PT1534404E - Utilização de um modificador de clatratos para promover a passagem de proteínas durante a nanofiltração - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "UTILIZAÇÃO DE UM MODIFICADOR DE CLATRATOS PARA PROMOVER A PASSAGEM DE PROTEÍNAS DURANTE A NANOFILTRAÇÃO"

Campo da Invenção A invenção refere-se ao campo da purificação de proteínas e à recuperação de material proteico grande através de filtros de exclusão com poros pequenos, de tamanho da ordem dos nanometros, para remoção de contaminantes tais como agentes patogénicos virais. A invenção refere-se à utilização de aditivos para promover a solubilidade de proteínas em soluções a ser filtradas para efeitos de remoção de agentes patogénicos, particularmente agentes patogénicos virais, e tem aplicação particular na purificação de biomoléculas proteicas grandes tais como imunoglobulinas.

Antecedentes da Invenção

Os processos de separação de líquidos e de gases são bem conhecidos na técnica. Os processos de separação mais comuns envolvem uma mudança de fase, que aumenta o custo dos processos e frequentemente requer excessivas mudanças de temperatura que podem alterar o produto. As separações por membranas, contudo, podem conseguir níveis desejados de separação sem uma mudança na fase da substância. Essencialmente, a separação por membranas força selectivamente uma ou mais substâncias através dos poros de um filtro, deixando para trás uma ou mais substâncias 1 maiores. Este processo é frequentemente repetido com tamanhos decrescentes dos poros dos filtros até se obter um nível de separação satisfatório. A utilização da nanofiltração para remover contaminantes tais como partículas virais de produtos proteicos parentéricos baseia-se na aptidão de um filtro com tamanho de poro definido para permitir a passagem de uma proteína solúvel ao mesmo tempo que impede a passagem das partículas virais maiores (DiLeo, A.J. et al.r BioTechnology 1992, 10: 182, 188.) A remoção de vírus de biomoléculas maiores, tais como imunoglobulinas (anticorpos monoclonais ou policlonais) , por exclusão de tamanho, é desfavorecida pela dificuldade de fazer passar as biomoléculas grandes através de tamanhos de poro da ordem dos nanometros, tipicamente 12-15 nm. Enquanto se espera que uma proteína em solução, mesmo uma tão grande quanto uma imunoglobulina, tenha um raio molecular muito mais pequeno do que uma partícula virai, vários factores podem levar a uma redução efectiva do tamanho de poro e do coeficiente de separação. Alguns destes factores devem-se a interacções entre a proteína e a superfície do filtro resultando na acumulação à superfície da membrana, conhecida como camada de gelificação ou de polarização. Outros factores, tais como a auto-associação ou agregação da proteína, fazem com que a proteína fique retida pelo filtro devido à formação de massas excessivamente grandes para passar através dos poros do filtro ou que têm características de superfície que apresentam afinidade para a superfície da membrana ou superfícies dos poros fazendo com que adiram à membrana em vez de passar através dela. O pedido de patente internacional WO 9600237, descreve métodos para nanofiltração com êxito utilizando tamanhos de poro tão pequenas quanto 15 nm para filtrar proteínas purificadas com peso molecular inferior a 150 kDa. O documento WO 9600237 2 divulga a utilização de concentrações de sal situadas na gama desde cerca de 0,2 M até à saturação da solução na filtração de virus de proteínas, polissacáridos e polipéptidos para aumentar coeficientes de separação. A vantagem do sal é explicada pelo requerente como sendo devida ao facto de "a proteína contrair" e passar mais facilmente através do filtro. A utilização de um teor elevado de sal de acordo com este método é também sugerida para permitir a utilização da filtração "dead-end" com membranas com tamanhos de poro de 5-30 nm. A filtração "dead-end" refere-se à prática de utilizar uma única bomba para forçar fluido através da membrana a partir da superfície. A filtração "dead-end" é mais simples e mais rentável do que um processo de filtração tangencial em que uma primeira bomba mantém um caudal constante à superfície da membrana e uma segunda bomba faz passar a proteína através do filtro por criação de uma pressão negativa (sucção) na parte de trás da membrana. A patente U.S. 6096872 reconheceu a utilidade da adição de tensoactivos juntamente com tamponação de alta força iónica durante a nanofiltração para remover vírus de soluções contendo imunoglobulinas de forma a reduzir a dimerização, trimerização e agregação das proteínas, descrições essas que são aqui dadas incorporadas por referência.

