PT1641436E - Formulação inalável de lisinato de aztreonam para tratamento e prevenção de infecções bacterianas pulmonares - Google Patents

Description

ΕΡ 1 641 436/ΡΤ

DESCRIÇÃO "Formulação inalável de lisinato de aztreonam para tratamento e prevenção de infecções bacterianas pulmonares"

ANTECEDENTES DO INVENTO

Campo do invento 0 presente invento refere-se a uma formulação inalável de lisinato de aztreonam nova, segura, não irritante e fisiologicamente compativel, adeguada para tratamento de infecções bacterianas pulmonares causadas por bactérias gram-negativas, tais como Escherichia coli, espécies de Enterobacteria, Klebsiella pneumoniae, K. oxytoca, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Serratia marcescens, Haemophilus influenzae, Burkholderia cepacia, Stenotrophomonae maltophilia, Alcaligenes xylosoxidans. Em particular, o invento refere-se à formulação inalável de lisinato de aztreonam derivado de α-aztreonam ou β-aztreonam adequada para tratamento e profilaxia de infecções bacterianas pulmonares agudas e crónicas, particularmente aquelas causadas por bactérias gram-negativas Burkholderia cepacia, Stenotrophomonae maltophilia, Alcaligenes xylosoxidans e Pseudomonas aeruginosa resistente a múltiplos fármacos, que são resistentes a tratamento com outros antibióticos. A formulação inalável de lisinato de aztreonam é entregue como um aerossol ou como um pó seco inalável. Para aerossolização, cerca de 1 a cerca de 250 mg de lisinato de aztreonam são dissolvidos em cerca de 1 a cerca de 5 mL de solução salina ou outra solução aquosa possuindo um pH entre 4,5 e 7,5, entregues ao espaço endobrônquico do pulmão num aerossol possuindo partículas de diâmetro aerodinâmico mediano em massa predominantemente entre 1 e 5 pm utilizando um nebulizador capaz de atomizar a solução de lisinato de aztreonam em partículas dos tamanhos requeridos. Uma combinação da nova formulação com o nebulizador de atomização permite a entrega de cerca de 50% da dose administrada de lisinato de aztreonam ao interior das vias aéreas. Para entrega de pó inalável seco, o lisinato de aztreonam é 2 ΕΡ 1 641 436/ΡΤ liofilizado, moído ou seco por pulverização até tamanhos de partícula entre cerca de 1 e 5 μιη. A formulação de pó seco ou um lisinato de aztreonam sólido reconstituído para aerossolização têm uma vida em prateleira longa e estabilidade no armazenamento. 0 invento refere-se adicionalmente a um processo para fabricação e à fabricação em grande escala de lisinato de a-aztreonam.

Antecedentes e revelações relacionadas

Uma ampla variedade de bactérias gram-negativas causam infecções pulmonares severas. Muitas destas bactérias são ou estão-se a tornar resistentes a antibióticos habitualmente utilizados ou de especialidade e requerem o tratamento com novos tipos de antibióticos. As infecções pulmonares causadas por bactérias gram-negativas são particularmente perigosas para pacientes que têm respostas imunoprotectoras diminuídas, tais como, por exemplo, pacientes de fibrose cística e de HIV, pacientes com bronquiectasia ou aqueles com ventilação mecânica. A terapia correntemente aceite para infecções bacterianas severas do tracto respiratório, particularmente para tratamento de pneumonia em pacientes com doenças subjacentes, inclui o tratamento com vários agentes antibacterianos intravenosos, frequentemente utilizados em combinações de dois ou três. A maioria destes agentes não são adequados, não estão disponíveis ou não estão aprovados pela FDA para administração oral ou por aerossol. Em alguns casos, a dose oral ou intravenosa sistémica eficaz requer doses que estão no limite ou que são francamente tóxicas impedindo assim muitas vezes a utilização de um antibiótico perfeitamente bom para tratamento das infecções pulmonares.

Assim seria desejável dispor de outros modos de vias de entrega destes antibióticos possibilitando uma entrega dirigida de quantidades mais pequenas do antibiótico ao espaço endobrônquico das vias aéreas para tratamento destas infecções bacterianas em vez de administrar o antibiótico sistemicamente em grandes quantidades. 3 ΕΡ 1 641 436/ΡΤ

Adicionalmente, pacientes cronicamente doentes são muitas vezes afectados por infecções causadas por bactérias que são grandemente resistentes a antibióticos habitualmente utilizados ou, pela utilização prolongada de certos antibióticos, desenvolvem muitas vezes forte resistência a um tal antibiótico. Por exemplo, a colonização pulmonar crónica com Pseudomonas aeruginosa em pacientes com fibrose cística é uma causa principal da sua elevada mortalidade. Quando estabelecida, a infecção pulmonar crónica é muito difícil, se não impossível, de erradicar. Mais de 60% dos pacientes de fibrose cística são colonizados com estirpes da bactéria Pseudomonas aeruginosa que são grandemente resistentes a antibióticos regulares e específicos, tais como piperacilina, ticarcilina, meropenem, netilmicina e apenas pouco sensíveis a azlocilina, ciprofloxacina, timentin e ceftazidima. Muitas estirpes têm também mostrado desenvolver resistência a tobramicina e a colistina, se utilizadas continuamente.

Frequentemente, após terapia prolongada com antibióticos, desenvolve-se uma superinfecção com organismos intrinsecamente resistentes a antibióticos orais, intravenosos ou inalados em pacientes com fibrose cística e outras infecções pulmonares crónicas. Os quatro organismos resistentes a fármacos mais comuns são Burkholderia cepacia, Stenotrophomonas maltophilia, Alcaligenes xylosoxidans e Pseudomonas aeruginosa resistente a múltiplos fármacos.

Pacientes de fibrose cística infectados com Burkholderia cepacia têm uma taxa de mortalidade acrescida comparada com aqueles pacientes com infecções de Pseudomonas aeruginosa. Em alguns pacientes de fibrose cística, a Burkholderia cepacia pode causar uma fatalidade rápida, como descrito, por exemplo em Am. J. Respir. Crit. Care Med., 160: 5, 1572-7 (1999) . O elevado nível de resistência a antibióticos, demonstrado pela maioria das estirpes de Burkholderia cepacia, limita gravemente as opções terapêuticas para o seu tratamento (Clinics Chest Med., 19:473-86 (Set. 1998)). Para além disso, ao contrário da Pseudomonas aeruginosa, a Burkholderia cepacia pode causar uma disseminação epidémica entre pacientes de fibrose cística e por este motivo qualquer 4 ΕΡ 1 641 436/ΡΤ paciente infectado com Burkholderia cepacia é usualmente isolado de outros pacientes. Isto não apenas origina despesas adicionais relacionadas com o cuidado destes pacientes mas também pode ser psicologicamente devastador para o paciente. Para além disso, a maioria dos centros de transplante de pulmão não realizará um transplante de pulmão em pacientes infectados com Burkholderia cepacia (Clinics Chest Med., 19:473-86 (Set. 1998)). Deste modo, a infecção por Burkholderia cepacia é muitas vezes encarada como uma sentença de morte por pacientes com fibrose cística. A Burkholderia cepacia é usualmente resistente à entrega parentérica de vários antibióticos, incluindo lisinato de aztreonam, com apenas 5% dos isolados sendo sensíveis a um tal tratamento (Antimicrob. Agents Chemother., 34: 3, 487-8 (Mar. 1990)). Assim, seria vantajoso dispor de um tratamento para infecções por Burkholderia cepacia.

Outras bactérias gram-negativas intrinsecamente resistentes a tobramicina podem também complicar o cuidado de um paciente com fibrose cística. Estas bactérias incluem Stenotrophomonas maltophília e Alcaligenes xylosoxidans. A terapia com antibióticos destas infecções é também usualmente ineficaz ou conduz ao rápido aparecimento de resistência a fármacos. Por conseguinte, o tratamento bem-sucedido de todas estas infecções requer que amostras destes isolados sejam enviadas para um laboratório para determinação de sinergias complexas de antibióticos para determinação da terapia apropriada para cada paciente individual (Ped. Pulmon., S17: 118-119 (1998)). Por conseguinte, seria também vantajoso proporcionar uma terapia para estas infecções bacterianas raras mas difíceis de tratar.

Similarmente, o desenvolvimento de infecções de P. aeruginosa com estirpes que são resistentes, isto é que têm uma concentração inibitória mínima (CIM) elevada, a uma maioria de antibióticos incluindo tobramicina, permite antever o declínio da função do pulmão e também pode desqualificar o paciente para efeitos de transplante do pulmão (Clinics Chest Med., 19:535-554 (Set. 1998)). 5 ΕΡ 1 641 436/ΡΤ

Os tratamentos com antibióticos existentes para infecções pulmonares por Burkholderia cepacia, Stenotrophomonas maltophilia, Alcaligenes xylosoxidans e Pseudomonas aeruginosa resistente a múltiplos fármacos ou são ineficazes ou conduzem ao rápido surgimento de resistência a fármacos. 0 aztreonam é um antibiótico sintético que possui uma boa actividade biológica contra bactérias gram-negativas e o seu sal de arginina derivado da forma beta tem sido anteriormente utilizado para tratamento intravenoso de infecções bacterianas. No entanto, a sua utilização está seriamente limitada devido a sua baixa eficácia requerendo a administração de doses intravenosas muito grandes entre 1000 e 4000 mg por dia de modo a tratar as infecções causadas por bactérias gram-negativas e também pela sua derivatização na forma de sal que não é adequada para o propósito de inalação. Ainda que fosse um antibiótico a seleccionar para tratamento complementar de pacientes tratados com tobramicina ou outros antibióticos, um tal tratamento não é prático por causa das doses elevadas requeridas e por causa da complicação encontrada com o sal de arginina. O aztreonam presentemente apenas está disponível como um sal de arginina. A arginina tem mostrado ser tóxica para o pulmão e causa irritação do tecido do pulmão, inflamação, broncospasmo e tosse, e por isso não é adequada para entrega por aerossolização. Consequentemente, o sal de arginina de aztreonam não está aprovado para utilização por inalação nem nos Estados Unidos da América nem em qualquer outro lugar. No entanto, como o antibiótico para tratamento de infecções bacterianas pulmonares causadas por bactérias gram-negativas, o aztreonam poderia tornar-se um fármaco escolhido para um tal tratamento, se pudesse ser entregue por inalação em concentrações terapeuticamente eficazes directamente aos pulmões e se os problemas relacionados com o aztreonam arginina pudessem ser ultrapassados proporcionando um derivado de sal diferente, mais seguro e fisiologicamente aceitável. A administração eficaz de aztreonam por inalação é adicionalmente complicada por uma ausência de formulações 6 ΕΡ 1 641 436/ΡΤ seguras, fisiologicamente aceitáveis e estáveis para utilização por inalação. Para além do sal fisiologicamente aceitável, esta formulação tem de satisfazer vários critérios, tais como um certo intervalo de tamanhos das partículas inaláveis, um certo intervalo de pH e um certo grau de salinidade. Quando o aerossol contém um grande número de partículas com um diâmetro aerodinâmico mediano em massa (MMAD) superior a 5 pm, estas são depositadas nas vias aéreas superiores diminuindo a quantidade de antibiótico entregue ao local de infecção no espaço endobrônquico das vias aéreas.

Similarmente, as condições altamente ácidas e alcalinas ou hipotónicas ou hipertónicas conduzem ambas a complicações respiratórias, tais como broncospasmo e tosse, impedindo a inalação do fármaco.

Assim, é um objectivo principal deste invento proporcionar uma formulação de aztreonam para inalação adequada para entrega eficaz de aztreonam ao interior do pulmão para tratamento de infecções pulmonares gram-negativas, especialmente aquelas causadas por Burkholderia cepacia, Stenotrophomonas maltophilia, Alcaligenes xylosoxidans e Pseudomonas aeruginosa resistente a múltiplos fármacos, proporcionando uma formulação segura, fisiologicamente aceitável e eficaz para inalação de um sal de lisinato de aztreonam puro concentrado, formulação que contém uma concentração suficiente mas não excessiva de cerca de 75 mg/mL de lisinato de aztreonam, formulação que pode ser eficientemente aerossolizada por nebulização utilizando nebulizadores de jacto, ultra-sónicos ou de atomização, num aerossol possuindo tamanhos de partícula dentro de um intervalo de 1 a 5 pm, ou administrada como um pó seco, bem tolerado não só por pacientes com fibrose cística mas também com função pulmonar debilitada devido a infecções, inflamação ou outra doença subjacente. É outro objectivo deste invento proporcionar um processo para fabricação de lisinato de a-aztreonam a partir de α-aztreonam em grande escala. A WO 03/035030 descreve um kit para a preparação de uma composição farmacêutica líquida. A WO 02/051356 descreve aztreonam inalável para tratamento e prevenção de infecções bacterianas pulmonares. 7 ΕΡ 1 641 436/ΡΤ

Sumário 0 presente invento proporciona um processo para a preparação de uma formulação inalável de pó seco de lisinato de aztreonam consistindo de lisinato de aztreonam, o processo compreendendo os passos de: a) solubilização da forma alfa de aztreonam em água para formar uma lama; b) adição de uma solução aquosa de lisina para formar lisinato de aztreonam em solução; e c) secagem do lisinato de aztreonam a partir da solução por liofilização ou secagem por pulverização; e onde o lisinato de aztreonam é moído, precipitado, seco por pulverização ou de outro modo processado até um tamanho de partícula entre 1 e 5 mícron. É descrito um método para tratamento de infecções pulmonares causadas por bactérias gram-negativas por inalação de lisinato de aztreonam aerossolizado. É também descrito um método para tratamento de infecções bacterianas pulmonares causadas por bactérias gram-negativas, o referido método compreendendo a administração de um lisinato de aztreonam puro concentrado inalável numa forma de pó seco ou como um aerossol contendo de cerca de 1 a cerca de 250 mg de lisinato de aztreonam, o referido lisinato de aztreonam administrado numa forma de pós seco inalável ou dissolvido em de cerca de 1 a cerca de 5 mL de uma solução aerossolizável de pH entre 4,5 e 7,5 contendo de cerca de 0,1 a cerca de 0,9% de cloreto ou outro anião ao espaço endobrônquico das vias aéreas do pulmão de um paciente necessitado do mesmo por nebulização num aerossol possuindo um diâmetro aerodinâmico mediano em massa entre cerca de 1 e cerca de 5 pm, uma ou várias vezes por dia tipicamente até uma dose diária de lisinato de aztreonam de 350 mg por dia mas em caso algum não superior a 750 mg por dia. É descrito um método para tratamento de infecções bacterianas pulmonares causadas por Escherichia coli, espécies de Enterobacteria, Klebsiella pneumoniae, K. oxytoca, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Serratia 8 ΕΡ 1 641 436/ΡΤ marcescens, Haemophilus influenzae, Burkholderia cepacia, Stenotrophomonas maltophilia, Alcaligenes xylosoxidans e Pseudomonas aeruginosa resistente a múltiplos fármacos utilizando uma formulação inalável de lisinato de aztreonam entregue por inalação ao espaço endobrônquico das vias aéreas numa forma de pó seco ou num aerossol. É descrita uma composição inalável farmaceuticamente aceitável compreendendo de cerca de 75 mg/ml de aztreonam, a referida composição adequada para tratamento de infecções bacterianas pulmonares causadas por bactérias gram-negativas onde o referido lisinato de aztreonam ou o seu sal farmaceuticamente aceitável são preparados como um pó seco inalável ou como uma solução aerossolizável. É descrita uma formulação de lisinato de aztreonam aerossolizada compreendendo de cerca de 25 a cerca de 90 mg/mL, preferivelmente 75 mg/mL de aztreonam dissolvidos em de cerca de 1 a 5 mL de uma solução salina normal ou diluída ou outra solução aquosa, possuindo pH entre 4,2 e 7,5. É descrita uma formulação compreendendo de cerca de 1 a cerca de 250 mg de lisinato de aztreonam numa solução salina diluída com uma concentração salina desde um décimo até metade da normal ou noutro solvente aquoso contendo cloreto ou outro anião, onde a referida formulação tem um pH entre 5,5 e 7,0 e é entregue por aerossolização em cerca de 1-5 mL de solução onde o aerossol tem partículas do MMAD predominantemente entre 1 e 5 pm, onde a referida formulação é nebulizada utilizando um nebulizador de jacto, de atomização, electrónico ou ultra-sónico. É descrita uma formulação de pó seco compreendendo de cerca de 1 a 200 mg de lisinato de α-aztreonam, onde a referida formulação é liofilizada, moída, seca por pulverização ou precipitada num pó fino possuindo partículas com o MMAD entre 1 e 5 pm utilizadas para inalação do pó seco administrado de uma a quatro vezes por dia não excedendo 750 mg por dia. É descrito um processo para fabricação de uma solução padrão ou de um lisinato de α-aztreonam liofilizado puro 9 ΕΡ 1 641 436/ΡΤ compreendendo cerca de 75 mg de aztreonam por 1 mL de solvente. 0 processo de fabricação pode ser utilizado para preparação de lisinato de α-aztreonam a partir de a-aztreonam sem necessidade de conversão de α-aztreonam em β-aztreonam, onde o lisinato de α-aztreonam resultante tem uma melhor estabilidade, pureza mais elevada e melhor rendimento. É descrito um sistema de reconstituição de dois componentes compreendendo um lisinato de α-aztreonam em forma de pó seco ou liofilizado e um diluente armazenados separadamente até à utilização.

Breve descrição das Figuras A Figura 1 é um esquema ilustrando parâmetros de liofilização utilizados para fabricação de um lisinato de a-aztreonam liofilizado. A Figura 2 é um gráfico mostrando a análise de impurezas de soluções padrão e liofilizados de α-aztreonam preparados de acordo com o procedimento de fabricação I em comparação com aztreonam ácido livre expressas como um ingrediente farmacêutico activo (API). A Figura 3 é um gráfico mostrando a análise de impurezas de soluções padrão e liofilizados de β-aztreonam preparados de acordo com o procedimento de fabricação I em comparação com aztreonam ácido livre expressas como um ingrediente farmacêutico activo (API). A Figura 4 é um gráfico mostrando a análise de impurezas de soluções padrão e liofilizados de α-aztreonam preparados de acordo com o procedimento de fabricação II em comparação com aztreonam ácido livre expressas como um ingrediente farmacêutico activo (API). A Figura 5 é um gráfico mostrando a análise de impurezas de soluções padrão e liofilizados de β-aztreonam preparados de acordo com o procedimento de fabricação II em comparação 10 ΕΡ 1 641 436/ΡΤ com aztreonam ácido livre expressas como um ingrediente farmacêutico activo (API). A Figura 6 é um gráfico mostrando a análise de impurezas de soluções padrão, liofilizados e liofilizados reconstituídos de α-aztreonam preparados de acordo com o procedimento de fabricação II em comparação com aztreonam ácido livre expressas como um ingrediente farmacêutico activo (API) . A Figura 7 mostra a actividade de lisinato de aztreonam contra P. aeruginosa na ausência (Figura IA) ou na presença (Figura 1B) de mucina gástrica de porco. Adicionou-se lisinato de aztreonam para produzir uma concentração nos múltiplos da CIM seguintes: 0,0 (♦) ; 0,1 (□) ; 1,0 () ; e 10 (0) . Figura IA, sem adição de mucina; Figura 1B, com adição de 10% de mucina. A Figura 8 mostra a actividade de lisinato de aztreonam contra P. aeruginosa na presença ou ausência de esputo de fibrose cística (CF). Adicionou-se lisinato de aztreonam para produzir uma concentração nos múltiplos da CIM seguintes: 0,0 (♦) ; 0,1 (□) ; 1,0 () ; e 10 (0). Figura 2A, sem adição de esputo; Figura 2B, com adição de 1% de esputo. A Figura 9 mostra a actividade de tobramicina contra P. aeruginosa na presença ou ausência de mucina adicionada. Adicionou-se tobramicina para produzir uma concentração nos múltiplos da CIM seguintes: 0,0 (♦); 1,0 (□) ; e 10 () .

Figura 3A, sem adição de mucina; Figura 3B, com adição de 10% de mucina.

Definições

Como aqui utilizados: "MMAD" significa diâmetro aerodinâmico mediano em massa. "Solução salina normal" significa uma solução aquosa contendo 0,9% (ρ/v) de NaCl. 11 ΕΡ 1 641 436/ΡΤ "Solução salina diluída" significa solução salina normal contendo 0,9% (p/v) de NaCl diluída na sua força inferior de cerca de 0,1% a cerca de 0,8%. "Solução salina meia normal" ou "1/2 NS" significa solução salina normal diluída até metade da sua força contendo 0,45% (p/v) de NaCl. "Solução salina um quarto normal" ou "1/4 NS" significa solução salina normal diluída até um quarto da sua força contendo 0,225% (p/v) de NaCl. "Solução salina um décimo normal" ou "1/10 NS" significa solução salina normal diluída até um décimo da sua força contendo 0,09% (p/v) de NaCl. "CF" significa fibrose cística. "Predominantemente" significa incluindo pelo menos 70% mas preferivelmente 90% de tamanhos de partícula entre 1 e 5 pm. "Solução fisiologicamente aceitável" significa uma solução salina diluída até entre 1/10 NS ou 1 NS ou outra solução aquosa compreendendo de cerca de 31 a cerca de 154 mM de cloreto ou uma concentração equivalente de bromo ou iodo. "Composição" significa uma formulação contendo lisinato de a- ou β-aztreonam adicionalmente contendo outros componentes, tais como excipientes, diluentes, soluções isotónicas, tampões, etc. "Formulação" significa uma composição específica formulada para utilização específica, tal como para aerossolização de uma solução contendo lisinato de a- ou β-aztreonam ou nebulização de pó seco. "Composição de lisinato de aztreonam", "formulação de lisinato de aztreonam" ou "lisinato de aztreonam" significa uma composição ou formulação compreendendo uma quantidade indicada de sal de lisinato de α-aztreonam ou β-aztreonam. Assim, por exemplo, se a dose de lisinato de aztreonam 12 ΕΡ 1 641 436/ΡΤ compreende a quantidade molar de aztreonam base livre contém 1,8 vezes a quantidade molar de lisina. Deve ser entendido que ambos os lisinatos de a- e β-aztreonam estão abrangidos pelo termo "lisinato de aztreonam" a não ser que designado especificamente como lisinato quer de α-aztreonam quer de β-aztreonam. "Lisinato de aztreonam concentrado" significa lisinato de a- ou β-aztreonam concentrado numa forma que permite a diluição de, ou de mais de, 75 mg de aztreonam em 1 mL de diluente. "Forma alfa de aztreonam" ou "α-aztreonam" significa uma configuração estereoquimica alfa de aztreonam. A forma alfa de aztreonam é distinguível das formas beta, gama e delta de aztreonam. Cada forma parece ter propriedades químicas e físicas diferentes, tais como, por exemplo, estabilidade, ponto de cristalização e curva de difracção. Diferenças entre estas duas formas são descritas, por exemplo na Patente dos E.U.A. 4 946 838. Os sais de arginina de alfa ou beta aztreonam estão descritos no pedido de patente EP 0 297 580 BI. As formas alfa, beta, gama e delta de aztreonam e as suas propriedades químicas e físicas estão descritas na Patente dos E.U.A. 4 826 973. "Composição de lisinato de α-aztreonam" ou "formulação de lisinato de α-aztreonam" significa uma composição ou formulação compreendendo uma quantidade indicada de sal de lisinato de α-aztreonam. A composição de lisinato de a-aztreonam pode compreender tipicamente de cerca de 50 mg a cerca de 300 mg de α-aztreonam anidro e de cerca de 35 mg a cerca de 420 mg de lisina monoidrato por um mililitro de água para injecção. "Liofilizado" significa um resíduo seco de lisinato de α-aztreonam obtido por um processo de liofilização a partir de uma solução padrão de lisinato de a-aztreonam.

DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO O presente invento refere-se a uma constatação de que um lisinato de aztreonam inalável formulado especificamente, 13 ΕΡ 1 641 436/ΡΤ particularmente lisinato de α-aztreonam, é eficaz para o tratamento de infecções pulmonares causadas por bactérias gram-negativas.

