BRPI0715633A2 - mÉtodo de reduÇço de dano em cÉlula neuronal - Google Patents

Abstract

MÉTODO DE REDUÇçO DE DANO EM CÉLULA NEURONAL. A presente invenção é dirigida a um método de reduzir a ocorrência de dano a células neuronais, incluindo morte, causado por hipoxia e/ou isguemia cerebral transiente. O método compreende as etapas de: diagnosticar um sujeito tendo uma condição hipôxica e/ou iscjuêmica cerebral transiente; e no prazo de 16 horas após início da condição, administrar ao sujeito uma condiçãO neuroprotetora de um agente farmacêutico. O agente farmacêutico é preferivelmente selecionado do grupo que consiste em: um estimulante do sistema nervoso central(CNSS) , neurotransmissor de monoamina, inibidor de monoamina oxidase (MAOI), antidepressante tricíclico (TCA) ou uma combinação dos mesmos. Agentes preferidos incluem anfetaminas, metanfetamina, metil fenidato, metilenodioximetanfetamina, ou uma combinação dos mesmos.

Description

MÉTODO DE REDUÇÃO DE DANO EM CÉLULA NEURONAL

Dados de pedido relacionado

Esse pedido reivindica o beneficio do pedido provisional US número 60/839.974 depositado em 23 de agosto de 2006, cujo teor é expressamente incorporado aqui na íntegra a título de referência ao mesmo. Campo técnico

A presente invenção é dirigida a um método de reduzir a ocorrência de dano à célula neuronal, incluindo morte de células, causado por hipoxia cerebral transiente e/ou isquemia. O método compreende as etapas de: diagnosticar um sujeito tendo uma condição hipóxica e/ou isquêmica cerebral transiente e no prazo de 16 horas após início da condição, administrar ao sujeito uma quantidade neuroprotetora de um agente farmacêutico. 0 agente farmacêutico é preferivelmente selecionado do grupo que consiste em: um estimulante do sistema nervoso central (CNSS), neurotransmissor de monoamina, inibidor de monoamina oxidase (MAOI), antidepressante tricíclico (TCA) ou uma combinação dos mesmos. Agentes preferidos incluem anfetamina, metanfetamina (MA), metilfenidato,

metilenedióxi metanfetamina ou uma combinação dos mesmos. Antecedentes da invenção

Derrames são a causa principal de incapacidade entre adultos, com mais de 80% envolvendo insulto isquêmico. Até a presente data, nenhuma terapia de prevenção ou neuroprotetora provou ser eficaz em seres humanos. As anfetaminas constituem um dos grupos de drogas mais extensamente estudados e promissores utilizados para 3 0 facilitar a recuperação de derrame após ocorrência de dano de células neuronais (vide Martinsson e Eksborg 2004) . Em ratos, uma única dose de anfetaminas (por exemplo, dexanfetamina) administrada 24 h após ablação de córtex sensorimotor promove recuperação hemiplégica (Feeney e outros, 1982). Esse efeito benéfico foi confirmado em uma variedade de modelos e espécies de lesão focai diferente (Sutton e outros, 1989; Hovda e Fenney 1984; Hovda e Feeney 1985; Schmanke e outros 1996; Dietrich e outros 1990; Stroemer e outros 1998). Em cada um desses estudos lesão isquêmica foi modelada pela ligação permanente/embolia de um componente vascular, ou ablação cortical.

Um tipo diferente de lesão isquêmica envolve a interrupção transiente e reperfusão de fluxo sangüíneo para o cérebro. 0 hipocampo é extremamente sensível a esse tipo de insulto isquêmico. Em seres humanos e modelos experimentais de roedores, breves episódios isquêmicos podem resultar na morte retardada e seletiva de neurônios localizados no hipocampo, especialmente as células piramidais do setor CAl (Kirino 1982) . Esse tipo de lesão prejudica o desempenho era tarefas cognitivas que envolvem memória espacial (Zola-Morgan e outros, 1986; Squire e Zola-Morgan 1991). Embora a administração de anfetamina seja associada à recuperação comportamental melhorada em modelos de isquemia focai ou ablação cortical, a técnica anterior reportou que o tratamento com anfetaminas não reduz volume de infarto e desse modo não é um protetor neuronal ou preventivo. A técnica anterior também sugere que anfetaminas facilitam a recuperação comportamental após lesão cortical por influenciar a plasticidade do cérebro (Gold e outros, 1984) bem como resolução de diásquise (Hovda e outros, 1987; Sutton e outros, 2000) . A técnica anterior, entretanto, revela ainda que as anfetaminas não melhoram a recuperação após certos tipos de lesão de ferimento incluindo lesões na substância negra (Mintz e Tomer, 1986). A técnica anterior também ensina que a administração de anfetaminas (por exemplo, metanfetamina; MA) antes da isquemia focai aumenta, na realidade, o volume de infarto em regiões estriatal e cortical (Wang e outros, 2001) .

Existe ainda necessidade de um tratamento que

evite dano neuronal antes de ocorrer e na realidade forneça proteção neuronal após a ocorrência de uma condição hipóxica e/ou isquêmica cerebral transiente para minimizar ou evitar dano. Tal método de prevenção é revelado aqui, que fornece um método de evitar ou reduzir dano às células neuronais cerebrais antes que ocorra em vez de tentar tratar o dano após ocorrência e promover recuperação. Sumário da invenção

A presente invenção é dirigida a um método de 2 0 reduzir a ocorrência de dano a células neuronais causado por hipoxia e/ou isquemia cerebral transiente. 0 método compreende preferivelmente as etapas de: diagnosticar um sujeito tendo uma condição hipóxica e/ou isquêmica cerebral transiente; e no prazo de 16 horas após início da condição, 2 5 administrar ao sujeito uma quantidade neuroprotetora de um agente farmacêutico. 0 agente farmacêutico é preferivelmente selecionado do grupo que consiste em: um estimulante do sistema nervoso central (CNSS) , neurotransmissor de monoamina, inibidor de monoamina oxidase (MAOI), antidepressante tricíclico (TCA) ou uma combinação dos mesmos.

