PT1704860E - Derivados de benzamidina para o tratamento e prevenção da mucosite - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

DERIVADOS DE BENZAMIDINA PARA O TRATAMENTO E PREVENÇÃO DA

MUCOSITE

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Embora tenham sido feitos avanços significativos no tratamento de pacientes submetidos a quimioterapia e radioterapia, muitos efeitos secundários gastrointestinais debilitantes continuam a ser aspectos críticos com impacto no tratamento do doente. Além dos vómitos, náusea e diarreia, um fenómeno adverso clinicamente relevante é representado pela mucosite. A mucosite é o resultado de um processo complexo de fenómenos biológicos interactivos que ocorrem, tanto no epitélio, como na submucosa, levando à destruição do epitélio da mucosa, o que resulta em ulcerações, essencialmente nas membranas mucosas que revestem o tracto oral e digestivo. A mucosite resulta em dor severa, qualidade de vida reduzida, hospitalização prolongada, risco aumentado de infecção local e sistémica; isto é uma consequência ainda mais grave da mucosite, uma vez que as lesões podem actuar como locais de infecção secundária e como portas de entrada para microorganismos orais endógenos. Deste modo, a mucosite é um factor de risco significativo para a infecção sistémica com risco de vida (que pode ser exacerbado por neutropenia concomitante; outro efeito secundário associado à quimioterapia) e compromete muitas vezes a nossa capacidade de tratar o cancro subjacente, por atrasar ou truncar a terapia anti-cancro e/ou impedir a recuperação. A quimioterapia de dose elevada e a terapia de radiação afectam selectivamente as células de divisão rápida, tanto as 1 cancerosas, como as não cancerosas. Tanto as células mucosais normais, como as malignas partilham esta característica de crescimento rápido ou ciclização; a renovação celular rápida apresentada pelo revestimento mucosal também é comum a outros tecidos normais, tais como células sanguíneas, cabelo e pele que também são afectados pelas terapias anti-cancro. Deste modo, a quimioterapia e terapia de radiação que são dirigidas para interromper o crescimento de células cancerosas também afectam as células de proliferação rápida no corpo, tal como o revestimento mucosal. Esta explicação amplamente aceite justifica porque a mucosite muitas vezes surge como complicação moderada a grave da terapia antineoplásica, tal como quimioterapia e ou terapia de radiação contra o cancro (M. Duncan, Grant G., Aliment. Pharmacol. Ther., 18 , 9 , 853-74, 2003) .

As mucosites melhor descritas são as que ocorrem na boca (mucosite oral, OM) e no tracto gastrointestinal (GI) (mucosite Gi, GIM), a OM é uma condição dolorosa que dificulta significativamente a mastigação e deglutição, enquanto que a GIM cada vez mais se revela como toxicidade associada com muitos regimes de quimioterapia de dose convencional, normalmente utilizados no tratamento de cancro (a mucosite induzida por quimioterapia está presente em 40-100% dos pacientes) e com radioterapia dirigida para qualquer parte do tracto GI. O intestino delgado é o mais afectado, mas também o esófago, estômago e intestino grosso podem ser afectados.

Uma vez que a mucosa da cavidade oral e do tracto gastrointestinal partilham uma origem e desenvolvimento embriológico comuns, é provável que partilhem uma patogénese 2 básica com apenas algumas diferenças devido a componentes funcionais específicos do tracto intestinal. O dano no intestino é semelhante ao dano que ocorre na mucosa oral, mas actua a uma velocidade muito maior. À semelhança da OM, a GIM não é apenas devido a um efeito de citotoxicidade da radioterapia, mas a uma soma de efeitos directos (morte celular clonogénica e apoptótica) e indirectos (alterações reactivas). A toxicidade aguda no GIM pode ser devida em grande parte à morte de células da cripta, resultando na degradação da barreira mucosal (Sonis ST et al., Câncer, suppl. 100, 9, 1995-2025, 2004). Este efeito secundário pode ser o resultado de um efeito directo ou mediado por uma série de passos intermédios, uma vez que a morte de células da cripta poderia ser uma consequência de apoptose endotelial que, tal como na mucosite oral, se torna no fenómeno primário. Como referido anteriormente, muitos agentes quimioterapêuticos matam as células em divisão rápida, tornando o tracto Gl particularmente vulnerável, mas de forma diferente da radiação, a mucosite induzida por quimioterapia tem-se focado essencialmente no intestino delgado. Os agentes citotóxicos actuam a diferentes níveis da hierarquia das células da cripta, levando a hipoplasia da cripta, seguida de regeneração. A primeira anomalia observada no intestino delgado humano é um aumento na apoptose no dia 1 após a quimioterapia; este é seguido por redução no tamanho da cripta, área de vilosidades e índice mitótico, que atinge a sua redução máxima no dia 3. A hiperplasia Rebound segue-se no dia 5, antes da normalização. Embora mais fenómenos moleculares tenham sido elucidados na patogénese da mucosite oral em relação ao seu equivalente no GI, a cavidade oral e o 3 tracto GI têm homologia suficiente para se esperar que o dano da barreira mucosal no tracto GI e na mucosa oral partilhem mecanismos semelhantes (Sonis ST et al, Câncer, suppl. 100, 9, 1995-2025, 2004) .

Apesar da mucosite representar um resultado clinico devido a uma interacção complexa da toxicidade do tecido local (tecido conjuntivo, endotélio, epitélio) induzida por quimioterapia ou radiação e poder ser vista como diferentes patologias, esforços científicos recentes nesta área revelaram o modo como um esquema mecanístico comum pode ser reconhecido para a base fisiológica da mucosite.

