Neste processo é retirada APP do sangue da pessoa por meio do aparelho de aférese. 2 ΡΕ1765388
2. 2. Estojo ("Kit") para utilização de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o suporte ser uma coluna estéril e isenta de pirogénios.
3. 3. Estojo ("Kit") para utilização de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por a vacina especifica para Αβ consistir de um péptido seleccionado de DKELR, DAEFRWP, SAEFRAT, SYEFRHH , SLEFRF , GPEFRW, EIDYHR, ELDYHR EVDYHR, DIDYHR, DLDYHR, DVDYHR, DIDYRR, DLDYRR, DVDYRR DKELRI, DWELRI, YREFFI, YREFRI, YAEFRG, EAEFRG, DYEFRG ELEFRG, DRELRI, DKELKI, DRELKI, GREFRN, EYEFRG, DWEFRDA SWEFRT, DNEFRSP, SAEFRTQ, SWEFRNP, SWEFRLY, SWELRQA SVEFRYH, SQEFRTP, SSEFRVS, DWEFRD, DAELRY, DWELRQ, GKEFRT ou SFEFRG ou compreende um péptido seleccionado de DKELR, DAEFRWP, SAEFRAT, SYEFRHH, SLEFRF, GPEFRW, EIDYHR, ELDYHR, EVDYHR, DIDYHR, DLDYHR, DVDYHR, DIDYRR, DLDYRR, DVDYRR, DKELRI, DWELRI, YREFFI, YREFRI, YAEFRG, EAEFRG, DYEFRG, ELEFRG, DRELRI, DKELKI, DRELKI, GREFRN, EYEFRG, DWEFRDA, SWEFRT, DNEFRSP, SAEFRTQ, SWEFRNP, SWEFRLY, SWELRQA, SVEFRYH, SQEFRTP, SSEFRVS, DWEFRD, DAELRY, DWELRQ, GKEFRT ou SFEFRG. Lisboa, 20 de maio de 2013 1 ΡΕ1765388 REFERENCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO Esta lista de referências citadas pelo requerente é apenas para conveniência do leitor. A mesma não faz parte do documento da patente Europeia. Ainda que tenha sido tomado o devido cuidado ao compilar as referências, podem não estar excluídos erros ou omissões e o IEP declina quaisquer responsabilidades a esse respeito. Documentos de patentes citadas na Descrição US :5817528 A US 6930614 A EP 110409 A DE 3817672 A > US 6551288 B * WD £084056318 A * US 5476716 A US 6536614 A Literatura que não é de patentes citada na Descrição ♦ RGHER «t aí. g*Amytefd-(1 -42) is a major compor» ní of cerebrovascufer amyfokf deposite: ImpBeatone for ihs paíhofogy of Aísb«imsr‘s diaease. PMAS, 1:983., vai. SG., 10838 ♦ GAMES et ai. Akhefcnsr-type Raurcpathaíegy io fasnsgenlc mies cvBrsxpressífig: W17F g-amyteíd precursor prcteíri, «afore, 1895, vai. 373.523 « SCHEteK et ai. ímmunize&os wffit amyioid-j} aftenu- ates ASzheífíier díssaseí&e paihoiogy io the PDAPP moLtse. Naitsre. 1SS9, vol. 400. 173 ♦ 8ARD et aí. PeripheraRy admttesiered adibodtes againat aasytosd 3-pepikfe enier lhe esníraí nervous sysfero and reduce paíhdcgy in a maus» mede! of Afzhróner dsssase. «afore Sfed., 2000, voi. 6. 316 ♦ JAKU5 *1 sf- Ag peptlde immursszattof! rsducss be-havseufaí impamnent and pisques i» a modsí aí AfcbeiraerA disease, Nbfore, 2806, vai. 408, 379 ♦ Ínsakíbfe probiam?. «afore Msd,, 2002. vc4 8, 1S1 ♦ BSCLAURÍN et ai. Thefapeidícaiíy effactive adibod-fes agatnst aroyicsd-S paptide tangei arayfcíd-g residires 4-1 ôand tehibií cyctotoxírity andfibrSÉogímesss. «afore Afed, 2002. vd. 8. 1263 » HOCK d ai. Gsneretion of aniíbodies spessSc for p-af^yieid by vesdnalton of pstsenis wdb AízheirTier dteease. «sfore Ãfeaf.» 2002. wl. 8,1270 ♦ WALSH «t aí. Msteraiiy secreísd cisgamers of arey-faid g protela pstentiy iríhibít htppocsfnpsí torsg-1ssrri potsníte&n m vivo. Afafore, 2002, vet 418. 635 * VO« WGLFE, «afore Remw® Drag Discov&y, 2002. voi. 1, 850-866 * DE MATTOS et al. P«4S, 2001, vol. 98 (15}, 8650-8855 * SSASOOKA et aí. Joamsi of Atearescrèmce, 2003. 29-33 * RE&ÍEKE et al. Ídemíftesfen d dísiíswt anfibsdy epitppes and mimofòpes ftom a pepifeie arrayof 5S20 randomiy generated sequentes, J. imnrittnai Meifr-ods. 2002. voí, 287. 37 * Sioi Ch&m.. yd. 353, 631 * smm et »L Atst. BblscÍp 1399. vol. 17,1075-1081 ·> ΟΉΑβΑ» et ai. «afore Rsviews. Dmg Diecovsry. 2003, vos. 2 (9), 727-735 « MATSUOKA et ai JoumsS of «eoroscrêfw», 2903. 29-33 * DEJRATTOS et aí. PNfíS. 2001, voL m {15}, 8865-6855 * WOOD et ai. FNAS, 1997, 1550-1555 * BARD et aí. NsSssre Medksne. 2000, 316-913 « BiíRGSTALLER et aí, Cursr. Opin, Diug Discav. Dsv.. 2902. vd. 5 (5), 630-700 * FAMULOK et aí. Aoc. Cimo. Rss., 2900, vos 33, 591-590 * MAYER et al. PHAS, 2001, voí. 98.4361-4985 * Bbcotnjugste Techníques. Acadendc Press, ínc. 1995, 785