Agentes farmacêuticos preferidos incluem anfetaminas, metanfetamina, metilfenidato, metilenodióxi metanfetamina ou uma combinação dos mesmos.

Em uma modalidade especifica, o agente

farmacêutico é metanfetamina administrado ao sujeito em quantidades de dosagem unitária, menores do que 5 mg/kg.

Em outras modalidades específicas, o agente farmacêutico é uma combinação de metanfetamina, metilfenidato, metilenedióxi metanfetamina, ou uma combinação dos mesmos e pelo menos um agente adicional selecionado do grupo que consiste em: um neurotransmissor de monoamina, MAOI ou um TCA. 0 agente adicional pode incluir também um neurotransmissor de monoamina, preferivelmente selecionado do grupo que consiste em: dopamina, norepinefrina ou serotonina.

A presente invenção reduz, preferivelmente, a ocorrência de dano a células neuronais cerebrais, que inclui morte de células, e mais preferivelmente, reduz a ocorrência de dano de célula neuronal a células neuronais . Em uma modalidade preferida, a presente invenção reduz a ocorrência de dano de célula neuronal a células neuronais do hipocampo.

Tipicamente, a condição hipóxica e/ou isquêmica cerebral transiente é causada por perda de sangue, ataque cardíaco, sufocação, cirurgia (por exemplo, cirurgia cardíaca), derrame, bloqueio de vias aéreas, neuropatia óptica isquêmica, lesões em cordão espinhal, lesão traumática do cérebro, ou pressão sangüínea baixa. A 3 0 condição, entretanto, pode ser causada por muitas condições, condições que causam dano a células neuronais devido à falta de oxigênio e/ou glicose que atinge as células neuronais por um período temporário de tempo.

Em certas modalidades preferidas, o agente farmacêutico é administrado no prazo de 16, 14, 12, 10, 8, 6, 4 ou 2 horas após o início da condição. 0 agente é administrado, preferivelmente, via parental ou oral, porém outras vias são consideradas e podem ser utilizadas dependendo da condição.

Em uma modalidade, o agente farmacêutico é administrado em uma composição farmacêutica compreendendo um veículo farmaceuticamente aceitável. A composição farmacêutica pode ser uma formulação de liberação imediata ou estendida dependendo da condição e probabilidade de recorrência.

Breve Descrição dos Desenhos

Figura 1: mostra uma resposta de dose neuroprotetora de MA após privação de glicose-oxigênio (OGD) . Imagens representativas de culturas de fatia hipocampal de rato coloridas com iodeto de propídio tiradas 4 8h pós-OGD são mostradas. As culturas foram tratadas com as seguintes doses de MA: (A) controle não OGD; (B) 125 μπι MA adicionado 5 min. põs-OGD; (C) 250 μπι MA adicionado 5 min. pós - OGD; (D) 500 μιη MA adicionado 5 min. pós-OGD; (E) ΙπιΜμίΐΐ MA adicionado 5 min. após-OGD; (F) OGD somente. Painel (G) mostra análise estatística de coloração de PI reportada como intensidade de fluorescência relativa (IOD) . * * =p< 0 , 01. One-way AN0VA, Dunnefs Post-Hoc (OGD) , barras de erro= média & SEM; (OGD) n=10, (Não-OGD) n=13, (ImM MA) n=10, (500 μΜ MA) n=ll, (250μΜ MA) n=9, (125μΜ MA) n=7 . Figura 2: mostra uma análise temporal de neuroproteção mediada por MA após OGD. Imagens representativas de culturas de fatia hipocampal de rato coloridas com iodeto de propídio tiradas 4 8 h após-OGD são mostradas. Uma dose de 250μΜ de MA foi administrada pós- derrame nos pontos de tempo indicados: (A) não-OGD; (B) 0-5 min. pós -OGD; (C) 2 h pós-OGD; (D) 4 h pós-OGD; (E) 8 h pós-OGD; (F) 16 h pós-OGD; (G) OGD-não tratado. Painel (H) mostra análise estatística de coloração com PI reportada como intensidade de fluorescência relativa (IOD) . N=4 , *=p<0, 05, One-way AN0VA, Dunnefs post-hoc (OGD) , barras de erro= média & SEM.

Figura 3 : mostra a distância média (+SEM) percorrida em um aparelho de campo aberto novo. Os animais foram testados 24 h após 5-min 2-V0 (Isch) ou cirurgia de simulação (Simulação). Após cirurgia (1-2 min.), gerbils receberam metanfetamina (5 mg) ou veículo de solução salina (0 mg) . Os gerbils foram colocados na região central e permitidos explorar o ambiente novo por 5 minutos e os dados de distância foram coletados utilizando um sistema de rastreamento automatizado. Gerbils isquêmicos sem tratamento de metanfetamina eram significativamente mais ativos em comparação com o grupo de simulação sem droga. Gerbils de simulação e isquêmicos tratados com a droga não eram diferentes e o tratamento com a droga falhou em alterar significativamente os níveis de atividade em relação à condição de controle. *P <0,05 vs. Isch + condição de droga.

Figura 4: mostra marcações de avaliação 3 0 histológicas individuais de seções de hipocampo avaliadas 21 dias após insulto isquêmico (Isch) ou cirurgia de controle de simulação (Simulação). Os gerbils foram tratados com metanf etamina (5 mg) ou veículo (0 mg) 1-2 minutos após cirurgia. 0 dano à região CAl hipocampal foi avaliado utilizando uma escala de avaliação de 4 pontos. Uma marcação de 0 (4-5 camadas compactas de corpos neuronais normais) , 1 (4-5 camadas compactas com presença de alguns neurônios alterados), 2 (corpos neuronais extras com "espaços fantasma" e/ou células gliais entre os mesmos), 3 (total ausência ou presença de corpos neuronais normais somente raros com gliose intensa do subcampo CAI) foi atribuída a cada animal. A análise revelou que o tratamento com metanfetamina reduziu significativamente o dano ao CAl hipocampal após insulto isquêmico. Figura 5: são fotomicrografias de seções

hipocampais processadas 21 dias após insulto isquêmico ou procedimento de simulação seguido por administração de metanfetamina (5 mg/kg) ou veículo. Um 5-min 2-VO resultou na perda seletiva de neurônios piramidais na região CAl hipocampal (Painéis C, D) . Como esperado, cirurgia de simulação (Painéis A, B) não resultou em nenhuma perda de células neuronais. Gerbils tratados com metanfetamina 1-2 minutos após insulto isquêmico falharam em exibir algum dano ao hipocampo (Painéis E, F). As seções foram coloridas com violeta cresila. Barras de escala = 200 μπι (A, C, E) e 60 μιτι (Β, D, F) .

