PT1599205E

PT1599205E - Inibidor de pten ou agente de abertura de canais maxi-k

Info

Publication number: PT1599205E
Application number: PT04713984T
Authority: PT
Inventors: Ki Whan Hong
Original assignee: Otsuka Pharma Co Ltd
Priority date: 2003-02-25
Filing date: 2004-02-24
Publication date: 2007-01-31
Also published as: ATE345800T1; HK1091409A1; DK1599205T3; JP5566482B2; CA2515590A1; WO2004075897A1; JP2010285456A; US8329731B2; US7825130B2; DE602004003348T2; HK1148225A1; AU2004216340B2; JP2006518732A; US20060154963A1; DE602004003348D1; US20130065921A1; JP5208172B2; CA2515590C; AU2004216340B9; CN1780623B

Description

DESCRIÇÃO

"INIBIDOR DE PTEN OU AGENTE DE ABERTURA DE CANAIS MAXI-K" CAMPO TÉCNICO A presente invenção refere-se a um novo inibidor de PTEN ou a um novo agente de abertura de canais Maxi-K. Mais em particular, refere-se a um inibidor de PTEN ou a um novo agente de abertura de canais Maxi-K que compreende, como ingrediente activo, um composto de tetrazolilalcoxidi-hidrocarbostirilo de fórmula (I):

N~N

em que R é um grupo cicloalquilo, A é um grupo alquileno inferior e a ligação entre as posições 3 e 4 do núcleo de carbostirilo significa uma ligação simples ou uma ligação dupla, ou um seu sal.

ANTECEDENTES DA TÉCNICA 0 PTEN (homólogo de Fosfatase e Tensina eliminado no cromossoma Dez) foi isolado como um gene supressor de tumor em 1997 e, desde ai, as suas funções fisiológicas têm sido analisadas de vários pontos de vista. Foi referido em 1998 que o produto do gene PTEN exibe uma nova actividade de fosfatase, i. e. é capaz de desfosforilar um substrato 3,4,5-trifosfato de fosfatidilinositol (PIP3) que é um segundo mensageiro lipídico, na sua posição D3 (cf. Beitner-Johnson D, Millhorn DE, J. Biol. Chem., 273:pp. 13375-13378, 1998). 1

Tendo em conta as funções de PTEN, é esperado que a inibição de PTEN seja eficaz para a promoção da sobrevivência de células normais, células cerebrais, células do coração e pele e também eficaz para inibir a sepsia por Gram negativos e a migração celular e invasão celular.

Além disso, é conhecido que a abertura de canais de

potássio induz o fluxo do ião potássio intracelular para fora das células, o que resulta num potencial intracelular negativo e que o canal de potássio é dependente da voltagem e é controlado pela concentração intracelular de cálcio e ATP intracelular. Os canais Maxi-K são uma classe de canais de potássio sensíveis a cálcio de condutância elevada e a actividade dos canais Maxi-K é controlada pela concentração intracelular de cálcio e potencial de membrana, etc. Os canais Maxi-K estão amplamente distribuídos no organismo vivo, tal como nos neurónios, células do coração, células de músculo liso e a abertura de canais Maxi-K induz a hiperpolarização das células. Também é conhecido que a abertura dos canais Maxi-K é útil para o tratamento de distúrbios neuronais, por exemplo, como um medicamento tal como (1) um anticonvulsivo, (2) um medicamento para neuroprotecção, para tratamento de edema cerebral regional e deficiência motora neurológica, distúrbios cognitivos, dano cerebral traumático, doença de Parkinson, epilepsia, enxaqueca e doença de Alzheimer, (3) um medicamento para o controlo de uma dor, (4) um medicamento para tratar incontinência urinária de urgência, hipermotilidade intestinal, contractilidade uterina, ansiedade e depressão.

DIVULGAÇÃO DA INVENÇÃO

Durante os estudos sobre PTEN, o presente requerente verificou que os compostos de tetrazolilalcoxidi-hidrocarbostirilo de fórmula (I) ou um seu sal como referido acima, em particular 6- [4-(l-ciclo-hexil-lH-tetrazol-5-il) butc3 2 xi]-3,4-di-hidrocarbostirilo ou um seu sal que são conhecidos por ter actividade inibidora da agregação de plaquetas e actividade vasodilatadora, exibem uma actividade de inibição de PTEN e, assim, são úteis como inibidores de PTEN, tendo-se deste modo realizado a presente invenção.

