PT1532269E - 1l1rl-1 como um marcador de doença cardiovascular - Google Patents

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Description

1
DESCRIÇÃO "1L1RL-1 COMO UM MARCADOR DE DOENÇA CARDIOVASCULAR" Campo da invenção
Esta invenção refere-se a métodos e composições para o diagnóstico de patologias cardiovasculares. Mais especificamente, a invenção refere-se a moléculas isoladas que podem ser utilizadas para predizer o resultado de patologias cardiovasculares que incluem enfarte do miocárdio e insuficiência cardíaca.
Antecedentes da invenção
Apesar dos avanços significativos na terapêutica, a doença cardiovascular permanece a causa individual mais comum de morbidez e mortalidade no mundo desenvolvido. Assim, a prevenção e terapêutica de patologias cardiovasculares tais como enfarte do miocárdio e acidente vascular cerebral é uma área de maior importância em saúde pública. Actualmente, vários factores de risco para futuros distúrbios cardiovasculares foram descritos e estão em ampla utilização clínica na detecção de indivíduos em alto risco. Tais testes de rastreio incluem avaliações de níveis de colesterol total e HDL. No entanto, um grande número de distúrbios cardiovasculares ocorrem em indivíduos com perfis de risco aparentemente baixo a moderado, e a capacidade de identificar tais pacientes é limitada. Além disso, os dados acumulados sugerem que os efeitos benéficos de certos tratamentos preventivos e terapêuticos para pacientes em risco de ou que se sabe que têm distúrbios cardiovasculares difere em magnitude entre diferentes grupos de paciente. Neste momento, no entanto, não existem dados que descrevam testes de diagnóstico para determinar se certas terapêuticas podem esperar-se que sejam mais ou menos eficazes. 2
Sumário da invenção
Esta invenção proporciona métodos para o diagnóstico de patologias cardiovasculares. Um gene foi identificado que é regulado positivamente em células cardíacas quando as células são submetidas a deformação induzida mecanicamente, Esta molécula de ácido nucleico codifica o Receptor tipo 1 de Interleucina 1 (IL1RL-1, também conhecido como T1/ST2, ST2, e Fit-1, SEQ ID NOs: I e 2 para a forma solúvel e SEQ ID NOs: 3 e 4 para forma na membrana) . Os termos IL1RL-1, T1/ST2, ST2, e Fit-1 são utilizados de forma intercambiável a seguir no presente documento por todo a memória descritiva.
De acordo com a invenção, um método para predizer o resultado de uma patologia cardiovascular é proporcionado.
Num primeiro aspecto, a invenção proporciona um método in vitro de predição do risco de mortalidade e/ou nova ou agravamento de insuficiência cardíaca congestiva (ICC) para um indivíduo com uma patologia cardiovascular seleccionada do grupo que consiste em ICC e enfarte do miocárdio (MI), sendo que o método compreende: obter um nível de proteína IL1RL-1 solúvel numa amostra biológica que compreende soro do indivíduo; e comparar o dito nível de proteína IL1RL-1 solúvel com um valor predeterminado específico para a patologia cardiovascular; em que um nível elevado de proteína IL1RL-1 solúvel em comparação com o valor predeterminado é indicativo de um risco aumentado de mortalidade dentro de 30 dias e/ou nova ou piora de ICC dentro de 30 dias, e a proteína IL1RL-1 solúvel é um produto de expressão de uma sequência de ácido nucleico como é representado em SEQ ID NO. 1.
Num segundo aspecto, a invenção proporciona um método in vitro para predizer o risco de mortalidade e/ou nova ou agravamento de insuficiência cardíaca congestiva (ICC) para um indivíduo com uma patologia cardiovascular seleccionada 3 do grupo que consiste em ICC e enfarte do miocárdio (MI), sendo que o método compreende: obter um primeiro nível de proteína IL1RL-1 solúvel numa amostra que compreende soro de um indivíduo; obter um segundo nível de proteína IL1RL-1 solúvel numa amostra subsequente que compreende soro do mesmo indivíduo; e comparar a mudança no nível da proteína IL1RL-1 com um valor predeterminado especifico para a patologia cardiovascular, em que uma mudança no nível da proteína IL1RL-1 que excede o valor predeterminado é indicativo de um risco aumentado de mortalidade dentro de 30 dias e/ou nova ou piora de ICC dentro de 30 dias.
Características preferidas e formas de realização da invenção são descritas nas reivindicações dependentes anexas (reivindicações 2-8 e 10-23).
Em certas formas de realização, o valor predeterminado específico para o resultado predito de uma patologia cardiovascular é uma pluralidade de intervalos de níveis de marcador predeterminados e a dita etapa de comparação compreende determinar em quais dos ditos intervalos de níveis de marcador predeterminados o dito nível do indivíduo está. A patologia cardiovascular é seleccionada do grupo que consiste em, enfarte do miocárdio e insuficiência cardíaca congestiva.
Estes e outros objectos da invenção serão descritos em mais detalhe em conjunto com a descrição detalhada da invenção.
Breve descrição das sequências SEQ ID NO: 1 é a sequência de nucleótidos do ADNc de IL1RL1 (solúvel) humano. SEQ ID NO: 2 é a sequência de aminoácidos predita do produto de tradução do ADNc de IL1RL1 (solúvel) humano (SEQ ID NO: 1). 4 SEQ ID NO: 3 é a sequência de nucleótidos do ADNc de IL1RL1 (membrana) humano. SEQ ID NO: 4 é a sequência de aminoácidos predita do produto de tradução do IL1RL1 (membrana) humano (SEQ ID NO: 3) . SEQ ID NO: 5 é a sequência de nucleótidos do ADNc de Fit-1 S de rato. SEQ ID NO: 6 é a sequência de aminoácidos predita do produto de tradução de ADNc Fit-1 S de rato (SEQ ID NO: 5). SEQ ID NO: 7 é a sequência de nucleótidos do ADNc Fit-1 M de rato. SEQ ID NO: 8 é a sequência de aminoácidos predita do produto de tradução do ADNc Fit-1 M de rato (SEQ ID NO: 7). Breve descrição dos Desenhos A Figura 1 representa por meio de Northern Blot os efeitos de esforço mecânico cíclico de 8 % sobre a expressão de
Fit-1 em miócitos cardíacos cultivados ao longo do curso do tempo. A Figura 2 representa por meio de Northern Blot os efeitos de esforço mecânico cíclico de 8 %, bloqueio de receptor de angiotensina, angiotensina II, IL-lb, e forbol éster, sobre a expressão de IL1RL-1 em miócitos cardíacos cultivados ao longo do curso do tempo. A Figura 3 representa por meio de Northern Blot os efeitos de esforço mecânico cíclico de 8 %, peróxido de hidrogénio, e TIRON, sobre a expressão de IL1RL-1 em miócitos cardíacos cultivados ao longo do curso do tempo. A Figura 4 representa por meio de Northern Blot os efeitos de actinomicina D e ciclohexamida sobre a indução de expressão de IL1RL-1 durante um esforço mecânico cíclico de 8 % sobre miócitos cardíacos ao longo do curso do tempo. A Figura 5 representa por meio de Northern Blot os efeitos de esforço mecânico cíclico de 8 % em separado e em combinação com IL-lb, e forbol éster na ausência de 5 esforço, sobre a expressão de IL1RL-1 em miócitos cardíacos cultivados ao longo do curso do tempo. A Figura 6 representa por meio de Northern Blot os efeitos de um esforço mecânico cíclico de 8 % sobre a expressão de ATPase vacuolar em miócitos cardíacos cultivados ao longo do curso do tempo. A Figura 7 representa um kit que incorpora características da presente invenção. A Figura 8 representa precoce (esquerda) e tardio (direita) curso de tempo da indução de ARNm de T2/ST2 por meio de esforço mecânico em miócitos cardíacos. A indução máxima ocorre em 3 horas, é sustentada durante 9 horas e declina em 15 horas. Painéis superiores, ARN de T1/ST2; painéis inferiores, brometo de etídio. No str, sem esforço. A Figura 9 representa indução de ARNm de T1/ST2 por meio de esforço mecânico (8%), interleucina-1 (10 ng/ml) e forbol éster (PMA, 200 nM) em 1 e 3 horas. PMA>esforço>IL-l. Painel superior, ARN de Tl/ST2m, painel inferior, brometo de etídio. A Figura 10 mostra que T1/ST2 pode ser um gene induzido por activação de NF-KB durante sinalização de IL-l/receptor de IL em miócitos cardíacos. IL-1 e ARN de Tl/ST2m induzido por esforço na presença de infecção com adenovírus de controlo (esquerda). Com infecção de IKB adenovírus (direita), que diminui actividade de ligação de ADN NF-KB, a indução de IL-1 de T1/ST2 foi bloqueada. A indução de esforço de T1/ST2 foi parcialmente bloqueada por infecção de adenovírus IKB que sugere outra via para indução de T1/ST2 por esforço. Painel superior, ARN de Tl/ST2m; painel inferior, brometo de etídio. A Figura 11 mostra a expressão de proteína de T1/ST2 em seguida ao enfarte do miocárdio em ratinhos por meio de imunohistoquímica no Io dia, mas não 3 dias após enfarte. 40X de aumento. 6 A Figura 12 mostra em forma gráfica niveis de proteína ST2 na circulação sistémica de pacientes humanos após enfarte do miocárdio; a. Proteína ST2 foi significativamente aumentada no dia 1 após o enfarte do miocárdio em comparação com o dia 14 e o dia 90; b. Análise de regressão linear que demonstra uma relação significativa positiva (p<0,001) entre proteína ST2 em curculação e creatina quinase 1 dia após o enfarte do miocárdio. Log ST2 = 0,454(log CK)-1,07; c. Análise de quartil de níveis em circulação de proteína ST2 dia 1 após o enfarte do miocárdio e fracção de ejecção. Fracção de ejecção baixa é associada a altos níveis de proteína ST2. A Figura 13 mostra que níveis de avaliação inicial elevados de ST2 foram indicativo de maior mortalidade através de 30 dias de seguimento (ordem de log, p = 0, 0009) .
Descrição detalhada da invenção A invenção envolve a descoberta de um número de genes que são regulados positivamente em células cardíacas quando as células são submetidas a uma deformação por esforço mecanicamente induzida aumento "Regulado positivamente", como é utilizado no presente documento, refere-se a expressão aumentada de um gene e/ou seu polipéptido codificado. "Expressão aumentada" refere-se a aumentar (isto é, a um grau detectável) a replicação, transcrição, e/ou tradução de qualquer dos ácidos nucleicos revelados (IL1RL-1, SEQ ID NOs. : 1, 3), uma vez que a regulação positiva de quaisquer destes processos tem como resultado a aumento de concentração/quantidade do polipéptido codificado pelo gene (ácido nucleico). Ao contrário, "regulação negativa", ou "expressão diminuída" como é utilizado no presente documento, refere-se a expressão diminuída de um gene e/ou seu polipéptido codificado. A regulação positiva ou regulação negativa da expressão de genes pode ser directamente determinada por meio da detecção de um aumento ou diminuição, 7 respectivamente, no nível de ARNm para o gene, ou o nível de expressão de proteínas do gene-polipéptido codificado, utilizando quaisquer meios adequados conhecidos na técnica, tais como hibridação de ácido nucleico ou métodos de detecção de anticorpos, respectivamente, e em comparação com controlos.
Uma "célula cardíaca", como é utilizado no presente documento, refere-se a um cardiomiócito.
Uma "molécula", como é utilizado no presente documento, abrange ambos "ácidos nucleicos" e "polipéptidos". "Expressão", como é utilizado no presente documento, refere-se a expressão de ácido nucleico e/ou polipéptido.
Como é utilizado no presente documento, um "indivíduo" é um mamífero ou um mamífero não humano. Em todas as formas de realização polipéptidos, ácidos nucleicos humanos, e indivíduos humanos são preferidos. Acredita-se que os resultados obtidos utilizando as moléculas humanas e de ratos descritas em outra parte no presente documento são preditivas dos resultados que podem ser obtidos utilizando outras sequências homólogas.
Em geral, homólogos e alelos partilharão tipicamente pelo menos 80 % de identidade de nucleótidos e/ou pelo menos 85 % de identidade de aminoácidos às sequências humanas caracterizadas da invenção. Em exemplos adicionais, homólogos e alelos partilharão tipicamente pelo menos 90 %, 95 %, ou mesmo 99 % de identidade de nucleótidos e/ou pelo menos 95 %, 98 %, ou mesmo 99 % de identidade de aminoácidos às sequências humanas caracterizadas, respectivamente. A homologia pode ser calculada utilizando várias ferramentas de software disponíveis publicamente desenvolvidas por NCBI (Betesda, Mariland). Ferramentas exemplares incluem o algoritmo heurístico de Altschul SF, et al. , (J Mol Biol, 1990, 215:403-410), também conhecido como BLAST. Alinhamentos por par e ClustalW (configuração de matriz BLOSUM30) bem como análise hidropática Kyte-Doolittle podem ser obtidos utilizando software de análise de sequências público (EMBL, Heidelberg, Alemanha) e comercial (por exemplo, o software de análise de sequências MacVector de Oxford Molecular Group/Genetics Computer Group, Madison, WI, Accelrys, Inc., San Diego, CA). Os complementos de Watson-Crick dos ácidos nucleicos precedentes também são abrangidos pela invenção.
No rastreio para genes relacionados, tais como homólogos e alelos das sequências descritas em outra parte no presente documento, um Southern blot pode ser realizado utilizando condições restringente, juntamente com uma sonda. 0 termo "condições restringentes", como é utilizado no presente documento, refere-se a parâmetros conhecidos na técnica. Com ácidos nucleicos, dizem-se que as condições de hibridação são restringentes tipicamente sob condições de baixa força iónica e uma temperatura justo abaixo da temperatura de fusão (Tm) do complexo de hibrido de ADN (tipicamente, aproximadamente 3 °C abaixo da Tm do hibrido). Restrigência mais alta contribui para uma correlação mais específica entre a sequência de sonda e o alvo. As condições restringentes utilizadas na hibridação de ácidos nucleicos são bem conhecidas na técnica e podem ser encontradas em referências que compilam tais métodos, por exemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook, et al., eds., Segunda Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, 1989, ou Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., Nova Iorque. Um exemplo de "condições de alta severidade" é hibridação a 65 °C em 6 x SSC. Outro exemplo de condições de alta restringência é hibridação a 65 °C em tampão de hibridação que consiste em 3,5 x SSC, 0,02 % de Ficoll, 0,02 % polivinil pirrolidona, 0,02 % de Albumina de Soro Bovino, 2,5 mM de NaH2P04 [pH7] , 0,5 % de SDS, 2 mM de EDTA. (SSC é 0,015 M de cloreto de 9 sódio/0,15 M de citrato de sódio, pH7; SDS é dodecil sulfato de sódio; e EDTA é ácido etilenodiaminatetracético). Após hibridação, a membrana sobre a qual o ADN é transferido é lavada a 2 x SSC a temperatura ambiente e então a 0,1 x SSC/0,1 x SDS a temperaturas até 68 °C. Num exemplo adicional, uma alternativa à utilização de uma solução de hibridação aquosa é a utilização de uma solução de hibridação de formamida. Condições de hibridação restringentes podem assim ser alcançadas utilizando, por exemplo, uma solução de formamida a 50 % e 42 °C. Existem outras condições, reagentes, e assim por diante que podem ser utilizados, e teriam como resultado um grau de restringência similar. O perito na especialidade conhece tais condições, e assim não serão apresentadas aqui. Será entendido, no entanto, que o perito na especialidade será capaz de manipular as condições de uma maneira a permitir a clara identificação de homólogos e alelos de ácidos nucleicos de IL1RL-1 da invenção. O perito na especialidade também conhece que a metodologia para rastrear células e bibliotecas para a expressão de tais moléculas que então são isoladas rotineiramente, seguido por isolamento da molécula de ácido nucleico pertinente e sequenciamento.
Dados os ensinamentos no presente documento de clones de ADNc de rato e humanos de comprimento completo, outras sequências de mamíferos tais como (ratinho, bovina, etc.) ADNc correspondentes aos ácidos nucleicos de rato e humanos relacionados podem ser isolados de bibliotecas de ADNc utilizando técnicas convencionais de hibridação de colónias, ou podem ser identificados utilizando uma pesquisa de homologia, por exemplo, em GenBank utilizando quaisquer dos algoritmos descritos em outra parte no presente documento ou conhecidos na técnica. Por exemplo, sequências com números de acesso do GenBank Y07519.1 e D13695.1 para os homólogos de IL1RL-1 de ratinho podem ser 10 utilizadas de forma intercambiável com as sequências homólogas de rato da invenção, em todos os aspectos da invenção sem se afastar da essência da invenção.