Descrição Detalhada das Modalidades Preferidas

A presente invenção pode ser utilizada para reduzir a ocorrência de dano a células neuronais, incluindo 3 0 morte de células, causado por uma condição hipóxica e/ou isquêmica, cerebral, transiente. Preferivelmente o método reduz a ocorrência dano a células neuronais às células do hipocampo. A condição hipóxica e/ou isquêmica cerebral transiente pode ser causada por muitas condições que causam falta de oxigênio e/ou glicose nas células cerebrais por um período temporário de tempo. Por exemplo, um ataque cardíaco, sufocação, cirurgia (por exemplo, cirurgia cardíaca), um derrame, perda de sangue, bloqueio de vias aéreas, ou pressão sangüínea baixa. Preferivelmente, o sujeito sendo tratamento é um mamífero, por exemplo, macaco, cão, gato, cavalo, vaca, carneiro, porco, e mais preferivelmente o sujeito é um ser humano.

Em contraste com a técnica anterior, o presente método provê, na realidade, proteção e evita dano a células neuronais cerebrais após a ocorrência de hipoxia e/ou isquemia cerebral transiente em vez de simplesmente promover a recuperação após o dano às células neuronais já ter sido causado. Para fornecer maior proteção neuronal ao sujeito, o agente neuroprotetor deve ser administrado ao sujeito no prazo de 16 horas após início (por exemplo, 10, 8, 6, 4, 2 horas) da condição hipóxica e/ou isquêmica cerebral transiente. O agente neuroprotetor é preferivelmente selecionado do grupo que consiste em: um estimulante de sistema nervoso central (CNSS), neurotransmissor de monoamina, inibidor de monoamina oxidase (MAOI), antidepressante tricíclico (TCA) ou uma combinação dos mesmos.

Em uma modalidade mais preferida, o agente neuroprotetor é anfetamina, metanfetamina, metilfenidato, etilenedióxi metanfetamina, ou combinações dos mesmos. Em uma modalidade preferida, a anfetamina é um composto contendo uma feniletilamina. Em certas modalidades, a feniletilamina é um d-anfetamina, como dextroanfetamina, por exemplo, aspartato de dextroanfetamina, sulfato de dextroanfetamina, sacarato de dextroanfetamina,

metanfetamina, etc. Exemplos não limitadores específicos incluem ADREX, BIFETAMINA, DESOXINA, DEXEDRINA, FERNDEX, ROBESE, SPANSULE, OXIDESS II, DEXTROSTAT.

Em uma modalidade, o agente farmacêutico é administrado em uma composição farmacêutica que compreende um veículo farmaceuticamente aceitável. A composição farmacêutica pode ser uma formulação de liberação imediata ou estendida dependendo da condição e probabilidade de recorrência. As composições podem incluir ainda outros compostos farmaceuticamente ativos incluindo, por exemplo, pelo menos um agente adicional selecionado do grupo que consiste em: um neurotransmissor de monoamina, MAOI ou um TCA. 0 agente adicional pode incluir também um neurotransmissor de monoamina, preferivelmente selecionado

2 0 do grupo que consiste em: dopamina, norepinefrina, ou

serotonina e mais preferivelmente norepinefrina.

Aqueles versados na técnica reconhecerão várias metodologias sintéticas que podem ser empregadas para preparar composições farmaceuticamente aceitáveis não tóxicas que compreendem o agente neuroprotetor.

Composições farmacêuticas podem ser preparadas em formas de dosagem individuais. Consequentemente, composições farmacêuticas e formas de dosagem da invenção compreendem os ingredientes ativos revelados aqui. A

3 0 notação de: "agente farmacêutico" ou "agente neuroprotetor" significa os compostos da invenção descritos aqui ou sais dos mesmos. As composições farmacêuticas e formas de dosagem da invenção podem compreender ainda um veiculo farmaceuticamente aceitável.

Em uma modalidade, o termo "farmaceuticamente

aceitável" significa aprovado por um órgão regulador do governo Federal ou estadual ou listado na U.S. Pharmacopeia ou outra farmacopéia genericamente reconhecida para uso em animais, e mais particularmente em seres humanos. 0 termo "veiculo" se refere a um diluente, adjuvante, excipiente, ou veiculo com o qual um ingrediente ativo é administrado. Tais veículos farmacêuticos podem ser líquidos, como água e óleos, incluindo aqueles de origem de petróleo, animal, vegetal ou sintética, como óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de gergelim e similar. Os veículos farmacêuticos podem ser solução salina, goma acácia, gelatina, pasta de amido, talco, queratina, sílica coloidal, uréia e similares. Além disso, outros excipientes podem ser utilizados. Formas de dosagem unitária, individuais da

invenção são apropriadas para administração oral, por mucosa (Por exemplo, nasal, sublingual, vaginal, bucal ou retal), parenteral (por exemplo, subcutânea, intravenosa, injeção de bolo, intramuscular ou intraarterial) ou transdérmica a um paciente. Os exemplos de formas de dosagem incluem, porém não são limitadas a: comprimidos; comprimidos revestidos; cápsulas, como cápsulas de gelatina elástica mole; cápsulas; trociscos; pastilhas; dispersões; supositórios; unguentos; cataplasmas (cataplasmas); pastas; 3 0 pós; curativos; cremes; emplastos; soluções; adesivos; aerossóis (por exemplo, inaladores ou pulverizações nasais); géis; formas de dosagem líquidas apropriadas para administração oral ou por mucosa a um paciente, incluindo suspensões (por exemplo, suspensões líquidas aquosas ou não aquosas, emulsões de óleo em água, ou emulsões líquidas de água em óleo), soluções e elixires; formas de dosagem líquida apropriadas para administração parenteral a um paciente; e sólidos estéreis (por exemplo, sólidos cristalinos ou amorfos) que podem ser reconstituídos para fornecer formas de dosagem líquida apropriadas para administração parenteral a um paciente. O agente é preferivelmente administrado por via parenteral ou oral, porém outras vias são consideradas como discutido em detalhe aqui e dependem amplamente da condição isquêmica. A composição, formato e tipo de formas de dosagem