Consequentemente, descrevemos aqui uma composição inalável e um método de tratamento para infecções bacterianas pulmonares causadas por Escherichia coli, espécies de Enterobacter, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Serratia marcescens, Haemophilus influenzae, incluindo estirpes resistentes à ampicilina e outras estirpes produtoras de penicilinases e espécies de Nitrobacter bem como para tratamento de bactérias mais raras, tais como Burkholderia cepacia, Stenotrophomonas maltophilia, Alcaligenes xylosoxidans e Pseudomonas aeruginosa resistente a múltiplos fármaco. 0 lisinato de aztreonam é entregue ao espaço endobrônquico das vias aéreas de um paciente por inalação de um pó seco ou de uma solução de aerossol. 0 método de tratamento de infecções bacterianas pulmonares é especialmente adequado para tratamento de pacientes com fibrose cística, bronquiectasia e pacientes com pneumonia assistidos por ventiladores, no entanto é também útil para tratamento de outras condições que são complicadas por infecções causadas por Burkholderia cepacia, Stenotrophomonas maltophilia, Alcaligenes xylosoxidans e Pseudomonas aeruginosa resistente a múltiplos fármacos ou outras bactérias gram-negativas. É descrita uma nova composição inalável de lisinato de aztreonam, eficaz, segura, não irritante e fisiologicamente compatível, adequada para tratamento de infecções bacterianas pulmonares causadas por bactérias gram-negativas particularmente aquelas que são resistentes a tratamento com outros antibióticos. A formulação inalável de lisinato de aztreonam é adequada tanto para tratamento como para profilaxia de infecções pulmonares agudas e crónicas. A formulação inalável é entregue como um aerossol ou como um pó seco inalável. Para aerossolização, o lisinato de aztreonam é dissolvido num volume mínimo de cerca de 1 a cerca de 5 mL de um solvente aquoso compreendendo um ião cloreto, bromo ou iodo, possuindo um pH entre 4,2 e 7,5, entregue ao espaço 14 ΕΡ 1 641 436/ΡΤ endobrônquico num aerossol possuindo partículas de MMAD predominantemente entre 1 e 5 pm utilizando um nebulizador capaz de aerossolizar a solução de lisinato de aztreonam em partículas dos tamanhos requeridos. 0 presente invento refere-se à constatação de que o lisinato de aztreonam derivado do α-aztreonam, em comparação com o β-aztreonam, tem melhores propriedades e está mais adaptado para preparação do sal de lisinato de aztreonam para um produto inalável. A utilização do α-aztreonam para preparação de lisinato de aztreonam proporciona vantagens demonstráveis não só nos processos de fabricação mas também resulta no produto com pureza mais elevada e melhor estabilidade. 0 processo para preparação de um lisinato de a-aztreonam puro e estável é novo pelo facto de, até agora, o a-aztreonam ter sido descrito como um intermediário instável adequado apenas para preparação de β-aztreonam estável e a sua conversão em β-aztreonam era requerida para a preparação de aztreonam arginina terapeuticamente útil.

Constatou-se agora que o lisinato de aztreonam derivado do α-aztreonam, em comparação com o β-aztreonam, preparado de acordo com o processo do invento, resulta num produto mais puro. A utilização de α-aztreonam para preparação de lisinato de α-aztreonam proporciona vantagens demonstráveis em processos de fabricação de um produto liofilizado ou de pó seco e resulta no produto com pureza mais elevada e melhor estabilidade. I. Lisinato de aztreonam para inalação 0 aztreonam é um composto conhecido pelo seu nome químico ácido (Z)-2-[[[(2-amino-4-tiazolil)[[(2S,3S)-2-metil-4-oxo-l-sulfο-3-azetidinil]carbamoiljmetileno]amino]oxi]-2-metil-propiónico. 0 aztreonam é um antibiótico sintético conhecido com actividade antibacteriana contra a maioria das bactérias gram-negativas. 0 aztreonam é uma monobactama e como tal possui um núcleo beta-lactama monocíclico único, e por isso é 15 ΕΡ 1 641 436/ΡΤ estruturalmente diferente de outros antibióticos de β-lactama tais como, por exemplo penicilinas, cefalosporinas ou cefamicinas. 0 substituinte ácido sulfónico na posição 1 do anel activa a porção beta-lactama. Uma cadeia lateral de aminotiazoliloxima na posição 3 e um grupo metilo na posição 4 conferem o espectro antibacteriano especifico e a estabilidade de beta-lactamase. 0 aztreonam é quimicamente conhecido e está disponível nas formas alfa, beta, gama e delta. 0 sal de arginina de aztreonam, conhecido pelo seu nome comercial AZACTAM® é derivado da forma beta. 0 AZACTAM® (aztreonam arginina para injecção, USP) disponível comercialmente na DURA Pharmaceuticals, Inc., San Diego, Califórnia, contém sal de arginina de aztreonam como o ingrediente activo, e está actualmente aprovado pela FDA apenas para utilização intramuscular ou intravenosa (PDR, pág. 1159 (2001)). A. Desvantagens do sal de arginina de aztreonam

Actualmente, o único aztreonam disponível comercialmente (AZACTAM®) compreende arginina que se verificou causar inflamação pulmonar quando administrado numa forma de aerossol ao pulmão dos pacientes humanos. Quando utilizado como um agente mucolitico aerossolizado potencial em pacientes com fibrose cística, causou a inflamação do pulmão, broncospasmo e irritação. Um estudo descrito em Pediatrics, 55:96-100 (1975) identifica a arginina como um substrato para produção de radicais de óxido nítrico e recomenda que a arginina não deverá ser utilizada para inalação em pacientes. 0 radical óxido nítrico reage com o anião superóxido para formar peronitrilo, que é em si mesmo tóxico para o tecido e também pode formar ainda um radical hidroxilo altamente reactivo e tóxico. Uma vez que a inflamação é um problema grave para a fibrose cística e todas as outras doenças que este invento tenta tratar, a utilização do sal de arginina não é adequada uma vez que iria contrariar este propósito e agravar em vez de melhorar as condições do paciente. 16 ΕΡ 1 641 436/ΡΤ A arginina é também um substrato importante para a lesão por imunocomplexos no pulmão, como revelado em PNAS, 14:6338-6342 (1991). Uma vez que a aerossolização concentra níveis elevados do fármaco aerossolizado no pulmão em comparação com a diluição observada após administração intravenosa, a aerossolização do sal de arginina de aztreonam seria prejudicial em vez de vantajosa para tratamento de pacientes de fibrose cística ou de pacientes padecendo de infecções pulmonares. Além disso, iria diluir e/ou anular o efeito de aztreonam.

Porque é formulado como sal de arginina, o aztreonam arginina não é adequado nem está aprovado para tratamento por inalação e administração de aerossol nos Estados Unidos da América. Consequentemente, não existe qualquer formulação conhecida contendo aztreonam ou lisinato de aztreonam disponível para entrega por aerossol ao espaço endobrônquico das vias aéreas. A única tentativa para entregar aztreonam arginina intermitentemente a sujeitos com fibrose cística é descrita em Spanish Annals on Pediatrics, 40: No. 3 (1994) onde esta tentativa foi efectuada num ensaio aberto em pacientes com fibrose cística com 500 e 1000 mg de AZACTAM® USP, sal de arginina, administrados intermitentemente, duas vezes ao dia durante 21 dias, utilizando a unidade nebulizadora CR60 System 22. 0 propósito deste estudo foi tratar organismos de Pseudomonas aeruginosa sensíveis a aztreonam, mas não Pseudomonas aeruginosa resistente a múltiplos fármacos. Não foi desenvolvido qualquer esforço para tratar Burkholderia cepacia, Stenotrophomonas maltophilia, infecções causadas por Alcaligenes xylosoxidans ou outras bactérias gram-negativas.

Com base nestas observações, de modo a proporcionar uma forma inalável segura de aztreonam, é claramente necessário outro sal de aztreonam para tratamento de infecções pulmonares por inalação. Constatou-se que o lisinato de aztreonam, particularmente lisinato de aztreonam derivado de α-aztreonam, é farmacologicamente muito aceitável para propósitos de inalação sem causar quaisquer reacções indesejáveis. 17 ΕΡ 1 641 436/ΡΤ Ο sal de lisinato de aztreonam farmaceuticamente aceitável preferido é derivado da reacção de a- ou β-aztreonam com lisina. B. Lisinato de a- e β-aztreonam

Anteriormente, a preparação de sais de arginina de aztreonam e outros, mas não lisinato, envolviam quase exclusivamente a forma β de aztreonam. Constatou-se anteriormente que a forma alfa de aztreonam era instável e não utilizável para preparação de composições terapêuticas. Por outro lado, o β-aztreonam era considerado a forma estável e se se utilizasse de todo α-aztreonam este era primeiro convertido em β-aztreonam. A Patente dos E.U.A. N.° 4 946 838 apresenta evidência conclusiva de que, até à data, o α-aztreonam é considerado uma forma instável de aztreonam que tem de ser convertida no β-aztreonam antes de ser utilizada para preparação de qualquer produto terapêutico. a. Estabilidade de a- e β-aztreonam 0 aztreonam pode existir em qualquer das formas anidras amorfa e cristalina ou em formas hidratadas e solvatadas cristalinas. As formas amorfas e hidratadas interconvertem-se sob certas condições de temperatura e humidade, e são ambas instáveis. No estado sólido, as formas anidras cristalina e solvatada mostram boa estabilidade sem interconversão. No entanto, na presença de excipientes que libertam humidade, a forma cristalina anidra rapidamente se decompõe numa extensão dependente do teor de humidade e da temperatura. A estabilidade do composto a- ou β-aztreonam é determinada pela sua perda a várias temperaturas. A especialidade anterior suporta a convicção geral de que o a-aztreonam é uma forma instável de aztreonam. De acordo com relatos da especialidade anterior, após uma semana de armazenamento, o α-aztreonam mostra uma perda de aproximadamente 1% à temperatura ambiente enquanto a 80 °C a perda atinge 80%. Em contraste, após 12 meses de armazenamento a uma temperatura entre -20°C e 40°C, ο β- 18 ΕΡ 1 641 436/ΡΤ aztreonam tem menos de 2% de aumento no nível de impurezas e uma diminuição de 3,0 a 3,5% em potência. Com base nestes resultados, o β-aztreonam poderia parecer um composto melhor e mais estável.

No entanto, constatou-se que o lisinato de a-aztreonam preparado de acordo com o processo do invento contém menos impurezas e tem uma melhor estabilidade e assim é um composto mais puro e estável. 2. Pureza de «- e β-aztreonam

Para preparação de um produto inalável, o ingrediente activo tem de ser relativamente puro ou tem de ser purificado para remover impurezas que causam ou potencialmente causariam broncospasmo, inflamação, irritação ou tosse. Consequentemente, o aztreonam para inalação tem de ser preparado numa forma pura ou tem de ser purificado. 0 tipo e grau de impurezas na formulação para inalação são importantes e têm um impacto específico na estabilidade a longo prazo do fármaco e na vida em prateleira do produto final.

De acordo com a especialidade anterior, a forma cristalina de α-aztreonam é considerada um intermediário instável que tem de ser convertido no β-aztreonam estável. Esta conversão é conseguida por recristalização de a-aztreonam a partir de um solvente orgânico, tipicamente etanol, num β-aztreonam muito estável. No entanto, como consequência do passo de recristalização, o β-aztreonam recristalizado contém tipicamente entre 1-2% de solvente orgânico residual e outras impurezas. A presença destas impurezas torna o β-aztreonam menos adequado para entrega por inalação.

Um processo de recristalização para preparação de β-aztreonam a partir de α-aztreonam utiliza etanol como solvente. No entanto, a utilização deste processo conduz a entre 5000-10000 ppm de etanol residual permanecendo no β-aztreonam preparado. A FDA limita uma presença permissível de etanol a menos de 5000 ppm. Além disso, com o tempo, a 19 ΕΡ 1 641 436/ΡΤ presença do etanol residual em β-aztreonam conduz à produção de éster de etilo, uma impureza que é indesejável e não está presente no a-aztreonam.

No processo de desenvolvimento deste invento constatou-se inesperadamente que, para preparação de uma solução padrão ou de uma forma liofilizada de lisinato de aztreonam para aerossolização ou nebulização, o α-aztreonam, que anteriormente se pensava ser instável, era de facto uma forma preferida de um material de partida para produção de lisinato de aztreonam. Quando comparado com o β-aztreonam, verificou-se que o lisinato de α-aztreonam continha menos impurezas. Adicionalmente, o processo para a sua preparação é mais fácil, mais rápido e não requer a utilização de solventes orgânicos que deixam impurezas residuais. 0 lisinato de α-aztreonam preparado de acordo com o processo do invento é um composto substancialmente puro não contendo qualquer quantidade substancial de impurezas e contaminantes. 3. Solubilidade de a- e β-aztreonam

Para preparação de produtos farmacêuticos inaláveis, é importante a solubilidade do ingrediente activo, neste caso aztreonam, em água ou solventes aquosos. 0 β-aztreonam é relativamente insolúvel em água e precipita numa matéria particulada e forma aglomerados quando misturado com água ou outro solvente aquoso durante um passo de dissolução do processo para preparação do sal de lisina. Esta precipitação e formação de aglomerados conduz a um aumento de impurezas pelo menos parcialmente causado por abertura de um anel nucleófilo de cadeia aberta. Na presença de humidade e sob várias condições de temperatura e humidade, a abertura do anel nucleófilo de cadeia aberta aumenta imprevisivelmente resultando na instabilidade mais elevada do composto. Os dados dos ensaios mostram que os niveis de impurezas iniciais gerados pela reacção do β-aztreonam com sal de lisina estão na gama do 1% e próximos do nível de impurezas permitido pela FDA. 20 ΕΡ 1 641 436/ΡΤ

Por outro lado, os níveis de impurezas de lisinato de a-aztreonam gerados por uma reacção directa de α-aztreonam com um sal de lisina são inferiores a 0,1%. O lisinato de α-aztreonam preparado de acordo com o processo do invento é um composto puro que se dissolve prontamente em solventes aquosos, tais como solução salina ou água. 4. Comparação das propriedades de a- e β-aztreonam

Determinaram-se as propriedades de a- e β-aztreonam e a sua adequabilidade para serem utilizados num processo de fabricação de uma solução padrão e liofilizado ou pó seco de lisinato de a- e β- aztreonam para inalação e realizaram-se as observações seguintes.

Para preparação de lisinato de aztreonam adequado para inalação, é importante que um composto de partida, a- ou β-aztreonam, seja prontamente solúvel em água e tenha um pH fisiológico manejável. a. β-Aztreonam

Quando estudado face aos requisitos acima enunciados, durante a fabricação de soluções padrão para secagem criogénica e liofilização, constatou-se que o β-aztreonam não pode ser suspenso em água a valores de pH intrínsecos porque começa imediatamente a polimerizar e a perder a cor. Independentemente da temperatura, a concentrações variando de 50 a 150 mg/mL de água o β-aztreonam gelifica em 15 minutos. Isto elimina a possibilidade de se utilizarem reacções pelas quais uma solução de lisina seria adicionada a β-aztreonam. A única outra possibilidade para preparação de lisinato de β-aztreonam é por isso adicionar β-aztreonam à solução de lisina.

Um processo de adicionar β-aztreonam à solução de lisina requer um tratamento da solução de β-aztreonam com algum equipamento de alto cisalhamento para conseguir a dissolução de β-aztreonam antes da sua adição à solução de lisina. Em qualquer caso, o pH elevado (cerca de 10) da solução de 21 ΕΡ 1 641 436/ΡΤ lisina causa formação significativamente aumentada de certas impurezas, aqui denominadas impureza B, no β-aztreonam num curto período de tempo.

Ainda que o método anterior resultasse na fabricação de sal de lisinato de β-aztreonam com um nível de impurezas relativamente elevado mas aceitável, constatou-se que o procedimento para a sua preparação era exequível mas não muito prático para produção de lisinato de β-aztreonam numa escala comercial, uma vez que envolve uma rápida adição de β-aztreonam à solução de lisina. Ambas as soluções, isto é a solução de β-aztreonam e a solução de lisina, independentemente, necessitam de ser manipuladas com equipamento e cuidado especial. A solução de β-aztreonam requer um misturador de alto cisalhamento para mistura de β-aztreonam e manutenção do mesmo na solução bem com equipamento de dosagem especial para a sua adição rápida à solução de lisina. b. ot-Aztreonam

Por outro lado, o α-aztreonam pode ser facilmente suspenso em água para formar uma lama homogénea, possuindo um pH ácido que melhora a sua estabilidade. A formação de sal pode assim ser facilmente realizada por adição de uma solução de lisina à lama de α-aztreonam. Este passo permite a monitorização do pH durante a formação de sal e a formulação pode ser facilmente mantida dentro de um pH inferior a 6, isto é num intervalo de pH proporcionando a adequada estabilidade do lisinato de α-aztreonam formado. Não existe qualquer necessidade de um misturador de alto cisalhamento, de equipamento de dosagem ou de qualquer outro. c. Diferenças entre a- e β-aztreonam A diferença importante entre a- e β-aztreonam é a sua solubilidade em água. 0 α-aztreonam é solúvel em água a um pH ligeiramente ácido e o β-aztreonam não é solúvel em água e não pode ser dissolvido a valores de pH intrínsecos. 0 β-aztreonam polimeriza, forma aglomerados e solidifica quando misturado com água sem intervenção de um equipamento 22 ΕΡ 1 641 436/ΡΤ de mistura de alto cisalhamento. 0 α-aztreonam é prontamente solúvel em água e forma uma lama.

Adicionalmente, o β-aztreonam tem de ser adicionado à solução de lisina enquanto a solução de lisina pode ser adicionada à lama de a-aztreonam. É necessário equipamento de mistura e dosagem e uma mistura rápida para conseguir a dissolução de β-aztreonam em água e para adição do mesmo à solução de lisina. Não é necessário qualquer equipamento para dissolução de a-aztreonam em água uma vez que o α-aztreonam é prontamente solúvel a um pH inferior a 6 e a solução de lisina pode ser vantajosamente adicionada ao α-aztreonam sem qualquer modificação substancial de pH. d. Avaliação das opções de fabricação

De modo a avaliar as opções de fabricação para preparação de lisinato de aztreonam para inalação, utilizaram-se α-aztreonam e β-aztreonam como materiais de partida para fabricar soluções padrão, pó seco e liofilizados. Os procedimentos utilizados para fabrico das soluções padrão representam as duas possibilidades óbvias: 1) adição de a- ou β-aztreonam a uma solução de lisina; e 2) adição da solução de lisina a solução de β-aztreonam ou à lama de a-aztreonam.

Os resultados analíticos descritos abaixo mostram que a adição de uma solução de lisina à forma cristalina de a-aztreonam oferece as opções de manipulação mais versáteis para fabricação em grande escala. C. Desenvolvimento de um processo de fabrico para preparação de lisinato de aztreonam

Na prossecução do propósito original de desenvolver um processo exequível e prático para fabricação em grande escala de lisinato de aztreonam for inalação, investigaram-se amos os lisinatos de a- e β-aztreonam. 23 ΕΡ 1 641 436/ΡΤ 1. Materiais

Todos os materiais utilizados estão disponíveis comercialmente. 0 α-aztreonam foi obtido na Eutical SpA. 0 β-aztreonam foi obtido na Teva Corp., Israel. A lisina monoidrato foi comprada na Merck KGaA. A água foi purificada por osmose inversa. 2. Métodos

Existiam dois processos de fabricação utilizados para desenvolvimento e optimização do processo de fabricação para preparação de uma solução padrão e por fim para preparação de um lisinato de aztreonam liofilizado.

Os dois processos são identificados como um Processo de fabricação I, onde as quantidades apropriadas de a- ou β-aztreonam foram adicionadas à solução de lisina, e um Processo de fabricação II onde a solução de lisina foi adicionada ao oc- ou β-aztreonam.

Foi anteriormente determinado que, para um produto de aztreonam inalável eficaz, a solução padrão necessita de conter cerca de 75 mg/mL de lisinato de aztreonam. Consequentemente, as quantidades necessárias de aztreonam, lisina e água foram calculadas de modo a atingir uma concentração de aztreonam óptima de 75,0 mg/mL na solução padrão e uma proporção de aztreonam para lisina de 1,4:1. A solução padrão necessita de ter um pH à volta de pH 4,8. Os tamanhos de lote das soluções padrão preparadas para ensaio foram 200 mL.

Tipicamente, a fabricação de solução padrão e o processo de formação de sal foram realizados dentro de um balão de vidro de camisa dupla de modo a controlar a temperatura ao longo do processo. As soluções padrão foram fabricadas de acordo com os procedimentos seguintes. 24 ΕΡ 1 641 436/ΡΤ 3. Processos de fabricação

a) Processo de fabricação I 0 Processo de fabricação I compreende quatro passos.

Passo 1) Pesou-se uma quantidade requerida de lisina-monoidrato e dissolveu-se numa quantidade apropriada de água purificada gerada por osmose reversa utilizando um agitador magnético e subsequentemente filtrou-se através de um filtro de membrana de 0,22 pm à temperatura ambiente (20°C ± 2°C).

Passo 2) Após dissolução completa de lisina-monoidrato, a solução de lisina foi trazida para uma temperatura de 2-8°C utilizando o arrefecedor refrigerado ligado ao balão de vidro de camisa dupla. A temperatura foi controlada com uma sonda de temperatura na solução.

Passo 3) Adicionou-se uma quantidade necessária de oí- ou β-aztreonam à solução de lisina para atingir a concentração de 75 mg/mL sob agitação e mistura constantes. A mistura foi realizada com um agitador magnético em combinação com um Ultra Turrax (11000 rpm, 30 segundos). Experiências preliminares têm mostrado que para β-aztreonam a utilização de um agitador magnético sozinho conduz a resultados insatisfatórios. Isto é devido ao facto de a baixa intensidade de mistura do agitador magnético não poder impedir as partículas de β-aztreonam de aderirem às paredes do balão ou formarem aglomerados.

Passo 4) Após adição do oí- ou β-aztreonam, continuou-se a mistura até ocorrer a dissolução total (solução amarelada livre de matéria particulada) . Durante a conversão de sal, monitorizaram-se constantemente a temperatura e o pH da formulação.

b) Processo de fabricação II O Processo de fabricaçao II compreende três passos. 25 ΕΡ 1 641 436/ΡΤ

Passo 1) Utilizaram-se 50% da quantidade calculada de água purificada a 2-8 °C para formar uma lama com a- ou β-aztreonam utilizando um agitador magnético.

Passo 2) Dissolveu-se a quantidade necessária de lisina-monoidrato na restante água possuindo a mesma temperatura que a lama de aztreonam e adicionou-se lentamente à lama sob agitação constante. A velocidade de adição foi tal que o pH permaneceu inferior a pH 6 durante a conversão de sal.

Passo 3) Continuou-se a agitação até ocorrer uma dissolução total de aztreonam. A dissolução total do aztreonam foi identificada por uma solução amarela livre de matéria particulada. c) Medições de pH e de temperatura

Um vez que os valores de pH de a- e β-aztreonam dissolvidos em água são diferentes, monitorizaram-se o pH e a temperatura durante a avaliação de ambos os processos.

Os valores de temperatura e pH das soluções de teste foram avaliados com um medidor de pH electrónico equipado com um eléctrodo de vidro. Antes de cada conjunto de medições, o medidor de pH foi calibrado utilizando padrões apropriados com valores de pH de 4,0 e 10,0. As medições foram realizadas à temperatura seleccionada para cada uma das experiências. Durante a formação de sal, o pH e a temperatura da massa foram registados automaticamente a cada 5 segundos.

As soluções padrão de lisinato de oí- ou β-aztreonam foram preparadas a diferentes temperaturas variando de 2°C a 20°C de modo a determinar a dependência da temperatura do pH de uma solução 75 mg/ml de lisinato de a-aztreonam. d) Liofilização

Soluções padrão de oí- e β-aztreonam preparadas de acordo com o Processo de fabricação I ou II foram liofilizadas e determinou-se um grau de impurezas em cada solução padrão e no liofilizado. Para esse fim, alíquotas de um ml das soluções padrão foram dispensadas em frascos de vidro para 26 ΕΡ 1 641 436/ΡΤ liofilização (1,0 mL de solução padrao por frasco) e liofilizadas de acordo com as condições seguintes.