De facto, a evolução do dano da barreira mucosal pode ser vista como um processo de cinco fases: a fase inicial (passo 1) é caracterizada pela produção de espécies de oxigénio reactivas (ROS). Isto é suportado por estudos que descrevem uma atenuação do dano mucosal induzido por agentes que bloqueiam ou neutralizam radicais livres de oxigénio (Facorro G et al., Bone Marrow Transplant., 33, 8, 793-8, 2004, Sonis ST et al., Câncer, suppl. 100, 9, 1995-2025, 2004). A segunda fase (passo 2) é caracterizada por uma série de múltiplos efeitos resultantes do estresse oxidativo. Embora as ROS possam danificar directamente o ADN (levando assim à morte celular clonogénica subsequente), o efeito mais marcante mediado pela ROS é a amplificação do dano, por estímulo de vários factores de transcrição (Sonis ST et al., Cell Prolif., 35, Suppl 1:93-102, 2002). De entre estes, o factor nuclear -kB (NF-kB) tem sido referido como o elemento chave na génese da mucosite (Sonis ST, Nat rev Câncer, 4, 4, 277-284, 2004) . O NF-kB é activado por quimioterapia, ou radioterapia e é capaz de supra-regular um grande painel de 4 genes, incluindo os que resultam na produção de citocinas pró-inflamatórias TNFa , IL-1 e IL-6, levando todas a apoptose e dano tecidular e à supra-regulação de genes que pode levar à expressão de moléculas de adesão, ciclooxigenase-2 e iNOS. O efeito dos produtos de COX-2 e iNOS na amplificação da degeneração tecidular na mucosite induzida por radiação, experimental, foi recentemente descrito em detalhe (Sonis ST et al., Oral Oncol., 40, 2, 170-6, 2004; A terceira fase (passo 3) caracteriza-se pela amplificação do sinal desencadeado por citocinas pró-inflamatórias que podem activar diferentes vias, tais como as vias da ceramida e caspase, levando todas a um novo aumento nas citocinas pró-inflamatórias. O quarto passo (passo 4) caracteriza-se pelos sintomas de destruição da barreira mucosal devido a ulceração do tecido. Durante esta fase, há uma infiltração massiva de células inflamatórias e colonização sustentada por bactérias gram-positivas e gram-negativas. Os produtos da parede celular de bactérias podem, por sua vez, activar o infiltrado de tecido celular e exacerbar a reacção inflamatória. Esta fase é muito crucial para a continuação da terapia de cancro e representa um risco grave de bacteriemia e/ou infecções por fungos. A fase final (passo 5), que ocorre apenas na ausência de infecções, representa a fase de cura, que tem inicio na matriz extracelular e leva à renovação da proliferação e diferenciação epitelial. Após a fase de cura, a mucosa oral parece normal: no entanto, o meio ambiente mucosal foi alterado e os pacientes estão em risco de ter um novo episódio durante a terapia anti-cancro. 5

Este cenário biológico complexo, que mostra como a mucosite deve ser considerada como resultado de efeitos cumulativos e interactivos de quimioterapia e/ou radiação com tecido conjuntivo epitelial, endotélio, citocinas pró-inflamatórias, elementos celulares na mucosa, bem como infecções concomitantes, pode explicar porque o tratamento da mucosite tem sido tão empírico e, devido à falta de um tratamento especifico e eficaz, tem levado quer à cessação da terapia anticancro, quer consistido de uma intervenção paliativa e de suporte (Rubenstein EB, et al., Câncer suppl., 100, 9, 2026-2046, 2004; Worthington HV et al. Cochrane Review, 3, 2004). A patente WO99/45910 descreve um método para tratar a mucosite por uma mistura de agentes terapêuticos, tais como NSAID, um inibidor de MMP, um inibidor de NO, um inibidor de mastócitos e um inibidor de citocina inflamatória. No entanto, não há evidência experimental de eficácia terapêutica destas misturas.

Para a OM é amplamente aceite que uma boa higiene oral reduz o risco. Os protocolos de cuidados orais são muito utilizados com a finalidade de manter a saúde e integridade orais, para reduzir o impacto da flora microbiana oral e para reduzir sintomas, tais como a dor e sangramento e impedir infecções de tecido mole que podem ser efeitos sistémicos. Em pacientes submetidos a transplante de células hemocitoblásticas hematopoiéticas o tratamento de escolha para controlo da dor é a analgesia com morfina. Outras abordagens incluem a utilização de analgésicos sistémicos e mistura paliativa de agentes, agente de revestimento e analgésicos tópicos. Não há evidência significativa da 6 eficácia desta mistura. Em pacientes com cancro da cabeça e pescoço tratados com radioterapia moderada o protocolo farmacológico preventivo sugere a utilização tópica de benzidamina, devido a estes efeitos anti-inflamatórios, além das suas propriedades analgésicas e anestésicas. Apesar da benzidamina ter sido extensivamente estudada, não há ensaios definitivos que confirmem a sua actividade na prevenção ou cura da mucosite induzida por radioterapia. Além disso, para tratar a mucosite induzida por quimioterapia: apenas estão disponíveis protocolos paliativos. Para quimioterapia de dose elevada, o protocolo recomenda terapia laser de baixo nível (LLLT) numa tentativa de reduzir a incidência de mucosite. Foi referido que a LLLT promove a cura de feridas e reduz a dor e inflamação. No entanto, este tipo de intervenção requer um equipamento específico, muitas vezes dispendioso, treino especializado e o tratamento pode ser demorado. Por fim, é sugerido que um fármaco reduz a esofagite induzida por quimioterapia e radioterapia combinadas, i.e. a amifostina, devido à sua actividade radioprotectora referida. A amifostina actua como um neutralizador de ROS potente, mas infelizmente este fármaco tem muitas características negativas: ele necessita de administração iv e tem toxicidade aguda. A FDA aprovou a sua utilização clínica apenas para redução de toxicidade renal associada com terapia de cisplatina, em pacientes que têm cancro dos ovários ou cancro do pulmão. Apenas muito recentemente a FDA aprovou a utilização de factor de crescimento de queratinócitos recombinante humano (rHu-KGF; palifermina), que, ao aumentar a proliferação, diferenciação e migração de células hemocitoblásticas epiteliais, assegura uma maior probabilidade de sobrevivência de células epiteliais e aumenta a velocidade de regeneração celular. A utilização de 7 palifermina é no entanto restrita ao tratamento de mucosite apenas em pacientes adultos com malignidades hematológicas submetidos a terapia mielotóxica que necessitem de transplante de células hemoticoblásticas hematopoiéticas (a segurança e eficácia de palifermina no tratamento de mucosite não foi estabelecida em pacientes adultos com malignidades não hematológicas, nem em crianças com ambas, malignidades hematológicas e não hematológicas).

Devido à falta de tratamentos farmacológicos eficazes, a incidência de mucosite é bastante elevada em pacientes submetidos a quimioterapia e/ou terapia de radiação ou irradiação de corpo inteiro (sendo esta última um procedimento de pré-condicionamento de rotina antes de transplante de medula óssea).