da invenção variarão tipicamente dependendo de sua via de administração e animal sendo tratado. Por exemplo, uma forma de dosagem parenteral pode conter quantidades menores de um ou mais dos ingredientes ativos que compreende do que uma forma de dosagem oral utilizada para tratar a mesma doença. Esses e outros modos nos quais formas de dosagem específica abrangidas por essa invenção variarão entre si, serão prontamente evidentes para aqueles versados na técnica. Vide, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a ed. , Mack Publishing, Easton Pa. (1990).

Composições farmacêuticas típicas e formas de dosagem compreendem um ou mais excipientes. Excipientes apropriados são bem conhecidos por aqueles versados na arte de farmácia e exemplos não limitadores de excipientes apropriados são fornecidos aqui. 0 fato de se um excipiente específico é apropriado para incorporação em uma composição farmacêutica ou forma de dosagem depende de uma variedade de fatores bem conhecidos na técnica incluindo, porém não limitado a, o modo no qual a forma de dosagem será administrada a um paciente. Por exemplo, formas de dosagem oral como comprimidos podem conter excipientes não apropriados para uso em formas de dosagem parenteral. A adequação de um excipiente específico pode depender também dos ingredientes ativos específicos na forma de dosagem.

Por exemplo, a decomposição de alguns ingredientes ativos pode ser acelerada por alguns excipientes como lactose, ou quando expostos à água.

A invenção abrange ainda composições farmacêuticas e formas de dosagem que compreendem um ou

mais compostos que reduzem a taxa pela qual um ingrediente ativo decomporá. Tais compostos, que são mencionados aqui como "estabilizadores" incluem, porém não são limitados a, antioxidantes como ácido ascórbico, tampões de pH ou tampões de sal.

2 0 Para uma condição específica ou método de

tratamento, a dosagem é determinada empiricamente, utilizando métodos conhecidos, e dependerá de fatos como a atividade biológica do composto específico empregado, o meio de administração, a idade, saúde e peso corpóreo do

hospedeiro; a natureza e extensão dos sintomas; a freqüência de tratamento; a administração de outras terapias e o efeito desejado. Doravante são descritas várias dosagens e métodos de administração possíveis com a compreensão de que o que se segue pretende ser somente

3 0 ilustrativo. As dosagens efetivas e método de administração ou distribuição podem ser determinados por uma pessoa versada na técnica. Por exemplo, quando o agente neuroprotetor é metanfetamina administrada a seres humanos, a quantidade de dosagem unitária é tipicamente menor do que 5 mg/kg. Dosagens grandes são genericamente tóxicas e não devem ser tipicamente utilizadas.

A freqüência de dosagem pode variar também dependendo do composto utilizado e de se uma formulação de liberação estendida é utilizada. Entretanto, para tratamento da maioria dos distúrbios, uma única dose é preferida.

Formas de dosagem oral

Composições farmacêuticas da invenção que são apropriadas para administração oral podem ser apresentadas como formas de dosagem discreta, como, porém não limitado a, comprimidos (por exemplo, comprimidos mastigáveis) , comprimidos revestidos, cápsulas, e líquidos (por exemplo, xaropes aromatizados). Tais formas de dosagem contêm quantidades predeterminadas de ingredientes ativos, e podem 2 0 ser preparadas por métodos de farmácia bem conhecidos por aqueles versados na arte. Vide genericamente Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a ed. , Mack Publishing, Easton Pa. (1990) .

Formas de dosagem oral típicas da invenção são

2 5 preparadas por combinar os ingredientes ativos em uma

mistura íntima com pelo menos um excipiente, de acordo com técnicas de composição farmacêutica convencionais. Excipientes podem assumir uma ampla variedade de formas dependendo da forma de preparo desejada para administração.

3 0 Por exemplo, excipientes apropriados para uso em formas d.e dosagem de aerossol ou líquida oral incluem, porém não são limitados a, água, glicóis, óleos, álcoois, agentes aromatizantes, preservativos e agentes corantes. Os exemplos de excipientes apropriados para uso em formas de dosagem oral, sólidas (por exemplo, pós, comprimidos, cápsulas e comprimidos revestidos) incluem, porém não são limitadas a, amidos, açúcares, celulose microcristalina, diluentes, agentes de granulação, lubrificantes, aglutinantes e agentes desintegrantes.

Devido à sua facilidade de administração, comprimidos e cápsulas representam as formas unitárias de dosagem oral; mais vantajosas; em cujo caso os excipientes sólidos são empregados. Se desejado, comprimidos podem ser revestidos por técnicas, aquosa ou não aquosa, padrão. Tais formas de dosagem podem ser preparadas por qualquer um dos métodos de farmácia. Em geral, composições farmacêuticas e formas de dosagem são preparadas por misturar uniforme e intimamente os ingredientes ativos com veículos líquidos, veículos sólidos finamente divididos, ou ambos, e então moldar o produto na apresentação desejada, se necessário.

Por exemplo, um tablete pode ser preparado por compressão ou moldagem. Comprimidos comprimidos podem ser preparados por comprimir em uma máquina apropriada, os ingredientes ativos em uma forma de fluxo livre como pó ou grânulos, opcionalmente misturados com um excipiente. Comprimidos moldados podem ser feitos por moldagem em uma máquina apropriada, de uma mistura do composto em pó umedecido com um diluente líquido inerte.