Também é genericamente conhecido que para reduzir a interacção de uma substância com a superfície da membrana, o potencial "zeta" ou "z" da superfície da membrana não deve ser electricamente atractor dessa substância e a alteração das propriedades de carga da membrana pode minimizar a precipitação à superfície. Por exemplo, a patente U.S. N° 6177011 descreve que a neutralização das cargas de superfície determinadas como potencial zeta podem reduzir a adsorção à superfície de substâncias conspurcantes da membrana durante processos de filtração por osmose inversa em que a substância tem um grupo 3 carregado. As alterações de pH e concentração de sal são outros meios de alterar o potencial z tanto dos solutos como da superfície da membrana. Em alguns casos, contudo, a manipulação do potencial z pela adição de sal é contraproducente, resultando num aumento da formação de agregados solúveis e num aumento do carácter hidrófobo da superfície da membrana que pode promover interacção com regiões hidrófobas da proteína. Pall, et al. (Colloids and Surfaces 1 (1980), 235-256) descreveram que o fenómeno de remoção de partículas mais pequenas do que os poros de um filtro se deve à aderência das partículas às paredes dos poros em condições em que as partículas e as paredes dos poros estão carregadas com cargas opostas ou alternativamente em que o potencial zeta das partículas e das paredes dos poros da membrana são ambos baixos. Zierdt (Applied and Environmental Microbiology, (1979) 38:1166-1172) atribuiu o fenómeno anteriormente referido a forças electrostáticas. Além disso, estas modificações não resolvem os efeitos da geometria molecular ou agregação de proteínas em solução na filtração por membranas.

Para além as considerações quanto aos componentes do tampão e suas concentrações, tem de se ter cuidado para manter a proteína a ser filtrada numa concentração apropriada para manter um bom fluxo e pressão transmembranar mínima através do filtro. O documento WO 9837086 descreve a adição de tampão ao retentado de forma a manter a pressão transmembranar durante o fluxo tangencial de um passo de pré-tratamento para remover proteínas com um peso molecular maior do que o da(s) proteína (s) do produto. 0 documento WO 9837086 faz ainda notar que a nanofiltração está limitada a proteínas terapêuticas com um peso molecular até 150 kDa. As moléculas de imunoglobulina G são constituídas por dois polipéptidos de cadeia pesada e dois polipéptidos de cadeia leve todos ligados covalentemente e têm um peso molecular médio de cerca de 180 kDa. A patente U.S. 4 6096872 procura resolver o problema de como filtrar vírus de produtos de IgG por inclusão de um excipiente não iónico com tampão de força iónica relativamente alta (fisiológica, que é cerca de 300 mOsm) . A utilização de tampões com força iónica alta, contudo, pode conduzir à agregação da proteína ou criar o problema da remoção de sal da formulação do produto. A patente U.S. 6096872 descreve e reivindica um segundo passo de nanofiltração para concentrar a imunoglobulina e recolhê-la num tampão de força iónica baixa.

Estes métodos sofrem de várias desvantagens, especialmente quanto à sua eficiência. É portanto o objecto da presente invenção superar as desvantagens do estado da técnica, especialmente no desenvolvimento de um sistema para filtração eficiente de vírus patogénicos de produtos de imunoglobulinas, proporcionando assim imunoglobulina pura, limpa de vírus, para inj ecção. A configuração molecular ou tamanho de uma espécie de proteínas foi prevista por alterações no volume específico parcial e auto-associação de proteínas. A alteração do volume específico parcial de proteínas assim modificadas foi demonstrada pelas medições independentes dos coeficientes de sedimentação utilizando centrifugação analítica. O método aqui descrito utiliza a adição de uma substância modificadora de clatratos para modificar a configuração molecular da proteína para minimizar o volume específico e agregação, aumentando assim a passagem da proteína através da membrana num processo de nanofiltração.