Prateleiras do liofilizador foram pré-arrefecidas a 0°C antes do inicio das operações para permitir uma congelação rápida da solução padrão nos frascos. Os frascos de liofilização contendo a solução padrão foram colocados sobre as prateleiras pré-arrefecidas do liofilizador. O interior do liofilizador foi depois arrefecido a -38°C temperatura à qual as amostras das soluções padrão nos frascos foram congeladas, a temperatura do liofilizador foi mantida a -38°C e o vácuo foi ajustado a 0,08 mbar a taxa constante em 3 horas. A temperatura do liofilizador foi depois elevada para -25°C em 15 minutos e mantida durante cerca de 11 horas. O vácuo foi depois ajustado a 0,047 mbar. A temperatura foi aumentada até + 5°C em 3 horas e mantida durante 12 horas. Após 12 horas a +5°C, o vácuo foi removido, e os frascos foram fechados e cravados. Os parâmetros do processo estão ilustrados na Figura 1, que mostra a evolução com o tempo, a temperatura das prateleiras e a pressão de vácuo utilizada para liofilização. e. Análise de impurezas

Determinaram-se os perfis de impurezas das soluções padrão e liofilizados fabricados por cromatografia liquida de alta pressão (HPLC). A HPLC foi realizada utilizando fases móveis A e B. A fase móvel A compreendia tampão de formato de amónio (pH 3,0) e metanol (94:6). A fase móvel B compreendia tampão de formato de amónio (pH 3,0) e metanol numa proporção de 55:45. As substâncias de referência utilizadas como padrão para detecção de impurezas foram aztreonam; aztreonam de anel aberto; isómero E de aztreonam; ácido (Z)-2-(aminotiazole-4-il)-2-(t-butoxicarbonil)isopropoxi-iminoacético (ATBA); 2- mercapto-benzotiazole (MBTA) e t-butil-aztreonam (t-butil-ATR). Os padrões foram preparados como soluções de reserva de impurezas de reserva e ensaiados em paralelo com a amostra de lisinato de aztreonam. 27 ΕΡ 1 641 436/ΡΤ

As condições de HPLC foram: coluna de 150 x 3 mm (4 pm); temperatura da coluna 30°C; temperatura da amostra 10 °C; caudal 0,6 ml/min; volume de injecção 40 μΐ, comprimento de onda de detecção 270 nm e tempo de ensaio 40 minutos.

As soluções padrão de aztreonam ou amostras liofilizadas contendo diferentes concentrações de aztreonam ou lisinato de aztreonam foram investigadas quanto à presença de impurezas.

As impurezas e produtos de degradação de a- e β-aztreonam foram separadas por RP-HPLC e detectadas por detecção de UV a 270 nm. A quantificação foi realizada e expressa como a área em % de todos os picos integrados superior a 0,1%.

Os perfis de impurezas para ambos os lisinatos de a- e β-aztreonam são apresentados numa forma gráfica nas Figuras 2-5. 4. Avaliação dos dois processos de fabricação

As duas formas de aztreonam foram avaliadas pelos dois processos de fabricação quanto à sua conversão no sal de lisinato e quanto ao efeito do processo seleccionado nos níveis de pureza e na estabilidade. a. Conversão de sal A conversão de a- ou β-aztreonam no seu sal de lisina, como descrito acima, depende da forma de partida de aztreonam bem como do processo de fabricação utilizado.

Constatou-se que o α-aztreonam era compatível com ambos os processos de fabricação. Isto foi devido ao facto de se poder suspender o α-aztreonam em água sem solidificação, um problema observado com β-aztreonam. Porque o β-aztreonam solidifica quase imediatamente quando adicionado a água, a conversão em sal após adição da solução de lisina demorou mais tempo e observou-se um grau de degradação de β-aztreonam relativamente elevado. A Tabela 1 resume as constatações no que se refere ao passo de conversão em sal. 28 ΕΡ 1 641 436/ΡΤ

Tabela 1

Conversão em sal

Processo de fabricação I Processo de fabricação II Lisinato de a-aztreonam • Nenhuma ocorrência invulgar durante a conversão em sal • Solução amarelada ligeiramente opalescente • Nenhuma ocorrência invulgar durante a conversão em sal • Solução amarelada ligeiramente opalescente Lisinato de β-aztreonam • Nenhuma ocorrência invulgar durante a conversão em sal • Solução amarelada, limpida • A lama de ATR solidificou parcialmente (em 30 s) antes da adição de lisina. Por isso, conversão em sal lenta após adição da solução de lisina • Solução rosada limpida

Utiliza-se ATR como abreviatura para aztreonam.

Os resultados mostram que, quando se utiliza a-aztreonam, o Processo de fabricação II mais simples pode ser utilizado para a produção de sal de lisina sem quaisquer consequências. Quando o aztreonam de partida é β-aztreonam, é necessário utilizar o Processo de fabricação I para a conversão em sal. Quando utilizado para a preparação de lisinato de β-aztreonam, o processo II resulta em lisinato de aztreonam impuro e instável. Por outro lado, o processo I requer equipamento mais complicado e caro e, por causa da presença de impurezas, requer também um trabalho de validação mais vasto, especialmente quando se prepara lisinato de aztreonam numa produção em grande escala. b. Teor de aztreonam em soluções padrão

Os teores em aztreonam encontrados nas soluções padrão fabricadas pelos processos I e II com uma concentração de partida de aztreonam de 75,0 mg/mL, imediatamente após a fabricação, são resumidos na Tabela 2. 29 ΕΡ 1 641 436/ΡΤ

Tabela 2

Teor em aztreonam de soluções padrão

Teor em aztreonam (mg/mL) Processo de fabricação em massa I Processo de fabricação em massa II Lisinato de a-aztreonam 74, 7 74, 7 Lisinato de β-aztreonam 74, 0 62,9 0 teor em aztreonam é a média de 2 injecçoes por solução.

Como observado na Tabela 2, existe apenas uma pequena perda observada em ambas as formas de aztreonam quando se utiliza o processo I. Quando se utiliza o processo II, está presente na solução padrão a mesma quantidade de a-aztreonam como na solução padrão preparada pelo processo I. No entanto, os resultados observados na Tabela 2 mostram que existe uma degradação significativa de β-aztreonam quando se segue o processo de fabricação II. Isto é devido, pelo menos parcialmente, à solidificação de β-aztreonam observada durante processo de fabricação II onde após dissolução em água a área superficial total de β-aztreonam é reduzida e a conversão em sal e dissolução é mais lenta em comparação com α-aztreonam sob as mesmas condições. Ocorrem reacções de degradação de β-aztreonam que são dependentes do pH. Este fenómeno não é observado com α-aztreonam que, como salientado acima, é facilmente dissolvido em água a um pH abaixo de pH 6,0. Como descrito acima, o α-aztreonam dissolvido em água forma uma lama homogénea possuindo uma grande área superficial. c. Liofilização

As condições de liofilização para preparação de a-aztreonam e β-aztreonam liofilizados eram adequadas para ambas as formas de aztreonam. Não se observaram quaisquer diferenças significativas entre as duas formas de aztreonam durante as operações de secagem criogénica. Todos os resíduos secos criogenicamente pareciam homogéneos sem se observarem quaisquer áreas 30 ΕΡ 1 641 436/ΡΤ molhadas, encolhidas ou sinterizadas no fundo dos frascos de liofilização. Adicionalmente, não se encontraram quaisquer partículas de aztreonam sobre a parede do frasco, indicando que se utilizaram a temperatura, a pressão e as taxas de aumento/redução (ramping) adequadas durante a secagem criogénica. A velocidade de dissolução para ambos os aztreonans liofilizados foi muito boa com uma reconstituição de ambos os resíduo secos criogenicamente ocorrendo em menos de 1 s após adição de solvente (solução salina a 0,17%/1,0 ml) . 0 ciclo de secagem criogénica conduziu a liofilizados com teores em água geralmente baixos entre 0,3-0,5%. Na medida em que o teor em água no lisinato de aztreonam seco criogenicamente final podia ser elevado para cerca de 2,0% sem problemas de estabilidade, a duração do ciclo podia ser adicionalmente encurtada para aproximadamente 30 horas. A Tabela 3 resume os teores em água dos dois liofilizados.

Tabela 3

Teor em água nos liofilizados

Teor em água nos liofilizados (%) Processo de fabricação em massa I Processo de fabricação em massa II Liofilizados de lisinato de a-aztreonam 0, 5% 0, 4% Liofilizados de lisinato de β-aztreonam 0, 3% 0,3% 0 teor em água nos liofilizados é a média de 3 frascos por lote. O teor em água em ambos os liofilizados de lisinato de aztreonam é bem inferior ao nível aceitável de água (2,0%) que podia afectar a estabilidade do lisinato de aztreonam. A Tabela 4 resume o conteúdo de aztreonam nos frascos de liofilização após liofilização de ambas as formas de lisinato de aztreonam preparadas pelos processos I e II. 31 ΕΡ 1 641 436/ΡΤ

Tabela 4

Conteúdo de aztreonam por frasco após liofilização

Conteúdo de aztreonam/frasco (mg) Processo de fabricação em massa I Processo de fabricação em massa II Liofilizados de lisinato de a-aztreonam 73,8 74,0 Liofilizados de lisinato de β-aztreonam 73,1 60,9 0 conteúdo de aztreonam é a média de 3 frascos.

Como esperado a partir dos resultados da solução padrão observados na Tabela 2, os liofilizados de β-aztreonam de acordo com o processo de fabricação II contêm muito menos do que 75,0 mg de aztreonam. Existe uma perda significativa de aproximadamente 12% de β-aztreonam durante o processo de fabricação II. Os resultados obtidos a partir do processo de liofilização mostram que não ocorre qualquer perda significativa de qualquer dos aztreonans durante a operação de secagem criogénica. A pequena diminuição na quantidade de aztreonans observada na Tabela 4 em comparação com as quantidades observadas na Tabela 2 é atribuída a operações de dispensa e à reconstituição dos bolos antes da análise. Por conseguinte, o ciclo de liofilização e as suas velocidades de aumento/redução (ramping) podem ser considerados como válidos para a combinação solução padrão/frasco. d. Análise das impurezas totais de a- e β-aztreonam A análise das impurezas totais nas duas formas de aztreonam é apresentada nas Figuras 2-5 e na Tabela 5. A Figura 2 mostra a análise de impurezas de soluções padrão e liofilizados de lisinato de α-aztreonam fabricados pelo processo de fabricação I em comparação com o ingrediente farmacêutico activo (API) aztreonam. Como observado na última coluna de Figura 2, as impurezas totais observadas em lisinato de α-aztreonam no API eram 0,280%, na solução padrão eram 0,332% e as impurezas totais em liofilizados atingindo 0,436% da área. 32 ΕΡ 1 641 436/ΡΤ A Figura 3 mostra a análise de impurezas da solução padrão e liofilizados de lisinato de β-aztreonam fabricados pelo processo de fabricação I em comparação com API. Como observado na última coluna de Figura 3, as impurezas totais no API eram 0,370%, na solução padrão de β-aztreonam eram 0,295% da área e as impurezas encontradas em liofilizados eram 0,457% da área.

Os níveis observados de impurezas no a- e β-aztreonam eram aproximadamente os mesmos para ambas as formas de aztreonam. A Figura 4 mostra a análise de impurezas das soluções padrão e liofilizados de α-aztreonam preparadas pelo processo de fabricação II. Como observado na Figura 4, as impurezas totais presentes no API eram 0,280%, na solução padrão eram 0,328% da área e as impurezas totais em liofilizados eram 0,471% da área. A Figura 5 mostra a análise da solução padrão e de liofilizados de β-aztreonam em comparação com API preparado pelo processo de fabricação II. Como se observa na Figura 5, as impurezas detectadas em API eram 0,370%, o que aproximadamente corresponde a níveis detectados nas Figuras 2, 3 e 4. Os níveis de impurezas detectados nas soluções padrão e liofilizados de β-aztreonam eram extremamente elevados. A solução padrão e o liofilizado de β-aztreonam ambos produzidos pelo processo de fabricação II continham 15,812% da área na solução padrão e 15, 867% da área nos liofilizados.

Em comparação com as impurezas totais observadas na solução padrão e liofilizado de α-aztreonam, os níveis de impurezas no β-aztreonam eram quase 34 vezes mais elevados em liofilizados e 48 vezes mais elevados nas soluções padrão. A Tabela 5 resume os dados obtidos para os níveis de impurezas presentes nas soluções padrão e liofilizados para α-e lisinato de β-aztreonam. 33 ΕΡ 1 641 436/ΡΤ

Tabela 5

Impurezas totais

Soluções padrão Liofilizados Lisinato de a-aztreonam Lisinato de β-aztreonam Lisinato de a-aztreonam Lisinato de β-aztreonam Processo de fabricação I 0,332% 0,295% 0,436% 0,457% Processo de fabricação II 0,328% 15,912% 0,471% 15,867%

As impurezas estão expressas como percentagem da área.

Quando se utiliza α-aztreonam como ingrediente farmacêutico activo (API), não se encontraram quaisquer diferenças significativas entre os processos de fabricação I e II. As soluções padrão têm um nivel de impurezas à volta de 0,33% da área, o que representa um aumento à volta de 0,04-0,05% versus o API. Os liofilizados têm impurezas totais à volta de 0,45% da área, o que representa um aumento à volta de 0,08-0,12% versus API. É importante enfatizar que as impurezas mais simples encontradas após fabricação de lisinato de α-aztreonam utilizando os processos de fabricação I e II descritos estão abaixo do nível 0,1% e consequentemente ambos os processos podem ser convenientemente utilizados para fabricação de lisinato de a-aztreonam. Quando se utiliza o nivel limite reportando à FDA de 0,1%, as soluções padrão e os liofilizados de a-aztreonam teriam apenas niveis de impurezas de 0,1%. Isto é significativamente inferior aos niveis de impurezas encontrados em AZACTAM® (aztreonam arginina disponível comercialmente), que contém 1,6% de impurezas totais. O lisinato de β-aztreonam pode ser fabricado com sucesso a partir de β-aztreonam de acordo com o processo de fabricação I, onde as impurezas totais na solução padrão são à volta de 0,3% e à volta de 0,45% nos liofilizados. Isto representa um aumento à volta de 0,1% versus o API. No entanto, quando se utiliza o processo de fabricação II para preparação de β-aztreonam, o nível de impurezas na solução padrão é à volta de 15,8%. Após liofilização, o nível de impurezas permanece inalterado. A análise do perfil de impurezas mostra que o nível de impurezas elevado no β- 34 ΕΡ 1 641 436/ΡΤ aztreonam é principalmente devido à geração da impureza B e uma segunda impureza desconhecida, ambas geradas durante o processo de conversão de lisinato de β-aztreonam em sal. Todas as outras impurezas tipicamente encontradas nas soluções padrão e liofilizados de β-aztreonam permanecem também inferiores a 0,1%.

Estes resultados indicam que o processo de fabricação II não é um processo muito adequado para preparação de lisinato de β-aztreonam. Não apenas este conduz ao elevado aumento em impurezas mas também requer um procedimento de fabricação dedicado e o equipamento dispendioso para produção da solução padrão. No entanto, quando é desejado o lisinato de β-aztreonam, o processo de fabricação I é muito adequado para preparar o produto com um grau aceitável de impurezas.

Como é observado a partir destes resultados, o a-aztreonam proporciona uma vantagem importante para a fabricação de lisinato de α-aztreonam em relação ao lisinato de β-aztreonam. O α-aztreonam pode ser facilmente suspenso em água, formando uma suspensão homogénea sem necessidade de qualquer equipamento especial permitindo a adição de uma solução de lisina ao a-aztreonam.

Deste modo, as soluções padrão e liofilizados para lisinato de α-aztreonam contendo cerca de 75 mg/mL podem ser fabricados de um modo directo, prático, rápido, fácil e barato. D. Vantagens de lisinato de a-aztreonam

Uma vez que o aztreonam contendo arginina não é adequado para inalação, prepararam-se e testaram-se outros sais de adição de ácido. Constatou-se que o lisinato de aztreonam, particularmente lisinato de aztreonam derivado da forma a-aztreonam, era farmacologicamente muito seguro, aceitável e eficaz para propósitos de inalação quando administrado por nebulização como pó seco ou liofilizados aerossolizados em quantidades de cerca de 75 mg/mL. O processo da especialidade anterior utilizando a- e β-aztreonam envolveu a conversão de α-aztreonam em β-aztreonam. 35 ΕΡ 1 641 436/ΡΤ

De modo a obter o lisinato de aztreonam como um produto final, este passo de conversão, se utilizado para produção de lisinato de aztreonam em solução padrão ou liofilizado, envolve necessariamente fazer reagir β-aztreonam relativamente insolúvel em água e possuindo um pH de aproximadamente pH 2,3, com o sal de lisina possuindo um pH de aproximadamente pH 10. A adição do componente de sal de lisina a β-aztreonam cria uma permuta iónica excessiva durante a titulação do aztreonam ácido a um pH fisiologicamente aceitável. Adicionalmente, esta reacção resulta numa reacção secundária indesejável com formação de cadeia aberta do anel de β-lactama no aztreonam, conduzindo subsequentemente a lisinato de β-aztreonam possuindo um grau mais elevado de impurezas, instabilidade e uma osmolalidade indesejavelmente elevada.

Uma osmolalidade elevada não é desejável para o aztreonam inalável. A formulação de aztreonam inalável requer um grau e um intervalo muito específicos de osmolalidade porque a elevada osmolalidade da formulação inalável pode fazer com que um paciente reaja à inalação com broncospasmo ou tosse.

No presente invento, o sal de lisinato de aztreonam farmaceuticamente aceitável preferido é derivado de uma reacção directa de α-aztreonam com lisina sem necessidade de converter primeiramente α-aztreonam em β-aztreonam. A produção de lisinato de α-aztreonam derivado da forma α-aztreonam sem conversão de α-aztreonam em β-aztreonam é um novo processo não revelado nem sugerido por qualquer especialidade anterior. O processo corrente revelado para fabricação de uma solução padrão ou liofilizado de lisinato de Oí-aztreonam para inalação é baseado na constatação de que o a-aztreonam, quando solubilizado em água e agitado, forma imediatamente uma emulsão ou lama suave. Quando uma solução de sal de lisina é titulada com a lama, resulta uma rápida formação de um sal de lisina de α-aztreonam amorfo. Este sal tem características de estabilidade similares ao lisinato de β-aztreonam liofilizado sem no entanto ter um aumento nocivo 36 ΕΡ 1 641 436/ΡΤ nas impurezas observadas durante a produção de um lisinato de β-aztreonam. A reacção com lisina, liofilização e secagem do lisinato de α-aztreonam não causa a abertura do anel nucleófilo e assim os níveis de impurezas iniciais gerados a partir da forma alfa são inferiores a 0,1%, substancialmente inferiores ao limite da FDA para o nível de impurezas permitido.

Deste modo, por utilização do α-aztreonam directamente para formação de lisinato de α-aztreonam, o produto obtido contém níveis de impurezas iniciais muito mais baixos, tem uma estabilidade mais elevada e ao longo do tempo mostra menor degradação conduzindo por isso ao produto com uma vida em prateleira mais longa.

No presente processo para preparação de lisinato de a-aztreonam a partir de α-aztreonam, os volumes de conversão em sal básico, a proporção de componentes individuais e o pH da mistura reaccional são titulados a um nível fixo. O processo de titulação confirma que permanecem no lisinato de a-aztreonam menos de 100 ppm de etanol residual utilizando o processo de fabricação II em comparação com a fabricação de lisinato de β-aztreonam onde no mesmo volume reaccional foram detectados níveis de etanol residual até 10000 ppm. Estes níveis são aproximadamente 100 vezes os observados durante a preparação de lisinato de α-aztreonam. Para além disso, utilizando o α-aztreonam, é eliminada a formação de éster de etilo, outra impureza detectada nas formas de β-aztreonam.

No que se refere à estabilidade das duas formulações, as condições de estabilidade acelerada mostram que o β-aztreonam de degrada desde os 0,9% iniciais da cadeia aberta até mais de 2% em 30 dias enquanto o α-aztreonam se degrada desde uns 0,06% iniciais até apenas 1,2% em 90 dias sob as mesmas condições de ensaio.

Consequentemente, a utilização do α-aztreonam e a preparação do lisinato de α-aztreonam utilizando o processo de fabricação II produz um produto mais estável com um melhor perfil de pH, teor em impurezas mais baixo, estabilidade mais longa e uma osmolalidade desejavelmente reduzida. 37 ΕΡ 1 641 436/ΡΤ Ε. Processo para fabricação de lisinato de a-aztreonam

Foram desenvolvidas três técnicas potenciais para proporcionar o lisinato de α-aztreonam derivado do a-aztreonam. A primeira técnica envolve titulação do sal de lisina no α-aztreonam. A segunda técnica envolve secagem sob vácuo do α-aztreonam em bruto no ponto final da síntese quando o aztreonam é combinado com lisina num liofilizador. Na terceira técnica, o lisinato de α-aztreonam é produzido directamente. A terceira técnica envolve secagem por pulverização do α-aztreonam e lisina numa massa sólida produzindo o lisinato de aztreonam como o produto final. Todas estas técnicas evitam a conversão do α-aztreonam no β-aztreonam. 0 processo preferido actual para preparação do lisinato de aztreonam derivado de α-aztreonam compreende solubilização de α-aztreonam em água e subsequente titulação de uma solução aquosa de lisina no α-aztreonam para formar o sal de lisina. A mistura é depois liofilizada ou seca por pulverização. 0 presente processo evita a clivagem do anel de β-lactama utilizando vantajosamente uma titulação para conseguir um perfil de pH desejável do lisinato de a-aztreonam que é contrário às técnicas utilizadas para preparação de sal de lisina de β-aztreonam. Em qualquer das técnicas aqui reveladas para preparação do lisinato de a-aztreonam derivado do α-aztreonam, são evitados a conversão no β-aztreonam bem como todos os problemas relacionados com a produção do lisinato de β-aztreonam derivado do β-aztreonam. e. Processo de fabricação de lisinato de a-aztreonam 0 processo de fabricação para preparação de soluções padrão de lisinato de α-aztreonam compreendendo cerca de 75 mg de α-aztreonam por um ml de água ou outro solvente aquoso é essencialmente baseado no processo de fabricação II anteriormente descrito. 0 processo envolve a reacção dos componentes listados abaixo na Tabela 6. 38 ΕΡ 1 641 436/ΡΤ

Tabela 6

Componentes mg por Unidade de 1 mL a-Aztreonam 75 mg Lisina monoidrato 52,5 mg Água para injecção até 1 mL Azoto qs

Para preparação de um litro de lisinato de a-aztreonam, dissolvem-se 75 gramas de α-aztreonam e 52,5 gramas de lisina monoidrato num litro de água para injecção. Para preparações em grande escala de lisinato de α-aztreonam, estas quantidades são multiplicadas de modo apropriado.

Especificamente, os passos do processo para preparação da solução padrão são como se segue. Aproximadamente adicionam-se 400 mL de água para injecção (WFI) a um vaso de mistura, arrefece-se o vaso de mistura a uma temperatura entre 2 e 8°C e adicionam-se à água 52,5 gramas de lisina monoidrato. Mantém-se a temperatura entre 2 e 8°C. Agita-se depois a mistura até ficar límpida. Ajusta-se a solução a um volume de 500 mL com água para injecção.

Separadamente, adicionam-se 400 mL de água para injecção ao segundo vaso de mistura e arrefece-se até entre 2 e 8°C e suspendem-se 75 gramas de α-aztreonam anidro na água arrefecida sob agitação rápida e arrefecimento para manter a temperatura abaixo de 10°C. Ajusta-se a quantidade real de a-aztreonam, que tipicamente pode conter até 15% de humidade, de modo a corresponder a 75 gramas de α-aztreonam anidro. Depois titula-se a quantidade calculada da solução de lisina na suspensão de aztreonam durante um período de tempo relativamente curto entre cerca de 1 e 15 minutos, preferivelmente em cerca de 6 minutos, ao mesmo tempo mantendo a temperatura constantemente abaixo de 10 °C e o pH igual ou inferior a 6,0. Mede-se o pH da solução e ajusta-se, se necessário, com solução de lisina monoidrato até um pH final de 4,8 +/-0,5. Ajusta-se o volume da solução com água para injecção e mistura-se até ficar límpida. O volume final da solução de lisina e da solução de α-aztreonam, combinadas, deverá ser um litro. 39 ΕΡ 1 641 436/ΡΤ

Após verificar que o pH e os resultados do ensaio estão dentro da especificação, a solução é filtrada por meio de uma bomba peristáltica através de um pré-filtro, preferivelmente um pré-filtro de 0,45 pm, e através de dois filtros adicionais, preferivelmente com um tamanho de cerca de 0,1 a cerca de 0,3 pm, preferivelmente um filtro de cartucho Millidisk 40 hidrófilo de 0,22 pm, para um vaso receptor que é mantido sob um fluxo de azoto filtrado (0,22 pm). A integridade do filtro final (0,22 pm) é testada após filtração. 0 vaso receptor é mantido a uma temperatura inferior a 10°C. Testam-se amostras pós-filtração no que se refere à quantidade de lisinato de α-aztreonam, contaminação, densidade e aspecto. O aspecto visual da solução padrão de lisinato de a-aztreonam era como uma solução amarelada livre de matéria particulada. 0 pH da solução padrão era 4,82. A viscosidade, tensão superficial e osmolalidade eram 1,55 mPas, 67,11 mN/m e 410 mOsmol/kg, respectivamente. As impurezas totais eram 0,328%.