Os exemplos de excipientes que podem ser utilizados em formas de dosagem oral da invenção incluem, porém não são limitados a, aglutinantes, cargas, desintegrantes e lubrificantes. Aglutinantes apropriados para uso em composições farmacêuticas e formas de dosagem incluem, porém não são limitados a, amido de milho, amido de batata, ou outros amidos, gelatina, gomas naturais e sintéticas como acácia, alginato de sódio, ácido algínico, outros alginatos, tragacanto em pó, goma guar, celulose e seus derivados (por exemplo, etil celulose, acetato de celulose, cálcio de carbóxi metil celulose, carbõxi metil celulose de sódio), polivinil pirrolidona, metil celulose, amido pré-gelatinizado, hidróxi propil metil celulose (por exemplo, nos. 2208, 2906, 2910), celulose microcristalina e misturas dos mesmos.

Formas apropriadas de celulose microcristalina incluem, porém não são limitados a, materiais vendidos com o AVICEL-PH-101, AVICEL-PH-103 , AVICEL RC-581, AVICEL-PH-105 (disponível a partir da FMC Corporation, American Viscose Division, Avicel Sales, Marcus Hook, Pa.) e misturas dos mesmos. Um aglutinante específico é uma mistura de celulose microcristalina e carbóxi metil celulose de sódio vendido como AVICEL RC-581. Aditivos ou excipientes de umidade baixa ou anidros apropriados incluem AVICEL-PH-103 e Amido 0 0 LM.

Os exemplos de cargas apropriadas para uso nas composições farmacêuticas e formas de dosagem reveladas aqui incluem, porém não são limitados a, talco, carbonato de cálcio, (por exemplo, grânulos ou pó) , celulose microcristalina, celulose em pó, dextratos, caulim, manitol, ácido silícico, sorbitol, amido, amido pré- gelatinizado e misturas dos mesmos. O aglutinante ou carga em composições farmacêuticas da invenção está tipicamente presente de aproximadamente 5 0 a aproximadamente 9 9 por cento em peso da composição farmacêutica ou forma de dosagem.

Desintegrantes são utilizados nas composições da

invenção para fornecer comprimidos que desintegram quando expostos a um ambiente aquoso. Comprimidos que contêm desintegrante em demasia podem desintegrar em armazenagem, enquanto aqueles que contêm muito pouco podem não desintegrar em uma taxa desejada ou sob as condições desejadas. Desse modo, uma quantidade suficiente de desintegrante que não é nem muito nem muito pouco para alterar prejudicialmente a liberação dos ingredientes ativos deve ser utilizada para formar formas de dosagem oral sólidas da invenção. A quantidade de desintegrante utilizada varia com base no tipo de formulação e é prontamente discernível por aqueles com conhecimentos comuns na arte. Composições farmacêuticas típicas compreendem de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 15 por 2 0 cento em peso de desintegrante, preferivelmente de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 por cento em peso de desintegrante.

Desintregrantes que podem ser utilizados em composições farmacêuticas e formas de dosagem da invenção incluem, porém não são limitados a agar-agar, ácido algínico, carbonato de cálcio, celulose microcristalina, sódio de croscarmelose, crospovidona, potássio de polacrilina, glicolato de amido de sódio, amido de tapioca ou batata, outros amidos, amido pré-gelatinizado, outros amidos, argilas, outras alginas, outros celuloses, gomas e misturas dos mesmos.

Lubrificantes que podem ser utilizados em composições farmacêuticas e formas de dosagem da invenção incluem, porém não são limitados a, estearato de cálcio, estearato de magnésio, óleo mineral, óleo mineral leve, glicerina, sorbitol, manitol, polietileno glicol, outros glicóis, ácido esteárico, sulfato de laurila de sódio, talco, óleo vegetal hidrogenado (por exemplo, óleo de amendoim, ól eo de semente de algodão, óleo de girassol, óleo de gergelim, azeite, óleo de milho, e óleo de soja) , estearato de zinco, oleato de etila, laureato de etila, agar e misturas dos mesmos. Lubrificantes adicionais incluem, por exemplo, um gel de sílica silóide (AEROSIL 200, fabricado por W.R. Grace Co. de Baltimore, Md.), um aerossol coagulado de sílica sintética (comercializado por Degussa Co. de Plano, Tex.), CAB-O-SIL (um produto de dióxido de silício pirogênico vendido por Cabot Co. de Boston, Mass.) e misturas dos mesmos. Se utilizado, os lubrificantes são tipicamente utilizados em uma quantidade menor do que aproximadamente 1 por cento em peso das composições farmacêuticas ou formas de dosagem nas quais são incorporados.

Uma forma de dosagem oral sólida preferida da invenção compreende um ingrediente ativo, lactose anidro, celulose microcristalina, polivinil pirrolidona, ácido esteárico, sílica anidra coloidal e gelatina. Formas de dosagem parenteral

Formas de dosagem parenteral podem ser administradas a pacientes por várias vias incluindo, porém não limitado a, subcutânea, intravenosa, injeção de bolo, intramuscular e intraarterial. Como sua administração tipicamente evita as defesas naturais dos pacientes contra contaminantes, formas de dosagem parenteral são preferivelmente estéreis ou capazes de serem esterilizadas antes da administração a um paciente. Os exemplos de formas de dosagem parenteral incluem, porém não são limitados às soluções prontas para injeção, produtos secos prontos para serem dissolvidos, ou suspensos, em um veículo farmaceuticamente aceitável para: injeção, suspensões prontas para injeção e emulsões.

Veículos apropriados que podem ser utilizados para fornecer formas de dosagem parenteral da invenção são bem conhecidos por aqueles versados na técnica. Os exemplos incluem, porém não são limitados a: água para injeção USP; veículos aquosos como, porém não limitados a, injeção de cloreto de sódio, injeção de Ringer, injeção de Dextrose, injeção de cloreto de sódio e dextrose, e injeção de lactato de Ringer; veículos miscíveis em água como, porém não limitado a, álcool de etila, polietileno glicol, e polipropileno glicol; e veículos não aquosos como, porém não limitado a, óleo de milho, óleo de semente de algodão, óleo de amendoim, óleo de gergelim, oleato de etila, miristato de isopropila, e benzoato de benzila.