Sumário da Invenção O método da invenção maximiza a passagem de proteína 5 durante a filtração por membrana por utilização de aditivos de tampões destinados a aumentar a hidrofobia da superfície da membrana e diminuir o raio hidrodinâmico da proteína bem como reduzir a tendência para auto-agregação da proteína que se deseja filtrar. 0 método da invenção, em primeiro lugar, maximiza a passagem da proteína por diminuição do pH e do sal do tampão que aumenta a hidrofobia da superfície da membrana e diminui o raio hidrodinâmico da proteína. Em segundo lugar, é incluído no tampão um modificador de clatratos, modificador esse que diminui o raio hidrodinâmico da proteína ao mesmo tempo que minimiza as tendências da proteína para se associar consigo própria ou com o filtro de membrana. 0 modificador de clatratos é um açúcar de poliol ou um álcool de açúcar com desde 4 a 8 grupos hidroxilo. Em terceiro lugar, o processo, inclui opcionalmente, a monitorização em linha contínua da filtração de forma a manter os parâmetros acima referidos de pH e modificador de clatratos constantes, ao mesmo tempo que mantém níveis locais baixos de proteína solúvel. A utilização dos métodos da invenção resulta num aumento do coeficiente de separação e na aptidão para manter uma pressão transmembranar reduzida durante a filtração das partículas de vírus. 0 processo é aplicável à purificação de qualquer biomolécula proteica grande, especialmente imunoglobulinas. As imunoglobulinas podem ser uma imunoglobulina monoclonal ou policlonal.

Como referido acima, o modificador de clatratos da presente invenção é um açúcar de poliol ou um álcool de açúcar com desde 4 a 8 grupos hidroxilo. Exemplos de polióis preferidos são açúcares, incluindo monossacáridos e dissacáridos, de modo preferido sacarose. A concentração do poliol utilizado como um modificador de clatratos será geralmente de 5% p/v ou superior. A utilização de sacarose causa um decréscimo do tamanho da molécula e uma redução da tendência de auto-associação da proteína que se deseja que fique isenta de partículas de vírus. 6

Assim, a invenção contempla um método para purificação de um material proteico, tal como uma imunoglobulina, compreendendo os passos de: (a) misturar o material proteico com: (i) uma solução tampão de baixa condutividade, de baixo pH, formulada para reduzir o pH entre 5,0 e 6,0, e para obter uma força iónica inferior a 30 mS/cm; (ii) um tensoactivo não iónico; e (iii) o modificador de clatratos da presente invenção; (b) realizar a nanofiltração do material proteico para obter um material purificado substancialmente isento de partículas virais. O método da invenção também pode incluir a realização de um passo de pré-filtração em linha e monitorização da concentração do material por instalação de um monitor de controlo da concentração em linha para manter os parâmetros de pH e concentração de proteína dentro de gamas óptimas pré-estabelecidas para o material a ser purificado

Breve Descrição dos Desenhos A Fig. 1 é uma representação esquemática dos recipientes e equipamento de monitorização utilizados em nanofiltração e a direcção do fluxo do fluido. 7

Descrição Pormenorizada A presente invenção utiliza uma combinação de selecção de tampão, tensoactivo não iónico e a utilização do modificador de clatratos da presente invenção como auxiliares de processamento durante a redução virai ou eliminações virais utilizado nanofiltração por exclusão de tamanho para purificação de biomoléculas proteicas grandes. A invenção permite a utilização de um nanofiltro de exclusão de tamanho com pequeno tamanho de poros com uma molécula de proteína globular, tal como uma imunoglobulina, de um modo que permite uma passagem eficiente, perda de rendimento mínima e sem alteração significativa do nível dos agregados ou da estabilidade que caracterizam a imunoglobulina.