Como é utilizado no presente documento com relação a ácidos nucleicos, o termo "isolado" significa: (i) amplificado in vitro por meio de, por exemplo, reacção em cadeia da polimerase (PCR); (ii) produzido recombinantemente por clonagem; (iii) purificado, como por clivagem e separação em gel; ou (iv) sintetizado por meio de, por exemplo, síntese química. Um ácido nucleico isolado é um que é prontamente manipulado por técnicas de ADN recombinante bem conhecidas na técnica. Assim, uma sequência de nucleótidos contida num vector em que os locais de restrição 5' e 3' são conhecidos ou para a qual as sequências de iniciador de reacção em cadeia da polimerase (PCR) foram reveladas é considerada isolada, mas não se considera isolada uma sequência de ácido nucleico existente em seu estado nativo em seu hospedeiro natural. Um ácido nucleico isolado pode ser purificado substancialmente, mas não é necessário. Por exemplo, um ácido nucleico que é isolado dentro de um vector de expressão ou clonagem não é puro em que pode compreender somente uma percentagem bem pequena do material na célula na qual está. Tal ácido nucleico é isolado, no entanto, como o termo é utilizado no presente documento porque é prontamente manipulado por técnicas padrão conhecidas aos peritos na especialidade. A expressão de qualquer dos ácidos nucleicos de IL1RL-1 precedentes da presente invenção, que incluem fragmentos únicos dos precedentes, pode ser determinada utilizando metodologias diferentes. Um "fragmento único", como é utilizado no presente documento, com relação a um ácido nucleico é um que é uma "assinatura" para o ácido nucleico maior. Por exemplo, o fragmento único é longo o suficiente para assegurar que a sua sequência exacta não seja 11 encontrada em moléculas dentro do genoma humano fora da sequência para cada ácido nucleico definido anteriormente. Os peritos na especialidade podem aplicar não mais que procedimentos de rotina para determinar se um fragmento é único dentro do genoma humano. Os fragmentos únicos, no entanto, excluem fragmentos completamente compostos de sequências de nucleótidos publicadas com anterioridade à data de depósito deste pedido.
Os fragmentos únicos podem ser utilizados como sondas em ensaios de Southern e Northern blot para identificar tais ácidos nucleicos, ou podem ser utilizadas em ensaios de amplificação tais como aqueles que utilizam PCR. Como é conhecido aos peritos na especialidade, sondas grandes tais como 200, 250, 300 ou mais nucleótidos são preferidas para certas utilizações tais como Southern e Northern blots, enquanto fragmentos menores serão preferidos para outras utilizações tais como PCR. Os fragmentos únicos também podem ser utilizados para produzir proteínas de fusão para gerar anticorpos, ou determinar a ligação dos fragmentos de polipéptidos, ou para gerar componentes de imunoensaio. De maneira similar, os fragmentos únicos podem ser utilizados para produzir fragmentos não fusionados de, por exemplo, os polipéptidos de IL1RL-1, úteis, por exemplo, na preparação de anticorpos, imunoensaios ou aplicações terapêuticas. Os fragmentos únicos podem ser utilizados ainda como moléculas antissentido para inibir a expressão dos ácidos nucleicos precedentes e polipéptidos respectivamente.
Como será reconhecido por aqueles peritos na especialidade, o tamanho do fragmento único dependerá de sua conservação no código genético. Assim, algumas regiões de SEQ ID NOs: 1, e 3, e complementos irão requerer segmentos mais longos para ser único enquanto outros irão requerer somente segmentos curtos, tipicamente entre 12 e 32 nucleótidos de comprimento (por exemplo, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 12 31 e 32 bases) ou mais, até o comprimento completo de cada uma das sequências reveladas. Como foi mencionado anteriormente, este pedido de patente pretende abranger cada e qualquer fragmento de cada sequência, começando no primeiro nucleótido, o segundo nucleótido e assim por diante, até 8 nucleótidos perto da extremidade, e terminando em qualquer lugar desde o nucleótido número 8, 9, 10 e assim por diante para cada sequência, até o último nucleótido, (contanto que a sequência seja única como foi descrito anteriormente) . Por exemplo, praticamente qualquer segmento da região de SEQ ID NO: 1 começando no nucleótido 1 e terminando no nucleótido 1357, ou SEQ ID NO: 3 começando no nucleótido 1 e terminando no nucleótido 2058, ou complementos do mesmo, que é 20 ou mais nucleótidos em comprimento serão únicos. Aqueles peritos na especialidade são bem versados em métodos para seleccionar tais sequências, tipicamente com base na capacidade do fragmento único de distinguir selectivamente a sequência de interesse de outras sequências no genoma humano do fragmento daqueles de bases de dados conhecida tipicamente é tudo que é necessário, embora hibridação confirmatória in vitro e análise de sequenciamento possam ser realizadas.
Os vectores de expressão que codificam proteínas codificadas pelos ácidos nucleicos correspondentes a SEQ ID NOs: 1 e/ou 3, fragmentos e variantes dos mesmos, e células hospedeiras que contêm esses vectores de expressão, são revelados. Virtualmente qualquer célula, procariótica ou eucariótica, que possa ser transformada com ADN ou ARN heterólogo e que possa ser crescida ou mantida em cultura, pode ser utilizada na prática da invenção. Os exemplos incluem células bacterianas tais como Escherichia coli e células de mamíferos tais como de ratinho, hamster, porco, cabra, primata, etc. Podem ser de uma ampla variedade de tipos de tecido, que incluem mastócitos, fibroblastos, oócitos e linfócitos, e podem ser células primárias ou 13 linhas de células. Os exemplos específicos incluem células CHO e células COS. Sistemas de transcrição livres de células também podem ser utilizados em lugar de células.
Como é utilizado no presente documento, um "vector" pode ser qualquer de um número de ácidos nucleicos em que uma sequência desejada pode ser inserida por restrição e ligação para o transporte entre ambientes genéticos diferentes ou para a expressão numa célula hospedeira. Os vectores são tipicamente compostos de ADN embora vectores de ARN estejam também disponíveis. Os vectores incluem, mas não são limitados a, plasmídeos, fagomídeos e genomas de vírus. Um vector de clonagem é um que é capaz de replicar numa célula hospedeira, e que é caracterizado ainda por um ou mais locais de restrição de endonuclease no qual o vector pode ser cortado de uma maneira determinável e em que uma sequência de ADN desejada pode ser ligada tal que o novo vector recombinante retém sua capacidade de replicar na célula hospedeira. No caso de plasmídeos, a replicação da sequência desejada pode ocorrer muitas vezes à medida que aumenta o número de cópias de plasmideo dentro da bactéria hospedeira ou somente uma única vez por hospedeiro antes do hospedeiro se reproduzir por mitose. No caso de fago, a replicação pode ocorrer activamente durante uma fase lítica ou passivamente durante uma fase lisogénica. Um vector de expressão é um em que uma sequência de ADN desejada pode ser inserida por restrição e ligação tal que é unida operativamente a sequências reguladoras e pode ser expressa como um transcrito de ARN. Os vectores podem conter ainda uma ou mais sequências marcadoras adequadas para utilização na identificação de células que foram ou não foram transformadas ou transfectadas com o vector. Marcadores incluem, por exemplo, genes que codificam proteínas que aumentam ou diminuem a resistência ou sensibilidade a antibióticos ou outros compostos, genes que codificam enzimas cujas actividades são detectáveis por 14 ensaios padrão conhecidos na técnica (por exemplo, β-galactosidase ou fosfatase alcalina), e genes que afectam visivelmente o fenótipo de células, hospedeiros, colónias ou placas (por exemplo, proteína verde fluorescente) transformadas ou transfectadas. Vectores preferidos são aqueles capazes de replicação autónoma e expressão dos produtos génicos estruturais presentes nos segmentos de ADN aos quais são unidos operativamente.
Como é utilizado no presente documento, uma sequência codificante e sequências reguladoras são ditas "unidas operativamente" quando são ligadas covalentemente de tal maneira a colocar a expressão ou transcrição da sequência codificante sob a influência ou controlo das sequências reguladoras. Se for desejado que as sequências codificantes sejam traduzidas numa proteína funcional, duas sequências de ADN são ditas unidas operativamente se a indução de um promotor nas sequências reguladoras 5' tem como resultado a transcrição da sequência codificante e se a natureza da ligação entre as duas sequências de ADN não (1) tem como resultado a introdução de uma mutação por deslocamento da grelha de leitura, (2) interfere com a capacidade da região promotora de direccionar a transcrição das sequências codificantes, ou (3) interfere com a capacidade do transcrito de ARN correspondente a ser traduzido numa proteína. Assim, uma região promotora seria unida operativamente a uma sequência codificante se a região promotora for capaz de realizar a transcrição dessa sequência de ADN tal que o transcrito resultante poderia ser traduzido na proteína ou polipéptido desejado. A natureza exacta das sequências reguladoras necessária para a expressão de genes pode variar entre espécies ou tipos celulares, mas devem em geral incluir, como for necessário, sequências não transcritas 5' e não traduzidas 5' envolvidas com a iniciação de transcrição e tradução respectivamente, tal como um TATA box, sequência 15 de capeamento, sequência CAAT, e similares. Tais sequências reguladoras não transcritas 5' incluirão com frequência uma região promotora que inclui uma sequência promotora para o controle transcricional do gene unido operativamente. As sequências reguladoras podem também incluir sequências melhoradoras ou sequências activadoras a montante como for desejado. Os vectores podem opcionalmente incluir sequências sinal ou lider 5'. A escolha e desenho de um vector apropriado estão dentro da capacidade e critério de um perito na especialidade.
Os vectores de expressão que contêm todos os elementos necessários para a expressão estão disponíveis comercialmente e são conhecidos a esses peritos na especialidade. Veja-se, por exemplo, Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. As células são modificadas geneticamente pela introdução nas células de ADN (ARN) heterólogo que codifica um polipéptido ou fragmento ou variante do mesmo. Esse ADN (ARN) heterólogo é colocado sob controlo operável de elementos transcricionais para permitir a expressão do ADN heterólogo na célula hospedeira.
Os sistemas preferidos para a expressão de ARNm em células de mamíferos são aqueles tais como pcDNA3.1 (disponível de Invitrogen, Carlsbad, CA) que contêm um marcador seleccionável tal como um gene que confere resistência a G418 (que facilita a selecção de linhas de células transfectadas estavelmente) e as sequências promotoras-melhoradoras do citomegalovírus humano (CMV). Adicionalmente, adequado para a expressão em linhas de células de primata ou caninas é o vector pCEP4 (Invitrogen, Carlsbad, CA), que contém uma origem de replicação de vírus de Epstein Barr (EBV), que facilita a manutenção de plasmídeo como um elemento extracromossomal de múltiplas cópias. Outro vector de expressão ainda preferido é um 16 adenovírus, descrito por Stratford-Perricaudet, que é defeituoso para proteínas EI e E3 (J. Clin. Invest. 90:626-630, 1992) .
As SEQ ID NOs: 1 e/ou 3, vectores de expressão que contêm sequência de ADNc descritos acima, podem ser utilizados para transfectar células hospedeiras e linhas de células, sejam estas procariótica (por exemplo, Escherichia coli), ou eucariótica (por exemplo, células CHO, células COS, sistemas de expressão em leveduras e expressão de baculovírus recombinante em células de insecto). Especialmente útil são células de mamíferos tais como de ratinho, hamster, porco, cabra, primata, etc. Podem ser de uma ampla variedade de tipos de tecido, e incluem células primárias e linhas de células. Os exemplos específicos incluem células dendríticas, células U293, leucócitos de sangue periférico, células estaminais da medula óssea e células estaminais embrionárias. A invenção pode utilizar polipéptidos isolados (que incluem proteínas totais e proteínas parciais), codificados pelos ácidos nucleicos precedentes (SEQ ID NOs: 1 e 3) , e incluem os polipéptidos de SEQ ID NOs: 2 e/ou 4, e fragmentos únicos dos mesmos. Tais polipéptidos são úteis, por exemplo, em separado ou como parte de proteínas de fusão para gerar anticorpos, como componentes de um imunoensaio, etc. Os polipéptidos podem ser isolados de amostras biológicas que incluem homogenatos de tecido ou célula, e podem também ser expressos recombinantemente numa variedade de sistemas de expressão procariótico e eucariótico pela construção de um vector de expressão apropriado ao sistema de expressão, introdução do vector de expressão no sistema de expressão, e isolamento da proteína expressa recombinantemente. Polipéptidos de cadeia curta, que incluem péptidos antigénicos (tais como aqueles apresentados pelas moléculas de MHC na superfície de uma célula para o reconhecimento imune) também podem ser 17 sintetizados quimicamente utilizando métodos bem estabelecidos de síntese de péptidos.
Como é utilizado no presente documento com relação a polipéptidos, o termo "isolado" significa separado do seu ambiente nativo em forma suficientemente pura de modo que pode ser manipulado ou utilizado para qualquer um dos propósitos da invenção. Assim, isolado significa suficientemente puro para ser utilizado (i) para criar e/ou isolar anticorpos, (ii) como um reagente num ensaio, (iii) para o sequenciamento, (iv) como um agente terapêutico, etc.
Um fragmento único para cada um dos polipéptidos precedentes, em geral, tem as características e atributos de fragmentos únicos como foi discutido anteriormente com respeito a ácidos nucleicos. Como será reconhecido por aqueles peritos na especialidade, o tamanho do fragmento único dependerá de factores tais como se o fragmento constitui uma porção de um domínio de proteína conservado. Assim, algumas regiões de um polipéptido irão requerer segmentos mais longos para serem únicos enquanto outras irão requerer somente segmentos curtos, tipicamente entre 5 e 12 aminoácidos (por exemplo, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 e 12 aminoácidos de comprimento ou mais, que incluem cada número inteiro até o comprimento completo de cada polipéptido).
Os fragmentos únicos de um polipéptido preferentemente são aqueles fragmentos que retêm uma capacidade funcional distinta do polipéptido. Capacidades funcionais que podem ser retidas num fragmento único de um polipéptido incluem interacção com anticorpos, interacção com outros polipéptidos ou fragmentos dos mesmos, interacção com outras moléculas, etc. uma actividade importante é a capacidade de actuar como uma assinatura para identificar o polipéptido. Aqueles peritos na especialidade são bem versados em métodos para seleccionar sequências de aminoácidos únicas, tipicamente com base na capacidade do 18 fragmento único de distinguir selectivamente a sequência de interesse de não membros da família. Uma comparação da sequência do fragmento com aquelas de bases de dados conhecidas tipicamente é tudo o que é necessário.
As variantes dos polipéptidos descritos anteriormente podem ser úteis. Como é utilizado no presente documento, uma "variante" de um polipéptido é um polipéptido que contém uma ou mais modificações à sequência de aminoácidos primária de um polipéptido natural (por exemplo, "tipo selvagem": um polipéptido com uma sequência de aminoácidos seleccionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 2 e 4) . Modificações que criam um polipéptido variante são tipicamente feitas ao ácido nucleico que codifica o polipéptido, e podem incluir deleções, mutações de ponto, truncagens, substituições de aminoácidos e adição de fracções de aminoácidos ou não de aminoácidos para: (1) reduzir ou eliminar uma actividade de um polipéptido; (2) melhorar uma propriedade de um polipéptido, tal como estabilidade da proteína num sistema de expressão ou a estabilidade de ligação de proteína-ligando; (3) proporcionar uma nova actividade ou propriedade a um polipéptido, tal como adição de um epítopo antigénico ou adição de uma fracção detectável; ou (4) proporcionar ligação equivalente ou melhor a um receptor de polipéptido ou outra molécula. Alternativamente, as modificações podem ser feitas directamente ao polipéptido, tal como por clivagem, adição de uma molécula ligante, adição de uma fracção detectável, tal como biotina, adição de um ácido gordo, e similares. As modificações também abrangem proteínas de fusão que compreendem todas ou parte da sequência de aminoácidos do polipéptido. Um perito na especialidade conhece métodos para predizer o efeito sobre conformação da proteína de uma mudança na sequência da proteína, e pode assim "desenhar" um polipéptido variante de acordo com métodos conhecidos. Um exemplo de tal método 19 é descrito por Dahiyat e Mayo em Science 278: 82-87, 1997, por meio do qual proteínas podem ser desenhadas de novo. 0 método pode ser aplicado a uma proteína conhecida para variar somente uma porção da sequência de polipéptidos. Por meio da aplicação dos métodos computacionais de Dahiyat e Mayo, variantes específicas de quaisquer dos polipéptidos precedentes podem ser propostas e testadas para determinar se a variante retém uma conformação desejada.
As variantes podem incluir polipéptidos que são modificados especificamente para alterar uma característica do polipéptido não relacionada com a sua actividade fisiológica. Por exemplo, resíduos de cisteína podem ser substituídos ou deletados para prevenir ligações dissulfureto indesejadas. De maneira similar, certos aminoácidos podem ser alterados para melhorar a expressão de um polipéptido por meio da eliminação da proteólise pelas proteases num sistema de expressão (por exemplo, resíduos de aminoácidos dibásicos em sistemas de expressão em leveduras em que actividade de protease KEX2 está presente).
As mutações de um ácido nucleico que codifica um polipéptido preferentemente preservam a grelha de leitura de aminoácidos da sequência codificante, e preferentemente não criam regiões no ácido nucleico que são prováveis de hibridar para formar estruturas secundárias, tais como hairpins ou loops, que podem ser prejudiciais à expressão da polipéptido variante.