A incidência de mucosite oral e do GI varia entre regimes de terapia (Sonis ST et al, Câncer, suppl. 100, 9, 1995-2025, 2004): os regimes baseados em antraciclina foram associados com 1-10%, bem como para pacientes com cancro da mama ou linfomas não Hodgkin, cujos regimes não incluíam 5-FU. Pelo contrário, a quimioterapia incluindo 5-FU foi associada com mais de 15 % de mucosite oral e a quimioterapia com CPT-11 foi associada com a mesma taxa de mucosite do GI. A adição de radiação à quimioterapia aumentou o risco para mais de 30%. A frequência e gravidade de mucosite oral e do GI em pacientes submetidos a quimioterapia de dose elevada combinada com irradiação de corpo inteiro com transplante de células hemocitoblásticas hematopoiéticas pode ocorrer em até 100% destes pacientes e caracteriza-se por dor, dificuldade em engolir, até uma necessidade de nutrição parentérica total, febre, risco de infecção e mesmo até sepsia fatal. A 8 terapia de radiação na cabeça e pescoço estava associada com uma incidência ainda maior de mucosite oral ou do GI, muitas vezes excedendo 50 % dos pacientes. A mucosite com frequência e gravidade elevadas também está presente em pacientes com malignidades do GI ou ginecológicas. O dano agudo da mucosa do tracto GI é uma consequência da radioterapia em 85-100 % dos pacientes.

Esta incidência significativa de mucosite em pacientes submetidos a tratamento para o cancro também se reflecte num custo social relevante, que inclui uma maior utilização dos recursos de cuidados de saúde, devido à redução na taxa de cura como resultado da redução da dose de terapia anti-cancro, prolongamento da hospitalização devido a febre, utilização de narcóticos e nutrição parentérica.

Por fim, apesar de numa extensão menor, a mucosite não é restrita apenas a pacientes de cancro, uma vez que esta doença também afecta pacientes com vih, pacientes afectados com linfoma não Hodgkin, pacientes idosos debilitados.

Consequentemente, persiste uma necessidade de novas terapias eficazes no tratamento e prevenção da mucosite.

DESCRIÇÃO GERAL DA INVENÇÃO O objecto da invenção é definido nas reivindicações anexas. A presente invenção refere-se à utilização de um composto de fórmula (I) para preparar um medicamento ou composições farmacêuticas contendo uma quantidade eficaz do 9 referido composto, para o tratamento e/ou prevenção da mucosite.

Os compostos de formula (I) representam um grupo seleccionado de compostos anteriormente descrito no pedido de patente internacional W002/070468, do nosso grupo, e reivindicados para o tratamento de doenças inflamatórias e auto-imunes. A presente invenção refere-se à descoberta de que um grupo seleccionado de derivados de benzamidina, os de fórmula (I) como referido acima, são particularmente adequados para o tratamento e/ou prevenção da mucosite, particularmente da mucosite induzida por quimioterapia e/ou radioterapia.

Como se pormenoriza a seguir, os compostos de fórmula (I) são capazes de interferir eficazmente com cada uma das fases da mucosite, como descrito na arte anterior, proporcionando assim uma ferramenta farmacológica altamente eficaz para a prevenção e tratamento da mucosite.

Mais pormenorizadamente, tal como referido na arte anterior, a mucosite (quer OM quer GIM) tem uma via degradativa comum que envolve cinco fases ou passos. 0 primeiro passo é representado pela acção de ROS que desencadeia uma série complexa de fenómenos que caracterizam o segundo passo, no qual, além da morte celular clonogénica, a activação de factores nucleares (em particular NF-kB) leva à produção de citocinas juntamente com outros agentes pró-inflamatórios (de entre estes, PGE2 o produto principal de COX-2). Durante o terceiro passo, o sinal desencadeado pelas citocinas é amplificado, originando a propagação do dano que 10 em última análise leva à ulceração do tecido. No quarto passo, ocorre a destruição da barreira mucosal e durante esta fase há uma colonização bacteriana massiva e infiltração de células inflamatórias; finalmente, durante o quinto passo, na ausência de infecção, ocorre a cura.

Os compostos de formula (I) apresentam um efeito notável na prevenção da formação de ROS em células humanas, actuando assim no passo 1, prevenindo o processo que desencadeia a mucosite. Além disso, o efeito dos compostos da presente invenção prolonga-se até ao passo 2, como sublinhado pelo efeito inibitório na produção de citocinas juntamente com outros compostos pró-inflamatórios endógenos, tais como prostaglandinas (PGE2) e óxido nitrico (NO). Adicionalmente, verificou-se que os compostos de formula (I) são fortemente eficazes em reduzir a morte de hemocitoblastos clonogénica. Deste modo, actuando quer no passo de iniciação, quer no passo de propagação subsequente, os compostos de fórmula (I) são agentes adequados quer para a prevenção, quer para o tratamento da mucosite. Evitar ou reduzir quer o insulto, quer a propagação subsequente do estimulo pró-inflamatório, estes compostos exercem a sua actividade também no passo 4, prevenindo e tratando o dano concorrente nas células epiteliais basais e a consequente degradação mucosal, que é crucial para a colonização bacteriana, eles também podem prevenir indirectamente a infecção. Por fim, os compostos de formula (I) mostraram ter propriedades de protecção mucosal e cura de feridas espantosas, pelo que estes compostos também são capazes de actuar durante a fase de cura (passo 5).