Adicionalmente, durante os estudos sobre a análise funcional de canais Maxi-K, a presente requerente verificou que os compostos de tetrazolilalcoxidi-hidrocarbostirilo de fórmula (I) ou um seu sal como referido acima, em particular 6- [4 - (l-ciclo-hexil-lH-tetrazol-5-il)butoxi]-3,4-di-hidrocar-bostirilo ou um seu sal que são conhecidos por ter actividade inibidora da agregação de plaquetas e actividade vasodilatadora, exibem uma actividade de abertura de canais Maxi-K e, assim, são úteis como agentes de abertura de canais Maxi-K, tendo-se deste modo realizado a presente invenção.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Fig. 1 mostra uma supressão do nivel aumentado de fosforilação de PTEN estimulado por TNF-a (50 ng/mL) por cilostazol (marca registada de 6- [4-(1-ciclo-hexil-lH--tetrazol-5-il)butoxi]-3,4-di-hidrocarbostirilo). A Fig. 2 mostra os efeitos de fármacos na abertura de corrente de K+ activada por cálcio em células SK-N-SH e a Fig. 2A mostra os efeitos do cilostazol (marca registada de 6- [4 - (l-ciclo-hexil-lH-tetrazol-5-il)butoxi]-3,4-di-hidrocar-bostirilo), a Fig. 2B mostra os efeitos do cilostazol e/ou glibenclamida (abreviada para "GBC" que está disponível comercialmente como antidiabético, sugerindo ausência de abertura de canais de K+ sensíveis a ATP) e a Fig. 2C mostra os efeitos do cilostazol e/ou iberiotoxina (abreviada para "Ibtx" que é conhecida como bloqueador de canais Maxi-K+, sugerindo abertura de canais Maxi-K+) . 3 A Fig. 3 mostra a concentração de amilóide-beta total (níveis de A-beta 40 e A-Beta 42) em cérebros de murganho, nos grupos de controlo e tratados com cilostazol que foram detectados por ELISA. A Fig. 4 mostra um resumo de resultados experimentais obtidos a partir do modelo do comportamento no labirinto Y para testar os efeitos do composto da presente invenção na doença de Alzheimer.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona um novo inibidor de PTEN ou um novo agente de abertura de canais Maxi-K que compreende, como ingrediente activo, um composto de tetrazolilalcoxi-carbostirilo de fórmula (I) ou um seu sal. A presente invenção proporciona também um método para inibir PTEN e um método para abrir canais Maxi-K que compreende administrar o composto de tetrazolilalcoxicarbostirilo (I) ou um seu sal a um doente necessitado destes tratamentos e proporciona, também, uma utilização do composto de tetrazolilalcoxi-carbostirilo (I), ou um seu sal para a inibição de PTEN, bem como para a abertura de canais Maxi-K. O composto de fórmula (I) ou um seu sal tem um efeito inibidor de PTEN excelente e, assim, o inibidor de PTEN da presente invenção, compreendendo como ingrediente activo o composto de fórmula (I) ou um seu sal, é útil como um medicamento para a promoção da sobrevivência de células normais, células de cerebrais, células do coração e pele e também para inibir a sepsia por Gram negativos e a migração celular e invasão celular, sem quaisquer efeitos secundários devido à inibição de PTEN.

Além disso, o composto de fórmula (I) ou um seu sal, tem um efeito excelente de abertura de um canal de K+ activado por cálcio de condutância elevada (canais Maxi-K) e, assim, o 4 agente de abertura do canal Maxi-K da presente invenção, compreendendo como ingrediente activo o composto de fórmula (I) ou um seu sal, é útil como um medicamento para o tratamento de distúrbios neuronais, por exemplo, um anticonvulsivo, um agente neuroprotector, um medicamento para o tratamento de edema cerebral regional e deficiência motora neurológica, distúrbios cognitivos, dano cerebral traumático, doença de Parkinson, epilepsia, enxaqueca e doença de Alzheimer, dor, incontinência urinária de urgência, hipermotilidade intestinal, contractilidade uterina, ansiedade e depressão.

Os compostos de tetrazolilalcoxidi-hidrocarbostirilo de fórmula (I) e processos para a sua preparação estão descritos na patente JP-63-20235.