As mutações podem ser feitas pela selecção de uma substituição de aminoácidos, ou por mutagénese aleatória de um local seleccionado num ácido nucleico que codifica o polipéptido. Polipéptidos variantes são então expressos e testados para uma ou mais actividades para determinar que mutação proporciona um polipéptido variante com as propriedades desejadas. Mutações adicionais podem ser feitas a variantes (ou a polipéptidos não variantes) que 20 são silenciadas como a sequência de aminoácidos do polipéptido, mas que proporcionam codões preferidos para a tradução num hospedeiro particular. Os codões preferidos para a tradução de um ácido nucleico em, por exemplo, Escherichia coli, são bem conhecidos aos peritos na especialidade. Outras mutações ainda podem ser feitas às sequências não codificantes de um gene ou clone de ADNc para melhorar a expressão do polipéptido. O perito na especialidade perceberá que substituições conservativas de aminoácidos podem ser feitas em quaisquer dos polipéptidos precedentes para proporcionar variantes funcionalmente equivalentes dos polipéptidos precedentes, isto é, as variantes retêm as capacidades funcionais de cada polipéptido. Como é utilizado no presente documento, uma "substituição conservativa de aminoácidos" refere-se a uma substituição de aminoácidos que não altera significativamente alter a estrutura terciária e/ou actividade do polipéptido. As variantes podem ser preparadas de acordo com métodos para alterar a sequência de polipéptidos conhecida a um perito na especialidade, e incluem aquelas que são encontradas em referências que compilam tais métodos, por exemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook, et ai., eds., Segunda Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, 1989, ou Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, et ai., eds., John Wiley & Sons, Inc., Nova Iorque. As substituições conservativas de aminoácidos incluem substituições feitas entre aminoácidos dentro dos seguintes grupos: (a) Μ, I, L, V; (b) F, Y, W; (c) K, R, H; (d) A, G; (e) S, T; (f) Q, N; e (g) E, D.
Assim variantes funcionalmente equivalentes de polipéptidos, isto é, variantes de polipéptidos que retêm a função dos polipéptidos naturais ("tipo selvagem"), são contempladas. As substituições conservativas de aminoácidos na sequência de aminoácidos de polipéptidos para produzir 21 variantes funcionalmente equivalentes de cada polipéptido tipicamente são feitas pela alteração de um ácido nucleico que codifica o polipéptido. Tais substituições podem ser feitas por uma variedade de métodos conhecidos a um perito na especialidade. Por exemplo, as substituições de aminoácidos podem ser feitas por mutação direccionada por PCR, mutagénese direccionada ao local de acordo com o método de Kunkel (Kunkel, Proc. Nat. Acad. Sei. U.S.A. 82: 488-492, 1985), ou pela síntese química de um gene que codifica um polipéptido. A actividade de fragmentos funcionalmente equivalentes de polipéptidos pode ser testada por clonagem do gene que codifica o polipéptido alterado num vector de expressão bacteriano ou de mamíferos, introdução do vector numa célula hospedeira apropriada, expressão do polipéptido alterado, e teste para uma capacidade funcional dos polipéptidos como foi revelado no presente documento.
Uma variedade de metodologias bem conhecidas ao perito na especialidade pode ser utilizada para obter moléculas isoladas. 0 polipéptido pode ser purificado a partir de células que produzem naturalmente o polipéptido por meios cromatográficos ou reconhecimento imunológico. Alternativamente, um vector de expressão pode ser introduzido em células para causar a produção do polipéptido. Em outro método, os transcritos de ARNm podem ser microinjectados ou de outra maneira introduzidos em células para causar a produção do polipéptido codificado. A tradução de ARNm em extractos livres de células tais como o sistema de lisado de reticulócitos também pode ser utilizada para produzir polipéptidos. Aqueles peritos na especialidade podem também prontamente seguir métodos conhecidos para isolar polipéptidos. Estes incluem, mas não são limitados a, imunocromatografia, HPLC, cromatografia de exclusão por tamanho, cromatografia de permuta iónica e cromatografia de imunoafinidade. 22 0 isolamento dos ADNc descritos tornam também possível para o perito diagnosticar um distúrbio caracterizado por uma expressão aberrante de quaisquer dos ADNc precedentes. Estes métodos envolvem determinar a expressão de cada um dos ácidos nucleicos identificados, e/ou polipéptidos derivados destes. Na situação anterior, tais determinações podem ser levadas a cabo via qualquer ensaio de determinação de ácido nucleico padrão, que incluem a reacção em cadeia da polimerase, ou ensaiar com sondas de hibridação marcadas como será exemplificado a seguir. Na última situação, tal determinação pode ser levada a cabo via qualquer ensaio imunológico padrão utilizando, por exemplo, anticorpos que se ligam à proteína secretada. A invenção pode utilizar também agentes de ligação a péptidos isolados que, por exemplo, podem ser anticorpos ou fragmentos de anticorpos ("polipéptidos de ligação"), que têm a capacidade de ligar-se selectivamente a qualquer dos polipéptidos descritos (por exemplo, SEQ ID NO: 2 ou 4) . Os anticorpos incluem anticorpos policlonal e monoclonal, preparados de acordo com a metodologia convencional.
Significativamente, como é bem conhecido na técnica, somente uma pequena porção de uma molécula de anticorpo, o paratopo, está envolvido na ligação do anticorpo ao seu epítopo (veja-se, em geral, Clark, W.R. (1986) The Experimental Foundations of Modern Immunology Wiley & Sons, Inc., Nova Iorque; Roitt, I. (1991) Essential Immunology, 7a Ed., Blackwell Scientific Publications, Oxford). As regiões pFc' e Fc, por exemplo, são efectoras da cascata do complemento, mas não estão envolvidas na ligação ao antigénio. Um anticorpo a partir do qual a região pFc' foi clivada enzimaticamente, ou que foi produzido sem a região pFc' , denominado de um fragmento F(ab')2f retém ambos os locais de ligação ao antigénio de um anticorpo intacto. De maneira similar, um anticorpo a partir do qual a região Fc foi enzimaticamente clivada, ou que foi produzido sem a 23 região Fc, denominado de um fragmento Fab, retém um dos locais de ligação ao antigénio de uma molécula de anticorpo intacta. Procedendo ainda, fragmentos Fab consistem numa cadeia leve de anticorpo covalentemente ligado e uma porção da cadeia pesada do anticorpo denominada de Fd. Os fragmentos Fd são o maior determinante de especificidade do anticorpo (um único fragmento Fd pode ser associado a até dez cadeias leves diferentes sem alterar a especificidade do anticorpo) e fragmentos Fd retêm capacidade de ligação a epitopo em isolamento.
Dentro da porção de ligação a antigénio de um anticorpo, como é bem conhecido na técnica, existem regiões de determinação de complementaridade (CDR), que interagem directamente com o epitopo do antigénio, e regiões framework (FRs), que mantêm a estrutura terciária do paratopo (veja-se, em geral, Clark, 1986; Roitt, 1991). Em ambos o fragmento Fd de cadeia pesada e o de cadeia leve de imunoglobulinas IgG, existem quatro regiões framework (FR1 através de FR4) separadas respectivamente por três regiões de determinação de complementaridade (CDR1 através de CDR3) . As CDR, e em particular as regiões CDR3, e mais particularmente a CDR3 de cadeia pesada, são amplamente responsáveis por especificidade do anticorpo. É agora bem estabelecido na técnica que as regiões não CDR de um anticorpo de mamíferos podem ser substituídas por regiões similares de anticorpos conspecífico ou heteroespecífico enquanto retêm a especificidade epitópica do anticorpo original. Isto é mais claramente manifestado no desenvolvimento e utilização de anticorpos "humanizados" em que nenhuma CDR humana é unida covalentemente às regiões FR e/ou Fc/pFc' humanas para produzir um anticorpo funcional. Veja-se, por exemplo, Patente US N° 4.816.567; 5.225.539; 5.585.089; 5.693.762 e 5.859.205. Assim, por exemplo, a Publicação Internacional PCX Número WO 92/04381 ensina a produção e utilização de anticorpos RSV murinos 24 humanizados em que pelo menos uma porção das regiões FR murinas foi substituída por regiões FR de origem humana. Tais anticorpos, que incluem fragmentos de anticorpo intactos com capacidade de ligação a antigénio, são com frequência denominados como anticorpos "quiméricos".
Assim, como será aparente a um perito na especialidade, o presente pode utilizar fragmentos F(ab')2f Fab, Fv e Fd; anticorpos quiméricos em que as regiões Fc e/ou FR e/ou CDR1 e/ou CDR2 e/ou CDR3 de cadeia leve foram substituídas por sequências homólogas humanas ou não humanas; anticorpos quiméricos de fragmento F(ab')2 em que as regiões FR e/ou CDR1 e/ou CDR2 e/ou CDR3 de cadeia leve foram substituídas por sequências homólogas humanas ou não humanas; anticorpos quiméricos de fragmento Fab em que as regiões FR e/ou CDR1 e/ou CDR2 e/ou CDR3 de cadeia leve foram substituídas por sequências homólogas humanas ou não humanas; e anticorpos quiméricos de fragmento Fd em que as regiões FR e/ou CDR1 e/ou CDR2 foram substituídas por sequências homólogas humanas ou não humanas. A presente invenção pode também utilizar os assim chamados anticorpos de cadeia simples.
Assim, a invenção pode envolver polipéptidos de numerosos tamanhos e tipos que se ligam especificamente a polipéptidos da invenção (por exemplo, SEQ ID NO: 2, ou 4-suas porções extracelulares), e complexos de ambos os polipéptidos e seus parceiros de ligação. Estes polipéptidos podem ser derivados também de fontes diferentes da tecnologia de anticorpos. Por exemplo, tais agentes de ligação a polipéptidos podem ser proporcionados pela degeneração de bibliotecas de péptidos que podem ser prontamente preparadas em solução, na forma imobilizada, como bibliotecas de apresentação de péptido de flagelos bacterianos ou como bibliotecas de apresentação de fagos. As bibliotecas combinatórias podem também ser sintetizadas de péptidos que contêm um ou mais aminoácidos. As 25 bibliotecas podem ainda ser sintetizadas de péptidos e fracções sintéticas não peptidicas.
Um método de diagnóstico de um distúrbio caracterizado por expressão aberrante de uma molécula de ácido nucleico, um produto de expressão do mesmo, ou um fragmento de um produto de expressão do mesmo, é descrito. 0 método envolve colocar em contacto uma amostra biológica isolada de um indivíduo com um agente que se liga especificamente à molécula de ácido nucleico, um produto de expressão do mesmo, ou um fragmento de um produto de expressão do mesmo, e determinar a interacção entre the agente e a molécula de ácido nucleico ou o produto de expressão como uma determinação do distúrbio, em que a molécula de ácido nucleico é um ácido nucleico de ILlRL-1 (SEQ ID NO.: 1). Numa forma de realização, o distúrbio é enfarte do miocárdio. Numa forma de realização, o distúrbio é insuficiência cardíaca.
No caso onde a molécula é uma molécula de ácido nucleico, tais determinações podem ser levadas a cabo via qualquer ensaio de determinação de ácido nucleico padrão, que incluem a reacção em cadeia da polimerase, ou ensaiar com sondas de hibridação marcadas como é exemplificado no presente documento. No caso onde a molécula é um produto de expressão da molécula de ácido nucleico, ou um fragmento de um produto de expressão da molécula de ácido nucleico, tal determinação pode ser levada a cabo via qualquer ensaio imunológico padrão utilizando, por exemplo, anticorpos que se ligam a quaisquer dos produtos de expressão do polipéptido. "Expressão aberrante" refere-se a expressão diminuída (sub-expressão) ou expressão aumentada (sobre-expressão) de quaisquer das moléculas de IL1RL-1 precedentes (ácidos nucleicos e/ou polipéptidos) em comparação com um controlo (isto é, expressão da mesma molécula num indivíduo saudável ou "normal"). Um "indivíduo saudável", como é utilizado no 26 presente documento, refere-se a um indivíduo que não está em risco de desenvolver uma patologia cardiovascular futura (veja-se discussão anterior e Harrison's Principies of Experimental Medicine, 13a Edição, McGraw-Hill, Inc., N.I.-a seguir no presente documento "Harrison's") . Indivíduos saudáveis não exibem também de outra maneira sintomas de doença. Em outras palavras, tais indivíduos, se examinados por um profissional médico, seriam caracterizados como saudáveis e livres de sintomas de um distúrbio cardiovascular ou em risco de desenvolver um distúrbio cardiovascular.
Quando o distúrbio é uma patologia cardiovascular seleccionada do grupo que consiste em hipertrofia cardíaca, enfarte do miocárdio, acidente vascular cerebral, arteriosclerose, e insuficiência cardíaca, a expressão diminuída de quaisquer das moléculas precedentes em comparação com um controlo (por exemplo, um indivíduo saudável) é indicativo da presença do distúrbio, ou indicativo do risco de desenvolver tal distúrbio no futuro. 0 valor predeterminado especifico para a patologia cardiovascular pode tomar uma variedade de formas. Pode ser valor de corte único, tal como uma mediana ou média. Pode ser estabelecido com base em grupos comparativos, tais como onde o risco num grupo definido é o dobro do risco em outro grupo definido. Pode ser um intervalo, por exemplo, onde a população testada é dividida igualmente (ou desigualmente) em grupos, tal como um grupo de baixo risco, um grupo de risco médio e um grupo de alto risco, ou em quadrantes, o quadrante mais inferior sendo indivíduos com o risco mais baixo e o quadrante mais superior sendo indivíduos com o risco mais alto. 0 valor predeterminado pode depender da população particular seleccionada. Por exemplo, uma população aparentemente saudável (nenhuma doença detectável e nenhum histórico anterior de um distúrbio cardiovascular) terá um 27 intervalo 'normal' diferente de marcadores de inflamação sistémica que terá uma população de fumadores ou uma população cujos membros tiveram um distúrbio cardiovascular anterior. Consequentemente, o valor predeterminado seleccionado pode levar em conta a categoria na qual o indivíduo está. Intervalos apropriados e categorias podem ser seleccionados com não mais que experimentação de rotina por peritos na especialidade. "Enfarte do miocárdio" é um foco de necrose que resultante da perfusão inadequada do tecido cardíaco. 0 enfarte do miocárdio geralmente ocorre com a diminuição abrupta no fluxo de sangue coronário que segue uma oclusão trombótica de uma artéria coronária anteriormente estreitada por arteriosclerose. Geralmente, o enfarte ocorre quando uma placa aterosclerótica se fissura, rompe, ou ulcera, e um trombo mural se forma levando a oclusão de artéria coronária. 0 diagnóstico de enfarte do miocárdio num indivíduo determina a necessidade de tratamento do indivíduo. Um número de testes de laboratório, bem conhecidos na técnica, é descrito, por exemplo, em Harrison's. Geralmente, os testes podem ser divididos em quatro categorias principais: (1) índices não específicos de necrose de tecido e inflamação, (2) electrocardiogramas, (3) alterações enzimáticas no soro (por exemplo, níveis de creatina fosfoquinase), e (4) formação de imagem cardíaca. Um perito na especialidade poderia facilmente aplicar quaisquer dos testes precedentes para determinar quando um indivíduo está em risco, está a sofrer, ou sofreu, um enfarte do miocárdio. Além disso, níveis aumentados de expressão de uma molécula de ácido nucleico de IL1RL-1, ou um produto de expressão do mesmo, são também factores de risco importantes. A insuficiência cardíaca é uma síndrome clínica de diversas etiologias ligadas ao denominador comum de 28 bombeamento cardíaco prejudicado e é caracterizada pela falha do coração em bombear sangue proporcionalmente aos requisitos dos tecidos metabolizantes, ou fazê-lo somente a partir de uma pressão de preenchimento de elevação. A invenção será mais completamente entendida por referência aos seguintes exemplos. Estes exemplos, no entanto, são meramente destinados a ilustrar as formas de realização da invenção e não são para serem interpretadas como limitativas do âmbito da invenção.
Exemplos EXEMPLO 1.
Protocolos experimentais: Materiais e Métodos Dispositivo de esforço mecânico
Experiências de sobrecarga mecânica de cardiomiócitos geralmente têm sido realizado pelo estiramento de células sem controlo do ciclo cardíaco, uma abordagem que não permite a distinção entre sobrecarga mecânica em contracção versus relaxação. No presente estudo, os inventores desenharam e construíram um único sistema experimental que permite esforços mecânicos controlados exactamente bem como estimulação eléctrica por marca-passo em cardiomiócitos cultivados, para investigar, entre outras coisas, como a mecanotransdução de cardiomiócito é regulada pelo ciclo cardíaco, e identificar genes que estão envolvidos em tal regulação. 0 Dispositivo de estimulação por marca-passo esforço. A abordagem para estimulação mecânica utilizou um aparelho que tem múltiplas prensas que entram em contacto com o lado inferior de membranas de elastómero de silicone para aplicar um perfil de esforço biaxial espacialmente isotrópico à membrana (Schaffer JL, et al., J Orthop Res, 1993,12:709-719; e Pedido de patente U.S. provisório depositado em 16 de Julho 1999 intitulado " AN APPARATUS FOR STUDYING MYOCARDIAL MECHANICAL OVERLOAD HYPERTROPHY AND USES THREFOR, de Richard T. Lee, e que porta o documento de 29 procurador n°. 100038,130 e correio expresso n°. EL110243781US). Seis membranas individuais de 78 mm podem ser esticadas de uma vez com amplitudes variantes de esforço pelo controlo de deslocamento de cada prensa com um motor de passo. Os esforços de Green medidos são exactos até ~ ± 0,25 % em esforços desde 1-14 % (Cheng GC, et ai., Circ Res, 1997, 80:28-36; Brown TD, J Biomechanics, 2000, 33:3-14). Por todo este estudo, 8 % de esforço biaxial foi utilizado.