Consequentemente, a presente invenção refere-se a uma nova terapia farmacológica para tratar e prevenir a mucosite, 11 que consiste em administrar a um humano necessitado, uma formulação farmacêutica aceitável de uma quantidade eficaz de um composto de fórmula (I), ou do seu sal ou um seu solvato, farmaceuticamente aceitável. 0 termo "prevenir" significa aqui qualquer acção profiláctica com o objectivo de evitar, inibir, ou restringir o desenvolvimento de mucosite num paciente necessitado. 0 termo "tratar" inclui proibir o desenvolvimento da doença, parar ou reverter a sua progressão, diminuir a gravidade ou sintomas clínicos resultantes da doença, bem como qualquer melhoria no bem-estar dos pacientes. 0 termo "mucosite" tem o mesmo significado que o descrito na arte anterior e refere-se a mucosite oral, mucosite gastrointestinal, urogenital e mucosite do tracto nasal. 0 paciente tratado com composições farmacêuticas dos compostos da invenção pode ser um paciente de cancro em preparação para ser submetido a quimioterapia ou terapia de radiação, ou um paciente de cancro actualmente submetido a quimioterapia ou terapia de radiação, ou um paciente em preparação para transplante de medula. Adicionalmente, pacientes de VIH, pacientes afectados com linfoma não-Hodgkin, pacientes idosos debilitados, em risco de sofrer de mucosite, podem ser tratados com métodos e composições da presente invenção.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO 12 A nova utilização da invenção refere-se aos seguintes compostos:

Compostos de formula (I): R4 R3

R2— (C)n— A. H

R5 H em que: - A é o grupo tiocarboxamida, - Ri é seleccionado de entre um grupo alquilo com 1 a 3 átomos de carbono e o grupo amino; não substituído ou substituído com o grupo nitro ou o grupo metilo, - R2 é seleccionado independentemente de entre hidrogénio, um grupo alquilo tendo de 1 a 4 átomos de carbono, um resíduo de cicloalcano tendo de 5 a 7 átomos de carbono, um grupo arilo, naftilo, ou heterocíclico, não substituído ou substituído com metilo, metoxi, hidroxi, amino ou halogéneo, - R3 e R4 são seleccionados independentemente de entre hidrogénio e um grupo alquilo com 1 a 3 átomos de carbono, - R5 representa um ou dois substituintes independentemente seleccionados de entre hidrogénio, e grupos metilo, metoxi e hidroxilo, - n é um número inteiro de 0 a 6, e 13 - o grupo amidina está na posição para ou meta em relação ao grupo "A-NH".

Nos compostos de fórmula (I), R2 está de preferência ligado a A através de um grupo alquileno com 1 a 6 átomos de carbono, opcionalmente substituído com um ou mais grupos alquilo tendo de 1 a 3 átomos de carbono.

No composto de fórmula (I), um grupo arilo é um fenilo substituído ou não substituído; um grupo heterociclico é um heterociclo aromático monociclico ou biciclico contendo 1 ou 2 átomos de azoto, ou um heterociclo aromático monociclico ou biciclico contendo 1 átomo de oxigénio ou enxofre.

Exemplos não limitativos de grupos heterocíclicos são piridina, furano, tiofeno, quinolina, benzofurano e benzotiofeno.

Os compostos de formula (I) utilizados na presente invenção podem ser preparados de acordo com procedimentos estabelecidos no documento W002/070468, sendo estes procedimentos aqui resumidos, para referência. Em geral, o processo tem inicio com a reacção da fenilenodiamina de formula (IV) substituída de forma adequada (esquema 1) que é reagida com o isotiocianato de fórmula (V a) correspondente, para originar respectivamente a tioureia de fórmula (m a) correspondente. Os compostos de formula (III) são em seguida reagidos com o cloridrato de imidato de fórmula (II) adequado, para se obterem os compostos de fórmula (I). 14

Esquema 1

Exemplos representativos, não limitativos, de compostos de fórmula (I) da presente invenção estão descritos a seguir e na tabela 1 : N-[4-(N-acetamidina)fenil]-N'-pentil tioureia (composto 1.1) - 1-guanidinofenil-4-ciclohexil tioureia (composto 1.2) - 1-nitroguanidinofenil-4-ciclohexil tioureia (composto 1.3) - N-[4-(N-acetamidina)fenil]-N'-butil tioureia (composto 1.4) N-[4-(N-acetamidina)fenil]-N(3-metilbutil) tioureia (composto 1.5) N-[4-(N-acetamidina)fenil]-N'-[2-(4-fluorofenil)etil) tioureia (composto 1.6) N-[4-(N-acetamidina)fenil]-Ν' -[2-(4-clorofenil)etil) tioureia (composto 1.7) 15

Tabela 1: R4

R5 k' r N^m R2— (C)n— An

I R3

H

Composto jRi |r2 í R3/R4 |n A 1.1 1 ch3 ]ch3 (h | 4 NH-CS 1.2 |nh2 1 ciclohexil |° NH-CS 1.3 |no2-nh | ciclohexil !° MWWWWWWWWWWWWVkVkY NH-CS — -------í----------------------------------------------- — — I—1 |ch3 |ch3 |H 13 NH-CS 1.5 |ch3 \ isopropil ]h ]2 NH-CS 1.6 1 ch3 > 4-F-fenil |h i2 NH-CS 1.7 |ch3 | 4-Cl-fenil |h j2 NH-CS R5 é sempre H nestes compostos; os dois substituintes fenilo N-H estão sempre em posição para.

Os sais farmaceuticamente aceitáveis de compostos de formula (I) podem ser particularmente adequados para a preparação de composições farmacêuticas úteis para o tratamento de mucosite, uma vez que têm solubilidade em água melhorada, em comparação com o composto do qual derivam. Como descrito a seguir, para o tratamento e/ou prevenção da mucosite, além das formulações orais usuais, tais como comprimidos, cápsulas e pílulas, os xaropes, lavagens orais, geles ou emulsões também podem ser formulações úteis para o tratamento desta doença. Adicionalmente, é essencial uma solubilidade em água considerável para um formulação adequada de formas de dosagem para administração parentérica, 16 adequadas para o tratamento das formas mais graves desta doença. Por fim, uma solubilidade em água melhorada também pode melhorar a adsorção de formulações orais.

Os sais do composto de formula (I) são tipicamente formados reagindo um composto de fórmula (I) com uma quantidade equimolar, ou em excesso, do ácido adequado.

Exemplos representativos, não limitativos, de sais dos compostos de fórmula (I), farmaceuticamente aceitáveis são: cloridrato, bromidrato, hidrogenossulfato e sulfato, metanossulfonato, maleato, fumarato e succinato.