Na fórmula (I), o "grupo cicloalquilo" inclui grupos cicloalquilo C3-8, tais como ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclo-hexilo, ciclo-heptilo, ciclooctilo, etc., mas de um modo preferido é ciclo-hexilo. 0 "grupo alquileno inferior" inclui grupos alquileno C1-6, tais como metileno, etileno, propileno, butileno, etc., mas de um modo preferido é butileno.

Um composto particularmente preferido é o 6-[4-(1-ciclo-hexil-lH-tetrazol-5-il)butoxi]-3,4-di-hidrocarbostirilo, que foi comercializado como um vasodilatador com a marca registada cilostazol. 0 composto de fórmula (I) da presente invenção pode ser utilizado em volume ou, de um modo preferido, na forma de uma preparação farmacêutica com um veiculo ou diluente farmacêutico convencional. A forma de dosagem não se limita a uma forma especifica, mas pode ser em qualquer forma de dosagem convencional, por exemplo, preparações para administração oral, tais como comprimidos, cápsulas, grânulos, várias preparações liquidas adequadas para administração oral, ou preparações para administração parentérica, tais como 5 injecções, supositórios. A dosagem não é limitada a uma gama especifica, mas situa-se normalmente na gama de 100 a 400 mg por dia no adulto (50 kg de peso corporal) que é administrada uma vez ou dividida numa ou várias vezes. 0 composto activo está, de um modo preferido, contido na preparação numa quantidade de 50 a 100 mg por unidade de dosagem. A preparação para injecção é normalmente preparada na forma de uma preparação liquida, uma emulsão ou uma suspensão, que são esterilizadas e são ainda, de um modo preferido, tornadas isotónicas em relação ao sangue. As preparações na forma de um liquido, emulsão ou suspensão são normalmente preparadas utilizando diluentes farmacêuticos convencionais, por exemplo água, álcool etilico, propilenoglicol, álcool isoestearilico etoxilado, álcool isoestearilico polioxilado, ésteres de ácido gordo de polioxietileno sorbitano. Pode-se também incorporar nestas preparações um agente isotónico, tais como cloreto de sódio, glucose, glicerina, numa quantidade suficiente para as tornar isotónicas e podem ser incorporados solubilizantes, tampões, agentes anestesiantes convencionais e opcionalmente corantes, conservantes, materiais com fragrâncias, sabores, agentes adoçantes e outros medicamentos.

As preparações, tais como comprimidos, cápsulas, líquidos para administração oral, podem ser preparadas por um método convencional. Os comprimidos podem ser preparados em mistura com veículos farmacêuticos convencionais, tais como gelatina, amidos, lactose, estearato de magnésio, talco, goma-arábica e semelhantes. As cápsulas podem ser preparadas misturando com agentes de enchimento ou diluentes farmacêuticos inertes e inserindo numa cápsula de gelatina dura ou mole. As preparações líquidas orais, tais como xaropes ou elixires, são preparadas misturando o composto activo e agentes adoçantes (e.g. sacarose), conservantes (e. g., metilparabeno, propilparabeno), corantes, sabores e semelhantes. As preparações para administração parentérica também podem ser 6 preparadas por um método convencional, por exemplo, dissolvendo o composto (I) da presente invenção num veiculo aquoso esterilizado, de um modo preferido água ou uma solução salina. A preparação liquida preferida adequada para administração parentérica é preparada dissolvendo cerca de 50-100 mg do composto activo (I) em água e num solvente orgânico e, também, num polietilenoglicol com um peso molecular de 300 a 5000 que é, de um modo preferido, incorporado com um lubrificante, tais como carboxi- metilcelulose sódica, metilcelulose, polivinilpirrolidona e álcool polivinílico. Pode-se também incorporar nas preparações líquidas acima, de um modo preferido, um desinfectante (e. g. álcool benzílico, fenol, timerosal), um fungicida e, também opcionalmente, um agente isotónico (e. g. sacarose, cloreto de sódio), um anestésico tópico, um estabilizador, um tampão e semelhantes. Tendo em vista a manutenção de estabilidade, a preparação para administração parentérica pode ser inserida numa cápsula, seguido de remoção do meio aquoso por uma técnica de liofilização convencional e é recuperada numa preparação líquida dissolvendo num meio aquoso, quando utilizada.