Para controlar o ritmo de esforço mecânico com relação ao ciclo cardíaco, o computador estimulou cada placa electricamente, e controlou: a fase entre o esforço mecânico e o impulso eléctrico, a duração do impulso eléctrico, e a voltagem do impulso. Além disso, os impulsos eléctricos tinham polaridade alternante para minimizar efeitos electroquímicos tais como gradientes pH nos eléctrodos. As duas saídas foram cada uma ligada a um conjunto individual de eléctrodos em cada placa, as placas foram estimuladas em paralelo com um resistência de aproximadamente 500 ohms por placa.
As fontes de voltagem positiva e negativa foram proporcionadas por dois fornecimentos de potência (6545A, Hewlett Packard Company, Paio Alto, CA) . O circuito de controlo foi dividido em duas partes: um circuito de alta voltagem e um circuito de baixa voltagem ou sinal digital. O circuito de alta voltagem foi uma ponte que comutou a saída com base no sinal de entrada. O circuito de baixa voltagem aceitou dois sinais de controlo desde o computador e aceitou a largura de pulso desde uma resistência variável, que controlou tanto a ponte de voltagem positiva e negativa. O circuito de baixa voltagem permitiu um pulso de voltagem entre 0-120V DC de amplitude e 2-37 ms de duração. Luzes proporcionado monitorização contínua dos pulsos, e a ritmo dos circuitos e calibração foram validados por osciloscópio. 30
Os eléctrodos para cada placa foram dois eléctrodos de fio de AgCl2 em forma de arco na base da superfície interna da placa, logo acima da membrana deformável. Os eléctrodos foram preparados de antemão, esterilizados com etanol, e colocados na placa logo antes de cada experiência para minimizar a toxicidade potencial da prata. Utilizando este método nenhuma morte celular ou separação foi observada em experiências de 24 h. Cada arco era de 120 graus; os inventores realizaram duas análises de elemento finito dimensional para estimular a uniformidade do campo de potencial com esta configuração. Estes cálculos estimam uma variação espacial no campo de potencial de {raiz quadrada média} = 29 %. Assim, este sistema proporciona esforço mecânico biaxial altamente uniforme, com uma variação relativamente pequena no campo de voltagem.
Protocolos de estimulação mecânica. Os inventores impuseram esforço somente durante o primeiro terço do ciclo cardíaco por meio de estimulação eléctrica para o esforço imposto durante a "fase sistólica", e somente durante um terço do ciclo cardiaco na fase de relaxação para o esforço imposto durante a "fase diastólica," respectivamente. As condições utilizadas neste estudo foram: (1) controlo; (2)esforço, sem estimulação por marca-passo; (3) estimulação por marca-passo, sem esforço; (4) esforço imposto durante a fase sistólica; e (5) esforço imposto durante a fase diastólica.
Miócitos ventriculares de ratos neonatais (NRVM) de ratos Sprague-Dawley de 1 dia de idade foram isolados por meio dos métodos anteriormente descritos (Springhom JP, e Claycomb WC. , Biochem J, 1989;258:73-78; Arstall MA, et al., J Mol Cell Cardiol, 1998, 30:1019-25). NRVM foram semeados em placa nas placas revestidas com membrana a uma densidade de 2.000.000 células/placa em DMEM contendo 7 % de FCS e incubadas de 24 h. Confluência celular aproximada foi de 85-90 %. NRVM foram então colocadas em repouso por 31 meio de lavagem com 10 ml de solução salina equilibrada de Hank (HBSS, 138 mM de NaCl, 5,3 mM de KC1, 4,0 mM de NaHC03, 1,3 mM de CaCl2, 0,5 mM de MgCl2, 0,4 mM de MgS04, 0,4 mM de KH2P04, 0,3 mM de Na2HP04, 5,6 mM de glucose; Life Technologies, Inc. , Rockville, MD) duas vezes e incubação com 26 ml de DMEM contendo 0,2 % de FCS durante 48-72 horas.
Nestas condições de cultura de célula, as células batem a 40-60 batidas/minuto. Nesta taxa, os inventores observaram competição desprezível quando estimulação por marca-passo a uma taxa de 70 batidas/minuto. Os inventores realizaram experiências de ensaio de captura; nove localizações em cada placa foram colhidas amostras. A eficiência de captura foi similar em todas as localizações, e a captura máxima ocorreu a 60 V e acima com 10 ms de largura de pulso. Portanto, uma voltagem de 70 V com 10 ms de duração de impulso a uma taxa de 1,2 Hz (70 batidas/ minuto) foi seleccionada. Sob estas condições os inventores não observaram separação parcial de células.
Perfil de transcrição. A experiência de microarranjo de ADN foi realizada com miócitos cardíacos de rato neonatal cultivados sobre membranas recobertas com fibronectina com meio livre de soro durante 48 horas. Células foram deformadas com um 8 % de deformação imposta somente durante sístole durante um período de 30 minutos, e ARN foi preparado após 6 horas de condições subsequentes sem esforço e condições sem estimulação por marca-passo. Este ponto de tempo baseou-se em estudos anteriores que demonstram que o gene tenascina (controlo positivo para cardiomiócitos) é induzido neste período de tempo. O Experiência de hibridação de microarranjo de ADN foi realizado utilizando o Affymatrix GeneChip RGU34A (Affymetrix, Inc., Santa Clara, CA). Os dados foram analisados utilizando o software Affymatrix. 32
Análises Northern. Os clones de ADNc for genes expressos diferencialmente foram obtidos por meio de PCR utilizando as sequências de GenBank. Cada clone foi sequenciado a partir de tanto as extremidades 5' como 3' para confirmar a identidade. Elementos positivos no microarranjo de ADN foram confirmados por meio de análise de hibridação de Northern blot em pelo menos três experiências independentes utilizando três diferentes fontes de NRVMs. 0 ARN total foi isolado pelo tiocianato de guanidio e método fenol e clorofórmio (Chomcyznski, et al., Anal. Biochem., 1987, 162:156-159). Para o Northern blotting, 15 pg de ARN foi carregado num gel de 1,0 % de agarose-formaldeido (2,0 mol/1), transferido a uma membrana de nylon (Amersham Pharmacia Biotech AB, Piscataway, NJ), e reticulado com UV com um UV Stratalinker (Stratagene, Inc., La Jolla, CA). Cada sonda foi hibridada com solução de Ex- pressHyb (Clontech Labs., Inc . , Paio Alto, CA) a 68 °C durante 1 hora. A membrana foi lavada com 2 x SSC, 0,05 O. o de solução SDS durante 30 a 40 minutos e três vezes a temperatura ambiente e 0,1 x SSC, 0,1 % de solução de SDS com agitação continua a 50 °C durante 40 minutos. A membrana foi exposta a filme a -80 °C, e radiografias foram examinadas e analisadas com o software Óptimas 5.0 (Óptimas Co./Media Cybernetics, Silver Springs, MD). Unidades densitométricas foram normalizadas para a subunidade ribosomal 28S corada com etidio na membrana.
Resultados. A Figura 1 mostra o curso de tempo (precoce, esquerda; tardio, direita) dz indução de expressão de ARNm IL1RL-1 por meio de esforço mecânico cíclico de 8 % em miócitos cardíacos neonatais em cultura. A indução máxima ocorre a 3 horas e é sustentada durante 15 horas. A Figura 2 mostra os efeitos de 8 % de esforço mecânico, bloqueio de receptor de angiotensina (ARB, CP-19116, 100 nM), angiotensina II (Ang II, 50 nM) , 33 interleucina-1 p (IL-1 p, 10 ng/ml), e forbol éster (PMA, 200 nM) durante 3 horas na indução de expressão de ARNm de IL1RL-1 em miócitos cardíacos de rato neonatal cultivado. A indução de expressão de ARNm de IL1RL-1 por meio de esforço não foi bloqueada por meio de bloqueio de receptor de angiotensina; além disso, o tratamento com angiotensina II não induz a expressão de ARNm de IL1RL-1. O tratamento com tanto IL-1 β como PMA foram associados a uma indução de expressão de ARNm de IL1RL-1 na ausência de esforço mecânico. A Figura 3 mostra os efeitos de 8 0. 0 de esforço mecânico, peróxido de hidrogénio (H202 100 uM) e 0 antioxidante, TIRON (10 mM) na indução de expressão de ARNm de ILlRL-1. Ao contrário da expressão de ARNm de the gene de Tenascina-C induzido mecanicamente que é induzido por H2O2 na ausência de esforço mecânico e bloqueada por meio de TIRON, H2O2 não induz IL1RL-1 na ausência de esforço e bloqueia a indução induzida por esforço de IL1RL-1. TIRON atenuou ligeiramente a expressão de ARNm de IL1RL-1 na ausência e presença de esforço. A Figura 4 mostra os efeitos de actinomicina D (5 pg/ml, esquerda) e ciclohexamida (10 pg/ml, direita) sobre a indução de expressão de ARNm de IL1RL-1 em 8 % de esforço mecânico. Actinomicina D e ciclohexamida foram aplicados durante esforço mecânico. A actinomicina D bloqueou a indução de expressão de ARNm de IL1RL-1 a tanto 2 como 4 horas sugerindo que a indução de IL1RL-1 em resposta ao esforço é devido a transcrição aumentada de IL1RL-1. A inibidor de síntese de proteína, ciclohexamida bloqueada a indução de expressão de ARNm de IL1RL-1 em resposta a esforço sugerindo que nova síntese de proteína é requerida para a indução de expressão de ARNm de IL1RL-1. A Figura 5 mostra os efeitos de 8 % de esforço mecânico sozinho e em combinação com interleucina-1 β (IL-1 β, 10 ng/ml), e forbol éster na ausência de esforço (PMA, 34 100 ng/ml) sobre a expressão de ARNm de IL1RL-1 em miócitos cardíacos neonatais cultivados. Tanto IL-1 β e esforço mecânico sozinho induziram a expressão de ARNm de IL1RL-1, mas a indução de IL1RL- 1 por meio de esforço mecânico na presença de IL-1 β não foi aumentada adicionalmente sugerindo que o esforço mecânico e IL-1 β não actua de uma maneira sinérgica ou aditiva sobre a indução de IL1RL-1. A indução de expressão mais forte de ARNm de IL1RL-1 é vista com PMA. A classificação de potência para a a indução de expressão de ARNm de IL1RL-1 é PMA>esforço>IL-l β. A Figura 6 mostra miócitos cardíacos neonatais cultivados que foram expostos a 8 % de esforço durante 0, 1, 3, 6, 9 horas. ARN total foi isolado utilizando um RNeasy kit. Cinco pg de ARN total foram separados por tamanho em 1 % de gel de agarose-formaldeído e transferido a membrana de nylon. Após reticulação com luz UV, a membrana foi hibridada com sonda marcada com 32P especifico para subunidade B de V-ATPase. A membrana foi então exposta a filme de raio X durante 3 horas a -80 °C com um rastreio de intensificação. EXEMPLO 2.
Introdução:
Citocinas e Lesão cardíaca. Citocinas activadas por stress participam de muitas formas de lesão cardíaca e condições fisiopatológicas, a mais caracterizada sendo factor de necrose tumoral-α, interleucina-1 e interleucina-6. Estas moléculas são não expressas constitutivamente no coração normal, mas são rapidamente induzidos durante isquemia e reperfusão ou sob sobrecarga hemodinâmica, sugerindo que desempenham um papel importante na resposta de miocárdio inicial a stress, lesão ou estímulos de crescimento (Mann DL, Citocina and Growth Factor Reviews. 1996;7:341-354; St. John Sutton MG, et al. Circulation. 2000; 101:2981-2988). No entanto, citocinas também têm mostrado que são expressas de maneira estável em condições 35 patológicas do miocárdio que incluem doença cardíaca isquêmica e insuficiência cardíaca e são associadas a um mau prognóstico (Pulkki KJ, et al. . Annals of Medicine. 1997; 29:339-343 ; Kubota T, et al Proc Natl Acad Sei. 1998;95:6930-6935 ; Aukrust P, et al. Am J Cardiol 1999;83:376-382; MacGowan GA, et al. Am J Cardiol 1997;79:1128-1132; Roig E, et al. Am J Cardiol 1998;688-690; Tsutamoto T, et al. JAm Coll Cardiol 1998;31:391-398; Prabhu SD, et al. Circulation. 2000; 101:2103-2109; Murray DR, et al.. Annu Rev Immunol. 2000;18:451-494).
Sinalização de interleucina-1 através de the receptor de interleucina-1 é um evento precoce em sinalização de citocina inflamatória em muitos sistemas diferentes (Trehu EG., Clin Câncer Res. 1996; 8:1341-51). Em lesão cardíaca, a interleucina-6 é produzida por miócitos cardíacos secundários para estimulação com interleucina-1, factor de necrose tumoral-α, ou lipopolissacárido e tem sido detectada na linfa pós-isquémica durante reperfusão de miocárdio isquémico (Gwechenberger M, et al. Circulation 1999; 99:546-551). Recentemente reconhecido é a expressão potencial de citocinas anti-inflamatórias neutralizantes em doença cardíaca secundária a sinalização de interleucina-1. Interleucina-4 e interleucina-10 podem suprimir a síntese de factor de necrose tumoral-α e potência a libertação de receptores de factor de necrose tumoral solúveis, que são "sumidouros" (do inglês sinks) de ligandos para o factor de necrose tumoral (Joyce DA., 1994; Eur. J. Immunol. 11:2699-705) . Interleucina-10 aumenta em pacientes com insuficiência cardíaca (Yamaoka M, et al. Jpn Circ J. 1999;63:951-956) e níveis séricos de interleucina-10 aumentam quando os níveis séricos de factor de necrose tumoral-α aumentam em pacientes com cardiomiopatia dilatada (Ohtsuka T, et al. J Am Coll Cardiol. 2001;37:412-417). T1/ST2 (IL1RL-1): Um novo receptor induzido mecanicamente. Os inventores identificaram uma nova via de 36 sinalização activada por stress potencial no coração: regulação da indução de um gene do membro da familia da interleucina-1, T1/ST2. Pouco é conhecido da indução, sinalização e função de T1/ST2 em qualquer tipo de célula e T1/ST2 foi mostrado em áreas de investigação separadas que têm duas funções aparentemente não relacionadas. Um destes é regulação de crescimento e a outra é modulação imune. Tanto o crescimento compensatório hipertrófico como a modulação imune/inflamatória estão envolvidas na patofisiologia de doenças cardiovasculares.
Crescimento. 0 gene de T1/ST2 foi primeiro identificado por sua indução seguindo estimulação de soro de fibroblastos de ratinho 3T3 em repouso, sugerindo que o gene de T1/ST2 participa na regulação de crescimento (Tominaga S., FEBS Letters 1989;258: 301-304). O mesmo grupo posteriormente identificou um transcripto mais longo que consiste em domínios transmembranar e citoplasmático homólogo ao receptor de interleucina-1 de comprimento completo (Yanagisawa K, et al. FEBS Letters. 1993;318:83-87) .
Imunidade. T1/ST2 é expresso em célula T auxiliar 2, mas não célula T auxiliar 1, células do sistema imune adaptativo, que produzem interleucina-4, interleucina-5 e interleucina-10 (Yanagisawa Kl, et al. J Biochem. 1997;121:95-103; Coile AJ, et al. J Exp Med. 1999; 190:895-902) . As células T auxiliares 2 mediam respostas benéficas à infecção, mas são prejudiciais no desenvolvimento de alergia e asma. Existe uma forte correlação entre s expressão de T1/ST2 e a produção de interleucina-4 em células T auxiliares 2 (Coile AJ, et al. J Exp Med. 1999; 190:895-902). T1/ST2 desempenha um papel crítico em diferenciação a e activação de célula T auxiliar 2, mas não células T auxiliares 1 (0'Neill LAJ, et al. Immunology Today. 2000;21:206-209). 37 A inibição de sinalização de T1/ST2 atenuou a indução mediada por célula T auxiliar 2 de respostas inflamatórias de eosinófilos em pulmão e inibiu a secreção de citocina desde células T auxiliares 2 sem modificar secreção de interferão gama desde Células T auxiliares 1 (Coile AJ, et al. J Exp Med. 1999; 190:895-902). Estes estudos indicam que a expressão de T1/ST2 pode alterar o perfil de citocina em favor de expressão de interleucina-4, interleucina-5 e interleucina-10. Interleucina-10 tem recentemente mostrado que tem efeitos anti-inflamatórios no contexto de lesão cardíaca (Ohtsuka T, et ai. J Am Coll Cardiol. 2001; 37: 412-417). De maneira similar, a ausência de expressão de T1/ST2 poderia resultar num desvio em direcção a expressão de interferão gama, que pode ser prejudicial em seguida a lesão do miocárdio.