A presente invenção será ilustrada agora pelos seguintes exemplos não limitadores. Deve ser entendido que o acima descreve modalidades preferidas da presente invenção e que modificações podem ser feitas na mesma sem se afastar do espírito ou escopo da presente invenção como exposto nas reivindicações. 3 0 EXEMPLOS A eficácia neuroprotetora de anfetaminas após insulto isquêmico cerebral transiente não foi investigada anteriormente. No presente estudo, metanfetamina (MA) foi avaliada utilizando modelos in vitro e in vivo de isquemia cerebral transiente. Para o modelo in vitro, culturas de fatia hipocampal de rato foram desafiadas com privação de glicose-oxigênio. Em uma segunda série de experimentos, um modelo de gerbil de oclusão 2-VO 5-min foi utilizado em combinação com teste de comportamento para testar a eficácia neuroprotetora de MA in vivo. Durante o presente estudo f oi descoberto surpreendentemente e demonstrado que a administração de MA no prazo de 16 horas após isquemia cerebral transiente é na realidade neuroprotetora, reduzindo dano a células neuronais, incluindo morte.

Materiais e métodos

1.1 Animais

Todos os procedimentos experimentais com animais foram aprovados pela University Institutional Animal Care and Use committee. Vinte e oito gerbils da Mongólia machos, adultos (Meriones unguiculatus) pesando 60-80 g foram utilizados para experimentos in vivo. Esses animais foram alojados individualmente em um ambiente com luz (12 h de ciclo de claridade/escuridão) e temperatura (23°C) controladas. Pelotas comerciais para roedores, e água, foram fornecidos ad libitum.

1.2 Estudos de fatia hipocampal in vitro

Ratos neonatais (Sprague-Dawley) no dia 7 pós- natal (P7) foram decapitados e os hipocampos dissecados sob condições esterilizadas. Os hipocampos foram cortados em fatias de 4 00 μπι em um cortador de tecido McIlwain e fatias individuais foram cultivadas em membranas permeáveis Millicell (0,4 μΜ de tamanho de poro) em placas com seis cavidades a 37°C em 5% C02. Para os dois primeiros dias, as fatias foram mantidas em um meio de revestimento primário (50% DMEM (+) glicose, 25% HBSS (+) glicose, 25% de soro de cavalo inativado a calor, 5 mg/mL de D-glicose (Sigma), ImM Glutamax, 1,5% PenStrep/Fungizone (Gibco) e 5 mL de 50X B27 (Gibco) suplemento mais antioxidantes que foi trocado a cada 24 horas. No quarto dia, as fatias foram colocadas em meio neurobasal isento de soro (IOmL Neurobasal-A, 200 μ!· de 5OX B27 suplemento, ΙΟΟμ]^ de IOOX Fungizone, e 100 μΐι de IOOX Glutamax) e esse meio foi mudado a cada 48 horas. 24h antes da experimentação, as inserções foram colocadas em um meio neurobasal isento de soro e suplemento B27 sem antioxidantes. Antes da privação de oxigênio-glicose (OGD) , uma solução de sal balanceada isenta de glicose (BSS) (120 mM NACl, 5mM KCl, 1,2 5 mM NaH2PO4, 2mM MgSO4, 2mM CaCl2, 2 5 mM NaHCO3, 2 0 mM HEPES, 2 5 mM sacarose pH 7,3) foi infundida por 1 hora com 5% CO2 e lOL/h de gás de

2 0 nitrogênio. As inserções foram então transferidas para BSS

desoxigenado e colocadas em um tanque 37° (Pro-Ox) com um sensor de realimentação de oxigênio que mantinha níveis de gás a 0,1% 02, 5% C02, 94,4% Nitrogênio por 90 h. Após OGD, as fatias foram transferidas de volta para meios neurobasais pré-aquecidos e ensaiadas por protocolos experimentais.

1.3 Isquemia cerebral transiente

Gerbils foram anestesiados com isoflurano e a temperatura do corpo-núcleo mantida a 37-38°C durante

3 0 cirurgia utilizando uma coberta homeotérmica (Harvard Apparatus, South Natick, EUA). Uma incisão de linha média foi feita no pescoço e as artérias carótidas comuns foram isoladas e fechadas por 5 min. utilizando grampos de aneurisma com pressão de 85 g (ISCH; n=14) . Um segundo grupo de gerbils (SIMULAÇÃO; n=14) foi submetido ao procedimento idêntico exceto que as artérias carótidas não foram presas. A incisão foi suturada e os animais receberam MA (5 mg/kg; i.p.) ou volume igual de veiculo (solução salina; 0 mg) em 2 minutos de reperfusão. Os animais foram colocados em uma gaiola aquecida, e observados por 3 0 minutos. Tilenol (8 mg/ml) foi adicionado à água de beber para fornecer analgesia pós-operativa.

1.4 Teste de comportamento e avaliação histológica

Cada gerbil foi testado 4 8 h após cirurgia em um

aparelho de campo aberto consistindo em um piso de tela de metal com 77 cm χ 77 cm com paredes com 15 cm de altura. Os animais foram colocados na região central e permitidos explorar o ambiente novo por 5 minutos. Os dados de comportamento (distância percorrida, velocidade) foram coletados utilizando um sistema de rastreamento automatizado (ANY-maze, Stoelting, IL) e avaliados separadamente utilizando ANOVA e o teste post hoc apropriado (P <0,05, considerado significativo). Vinte e um dias após cirurgia gerbils foram submetidos à eutanásia com C02 e perfundidos com solução salina tamponada com fosfato seguido por 4% de paraformaldeído. 0 tecido de gerbils de simulação tratado com MA (SIMULAÇÃO + 0 mg) não foi avaliado uma vez que não se esperava que a administração 3 0 aguda de MA alterasse histologicamente o hipocampo desse grupo. Os cérebros foram removidos e pós-fixados por pelo menos 4 8 h antes da coleta de seções de vibratome de 4 0 μπι através da região hipocampal. Seções foram montadas em lâminas e coloridas com violeta de cresila. Dano à região Cal hipocampal foi avaliado sem conhecimento de condição de tratamento por dois observadores independentes utilizando uma escala de avaliação de 4 pontos descrita em outro lugar (Babcok e outros, 1993) . Uma marcação de 0 (4-5 camadas compactas de corpos neuronais normais), 1 (4-5 camadas compactas com presença de alguns neurônios alterados), 2 (corpos neuronais extras com "espaços fantasma" e/ou células gliais entre os mesmos), 3 (total ausência ou presença de corpos neuronais normais somente raros com gliose intensa do subcampo de CAI) foi atribuída para cada animal. As avaliações foram mediadas e avaliadas utilizando estatística não paramétrica (teste Kruskal-Wallis e Mann- Whitney U; P<0,05, considerado significativo).