MELHOR MODO DE REALIZAR A INVENÇÃO A presente invenção é ilustrada pelos exemplos de preparação e experiências seguintes sobre os efeitos supressores dos compostos no aumento da fosforilação de PTEN que é estimulada por TNF-oí, ou na abertura do canal Maxi-K+, mas não deverão ser entendidos como limitativos da mesma. 7

Preparação 1

Preparação da preparação para injecção:

Componentes Quantidade 6-[4-(1-Ciclo-hexil-l,2,3,4-tetrazol-5-il)butoxi]-3,4-di-hidrocarbostirilo 5 g

Polietilenoglicol (peso molecular: 4000) 0,3 g

Cloreto de sódio 0,9 g

Monooleato de polioxietileno sorbitano 0,4 g

Metabissulfito de sódio 0,1 g

Metilparabeno 0,18 g

Propilparabeno 0,02 g

Água destilada para injecção 10,0 mL

Os parabenos, metabissulfito de sódio e cloreto de sódio acima são dissolvidos em metade da quantidade da água destilada acima, com agitação a 80 °C. A mistura é arrefecida a 40 °C e dissolve-se nesta o composto activo e também polietilenoglicol e monooleato de polioxietileno sorbitano. A restante água destilada para injecção é adicionada à mistura, esterilizada por filtração com um papel de filtro, para se obter a preparação para injecção desejada.

Preparação 2

Preparação de comprimidos:

Componentes Quantidade 6- [4 - (1-Ciclo-hexil-l,2,3,4-tetrazol-5-il)butoxi]-3,4-di-hidrocarbostirilo 100 g

Lactose (Farmacopeia Japonesa) 40 g

Amido de milho (Farmacopeia Japonesa) 40 g

Celulose cristalina (Farmacopeia Japonesa) 20 g

Hidroxipropilcelulose (Farmacopeia Japonesa) 4 g

Estearato de magnésio (Farmacopeia Japonesa) 2 g 0 composto da presente invenção, lactose, amido de milho e celulose cristalina acima são bem misturados e a mistura é granulada com uma solução aquosa de hidroxipropilcelulose a 5% e a mistura granulada é crivada com um crivo de malha 200 para secar os grânulos cuidadosamente e em seguida os grânulos são moldados em comprimidos, por um método convencional de obtenção de comprimidos (1000 comprimidos).

Experiências farmacológicas

Testaram-se os efeitos para supressão do aumento do nivel de fosforilação de PTEN estimulado por TNF-α pelo composto representativo da presente invenção: cilostazol.

Adicionalmente, testaram-se os efeitos na abertura de canais Maxi-K do composto representativo da presente invenção: cilostazol e alguns agentes de abertura ou bloqueio de canais Maxi-K disponíveis comercialmente.

Experiência 1

Efeitos do cilostazol na supressão do aumento no nivel de fosforilação de PTEN estimulado por TNF-a:

Materiais:

Culturas de células: cultivaram-se células SK-N-SH (KCLB 30011, neuroblastoma de cérebro humano) em meio minimo essencial de Eagle (MEM) com L-glutamina 2 mM e piruvato de sódio 1,0 mM suplementado com soro fetal de bovino inactivado pelo calor a 10%. As células foram crescidas até à confluência a 37 °C em CO2 a 5% e utilizadas para experiências, a não mais da passagem 20.

Preparação da solução de TNF-α: dissolveu-se TNF-a (Upstate Biotechnology, Inc., Lake Placid, Nova Iorque) na solução salina tamponada com fosfato, como uma solução mãe a 10 yg/mL. 9 Método:

Análise de transferência de Western: As células confluentes receberam meio MEM com FBS a 1% mais cilostazol, 3 horas antes da estimulação com TNF-α e, em seguida, foram expostas a TNF-α, durante uma hora.

As células foram lisadas em tampão de lise contendo Tris-C1 a 50 mM (pH 8,0), NaCl a 150 mM, azida de sódio a 0,02%, fluoreto de fenilmetilsulfonilo a 100 pg/mL, aprotinina a 1 pg/mL e Triton X-100 a 1%. Após centrifugação a 12.000 rpm, carregaram-se 50 pg da proteína total num gel de SDS-PAGE a 8 ou 10% e transferiu-se para uma membrana de nitrocelulose (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). As membranas bloqueadas foram em seguida incubadas com o anticorpo indicado e as bandas imunorreactivas foram visualizadas utilizando reagente quimioluminescente de acordo com o recomendado pelo Supersignal West Dura Extended Duration Substrate Kit (Pierce, Rockford, IL) . Os sinais das bandas foram quantificados utilizando um densitómetro de imagem calibrado, GS-710 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Os resultados foram expressos como uma densidade relativa. Os anticorpos policlonais contra PTEN, fosfo-PTEN (Ser 380/Thr382/383) eram da Cell Signaling Technology (Beverly, MA).