Os vírus removidos do material proteico pelo método de nanofiltração da invenção incluem todas as potenciais categorias de vírus, quer com envelope (por exemplo VIH, Hepatite B) e sem envelope (por exemplo Hepatite A, Parvovírus B19).

As vantagens da utilização dos auxiliares de processamento e do método da presente invenção incluem: (1) a redução do tempo de processamento e o rendimento acrescido, uma vez que as condições utilizadas aumentam a hidrofobia da superfície da membrana e reduzem o volume específico e agregação do material proteico; (2) a possibilidade de utilizar nanofiltros com tamanho de poro mais pequeno, assegurando assim a remoção de partículas virais mais pequenas; (3) o processo pode ser automatizado para monitorização contínua de modo a permitir máxima eficiência e o mais alto 8 rendimento de produto por área de filtro; (4) as caracteristicas essenciais do material proteico não são afectadas pelo processo, mantendo a integridade e qualidade do produto final.

Em sentido lato, um clatrato é uma associação molecular em que o resultado pode formar uma partícula. Os clatratos estão incluídos entre os complexos em que um componente (o hospedeiro) forma uma cavidade ou, no caso de um cristal, uma rede cristalina contendo espaços na forma de túneis ou canais longos em que estão localizadas entidades moleculares de uma segunda espécie química (o hóspede). Não há ligação covalente entre o hóspede e o hospedeiro, sendo a atracção geralmente devida a forças de van der Waals. Se os espaços na rede do hospedeiro estiverem fechados em todos os lados de modo que a espécie hóspede fique "encurralada" como numa gaiola, esses compostos são conhecidos como "clatratos" ou "compostos gaiola". As forças de van der Waals e as interacções hidrófobas ligam o hóspede à molécula hospedeira em clatratos e compostos de inclusão. Exemplos de moléculas ligadas por ligações hidrogénio que formam clatratos são hidroquinona e água, e moléculas hospedeiras de compostos de inclusão, ureia ou tioureia.

Tal como aqui utilizado, o termo "modificador de clatratos" significa uma substância que é capaz de modificar a estrutura de clatrato de uma proteína num meio aquoso e de reduzir o seu volume específico global. Substâncias tais como proteínas globulares grandes são bons candidatos a modificadores de clatratos devido à sua capacidade de formação de ligações hidrogénio num meio aquoso. 0 poliol modificador de clatratos da presente invenção modifica o complexo clatrato do material proteico reduzindo assim o seu volume específico e permitindo uma redução do tempo de processamento e maior caudal no processo 9 de nanofiltração.

Nesta especificação por "açúcares de polióis e álcoois de açúcares" significa-se um grupo de polióis com 4 a 8 grupos hidroxilo. Exemplos de polióis preferidos são açúcares, incluindo monossacáridos e dissacáridos, e álcoois de açúcares bem como os seus derivados com 4 a 8 grupos hidroxilo.

Exemplos de monossacáridos com 4 grupos hidroxilo são arabinose, ribose e xilose. Um exemplo de um álcool de açúcar com 4 grupos hidroxilo é o álcool de açúcar derivado de eritrose, i. e., eritritol.

Exemplos de monossacáridos com 5 grupos hidroxilo são galactose, frutose, glucose e sorbose. Um exemplo de um álcool de açúcar com 5 grupos hidroxilo é o álcool de açúcar derivado de xilose, í. e. xilitol.

Exemplos de álcoois de açúcares com 6 grupos hidroxilo são os derivados de glucose e sorbose bem como dos produtos da hidrólise de sacarose, e. g. sorbitol e manitol.