Utiliza-se a solução filtrada para enchimento de frascos de vidro âmbar com um volume de enchimento de 1 mL ± 10%. Os volumes de enchimento são verificados a cada 15 minutos. Os frascos são equipados com rolhas mantidas na posição aberta e colocados no liofilizador. A liofilização é realizada de acordo com condições de liofilização exemplares em três passos que se resumem na Tabela 7. 40 ΕΡ 1 641 436/ΡΤ

Tabela 7

Condições de liofilização

Passo Procedimento Processo de liofilização 1 Congelação do produto Condições de congelação: Prateleiras geladas: <-46°C 0 produto congelado a -10°C ±3°C sem qualquer vácuo e mantido durante duas horas 2 Secagem primária Condições de secagem: 1 hora: -40°C ±3°C e a <80 microbar Pelo menos 15 horas: -25°C ±3°C e <80 microbar Temperatura foi aumentada até 25°C ±3°C com um gradiente de 10°C/hora 3 Secagem secundária Condições de secagem: Pelo menos 10 horas: 25°C ±3°C e <80 microbar e até o produto atingir 25°C ±3 °C 0 vácuo foi interrompido com azoto estéril

Alternativamente, o ciclo de liofilização pode ser realizado sob condições diferentes, tais como por exemplo, as condições listadas na Tabela 8.

Tabela 8

Condições de liofilização

Passo Passo Passo 1 Congelação do produto Condições de congelação: Prateleiras geladas: -38°C 0 produto congelado a -35°C ±3°C sem qualquer vácuo e mantido durante quatro horas 2 Secagem primária Condições de secagem: Vácuo iniciado a <80 microbar Temperatura diminuída para -25°C ±3°C e mantida durante 8 horas a <80 microbar 3 Secagem secundária Condições de secagem: Vácuo ajustado a <47 microbar Temperatura aumentada até +25°C ±3°C e mantida durante 16 horas Ciclo terminado, frascos fechados, vácuo interrompido 41 ΕΡ 1 641 436/ΡΤ

No segundo ciclo de liofilização, os frascos são fechados dentro do liofilizador sob vácuo, no final da secagem secundária.

Deve ser entendido que se pretende que qualquer variação no processo de liofilização esteja dentro do âmbito deste invento.

Ao longo de todo o processo de fabricação, realizam-se testes do teor em água e de inspecção visual. Após a liofilização, os frascos são completamente fechados com rolhas e providos com cápsulas de cravação de alumínio. Os frascos são visualmente verificados quanto à eficaz colocação das cápsulas a cada 15 minutos durante o processo de colocação das cápsulas e vedação.

Os frascos de liofilizado são mantidos e armazenados à temperatura entre cerca de -20° e 8°C que se verificou ser a temperatura óptima para a estabilidade do produto liofilizado. Adicionalmente, verificou-se que esta temperatura é a temperatura óptima para manutenção da estabilidade do produto durante a fabricação. 0 processo de fabricação II utilizado para fabricação de lisinato de α-aztreonam foi descrito acima e o perfil de impurezas está ilustrado na Figura 4. As impurezas totais observadas durante uma fabricação em grande escala de lisinato de α-aztreonam de acordo com o processo II são apenas ligeiramente mais elevadas do que as impurezas observadas em API. Especificamente, apenas podem ser detectados vestígios (0,014%) de impureza B no produto de lisinato de α-aztreonam e representam uma redução de 5 vezes nessa impureza particular em comparação com as soluções padrão e liofilizados de β-aztreonam. O aspecto visual dos liofilizados de α-aztreonam era como uma solução amarelada livre de matéria particulada. O pH do liofilizado era 4,78. A viscosidade, tensão superficial e osmolalidade eram 1,5 mPas, 70,34 mN/m e 430 mOsmol/kg, respectivamente. As impurezas totais eram 0,471%. Estes 42 ΕΡ 1 641 436/ΡΤ resultados eram reprodutíveis em três ensaios independentes de lotes de fabricação de lisinato de a-aztreonam.

Para confirmar que o processo de fabricação II representa as condições óptimas para fabricação de lisinato de α-aztreonam para efeitos de inalação, realizaram-se investigações sobre o efeito do pH, temperatura e concentrações de solução padrão. Adicionalmente, avaliou-se também a estabilidade do produto liofilizado e também do produto diluído. b. Avaliação do efeito do pH e da temperatura

Uma vez que os valores de pH desempenham um papel tão importante na distinção entre α e β-aztreonam, avaliou-se o efeito de pH e temperatura para optimização do processo de fabricação para fabrico de lisinato de a-aztreonam.

Resumidamente, lisinato de a-aztreonam (75 mg/ml) a pH 4,8 a 20°C foi arrefecido até 10°C e 2°C e mediu-se o pH a cada 5 segundos. Não existia qualquer impacto significativo do arrefecimento até uma temperatura de 10 ou 2°C sobre o pH da solução padrão de lisinato de a-aztreonam. Consequentemente, o processo de fabricação pode ser convenientemente realizado a temperaturas entre 2 e 20°C, no entanto, como afirmado acima, o processo é realizado optimamente a 2-8°C.

Adicionalmente, como já descrito acima, o α-aztreonam é prontamente solúvel em água sem polimerização, descoloração, solidificação e gelificação, permitindo a adição de uma solução de lisina à solução de α-aztreonam sem encontrar valores de pH elevados durante o processo. A estabilidade de aztreonam é dependente do pH. A estabilidade máxima de aztreonam está num intervalo de pH entre pH 4,2 e 7, com o intervalo de pH óptimo estando entre 4,6 e 4,8. Como descrito acima, o pH do α-aztreonam situa-se dentro do intervalo de pH óptimo. 43 ΕΡ 1 641 436/ΡΤ c. Influência de soluções padrão no perfil de impurezas A concentração óptima para a quantidade de aztreonam no aerossol é cerca de 75 mg/ml, no entanto, esta concentração pode diferir para tratamento de diferentes condições. Para optimizar o processo de fabricação investigaram-se alterações na concentração de aztreonam nas soluções padrão face a limitações impostas pelo processo de secagem criogénica, pela quantidade de água a ser removida durante a secagem criogénica e pela forma e tamanho do frasco de liofilização onde o produto é armazenado.

Tipicamente, concentrações baixas conduzem a um produto fisicamente instável e concentrações elevadas do composto ingrediente activo na solução padrão podem ser prejudiciais para o processo de secagem global. A forma e tamanho dos frascos têm um impacto no volume da solução padrão e na concentração do ingrediente activo na mesma.

Quando se investigaram as soluções padrão de 25, 37,5 e 75 mg/ml de lisinato de α-aztreonam no que se refere ao nível de impurezas, a solução padrão mais pura foi obtida para uma concentração de 37,5 mg/ml. No entanto, constatou-se que o a-aztreonam numa concentração de 75 mg/ml tinha apenas um nível de impurezas ligeiramente mais elevado e este nível de impurezas estava a níveis aceitáveis inferiores ou à volta de 0,1% de impurezas e, o mais importante, a concentração de fármaco satisfez a quantidade requerida do composto activo necessária para um produto de inalação. d. Estabilidade de a-Aztreonam

Em comparação com o β-aztreonam, o α-aztreonam permite a produção de lisinato de aztreonam com uma pureza mais elevada, melhor estabilidade e vida em prateleira mais longa. O α-aztreonam tem vantagens de melhor dispersão em água e menor teor residual em etanol (100 ppm) do que ο β-aztreonam (10000 ppm). Esta propriedade resulta em menores impurezas totais durante a conversão em sal. A utilização do a- ou β-aztreonam no início do processo de fabricação resulta no mesmo produto farmacêutico final comparável, um sal de 44 ΕΡ 1 641 436/ΡΤ aztreonam amorfo, cada um possuindo porém um nível diferente de impurezas e de estabilidade.

Foram produzidos dois lotes de produtos farmacêuticos utilizando o β-aztreonam e foi produzido um lote de produto farmacêutico utilizando o α-aztreonam. Os três lotes de produto farmacêutico foram avaliados quanto à estabilidade no momento do fabrico do produto (impurezas totais iniciais) e aos 6 meses após o fabrico (impurezas totais aos 6 meses) no produto armazenado sob refrigeração a 5°C. Na Tabela 8 apresentam-se os resultados de impurezas totais para os lotes.

Tabela 8

Impurezas totais

Forma de aztreonam Impurezas totais iniciais Impurezas totais aos 6 meses Produto farmacêutico 1 Lisinato de β-aztreonam 1,23% 1, 47% Produto farmacêutico 2 Lisinato de β-aztreonam 1,27% 1,35% Produto farmacêutico 3 Lisinato de a-aztreonam 0,65% 0, 84%

As impurezas totais iniciais para o produto farmacêutico (lisinato de aztreonam) produzido a partir de β-aztreonam eram 1,23% e 1,27%, respectivamente, conforme medido por HPLC, enquanto as impurezas totais iniciais para o produto farmacêutico produzido a partir de α-aztreonam eram 0,65%. Após 6 meses de armazenamento a 5°C, as impurezas totais para o lisinato de β-aztreonam eram 1,47% e 1,35%, respectivamente, enquanto as impurezas totais para lisinato de α-aztreonam eram 0,84%.

Uma vez que o limite de impurezas provável para o produto final no momento de administração é 2%, o lisinato de α-aztreonam é um melhor candidato para um produto estável e assim uma forma de aztreonam preferida, conduzindo a um produto com uma vida em prateleira mais longa do que o 45 ΕΡ 1 641 436/ΡΤ lisinato de β-aztreonam, ainda que o lisinato de β-aztreonam tenha também um nível de impurezas aceitável. e. Estabilidade do α-aztreonam diluído

Uma vez que o lisinato de α-aztreonam inalável, num dos modos, é entregue como uma solução aerossolizável, determinou-se a sua estabilidade na solução.

Para esse efeito, amostras de lisinato de a-aztreonam retiradas das soluções padrão foram diluídas com um tampão numa proporção de 1:250. As amostras foram depois investigadas num instante zero (preparadas de fresco) e após 1, 3, 6 e 12 horas, e determinaram-se os perfis de impurezas.

Constatou-se que as amostras diluídas de lisinato de a-aztreonam eram estáveis para todas as 12 horas, com apenas aumentos negligenciáveis em impurezas até se atingir o limite de 12 horas.

Estas constatações mostram que existe uma boa estabilidade do lisinato de α-aztreonam num estado diluído e que não existe qualquer degradação rápida do lisinato de a-aztreonam quando o produto liofilizado é diluído antes da sua utilização como um produto de inalação. a. Reconstituição de lisinato de α-aztreonam liofilizado

Determinou-se o perfil de impurezas para amostras reconstituídas de lisinato de α-aztreonam liofilizado.

Para este propósito, os liofilizados foram reconstituídos com 1 ml da solução salina a 0,17% e determinaram-se o aspecto visual, pH, viscosidade, tensão superficial, osmolalidade e impurezas totais. O aspecto visual do liofilizado de lisinato de a-aztreonam era uma solução amarelada livre de matéria particulada. O pH do liofilizado era 4,78. Viscosidade, tensão superficial e osmolalidade eram 1,5 ± 0,16 mPas, 70,34 ± 0,2 mN/m e 430 mOsmol/kg, respectivamente. As impurezas totais eram 0,601%. 46 ΕΡ 1 641 436/ΡΤ A osmolalidade do produto inalável é extremamente importante. A osmolalidade elevada não é desejável para o aztreonam inalável dado que este não é tolerado por pacientes com infecções respiratórias. A formulação de aztreonam inalável requer um grau e um intervalo de osmolalidade muito específicos porque a elevada osmolalidade da formulação inalável pode fazer com que um paciente reaja à inalação com broncospasmo ou tosse.

Por conseguinte é de grande importância que o lisinato de α-aztreonam não só liofilizado mas também liofilizado reconstituído tenha uma osmolalidade aceitável no intervalo à volta de 400-550 mOsml/kg. A Figura 6 ilustra graficamente os perfis de impurezas da solução padrão, liofilizado e liofilizado reconstituído de lisinato de α-aztreonam em comparação com API.

Como se observa na Figura 6, o perfil de impurezas de API, solução padrão e liofilizado era comparável com os perfis observados na Figura 4. Os liofilizados reconstituídos mostraram um nível de impurezas global ligeiramente mas não significativamente aumentado nos liofilizados reconstituídos de cerca de 0,471% para cerca de 0,601%. F. Actividade farmacológica de lisinato de aztreonam O lisinato de aztreonam exibe actividade potente e específica in vitro contra um largo espectro de patogénios aeróbios gram-negativos incluindo Pseudomonas aeruginosa. A acção bactericida de lisinato de aztreonam resulta da inibição da síntese da parede da célula bacteriana devido a uma elevada afinidade de lisinato de aztreonam pela proteína 3 de ligação a penicilina (PBP3).

Ao contrário da maioria dos antibióticos de β-lactama, o lisinato de aztreonam não induz actividade de β-lactamase e a sua estrutura molecular confere um elevado grau de resistência a hidrólise por β-lactamases, tais como penicilinases e cefalosporinases, produzidas por muitos patogénios gram-negativos e gram-positivos. O lisinato de 47 ΕΡ 1 641 436/ΡΤ aztreonam é por isso especialmente eficaz contra organismos aeróbios gram-negativos que são resistentes a antibióticos hidrolisados por β-lactamases. 0 lisinato de aztreonam mantém a sua actividade antimicrobiana a um pH variando de 6 a 8 in vitro bem como na presença de soro humano e sob condições anaeróbias. 0 lisinato de aztreonam é activo in vitro e é eficaz em modelos de animais de laboratório e infecções clinicas contra a maioria das estirpes dos organismos seguintes, Escherichia coli, espécies de Enterobacter, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Serratia marcescens, Haemophilus influenzae e espécies de Nitrobacter, incluindo muitas que são multirresistentes a outros antibióticos tais como certas cefalosporinas, penicilinas e aminoglicósidos.

Correntemente, as únicas infecções para as quais o sal de arginina de aztreonam está aprovado pela FDA são aquelas causadas por Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Haemophilus influenzae, Proteus mirabilis, espécies de Enterobacter e Serratia marcescens.

Constatou-se agora que todas as estirpes bacterianas acima enunciadas bem como as estirpes raras e altamente resistentes, tais como Burkholderia cepacia, Stenotrophomonas maltophilia, Alcaligenes xylosoxidans e Pseudomonas aeruginosa resistente a múltiplos fármacos, são erradicadas com sucesso por tratamento diário com doses baixas entre cerca de 1 e cerca de 250 mg, preferivelmente cerca de 75 mg/mL, de lisinato de aztreonam, preferivelmente administrados uma vez ou duas vezes ao dia, com doses diárias totais não excedendo 750 mg/dia. II. Composição inalável de lisinato de aztreonam É descrita uma composição inalável concentrada de lisinato de a- ou β-aztreonam, preferivelmente lisinato de a-aztreonam, adequada para entrega eficaz de lisinato de aztreonam ao interior do espaço endobrônquico das vias aéreas por aerossolização ou como um pó seco. 48 ΕΡ 1 641 436/ΡΤ É muito preferivelmente adequada para formulação de lisinato de aztreonam concentrado para aerossolização por atomização, jacto, ultra-sónica, pressurizada, placa porosa vibratória ou nebulizadores equivalentes ou por inaladores de pó seco que predominantemente produzem aerossol ou partículas de pó seco entre 1 e 5 ym de lisinato de aztreonam. Estes tamanhos de partícula são necessários para entrega eficaz de lisinato de aztreonam ao interior do espaço endobrônquico para tratar infecções bacterianas. A. Composição aerossolizada de lisinato de aztreonam A composição de lisinato de aztreonam para aerossolização é formulada para entrega eficaz de lisinato de aztreonam aerossolizado ao espaço endobrônquico das vias aéreas do pulmão. A formulação de aerossol é entregue num volume total de entre cerca de 1 e cerca de 5 ml de solução aquosa fisiologicamente aceitável para uma dose de inalação. Quando formulada e entregue como descrito, esta entrega uma dose terapeuticamente eficaz de lisinato de aztreonam ao local da infecção em quantidade suficiente para tratar infecções pulmonares bacterianas.

Uma combinação da nova formulação com o nebulizador de atomização, jacto, pressurizado, placa porosa vibratória ou ultra-sónico permite, dependendo do nebulizador, a entrega de pelo menos 20 a cerca de 90%, tipicamente cerca de 70% da dose administrada de lisinato de aztreonam ao interior das vias aéreas. A formulação contém uma quantidade mínima mas ainda assim eficaz de lisinato de aztreonam de cerca de 1 a cerca de 250 mg, mais preferivelmente de cerca de 25 a cerca de 90 mg/mL, e muito preferivelmente cerca de 75 mg/mL, formulados no mais pequeno volume possível de diluente fisiologicamente aceitável possuindo um certo grau de salinidade e um certo pH, ajustados para permitir a geração de um aerossol de lisinato de aztreonam bem tolerado por pacientes mas minimizando o desenvolvimento de efeitos colaterais 49 ΕΡ 1 641 436/ΡΤ secundários indesejáveis tais como broncospasmo, inflamação ou tosse.

Os principais requisitos para a formulação de lisinato de aztreonam aerossolizado são a sua segurança e eficácia. Vantagens adicionais são menor custo, conveniência de fabricação, pureza do produto, facilidade de utilização, vida em prateleira longa, armazenamento e manipulação do dispositivo de aerossol. Constatou-se que estes requisitos para lisinato de aztreonam aerossolizado são satisfeitos pela formulação contendo um certo grau de salinidade e que tem um certo intervalo de pH. 1. Dosagem de lisinato de aztreonam 0 lisinato de aztreonam tem um tempo de vida relativamente curto. 0 seu tempo de meia vida é cerca de 1-2 horas e em dez a doze horas toda a dose de aztreonam é eliminada. Consequentemente, o tratamento eficaz de infecções pulmonares bacterianas requer um regime de tratamento que proporciona quantidade suficiente de fármaco para manter o nivel antibacteriano de lisinato de aztreonam no pulmão. Um tal regime requer assim a administração de um lisinato de aztreonam inalável de uma a várias, preferivelmente duas a quatro, vezes ao dia. Um regime de dosagem muito preferido para conveniência do paciente é de uma vez ou duas vezes ao dia, no entanto, por causa de um efeito especifico que o lisinato de aztreonam exerce sobre as bactérias, e por causa do seu tempo de vida relativamente curto de cerca de 12 horas, é muitas vezes requerida uma dosagem de mais de duas vezes ao dia para a erradicação completa das bactérias do espaço endobrônquico. É por isso preferível entregar lisinato de aztreonam aerossolizado ou em pó seco numa mais pequena quantidade terapeuticamente eficaz pelo menos duas vezes ao dia, em alguns casos três a quatro vezes, e excepcionalmente mais do que quatro vezes ao dia. Uma dose de lisinato de aztreonam é por isso ajustada para estar entre 1 e 250 mg por uma dose formulada, muito preferivelmente, cerca de 75 mg de aztreonam/mL. 50 ΕΡ 1 641 436/ΡΤ

Tipicamente, uma dose terapeuticamente eficaz contém entre 1 e 250 mg, preferivelmente entre 25 e 90 mg de lisinato de aztreonam, em equivalente, administrada por meios que proporcionam pelo menos cerca de 50%-70% de eficácia de entrega de lisinato de aztreonam ao espaço endobrônquico. Assim, com uma dose de cerca de 250 mg, são entregues 125 mg de lisinato de aztreonam durante cada administração. Constatou-se que 100-250 mg de lisinato de aztreonam entregues ao pulmão são eficazes na erradicação de bactérias. Em nenhum caso a dose deverá exceder 250 mg. Acima desta quantidade, a aerossolização é difícil, o fármaco tende a precipitar e são necessários maiores volumes para a sua entrega por aerossol, o que contraria o propósito do invento de entregar a quantidade terapêutica de fármaco com a maior eficiência. A determinação da dosagem eficaz de lisinato de aztreonam administrado e do regime utilizado para tratamento de cada paciente depende da responsividade do paciente individual ao tratamento. 0 derradeiro factor decisivo é o nível esperado de lisinato de aztreonam no esputo após aerossolização. O intervalo óptimo de lisinato de aztreonam em 1 mL de esputo num qualquer dado momento deverá estar no intervalo de 500 a 2000 pg/mL. Assim, a frequência da administração está correlacionada com a eficácia do lisinato de aztreonam administrado. A eficácia de lisinato de aztreonam aerossolizado é surpreendentemente elevada quando comparada com a eficácia do lisinato de aztreonam administrado intravenosamente onde os níveis de pico no soro após a dose máxima permitida de 2000 mg resultaram apenas em 242 pg/mL de esputo. Após esta administração intravenosa, constatou-se que os níveis às 6 horas estavam na gama de 16 pg/mL, que é a CIM para Pseudomonas aeruginosa não resistente. O novo modo de administração, permitindo uma administração não invasiva de pequenas quantidades, mas ainda assim eficazes, de lisinato de aztreonam directamente ao interior dos pulmões, é uma grande melhoria em comparação com todos os métodos anteriormente conhecidos utilizados para entrega de lisinato de aztreonam. 51 ΕΡ 1 641 436/ΡΤ 2. Efeito do ρΗ na formulação de lisinato de aztreonam A solução ou diluente utilizado para preparação de aerossol de lisinato de aztreonam tem um intervalo de pH limitado de 4,2 a 7,5, preferivelmente entre 5,5 e 7,0. O pH da formulação é um aspecto importante para a entrega de lisinato de aztreonam aerossolizado. Quando o aerossol é quer ácido quer básico, pode causar broncospasmo e tosse. Ainda que o intervalo seguro de pH seja relativo e alguns pacientes possam tolerar um aerossol moderadamente ácido, outros, particularmente aqueles com fibrose cística ou outra doença subjacente, experimentarão broncospasmo.

Qualquer aerossol com um pH inferior a 4,5 tipicamente induz broncospasmo. Aerossóis com um pH entre 4,5 e 5,5 causarão broncospasmo ocasionalmente. O ensaio com aerossol de lisinato de aztreonam permitiu constatar que uma formulação de lisinato de aztreonam aerossolizável possuindo um pH entre 5.5 e 7,0 é bem tolerada e segura. Qualquer aerossol possuindo um pH superior a 7,5 deve ser evitado uma vez que os tecidos corporais são incapazes de tamponar aerossóis alcalinos. Um aerossol com pH controlado abaixo de 4,5 e acima de 7,5 causa irritação do pulmão acompanhada por broncospasmo severo, tosse e reacções inflamatórias.

Por estas razões, bem como para evitar broncospasmo, tosse ou inflamação em pacientes, o pH óptimo para a formulação de aerossol foi determinado como estando entre pH 5.5 e pH 7,0.

Consequentemente, a formulação de aerossol de lisinato de aztreonam é ajustada a pH entre 4,5 e 7,5 com um intervalo de pH preferido de cerca de 5,5 a 7,0. 0 intervalo de pH mais preferido é de 5,5 a 6,5. 3. Efeito da salinidade na formulação de lisinato de aztreonam

Pacientes padecendo de infecções endobrônquicas agudas ou crónicas e particularmente aqueles com fibrose cística ou bronquiectasia têm sensibilidade aumentada a vários agentes 52 ΕΡ 1 641 436/ΡΤ químicos e têm elevada incidência de incidentes broncospásticos, asmáticos ou de tosse. As suas vias aéreas são particularmente sensíveis a condições hipotónicas ou hipertónicas e ácidas ou alcalinas e à presença de qualquer ião permanente, tal como cloreto. Qualquer desequilíbrio nestas condições ou a ausência de cloreto abaixo de certos valores conduz a eventos broncospásticos ou inflamatórios e/ou a tosse o que prejudica grandemente o tratamento com formulações inaláveis. Estas condições impedem ambas a entrega eficiente de lisinato de aztreonam aerossolizado ao interior do espaço endobrônquico. As manifestações clínicas das vias aéreas irritadas são extremamente indesejáveis.