Análise estatística: Os resultados são expressos como média + EPM. As diferenças estatísticas entre os grupos foram determinadas pelo teste t de Student. p<0,05 foi considerado como significativo.

Resultados: A transferência de Western e análise densitométrica são apresentadas na Fig. 1 anexa.

Como se pode ver na Fig. 1, o cilostazol (1, 10 e 100 pM) suprimiu de um modo dependente da concentração o nível de fosforilação de PTEN aumentado, estimulado por TNF-a (50 ng/mL). 10 A partir dos resultados experimentais acima, é óbvio que o cilostazol apresentava uma actividade potente de inibição da fosforilação de PTEN.

Experiência 2

Materiais:

Cultura de células: as células SK-N-SH (KCLB 30011, neuroblastoma cerebral humano) foram cultivadas em meio minimo essencial de Eagle (MEM) com L-glutamina 2 mM e piruvato de sódio 1,0 mM suplementado com soro fetal de bovino inactivado pelo calor a 10%. As células foram crescidas até à confluência a 37 °C em CO2 a 5% e utilizadas para experiências, a não mais da passagem 20. Fármacos de teste: (1) Cilostazol (um composto da presente invenção, uma marca registada de 6-[4-(l-ciclo-hexil-lH-tetrazol-5-il)- butoxi]-3,4-di-hidrocarbostirilo). (2) Glibenclamida (abreviado para "GBC", nome geral:

Gliburide, nome quimico: 5-cloro-N-[2-[4-[[[(ciclo-hexil- amino)carbonil]amino]sulfonil]fenil]etil]-2-metoxibenzamida, que está disponível comercialmente como antidiabético, um bloqueador de canais de K+ sensíveis a ATP). (3) Iberiotoxina (abreviada para "Ibtx", que é conhecida como bloqueador de canais Maxi-K+) . Método:

Registo da corrente de K+ da célula total: As experiências foram realizadas num pequeno banho (0,5 mL) montado na platina de um microscópio invertido (modelo TE300 Nikon, Tóquio, Japão) com perfusão continua a um caudal de 1 mL/min. 11

Utilizando a configuração de célula total da técnica de retalho controlado (patch clamp), as correntes de K+ foram registadas à temperatura ambiente (20-22 °C) com um amplificador de retalho controlado Axopatch-200B (Axon Instruments, Foster City, CA) . As correntes foram amostradas de 1 a 10 kHz após filtração anti-alias de 0,5 a 5 kHz. A aquisição de dados e potenciais de comando foram controlados pelo programa pClamp 6.0.3 (Axon Instruments, Foster City, CA). Para assegurar a qualidade do controlo de voltagem a resistência do eléctrodo foi mantida abaixo de 3 ΜΩ. Os potenciais de junção foram anulados com o eléctrodo na solução de banho padrão. A formação de um selo de gigaohm foi obtida por sucção e, após estabelecimento da configuração de célula total, registaram-se a 50 kHz os transitórios capacitivos produzidos por passos de voltagem regulada, de 10 mV, simétricos, desde -80 mV, para cálculo da capacitância da célula. A solução de banho normal para os registos em célula total era: NaCl a 130 mM, KC1 a 5 mM, MgCl2 a 1,2 mM, CaCl2 a 1,8 mM, HEPES a 10 mM, glucose a 5,2 mM e o pH foi ajustado para 7,4 com NaOH. As pipetas foram cheias com KC1 a 140 mM, MgCl2 a 0,5 mM, CaCl2 a 0,1 mM, ácido etilenobis(oxonitrilo)tetracético (EGTA) a 0,09 mM, HEPES a 10 mM, glucose a 10 mM e o pH foi ajustado para 7,4 com KOH.