Resultados

2.1 estudos de fatia hipocampal in vitro 2 0 Fatias hipocampais de rato expostas a 90 min. de

privação de oxigênio glicose (OGD) e tratadas com metanfetamina (MA) mostraram níveis significativamente diminuídos (p=<0,01) de absorção de iodeto de propídio (PI) indicando morte neuronal diminuída quando comparado com fatias de OGD somente (figura 1) . Em estudos de respostas de dose com MA, os requerentes observaram dosagem ótima com 250 μΜ MA e absorção de PI crescente à medida que a concentração aumentou ou diminuiu a partir dessa quantidade. Entretanto, em todas as concentrações testadas (125 μΜ, 250 μΜ, 500 μΜ, ImM) os requerentes observaram neuroproteção significativa (p=<0,01) quando comparado com fatias de OGD-somente.

Para elucidar adicionalmente o efeito de MA os requerentes adicionaram 250 μΜ em vários pontos de tempo após OGD e verificaram que MA diminuiu significativamente (p=<0,05) morte neuronal quando administrado até 16 h após OGD. A adição de MA 24 horas após-OGD diminuiu a morte neuronal, porém não diferiu significativamente de OGD.

2.2 Estudos de isquemia cerebral transiente Os gerbils apresentaram movimentos coordenados em

minutos de término de isoflorane. Os animais tratados com MA se tornaram piloeretos com suas caudas apontando para cima. Os animais foram testados em um aparelho de campo aberto 48 h após a cirurgia. Os gerbils que foram submetidos a insulto isquêmico sem tratamento MA percorreram 129,4 m (±2 0; SEM) enquanto controles de simulação com e sem tratamento com droga percorreram 72,7 m (±6) e 73,2 m (±7,5), respectivamente. Gerbils isquêmicos tratados com MA após cirurgia percorreram 66,3 m ± 5,6. A 2 0 análise de dados de atividade revelou uma interação significativa entre tratamento com droga e condições cirúrgicas (P<0,05). Comparações planejadas subsequentes indicaram que gerbils isquêmicos, na ausência de tratamento com MA, eram significativamente mais ativos em comparação com o grupo de simulação sem droga (P<0,05) . Gerbils isquêmicos e de simulação tratados com MA não eram significativamente diferentes (P>0,05). Finalmente, o tratamento com MA falhou em alterar significativamente os níveis de atividade em relação à condição de controle (SIMULAÇÃO + 0 mg vs. SIMULAÇÃO + 5 mg; P >0,05) . A análise de dados de velocidade (distância percorrida/tempo) revelou um padrão similar com gerbils isquêmicos tratados com solução salina (ISCH apresentando velocidades

significativamente mais rápidas em relação a todos os outros grupos experimentais (dados não mostrados).

As marcações de histopatologia e fotomicrografias representativas dos grupos avaliados são ilustradas nas figuras 3 e 4, respectivamente. Gerbils na condição ISCH + 0 mg apresentaram dano extenso à região hipocampal CAl. Quatro de seis gerbils nesse grupo tiveram total ausência de corpos neuronais normais com gliose intensa do subcampo CAI. Ao contrário, todos os gerbils no grupo DE SIMULAÇÃO + 0 mg foram classificados como não tendo dano detectável ao hipocampo (avaliação média 0 ± 0) . Seis dos animais no grupo ISCH + 5 mg MA apresentaram 4-5 camadas compactas de corpos neuronais normais no hipocampo (avaliação de grupo 0,07 ± 0,07). Somente 1 gerbil nessa condição apresentou algum dano detectável à região CAI. A análise de marcações de avaliação revelou uma diferença significativa entre os grupos (P < 0,05) . A avaliação subsequente de dados individuais do grupo indicou que condições DE SIMULAÇÃO + 0 mg e ISCH + 5 mg não eram significativamente diferentes (P > 0,05) e essas duas condições eram significativamente diferentes do grupo ISCH + 0 mg (P < 0,05) . Discussão

Os resultados do presente estudo indicam que se um agente neuroprotetor, por exemplo, MA é administrado no prazo de 16 horas após insulto isquêmico transiente, dano às células neuronais pode ser reduzido u evitado no hipocampo. MA, por exemplo, resultou em uma resposta neuroprotetora dependente de dose em culturas de fatia hipocampal de rato desafiadas com privação de oxigênio- glicose. A dose de 250 μΜ mostrou o maior grau de proteção e foi eficaz quando administrada até 16 horas após privação de oxigênio-glicose. 24 h pós-OGD a administração de MA não reduziu significativamente absorção de PI indicando que a dosagem de MA deve ocorrer em um período de tempo relativamente curto após OGD para ativar o(s) mecanismo(s) responsável(is) por reduzir dano neuronal e morte.