Obviamente, para lisinato de aztreonam, não é possível utilizar somente um solvente aquoso sem proporcionar um certo grau de osmolalidade para satisfazer e emular as condições fisiológicas encontradas em pulmões saudáveis. Consequentemente, é necessária uma certa quantidade do cloreto ou de outro anião para a entrega bem-sucedida e eficaz de lisinato de aztreonam aerossolizado mas esta quantidade é muito mais baixa do que as quantidades proporcionadas e tipicamente utilizadas para aerossóis de outros compostos. 0 broncospasmo ou os reflexos de tosse não respondem à mesma osmolalidade do diluente para aerossolização, no entanto, podem ser suficientemente controlados e/ou suprimidos quando a osmolalidade do diluente está num certo intervalo. A solução preferida para nebulização de lisinato de aztreonam que é segura e tem tolerância das vias aéreas tem uma osmolalidade total entre 50 e 550 mOsm/kg com um intervalo de concentração de cloreto entre 31 mM e 300 mM. A osmolalidade indicada controla o broncospasmo, e a concentração de cloreto, como um anião permeante, controla a tosse. Em relação a este aspecto o anião cloreto pode ser substituído por aniões de bromo ou iodo, uma vez que são ambos aniões permeantes. Adicionalmente, o ião cloreto pode ser substituído totalmente ou parcialmente por bicarbonato. A solução salina normal (NS) contém 154 mM de cloreto enquanto 31 mM de cloreto correspondem solução salina cerca de 0,2 normal. 53 ΕΡ 1 641 436/ΡΤ

Consequentemente, a formulação para aerossol de lisinato de aztreonam compreende de cerca de 1 a cerca de 90 mg, preferivelmente cerca de 75 mg, de lisinato de aztreonam dissolvidos em 1 mL de uma solução salina normal, ou preferivelmente de uma solução salina diluída desde cerca de 1/10 de solução salina normal (NS) até cerca de, e no máximo, uma solução 1 NS, preferivelmente de cerca de 1/10 a cerca de 1/4 NS, que é solução salina normal diluída a um décimo até um quarto. Constatou-se agora que o lisinato de aztreonam é eficazmente entregue ao interior dos pulmões quando dissolvido em solução salina inferior à normal, isto é solução salina contendo 0,9% de cloreto de sódio, e que a concentração de ião cloreto igual ou inferior a solução salina 1/4 N permite e assegura uma entrega de lisinato de aztreonam ao interior do espaço endobrônquico. A formulação de lisinato de aztreonam contendo cerca de 50 mg de lisinato de aztreonam por 1 mL de 0,2 NS tem uma osmolalidade de cerca de 290 mOsm/L. Esta osmolalidade está dentro de um intervalo seguro de aerossóis adequados para administração a pacientes padecendo de infecções bacterianas pulmonares e também àqueles pacientes com uma fibrose cística ou bronquiectasia.

Um aspecto e uma vantagem adicionais de se utilizar uma solução 1/10 a 1/4 NS compreendendo 50 mg/mL de lisinato de aztreonam é que a formulação de aerossol resultante é muito eficientemente nebulizada por um nebulizador atómico, de jacto ou ultra-sónico em comparação com lisinato de aztreonam dissolvido numa solução salina normal. Uma vez que a entrega de lisinato de aztreonam formulado como aqui descrito é muito mais eficiente, é necessária uma quantidade muito menor de lisinato de aztreonam para conseguir a erradicação completa de bactérias gram-negativas nos pulmões. Em vez de 1000 a 4000 mg de aztreonam que mostraram ser de algum modo eficazes na única tentativa anterior para aerossolizar aztreonam, a formulação de lisinato de aztreonam aqui descrita permite tratamentos com tão pouco quanto 1 mg/mL e com num máximo até 50 mg/mL de lisinato de aztreonam numa quantidade máxima de um volume de 5 mL, entregues preferivelmente com um nebulizador de atomização, de jacto, electrónico ou ultra-sónico . 54 ΕΡ 1 641 436/ΡΤ 4. Formulação de lisinato de aztreonam aerossolizável A formulação aerossolizável de lisinato de aztreonam é constituída de cerca de 1 a cerca de 250 mg, preferivelmente formulados em cerca de 25 a cerca de 90 mg/mL, muito preferivelmente cerca de 75 mg/mL de aztreonam dissolvidos em cerca 1 a 5 mL de uma solução aguosa contendo uma concentração baixa de ião cloreto entre 0,09% e 0,9%, com o pH ajustado a entre 4,2 e 7,5, a referida formulação entregue por aerossolização utilizando um nebulizador de atomização, de jacto, electrónico, ultra-sónico. A formulação de aerossol mais preferida para aztreonam compreende 75 mg/mL de aztreonam dissolvidos em cerca de 1-5 mL de uma solução salina diluída preferivelmente até um quarto (0,225%) ou um décimo (0,09%) da força da solução salina normal, com um pH ajustado a entre 5,5 e 7,0, entregues por nebulização em partículas de aerossol possuindo um MMAD predominantemente entre 1 e 5 ym, onde a referida formulação é nebulizada utilizando um nebulizador de atomização, de jacto, electrónico ou ultra-sónico. A dose de aztreonam está recalculada para se referir apenas a um componente de aztreonam.

Utilizando o nebulizador PARI E-flow disponível comercialmente na PARI, Starnberg, Alemanha, o tempo de entrega para um mL de solução de aztreonam 75 mg/mL é 3 minutos em comparação com 4 minutos para a solução de aztreonam 90 mg/mL. A entrega de 25 mg de aztreonam por minuto é mais rápida para a solução 75 mg/mL do que a entrega de 22,5 mg de aztreonam por minuto para a solução 90 mg/mL. Uma vez que o tempo de entrega é importante de uma perspectiva do paciente e melhora o cumprimento pelo paciente, a constatação de que uma formulação 75 mg/mL é entregue mais rapidamente do que a formulação 90 mg/mL é importante e também inesperada. A concentração 90 mg/mL é a concentração máxima de aztreonam que é dissolvida em 1 mL da solução.

Constatou-se ainda que a concentração dissolúvel mais elevada, i.e. 90 mg/mL, não é tão bem nebulizada como a 55 ΕΡ 1 641 436/ΡΤ concentração 75 mg/mL. Por investigação subsequente, determinou-se que isto é provavelmente devido à viscosidade das soluções para cada concentração como se segue

Concentração de aztreonam Viscosidade de aztreonam 75 mg/mL 1,48±0,1 mPas 90 mg/mL 1,7±0,03 mPas

Estas constatações são contraditórias e mostram surpreendentemente que a concentração mais baixa do fármaco, nomeadamente a formulação 75 mg/mL, é a melhor dose para a entrega mais eficaz de aztreonam por inalação. 5. Pó seco, aerossol e suspensões de aerossol A formulação de acordo com o invento contém lisinato de aztreonam formulado como um pó seco, solução de aerossol ou suspensão de aerossol de lipossomas ou outras partículas microscópicas num solvente aquoso. A formulação está concebida para ser bem tolerada e susceptível de ser fiavelmente e completamente nebulizada em partículas de aerossol dentro do intervalo de tamanhos respiráveis de 1 a 5 pm.

As doses estão concebidas para conterem a quantidade necessária, mas não mais do que a quantidade necessária, de uma forma muito activa de lisinato de aztreonam para prevenir a colonização e/ou para tratar infecções pulmonares severas causadas por uma gama de organismos gram-negativos susceptíveis.

Os pacientes podem ser sensíveis a pH, osmolalidade e teor iónico de uma solução nebulizada. Por conseguinte estes parâmetros são ajustados para serem compatíveis com a química de lisinato de aztreonam e ainda toleráveis para os pacientes. A formulação é nebulizada predominantemente em tamanhos de partícula permitindo uma entrega do fármaco ao interior dos bronquíolos terminais e respiratórios onde as bactérias 56 ΕΡ 1 641 436/ΡΤ residem durante a infecção e nas vias aéreas maiores durante a colonização.

Para entrega eficaz de lisinato de aztreonam ao espaço endobrônquico das vias aéreas do pulmão numa partícula de aerossol, é necessária a formação de um aerossol possuindo um MMAD predominantemente entre 1 e 5 pm. A quantidade formulada e entregue de lisinato de aztreonam para tratamento e profilaxia de infecções bacterianas endobrônquicas tem efectivamente de atingir a superfície do pulmão. A formulação tem de ter um volume aerossolizável o mais pequeno possível capaz de entregar uma dose eficaz de lisinato de aztreonam ao local da infecção. A formulação tem adicionalmente de proporcionar condições que não afectem adversamente a funcionalidade das vias aéreas. Consequentemente, a formulação tem de conter uma quantidade suficiente do fármaco formulada sob as condições que permitem a sua entrega eficaz evitando ao mesmo tempo reacções indesejáveis. A nova formulação satisfaz todos estes requisitos.

Um modo de entregar lisinato de aztreonam inalável é através de pó seco inalável. 0 lisinato de aztreonam preparado de acordo com o invento pode ser administrado endobronquicamente numa formulação de pó seco para entrega eficaz do pó de aztreonam finamente moído ao interior do espaço endobrônquico utilizando inaladores de pó seco ou de dose calibrada como uma alternativa à entrega de aerossol.

Uma formulação de pó seco tem uma potência, numa base em massa, que permite esta entrega alternativa de lisinato de aztreonam como um pó seco utilizando um inalador de pó seco. Uma formulação suficientemente potente de lisinato de aztreonam proporciona um pó seco que pode ser vantajosamente entregue por um inalador de pó seco ou por um inalador de dose calibrada. Para entrega de pó seco inalável, o lisinato de aztreonam é moído, precipitado, seco por pulverização ou de outro modo processado até tamanhos de partícula entre cerca de 1 e 5 pm. 57 ΕΡ 1 641 436/ΡΤ A formulação de pó seco compreende de cerca de 20 a 200 mg, preferivelmente 10 a 100 mg de lisinato de aztreonam.

Para formulação de pó seco preparada de acordo com o invento, o lisinato de aztreonam é moido até um pó possuindo diâmetros aerodinâmicos medianos em massa variando de 1 - 5 micron por técnicas de moagem de meios, moagem de jacto, secagem por pulverização ou precipitação de partículas como descrito no Exemplo 6.

Resumidamente, para secagem por pulverização, a forma alfa de aztreonam é suspensa em água, agitada e arrefecida. L-lisina dissolvida em água é adicionada lentamente durante cerca de 3 a cerca de 10 minutos, preferivelmente cerca de 6 minutos, até ambos os componentes serem quase completamente dissolvidos. Purifica-se a solução utilizando um carvão activado e filtra-se. Subsequentemente, seca-se a solução por pulverização utilizando qualquer equipamento adequado de secagem por pulverização, tal como, por exemplo um Buchi Mini Spray Dryer B-191.

As determinações do tamanho de partículas são efectuadas utilizando um impactador de cascata Anderson de múltiplas etapas ou outro método adequado. O Thermo Andersen Eight Stage Non-Viable Cascade Impactor é especificamente citado na US Farmacopoeia Chapter 601 como um dispositivo de caracterização para aerossóis dentro dos inaladores de dose calibrada e de pó seco. O impactador de cascata de oito etapas utiliza oito etapas de jacto permitindo a classificação de aerossóis de 9,0 micron a 0,4 micron (a 28,3 L/min) e permite que particulados aéreos impactem sobre superfícies de impactação de aço inoxidável ou sobre uma variedade de substratos de meios de filtração. Um filtro final recolhe todas as partículas menores do que 0,4. A moagem de meios é efectuada colocando uma substância farmacêutica num moinho contendo, por exemplo, bolas de aço inoxidável ou cerâmicas e fazendo rodar ou cair o material até se conseguirem os intervalos de tamanho de partículas de fármaco desejados. As vantagens da moagem de meios incluem bom controlo de tamanhos, intervalos de tamanhos de produto estreitos, eficiências de recuperação elevadas e processos 58 ΕΡ 1 641 436/ΡΤ facilmente escaláveis. Desvantagens incluem tempos longos do processo de fabricação que demoram de várias horas a vários dias, o requisito de os meios de moagem serem separados do produto após conclusão, e a possibilidade de contaminação do produto com os meios. A moagem de jacto utiliza correntes de ar a muito alta pressão para fazer colidir partículas umas com as outras, com partículas finas do tamanho desejado sendo recuperadas a partir do moinho. Vantagens incluem rapidez do processo de fabricação e menos transferência de energia durante a moagem, resultando em menor subida de temperatura durante a produção de fármaco. 0 processo de moagem de jacto é concluído em segundos a minutos. Desvantagens da moagem de jacto incluem rendimento e eficiências de recolha piores, com apenas 50 a 80% de recuperação sendo um rendimento típico. A secagem por pulverização é outra técnica útil para preparação de pó seco inalável. A secagem por pulverização envolve pulverização de uma fina névoa de solução de lisinato de aztreonam sobre um suporte e secagem das partículas. As partículas são depois recolhidas. A secagem por pulverização tem a vantagem de ser a menos propensa a entidades químicas de degradação. A adição de um co-solvente que diminui a solubilidade de um fármaco a uma solução de fármaco uniforme resulta em precipitação da solução. Quando se adiciona co-solvente suficiente, a solubilidade do fármaco cai para o ponto onde se formam partículas de fármaco sólidas que podem ser recolhidas por filtração ou centrifugação. A precipitação tem a vantagem de ser altamente reprodutível, possuindo um elevado rendimento de recuperação e sendo susceptível de ser realizada sob condições de temperatura baixa, o que reduz a degradação. A inalação de pó seco e inalações de dose calibrada são mais práticas quando as doses administradas resultam numa entrega de pelo menos cerca de 10 mg, e mais preferivelmente cerca de 25 a cerca de 100 mg, de lisinato de aztreonam ao pulmão do paciente que recebe o tratamento. Dependendo da eficiência do dispositivo de entrega de pó seco, que é tipicamente cerca de 70%, os níveis de dosagem de pó seco eficazes típicos situam-se no intervalo de cerca de 20 a 59 ΕΡ 1 641 436/ΡΤ cerca de 60 mg de lisinato de aztreonam. Por conseguinte, tipicamente é requerida mais do que uma inspiração de fármaco.

Em relação a este aspecto, é proporcionada uma formulação suficientemente potente de lisinato de aztreonam puro em forma de pó seco ou dose calibrada de partículas de fármaco moídas ou de outro modo preparadas até tamanhos de partícula predominantemente dentro de um intervalo de 1 a 5 mícron. Esta formulação é prática e conveniente porque não requer qualquer manipulação adicional tal como diluição do pó seco ou enchimento num recipiente de aerossol. Adicionalmente, esta utiliza os dispositivos que são suficientemente pequenos, totalmente portáteis e não requerem, por exemplo, um compressor de ar que é necessário para um nebulizador de jacto. Adicionalmente, a formulação de pó seco tem uma vida em prateleira mais longa do que as formulações líquidas de lisinato de aztreonam para aerossolização. Quando reconstituído numa solução aerossolizável, o lisinato de aztreonam tem apenas uma vida em prateleira limitada à temperatura ambiente devido à hidrólise do anel de monobactama. O pó seco de lisinato de aztreonam não tem este problema. A formulação de pó seco é assim prática e conveniente para utilização ambulatória porque não requer diluição ou outra manipulação, tem uma vida em prateleira e estabilidade no armazenamento prolongadas e os dispositivos de entrega por inalação de pó seco são portáteis e não requerem um compressor de ar necessitado por nebulizadores de aerossol.

Pretende-se que todas as técnicas adequadas para preparação de pós secos inaláveis, e todas e quaisquer melhorias dos mesmos, bem como qualquer inalador de pó seco, estejam dentro do âmbito do invento. B. Estabilidade, vida em prateleira e armazenamento A estabilidade da formulação é outra questão muito importante para uma formulação eficaz. Se o fármaco é degradado antes da aerossolização, uma menor quantidade do fármaco é entregue ao pulmão prejudicando assim a eficácia do 60 ΕΡ 1 641 436/ΡΤ tratamento. Para além disso, a degradação de lisinato de aztreonam armazenado pode gerar materiais que são pobremente tolerados por pacientes. A forma seca de lisinato de aztreonam tem uma vida em prateleira de pelo menos 2 anos. Uma estabilidade a longo prazo de aztreonam base livre ou lisinato de aztreonam em soluções aquosas podem não proporcionar uma vida em prateleira suficientemente longa que seria comercialmente aceitável. Uma formulação liquida, por conseguinte, pode requerer uma separação de lisinato de aztreonam do diluente apropriado. Por esta razão, a formulação é preferivelmente fornecida numa forma seca e pode ser reconstituída antes da administração como descrito abaixo.

Uma formulação para aerossolização é assim fornecida preferivelmente como dois componentes separados, um contendo um lisinato de aztreonam seco e o outro contendo um diluente apropriado tal como solução salina 0,1 a 0,9 N, bicarbonato, água para injecção ou qualquer solução aquosa equivalente, como descrito acima. A formulação é reconstituída imediatamente antes da administração. Este arranjo previne problemas relacionados com a estabilidade a longo prazo de lisinato de aztreonam em solventes aquosos.

De acordo com o invento, o lisinato de aztreonam para aerossolização é preferivelmente formulado numa forma de dosagem liofilizada destinada a utilização como um pó seco para reconstituição antes da terapia de inalação. A formulação de lisinato de aztreonam pode ser preparada assepticamente como um pó liofilizado para entrega de pó seco ou para reconstituição e entrega, ou como uma solução congelada, uma suspensão lipossómica ou como partículas microscópicas. A adequabilidade da formulação para armazenamento permite a reconstituição fiável do lisinato de aztreonam formulado adequada para aerossolização. c. Formulação para inalação - embalagem A formulação do invento é embalada para entrega a um paciente numa embalagem compreendendo vários componentes. 61 ΕΡ 1 641 436/ΡΤ

Uma embalagem exemplar da formulação consiste de dois componentes embalados separadamente: o pó de lisinato de aztreonam liofilizado e o diluente de solução salina estéril para reconstituir o pó antes da entrega por nebulização.

Cada frasco contém 90-110% da quantidade do rótulo de aztreonam (75 mg) e lisina (47 mg) como lisinato de aztreonam. Aztreonam e lisina formam um sal iónico, que prontamente se dissolve em solução salina. O diluente está num frasco estéril de 1 mL de solução para inalação de cloreto de sódio a 0,17% (0,17 mg de NaCl/mL). Após reconstituição com NaCl a 0,17%, o pH da solução é 4,2 - 7,0 e a osmolalidade é de 350 a 500 mOsmol/kg. As impurezas relacionadas com aztreonam são as seguintes: aztreonam de cadeia aberta, aztreonam dessulfonado, aztreonam isómero E e t-butil-aztreonam. As impurezas totais são menos do que 1%. Cada contaminante conhecido é menos do que <0,2%. As impurezas desconhecidas são menos do que <0,1%. Todos os ingredientes satisfazem os requisitos da USP com a excepção do monoidrato de lisina, que actualmente não tem qualquer monografia na USP. A formulação não contém quaisquer conservantes. c. Administração de lisinato de aztreonam por inalação O lisinato de aztreonam não está actualmente disponível. A. Dois modos de administração inalável A administração de lisinato de aztreonam inalável é conseguida quer com aerossol de lisinato de aztreonam quer com pó seco de lisinato de aztreonam inalável.

Foi mostrado que uma formulação livre de arginina entregue por inalação trata com segurança infecções respiratórias causadas por todas as bactérias gram-negativas susceptíveis incluindo Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Haemophilus influenzae, Proteus mirabilis, espécies de

Enterobacter e Serratia marcescens, bem como, e o mais importante, estirpes resistentes a antibióticos Burkholderia cepacia, Stenotrophomonas maltophilia, Alcaligenes 62 ΕΡ 1 641 436/ΡΤ xylosoxidans e Pseudomonas aeruginosa resistente a múltiplos fármacos. B. Frequência de dosagem 0 tratamento de infecções pulmonares causadas pelas bactérias mencionadas acima é conseguido por um regime de tratamento que proporciona uma a várias, preferivelmente uma a duas, vezes por dia um lisinato de aztreonam inalável. Um regime de dosagem muito preferido para conveniência do paciente é uma vez ou duas vezes ao dia, no entanto, por causa de um efeito especifico que o lisinato de aztreonam exerce sobre as bactérias, e por causa do seu tempo de vida relativamente curto de cerca de 12 horas, uma dosagem mais frequente é por vezes requerida para erradicação completa das bactérias do espaço endobrônquico.

Em pacientes com função pulmonar gravemente comprometida, a frequência de dosagem pode ser aumentada até cerca de doze vezes por dia de cada vez, proporcionando apenas uma tal quantidade de lisinato de aztreonam conforme necessária para manter o nivel terapêutico no pulmão. 0 lisinato de aztreonam mata bactéria por lise das paredes celulares desde que a concentração local de antibiótico exceda a concentração inibitória mínima das bactérias (Med. Clinics N. Am., 79: 4, 733-743 (1995)). Por causa da depuração relativamente rápida de antibióticos a partir do tracto respiratório devida a acção mucociliar, uma maior eficácia é obtida para uma dose mais baixa de lisinato de aztreonam administrada por tratamento de um paciente três, quatro ou mais vezes ao dia, em vez de administrar o fármaco apenas uma vez ou duas vezes. Para este efeito a dose de lisinato de aztreonam entregue por inalação é pelo menos quatro vezes e pode ser uma milésima vez mais baixa do que a dose de aztreonam arginina entregue intravenosamente ou utilizada na única tentativa descrita acima para entregar aztreonam arginina por aerossolização onde 500-1000 mg foram entregues duas vezes ao dia até uma quantidade total de 1000 mg para crianças abaixo dos 5 anos de idade e 2000 mg para indivíduos com mais de 5 anos de idade. 63 ΕΡ 1 641 436/ΡΤ A dose diária actual de lisinato de aztreonam pode ser tão pequena quanto 2 mg. 0 limite superior típico é 500 mg de lisinato de aztreonam por dia entregues em duas a quatro administrações. Em casos extremos a dose pode atingir até 750 mg por dia entregues em três, quatro ou mais administrações de aerossol. A gama típica e preferida para uma dosagem de aerossol está entre 20 e 200 mg administrados duas vezes ao dia ou entre 10 e 100 mg administrados três ou quatro vezes ao dia. A dose mais preferida é 75 mg/mL entregues duas ou mais vezes ao dia.

Aerossolização de lisinato de aztreonam utiliza a entrega de lisinato de aztreonam aerossolizado utilizando nebulizadores de atomização, de jacto, ultra-sónicos, electrónicos ou outros equivalentes. Nebulizadores portáteis, tais como nebulizadores de atomização, ultra-sónicos e electrónicos são preferidos para tratamento ambulatório. Os nebulizadores de jacto com um compressor nebulizam a formulação de lisinato de aztreonam muito eficientemente mas são mais adequados para utilização no hospital e no consultório médico.

Uma inalação de pó seco, como o segundo modo de administração do lisinato de aztreonam inalável, utiliza a formulação de pó seco de lisinato de aztreonam. Esta formulação compreende uma entrega do lisinato de aztreonam finamente moído directamente ao espaço endobrônquico. Neste caso, o lisinato de aztreonam é entregue ao interior do espaço endobrônquico utilizando inaladores de pó seco ou de dose calibrada. A potência do lisinato de aztreonam, determinada numa base em massa, permite a inalação de pó de lisinato de aztreonam, como um modo de administração alternativo ao aerossol. A inalação de pó seco é muito eficaz, prática e económica quando as doses administradas contêm menos de 100 mg. A frequência de dosagem é assim tipicamente três ou quatro vezes ao dia mas inclui também um regime de dosagem de uma ou duas ou mais do que quatro vezes na medida em que este regime depende da necessidade e condição do paciente.

Uma formulação de lisinato de aztreonam suficientemente potente é descrita numa forma de pó seco entregue como 64 ΕΡ 1 641 436/ΡΤ inalação de dose calibrada de partículas de lisinato de aztreonam moídas ou secas por pulverização até tamanhos de partícula predominantemente dentro de um intervalo de 1 a 5 pm. Esta entrega de pó seco é possível e preferível particularmente para inalação ambulatória na medida em que esta simplifica o processo de entrega. Esta entrega é conveniente porque não requer qualquer manipulação adicional tal como diluição do pó seco ou mistura do pó com um solvente, etc. Além disso, a inalação de pó seco utiliza os dispositivos que são suficientemente pequenos, totalmente portáteis e não requerem, por exemplo, um compressor de ar que é necessário para um nebulizador de jacto.

Adicionalmente, a formulação de pó seco tem mesmo uma vida em prateleira mais longa do que a formulação de lisinato de aztreonam líquida para aerossolização. 0 regime de dosagem para lisinato de aztreonam em aerossol e pó seco compreende a administração do aerossol ou pó seco uma a quatro, tipicamente, ou mais do que quatro vezes diariamente, em casos não típicos.