Após estabelecimento dos registos em célula total e recolha de registos de controlo durante aproximadamente 5 minutos, até a corrente produzida por despolarização estar estabilizada, aplicou-se cilostazol ao banho. Nas experiências, utilizando glibenclamida ou iberiotoxina, aplicou-se cilostazol ao banho durante cerca de 20 minutos após administração de glibenclamida ou iberiotoxina.

Resultados:

Os resultados de teste são apresentados na Fig. 2 anexa, em que a Fig. 2A mostra os efeitos do cilostazol, a Fig. 2B 12 mostra os efeitos do cilostazol e/ou glibenclamida ("GBC", que sugere abertura de canais Maxi-K+) e a Fig. 2C mostra os efeitos de cilostazol e/ou iberiotoxina ("Ibtx", bloqueador de canais Maxi-K+) .

Como se pode ver pela Fig. 2, a corrente foi significativamente aumentada pelo cilostazol mas, por outro lado, foi bloqueada reversivelmente por adição de iberiotoxina (100 nM) ao banho, mas não de glibenclamida (10 μΜ) . O aumento das correntes de canais Maxi-K com medicamentos ocorreu com cilostazol, mesmo com a coexistência de glibenclamida, enquanto que a glibenclamida isolada não foi capaz de aumentar as correntes mediadas pelo canal Maxi-K. Quando se adicionou cilostazol às células juntamente com iberiotoxina, um bloqueador de canais Maxi-K, o aumento da corrente era bastante inferior ao com iberiotoxina isolada.

Experiência 3 1. Preparação do composto

Veiculo de controlo; carboximetilcelulose a 0,5%. Duas vezes por dia (n=10)

Cilostazol; 100 mg/kg, duas vezes por dia (n=10)

Triturar uma pequena quantidade de pó (cilostazol) num almofariz de ágata. Adicionar duas ou três gotas de carboximetilcelulose (CMC) a 0,5% e triturar bem. Adicionar 4-5 mL de CMC a 0,5% e recuperar o cilostazol suspenso numa garrafa de vidro protegida da luz.

Testar a preparação do composto semanalmente na concentração de 1000 mg/50 mL e armazenar protegida da luz, a 4 °C.

Administração do composto

Antes da administração, sonicar a garrafa mãe do composto de teste num sonicador de ultra-sons e misturar bem. 13

Compostos por sonda esofágica oral duas vezes por dia de acordo com o atribuido a cada grupo.

Controlo de veiculo (carboximetilcelulose a 0,5%: CMC; 1 kg/5 mL) sonda esofágica duas vezes por dia. Composto de teste (cilostazol; 100 mg/kg/5 mL) sonda esofágica duas vezes por dia. 2. Métodos de observação, análises e medições a. Os animais (8 semanas de idade, murganhos transgénicos hemizigóticos gue expressam o mutante humano APPK670N,M67ii/linha Tg2576) foram distribuídos ao acaso em 2 grupos de murganhos APP/PS1 duplo transgénicos (controlo e cilostazol, total = 20 murganhos). Administrou-se a cada murganho duas vezes por dia por sonda esofágica, durante 6 semanas, como se mostra na tabela seguinte:

Concepção do protocolo Tratamento Idade no início Número de murganhos Idade no final Controlo (veículo) 8 semanas 10 14 semanas Composto de teste 8 semanas 10 14 semanas Total de murganhos = 20 b. Determinou-se o genótipo dos murganhos no início e fim do estudo. c. Os murganhos foram submetidos ao modelo do comportamento num labirinto Y antes de completar a fase em vida. d. Os murganhos foram sacrificados às 14 semanas de idade. 14 e. Aquando do sacrifício recolheu-se 1 mL de sangue para medição da concentração de cilostazol no sangue e os murganhos APP/PS1 receberam uma perfusão de solução salina. Os cérebros foram seccionados ao meio, sendo um hemisfério fixado e o outro hemisfério congelado. f. 0 hemisfério congelado foi homogeneizado e analisado quanto à concentração de amilóide-beta total, por ELISA.