Tomados juntamente, o envolvimento de T1/ST2 em respostas de crescimento e função imune acoplada com o reconhecimento clínico do papel de citocinas na resposta inflamatória a isquemia/reperfusão são sugestivos de que A activação de T1/ST2 é uma via de sinalização activada por crescimento ou stress que contribui para o crescimento do miocárdio e remodelamento.
Fenótipo de Ratinhos T1/ST2 Null. (Townsend MJ, et al. J Exp Med. 2000;191:1069-1075). A ausência de T1/ST2 em ratinhos T1/ST2 null não compromete sua função imune basal na ausência de desafio imune. No entanto, ratinhos T1/ST2 null têm uma capacidade deteriorada de gerar IL-4, IL-5, e IL-10, mas não IFN-γ (uma citocina Thl) e para gerar uma resposta inflamatória de célula T auxiliar 2 durante infiltração de eosinófilos no pulmão (uma resposta Th2).
Os inventores começaram a estudar a indução de T1/ST2 em miócitos cardíacos e seu envolvimento em sinalização de sobrevivência/morte dentro do contexto das vias de sinalização de miócitos. Estudos preliminares apresentados a seguir mostram que T1/ST2 é induzido em miócitos 38 cardíacos em resposta a interleucina-1 e esforço mecânico e que a indução de T1/ST2 por interleucina-1 pode ser dependente da activação de NF-KB. ARNm de T1/ST2 é também induzido em células de músculo liso vascular de ser humano adulto em resposta a interleucina-1. Tl/Proteína ST2 é expressa no coração do ratinho precocemente após isquemia do miocárdio in vivo bem como em tecido de aorta humana de pacientes com placa instável.
Resultados: ESTUDOS IN VITRO. Os seguintes estudos demonstram a indução de T1/ST2 por meio de esforço mecânico e interleucina-1, possivelmente através de activação de NF-KB. Ambos os transcriptos de T1/ST2 (isto é, IL1RL-1S-solúvel- e ILlRL- 1M -membrana-) são induzidos por esforço em miócitos cardíacos embora o transcripto mais abundante fosse a isoforma solúvel. ARNm de T1/ST2 é induzido por meio de esforço mecânico em miócitos cardíacos neonatais cultivados (Figura 8). ARNm de T1/ST2 é induzido por meio de esforço mecânico em miócitos cardíacos neonatais cultivados. Miócitos ventriculares de ratos neonatais foram isolados por meio de digestão de colagenase, semeados em placas com membrana de silicone revestidas com fibronectina a uma densidade de 3,5 milhões de células/placa em 13 ml de meio como foi descrito anteriormente (Yamamoto K, et al. J Biol Chem. 1999;274:21840-21846). Esta técnica proporciona culturas com > 95 % de miócitos. A deformação mecânica foi aplicada utilizando um dispositivo que proporciona esforço cíclico biaxial uniforme como foi descrito anteriormente (Yamamoto K, et al. J Biol Chem. 1999; 274:21840-21846). O ARN foi extraido (Qiagen) e Northern blotting foi realizado utilizando como uma sonda um fragmento de PCR de 600 pb marcado com 32P específico para T1/ST2 de rato. A indução máxima ocorre a 3 horas, é sustentada durante 9 horas e declina em 15 horas. 39
Tanto a interleucina-1 p como o esforço mecânico cada um induz ARN de T1/ST2 em miócitos cardíacos (Figura 9). É mostrada a indução de T1/ST2 por interleucina-1 e esforço. Os inventores também encontraram que a indução de T1/ST2 por meio de esforço mecânico na presença de interleucina-1 β foi não adicionalmente aumentada sugerindo que interleucina-1 não sensibiliza miócitos para os efeitos de esforço mecânico (ou vice versa) na indução de T1/ST2. 0 ponto de tempo de 1 hora foi incluído no caso de que a indução por esforço seja saturada a 3 horas e, portanto, mascaare um efeito aditivo de interleucina-1 β. São mostrados nas duas pistas da direita os efeitos de forbol éster (PMA) a 1 e 3 horas. A ordem de classificação de potência para a indução de expressão de ARNm de T1/ST2 é PMA>esforço> interleucina-1 β. Uma vez que a interleucina-1 β sinaliza através de NF-KB e PMA através de PKC estes resultados sugerem que a activação NF-KB e PKC ambas participam na indução de T1/ST2. T1/ST2 pode ser um gene alvo de NF-KB em miócitos cardíacos através de sinalização interleucina-1/receptor de interleucina-1 (Figura 10). Observado anteriormente pelos inventores (Yamamoto K, et al. J Biol Chem. 1999; 274:21840-21846), o esforço mecânico de miócitos cardíacos activa NF-KB. Para investigar o papel de NF-KB em interleucina-1 β e indução por esforço de ARN de T1/ST2, os inventores sobre-expressaram lKBa, que diminui actividade de ligação de ADN de NF-KB. Miócitos cardíacos cultivados foram infectados com vector de adenovirus de sobre-expressão de lKBa ou com vector de controlo de β-galactosidase e expostos durante 4 horas a esforço mecânico cíclico de 8 % ou interleucina-1 (lOng/ml). 0 ARN foi analisados por meio de Northern blotting com sonda de ADNc IL1RL-1 de marcado com 32P. Expressão ectópica de kBa bloqueou a indução de interleucina-1 β de ARNm de T1/ST2-1 e parcialmente bloqueou a indução por esforço de expressão de ARNm de 40 T1/ST2 em comparação com indução de T1/ST2 em células tratadas com o vector de controlo de β-galactosidase. Estes resultados sugerem que T1/ST2 é um gene alvo precoce de NF-KB através de sinalização de interleucina-l/receptor de interleucina-1. Em contraste, vias além de activação de NF-KB pode estar envolvidas na indução de ARN de T1/ST2 por meio de esforço mecânico. ARNm de T1/ST2 é também induzido por interleucina-1, mas não PMA ou factor de necrose tumoral (TNF) em células de músculo liso vascular de ser humano adulto.
Além dos resultados observados anteriormente, os inventores mostraram que T1/ST2 é induzido secundário a activação de NF-KB por interleucina-1 e NF-KB é ligado a sobrevivência miócito cardíaco. Estudos in vitro adicionais são realizados para confirmar que a activação de T1/ST2 é ligada a crescimento e sobrevivência celular. ESTUDOS IN VIVO.
Materiais e Métodos
Enfarte do miocárdio experimental em ratinhos.
Procedimentos experimentais em ratinhos foram aprovados pelo Comité permanente da Escola de Medicina de Harvard sobre Animais. O enfarte do miocárdio experimental foi criado em ratinhos por ligação da artéria coronária como foi descrito anteriormente (13). Corações foram colhidos de ratinhos 1 e 3 dias após a ligação da artéria coronária seguido por fixação de perfusão do coração com Z-Fix (Anatech LTD) . Os corações foram então fixos por imersão em Z-Fix durante a noite a 4 °C. Após desidratação em soluções de etanol graduadas, os corações foram colocados em Histo-Clear (National Diagnostics) e incrustados em parafina. Secções de tecido de cinco micrones foram desparafinizados, rehidratados, incubadas com 3 % de peróxido de hidrogénio, enxaguados em água seguido por solução salina tamponada com fosfato. Secções foram bloqueadas, incubadas em anticorpo primário de ST2 anti-ratinho 1:50 (Morwell Diagnostics) e 41 1:100 anticorpo secundário conjugado de HRP anti-ratinho (Vector Laboratories). Lâminas foram contra-coradas com hemotoxilina e eosina.
Estudos de pacientes e ELISA para ST2. estudo HEART O estudo Healing and Early Afterload Reducing Therapy (HEART) foi um ensaio clinico randomizado, controlado com placebo de dupla ocultação que recrutou 352 pacientes com enfarte agudo do miocárdio (EM) de 36 centros nos Estados Unidos e Canada. Homens e mulheres com mais de de 21 anos de idade que tinha sofrido um EM dentro de 24 horas foram elegíveis. Os critérios de inclusão e exclusão, e detalhes do desenho do ensaio clínico foram anteriormente descritos (Pfeffer M.Um., et al., Circulation, 1997, 95:26 43-26 51; Greaves S.C., et al., Am. J. Cardiol, 1997, 80:442-448; Solomon S.D., et al., Ann. Intern. Med., 2001, 134:451-458; Aikawa Y., et al., Am. Heart J, 2001, 141:234-242). Amostras de sangue em série dos dias 1, 14, e 90 após o enfarte do miocárdio de 69 pacientes escolhidos randomicamente no ensaio clínico Heart estavam disponíveis para este estudo. T1/ST2 solúvel foi ensaiada com um ensaio de ELISA sanduíche monoclonal duplo que foi descrito anteriormente (Kuroiwa K., et al., Hybridoma, 2000, 19:151-159). O ensaio está comercialmente disponível (MBL International, Watertown, MA). estudo PRAISE O estudo Prospective Randomized Amlodipine Survival Trial (PRAISE) foi um estudo prospectivo em grande escala de amlodipina em pacientes com insuficiência cardíaca devido a doença na artéria coronária. Os resultados deste ensaio clínico foram nulos para um benefício de Amlodipina em insuficiência cardíaca grave. Amostras de sangue foram retiradas no início deste estudo antes de terapêutica e então duas vezes mais durante o estudo. T1/ST2 solúvel foi ensaiada como foi descrito anteriormente. Um dos testes de sangue actuais chave para insuficiência cardíaca é péptido natriurético cerebral 42 (ΒΝΡ) . Os inventores examinaram se níveis de T1/ST2 em insuficiência cardíaca pacientes estavam alterados e se os níveis de T1/ST2 correlacionados com níveis de BNP nestes pacientes.
Estatísticas. Cada experiência in vítro mostrada foi realizada um mínimo de três vezes. Os valores são médias ± SEM. Os dados foram analisados por Análise de variância de um factor, ou ANOVA de medições repetidas, com análises de comparação múltiplas de Bonferroni post hoc onde fosse apropriado. Regressão linear foi realizada nos valores de soro com valores transformados em log devido a distribuições de parâmetro não normais. Valores de p <0,05 foram considerados estatisticamente significativos. Resultados:
Expressão in vivo de Tl/Proteina ST2 em Enfarte do miocárdio em Ratinhos. Para avaliar a expressão de T1/ST2 em miocárdio lesionado, ratinhos foram submetidos a enfarte do miocárdio experimental através de ligação da artéria coronária. A Figura 11 mostra a expressão de proteínas de T1/ST2 utilizando imunohistoquímica em corações de ratinho 1 e 3 dias após o enfarte do miocárdio. Coloração positiva foi vista 1 dia após o enfarte do miocárdio (pós-EM) em todas as regiões do ventrículo esquerdo, normal, enfarto e zonas de borda, mas não a 3 dias após o enfarte do miocárdio. Nenhuma coloração para T1/ST2 foi observada em 1 e 3 dia controlos operados de forma simulada. Estes resultados sugerem que Tl/Proteína ST2 é expressa em resposta a lesão aguda durante a fase precoce de remodelamento pós-enfarte antes da migração de macrófagos no enfarto e zonas de borda vistas a 3 dias. 0 anticorpo monoclonal utilizado para estes estudos não distingue entre formas solúvel e de mebrana de T1/ST2. T1/ST2 solúvel é aumentada na circulação sistémica de pacientes um dia após enfarte do miocárdio. 43
Uma vez que T1/ST2 solúvel é altamente induzida em miócitos cardíacos, e Tl/Proteína ST2 é altamente expressa em miocárdio de ratinho em seguida ao enfarte do miocárdio experimental, os inventores hipotetizaram que T1/ST2 solúvel é aumentada na circulação sistémica de pacientes em seguida a enfarte do miocárdio. Métodos e Resultados: Utilizando um ensaio de ELISA sanduíche monoclonal duplo, os inventores ensaiaram amostras de sangue de 69 participantes do Estudo Heart no dia de enfarte do miocárdio (dia 1), bem como dia 14 e dia 90 após o enfarte. Como é mostrado na Figura 12a, Tl/Proteína ST2 sistémica foi significativamente aumentada um dia após enfarte do miocárdio (média ± SEM, 3,8 + 0,4 ng/ml, p<0,001; intervalo, de 0,32 a 17,42 ng/ml) em comparação com dia 14 (média ± SEM, 0,98 ± 0,06 ng/ml; intervalo, de 0,25 a 3,42 ng/ml) e dia 90 (média ± SEM, 0,79 ± 0,07 ng/ml; intervalo, de 0,02 a 3,53 ng/ml; dia 14 vs. dia 90, P = NS) . Valores médios no dia 90 foram similares a valores médios publicados para controlos saudáveis (Kuroiwa K., et al., Hybridoma, 2000, 19:151-159). Níveis de Tl/Proteína ST2 sistémica correlacionaram-se positivamente com níveis pico de creatina quinase (r = 0,41, p < 0,001), mostrados na Figura 12b. Níveis de proteína ST2 sistémica altos foram também associados a fracção de ejecção baixa um dia após o enfarte do miocárdio como é mostrado em análise de quartil (p = 0,03) na Figura 12c.
Conclusões: Estes resultados sugerem uma regulação coordenada entre a extensão da lesão do miocárdio e síntese e secreção de T1/ST2 solúvel na circulação sistémica no quadro clinico de enfarte do miocárdio. T1/ST2 solúvel é aumentada na circulação sistémica de pacientes com insuficiência cardíaca crónica grave. Este estudo testou a hipótese de que níveis de T1/ST2 solúvel no soro de pacientes com insuficiência cardíaca crónica grave 44 são associados a níveis de BNP, ProANP e norepinefrina, neurohormonas que são aumentados em insuficiência cardíaca. Métodos e Resultados: Amostras de soro, variáveis clínicas e níveis de neurohormona do subestudo neurohormona do ensaio clínico de insuficiência cardíaca Prospective Randomized Amlodipina Survival Evaluation 2 estudo (PRAISE-2) (Associação Cardíaca de Nova Iorque, classe funcional III ou IV, critério de avaliação: mortalidade ou transplantação) foram utilizadas. 0 estudo PRAISE-2 foi um estudo multicéntrico, randomizado, de dupla ocultação, de grupo paralelo controlado por placebo para avaliar os efeitos de amlodipina 10 mg/dia na sobrevivência em pacientes com insuficiência cardíaca congestiva de um etiologia não isquémica. O ensaio clínico consistia em -pacientes recrutado de 240 locais dos Estados Unidos e Canada. 0 subestudo neurohormona consistia em 181 pacientes recrutado de 26 centros participatantes no estudo principal. Tanto o estudo proncipal PRAISE-2 como o subestudo neurohormonal foram aprovados pelos comités de supervisão institucional das instituições participantes. Pacientes foram elegíveis se tinha pelo menos 18 anos de idade, tinham insuficiência cardíaca de uma etiologia não isquémica, sintomas no repouso ou sob exercício mínimo (Associação Cardíaca de Nova Iorque, classe funcional III ou IV) e uma fracção de ejecção ventricular esquerda inferior a 30 %. Todos os pacientes estavam em tratamento com inibidores de ACE e digoxina durante pelo menos 3 meses. Pacientes foram excluídos se tinham uma história recente ou remota de angina.
Ensaios para T1/ST2, Neurohormonas e medição de Stress oxidativo. Amostras de sangue foram avaliadas na avaliação inicial e 2 semanas (Quadro 1) . T1/ST2 solúvel foi medida com um método de ELISA sanduíche de anticorpo monoclonal duplo (Medicai & Biological Laboratories Co., Ltd., Nagoya, Japão) de acordo com a instrução do fabricante. Em resumo, 45 as amostras de soro ou padrões foram incubados nas micropoços recobertas com anticorpo de T1/ST2 anti-humano. Após lavagem, anticorpo de T1/ST2 anti-humano conjugado com peroxidase foi adicionado no micropoço e incubadas. Após outra lavagem, o substrato de peroxidase foi adicionado e a densidade óptica a 450 nm foi determinada. Catecolaminas em circulação (norepinefrina, epinefrina, dopamina), angiotensina II, péptidos natriuréticos (péptido natriurético pró-atrial (Pro- ANP), péptido natriurético cerebral (BNP)) e índices de stress oxidativo (malondialdeído, adrenolutina) foram medidos como foi descrito anteriormente (Dhalla KS, et al., Mol Cell Biochem, 1989;87:85-92; Moe GW, et al., Am Heart J, 2000;139: 587-95). Medições em soro de T1/ST2 foram realizadas nas amostras de 162 pacientes obtidos no registo do ensaio clínico e de 135 dos mesmos pacientes obtidos 2 semanas após o registo do ensaio clinico. Niveis de avaliação inicial de T1/ST2 correlacionados com níveis de avaliação inicial de BNP (r = 0,3511, p < 0,0001), níveis de avaliação inicial de ProANP (r = 0,3598, p < 0,0001) e níveis de avaliação inicial de norepinefrina (r = 0,3854, p < 0,0001) (Quadro 2). A mudança em T1/ST2 (níveis de T1/ST2 a 2 semanas menos níveis de T1/ST2 no registo do ensaio clínico) foi significativo como um prognosticador univariado de mortalidade ou transplantação (p = 0,048) como foi avaliação inicial de BNP (p < 0,0001) e avaliação inicial de ProANP (p < 0, 0001) (Quadro 3) . Em modelos multivariados que incluem BNP e ProANP, a mudança em T1/ST2 permaneceu significativa como um prognosticador independente de mortalidade ou transplantação independente de BNP e ProANP (Quadro 4).