Pacientes de fibrose cística gravemente comprometidos, por exemplo, podem ser capazes de suportar apenas uma inalação de cada vez mas poderão repetir esta inalação de pequena quantidade de lisinato de aztreonam a cada duas, três ou quatro horas para obter um nível suficiente de lisinato de aztreonam nos pulmões. IV. Dispositivos para entrega de lisinato de aztreonam aerossolizado

Um requisito primário é entregar lisinato de aztreonam eficientemente ao espaço endobrônquico das vias aéreas de um modo muito económico. Assim, pelo menos 30-50%, preferivelmente 70-90% do fármaco activo, isto é lisinato de aztreonam, sujeitos a nebulização são de facto entregues a um local onde exercem o seu efeito terapêutico. A. Nebulizadores A composição descrita acima proporciona o fármaco formulado numa solução permitindo a entrega de uma quantidade 65 ΕΡ 1 641 436/ΡΤ terapeuticamente eficiente do fármaco, desde que o aerossol gerado pela nebulização satisfaça os critérios requeridos para esta entrega eficiente. 0 aparelho (nebulizador) que aerossoliza a formulação de lisinato de aztreonam torna-se assim uma parte muito importante.

Existem bastantes tipos de nebulizadores actualmente disponíveis comercialmente. Nem todos são adequados para praticar o método aqui descrito.

Um nebulizador é seleccionado principalmente na base de permitir a formação de aerossol de lisinato de aztreonam possuindo um MMAD predominantemente entre 1 e 5 pm. A quantidade entregue de lisinato de aztreonam tem de ser eficaz para tratamento e profilaxia de infecções endobrônquicas, particularmente aquelas causadas por bactérias susceptíveis. 0 nebulizador seleccionado tem assim de ser capaz de aerossolizar eficientemente a formulação que tem salinidade, força osmótica e pH ajustados de modo a permitir a geração de aerossol de lisinato de aztreonam que é terapeuticamente eficaz e bem tolerado por pacientes. 0 nebulizador tem de ser capaz de lidar com a formulação possuindo um volume aerossolizável o mais pequeno possível e ainda assim capaz de entregar uma dose eficaz de lisinato de aztreonam ao local da infecção. Adicionalmente, a formulação aerossolizada não pode comprometer a funcionalidade das vias aéreas e tem de minimizar efeitos secundários indesejáveis. É bem conhecida a incapacidade de certos nebulizadores para nebulizar quantidades terapêuticas de fármacos em aerossóis de tamanhos de partícula pequenos e uniformes. Para entrega eficaz de lisinato de aztreonam um intervalo de MMAD de partículas necessário para entregar o fármaco ao espaço endobrônquico, o local da infecção, está entre 1-5 pm. Muitos nebulizadores disponíveis comercialmente são capazes de aerossolizar grandes volumes da solução com um propósito de entregar pelo menos 10% do volume ao espaço endobrônquico produzindo à volta de 90% de grandes partículas de aerossol acima de 5 pm com um número muito grande de partículas estando no intervalo de 50-100 pm. Estes nebulizadores são ineficientes e não adequados para entrega de lisinato de aztreonam. 66 ΕΡ 1 641 436/ΡΤ

De modo a ser terapeuticamente eficaz, a maioria das partículas de lisinato de aztreonam aerossolizado não deverão um MMAD maior do que entre 1 e 5 pm. Quando o aerossol contém um grande número de partículas com um MMAD maior do que 5 pm, estas são depositadas nas vias aéreas superiores diminuindo a quantidade de antibiótico entregue ao local de infecção no tracto respiratório inferior.

Anteriormente, dois tipos de nebulizadores, de jacto e ultra-sónico, têm mostrado ser capazes de produzir e entregar partículas de aerossol com tamanhos entre 1 e 5 pm. Estes tamanhos de partícula são óptimos para tratamento de infecções pulmonares bacterianas causadas por bactérias gram-negativas tais como Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, espécies de Enterobacter, Klebsiella pneumoniae, K. oxytoca, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Serratia marcescens, Haemophilus influenza, Burkholderia cepacia, Stenotrophomonas maltophilia, Alcaligenes xylosoxidans e Pseudomonas aeruginosa resistente a múltiplos fármacos. No entanto, a não ser que se utilize uma solução especialmente formulada, tipicamente estes nebulizadores necessitam volumes maiores para administrar a quantidade suficiente de fármaco para obter um efeito terapêutico. Por este motivo, sem um lisinato de aztreonam formulado especialmente a entrega eficiente de lisinato de aztreonam não é conseguida.

Nebulizadores adequados têm de ser capazes de nebulizar um pequeno volume da formulação eficientemente, isto é no tamanho de partículas de aerossol predominantemente no intervalo de 1-5 pm. Neste pedido de patente, predominantemente significa que pelo menos 70% mas preferivelmente mais do que 90% de todas as partículas de aerossol geradas estão dentro do intervalo 1- 5pm.

Os nebulizadores de jacto e ultra-sónicos podem produzir e entregar partículas com diâmetros de partícula entre 1 e 5 pm. Um nebulizador de jacto utiliza a divisão por pressão de ar de uma solução aquosa de lisinato de aztreonam em gotículas de aerossol. Um nebulizador ultra-sónico utiliza o cisalhamento da solução aquosa de lisinato de aztreonam por um cristal piezoeléctrico. 67 ΕΡ 1 641 436/ΡΤ

Tipicamente, porém, os nebulizadores de jacto apenas são cerca de 10% eficientes sob condições clinicas, enquanto os nebulizadores ultra-sónicos apenas são 5% eficientes. A quantidade depositada e absorvida nos pulmões é assim uma fracção dos 10% apesar das grandes quantidades do fármaco colocadas no nebulizador.

Um tipo de nebulizador que é adequado e preferido para entrega de lisinato de aztreonam é um nebulizador de atomização que consiste de um recipiente de armazenamento de liquido em contacto de fluido com o diafragma e válvulas de inalação e exalação. Para administração da formulação de lisinato de aztreonam, colocam-se 1 a 5 mL da formulação no recipiente de armazenamento, e utiliza-se um gerador de aerossol acoplado que produz um aerossol atomizado de tamanhos de partícula selectivamente entre 1 e 5 pm.

Dispositivos de nebulização típicos adequados para a prática do método incluem nebulizadores de atomização, ou nebulizadores de jacto modificados, nebulizadores ultra-sónicos, nebulizadores electrónico, nebulizadores de placa porosa vibratória e inaladores de pó seco energizado modificados para lidar com um pequeno volume de fármaco altamente concentrado numa formulação especifica possuindo um pH, osmolalidade e salinidade específicos. O nebulizador mais preferido é o nebulizador de inalação PARI descrito no PCT/US00/29541 modificado para satisfazer os requisitos do método. B. Inaladores de pó seco O pó seco é administrado como tal utilizando dispositivos que entregam o pó seco directamente aos pulmões.

Existem duas concepções principais de inaladores de pó seco. Uma concepção é a do dispositivo de dose calibrada no qual um reservatório para o fármaco é colocado dentro do dispositivo e o paciente adiciona uma dose do fármaco ao interior da câmara de inalação. A segunda é um dispositivo calibrado de fábrica no qual cada dose individual foi fabricada num recipiente separado. Ambos os sistemas dependem 68 ΕΡ 1 641 436/ΡΤ da formulação de fármaco em pequenas partículas de diâmetros medianos em massa de 1 a 5 mícron, e usualmente envolvem co-formulação com partículas de excipiente maiores (tipicamente partículas de lactose de 100 mícron de diâmetro) . O pó de fármaco é colocado no interior da câmara de inalação (quer pelo dispositivo de calibração quer por ruptura de uma dose calibrada de fábrica) e o fluxo inspiratório do paciente acelera o pó para fora do dispositivo e para o interior da cavidade oral. Características de fluxo não laminar do percurso de pó fazem com que os agregados de excipiente-fármaco se decomponham, e a massa das grandes partículas de excipiente provoca o seu impacto na parte de trás da garganta, enquanto as partículas de fármaco mais pequenas são depositadas profundamente nos pulmões. A tecnologia actual para inaladores de pó seco é tal que os limites de carga útil são à volta de 100 mg de pó. A falta de estabilidade a longo prazo de lisinato de aztreonam numa solução aquosa devida a hidrólise possibilita à tecnologia de inalador de pó seco tornar-se um veículo de entrega preferido para pó seco de lisinato de aztreonam. C. Tamanho de partículas de aerossol ou pó seco 0 tamanho de partículas da formulação de aerossol de lisinato de aztreonam é um dos aspectos mais importantes do invento. Se o tamanho de partícula é maior do que 5 pm então as partículas são depositadas nas vias aéreas superiores. Se o tamanho de partículas do aerossol é menor do que 1 pm então este não se depositará no espaço endobrônquico mas continua a ser entregue aos alvéolos e pode ser transferido para a circulação sanguínea sistémica.

Um nebulizador de jacto utiliza pressão de ar para quebrar uma solução líquida em gotículas de aerossol. Um nebulizador ultra-sónico trabalha através de um cristal piezoeléctrico que cisalha um líquido em pequenas gotículas de aerossol. Um sistema de nebulização pressurizado força a solução sob pressão através de pequenos poros para gerar gotículas de aerossol. Um dispositivo de placa porosa vibratória utiliza vibração rápida para cisalhar uma corrente de líquido em tamanhos de gotícula apropriados. No entanto, 69 ΕΡ 1 641 436/ΡΤ apenas algumas formulações de lisinato de aztreonam podem ser eficientemente nebulizadas uma vez que os dispositivos são sensíveis ao pH e à salinidade.

Em inaladores de pó seco, utiliza-se directamente o pó seco de lisinato de aztreonam preparado como descrito acima em dosagens de 1-100 mg, preferivelmente de 10-50 mg, de pó seco como partículas possuindo tamanhos entre 1 e 5 pm. D. Eficácia de nebulização de lisinato de aztreonam A selecção e escolha do nebulizador afecta grandemente a eficácia da entrega de lisinato de aztreonam inalável.

Uma combinação de uma formulação de aerossol de lisinato de aztreonam e de um dispositivo de nebulização melhora significativamente a eficiência e velocidade da administração de fármaco. Actualmente, por exemplo o tempo médio para administração de outros fármacos aerossolizados, tais como por exemplo tobramicina, é 15-20 minutos por dose. O tempo requerido para este tratamento representa um incómodo significativo para o paciente e contribui para o reduzido cumprimento com o regime BID.

Adicionalmente, o sistema de nebulizador utilizado para administração de tobramicina é menos eficiente do que os novos dispositivos de atomização. A dose total de tobramicina depositada no pulmão está no intervalo de 12 a 15%. Aproximadamente 30% do fármaco dispensado permanecem no nebulizador no final do tratamento e, da porção que é aerossolizada, cerca de 30% são emitidos como partículas demasiado grandes ou pequenas para atingirem as vias aéreas inferiores. O novo nebulizador de atomização, com um débito de 8 a 10 microlitros/segundo, ou 0,48 a 0,60 mL/minuto, é capaz de entregar material de fármaco 2 a 4 vezes mais rápido do que os nebulizadores anteriores exemplificados pelo nebulizador PARI LC plus. Além disso, o novo nebulizador é capaz de aerossolizar aproximadamente 90% da dose dispensada, com 85% ou mais das partículas de aerossol estando dentro do intervalo de tamanhos requerido para deposição nas vias 70 ΕΡ 1 641 436/ΡΤ aéreas. Como resultado, a administração de uma formulação de lisinato de aztreonam concebida especificamente utilizando o nebulizador de atomização conduz a melhoria substancial na entrega local às vias aéreas, a um tempo mais curto requerido para entrega e, dependendo da concentração final da solução de lisinato de aztreonam, reduz o tempo de tratamento a tanto quanto três ou quatro minutos. V. Estudos experimentais de suporte A Pseudomonas aeruginosa é a causa mais comum de infecção endobrônquica crónica em pacientes de fibrose cística (CF). Esta infecção é uma causa importante de morbilidade e mortalidade nestes pacientes. A aplicação tópica de agentes antibióticos inalados como névoas de aerossol tem demonstrado benefício significativo para pacientes de CF. A terapia de antibiótico aerossolizado com agentes incluindo carbenicilina, gentamicina, ticarcilina, tobramicina e colistina, mas não aztreonam, tem sido praticada desde há muitos anos. O antibiótico aerossolizado mais amplamente utilizado para tratamento de pacientes de CF é a tobramicina, que produz melhorias substanciais na função pulmonar e noutros parâmetros clínicos. In vítro, a tobramicina é activa contra a maioria dos organismos de P. aeruginosa na ausência de esputo; no entanto, na presença de esputo, a actividade de tobramicina é significativamente reduzida. O aztreonam é um antibiótico de monobactama com excelente actividade contra muitas bactérias aeróbias gram-negativas, incluindo P. aeruginosa. Está actualmente aprovado como terapia parentérica para uma variedade de infecções graves e tem sido amplamente utilizado no controlo de exacerbações pulmonares em pacientes de CF. O aztreonam tem um espectro antibacteriano similar aos antibióticos de aminoglicósido tobramicina e gentamicina. A sua excelente actividade contra muitas bactérias aeróbias gram-negativas, incluindo P. aeruginosa, tem conduzido à sua utilização generalizada entre pacientes de CF, incluindo administração intravenosa como terapia de um único agente e em combinação com outros antibióticos para tratamento de exacerbações 71 ΕΡ 1 641 436/ΡΤ pulmonares. Estes estudos têm demonstrado melhoria na função pulmonar e pontuações clínicas, bem como reduções em carga bacteriana e contagens de glóbulos brancos. Adicionalmente, o aztreonam tem mostrado ter um potencial para controlo de Burkholderia cepacia, um patogénio intrinsecamente resistente aos antibióticos de aminoglicósido habitualmente utilizados.

De modo a determinar se o aztreonam seria bem-sucedido para tratamento de P. aeruginosa e de outras infecções bacterianas, investigou-se a bioactividade de aztreonam in vitro na presença de esputo ou antagonizada por mucina.

As condições experimentais estão descritas no Exemplo 8.

Os resultados destes estudos são descritos nas Figuras 7 a 9 que representam as curvas de morte por antibiótico obtidas com diferentes concentrações dos antibióticos aztreonam (Figs. 7 e 8) e tobramicina (Fig. 9), na presença ou ausência de mucina ou esputo de CF. A mucina é um modelo para o componente de esputo de ligação de proteína. A Figura 7 ilustra a actividade de aztreonam contra P. aeruginosa na ausência (Figura 7A) ou na presença (Figura 7B) de mucina gástrica de porco. Adicionou-se aztreonam para produzir uma concentração nos múltiplos da CIM seguintes: 0,0 (♦) ; 0,1 (□) ; 1, 0 () ; e 10 (0) .

Como se observa na Figura 7, as curvas sem mucina gástrica de porco (Figura 7A) e com mucina gástrica de porco (Figura 7B) são virtualmente idênticas, não indicando qualquer inibição mensurável do antibiótico por mucina. A Figura 8 mostra a actividade de aztreonam contra P. aeruginosa na presença ou ausência de esputo de fibrose cística (CF) . Adicionou-se aztreonam para produzir uma concentração nos múltiplos da CIM seguintes: 0,0 (♦); 0,1 (□); 1,0 (); e 10 (0).

Como se observa na Figura 8, as curvas sem esputo (Figura 8A) e com esputo (Figura 8B) de CF são virtualmente idênticas, não indicando qualquer inibição mensurável do antibiótico por esputo de CF. 72 ΕΡ 1 641 436/ΡΤ A tobramicina, que é conhecida por se ligar a mucinas e ser inibida por esputo e mucina, foi testada com e sem mucina no mesmo ensaio para fins comparativos. A Figura 9 mostra a actividade de tobramicina contra P. aeruginosa na ausência (Figura 9A) ou na presença (Figura 9B) de mucina adicionada. Adicionou-se tobramicina para produzir uma concentração nos múltiplos da CIM seguintes: 0,0 (♦); 1,0% (□); e 10% (). A Figura 9 demonstra a capacidade de mucina de porco para inibir a actividade de tobramicina. Na ausência de mucina, a tobramicina matou P. aeruginosa eficazmente, reduzindo as contagens de colónias em sete logaritmos em uma hora quando aplicada a lOx CIM. Em contraste, a mesma concentração de tobramicina na presença de mucina causou muito menos mortes: quantidades negligenciáveis após uma hora e apenas três a quatro logaritmos às quatro horas. Para lx CIM, a tobramicina matou sete logaritmos de P. aeruginosa em quatro horas na ausência de mucina, mas matou menos do que um logaritmo às quatro horas na presença de mucina.

Nem esputo de CF nem mucina gástrica de porco mostraram inibição significativa da actividade de aztreonam sob as condições deste ensaio. As curvas de morte de P. aeruginosa obtidas eram virtualmente idênticas aos controlos sem esputo ou mucina. Conforme esperado, o crescimento de P. aeruginosa ocorreu quando se adicionou aztreonam em quantidades inferiores à CIM (curvas superiores nas Figuras 7-9), enquanto a morte efectiva ocorreu quando o aztreonam estava presente na CIM ou superior (curvas inferiores).

Isto está em contraste com o resultado para tobramicina, um antibiótico que se conhece ser inibido por esputo de CF e mucina gástrica de porco. A adição de mucina a tobramicina resultou em morte diminuída em até quatro logaritmos, dependendo do momento e da concentração utilizada de antibiótico. Estes resultados confirmam a validade do ensaio de inibição de mucina como modelo para interpretação dos resultados esperados nos pulmões de pacientes de CF. 73 ΕΡ 1 641 436/ΡΤ

Estes resultados mostram que o aztreonam não é inibido por esputo de pacientes de fibrose cística e que não será inibido como um tratamento complementar primário ou secundário quando administrado por inalação, pelo menos não na extensão que a tobramicina é inibida. Isto implica que o aztreonam pode ser preferível a tobramicina no tratamento de infecções respiratórias em pacientes de fibrose cística ou outros, uma vez que mais antibióticos estarão disponíveis para erradicar Pseudomonas aeruginosa. VI. Tratamento de infecções bacterianas pulmonares

Descrevemos aqui um tratamento e prevenção eficazes de infecções bacterianas pulmonares agudas e crónicas causadas por Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Klebsiella pneumonia, Pseudomonas aeruginosa, Haemophilus influenzae, Proteus mirabilis, espécies de Enterobacter e Serratia marcescens, bem como infecções causadas por estirpes resistentes a antibióticos Burkholderia cepacia, Stenotrophomonas maltophilia, Alcaligenes xylosoxidans, e Pseudomonas aeruginosa resistente a múltiplos fármacos. A. Dois modos de tratamento inalável

Um método para tratamento de infecções pulmonares compreende a administração de lisinato de aztreonam em forma inalável quer por aerossol quer como um pó seco, várias vezes ao dia. A dose diária de lisinato de aztreonam está entre 1 e 500 mg/dia, com uma dose excepcional até 750 mg/dia administrada em 1-50 mg/mL para aerossol e uma dose diária de pó seco de 2 a 200 mg administrada numa dose de 1-100 mg/um tratamento. A dosagem de lisinato de aztreonam e a frequência de dosagem dependem do tipo de infecção bacteriana, da sua gravidade, da idade do paciente, das condições do paciente, etc. No caso de pacientes de fibrose cística onde a capacidade aérea dos pulmões está diminuída, a dosagem é mais frequente com doses mais baixas. A formulação de pó seco adequada para tratamento de infecções pulmonares compreende 1 a 200 mg, preferivelmente cerca de 10 a 100 mg, de pó num estado amorfo ou cristalino em tamanhos de partícula entre 1 e 5 mícron em diâmetro 74 ΕΡ 1 641 436/ΡΤ aerodinâmico mediano em massa para entrega eficaz de lisinato de aztreonam ao interior do espaço endobrônquico. A formulação de pó seco é entregue uma a quatro ou mais vezes ao dia, preferivelmente duas vezes ao dia. A formulação de pó seco é estável à temperatura e tem um pH fisiologicamente aceitável de 4,2-7,5, preferivelmente 5,5 a 7,0, e tem uma vida em prateleira de mais de cinco anos. B. Tratamento de infecções em pacientes com doenças pulmonares supurativas A terapia de aerossol é particularmente útil para tratamento de pacientes padecendo de doenças pulmonares supurativas e é especialmente adequada para tratamento de pacientes com fibrose cística, bronquiectasia e daqueles pacientes com ventilação mecânica.

Anteriormente, a terapia de aerossol para fibrose cística com antibióticos inalados (ATCF) tem demonstrado benefício significativo de tal tratamento para pacientes de fibrose cística (CF) padecendo de infecções pulmonares crónicas.

Nos E.U.A., o agente mais amplamente utilizado e bem-sucedido em relação a este aspecto tem sido a tobramicina, que tem mostrado produzir melhorias na função do pulmão e noutros parâmetros clínicos.

Constatou-se agora que o lisinato de aztreonam inalável proporciona o tratamento bem-sucedido em fibrose cística, bronquiectasia ou outras doenças pulmonares supurativas para infecções pulmonares causadas por bactérias gram-negativas e particularmente aquelas causadas por estirpes resistentes a antibióticos de Burkholderia cepacia, Stenotrophomonas maltophilia, Alcaligenes xylosoxidans e Pseudomonas aeruginosa resistente a múltiplos fármacos. O tratamento destas infecções bacterianas multirresistentes com lisinato de aztreonam aerossolizado tem sido bem-sucedido na erradicação das bactérias como descrito no Exemplo 2. 75 ΕΡ 1 641 436/ΡΤ

Este tratamento é realizado autonomamente ou pode ser um tratamento complementar a outros antibióticos, tais como tobramicina, que após utilização prolongada resulta no desenvolvimento de resistência anti-tobramicina. Quando o tratamento com tobramicina é intervalado com períodos de tratamento com lisinato de aztreonam, esta resistência ou não se desenvolve ou regride. C. Limitações de antibióticos aerossolizados actuais no tratamento de fibrose cistica

Até à data, um aminoglicósido tobramicina é o único antibiótico com aprovação da FDA para administração como um aerossol. No entanto, apesar dos benefícios obtidos em pacientes de fibrose cística com a administração de tobramicina aerossolizada, a sua utilidade está algo limitada.

Em primeiro lugar, a utilização frequente de aminoglicósidos para controlar exacerbações pulmonares conduz a desenvolvimento selectivo de estirpes de Pseudomonas aeruginosa resistentes. A emergência generalizada destes organismos é reconhecida como uma crise em crescimento na comunidade da CF. Por exemplo, 21% dos pacientes rastreados de 69 centros de CF diferentes, para os ensaios clínicos de tobramicina da fase III, tinham isolados resistentes à tobramicina (CIM > 16 pg/mL). Por conseguinte, muitos clínicos estão relutantes em prescrever este aminoglicósido aerossolizado como terapia supressora crónica, receando que poderia promover adicionalmente resistência e assim diminuir a eficácia da terapia IV. De modo a reduzir o risco deste tratamento-resistência emergente, a terapia de tobramicina está restringida a ciclos de 28 dias com e 28 dias sem o fármaco.

Uma segunda limitação da tobramicina aerossolizada é a sua falta de actividade contra várias bactérias intrinsecamente resistentes à tobramicina, incluindo Stenotrophomonas maltophilia, Alcaligenes xylosoxidans e Burkholderia cepacia, a última das quais é amplamente reconhecida como uma ameaça significativa para pacientes de fibrose cística. Pacientes de fibrose cística infectados com 76 ΕΡ 1 641 436/ΡΤ

Burkholderia cepacia têm uma taxa de mortalidade aumentada, e muitos experimentam uma evolução fatal rápida, como descrito em Am. J. Respir. Crit. Care Med., 160:1572-1577, (1999). Adicionalmente, a Burkholderia cepacia é uma infecção transmissível que pode causar disseminação epidémica entre pacientes de fibrose cistica. Por conseguinte, um paciente infectado com Burkholderia cepacia tem de ser isolado de outros pacientes. O lisinato de aztreonam aerossolizado não induz resistência a aminoglicósidos e tem boa actividade contra patogénios resistentes observados em pacientes de fibrose cistica.