De modo a proporcionar exemplos sobre o impacto na solubilidade exercido por diferentes sais do composto de fórmula (I) farmaceuticamente aceitáveis, a preparação do maleato e do metanossulfonato de composto 1.1 é aqui descrita como um exemplo representativo, não limitativo. N-[4-(N-acetamidina)fenil]-Ν'-pentiltioureia maleato 0 composto 1.1, lg (3,59 mmoles), é suspenso em acetato de etilo (30 mL), em seguida uma solução de ácido maleico, 416 mg (3,59 mmoles) em metanol (10 mL) é adicionada sob agitação, à temperatura ambiente. A solução resultante é agitada à temperatura ambiente durante 10 minutos, em seguida concentrada sob vácuo, o resíduo resultante é tratado com uma mistura de acetato de etilo (10 mL) e éter isopropilico (10 mL), o precipitado resultante é filtrado e seco para se obter 1.1 g do maleato. 17 p.f. 2150 C; IV: 1681, 1622, 1543, 1511, XHRMN (DMSO-de), ppm: 0,90 (t, 3H, J= 6,2Hz); 1,31-1,36 (m, 4H); 1,53-1,59 (m, 2H); 2,32 (s, 3H); 3,37-3,48 (m, 2H); 6,06 (s, 2H); 7,25 (d, 2H, J= 8,2); 7,69 (d, 2H, J= 8,2 Hz); 7,94 (m, 1H); 8,48 (bs, 1H); 9,43 (bs, 1H); 9,73 (bs, 1H) ; 11, 1 (s, 1H); 14,3 (s, 1H). N-[4-(N-acetamidina)fenil]-Ν'-pentiltioureia metanossulfonato

Este sal é preparado a partir de lg do composto 1,1 e 0,23 mL (3,59 mmol) de ácido metanossulfónico utilizando o mesmo procedimento como referido acima para o maleato. IV: 1676, 1627, 1544, 1511. XHRMN (DMSO -d6) , ppm: 0,93 (t, 3H, J= 6,0Hz); 1,30 -1,38 (m, 4H) ; i,5i-i ,59 (m, 2H); 2,30 (: 3, 3H) ; 2 ,39 (s, 3H) ; 3,40-3 ,48 (m, 2H); 7, 23 (d, 2H, j= 8,9); 7, 69 (d, 2H, J= = 8,9 Hz) ; 8 ,04 (m, 1H); 8, .50 (bs, 1H); 9,43 (bs, 1H) ; 9,79 (bs, 1H);11 ,05 (s, 1H) . O cloridrato do composto 1.1 é preparado como descrito no documento W002/070468. A solubilidade em água, a 25°C, para os exemplos representativos de sais do composto 1.1 está descrita na tabela a seguir: 18

Sais para o composto Solubilidade em água j Solubilidade em 1.1* (mg/mL) j água (%) Cloridrato 9,0 j 0,90 Maleato Í7l2 j 0,31 Metanossulfonato >32 j >32 (*) 0 composto 1.1 não é solúvel em água como base livre.

Actividade farmacológica

Verificou-se que os compostos da invenção inibem a produção de ROS em leucócitos polimorfonucleares humanos (PMNL), para inibir a produção de citocinas, expressão de proteínas iNOS e COX-2, como determinado num modelo de rato "in vitro", para proteger a mucosa e apresenta propriedades de cura de feridas, tal como determinado num modelo de rato de ulceração da mucosa gástrica induzida por indometacina. Por fim, os compostos da invenção aumentam a sobrevivência de células da cripta, tal como avaliado num modelo de mucosite "in vivo", em ratinhos.

Como exemplo não limitativo, representativo, apresentam-se a seguir os dados farmacológicos para o composto 1.1.

Inibição da produção de ROS em PMNL humano:

Antecedentes do ensaio: Um dos fenómenos mais importantes envolvidos na cascata intracelular que leva à activação de NF-kB é a produção de estresse oxidativo e o aumento de ROS; a inibição destas espécies pode contribuir para reduzir o dano directo do ADN e a morte celular 19 clonogénica, subsequente e também diminuir a activação de factores de transcrição. 0 efeito do composto 1,1 no ensaio quimiluminescente dependente de luminol foi determinado em PMNL humanos. Os dados são apresentados na figura 1.

Inibição de citocinas em macrófagos peritoneais de rato.

Antecedentes do ensaio: factor nuclear-KB(NF-KB), um elemento chave na génese da mucosite, tem a capacidade de supra-regular um grande painel de genes, incluindo os que resultam na produção de citocinas pró-inflamatórias, TNFa, IL-1 e IL-6, todos levando à apoptose e dano tecidular e a supra-regulação de genes que podem causar a expressão de iNOS e ciclooxigenase-2. A terceira fase da mucosite é de facto caracterizada pela amplificação da sinalização desencadeada por citocinas pró-inflamatórias. 0 efeito do composto 1.1 foi determinado em macrófagos peritoneais de rato. Os dados são apresentados na tabela 1 e 2.

Tab. 1: inibição da libertação de citocinas induzida por lps pelo composto 1.1, em macrófagos peritoneais de rato IC50 (μΜ) Exemplo IL-β H r* 1 σι TNFa Composto 1.1 j 30 μΜ | 63 μΜ j 54 μΜ Tab. 2: Inibição da expressão de proteínas iNOS e COX-2 induzida por LPS, pelo composto 1.1, em macrófagos de rato 20

inibição

Tratamento s iNOs s COX-2 0 | 0 79 j 53 ;LPS, 0,lpg/ml, 24h ;LPS, 0,lyg/ml + Composto 1.1, 30μΜ Úlcera gástrica induzida por indometacina no rato: Propriedades de cura de feridas do composto 1.1 A indometacina induz a formação de lesões mucosais gástricas agudas. 0 dano histológico é representado por necrose com perda de epitélio de superfície, edema submucosal e infiltração de leucócitos. 0 mecanismo envolve um processo dependente de neutrófilos que induz uma variedade de mediadores inflamatórios, tais como espécies de oxigénio reactivas e acção prejudicial directa pela indometacina em processos ligados à proliferação epitelial e apoptose. 0 processo de reparação epitelial é devido à continuidade de células epiteliais com células saudáveis de porções gástricas que podem migrar para a membrana basal; a reepitelilização e reconstrução da arquitectura mucosal está sob o controlo de factores de crescimento produzidos localmente por células regeneradoras. 0 efeito do composto 1.1 foi determinado na mucosa gástrica de rato. Os dados são apresentados na Figura 2.