Quadro 1, Avaliação inicial: Características_ A. Todos os pacientes N_Mediana Percentil 5° Percentil 95°
Avaliação inicial ST2 (ng/mL) 161 0,24 0,16 0,70
Avaliação inicial BNP (pmol/L) 162 56,0 3,70 264,30 46
Avaliação inicial ProANP (pg/L) Norepinef rina (pg/rtiL)
Dopamina (pg/rtiL) 162 1778,50 531,00 5615,00 158 401,58 165,90 1096,00 158 39,06 4, 22 398,40 47(cont.) A. Todos os pacientes N Mediana Percentil 5o Percentil 95° Epinefrina (pg/mL) 158 54, 92 11,64 139,90 Angiotensina II (pg/mL) 157 22,60 7, 00 67,30 Adrenolutina (ng/mL) 156 22,84 4, 31 369,31 Creatinina (mmol/L) 158 1, 10 0, 80 1, 90 Idade (anos) 157 59,9 32,5 78,2 índice de massa corporal (kg/mm2) 157 27,6 20,4 39, 7 LV Fracção de ejecção 158 22,0 11,0 30,0 B. Pacientes Com Amostras de sangue na Avaliação inicial e Semana 2 N Mediana Percentil 5o Percentil 95° Avaliação inicial ST2 (ng/mL) 135 0, 24 0, 15 0, 81 Avaliação inicial BNP (pmol/L) 135 54, 90 3, 30 264,30 Avaliação inicial ProANP (pg/L) 135 1788,00 488,00 4788,00 Norepinefrina (pg/mL) 130 395,05 171,70 1118,00 Dopamina (pg/mL) 130 64, 02 4, 32 405,50 Epinefrina (pg/mL) 130 56,07 12,24 134,80 Angiotensina II (pg/mL) 131 21, 70 7, 00 58,30 Adrenolutina (ng/mL) 130 24, 41 4, 43 369,31 Creatinina (mmol/L) 135 1, 10 0, 80 2, 00 Idade (anos) 134 60,5 34, 4 78,2 índice de massa corporal (kg/mm2) 134 27,4 20,5 39, 7 LV Fracção de ejecção 135 22,0 11, 0 30,0
Quadro 2. Relaçao de ST2 para Variáveis Clinicas e Neurohormonas: Correlações de Spearman
Avaliação inicial Mudança em ST2 ST2
Avaliação inicial BNP R 0, ,3511 -0, , 11327 (pmol/L) valor de p <0 , 0001 0, , 1843 N 161 139 Avaliação inicial ProANP R 0, 35979 -0, ,10967 (pmol/L) 48 (cont.)_
Avaliação inicial Mudança em ST2 ST2 valor de P <0,0001 0,1987 N 161 139 Mudança em BNP* (pmol/L) R -0,10184 0,21497 valor de P 0,2329 0,0110 N 139 139 Mudança em ProANP *R 0,05584 0,28847 (pmol/L) valor de P 0,5138 0,0006 N 139 139 Norepinefrina (pg/ml) R 0,38535 -0,25253 valor de P <0,0001 0,0032 N 156 134 Dopamina (pg/mL) R 0,07879 0,22127 valor de P 0,3283 0,0102 N 156 134 Epinefrina (pg/mL) R 0,08043 -0,12110 valor de P 0,3182 0,1634 N 156 134 Angiotensina II (pg/mL) R 0,00374 -0,00725 valor de P 0,9630 0,9335 N 156 135 Adrenolutina (ng/mL) R 0,00544 -0,10422 valor de P 0,9464 0,2308 N 155 134 Creatinina (units) R 0, 16567 0,02513 valor de P 0,0388 0,7724 N 156 135 LV Fracção de ejecção R -0,08006 0,03651 valor de P 0,3205 0,6742 N 156 135 Idade (anos) R -0,11768 0,19260 valor de P 0,1447 0,0274 49 Ν 155 134 índice de massa corporalR 0,04561 -0,05410 (units) valor de p 0,5731 0,5347 N 155 134 R, coeficiente de correlação de Spearman; N, número da amostra. Avaliação inicial, valores no registo do ensaio clinico; * Mudança, valores na semana 2 menos valores no registo do ensaio clinico. Quadro 3. Prognosticadores univariados de Mortalidade e Transplantação (Critério de avaliaçao' ) Variável Razão de intervalo de valor de p chance confiança de 95 % Avaliação inicial ST2, por 0,1 1,114 0,961-1,300 0, 1509 ng/mL Avaliação inicial BNP, por 10 1, 106 1,060-1,161 <0,0001 pmol/L Avaliação inicial ProANP, por 1, 007 1,005-1,010 <0,0001 10 pg/L Mudança em ST2*, por mudança de 1,320 1,042-1,827 0,0482 0,1 ng/mL Mudança em BNP*, por mudança de 1, 033 0,966-1,110 0,3401 10 pmol/L Mudança em ProANP*, por mudança 1, 003 0,997-1,009 0,3413 de 10 pg/L Norepinefrina, por 1 pg/mL 1, 001 1,000-1,002 0,0562 Dopamina, por 10 pg/mL 1, 029 1,006-1,059 0,0433 Epinefrina, por 1 pg/mL 0, 999 0,995-1,001 0,6645 Angiotensina II, por 1 pg/mL 0, 997 0,977-1,017 0,7921 Adrenolutina, por 10 ng/mL 0, 985 0,943-1,017 0,4167 Creatinina, por 1 mmol/L 2, 487 0,997-6,417 0,0526 Fracção de ejecção LV 0, 952 0,897-1,007 0,0906 Raça 1, 947 0,946-4,192 0,0776 Sexo 1,225 0,576-2,728 0,6061 50 (cont)
Variável Razão de intervalo de valor de p chance confiança de 95 % Idade 1, 435 1,099-1,914 0,0104 Etiologia 1, 543 0,744-3,336 0,2543 índice de massa corporal, por 1 0,972 0,919-1,021 0,2876 kg/mm2
Avaliação inicial, valores no registo do ensaio clinico.; * Mudança, valores na semana 2 menos valores no registo do ensaio clinico.
Quadro 4. Prognosticadores multivariados de Mortalidade e Transplantação (Critério de avaliação): Valor Preditivo de ST2
Variáveis P Avaliação inicial ST2 e Avaliação inicial BNP Avaliação inicial BNP 0,0003 Avaliação inicial Dopamina 0,0906 Avaliação inicial ST2 0,6368 Avaliação inicial ST2 e Avaliação inicial ProANP Avaliação inicial ProANP <0,0001 Avaliação inicial Dopamina 0,0944 Avaliação inicial ST2 0,3306 Mudança em ST2* e Avaliação inicial BNP Avaliação inicial BNP 0,0001 Mudança em ST2 0,0392 Mudança em ST2* ProANP e Avaliação inicial Avaliação inicial ProANP <0,0001 Mudança em ST2 0,0274 Avaliação inicial, valores no registo do ensaio clínico; * Mudança, valores na semana 2 menos valores no registo do ensaio clínico. 51 EXEMPLO 3 Métodos
Populações de estudo. A Trombólise em 14 ensaio clínico de Enfarte do miocárdio (TIMI) foi um estudo de variação de doses aberto aleatorizado de terapêutica de reperfusão de combinação para pacientes com EM com elevação de segmento ST conduzido entre Março de 1997 e Julho de 1998. Especificamente, este estudo foi um ensaio clínico angiográfico que compara 4 diferentes combinações trombolíticas: abciximab sozinho, alteplase sozinho, abciximab com dose reduzida de alteplase, e abciximab com dose reduzida de estreptoquinase (Antman EM et al., Circulation, 1999; 99:2720-32; Antman EM et al., Eur Heart J, 2000; 21:1944-53). 0 ensaio clínico ENTIRE-TIMI 23 foi um estudo multicêntrico de variação de doses aberto conduzido entre Fevereiro de 2000 e Setembro de 2001 para avaliar enoxaparina como terapêutica anti-trombina adjuvante com várias formas de reperfusão farmacológica, que incluem tenecteplase de dose completa e tenecteplase de metade de dose mais abciximab (Antman EM et al., Circulation. 2002;105:1642-9). Em ambos os estudos, os pacientes foram elegíveis para inclusão se tivessem um episódio de qualificação de desconforto isquémico de pelo menos 30 min dentro de 6 h (ENTIRE) ou 12 h (TIMI 14), e exibissem pelo menos 0,1 mV EM com elevação de segmento ST 2 condutores electrocardiográficos precordiais contíguos. Os critérios de exclusão para ambos os ensaios clínicos incluíram o risco aumentado de hemorragia, insuficiência renal severa, e choque cardiogénico.
Análises de laboratório. As amostras de soro colhidas na avaliação inicial, 1, 3, 12, e 24 h após o registo em TIMI 14 foram avaliadas. As amostras de soro do ensaio clínico ENTIRE estavam disponíveis somente na avaliação inicial. O soro foi isolado dentro de 60 min desde a colheita da amostra e armazenado a -20 °C ou mais frio até 52 o envio a TIMI Biomarcador Core Lab (Boston, MA) , onde as amostras foram mantidas a -70 °C. ST2 solúvel foi medido com um método de ELISA sanduíche de anticorpo monoclonal duplo (Medicai & Biological Laboratories Co., Ltd., Nagoya, Japão) . As amostras de soro ou padrões foram incubadas em micropoços revestidos com anticorpo ST2 anti-humano. Após a lavagem, o anticorpo ST2 anti-humano conjugado com peroxidase foi adicionado no micropoço e incubado. Depois de lavar de novo, o substrato de peroxidase foi adicionado e a densidade óptica a 450 nm foi determinada. A proteína C reactiva de alta sensibilidade (hs-CRP, Dade-Behring Inc, Deerfield, IL) , isoenzima MB creatina quinase (CK-MB), péptido natriurético do tipo B (SHIONORIA BNP, Shionogi, Osaka, Japão), e troponina cardiaca I (ACS:180, Bayer Diagnostics, Tarrytown, NY) foram medidas utilizando os métodos descritos anteriormente (Morrow DA et al., J Am Coll Cardiol. 1998; 31:1460-5; Morrow DA et al., Clin Chem. 2000; 46:453-460). Os níveis de isoenzima creatina quinase foram medidos localmente no local de admissão, a 3 horas, e a intervalos de 6 a 8 horas para as primeiras 24 horas. Devido a disponibilidade da amostra, os níveis de BNP foram medidos em amostras de ENTIRE-TIMI 23, mas não TIMI 14.
Análise estatística. Os pacientes foram divididos em quartis com base nos seus níveis séricos de ST2 no momento do registo nos estudos. Os níveis de ST2 são descritos utilizando a mediana e percentis 25-75. A associação entre características clínicas de avaliação inicial e quartis de ST2 foi analisada utilizando o teste de Kruskal-Wallis para variáveis contínuas e o teste x2 para variáveis categóricas. As correlações entre ST2 e outras variáveis de avaliação inicial contínuas foram estudadas com um coeficiente de correlação não paramétrico (Spearman). Para a avaliação da associação com resultados clínicos, ST2 foi comparado entre pacientes que tinham um critério de avaliação de estudo e aqueles que não, utilizando o teste 53 de soma de postos de Wilcoxon. A análise multivariável da associação de ST2 com resultados foi realizada utilizando regressão logística que inclui termos para prognosticadores estabelecidos de mortalidade em enfarte do miocárdio com elevação do ST (STEMI) (Morrow, DA et al., Circulation 2000; 24 de Outubro; 102(17):2031-7). Excepto onde foi indicado, os resultados apresentados são para a população de estudo TIMI 14 e ENTIRE-TIMI 23 combinados.
Resultados ST2 de avaliação inicial e Variáveis Clínicas. A maioria das características clínicas de avaliação inicial, que incluem sexo, idade, peso, e extensão da doença na artéria coronária não se correlacionou com os níveis de ST2 de avaliação inicial (Quadro 5) . Poucos pacientes nesta população tinham um historial anterior ou apresentaram-se com indícios clínicos de insuficiência cardíaca. De maneira interessante, a frequência cardíaca correlacionou-se positivamente com níveis de ST2 (p < 0,0001) e pressão sanguínea sistólica mostrou uma correlação modesta com níveis de ST2 (p = 0,05), consistente com a teoria de que ST2 é secretado por miócitos cardíacos sob tensão biomecânica. Os biomarcadores troponina cardíaca I, BNP, e CRP—que mostraram todos que predizem o resultado após enfarte do miocárdio (de Lemos JA et al., N Engl J Med 2001; 345:1014-21; Antman EM et al, N Engl J Med 1996; 335:1342-9; Morrow DA et al., J Am Coll Cardiol 1998; 31:1460-5) foram correlacionados com ST2 pela análise de quartil e troponina cardíaca I e CRP foram estatisticamente significativos. Quando estes biomarcadores foram avaliados como variáveis contínuas, correlações quantitativamente fracas foram observadas (Quadro 6). 54
Quadro 5. Características clínicas de avaliaçao inicial De acordo com Quartis de ST2 (ng/mL) 54 Historial familiar 73 % de CAD Hipercolesterolemia 22 % Estado de tabagismo: Fumador actual 57 % Achados físicos 21 % 21 % 29 % 0,2 0, 0£ 0,2 0, 1 49 % 48 % 0,2 0, 06
Quartil 1 Quartil 2 Quartil 3 Quartil 4 p trend p Q4 vs Q1 Intervalo, ng/mL 0,085 - 0, 179 0,180 - 0,235 0,236 - 0,346 0,347 - 6, 88 n 204 202 202 202 Tempo CP para 2,8 ± 1, 6 3,1 ± 1, 5 3,2 ± 1, 4 4,0 ± 1, 9 <0,0001 <0,0001 randomização (hrs) Idade (anos) 58 ± 10 58 ± 10 58 ± 11 58 ± 10 0, 9 1, 0 Homem 74 % 77 % 85 % 81 % 0, 03 0, 09 Branco 88 % 89 % 90 % 88 % 0, 9 1, 0 Historial médico passado Hipertensão 25 % 24 % 36 % 33 % 0, 02 0, 09 Insuficiência 0 % 0 % 1,5% 1,0% 0, 1 0,2 cardíaca congestiva Angina 26 % 24 % 26 % 32 % 0,3 0,2 Diabetes 14 % 14 % 15 % 16 % 0, 9 0,5 73 % 73 % 73 % 83 ± 16 81 ± 15 82 ± 14 83 ± 15 0, 4 0, 8 139 ± 21 138 ± 22 141 ± 23 143 ± 22 0, 1 0, 05 7 ± 17 75 ± 17 72 ± 16 80 ± 17 0, 001 <0,0001 2,0% 1,5 % 3,6 % 4,5 % 0,3 0,2
Peso kg BP sistólico (mm Hg) HR (BPM)
Classe II-IV de Killip 61 % 69 % 77 % 84 % 0, 001 <0,0001 1,8% 5,4% 7,2% 14, 4 % 0, 003 0, 001 2,1% 8,8 % 8,1 % 11,4% 0, 006 <0,0001 1,0 ± 0,21 1,0 ± 0,20 1,0 ± 0,25 1,1 ± 0,28 0, 1 0, 03
Teste de diagnóstico cTnI> 0,1 ng/ml* BNP > 80 pg/ml* CRP > 1,5 ng/ml
Creatinina mg/dL 55 55 (cont.) Quartil 1 Quartil 2 Quartil 3 Quartil 4 p trend p Q4 vs Q1 Extensão de CAD (50 0, 3 0,2 estenose) 1 vaso 48 % 55 % 45 % 50 % 2 vaso 38 % 28 % 34 % 30 % 3 vaso 15 % 18 % 20 % 20 % EF ( % ) * * 58 ± 15 58 ± 15 57 ±15 57 ± 15 1, 0 0,9 CP = Dor no peito; HR = Frequência cardíaca; cTnl = Troponina cardíaca I; BNP = Péptido natriurético do tipo B; CRP = Proteína C Reactiva; CAD = Doença na artéria coronária; EF = Fracção de ejecção *Medida na população ENTIRE-TIMI 23 somente; N = 448 excepto **(N = 469)
Quadro 6. Correlação entre ST2 e Variáveis Continuas
Variável Spearmans rho Valor de p Tempo CP p ara 0,29 <0,0001 randomização Idade -0,003 0, 9 Peso (kg) 0, 01 0, 8 pico CKMB 0, 08 0, 02 cTnl * 0,26 <0,0001 CRP 0,10 0, 007 BNP* 0, 068 0, 15 Creatinina 0, 09 0, 01 LVEF* * -0,005 0,9 CP = Dor no peito; CKMB = MB isoenzima de creatina quinase; cTnl = Troponina cardíaca I; BNP = B tipo Péptido natriurético; CRP = Proteína C Reactiva; CAD = Doença na artéria coronária; EF = Fracção de ejecção. *Medida na população ENTIRE-TIMI 23 somente; N = 448 excepto **(N = 469) ST2 e Resultados Clínicos. Para o coorte combinado de 810 pacientes, ST2 de avaliação inicial foi associado 56 significativamente a resultados clínicos a 30 dias (Quadro 7) . Especificamente, os níveis de ST2 foram significativamente mais altos na apresentação entre pacientes que morreram subsequentemente (p = 0,0001), ou desenvolveram nova ou piora de ICC (p = 0,009), em 30 dias após o registo. Dicotomizados na mediana, níveis elevados de avaliação inicial de ST2 foram indicativos de mortalidade mais alta através de 30 dias de seguimento (ordem de log, p = 0, 0009, Figura 13) . Além disso, numa análise por quartis de ST2, o risco de ambos morte (p = 0,001) e o compósito de morte ou ICC (p = 0,001) aumentou de uma maneira graduada em etapas com níveis mais altos de ST2. Esta associação entre ST2 e eventos clínicos foi homogénea entre os dois ensaios clínicos individuais (TIMI 14 e ENTIRE-TIMI 23) .