Um lisinato de aztreonam aerossolizado pode substituir a tobramicina, ou pode ser utilizado como um tratamento alternativo e intermitente para tobramicina durante os períodos de 28 dias isentos de tobramicina, que são requeridos para prevenir o desenvolvimento de resistência permanente à tobramicina. O lisinato de aztreonam é um antibiótico com excelente actividade contra muitas bactérias aeróbias gram-negativas, incluindo Pseudomonas aeruginosa multirresistente. O espectro de actividade de lisinato de aztreonam é similar ao dos antibióticos de aminoglicósido tobramicina e gentamicina, e a sua actividade anti-Pseudomonas é comparável à da ceftazidina e em vários aspectos é melhor do que a da tobramicina. Por exemplo, o lisinato de aztreonam não é inibido por esputo de paciente de CF, tornando-o um fármaco muito mais potente do que a tobramicina que é inibida deste modo. O lisinato de aztreonam resiste à destruição por muitas β-lactamases bacterianas, que são a origem de muita da resistência emergente ao tratamento para antibióticos de β-lactama que surge frequentemente entre pacientes hospitalizados. A actividade de lisinato de aztreonam contra bactérias gram-negativas, especialmente Pseudomonas aeruginosa, combinada com o seu excelente perfil de segurança, tornam-no uma boa alternativa a aminoglicósidos no tratamento de 77 ΕΡ 1 641 436/ΡΤ infecções pulmonares crónicas entre pacientes de fibrose cística. Até agora, a utilização clínica de lisinato de aztreonam em pacientes de CF tem incluído a administração IV de aztreonam como terapia de agente único ou em combinação com outros antibióticos para tratamento de exacerbações pulmonares. D. Vantagens de lisinato de aztreonam como um antibiótico aerossolizado 0 lisinato de aztreonam possui várias caracteristicas que o tornam muito atractivo para administração de aerossol a pacientes de CF. A primeira destas caracteristicas decorre do seu mecanismo de acção, que, ao contrário dos antibióticos de aminoglicósido, envolve a ligação preferencial a proteína de ligação a penicilina 3 (PBP3) e subsequente interferência com a síntese da parede celular bacteriana. Porque o mecanismo de acção de lisinato de aztreonam difere do da tobramicina, a sua utilização não contribui para a emergência de estirpes de Pseudomonas aeruginosa resistentes a aminoglicósido. A segunda vantagem de uma formulação aerossolizada de lisinato de aztreonam é a sua actividade contra Pseudomonas aeruginosa resistente a tobramicina, e resistente a múltiplos fármacos. Quando se examinaram isolados de pacientes arrolados nos ensaios de tobramicina da Fase II, quase 75% dos isolados com uma CIM de tobramicina >16 pg/mL eram susceptíveis a lisinato de aztreonam. A terceira caracteristica é a capacidade de lisinato de aztreonam aerossolizado para controlar intrinsecamente organismos resistentes a tobramicina, especialmente Burkholderia cepacia, que são considerados resistentes aos níveis de lisinato de aztreonam conseguidos por administração parentérica. VII. Actividade antibacteriana de aztreonam

De modo a testar a actividade antibacteriana de aztreonam aerossolizado contra estirpes multirresistentes de 78 ΕΡ 1 641 436/ΡΤ

Pseudomonas aeruginosa, Burkholderia cepacia, Stenotrophomonas maltophilia e Alcaligenes xylosoxidans, testaram-se as actividades in vitro de aztreonam em concentrações correspondentes às que se conseguem com aztreonam inalável contra isolados clínicos a partir de pacientes de fibrose cística. A entrega de aerossol de aztreonam de acordo com o invento consegue concentrações de aztreonam que atingem níveis de 500 até tão elevados quanto 8000 pg/mL, com um nível médio à volta de 2000 pg/mL, de aztreonam no esputo. Estes níveis dependem da formulação bem como do nebulizador utilizado para aerossolização. Com certos nebulizadores a concentração de aztreonam pode atingir um nível médio de 5000 pg/mL.

As susceptibilidades determinadas in vitro das bactérias testadas são preditivas da eficácia clínica de aerossol ou pó seco de aztreonam inalado. O aztreonam mata por lise das paredes celulares desde que a concentração local de antibiótico exceda a concentração inibitória mínima das bactérias (Med. Clinics N. Am., 79: 4, 733-743, (1995)) . A actividade in vitro de elevadas concentrações de aztreonam contra isolados clínicos de B. cepacia, S. maltophilia e A. xylosoxidans foi testada no Children's Hospital and Regional Medicai Center em Seattle, WA. O ensaio foi realizado em placas de microdiluição em caldo preparadas com concentrações de aztreonam de 1 para 2 de 2 a 2048 pg/mL. 0 Staphylococcus aureus, um organismo gram-positivo, foi utilizado como um controlo negativo.

No Exemplo 1 descreve-se o procedimento detalhado utilizado para o ensaio. Os resultados são apresentados na Tabela 9 . 79 ΕΡ 1 641 436/ΡΤ

Tabela 9

Organismo (# de isolados) Intervalo de CIM CIM50 CIM90 P. aeruginosa (54) 2-1024 16 512 B. cepacia (38) 2-2048 32 512 S. maltophilia (20) 8->2048 256 >2048 A. xylosoxidans (20) 2>2048 256 2048 S. aureus (20) 512-2048 1024 2048

Para ensaio, cada placa de micropoços continha uma diluição de 1 para 2 de 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256, 512, 1024 e 2048 pg/mL de aztreonam. Cada placa contendo os micropoços foi utilizada para testar um isolado de um organismo. A Tabela mostra as diferentes espécies de bactérias testadas quanto à sensibilidade ao aztreonam, isto é a capacidade do antibiótico para inibir o seu crescimento, com o número de isolados para cada espécie indicado entre parênteses. A coluna designada "Intervalo de CIM" mostra o intervalo dos limites inferior e superior de sensibilidades observadas nos isolados testados. A coluna designada CIM50 mostra o nivel mediano de sensibilidade para os 50% de isolados mais sensíveis. A coluna final, designada CIM90, mostra o valor mediano para o nível de sensibilidade para os 90% dos isolados mais sensíveis. A Tabela 9 mostra os resultados de actividade de aztreonam in vitro comparativa contra isolados clínicos obtidos a partir de pacientes de fibrose cística.

Para interpretação destes dados, os valores que representam qual a concentração de aztreonam requerida para inibir o crescimento de bactérias são comparados com as concentrações de aztreonam obteníveis pelas diferentes vias de administração. Assim, para administração intravenosa de aztreonam, o nivel no soro após administração de 2 g de aztreonam, a dose intravenosa máxima permitida, o nivel de pico no soro é 256 pg/mL e depois diminui rapidamente. Às seis horas após a administração, o nível de aztreonam no soro 80 ΕΡ 1 641 436/ΡΤ está no intervalo de 16 pg/mL. Por razões de segurança, o aztreonam arginina intravenoso apenas pode ser administrado a cada seis horas. Com a possível excepção de Pseudomonas aeruginosa que tem uma CIM50 de 16 pg/mL, todos os outros organismos seriam predominantemente resistentes a aztreonam intravenoso, na medida em que o seu nível de resistência excede mesmo a concentração de pico (256 pg/mL) da concentração de aztreonam no soro de esputo após administração intravenosa. No entanto, uma vez que a resistência de bactérias é relativa à concentração de fármaco, para administração de aerossol a concentração de pico deverá estar pelo menos no intervalo de 500 a 2000 pg/mL. Este intervalo é conseguido com as doses de aztreonam e com a formulação combinados com o nebulizador eficiente. Para a concentração no esputo de 500-2000 pg/mL, a terapia de aerossol é capaz de tratar muitas das infecções endobrônquicas causadas por bactérias gram-negativas, especificamente aquelas bactérias listadas na Tabela 9, com excepção de Staphylococcus aureus.

As CIM50 e CIM90 mostraram que o tratamento de P. aeruginosa com aztreonam inalável erradica a maioria dos isolados de P. aeruginosa com as elevadas concentrações de aztreonam no esputo de pacientes de fibrose cística obteníveis após entrega de aerossol. Os dados obtidos para isolado de Burkholderia cepacia indicaram que será de esperar que pelo menos metade dos pacientes respondam a um tal tratamento com erradicação das bactérias. Se forem entregues ao pulmão concentrações de aztreonam suficientemente elevadas, é de esperar que a percentagem seja mais elevada. Uma vez que a infecção por Burkholderia cepacia é actualmente encarada como uma condição não tratável, o tratamento com aztreonam inalável por aerossol é a primeira terapia eficaz documentada.

Os resultados obtidos nestes estudos são surpreendentes e inesperados uma vez que não existe qualquer indicação na literatura de que a Burkholderia cepacia é susceptível a tratamento com aztreonam. Os dados mostram também que alguns isolados de S. maltophilia e A. xyloxidans respondem a elevadas concentrações de aztreonam. 81 ΕΡ 1 641 436/ΡΤ A inalação de aztreonam como descrito permite atingir concentrações de aztreonam no esputo tão elevadas quanto 2000-5000 pg/mL. Os niveis de aztreonam no esputo conseguidos através de administração de aerossol excedem os requeridos para inibir organismos responsáveis por infecções de outro modo não tratáveis em pacientes de CF.

Adicionalmente, o aztreonam entregue por inalação a todos os pacientes com Burkholderia cepacia e/ou S. maltophilia e/ou A. xyloxidans, em conjunto com outros antibióticos quer administrados sistemicamente parentericamente quer por inalação contribui para sinergia desse tratamento. Uma combinação de aztreonam inalável com outros antibióticos proporciona outra abordagem terapêutica para tratar estirpes bacterianas multirresistentes.

Os estudos aqui descritos demonstraram que as concentrações de aztreonam conseguidas após administração de aerossol têm actividade contra Burkholderia cepacia isolada a partir de esputo de pacientes de CF bem como contra outras bactérias que são grandemente resistentes a tratamento com outros antibióticos. A CIM50 e a CIM90 observadas para uma bactéria gram-positiva, Staphylococcus aureus, mostram que elevadas concentrações de aztreonam tiveram alguma actividade contra esta bactéria gram-positiva. No entanto, estas constatações não têm grande significância uma vez que existem muitos outros fármacos com eficácia razoável contra Staphylococcus aureus. VIII. Segurança e ensaios clínicos

As infecções requerendo particular atenção são infecções causadas por e incluindo B. cepacia, S. maltophilia e A. xylosoxidans, bem como estirpes multirresistentes de Pseudomonas aeruginosa. A infecção clinica mais significativa é a primeira.

De modo a determinar se um lisinato de aztreonam apropriadamente formulado para aerossolização podia tornar-se eficaz para tratamento destas estirpes raras mas ainda assim 82 ΕΡ 1 641 436/ΡΤ muito resistentes, ο tratamento com lisinato de aztreonam aerossolizado foi iniciado e testado num paciente de fibrose cistica possuindo uma grave infecção com Burkholderia cepacia que não respondia a qualquer tratamento. 0 tratamento clinico e os resultados obtidos com um lisinato de aztreonam aerossolizado são descritos no Exemplo 2. A segurança da formulação de lisinato de aztreonam foi também estudada tanto no ser humano como em cães Beagle. As condições destes estudos são descritas nos Exemplos 10 e 11.

Os resultados de ambos os estudos confirmam a segurança da formulação de lisinato de aztreonam para inalação. Em comparação com uma formulação contendo arginina, a nova formulação é segura no ser humano (Exemplo 10) e no cão até 200 vezes a dose em humano como mostrado num estudo de 28 dias no cão (Exemplo 11). A segurança aumentada estabelece a utilidade do lisinato de aztreonam em ambos os casos.

Os resultados de segurança a partir de ambos os estudos mostram que não foram registados quaisquer eventos adversos graves durante o ensaio e nenhum sujeito foi retirado do ensaio por causa de um evento adverso. No total, foram reportados 7 eventos adversos pós-dose para 7 sujeitos. Nem um único evento adverso individual foi experimentado por mais do que um sujeito. Um único evento adverso relacionado com fármaco ocorreu em cada um dos grupos de dose de aztreonam inalada de 95 e 190 mg (dor de cabeça e tonturas, respectivamente) e 2 eventos adversos relacionados com fármaco ocorreram no grupo de dose de aztreonam inalada de 285 mg (disgeusia, i.e. sabor desagradável e tosse). Um evento adverso foi de gravidade Grau 2 (dor de cabeça) e os restantes eventos adversos foram de Grau 1. Todos os eventos adversos estavam resolvidos antes do final do ensaio. O evento adverso de tosse conduziu a descontinuação da medicação do ensaio, ainda que o sujeito continuasse no ensaio e completasse todas as avaliações do ensaio. Não se verificaram quaisquer alterações médias assinaláveis em relação à linha de base em qualquer parâmetro da função pulmonar pós-dose. Um sujeito, que foi doseado com placebo, tinha uma diminuição de FEVi em relação à linha de 83 ΕΡ 1 641 436/ΡΤ base superior a 15% (+30 min) . Isto foi registado como um evento adverso, mas não foi considerado como estando relacionado com a medicação de ensaio. Não se verificaram quaisquer alterações médias assinaláveis em relação à linha de base em qualquer parâmetro de hematologia ou coagulação avaliado. Não se verificaram quaisquer alterações médias assinaláveis em relação à linha de base em pressão sistólica e diastólica, ritmo de pulsação, temperatura, ritmo de respiração ou oximetria de pulso em sujeitos doseados com placebo ou 90 mg, 190 mg ou 285 mg de aztreonam inalado. Nenhum valor de qualquer sujeito individual em qualquer destes parâmetros foi reportado como um evento adverso. Não se verificaram quaisquer alterações médias assinaláveis em relação à linha de base em qualquer parâmetro de ECG avaliado e nenhum valor de ECG de qualquer sujeito individual foi reportado como um evento adverso. Não se verificaram quaisquer alterações em relação à linha de base em qualquer exame fisico pós-dose.

Em conclusão, o aztreonam inalado era genericamente seguro e bem tolerado neste ensaio quando administrado em doses de 95 mg, 190 mg e 285 mg. Não se verificaram quaisquer alterações clinicamente significativas em FEVj (definidas como uma diminuição em relação à linha de base de 15% ou mais) em qualquer sujeito tratado com aztreonam. Um sujeito que foi tratado com placebo experimentou uma diminuição em FEVi em relação à linha de base de 15,58%. Isto foi reportado como um evento adverso não considerado como relacionado com o tratamento. Não se verificaram quaisquer alterações clinicamente significativas em quaisquer outras medições de segurança (quer em valores médios quer em valores individuais) que fossem consideradas como estando relacionadas com o tratamento. O objectivo do segundo estudo foi avaliar a tolerabilidade e toxicidade da formulação de lisinato de aztreonam aerossolizado no cão Beagle após dosagem repetida 84 ΕΡ 1 641 436/ΡΤ durante 28 dias pela via de inalação e avaliar a reversibilidade de quaisquer efeitos após um período de recuperação de 14 dias. A exposição por inalação foi levada a cabo utilizando um sistema de máscara facial fechada com os cães respirando passivamente a partir de um nebulizador ultra-sónico.

As condições sob as quais o estudo foi conduzido estão descritas no Exemplo 11.

Os resultados globais deste estudo mostram que a inalação de lisinato de aztreonam nebulizado é segura e não existem quaisquer sinais clínicos adversos observados nem efeitos relacionados com o tratamento sobre peso corporal, consumo de alimentos, observações oftalmoscópicas, leituras de ECG, investigações laboratoriais ou pesos de órgãos. Não existiram quaisquer observações de necropsia ou histológicas que pudessem ser atribuídas ao tratamento com Aztreonam. Uma vez que a dose humana prevista é 75 mg, e o peso médio é 75 kg, a margem de segurança pode ser tão elevada quanto 200 vezes a dose para humano.

UTILIDADE O método de tratamento e as composições inaláveis de lisinato de aztreonam aqui reveladas são adequadas para tratamento de infecções do tracto respiratório causadas por Burkholderia cepacia, Stenotrophomonas maltophilia,

Alcaligenes xylosoxidans e Pseudomonas aeruginosa resistente a múltiplos fármacos bem como para tratamento de outras infecções pulmonares causadas por bactérias gram-negativas. EXEMPLO DE REFERENCIA 1

Ensaio in vitro de isolados a partir de pacientes de fibrose cística

Este exemplo descreve o procedimento utilizado para estudos in vitro de isolados bacterianos obtidos a partir de pacientes de fibrose cística. 85 ΕΡ 1 641 436/ΡΤ

Isolados bacterianos do tracto respiratório (144) a partir de pacientes com CF, que tinham sido armazenados a - 70°C, foram cultivados por duas passagens consecutivas de um dia para o outro a 37°C sobre ágar de sangue a 5% (Remei, Lenexa, KS).

As concentrações inibitórias mínimas (CIM) foram determinadas pelos passos seguintes:

Ensaio antimicrobiano de CIM de organismos aeróbios 1. Placas de CIM foram trazidas até à temperatura ambiente. 2. 3,0 mL de solução salina fisiológica foram inoculados com uma cultura de 18-24 h do organismo a ser testado até uma turvação igual a um padrão McFarland 0,5 (1,5 x 108 CFU/mL).

Isto corresponde a uma OD600 de 80 - 88% de transmissão. 3. Em 15 minutos após a preparação, a suspensão de inoculo ajustada foi diluída transferindo 100 mL para 2,9 mL de água estéril de diluição. 4. Misturou-se gentilmente a suspensão e dispensaram-se 10 mL em cada poço de CIM possuindo um volume inicial de 100 μΐ. A concentração final em cada poço era igual a 5 x 105 CFU/mL ou 5 x 104 CFU/poço. 5. Incubaram-se as placas aerobicamente a 37°C durante 16-20 horas. A mesma temperatura de incubação foi mantida para todas as culturas. As placas de microdiluição não foram empilhadas em altura mais de quatro. 6. O ponto final antimicrobiano foi lido e registado como o primeiro poço não mostrando qualquer crescimento ou névoa prontamente visível conforme detectado pelo olho nu. 7. As placas de microdiluição foram postas em contacto com concentrações 1 para 2 de lisinato de aztreonam de 2 a 2048 mg/mL. Cada placa de micropoços foi tratada com uma diluição 1 para 2 de lisinato de aztreonam nas quantidades seguintes: 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256, 512, 1024 e 2048 pg/mL. Cada placa contendo os micropoços foi utilizada para testar um isolado de um organismo. 8. Os resultados foram lidos e registados. 86 ΕΡ 1 641 436/ΡΤ EXEMPLO DE REFERÊNCIA 2

Tratamento clínico de paciente com Burkholderia cepacia

Este exemplo descreve uma primeira constatação de eficácia do tratamento com aztreonam aerossolizado de um paciente de fibrose cística padecendo de Burkholderia cepacia resistente. 0 paciente era uma mulher de 20 anos de idade com fibrose cística e doença pulmonar de fase terminal. Ela tinha sido diagnosticada com infecções pulmonares de Burkholderia cepacia que se tinha tornado resistente a todos os antibióticos intravenosos, orais e inalados. Ela tinha duas estirpes documentadas geneticamente diferentes de Burkholderia cepacia. Por esta razão a paciente foi rejeitada como candidata para um transplante de pulmão.

Foi fornecida à paciente uma formulação do invento compreendendo 200 mg/mL de aztreonam e esta foi instruída para utilizar esta formulação em 3 a 5 mL de diluente e utilizá-la num nebulizador de jacto de respiração assistida alimentado com um compressor de ar e a tomar a terapia duas vezes ao dia. Este tipo de nebulizador entrega apenas cerca de 10 a 20% da dose colocada nos nebulizadores aos pulmões, no entanto, esse era o único nebulizador disponível para o paciente para tratamento doméstico.

Após três meses de terapia contínua duas vezes ao dia, a infecção pulmonar foi tratada com sucesso e não podia ser detectada qualquer evidência de Burkholderia cepacia. A paciente foi considerada tratada da infecção e eventualmente foi sujeita a um procedimento de transplante do pulmão bem-sucedido . Não ocorreu qualquer recorrência ou relapso pós-operatório de infecção por Burkholderia cepacia apesar da intensa terapia de imunossupressão que se seguiu ao transplante.

Estas constatações foram surpreendentes uma vez que a utilização anterior de aztreonam arginina disponível 87 ΕΡ 1 641 436/ΡΤ comercialmente numa geração mais antiga, entregue em nebulizadores ainda menos eficientes, não conduziu a erradicação de P. aeruginosa como descrito em Clinics Chest Med., 19:473-86, (Set. 1998). No ensaio ai descrito, os autores interromperam a terapia ao desenvolvimento de qualquer resistência ao aztreonam em vez de continuar o tratamento destes pacientes. 0 tratamento anterior não testou nem especulou que esta terapia pudesse ser eficaz no tratamento de outras bactérias gram-negativas incluindo Burkholderia cepacia, S. maltophilia, X. xylosoxidans, ou outras infecções por Pseudomonas resistente a múltiplos fármacos.

Os resultados obtidos com o tratamento do paciente anterior são ainda mais surpreendentes na medida em que a erradicação de Burkholderia cepacia é uma ocorrência extremamente rara, particularmente quando a infecção está bem estabelecida como era o caso desta paciente. EXEMPLO 3

Preparação de pó seco de lisinato de aztreonam

Este exemplo proporciona métodos e procedimentos utilizados para preparação de pó seco inalável contendo lisinato de aztreonam.

Para a formulação de pó seco, um lisinato de aztreonam purificado é moido até um pó possuindo diâmetros aerodinâmicos medianos em massa no intervalo de 1 a 5 pm por moagem de meios, moagem de jacto, secagem por pulverização ou técnicas de precipitação de partículas.

As determinações do tamanho de partículas são efectuadas utilizando um impactador de cascata de múltiplas etapas Anderson. A moagem de meios pode ser efectuada colocando o fármaco num moinho contendo, por exemplo, bolas de aço inoxidável ou cerâmicas e fazendo rodar ou cair o material até se conseguirem os intervalos de tamanho de partículas de fármaco desejados. 88 ΕΡ 1 641 436/ΡΤ A moagem de jacto utiliza correntes de ar a pressão muito elevada para fazer colidir as partículas umas com as outras, com as partículas finas do tamanho desejado sendo recuperadas a partir do moinho. A secagem por pulverização é conseguida por pulverização de uma fina névoa de solução de fármaco sobre um suporte e secagem das partículas. As partículas são depois recolhidas. A precipitação de partículas é conseguida por adição de um co-solvente às partículas secas por pulverização. A solubilidade do fármaco cai para o ponto onde se formam partículas de fármaco sólidas. As partículas são recolhidas por filtração ou centrifugação. A precipitação tem a vantagem de ser altamente reprodutível e poder ser realizada sob condições de temperatura baixa, o que reduz a degradação. EXEMPLO 4

Inaladores de pó seco

As formulações de dose calibrada e de pó seco preparadas de acordo com o invento podem ser utilizadas directamente em inaladores de dose calibrada ou pó seco.

Um inalador de dose calibrada consiste de três componentes: uma lata contendo a suspensão de fármaco num propulsor, uma válvula doseadora concebida para entregar com exactidão volumes calibrados da suspensão em propulsor, e um adaptador oral que contém um orifício de pulverização a partir do qual a dose calibrada é entregue. Na posição em repouso, a câmara de medição da válvula está ligada ao reservatório da suspensão de fármaco através de um canal ou orifício de enchimento. Com a depressão da válvula este canal de enchimento é fechado e a câmara de medição é exposta à pressão atmosférica através do orifício de pulverização no adaptador oral e o orifício da haste da válvula. Esta rápida redução de pressão conduz a ebulição instantânea do propulsor e a expulsão da mistura rapidamente em expansão a partir da câmara de medição. A mistura de líquido/vapor entra depois na câmara de expansão que é constituída pelo volume interno da 89 ΕΡ 1 641 436/ΡΤ haste da válvula e do adaptador oral. A mistura sofre expansão adicional antes de ser expelida, sob a sua própria pressão, a partir do bico de pulverização. Ao sair do orifício de pulverização, os ligamentos de líquido que estão embebidos no vapor de propulsor são despedaçados por forças aerodinâmicas. Tipicamente, nesta etapa, as goticulas têm 20 a 30 pm de diâmetro e movem-se à velocidade do som da mistura de duas fases vapor líquido (aproximadamente 30 metros por segundo). À medida que a nuvem de goticulas se afasta do bico de pulverização, esta arrasta ar a partir da sua vizinhança e desacelera, ao mesmo tempo que o propulsor se evapora através de evaporação e as goticulas arrastadas eventualmente atingem o seu diâmetro residual.

Neste ponto, as partículas/gotículas consistem de um núcleo de fármaco em pó revestido com surfactante. Dependendo da concentração e do tamanho do material suspenso o núcleo de fármaco em pó consiste quer de partículas de fármaco individuais quer de agregados. Actualmente, a tecnologia de inalador de dose calibrada está optimizada para entregar massas de 80 a 100 microgramas de fármaco, com uma limitação superior de 1 mg de fármaco entregável.