Por fim, a eficácia in vivo dos compostos da invenção foi demonstrada num modelo de mucosite no ratinho. 21

Modelo de mucosite de ratinho

Pensa-se que existem entre quarto e dezasseis hemocitoblastos efectivos em cada cripta do intestino delgado. Também há outra reserva de células clonogénicas que são capazes de regenerar a cripta quando todos os hemocitoblastos efectivos foram mortos. A sobrevivência destas células clonogénicas é portanto chave para a sobrevivência da cripta e a recuperação de um revestimento epitelial intacto após dano citotóxico (apenas é necessário que uma célula clonogénica sobreviva para assegurar a sobrevivência da cripta, e, deste modo, a manutenção de um epitélio intacto). Podem-se utilizar factores de crescimento e outras moléculas para manipular a sensibilidade destas células a agentes citotóxicos e, deste modo, reduzir a gravidade da mucosite gastrointestinal e oral. Os factores dados antes de um insulto citotóxico podem aumentar o número de células clonogénicas (aumentando deste modo a probabilidade de sobrevivência clonogénica) ou actuam para parar o ciclo celular nestas células (tornando-as deste modo mais resistentes ao dano ou morte). Os factores dados após o insulto podem iniciar a amplificação ou proliferação precoce de hemocitoblastos e deste modo acelerar o processo de regeneração. Uma combinação de ambos os protocolos poderia originar uma protecção máxima do epitélio.

Este estudo analisou, portanto, a eficácia do composto 1.1 na protecção de células clonogénicas e, deste modo, das criptas, contra o dano induzido por radiação. Os efeitos de administração durante 3 dias antes da exposição a radiação foram testados. 22 0 efeito protector está resumido na Figura 3 e detalhado na tabela 3. 0 composto 1.1 a 20mg/kg preveniu a ausência de criptas sobreviventes (como observado em 4% da circunferência em ratinhos tratados com veiculo), e aumentou a percentagem de criptas sobreviventes por circunferência.

Tabela 3. Efeito do composto 1.1 na morte de células de cripta clonogénicas induzida por irradiação de corpo inteiro, em ratinhos.

Tratamento 3 no. Criptas/ Largura da ΪCriptas 3circunferência cripta (vim) í/circunferênci | 3 ja corrigidas j 20mg/kg Composto média 313,2 +/- 5,7 66,19+/-3, 0 j 6,7+/-3, o”""™] 1.1 durante 3 +/- dp | \ | dias pre 3 V irradiação com ^ | 13Gy 3 10mg/kg Composto »v»v*v»v»v»v»v»v»v»v»v»^sv»v»v»v»v»v»v»v»v»v»v»v»v»v»v»v»v»v»v»v»v»v»v»·» média $9,2 +/-4,7 'V»v»sv»v»v»v»v»v»v»v»v»sv»v»v»v»\^\v»v»v»^v»v»v»v»v»v»v»v»\v»v»v»v»v»v»v»v»v»"»sv»v»v»v»v»v3 68,25+/-2,4 j 4,5+/-2,4 j 1.1 durante 3 +/- dp | 1 | dias pre 3 \ | irradiação 13Gy $ 1 5mg/kg Composto média 39,6+/-3,4 68,54+/-6, 6 U,7+/-1,3 1.1 durante 3 +/- dp ^ | | dias pre | 3 I irradiação com - 3 3 1 13Gy | I Controlos de média 37,2+/-3,9 68,92+/-6,1 j3,5+7-T79 j veículo, +/- dp | 3 3 irradiação 13Gy 3 3 23

Tratamento mo. Criptas/ ;circunferência Largura da\Criptas cripta (pm) j/circunferênci ja corrigidas Controlos não média s102,8+/-5,8 33,66+7-1,3 | tratados +/- dp j |

Ensaios farmacológicos

Inibição da químíluminescência em PMNL humanos

Obtiveram-se neutrófilos humanos a partir de voluntários saudáveis. 0 sangue foi anti-coagulado com citrato-Na a 0,38% e os neutrófilos foram purificados de acordo com Boyum (Boyum A. Scand J Clin Invest 1968;21:77-89). A purificação de neutrófilos foi obtida por centrifugação em gradiente de Histo-paque a 400 g durante 30 min. Os neutrófilos resultantes foram suspensos em PBS mais CaCl2 0,87 mM, MgCl2 1 mM, contados, e diluídos até 2,5 x 106 /ml. A suspensão de neutrófilos foi pré-misturada com luminol (5 μΜ final). Uma alíquota de 200 μΐ de suspensão celular foi incubada numa placa de 96 poços, com fármacos, durante 10 min a 37°C. Os neutrófilos foram activados com forbol 12-miristato 13-acetato 0,1 μΜ (pma) e a emissão de luz foi monitorizada a intervalos de 3 min durante 24 min, num leitor de microplacas HTS7000 plus. Os resultados foram expressos como redução do sinal de fluorescência registado para células activadas com apenas PMA. A activação de neutrófilos com PMA 0,1 μΜ induziu um aumento dependente do tempo no sinal de luminescência, com um aumento máximo no espaço de 10-12 min. A pré-incubação com composto 1.1 (1-10 μΜ) diminuiu de forma dependente da 24 concentração a quimiluminescência potenciada pelo luminol (fase de aumento, aos 15 min, IC50= 6,4±0,6 μΜ, fase estacionária, a 24 min, IC50=2,9±0,2 μΜ). 0 efeito inibitório era detectável mesmo na concentração mais baixa de ΙμΜ (20 % de inibição) e a 30μΜ o composto 1.1 inibiu completamente a produção de ROS (dados não apresentados). Os dados estão ilustrados na Fig. 1.

Inibição de citocinas em macrófagos peritoneais de rato

Obtiveram-se culturas de células primárias a partir de ratos albino macho (SD, 200-250g, Harlan, Itália), como descrito em Methods in Enzymology (Methods in Enzymology, vol. LVIII, páginas 494-506). As células foram estimuladas no dia após o plaqueamento, com LPS, lpg/ml ou O.lpg/ml como referido, durante 24h. Os compostos foram adicionados 20 min antes da estimulação. A estimulação foi realizada em DMEM, glucose 1 g/1, gentamicina 50 pg/ml. Os sobrenadantes e lisados celulares foram recolhidos e armazenados a -80°C até utilização. A quantificação de citocinas em sobrenadantes foi determinada por meio de kits ELISA disponíveis comercialmente para TNFa de rato, IL-Ιβ de rato e IL-6 de rato (Amersham).