Quadro 7. Associação entre Avaliaçao inicial ST-2 Concentração (ng/ml) e Resultados_
Resultado (30 dias) n Mediana [25,75] valor de p Morte 28 0,379 [0,267, 0,611] 0,0001 Vivo 782 0,233 [0,178, 0,340] EM 29 0,213 [0,171, 0,259] 0,11 Nenhum EM 781 0,237 [0,181, 0,348] ICC 21 0,287 [0,237, 0,470] 0, 009 Nenhuma ICC 789 0,233 [0,178, 0,345] Morte/ICC 47 0,317 [0,246,0,590] <0,0001 Nenhuma Morte/ICC 763 0,231 [0,177,0,339] EM = Enfarte do miocárdio; ICC = Insuficiência cardíaca congestiva
Evolução de níveis de ST2 séricos. Os níveis de ST2 de avaliação inicial analisados por quartil foram correlacionados significativamente com o tempo para randomização (Quadros 5 e 6) . Os níveis de ST2 foram antecipados para aumentar no primeiro dia seguinte a oclusão coronária e retorno ao normal ao longo dos próximos 57 14 dias (6). Entre os pacientes TIMI 14, análise de medições em série de ST2 em soro em 228 pacientes revelou um aumento com o tempo, com a maioria dos pacientes alcançando um pico de nível de ST2 a 12 horas, embora, poucos pacientes tivessem níveis de ST2 séricos que continuaram a aumentar passado este ponto de tempo.
Análise Multivariada. Após o controlo para prognosticadores clínicos estabelecidos em STEMI que incluem idade, frequência cardíaca, pressão sanguínea sistólica, localização do enfarte do miocárdio, classe de Killip, e tempo desde o aparecimento de dor no peito, níveis crescentes de ST2 permaneceram um prognosticador independente de morte a 30 dias (OR 1,77; 95 % Cl 1,01 -3,12, p = 0, 047). Esta associação não foi mais significativa quando BNP foi adicionado ao modelo clínico (avaliação foi limitada a ENTIRE). A capacidade preditiva de ST2 confirmada nos últimos pontos de tempo (3 e 12 horas em TIMI 14) foi também avaliada; revelando uma associação mais forte entre ST2 e risco de mortalidade. T1/ST2 solúvel em soro, portanto é um novo biomarcador para insuficiência cardíaca grave que equivale a activação neurohormonal. Em pacientes com insuficiência cardíaca crónica severa de Classe III-IV de NYHA, a mudança em níveis de T1/ST2 é um prognosticador independente do critério de avaliação de mortalidade ou transplantação.
Neste estudo, os inventores exploraram o potencial papel de medição em soro de um receptor identificado recentemente da familia da interleucina-1 em enfarte agudo do miocárdio. A forma solúvel deste receptor é rapidamente secretada pelos miócitos cardíacos quando as células são biomecanicamente sobrecarregadas; isto sugere que o receptor pode desempenhar um papel em condições onde o miocárdio é rapidamente sobrecarregado, tal como em enfarte do miocárdio. Para explorar isto, os inventores mediram os níveis em soro de ST2 no momento da apresentação num coorte 58 de pacientes com enfarte agudo do miocárdio. Os resultados demonstram que os níveis de ST2 no momento da apresentação nestes pacientes são associados a mortalidade em hospital e em 30 dias. Além disso, a análise multivariada indicou que o nível de ST2 é independentemente associado ao resultado após o controlo para importantes factores clínicos.
Assim, a significância destes dados é dobrada. Em primeiro lugar, estes dados sugerem que a família de receptor de interleucina, que participa na defesa do hospedeiro e diferenciação de células T (Sims JE. IL-1 and IL-18 receptors, and their extended family. Curr Opin Immunol. 2002; 14: 117-22), pode participar em eventos precoces em enfarte agudo do miocárdio. Estes dados implicam este receptor como um potencial novo alvo para modificar o prognóstico em pacientes com enfarte do miocárdio. Em segundo lugar, ST2 representa um novo biomarcador que oferece informação prognóstica em pacientes com enfarte agudo do miocárdio; assim, prosseguindo com esse trabalho anterior que demonstra uma associação entre ST2 e mortalidade entre pacientes com insuficiência cardíaca congestiva não isquémica (Weinberg EO, Shimpo M, Hurwitz S, Tominaga S, Rouleau JL, Lee RT. Identification of serum soluble ST2 receptor as a novel heart failure biomarker. Circulation. 2003;107:721-6), outra condição de sobrecarga do miocárdio.
Embora não esteja excluído, é improvável que a relação de ST2 e resultado após enfarte do miocárdio seja simplesmente um reflexo da associação de elevações crónicas em marcadores inflamatórios como CRP e risco de enfarte do miocárdio. ST2, como BNP, pode ser sintetizado pelos próprios miócitos cardíacos e os dados de pacientes sem doença isquémica aparente sugere que ST2 prediz o prognóstico na ausência de doença na artéria coronária. Além disso, os dados preliminares sugerem que os níveis de ST2 em pacientes externos com doença estável na artéria 59 coronária não estão relacionados a níveis de CRP. Enquanto os presentes dados suportam o valor complementar de ST2 para a avaliação do risco quando adicionado a um modelo clínico robusto (REF TIMI Risk Score), ST2 não contribuiu informação adicional a BNP no conjunto de dados menor limitada ao ENTIRE-TIMI 23. Pode também haver valor prognóstico de ST2 em conjunto com outros biomarcadores disponíveis.
Embora SI2 possa ser secretado por miócitos cardíacos mecanicamente sobrecarregados, muitas células podem secretar ST2. É portanto possível que as elevações em soro de ST2 não sejam completamente específicas para enfarte agudo do miocárdio. Além da insuficiência cardíaca não isquémica (Weinberg EO, Shimpo M, Hurwitz S, Tominaga S, Rouleau JL, Lee RT. Identification of serum soluble ST2 receptor as a novel heart failure biomarker. Circulation. 2003;107:721-6), pacientes com asma (Oshikawa K, Kuroiwa K, Tago K, Iwahana H, Yanagisawa K, Ohno S, Tominaga SI, Sugiyama Y. Elevated soluble ST2-protein leveis in sera of patients with asthma with an acute exacerbation. Am J Respir Crit Care Med. 2001;164: 277-81) ou doenças auto-imunes como lúpus eritematoso sistémico (Kuroiwa K, Arai T, Okazaki H, Minota S, Tominaga S. Identification of human ST2 protein in the sera of patients with autoimmune diseases. Biochem Biophys Res Commun. 2001; 284:1104-8) podem também ter níveis séricos aumentados de ST2. Portanto, a utilidade da medição de ST2 no diagnóstico inicial de enfarte agudo do miocárdio em tais indivíduos não é inequívoca.
No entanto, ST2 permanece um possível alvo para a terapêutica em pacientes com EM. Estes dados demonstram como a tecnologia genómica pode revelar uma nova potencial via fisiopatológica numa doença comum. ST2 foi inicialmente identificado através de estudos da família da interleucina-1, mas seu papel na doença do miocárdio foi somente 60 recentemente sugerida por estudos genómicos com microarranjos de ADN. Estudos com microarranjos de ADN permitem a identificação de potenciais novas vias de doença, mas isto é somente uma etapa inicial no entendimento do papel da via. Os dados acima suportam o papel para ST2 em enfarte agudo do miocárdio, uma vez que os níveis de ST2 predizem o resultado. Estudos da função de ST2 em enfarte do miocárdio são possíveis. Além disso, a identificação do ligando para os receptores de ST2 de membrana e solúvel poderia ajudar ainda no entendimento dos papéis potencialmente competidores de membrana e receptores solúveis.
Os resultados descritos estabelecem que o T1/ST2 é secretado durante um ataque do coração e/ou insuficiência cardíaca, e pode ser facilmente medido, suportando deste modo as utilidades reivindicadas da invenção. 61
LISTA DE SEQUÊNCIAS <110> The Brigham e Mulheres's Hospital, Inc.
<120> IL1RL-1 COMO UM MARCADOR DE DOENÇA CARDIOVASCULAR E
ALVO TERAPÊUTICO
<130> B00801,70284.WO <150> US 60/379.173 <151> 2002-05-09 <16 0>8 <170> Patentln versão 3.0 <210> 1 <211> 1357 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (47)..(1033) <223> HUMST2M, D12763, <400> 1 62 atctcaacaa cgagttacca atacttgctc ttgattgata aacaga atg ggg ttt 55
Met Gly Phe 1 tgg ate tta gea att ctc aca att ctc atg tat tcc aca gea gea aag 103 Trp Ile Leu Ala Ile Leu Thr Ile Leu Met Tyr Ser Thr Ala Ala Lys S 10 15 ttt agt aaa caa tca tgg ggc ctg gaa aat gag gct tta att gta aga 151 Phe Ser Lys Gin Ser Trp Gly Leu Glu Asn Glu Ala Leu Ile val Arg 20 25 30 35 tgt cct aga caa gga aaa cct agt tac acc gtg gat tgg tat tac tca 199 Cys Pro Arg Gin Gly Lys Pro Ser Tyr Thr Val Asp Trp Tyr Tyr Ser 40 45 50 caa aca aac aaa agt att ccc act cag gaa aga aat cgt gtg ttt gee 247 Gin Thr Asn Lys Ser Ile Pro Thr Gin Glu Arg Asn Arg Val Phe Ala 55 60 65 tca ggc caa ctt ctg aag ttt cta cca gct gaa gtt gct gat tet ggt 295 Ser Gly Gin Leu Leu Lys Phe Leu Pro Ala Glu Val Ala Asp Ser Gly 7 0 75 80 att tat acc tgt att gtc aga agt ccc aca ttc aat agg act gga tat 343 Ile Tyr Thr Cys Ile Vai Arg Ser Pro Thr Phe Asn Arg Thr Gly Tyr 85 90 95 gcg aat gtc acc ata tat aaa aaa caa tca gat tgc aat gtt cca gat 391 Ala Asn Vai Thr Ile Tyr Lys Lys Gin Ser Asp Cys Asn Val Pro Asp 100 105 110 115 tat ttg atg tat tca aca gta tet gga tca gaa aaa aat tcc aaa att 439 Tyr Leu Met Tyr Ser Thr Vai Ser Gly Ser Glu Lys Asn Ser Lys Ile 120 125 130 tat tgt cct acc att gac ctc tac aac tgg aca gea cct ctt gag tgg 487 Tyr Cys Pro Thr Ile ASp Leu Tyr Asn Trp Thr Ala Pro Leu Glu Trp 135 140 145 ttt aag aat tgt cag gct ctt caa gga tca agg tac agg gcg ca c aag 535 Phe Lys Asn Cys Gin Ala Leu Gin Gly Ser Arg Tyr Arg Ala His Lys 150 155 160 tca ttt ttg gtc att gat aat gtg atg act gag gac gea ggt gat tac 583 Ser Phe Leu Vai Ile Asp Asn Val Met Thr Glu Asp Ala Gly Asp Tyr 63 165 170 175 acc tgt aaa ttt ata cac aat gaa aat gga gee aat tat agt gtg acg 631 Thr Cys LyS Phe Ile His Asn Glu Asn Gly Ala Asn Tyr Ser Val Thr 180 185 190 195 gcg acc agg tec ttc acg gtc aag gat gag caa ggc ttt tet ctg ttt 679 Ala Thr Arg Ser Phe Thr Vai Lys Asp Glu Gin Gly Phe Ser Leu Phe 200 205 210 cca gta ate gga gee cct gea caa aat gaa ata aag gaa gtg gaa att 727 Pro Vai Ile Gly Ala Pro Ala Gin Asn Glu Ile LyS Glu Vai Glu Ile 215 220 225 gga aaa aac gea aac cta act tgc tet gct tgt ttt gga aaa ggc act 775 Gly Lys Asn Ala Asn Leu Thr Cys Ser Ala Cys Phe Gly Lys Gly Thr 230 235 240 cag ttc ttg gct gee gtc ctg tgg cag ctt aat gga aca aaa att aca 823 Gin Phe Leu Ala Ala Vai Leu Trp Gin Leu Asn Gly Thr Lys Ile Thr 245 250 255 gac ttt ggt gaa cca aga att caa caa gag gaa ggg caa aat caa agt 871 Asp Phe Gly Glu Pro Arg Ile Gin Gin Glu Glu Gly Gin Asn Gin Ser 260 265 270 275 ttc age aat ggg ctg gct tgt cta gac atg gtt tta aga ata gct gac 919 Phe Ser Asn Gly Leu Ala Cys Leu Asp Met Vai Leu Arg Ile Ala Asp 280 285 290 gtg aag gaa gag gat tta ttg ctg cag tac gac tgt ctg gee ctg aat 967 Vai Lys Glu Glu Asp Leu Leu Leu Gin Tyr Asp Cys Leu Ala Leu Asn 295 300 30S ttg cat ggc ttg aga agg cac acc gta aga cta agt agg aaa aat cca 1015 Leu His Gly Leu Arg Arg HiS Thr Vai Arg Leu Ser Arg Lys Asn Pro 310 315 320 agt aag gag tgt ttc tga gactttgatc acctgaactt tetetageaa 1063 Ser Lys Glu Cys Phe 325 gtgtaagcag ccataaaatg cctgtttgct cgttggtttg aactccctct aatggagtgt tgcttctctt gggagcttct tctagaacac gtgtcactgt ggttccaaga cttcgggatg ctgctgctta tcagctgctt atgtgaaagg gatccatcaa ttgtttgctg aattgttcgt ctttggtcat aaatgcacca gacaatggga tctgatcttt cctcccccac ccttgttttc acaaccgaaa atggcctgtg gtagactgtt tccctcctat taactttatg actg 112 3 1183 1243 1303 1357
<210>2 <211>328 <212> PRT <213> Homo sapiens <400>2 64