Uma via alternativa de entrega de pó seco é através de inaladores de pó seco. Existem duas concepções principais de inaladores de pó seco, concepções de dispositivo de dose calibrada nos quais um reservatório de fármaco está colocado dentro do dispositivo e o paciente "carrega" uma dose do dispositivo para o interior da câmara de inalação, e dispositivos calibrados de fábrica nos quais cada dose individual foi fabricada num recipiente separado. Ambos os sistemas dependem da formulação de fármaco em pequenas partículas de diâmetros medianos em massa de 1 a 5 mícron, e usualmente envolvem co-formulação com partículas de excipiente grandes (tipicamente partículas de lactose de 100 mícron de diâmetro). O pó de fármaco é fornecido dentro da câmara de inalação (quer pelo dispositivo de calibração quer por ruptura de uma dose calibrada de fábrica) e o fluxo inspiratório do paciente acelera o pó para fora do dispositivo e para o interior da cavidade oral. Características de fluxo não laminar do percurso de pó fazem com que o agregado de excipiente-fármaco se decomponha, e a 90 ΕΡ 1 641 436/ΡΤ massa das grandes partículas de excipiente causam o seu impacto na parte de trás da garganta, enquanto as partículas de fármaco mais pequenas são depositadas profundamente nos pulmões. A tecnologia actual para inaladores de pó seco é tal que os limites de carga útil são à volta de 50 mg de pó (dos quais o fármaco é usualmente um componente parcial em massa). Excipientes habitualmente utilizados incluem lactose, no entanto no presente caso faz-se reagir aztreonam com aminoácido lisina e esta reacção conduz a uma melhor formação de pó e a uma formulação de pó mais estável. Níveis de dosagem eficazes de antibiótico de lisinato de aztreonam para inalação de pó seco e inalação de dose calibrada resultam na entrega de pelo menos cerca de 25 mg, e mais preferivelmente cerca de 50 a cerca de 100 mg de lisinato de aztreonam ao pulmão do paciente que recebe tratamento. Dependendo da eficiência do dispositivo de entrega de pó seco, formulações de pó seco adequadas para utilização no invento compreendem de cerca de 1,0 a cerca de 250 mg, preferivelmente de cerca de 10 a cerca de 100 mg de pó num estado cristalino ou amorfo em tamanhos de partícula entre 1 e 5 mícron em diâmetro aerodinâmico mediano em massa necessário para entrega eficaz do antibiótico ao interior do espaço endobrônquico. EXEMPLO 5

Preparação de pó de lisinato de aztreonam

Este exemplo descreve o procedimento utilizado para preparação de pó de lisinato de aztreonam. A uma solução de 10 g (23 mmol) de lisinato de aztreonam em 100 mL de MeOH arrefecida num banho de gelo adicionaram-se gota a gota 23 mL (23 mmol, 1,0 eq) de solução de hidróxido de sódio 1 N. Aqueceu-se a solução resultante até à temperatura ambiente durante um período de 30 min, e depois removeu-se o solvente sob pressão reduzida. Adicionou-se dietiléter (50 mL) e concentrou-se a suspensão. Repetiu-se este passo quatro vezes para proporcionar um rendimento de 10,1 g (96%) de sal de lisinato de aztreonam como um pó seco. 91 ΕΡ 1 641 436/ΡΤ EXEMPLO 6

Formulação e secagem por pulverização de lisinato de aztreonam

Suspendeu-se aztreonam (a-aztreonam, 29,4 g com 15% de humidade, equivalente a 25,0 g anidros) e agitou-se rapidamente em água (190 mL) e arrefeceu-se com um banho de gelo moido. L-lisina (anidra, 17,7 g, dissolvida em 40 mL de água à temperatura ambiente) foi titulada durante 6 minutos para a suspensão branca leitosa para obter um pH de 4,34. 0 volume total da solução de lisinato de aztreonam era aproximadamente 270 mL e tinha uma cor amarela a castanho-claro. Adicionou-se aproximadamente 1 g de carvão activado à solução com agitação e depois filtrou-se. A solução de lisinato de aztreonam foi mantida a 2 a 10°C. A secagem por pulverização foi realizada obtendo-se um rendimento de 22,2 g (56%) de lisinato de aztreonam. Ilustra-se abaixo um método não optimizado para secagem por pulverização:

Regulação à entrada 135°C.

Aspirador 90% (um valor de 100% = 35 metros cúbicos/h).

Bomba 34% (um valor de 100% = 1500 mL/h).

Caudal de ar no bico 400 L/h inicial; a meio do ensaio foi aumentado para 600 L/h.

Temperatura do balão receptor 35 a 40°C. EXEMPLO DE REFERÊNCIA 7

Nebulizadores de ensaio

Este exemplo descreve o ensaio de nebulizadores em condições clinicas para determinar a dose a ser utilizada em cada caso. É conduzido um estudo clinico de modo a determinar a concentração de lisinato de aztreonam na formulação de aerossol requerida para conseguir uma concentração no esputo entre 500 pg/g e 2000 pg/g de esputo aos 10 min após a conclusão da administração por aerossol utilizando um nebulizador de atomização, ultra-sónico ou de jacto. 92 ΕΡ 1 641 436/ΡΤ

Neste estudo, pacientes de fibrose cística receberam doses crescentes em série de múltiplos de 75 mg de aztreonam (1 mL de uma solução 75 mg/mL em 1/4 NS) a partir de cada um dos nebulizadores. As doses são separadas por pelo menos 2 dias e não mais do que 5 dias. Avaliam-se as concentrações de pico no soro e esputo. EXEMPLO DE REFERÊNCIA 8 Ensaio da actividade inibidora de esputo

Este exemplo descreve condições utilizadas para ensaio da actividade inibidora de lisinato de aztreonam e tobramicina em esputo ou mucina gástrica de porco.

Reagentes A não ser que declarado de outro modo, todos os produtos químicos foram comprados na Sigma Chemical Company (St. Louis, Mo.), e todas as soluções foram preparadas em água desionizada estéril. 0 aztreonam (Azactam®) foi obtido na Elan Biofarmaceuticals. 0 lisinato de aztreonam foi preparado na Corus Farma, Seattle, WA. As soluções de reserva de trabalho de aztreonam e lisinato de aztreonam foram preparadas em água desionizada estéril e utilizadas de imediato.

Meio de cultura

Caldo de Mueller Hinton com ajustamento de catiões (CAMHB) foi comprado na PML e utilizado não só como o meio de crescimento do estudo para P. aeruginosa mas também como o meio de crescimento de ensaio.

Esputo 0 esputo foi obtido a partir de crianças e adultos com CF que não estavam a receber qualquer outro fármaco antimicrobiano durante pelo menos 48 horas antes da colheita da amostra. 0 esputo foi esterilizado por agitação com um agitador magnético sob luz UV durante 4 horas. A esterilidade foi testada por inoculação de 100 pL de esputo em 10 mL de 93 ΕΡ 1 641 436/ΡΤ CAMHB numa linha de meio e incubação de um dia para o outro. Examinou-se a cultura resultante quanto à turvação e plaquearam-se 100 pL em ágar Luria para assegurar a esterilidade. As amostras de esputo foram mantidas congeladas a -20°C até serem utilizadas.

Organismos

Para cada experiência utilizaram-se subculturas frescas de P. aeruginosa estirpe PA27853. A reserva de congelador foi cultivada em placas de ágar Luria (Sigma L-3522) de um dia para o outro a 37°C. Colheu-se uma colónia individual e inoculou-se em 5 mL de CAMHB e cultivou-se durante 16 horas a 37°C com agitação a 250 rpm. Esta cultura de um dia para o outro foi diluída 1:10000 em CAMHB fresco ou em CAMHB fresco suplementado com 10% (p/v) de mucina gástrica porcina (Sigma M-1778), e depois tratada em autoclave, ou com 1% de esputo de CF esterilizado.

Curvas de morte

Cultivou-se P. aeruginosa (densidade inicial ~106 CFU/mL) numa cultura de um dia para o outro e diluiu-se 1:10000 em caldo. Dividiram-se cada uma das diluições em 4 tubos (10 mL por tubo) e adicionou-se antibiótico a cada tubo até uma concentração final de 0, 0,1, 1 e 10 vezes a CIM para a estirpe PA27853 (4 pg/mL para aztreonam, 1,56 pg/mL para tobramicina, determinadas por métodos padrão). Cada tubo foi incubado a 37 °C com agitação a 250 rpm. A cada hora, retiraram-se amostras do tubo, diluíram-se e plaquearam-se em ágar Luria para quantificação. Incubaram-se as placas de um dia para o outro a 37°C e contaram-se as colónias manualmente. 94 ΕΡ 1 641 436/ΡΤ EXEMPLO DE REFERÊNCIA 9

Protocolo de ensaio clínico

Este exemplo descreve um protocolo utilizado para ensaio clinico e para comparar as farmacocinéticas de dosagens crescentes de uma formulação de lisinato de aztreonam administradas pelo nebulizador electrónico PARI a pacientes com fibrose cística. 0 principal propósito deste estudo foi determinar qual dos níveis de dose testados entregues por aerossol pode entregar quantidade suficiente de lisinato de aztreonam para conseguir uma concentração de pico média de lisinato de aztreonam no esputo de 1000 pg/g ou superior medida 10 minutos após a conclusão da nebulização em pacientes com CF. O propósito secundário foi determinar se a concentração de lisinato de aztreonam requerida para conseguir uma concentração média de pico no esputo de 1000 pg/g ou superior é segura e bem tolerada pelo paciente.

Desenho do estudo

Este foi um estudo sem ocultação, multicentro, randomizado, de dose crescente.

Cada braço continha uma dose diferente. Os dois braços entregaram a mesma formulação de lisinato de aztreonam. 1. 1,0 mL de solução de lisinato de aztreonam contendo 75 mg/mL de aztreonam 2. 2,0 mL de solução de lisinato de aztreonam contendo 75 mg/mL de aztreonam 3. 3, 0 mL de solução de lisinato de aztreonam contendo 75 mg/mL de aztreonam

Avaliação de eficácia e segurança

Neste estudo, os parâmetros de eficácia e segurança avaliados foram os seguintes: 95 ΕΡ 1 641 436/ΡΤ A eficácia foi determinada para cada nebulizador medindo a concentração de lisinato de aztreonam em esputo 10 minutos após a conclusão da nebulização. A concentração média de 1000 yg/g de esputo foi considerada adequada.

Os parâmetros de segurança avaliados: 1. Incidência de reacções adversas relacionadas com o tratamento que ocorreram durante a administração do lisinato de aztreonam aerossolizado para os diferentes niveis de dose. 2. Broncospasmo agudo no momento da administração de fármaco. 3. Absorção de lisinato de aztreonam na circulação sistémica.

Cada paciente recebeu por ordem aleatória pelo menos uma administração. Cada administração de aerossol foi separada por um mínimo de 48 h. As amostras de esputo foram colhidas na linha de base, 1, 2, 4 e 6 horas após conclusão da administração de fármaco de aerossol para medir a concentração de lisinato de aztreonam. As amostras de soro foram colhidas na linha de base, 1, 2, 4 e 6 horas após conclusão da administração de aerossol para medir os níveis de lisinato de aztreonam. A irritação das vias e o broncospasmo agudo foram avaliados por medição da espirometria imediatamente antes e 30 min após conclusão da administração de aerossol. Uma diminuição em volume expiratório forçado no l.° segundo (FEVi) >15% no ensaio de espirometria de 30 min é considerada evidência de broncospasmo.

Objectivos adicionais deste estudo foram determinar para qual dose o nebulizador electrónico PARI testado pode aerossolizar sulfato de lisinato de aztreonam suficiente para conseguir uma concentração de pico média no esputo de lisinato de aztreonam de 1000 yg/g ou superior em pelo menos 85% de pacientes com CF, medida 10 minutos após a conclusão da nebulização, para determinar se a concentração de lisinato de aztreonam requerida para conseguir uma concentração de pico média no esputo de 1000 yg/g ou superior é segura e bem tolerada pelo paciente. A segurança é definida como uma ausência de broncospasmo agudo e absorção sistémica mínima. 96 ΕΡ 1 641 436/ΡΤ

Tratamento de pacientes

Todos os pacientes com doença subjacente de fibrose cística (CF), confirmada na entrada pelos critérios de inclusão/exclusão especificados neste protocolo, foram elegíveis para arrolamento no estudo. Investigadores nos centros de CF participantes seleccionaram pacientes que satisfazem todos os critérios de inclusão e um dos critérios de exclusão.

Os pacientes elegíveis foram admitidos no centro de estudo no dia do estudo e receberam terapia de aerossol se preenchessem os critérios de entrada.

Um exame físico é realizado por um médico ou enfermeiro RC apenas antes do tratamento de aerossol inicial.

Utilizaram-se sinais vitais, altura, peso, oximetria, avaliação do estado respiratório corrente e resumo da história médica. Colheram-se amostras de esputo e soro para medir as concentrações de lisinato de aztreonam de linha de base.

Os pacientes estavam sentados na posição vertical e utilizaram clips de nariz durante a administração de aerossol.

Registaram-se a duração de tempo total e o número de inalações requeridas para completar o tratamento de aerossol.

Quaisquer evidências de pieira ou dificuldade respiratória são registadas bem como o número de períodos em repouso requeridos pelo sujeito por causa de dispneia ou tosse excessiva durante o período de administração.

Imediatamente após conclusão da terapia de aerossol, o sujeito foi lavado com 30 mL de solução salina normal através da montagem, gargarejou durante 5-10 segundos e expectorou a lavagem. Repetiu-se isto num total de três lavagens. 97 ΕΡ 1 641 436/ΡΤ

Colheram—se amostras de esputo 10 minutos após lavagem da cavidade oral e 2 horas após conclusão da administração de fármaco de aerossol.

Colheu-se soro às 1 e 2 horas após conclusão da administração de fármaco de aerossol para determinação dos níveis de lisinato de aztreonam. A espirometria foi obtida 30 minutos após conclusão da administração do fármaco de aerossol.

Após o último tratamento de aerossol do estudo, pacientes foram sujeitos a um breve exame físico após se ter medido a pós-espirometria. EXEMPLO DE REFERÊNCIA 10

Ensaios clínicos de segurança

Este exemplo descreve o protocolo clínico utilizado para ensaios clínicos de segurança com lisinato de aztreonam.

Nome do produto acabado: Aztreonam para inalação

Nome do ingrediente activo: Lisinato de aztreonam

Este foi um ensaio randomizado, de dupla ocultação, controlado por placebo, para avaliar a segurança e a tolerabilidade de lisinato de aztreonam inalado em voluntários masculinos e femininos saudáveis. O objectivo primário era determinar a segurança e tolerabilidade de 3 doses crescentes de aztreonam para inalação em voluntários masculinos e femininos.

Metodologia

Os sujeitos foram rastreados para inclusão no ensaio até 21 dias antes da dosagem e a sua elegibilidade foi confirmada na visita do dia 1. Os sujeitos foram admitidos na clínica na manhã do dia antes da dosagem (Dia -1). Dentro de cada um dos 3 grupos de tratamento que receberam 95 mg, 190 mg e 285 mg de aztreonam inalado, os sujeitos foram alocados 98 ΕΡ 1 641 436/ΡΤ aleatoriamente quer a tratamento activo (6 sujeitos) quer a placebo (2 sujeitos). A progressão para as doses de 190 mg e 285 mg ocorreu apenas quando os dados de segurança com ocultação a partir dos grupos de 95 mg e 190 mg, respectivamente, tinham sido avaliados. Na manhã do dia 1, os sujeitos auto-administraram a sua medicação de ensaio alocada por inalação utilizando um nebulizador eFlow™IMP (PARI). Os sujeitos permaneceram na clinica durante 24 h após dosagem e retornaram 3 dias após a dosagem para uma visita de seguimento. A segurança foi monitorizada ao longo do ensaio. Número de sujeitos

Foram recrutados 24 sujeitos (3 grupos de 8 sujeitos) e 24 foram incluídos na análise de segurança.

Diagnóstico e principais critérios para inclusão

Os sujeitos eram homens ou mulheres não fumadores, com idades entre os 18 e os 55, pesando entre 50 e 100 kg com um índice de massa corporal de 18 a 28 kg.rrf2, com um resultado negativo no teste de Coombs e um volume expiratório forçado no l.° segundo (FEVi) de pelo menos 80% do normal previsto.

Produto de teste, dose e modo de administração

Placebo (1, 2 ou 3 mL de solução salina a 0,9% estéril; fabricado pela Phoenix Pharma) foi auto-administrado pelo sujeito ao interior das vias aéreas utilizando um nebulizador eFlow™IMP (PARI).

Segurança

Eventos adversos, dados de laboratório (hematologia, química clínica, teste de Coombs, coagulação e teste de gravidez para mulheres com potencial de gravidez), urinálise, sinais vitais, ECG, exame físico (incluindo auscultação torácica) e testes de função pulmonar. 99 ΕΡ 1 641 436/ΡΤ

Resultados de segurança Não foram registados quaisquer eventos adversos graves durante o ensaio e nenhum sujeito foi retirado do ensaio por causa de um evento adverso. EXEMPLO DE REFERENCIA 11 Estudo de segurança no cão Beagle

Este exemplo descreve as condições utilizadas para estudos de segurança em cães Beagle.

Dezasseis cães Beagle machos e fêmeas foram alocados a 4 grupos de dose e testados como se segue:

Grupo de dose / tratamento Níveis de dose alvo (mg.kg”1. dia”1) Números de animais /alocação Total Pulmonar Machos Fêmeas 1 - Controlo de veículo 0 0 Estudo principal 1-3 17-19 Recuperação 4-5 20-21 2 - Dose baixa 40 8 Estudo principal 6-8 22-24 3 - Dose intermédia 80 16 Estudo principal 9-11 25-27 4 - Dose elevada 200 40 Estudo principal 12-14 28-30 Recuperação 15-16 31-32

Durante as fases pré-ensaio e de recuperação do estudo os animais foram monitorizados pelo menos uma vez ao dia para identificar quaisquer sinais clínicos adversos. Durante o período de tratamento, todos os animais foram examinados para identificar quaisquer sinais clínicos adversos antes da exposição, continuamente durante a exposição e 1-2 horas após a exposição. Os pesos corporais foram registados semanalmente 100 ΕΡ 1 641 436/ΡΤ enquanto ο consumo de alimentos foi monitorizado diariamente até ao final do período de estudo.

Realizaram-se exames oftalmoscópicos uma vez pré-ensaio, durante a semana 4 de tratamento e mais para o final do período de recuperação de 14 dias para animais designados. Registaram-se os electrocardiogramas uma vez pré-ensaio, aos Dias 2 e 28 de tratamento e para os animais de recuperação designados mais para o final do período de recuperação de 14 dias.

Obtiveram-se amostras de sangue e urina para investigações de hematologia de rotina, química clínica e urinálise a partir de todos os animais uma vez pré-ensaio, durante a semana 4 de tratamento, e para animais de recuperação designados mais para o final do período de recuperação de 14 dias. Colheram-se amostras de sangue para análise toxico-cinética a partir de todos os animais a partir dos Grupos 2, 3 e 4 aos Dias 1 e 27 de exposição nos instantes de tempo pretendidos seguintes: pré-dose, imediatamente pós-dose (IPD) e às 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 6, 8 e 24 h pós-dose. Colheram-se amostras a partir dos animais do Grupo 1 pré-dose e imediatamente pós-dose. Foram colhidas amostras de urina para análise toxico-cinética a partir de todos os animais aos Dias 1 e 27 de exposição durante um período de 24 h.

Na conclusão do período de tratamento de 28/29 dias ou do período de recuperação de 14 dias, todos os animais foram sujeitos a uma necropsia detalhada com registo de peso dos órgãos. Foi realizada avaliação microscópica de uma lista exaustiva de tecidos.

As doses conseguidas médias estimadas globais de 0, 53,0, 94,3 e 194,7 mg. kg-1. dia-1 (doses pulmonares médias estimadas de 0, 10,6, 18,9 e 38,9 mg. kg-1. dia^1) foram conseguidas para os Grupos 1, 2, 3 e 4, respectivamente. As medições de distribuição do tamanho de partículas mostraram que o aerossol de aztreonam era respirável para cães. O tratamento aqui descrito era um método seguro para qualquer sinal de reacção adversa. 101 ΕΡ 1 641 436/ΡΤ EXEMPLO 12

Preparação de sal de lisinato de a-aztreonam

Este exemplo descreve o procedimento utilizado para preparação de sal de lisinato de a-aztreonam.

Suspendeu-se a-aztreonam (29,4 g com 15% de humidade, equivalente a 25,0 g anidros) e agitou-se rapidamente em água (190 mL) e arrefeceu-se com um banho de gelo moído. L-lisina (anidra, 17, 7 g, dissolvida em 40 mL de água à temperatura ambiente) foi titulada durante 6 minutos para a suspensão branca leitosa para obter um pH de 4,34. O volume total da solução de lisinato de aztreonam era aproximadamente 270 mL e tinha uma cor amarelada sem qualquer matéria particulada. Adicionou-se aproximadamente 1 g de carvão activado à solução com agitação e depois filtrou-se. A solução de lisinato de a-aztreonam foi armazenada a uma temperatura de 2°C. EXEMPLO 13

Secagem por pulverização de lisinato de a-aztreonam

Este exemplo descreve condições utilizadas para secagem por pulverização de lisinato de a-aztreonam. A secagem por pulverização de lisinato de a-aztreonam foi realizada por pulverização de uma névoa fina de solução de lisinato de α-aztreonam sobre um suporte e secagem sob vácuo. Recolhem-se as partículas secas obtendo-se um rendimento de 22,2 g (56%) de lisinato de aztreonam.

Um método optimizado para secagem por pulverização:

Regulação à entrada 135°C.

Aspirador 90% (um valor de 100% = 35 metros cúbicos/h).

Bomba 34% (um valor de 100% = 1500 mL/h).

Caudal de ar no bico 400 L/h inicial; a meio do ensaio foi aumentado para 600 L/h.

Temperatura do balão receptor 35 a 40°C.

Lisboa, 2013-10-31

Claims (12)

1. ΕΡ 1 641 436/ΡΤ 1/2 REIVINDICAÇÕES 1. Processo para preparação de uma formulação inalável de pó seco de lisinato de aztreonam consistindo de lisinato de aztreonam, o processo compreendendo os passos de: a) solubilização da forma alfa de aztreonam em água para formar uma lama; b) adição de uma solução aquosa de lisina para formar lisinato de aztreonam em solução; e c) secagem do lisinato de aztreonam a partir da solução por liofilização ou secagem por pulverização; e onde o lisinato de aztreonam é moído, precipitado, seco por pulverização ou de outro modo processado até um tamanho de partícula entre 1 e 5 mícron.
2. 2. Processo da reivindicação 1 onde a moagem é realizada por moagem de meios até um pó possuindo um diâmetro aerodinâmico mediano em massa de 1 a 5 mícron.
3. 3. Processo da reivindicação 1 onde a moagem é realizada por moagem de jacto até um pó possuindo um diâmetro aerodinâmico mediano em massa de 1 a 5 mícron.
4. 4. Processo da reivindicação 1 onde a secagem do lisinato de aztreonam é realizada por secagem por pulverização.
5. 5. Processo da reivindicação 1 onde o tamanho de partícula é conseguido por técnicas de precipitação de partículas até um pó possuindo um diâmetro aerodinâmico mediano em massa de 1 a 5 mícron.
6. 6. Processo da reivindicação 1 onde a secagem do lisinato de aztreonam é realizada por liofilização.
7. 7. Processo da reivindicação 1 onde a composição de aztreonam solubilizado é mantida a um pH inferior a 6. realizado a uma
8. 8. Processo da reivindicação 1 temperatura de 2 a 20°C. ΕΡ 1 641 436/ΡΤ 2/2
9. 9. Processo da reivindicação 8 realizado a uma temperatura de 2 a 8°C.
10. 10. Processo da reivindicação 7 onde a composição de aztreonam solubilizado é mantida a um pH entre 4,6 e 4,8.
11. 11. Processo de qualquer das reivindicações 1 a 10 no qual um reservatório da formulação de pó seco de lisinato de aztreonam é colocado num dispositivo adequado para entregar o pó seco directamente aos pulmões.
12. 12. Processo de qualquer das reivindicações 1 a 11 no qual uma dose individual da formulação inalável de pó seco de lisinato de aztreonam é fabricada num recipiente. Lisboa, 2013-10-31