Análise de transferência Western de iNOS e COX-2: Os lisados celulares foram analisados por SDS-PAGE. As proteínas foram transferidas para membranas PVDF e saturadas em tampão bloqueador. As membranas foram incubadas durante 2 h à TA, com os seguintes anticorpos: anti-COX-2, anti-iNOS, anti-β-actina e posteriormente incubados com um anticorpo secundário, durante 45 min, à TA. A detecção foi realizada utilizando ECL (Amersham). A quantificação foi determinada por análise de densitometria utilizando o programa NIH Image. 25 A activação de macrófagos com LPS 1 pg/ml induziu um aumento na produção de citocinas, em relação ao nivel basal. A pré-incubação com composto 1.1 (3-100 μΜ) diminuiu de forma dependente da concentração todas as três citocinas, i.e. IL-1β, IL-6 e TNFa. O composto 1.1 na gama 30-100 μΜ inibiu de forma significativa a produção de citocinas. Os dados estão ilustrados na tabela 1. A avaliação de mediadores da inflamação, tais como iNOS e COX-2, foi realizada em macrófagos estimulados com LPS 0,1 pg/ml durante 24h. 0 composto 1.1, testado a 30μΜ, diminuiu de forma significativa tanto a expressão de proteína iNOs como COX-2. Os dados estão ilustrados na tabela 2. Úlcera gástrica induzida por índometacína no rato: propriedades de cura de feridas do composto 1.1

Utilizaram-se 20 ratos SD macho (140-160). Os animais foram privados de alimentos, mas não de água, 24 horas antes da experiência. A úlcera gástrica foi induzida em ratos conscientes por administração oral de 10 mg/kg/4ml de indometacina, suspensa em metilcelulose a 0,5%. O fármaco testado foi administrado 30 min por lavagem oral (os), ou 15 min subcutaneamente (sc), antes da indometacina.

Quatro horas após a administração de indometacina, os animais foram sacrificados por excesso de éter. O estômago foi dissecado, aberto ao longo da curvatura maior e a mucosa foi analisada por um observador que desconhecia o tratamento dado. A extensão das úlceras foi medida utilizando uma binocular lOx ajustada com uma escala de divisões de 0,lmm. 26

Os dados são apresentados como comprimento total das úlceras por grupo.

Os animais foram divididos em 4 grupos de 5 animais, e foram tratados como se segue:

Grupos: 1. lOmg/kg composto 1.1, administrado antes de indometacina 10 mg/kg, os. 2. 5mg/kg composto 1.1, administrado antes de indometacina 10 mg/kg, os. 3. lmg/kg composto 1.1, administrado antes de indometacina 10 mg/kg, os. 4. veiculo, administrado antes de indometacina 10 mg/kg, os. O composto 1.1 foi administrado a 1, 5 e lOmg/kg antes da indometacina. Nos grupos tratados com veiculo, todos os animais exibiam úlceras. Nos grupos tratados com composto 1.1 os niveis de animais ulcerados diminuiu de forma dependente da dose. O efeito máximo, i.e. nenhum animal ulcerado, foi obtido na dose mais elevada (10mg/ kg) . A dose de 5 mg/kg reduziu para cerca de 50% a incidência de úlceras em ambos os protocolos de administração (3/5 dos animais), e, de maior importância, a extensão de ulceração foi drasticamente reduzida até 80-90%. A dose mais baixa (lmg/kg) era apenas eficaz no protocolo de administração os. 27

Todos os animais sobreviveram ao tratamento e não exibiam efeitos adversos notórios.

Os dados estão ilustrados na Figura 2.

Modelo de mucoslte de ratinho

Utilizaram-se 30 ratinhos BDFl macho, adultos (com idades de 10-12 semanas). Os animais foram acomodados durante 2 semanas em gaiolas ventiladas, individuais sob um ciclo de luz:escuro de 12hr para estabilizar o ritmo cardíaco. Os animais tinham livre acesso a alimento e água.

Os animais foram divididos em 5 grupos de 6 animais e foram tratados como se segue:

Grupos: 1. lavagem oral 20mg/kg Composto 1.1 72, 48 e 24hrs antes de exposição a raios-X de 13Gy (corpo inteiro). 2. lavagem oral 10mg/kg Composto 1.1 72, 48 e 24hrs antes de exposição a raios-X de 13Gy X (corpo inteiro). 3. lavagem oral 5mg/kg Composto 1.1 72, 48 e 24hrs antes de exposição a raios-X de 13Gy (corpo inteiro). 4. lavagem oral veiculo, 72, 48 e 24hrs antes de exposição a raios-x de 13Gy (corpo inteiro). 5. Controlos não irradiados, não tratados. 28

Induziu-se dano intestinal utilizando uma única dose de irradiação-X de 13Gy. Quatro dias após a irradiação, os animais foram sacrificados. 0 intestino delgado foi removido e fixado em fixador de Carnoy, antes de ser processado para análise histológica. Cortaram-se secções de 3pm e coraram-se com hematoxilina e eosina. Eram claramente visíveis focos de regeneração (criptas sobreviventes com uma ou mais células clonogénicas) nas secções irradiadas. Para além destes focos, o mesênquimna estava totalmente desnudado; estes animais iriam desenvolver diarreia e morrer devido a mucosite se deixados viver além dos quatro dias.