Exemplos de dissacáridos são maltose, lactose e sacarose, sendo preferido este último, de que todos contêm 8 grupos hidroxilo. 0 material proteico grande que pode ser processado de acordo com a presente invenção inclui proteínas globulares grandes, tais como imunoglobulinas (por exemplo IgG) e os seus fragmentos, factores de coagulação do sangue, hormonas do crescimento, apolipoproteínas, enzimas e biomoléculas de proteínas semelhantes, quer de ocorrência natural quer geneticamente modificados. 10 0 termo "potencial z", tal como aqui utilizado, significa a carga à superfície. A carga à superfície de uma partícula é por vezes referida como o seu potencial z, uma medida de carga que diminui com a distância. 0 potencial z está directamente correlacionado com a polaridade ou carga líquida de um composto.

Tal como aqui utilizado, o termo "nanofiltração" refere-se a filtração utilizando meios de exclusão de tamanho em que o tamanho dos poros é da ordem dos nanometros. Em geral, o tamanho dos poros das unidades de nanofiltração, também referidas como filtros UF, utilizadas na produção de produtos de imunoglobulinas substancialmente puros e isentos de vírus da presente invenção é inferior a cerca de 30 nm, de modo muito preferido inferior a cerca de 15 nm. Contudo, qualquer membrana tendo uma classificação de corte de filtração suficiente para reduzir ou eliminar vírus sem envelope de uma solução proteinácea pode ser utilizada nos métodos de processamento da invenção. Por exemplo, pode ser utilizada a unidade do sistema de ultrafiltração VIRESOLVE® 180 SYSTEM (Millipore Corporation, Bedford, Mass.), unidade essa que tem uma classificação de peso molecular e tamanho de poro inferior a cerca de 180 kD de peso molecular ou cerca de 12 nm. O tensoactivo não iónico ou detergentes que podem ser utilizados na presente invenção incluem os detergentes de polioxietileno não iónicos, por exemplo os polissorbatos, TWEENS; polímeros vinílicos, PLURONICS; polímeros ou copolímeros de polioxietileno-polipropileno; Brij, Sterox-AJ e Tritons. O mais preferido é o monooleato de polioxietileno sorbitano, polissorbato 80 (TWEEN 80). O tampão utilizado na invenção é seleccionado de qualquer tampão adequado de pH baixo, com baixa condutividade, tal como tampões fosfato, tampões citrato, tampões borato, tampões 11 acetato e tampões glicina a um pH de cerca de 5,0. O tampão é utilizado para manter o pH abaixo de 6 e reduzir a agregação da proteína permitindo assim um caudal mais eficiente através do nanofiltro. De modo preferido utiliza-se um tampão com uma força iónica baixa de 50 mM+/-20%, de modo preferido um tampão de acetato de sódio, pH 5,0. O método envolve a transferência da proteína de interesse para um tampão de baixo pH (pH 5,0-6,0) e baixa condutividade (10-20 mS/cm), contendo um detergente não iónico, tal como TWEEN 80, numa concentração de 0,01% e sacarose numa concentração entre 5 e 10% p/v. O dispositivo de fluxo tangencial está em comunicação fluida com vários outros recipientes: um tanque do produto, um tanque do tampão e um tanque de alimentação/recirculação equipado com um agitador. A relação destes recipientes e o fluxo de fluido entre eles está ilustrada na Fig. 1. A concentração de proteína utilizada no processamento da presente invenção estará na gama de cerca de 0,1% a cerca de 1% em peso. Até cerca de 1% pode ser utilizada quando a proteína é monomérica ou monoclonal. Para imunoglobulinas tais como uma IgGl monoclonal quimérica, a concentração de proteína inicial utilizada para processamento é de cerca de 1 a 10 mg/mL.