Os níveis de A-beta 40 total e A-beta 42 total em cérebros de murganho foram detectados no grupo de controlo e no grupo tratado com cilostazol. Os resultados são apresentados na Fig. 3 anexa. 3. Procedimento O procedimento seguinte enumera os passos seguidos para realizar o teste de "alternância espontânea no labirinto Y". Os murganhos têm uma tendência inata para explorar o seu meio ambiente. Uma exploração bem sucedida depende da capacidade para evitar sítios recentemente visitados, nos quais a quantidade de alimento possa estar diminuída ou ausente ("alternância espontânea"). O labirinto Y é um teste baseado em etiologia que não envolve o fornecimento de recompensas. Os murganhos com uma função de "memória de trabalho" comprometida não conseguem reter informação relativa a locais já visitados na sua memória de trabalho; deste modo, eles apresentam uma alternância espontânea diminuída.

Resultados publicados mostraram uma menor alternância espontânea e maior exploração nalgumas estirpes de murganhos transgénicos, por exemplo murganhos APP/PS1. O cilostazol tem uma acção anti-plaquetas e vasodilatadora que tem uma indicação para ASO e prevenção de enfarte cerebral secundário. 15

Estas acções do cilostazol podem contribuir para reduzir a deposição de proteína amilóide-beta e melhoram um comportamento de demência de Alzheimer. i. Levar os murganhos a ser testados para o compartimento de teste. Evitar trazer muitos murganhos (mais do que três gaiolas) para a área de teste de uma vez, dado que isso pode influenciar o seu comportamento. (Opcional, fazer apenas se os animais não estiverem já marcados, e. g. com etiquetas electrónicas ou tatuagens claramente visíveis). Marcar as suas caudas com um marcador colorido não tóxico, pela seguinte ordem: 1: vermelho 2: verde 3: azul 4: preto ii. As experiências podem ser registadas por vídeo. Isto produz um registo permanente e permite que os investigadores revejam as experiências se houver algumas questões. iii. Retirar o primeiro murganho a ser testado da sua gaiola pela base da cauda e pesar. Registar o peso na folha de cálculo de dados do labirinto Y. Colocar o murganho de volta na gaiola. (Alternativamente, os murganhos podem ser pesados antes do início da experiência, e. g., no dia anterior). iv. Deixar o murganho sem o perturbar durante 1 hora antes do início do teste, de modo a que ele se possa aclimatar ao compartimento. Deve ter-se um cuidado adicional para assegurar que as gaiolas não são deixadas adjacentes a um braço particular, uma vez que o cheiro, por exemplo, pode influenciar a entrada de um murganho num único braço. Deste modo, colocar a gaiola, ou a uma distância do dispositivo, ou 16 assegurar que as gaiolas estão distribuídas uniformemente em torno do compartimento (e. g. podem-se introduzir três gaiolas de uma vez ? uma na proximidade de cada braço) . Poderão estar presentes técnicos no compartimento de teste, mas estes não deverão perturbar os murganhos. v. Antes do teste começar, limpar o interior do labirinto Y com isopropanol. vi. Manusear os murganhos com cuidado, segurando pela cauda e deixar repousar num braço, tendo o cuidado de não deixar o murganho mergulhar de cabeça primeiro no labirinto. Os murganhos são colocados individualmente no centro de um labirinto em Y com todos os três braços (braço A, braço B e braço C) disponíveis para exploração, durante um período de 8 minutos. vii. Registar todas as entradas numa impressão da folha de dados do labirinto Y. Seleccionar um "A" no campo ARM ENTERED se o murganho entrar completamente no braço A, etc. Na mesma linha, seleccionar "end" em OBSERVATIONS se o murganho explorar o braço até ao fim, "R" por cada vez que o murganho se ergue (senta-se nas suas patas traseiras com as patas dianteiras livres) ou "L" quando se inclina ("explora subindo a parede" com as patas dianteiras a tocar a parede) e "F" quando pára (permanece imóvel durante 5 segundos ou mais). Se o murganho anda para trás e para a frente dentro do braço A, seleccionar outro "bf" em OBSERVATIONS na mesma linha. Seleccionar quaisquer outras observações em texto completo. Se não houver tempo suficiente para seleccionar as observações, passar à frente. Se o murganho volta ao centro, começar uma nova linha. Seleccionar "A" na nova linha se o murganho retorna ao braço A, "B" para o braço B ou "C" para o braço C. 17 viii. Após 8 minutos, remover os murganhos pela cauda e colocá-los na sua gaiola original. Registar o número de dejectos e se o murganho urinou ou não, na folha de cálculo do labirinto Y. Limpar o interior do labirinto Y com isopropanol. Utilizar uma escova para chegar aos cantos, limpar paredes e chão. Assegurar que o labirinto Y está limpo e livre de qualquer cheiro, material de cama ou alimentos que possam ter sido trazidos para o labirinto por um murganho anterior.