Para cada animal analisaram-se dez circunferências intestinais (60 por grupo) - uma circunferência é equivalente a um determinado comprimento de intestino e portanto uma unidade de comprimento de linha de base conveniente. O número de criptas sobreviventes por circunferência foi pontuado e determinou-se a média por grupo. Apenas foram pontuadas as criptas contendo 10 ou mais células fortemente coradas com hematoxilina e eosina (excluindo células de Paneth) e apenas circunferência intactas que não contêm retalhos de Peyers (os retalhos de Peyers influenciam quer o número de criptas numa circunferência normal, quer a capacidade de uma cripta sobreviver ao insulto). A largura média da cripta (medida no seu ponto mais largo) também foi medida de modo a corrigir erros de pontuação devido a diferenças de tamanho das criptas. A correlação é aplicada do seguinte modo: Número de criptas /circunferência corrigido = 29

Largura média da cripta no controlo não tratado X número médio de Largura média da cripta em animais tratados criptas sobreviventes no grupo de tratamento 0 composto 1.1 foi dado a 5, 10 e 20mg/kg diariamente, durante três dias antes de exposição à radiação. Em animais tratados com veiculo 3,5 + /- 1,9 criptas por circunferência (secção transversal) sobreviveram ao insulto. Em cada grupo tratado com composto 1.1, os níveis de sobrevivência estavam aumentados. Alcançou-se a sobrevivência máxima na dose mais elevada (20mg/kg) em que 6,7 +/- 3,0 criptas sobreviveram (aumento de l,9x). As doses mais baixas aumentaram a sobrevivência cerca de 1,3 vezes. Estes níveis de protecção podem permitir a sobrevivência dos animais após uma dose de irradiação que seria de outro modo letal (assumindo que o dano da medula óssea é minimizado) (Ambos revistos em Booth & Potten 2001, JNCI Monogr, 29; 16-20).

Todos os animais sobreviveram ao tratamento e não exibiam efeitos adversos óbvios.

Os dados estão ilustrados na Tabela 3 e Figura 3. Composições farmacêuticas A via de administração é regulada pelas propriedades físicas do composto utilizado e pelo tipo de mucosite a ser tratada e/ou prevenida. Como discutido acima, para tratamento e/ou prevenção da mucosite os compostos de fórmula (I) podem ser administrados como formulações orais, tais como comprimidos, cápsulas, pílulas ou xaropes, lavagem oral, geles e emulsões. Uma vez que a composição da invenção pode ser utilizada também para prevenir a mucosite, a 30 administração das composições deverá preferencialmente preceder a dose inicial de terapia antineoplásica ou a terapia de radiação, em pelo menos 24 horas. A dosagem particular dos compostos de formula (I) necessária para prevenir ou tratar a mucosite ou os seus sintomas, de acordo com a presente invenção, irá depender da gravidade da condição, da via de administração e de factores relacionados que serão decididos pelo médico assistente. Em geral, doses diárias aceites e eficazes serão de cerca de 0,5 a 500 mg/dia (e mais tipicamente de cerca de 10 a 100 mg/dia). Estas dosagens serão administradas a um indivíduo necessitado, de uma, a cerca de três vezes por dia, ou mais frequentemente, conforme necessário e durante um período de tempo suficiente para inibir eficazmente a mucosite.

Podem-se preparar composições farmacêuticas adequadas de compostos de fórmula (I) por procedimentos conhecidos na arte. Por exemplo, os compostos podem ser formulados com excipientes, diluentes ou transportadores comuns e moldados em comprimidos, cápsulas, pílulas, lavagens orais, suspensões ou geles.

Exemplos de excipientes, diluentes, e transportadores que são adequados para estas formulações incluem, mas não se limitam a: agentes de enchimento e de volume, tais como amido, lactose, manitol e derivados de sílica; agentes de ligação, tais como carboximetilcelulose e outros derivados de celulose, alginatos, polivinilpirrolidona.

Podem-se adicionar agentes desintegrantes, tais como carbonato de cálcio ou bicarbonato de sódio, quando 31 necessário. Os lubrificantes, tais como talco, estearato de cálcio e magnésio ou polietilglicóis sólidos podem ser utilizados para o fabrico destas composições, dependendo das propriedades fisicas do composto de fórmula (I) a ser formulado.

Os compostos da invenção também podem ser formulados como suspensões ou soluções para administração oral conveniente, ou como soluções adequadas para administração parentérica, por exemplo por via intramuscular, subcutânea ou intravenosa. As composições da invenção podem ser na forma de um liquido aquoso ligeiramente viscoso (gel), que proporciona um efeito de formação de pelicula e revestimento nas superfícies epiteliais, tais como, mas não se limitando, à mucosa oral. 32

Claims (6)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de um composto de formula (I), ou um seu sal ou solvato farmaceuticamente aceitável, para preparar um medicamento para tratar ou prevenir a mucosite:

   H em que: - A é o grupo tiocarboxamida, - Ri é seleccionado de entre um grupo alquilo com 1 a 3 átomos de carbono e o grupo amino, não substituído ou substituído com o grupo nitro ou o grupo metilo, - R2 é seleccionado independentemente de entre hidrogénio, um grupo alquilo tendo de 1 a 4 átomos de carbono, um resíduo de cicloalcano tendo de 5 a 7 átomos de carbono, um grupo arilo, naftilo, ou heterocíclico, não substituído ou substituído com grupos metilo, metoxi, hidroxi, amino ou halogéneo. - R3 e R4 são seleccionados independentemente de entre hidrogénio e um grupo alquilo com 1 a 3 átomos de carbono. - R5 representa um ou dois substituintes independentemente seleccionados de entre hidrogénio, e grupos metilo, metoxi e hidroxilo, - n é um número inteiro de 0 a 6, e 1 - o grupo amidina está na posição para ou meta em relação ao grupo "A-NH".
2. 2. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que nos compostos de fórmula (I), R4 e R2 são grupos metilo, R3 e R4 e Rs são hidrogénio, n é um número inteiro de 0 a 6 e o grupo amidina está na posição para em relação ao grupo "A-NH", ou um seu sal ou solvato farmaceuticamente aceitável.
3. 3. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que nos compostos de fórmula (I), Ri e R2 são grupos metilo, R3 e R4 e Rs são hidrogénio, n é 4 e o grupo amidina está na posição para em relação ao grupo "A-NH", ou um seu sal ou solvato farmaceuticamente aceitável.
4. 4. Composto como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, para utilização no tratamento ou prevenção terapêutica de mucosite induzida por terapia de cancro, compreendendo quimioterapia e/ou radioterapia.
5. 5. Composição farmacêutica compreendendo um composto como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3 e excipientes farmacêuticos para utilização no tratamento terapêutico ou prevenção de mucosite induzida por terapia para o cancro, compreendendo quimioterapia e/ou radioterapia.
6. 6. Composição farmacêutica para utilização de acordo com a reivindicação 5, em que o referido composto é um sal farmaceuticamente aceitável de um composto de fórmula (I), seleccionado do grupo constituído por cloridrato, bromidrato, 2 fumarato e hidrogenossulfato, metanossulfonato, maleato, succinato. 3