Durante o processamento e filtração, a concentração de proteína é, de um modo preferido monitorizada para manter níveis óptimos. Como ilustrado na Fig. 1, isto pode ser realizado pela instalação de um monitor de concentração em linha. Um pré-filtro de "dead-end" pode ser colocado em linha entre o tanque de alimentação/recirculação e o filtro UF. Um monitor de UV está colocado em linha entre o filtro UF e o tanque de recirculação, na linha do concentrado, para proporcionar informação aos tanques de alimentação e de adição de tampão para permitir a 12 manutenção da concentração da proteína alvo. 0 ajuste da solução contendo produto pré-filtrado é conseguido pela adição de tampão ao tanque de alimentação/recirculação para obter o pH, condutividade, concentração de detergente e concentração de sacarose desejados. A Fig. 1 mostra o fluxo de fluido a partir do tanque de alimentação/recirculação. Durante a filtração, a concentração do concentrado é mantida constante pela adição de tampão de modo a minimizar a interacção proteína-proteína. No exemplo apresentado, isto é realizado por controlo das bombas que fornecem o produto ao tanque de recirculação. Por aumento/diminuição da velocidade da bomba, a concentração pode ser mantida dentro de uma gama estreita especificada. Utiliza-se uma célula de carga sob o tanque de recirculação como uma informação de adição à bomba do tampão para evitar que o tanque transborde.

Durante a filtração, a pressão transmembranar está de um modo preferido na gama de 0,2 a cerca de 2,0 bar, sendo de um modo preferido mantida a menos do que cerca de 1,0 bar. O coeficiente de separação estará, de um modo preferido, na gama de 75-95% com desvios não inferiores a 60%.

Exemplo

Um exemplo de aplicação desta invenção é demonstrado na produção de uma IgGl quimérica humana/murina. A proteína, após eluição de uma coluna de permuta catiónica a pH 5,0, é colocada no tanque do produto. O tanque do tampão é cheio com acetato de sódio a 50 mM, 6% de sacarose, 0,01% de polissorbato (Tween) 80. A proteína e o tampão são misturados para se obter uma concentração final de proteína de 2,0 V0,2 mg/mL no tanque de alimentação. A filtração é iniciada com um caudal transversal de xx mL/min/cm^ e um caudal de permeado não superior a yy 13 mL/min/cm^. A pressão transmembranar e a concentração do concentrado é monitorizada para assegurar que o processo permanece dentro dos limites prescritos. Uma vez vazio o tanque do produto, os filtros são lavados com 3x o volume de retenção do sistema para maximizar o rendimento.

Lisboa, 21 de Março de 2007 14

Claims (6)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Método para purificação de um material proteico compreendendo os passos de: (a) misturar o material proteico com: (i) uma solução tampão de baixa condutividade, de baixo pH, formulada para reduzir o pH entre 5,0 e 6,0, e para obter uma força iónica inferior a 30 mS/cm; (ii) um tensoactivo não iónico; e (iii) um açúcar de poliol ou álcool de açúcar com desde 4 a 8 grupos hidroxilo; e (b) realizar a nanofiltração do material proteico para obter um material purificado substancialmente isento de partículas virais.
2. 2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o material proteico é uma imunoglobulina.
3. 3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o poliol é um monossacárido ou dissacárido.
4. 4. Método de acordo com a reivindicação 3, em que o poliol é sacarose. 1
5. 5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a concentração do poliol é cerca de 5% p/v ou superior.
6. 6. Método de acordo com a reivindicação 1 compreendendo os passos de: a) misturar o material proteico com uma solução tampão; b) ajustar o pH e a força iónica do tampão para que o pH seja 5,0-6,0 e a força iónica seja inferior a 30 mS/cm; c) adicionar um tensoactivo ao tampão para minimizar as interacções proteina-proteina e proteína-membrana; d) adicionar um açúcar de poliol ou álcool de açúcar com 4 a 8 grupos hidroxilo ao tampão, açúcar de poliol ou álcool de açúcar esse que i) reduz o raio hidrodinâmico da proteína e ii) minimiza a auto-associação da proteína; e) instalar um pré-filtro em linha no sistema; f) instalar no sistema um monitor de controlo da concentração em linha; e g) utilizar a informação do monitor de controlo da concentração em linha para manter o parâmetro do tampão de pH e a concentração de proteína dentro da 2 gama de pH de 5,0-6,0 e a força iónica inferior a 30 mS/cm. Lisboa, 21 de Março de 2007 3