A eficácia neuroprotetora de MA também foi

demonstrada in vivo utilizando um modelo de isquemia transiente 2-VO 5-min de gerbil. A administração MA em 1-2 minutos de reperfusão evitou qualquer perda significativa de células piramidais Cal hipocampais. A avaliação

histológica revelou que gerbils isquêmicos tratados com MA apresentaram proteção quase total da região Cal hipocampal com somente 1 a 7 animais apresentando qualquer patologia neuronal detectável no hipocampo. Uma oclusão de carótida bilateral de 5 min. no gerbil produz atividade locomotora

2 0 aumentada que correlaciona com morte de células Cal

hipocampal (Wang e Corbett 1990; Babcock e outros, 1993) . A atividade locomotora de gerbils isquêmicos tratados com MA no presente estudo foi comparável com níveis de controle, que é indicativo de neuroproteção significativa. E

totalmente possível que a excitação e hiperatividade que anfetaminas produzem possam interagir com os efeitos comportamentais de isquemia. Entretanto, o teste de comportamento no presente estudo foi conduzido após a droga ter sido metabolizada (48 h) . Compatível com essa

3 0 interpretação foi a observação de que gerbils de controle tratados com MA não eram hiperativos em relação a animais que receberam solução salina (SIMULAÇÃO + 0 mg) . A dose de MA utilizada no experimento in vivo foi derivada de um relatório anterior que utilizou gerbils (Teuchert-Noodt e outros 2000; Araki e outros 2002) como modelo experimental. Os requerentes também conduziram um estudo preliminar no qual se verificou que doses de MA maiores do que 5 mg/kg (por exemplo, 10 e 20 mg/kg) eram letais em gerbils após cirurgia e não foram avaliadas adicionalmente. Anfetamina em combinação com treinamento mostrou

ser uma estratégia farmacológica promissora para recuperação de comportamento de derrame (vide Martinsson e Eksborg, 2 0 04) . A observação dos requerentes de que MA na realidade evita dano hipocampal detectável após insulto isquêmico se dado em um quadro de tempo específico após insulto, isto é, em 16 horas, representa uma nova descoberta. É observável que essas descobertas mostram que a neuroproteção é independente de qualquer treinamento comportamental após o insulto. É possível que a capacidade 2 0 de MA de proteger na realidade e evitar dano neuronal ao hipocampo, em contraste com os ensinamentos de tratamento da técnica anterior após ocorrência do dano, é efetuada in com isquemia cerebral transiente. Ao contrário de isquemia focai ou outros tipos de lesão cortical, isquemia cerebral transiente é caracterizada por um padrão de morte retardada de células limitada a células piramidais hipocampais. A reperfusão que segue o breve episódio isquêmico nesse modelo é um evento chave para a morte subsequente de células que ocorre 3-5 dias após insulto. Os estudos atuais de administração de MA antes de um evento de derrame agudo indicam que MA aumenta significativamente a morte neuronal (Wang e outros, 2001). Entretanto à luz das descobertas atuais dos requerentes, é totalmente possível que o tratamento com MA antes de um evento de derrame esgote depósitos de dopamina e norepinefrina que permanecem não disponíveis para liberação após um evento de derrame, e a diminuição subsequente em sinalização neuronal pode estar desempenhando um papel chave no dano observado em pré-tratamento com MA e derrame. A capacidade de CNSS, por exemplo, MA, de induzir uma liberação extremamente grande desses neurotransmissores em um período de tempo muito curto pode explicar parcialmente o efeito neuroprotetor que os requerentes observaram nos seus experimentos. A pesquisa adicional dirigida à compreensão do mecanismo neuroprotetor de agentes de CNSS pode elucidar adicionalmente o mecanismo exato e tratamento para eventos isquêmicos agudos.

A revelação tecnológica precedente descreve modalidades ilustrativas do método de reduzir a ocorrência de dano a células neuronais causado por hipoxia e/ou isquemia cerebral transiente e não pretende limitar a presente invenção a essas modalidades precisas. Além disso, quaisquer alterações e/ou modificações, que podem ser óbvias para uma pessoa com conhecimentos comuns na técnica relacionada, incluindo porém não limitado a derivados de sal farmacêutico ou alterações não funcionais pretendem ser incluídas no escopo da invenção. REFERÊNCIAS

Araki, H., Yamamoto, T., Kobayashi, Y., Futagami, K., Kawasaki, H., Gomita, Y. 2002. Effect of methamphetamine and imipramine on cerebral ischemia-induced hyperactivity in Mongolian gerbils. Japan Journal of Pharmacology 88, 293-299.

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Claims (16)

1. Uso de uma metanf etamina caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de um medicamento para reduzir a ocorrência de dano ou morte de células do cérebro causado por hipoxia e/ou isquemia cerebral transiente em um sujeito, por um método que compreende as etapas de: identificar um sujeito tendo uma condição hipóxica e/ou isquêmica cerebral transiente; e em 16 horas após início da condição, administrar ao sujeito uma quantidade terapêutica eficaz de uma metanfetamina.

2. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a metanfetamina administrada ao sujeito em quantidades de dosagem unitária, menores do que 5 mg/kg.

3. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o tratamento reduz a ocorrência de dano a células neuronais a células do cérebro do hipocampo.

4. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a condição é causada por pressão sangüínea baixa, perda de sangue, ataque cardíaco, lesão traumática do cérebro, sufocação, cirurgia, derrame, neuropatia óptica isquêmica, ou bloqueio de vias aéreas.

5. Uso, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a condição é causada por cirurgia cardíaca.

6. Uso, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a condição é causada por lesão traumática do cérebro.

7. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a administração ocorre em 14 horas após início da condição e somente uma dose única da metanfetamina é administrada.

8. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a administração é via uma injeção de bolo.

9. Uso, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a metanfetamina está em uma composição farmacêutica que compreende um veículo farmaceuticamente aceitável.

10. Uso, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a composição farmacêutica é uma formulação de liberação estendida.

11. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o sujeito é um ser humano que necessita desse tratamento.

12. Uso, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a condição é causada por um derrame isquêmico, cirurgia cardíaca ou neuropatia óptica isquêmica.

13. Uso, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a metanf etamina é administrada no prazo de 12 horas de cirurgia.

14. Uso, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a metanf etamina é administrada no prazo de 2 horas de cirurgia.

15.

Uso de uma metanfetamina na fabricação de um medicamento para reduzir a ocorrência de dano ou morte de células do cérebro causada por lesão traumática cerebral em um sujeito, caracterizado por um método que compreende as etapas de: identificar um sujeito tendo lesão traumática cerebral e no prazo de 16 horas após início da lesão, administrar ao sujeito uma quantidade terapêutica eficaz de uma metanfetamina.