Assegurar que o labirinto Y está seco após limpeza com álcool. Assegurar que não é deixado no labirinto nenhum material de limpeza (tal como um pano). ix. Repetir os passos para todos os murganhos a ser testados. x. Após o teste, transferir os dados da cópia impressa para uma folha de cálculo Excel.

Os resultados obtidos a partir do modelo do comportamento num labirinto Y estão resumidos na Fig. 4 anexa. xi. Análise de dados: Uma alternância é definida como uma

visita a todos os três braços sem reentrada (ABC, ACB, BAC, BCA, CAB ou CBA) . Analisar cada ENTRADA NUM BRAÇO separadamente e determinar se completou uma alternância. A sequência ABCABC tem quatro alternâncias, a primeira termina com C, a próxima com A, em seguida B, em seguida C. A sequência ABCBAC tem apenas três alternâncias, a primeira termina em C, a segunda termina com A e a terceira com C. A % de alternâncias é (número de alternâncias observadas)/(número de alternâncias possíveis). Se n braços são visitados, o número mais elevado de alternâncias possíveis é n-2. Se o animal se move ao acaso, serão de esperar 22% de alternâncias (3*2*l/3*3*3). A actividade global é reflecti- 18 da no número total de visitas aos diferentes braços. A ACTIVIDADE é assim (número total de entradas no braço/minutos de observação).

Deste modo, os compostos de tetrazolilalcoxidi--hidrocarbostirilo (I) ou um seu sal da presente invenção são eficazes para abrir canais Maxi-K e são úteis para o tratamento de distúrbios neuronais, em particular para o tratamento da doença de Alzheimer.

Aplicabilidade industrial A presente invenção proporciona uma composição compreendendo como ingrediente activo um composto de tetrazolilalcoxidi-hidrocarbostirilo (I) ou um seu sal, que tem efeitos inibitórios de PEN excelentes e é útil como um medicamento para a promoção da sobrevivência de células normais, células cerebrais, células do coração e pele e também para inibir a sepsia por Gram negativos e a migração celular e invasão celular, sem qualquer efeito secundário devido à inibição de PTEN. A composição da presente invenção também é útil como um agente para abrir um canal de K+ activado por Ca2+ de condutância elevada (canal Maxi-K) e assim, como um medicamento para o tratamento de distúrbios neuronais, por exemplo, um anticonvulsivo, um agente neuroprotector, um medicamento para o tratamento de edema cerebral regional e insuficiência motora neurológica, distúrbios cognitivos, dano cerebral traumático, doença de Parkinson, epilepsia, enxaqueca e doença de Alzheimer, etc.

Lisboa, 29 de Dezembro de 2006 19

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de um composto de tetrazolilalcoxidi-hidrocarbostirilo de fórmula (I):

O <*) H em que R é um grupo cicloalquilo, A é um grupo alquileno inferior e a ligação entre as posições 3 e 4 do núcleo de carbostirilo significa uma ligação simples ou uma ligação dupla, ou um seu sal, para a preparação de um medicamento para inibir PTEN.
2. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o composto é 6-[4-(l-ciclo-hexil-lH-tetrazol-5-il)butoxi]-3,4-di-hidrocarbostirilo ou um seu sal.
3. Utilização de um composto de tetrazolilalcoxidi- hidrocarbostirilo de fórmula (I): N-N

{*) NH 1 em que R é um é um grupo cicloalquilo, A é um grupo alquileno inferior e a ligação entre as posições 3 e 4 do núcleo de carbostirilo significa uma ligação simples ou uma ligação dupla, ou um seu sal, para a preparação de um medicamento para abrir o canal Maxi-K.
4. Utilização de acordo com a reivindicação 3, em que o composto é 6-[4-(l-ciclo-hexil-lH-tetrazol-5-il)butoxi]--3,4-di-hidrocarbostirilo ou um seu sal.
5. Utilização de acordo com a reivindicação 3 ou 4, que é para a preparação de um medicamento para o tratamento de um distúrbio neuronal.
6. Utilização de acordo com a reivindicação 5, em que o distúrbio neuronal é uma doença de Alzheimer. Lisboa, 29 de Dezembro de 2006 2