Met 1 Gly Phe Trp Ile 5 Leu Ala Ile Leu Thr 10 Ile Leu Met Tyr Ser 15 Thr Ala Ala Lys Phe 20 Ser Lys Gin Ser Trp 25 Gly Leu Glu Asn Glu 30 Ala Leu Ile Vai Arg 35 Cys Pro Arg Gin Gly 40 Lys Pro Ser Tyr Thr 45 Val Asp Trp Tyr Tyr 50 Ser Gin Thr Asn Lys 55 Ser Ile Pro Thr Gin 60 GlU Arg Asn Arg Vai 65 Phe Ala Ser Gly Gin 70 Leu Leu Lys Phe Leu 75 Pro Ala Glu Val Ala 80 Asp Ser Gly Ile Tyr 85 Thr Cys Ile Val Arg 90 Ser Pro Thr Phe Asn 95 Arg Thr Gly Tyr Ala 100 Asn vai Thr Ile Tyr 105 Lys Lys Gin Ser Asp 110 Cys Asn Vai Pro Asp 115 Tyr Leu Met Tyr Ser 120 Thr Val Ser Gly Ser 125 Glu Lys Asn Ser Lys 130 Ile Tyr Cys Pro Thr 135 Ile Asp Leu Tyr Asn 14 0 Trp Thr Ala Pro Leu Glu Trp Phe Lys Asn Cys Gin Ala Leu Gin Gly Ser Arg Tyr Arg 145 150 155 160 Ala His Lys Ser Phe Leu Val Ile Asp Asn Val Met Thr Glu Asp Ala 165 170 175 Gly Asp Tyr Thr Cys Lys Phe Ile His Asn Glu Asn Gly Ala Asn Tyr 180 185 190 Ser Val Thr Ala Thr Arg Ser Phe Thr Val Lys Asp Glu Gin Gly Phe 195 200 205 Ser Leu Phe Pro Val Ile Gly Ala Pro Ala Gin Asn Glu Ile Lys Glu 210 215 220 Val Glu Ile Gly Lys Asn Ala Asn Leu Thr Cys Ser Ala Cys Phe Gly 225 230 235 240 Lys Gly Thr Gin Phe Leu Ala Ala Val Leu Trp Gin Leu Asn Gly Thr 245 250 255 Lys Ile Thr Asp Phe Gly Glu Pro Arg Ile Gin Gin Glu Glu Gly Gin 260 265 270 Asn Gin Ser Phe Ser Asn Gly Leu Ala Cys Leu Asp Met Val Leu Arg 275 280 285 Ile Ala ASp Val Lys Glu Glu Asp Leu Leu Leu Gin Tyr Asp Cys Leu 290 295 300 Ala Leu Asn Leu His Gly Leu Arg Arg His Thr Val Arg Leu Ser Arg 305 310 315 320 Lys Asn Pro Ser Lys Glu Cys Phe 325
<210>3 <211>2058 <212> ADN <213> Homo sapiens <220>
<221> CDS <222> (272)..(1942) 65 <223>ΑΒ012701 <4Ο0> 3 aaagagaggc tggctgttgt atttagtaaa gctataaagc tgtaagagaa attggctttc eo tgagttgtga aactgtgggc agaaagttga ggaagaaaga actcaagtac aacccaatga 120 ggttgagata taggctactc ttcccaactc agtcttgaag agtatcacca actgcctcat 180 gtgtggtgac cttcactgtc gtatgccagt gactcatctg gagtaatctc aacaacgagt 240 taccaatact tgctcttgat tgataaacag a atg ggg ttt tgg ate tta gea 292
Met Gly Phe Trp Ile Leu Ala 1 5 att ctc aca att ctc atg tat tcc aca gea gea aag ttt agt aaa caa 340 Ile Leu Thr Ile Leu Met Tyr Ser Thr Ala Ala Lys Phe Ser Lys Gin 10 15 20 tea tgg ggc ctg gaa aat gag gct tta att gta aga tgt cct aga caa 388 Ser Trp Gly Leu Glu Asn Glu Ala Leu Ile Val Arg Cys Pro Arg Gin 25 30 35 gga aaa cct agt tac acc gtg gat tgg tat tac tea caa aca aac aaa 436 Gly Lys Pro Ser Tyr Thr Vai Asp Trp Tyr Tyr Ser Gin Thr Asn Lys 40 45 50 55 agt att ccc act cag gaa aga aat cgt gtg ttt gee tea ggc caa ctt 484 Ser Ile Pro Thr Gin Glu Arg Asn Arg Val Phe Ala Ser Gly Gin Leu 60 65 70 ctg aag ttt cta cca gct gaa gtt gct gat tet ggt att tat acc tgt 532 Leu Lys Phe Leu Pro Ala Glu Val Ala Asp Ser Gly Ile Tyr Thr Cys 75 80 85 att gtc aga agt ccc aca ttc aat agg act gga tat gcg aat gtc acc 580 Ile Vai Arg Ser Pro Thr Phe Asn Arg Thr Gly Tyr Ala Asn Val Thr 90 95 100 ata tat aaa aaa caa tea gat tgc aat gtt cca gat tat ttg atg tat 628 Ile Tyr Lys Lys Gin Ser Asp Cys Asn Val Pro Asp Tyr Leu Met Tyr 66 105 tca aea gta tet gga tca Ser Thr Val Ser Gly Ser 120 125 att gac ctc tac aac tgg Ile Asp Leu Tyr Asn Trp 140 cag gct ctt caa gga tca Gin Ala Leu Gin Gly Ser 155 att gat aat gtg atg act Ile Asp Asn Val Met Thr 170 ata cac aat gaa aat gga Ile His Asn Glu Asn Gly 185 ttc acg gtc aag gat gag Phe Thr Val Lys Asp Glu 200 205 gcc cct gea caa aat gáa Ala Pro Ala Gin Asn Glu 220 aac cta act tgc tet gct Asn Leu Thr Cys Ser Ala 235 gcc gtc ctg tgg cag ctt Ala Val Leu Trp Gin Leu 250 cca aga att caa caa gag Pro Arg Ile Gin Gin Glu 265 ctg gct tgt cta gac atg Leu Ala Cys Leu Asp Met 280 285 gat tta ttg ctg cag tac Asp Leu Leu Leu Gin Tyr 300 aga agg cac acc gta aga Arg Arg His Thr Val Arg 315 age ate tac tgc ata att Ser Ile Tyr Cys Ile lie 330 aat gtc Ctg gtt ate ate Asn Val Leu Val Ile Ile 345 ctc tgg aga gac ata gct Leu Trp Arg Asp Ile Ala 360 365 ctc tat gat gct tat gtt Leu Tyr Asp Ala Tyr Val 380 gat ggg gcc agt cgt gta Asp Gly Ala Ser Arg Val Γ95 gtt ctt gaa aat aaa tgt Val Leu Glu Asn Lys Cys 410 atg cta cct gga gaa gat Met Leu Pro Gly Glu Asp 425 aag age agg cgg cac att 110 115 gaa aaa aat tcc aaa att Glu Lys Asn Ser Lys Ile 130 aca gea cct ctt gag tgg Thr Ala Pro Leu Glu Trp 145 agg tac agg gcg cac aag Arg Tyr Arg Ala HiS Lys 160 gag gac gea ggt gat tac Glu Asp Ala Gly Asp Tyr 175 gcc aat tat agt gtg acg Ala Asn Tyr Ser Val Thr 190 195 Caa ggc ttt tet ctg ttt Gin Gly Phe Ser Leu Phe 210 ata aag gaa gtg gaa att Ile T i;e Glu Val Glu Ile 225 tgt ttt gga aaa ggc act Cys Phe Gly Lys Gly Thr 240 aat gga aca aaa att aca Asn Gly Thr Lys Ile Thr 255 gaa ggg caa aat caa agt Glu Gly Gin Asn Gin Ser 270 275 gtt tta aga ata gct gac Val Leu Arg Ile Ala Asp 290 gac tgt ctg gcc ctg aat Asp Cys Leu Ala Leu Asn 305 Cta agt agg aaa aat cca Leu Ser Arg Lys Asn Pro 320 gea gta tgt agt gta ttt Ala Val o Sêr \r<.1 v αχ Phe 335 cta aaa atg ttc tgg att Leu Lys Met Phe Trp Ile 350 355 aaa cct tac aag act agg Lys Pro Tyr Lys Thr Arg 370 gtc tac cca cgg aac tac Val Tyr Pro Arg Asn Tyr 385 gag cac ttt gtt cac cag Glu His Phe Val His Gin 400 ggc tat acc tta tgc att Gly Tyr Thr Leu Cys Ile 415 gta gtc act gea gtg gaa Val Val Thr Ala val Glu 430 435 ttc ate ctg acc cct cag tat tgt cct acc 676 Tyr Cys Pro Thr 135 ttt aag aat tgt 724 Phe Lys Asn 150 Cys tca ttt ttg gtc 772 Ser Phe 165 Leu Val acc tgt aaa ttt 820 Thr 130 Cys Lys Phe gcg acc agg tcc 868 Ala Thr Arg Ser cca gta ate gga 916 Pro Val Ile Gly 215 99a aaa aac gea 964 Gly Lys Asn 230 Alã cag ttc ttg gct 1012 Gin Phe 245 Leu Ala gac ttt ggt gaa 1060 Asp 260 Phe Gly Glu ttc age aat ggg 1108 Phe Ser Asn Gly gtg aag gaa gag 1156 Val Lys Glu Glu 295 ttg cat ggc ttg 1204 Leu His Gly 310 Leu att gat cat cat 1252 Ile ASp 325 His His tta atg cta ate 1300 Lsu 340 1UCL Leu Ile gag gcc act ctg 1348 Glu Ala Thr Leu aat gat gga aag 1396 Asn Asp Gly Lys 375 aaa tcc agt aca 1444 Lys Ser Ser 39o Thr att ctg cct gat 1492 Ile Leu 405 Pro Asp tat 999 aga gat 1540 Tyr 420 Gly Arg Asp acc aac ata cga 1588 Thr Asn Ile Arg ate act cac aat 1636 67
Lys Ser Arg Arg His Ile Phe Ile Leu Thr Pro Gin Ile Thr His Asn 440 445 450 455 aag gag ttt gcc tac gag cag gag gtt gcc ctg cac tgt gcc ctc ate 1684 Lys Glu Phe Ala Tyr Glu Gin Glu Val Ala Leu His Cys Ala Leu Ile 460 465 470 cag aac gac gcc aag gtg ata ctt att gag atg gag gct ctg age gag 1732 Gin Asn Asp Ala Lys Val Ile Leu Ile Glu Met Glu Ala Leu Ser Glu 475 480 485 ctg gac atg ctg cag gct gag gcg ctt cag gac tcc ctc cag cat ctt 1780 Leu Asp Met Leu Gin Ala Glu Ala Leu Gin Asp Ser Leu Gin His Leu 490 495 500 atg aaa gta cag 999 acc ate aag tgg agg gag gac cac att gcc aat 1828 Met Lys Val Gin Gly Thr Ile Lys Trp Arg Glu Asp His ile Ala Asn 505 510 SIS aaa agg tcc ctg aat tcc aaa ttc tgg aag cac gtg agg tac caa atg 1876 Lys Arg Ser Leu Asn Ser Lys Phe Trp Lys His Val Arg Tyr Gin Met 520 525 530 535 cct gtg cca age aaa att ccc aga aag gcc tet agt ttg act ccc ttg 1924 Pro Val Pro Ser Lys Ile Pro Arg Lys Ala Ser Ser Leu Thr Pro Leu 540 545 550 gct gcc cag aag caa tag tgcctgctgt gatgtgcaaa gggatctggg 1972 Ala Ala Gin Lys Gin 555 tttgaagctt tcctgacttc tcctagctgg cttatgcccc tgcactgaag tgtgaggagc 2032 gggaatatta aagggattca ggccac 2058
<210>4 <211>556 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 68
Met 1 Gly Phe Trp Ile 5 Leu Ala Ile Leu Thr 10 Ile Leu Met Tyr Ser 15 Thr Ala Ala Lys Phe 20 Ser Lys Gin Ser Trp 25 Gly Leu Glu Asn Glu 30 Ala Leu Ile Vai Arg 35 Cys Pro Arg Gin Gly 40 Lys Pro Ser Tyr Thr 45 Val Asp Trp Tyr Tyr 50 Ser Gin Thr Asn Lys 55 Ser Ile Pro Thr Gin 60 Glu Arg Asn Arg Vai 65 Phe Ala Ser Gly Gin 70 Leu Leu Lys Phe Leu 75 Pro Ala Glu Val Ala 80 Asp Ser Gly Ile Tyr 85 Thr Cys Ile Vai Arg 90 Ser Pro Thr Phe Asn 95 Arg Thr Gly Tyr Ala 100 Asn Vai Thr Ile Tyr 105 Lys Lys Gin Ser Asp 110 Cys Asn Vai Pro Asp 115 Tyr Leu Met Tyr Ser 120 Thr Vai Ser Gly Ser 125 Glu Lys Asn Ser Lys 130 Ile Tyr Cys Pro Thr 135 Ile Asp Leu Tyr Asn 140 Trp Thr Ala Pro Leu 145 Glu Trp Phe Lys Asn 150 Cys Gin Ala Leu Gin 155 Gly Ser Arg Tyr Arg 160 Ala His Lys Ser Phe 165 Leu Vai Ile Asp Asn 170 val Met Thr Glu Asp 175 Ala Gly Asp Tyr Thr 180 Cys Lys Phe Ile His 185 Asn Glu Asn Gly Ala 190 Asn Tyr Ser Vai Thr 195 Ala Thr Arg Ser Phe 200 Thr Vai Lys Asp Glu 205 Gin Gly Phe Ser Leu 210 Phe Pro Vai Ile Gly 215 Ala Pro Ala Gin Asn 220 Glu Ile Lys Glu Vai 225 Glu Ile Gly Lys Asn 230 Ala Asn Leu Thr Cys 235 Ser Ala Cys Phe Gly 240 69
Lys Gly Thr Gin Phe 245 Leu Ala Ala Lys Ile Thr Asp 260 Phe Gly Glu Pro Asn Gin Ser 275 Phe Ser Asn Gly Leu 280 Ile Ala 290 Asp Val Lys Glu Glu 295 Asp Ala 305 Leu Asn Leu His Gly 310 Leu Arg Lys Asn Pro Ile Asp 325 His His Ser ser Vai Phe Leu 340 Met Leu Ile Asn Phe Trp Ile 355 Glu Ala Thr Leu Leu 360 Lys Thr 370 Arg Asn Asp Gly Lys 375 Leu Arg 385 Asn Tyr Lys ser Ser 390 Thr Asp Vai His Gin Ile Leu 405 Pro Asp Val Leu Cys Ile Tyr 420 Gly Arg Asp Met Ala Vai Glu 435 Thr Asn Ile Arg Lys 440 Thr Pro 450 Gin Ile Thr His Asn 455 Lys Ala 465 Leu His Cys Ala Leu 470 Ile Gin Glu Met Glu Ala Leu 485 Ser Glu Leu Gin Asp Ser Leu 500 Gin His Leu Met Arg Glu Asp 515 His Ile Ala Asn Lys 520 Lys HiS 530 Vai Arg Tyr Gin Met 535 Pro Ala 545 Ser Ser Leu Thr Pro 550 Leu Ala
Val Leu Trp Gin Leu Asn Gly Thr Arg 250 Ile Gin Gin Glu Glu 255 Gly Gin 265 Ala Cys Leu Asp Met 270 Val Leu Arg Leu Leu Leu Gin 285 Tyr Asp Cys Leu Arg His Thr 300 val Arg Leu Ser Arg Ile Tyr 315 Cys Ile Ile Ala Val 320 Cys Val 330 Leu Val Ile Ile Leu 335 Lys Met 345 Trp Arg Asp Ile Ala 350 Lys Pro Tyr Tyr Asp Ala Tyr 365 Val Val Tyr Pro Gly Ala Ser 380 Arg Val Glu His Phe Leu Glu 395 Asn Lys Cys Gly Tyr 400 Thr Leu 410 Pro Gly Glu Asp Val 415 Val Thr 425 Ser Arg Arg His Ile 430 Phe Ile Leu Glu Phe Ala Tyr 445 Glu Gin Glu Val Asn Asp Ala 460 Lys Val Ile Leu Ile Asp Met 475 Leu Gin Ala Glu Ala 480 Leu Lys 490 Val Gin Gly Thr Ile 495 Lys Trp 505 Arg Ser Leu Asn Ser 510 Lys Phe Trp val Pro Ser Lys 525 Ile Pro Arg Lys Ala Gin Lys 555 540 Gin <210>5 <211>2 586 <212> ADN <213> Rattus norvegicus <220> <221> CDS <222> (202) . . (1212) <223> Fit-lS <400>5 70 gggtagtctg aagagaccag aggaaggagc accaagtagc ctcagggccc tgggtttatt 60 cttcccagcc cttcatctgg gctacactga tttctctttt ggaccctaca tcagacagca 120 cacatcaacc gcctagtgga ctcaccgtta ccttcctgtg ccattgccat cggagagatc 180 tcggccatca atcactagca c atg att ggc aaa tgg aga atg ggg ctt tgg 231
Met He Gly Lys Trp Arg Met Gly Leu Trp 15 10 gct ttg gca att ctg aca gtt ccc atg tat ttc ata gtg aca gag ggc 279
Ala Leu Ala Ile Leu Thr Vai Pro Met Tyr Phe Ile Vai Thr Glu Gly 15 20 25 aga aaa aca tcc tgg ggt cta gaa aac gag gct tta att gtc aga tgc 327 71 Arg Lys Thr ccc caa aga Pro Gin Arg 45 aca aat gaa Thr Asn 60 Glu aga gat cgt Arg 75 Asp Arg tat acg tgt Tyr Thr Cys aat gtc acc Asn Val Thr atg atg tac Met Met Tyr 125 tgt cca aca Cys Pro 140 Thr aag aac tgc Lys 155 Asn Cys tat ttg ttc Tyr Leu Phe tgt cga ttc Cys Arg Phe acc aga tca Thr Arg Ser 205 att aca aac Ile Thr 220 Asn aca gca aac Thr 235 Ala Asn nt-1 gct nh c Val Ala Val aaa gca aga Lys Ala Arg ggc atg att Gly Met Ile 285 aag gac ttc Lys Asp 300 Phe gtg ata agg Val 315 Ile Arg tgt ctc tca Cys Leu Ser
Ser Trp Gly 30 gga ggt gcg Gly Gly Ala aga att cct Arg Ile Pro ctg aag ttt Leu Lys Phe 80 gtt ate aga Val Ile Arg 95 ata tat aaa Ile Tyr Lys 110 tcg aca gta Ser Thr Val att gee ttg Ile Ala Leu aaa gct ctc Lys Ala Leu 160 att gac aaa Ile Asp Lys 175 act cac acg Thr His Thr 190 ttc aca gtt Phe Thr Val cct cca cac Pro Pro His att gee tgc Ile Ala Cys 240 tgg cag Leu Trp Gin 255 att caa gaa Ile Gin Glu 270 tgc tta acc Cys Leu Thr tcc ctg aaa Ser Leu Lys cac ccc gta His Pro Val 320 caa att gct Gin Ile Ala 335
Leu Glu Asn 35 att aac cct ile Asn Pro 50 act caa aag Thr Gin Lys 65 cta cca gee Leu Pro Ala age cct gaa Ser Pro Glu aga cca cca Arg Pro Pro 115 gat gga tca Asp Gly Ser 130 tat aat tgg Tyr Asn Trp 145 caa ggg cca Gin Gly Pro gtg agt cat Val Ser His gag aac gga Glu Asn Gly 195 gaa gaa aaa Glu Glu Lys 210 aac tac aca Asn Tyr Thr 225 tca gct tgc Ser Ala Cys att a a £ aaa Ile Asn Lys gag aaa ggc Glu Lys Gly 275 tca ctg tta Ser Leu Leu 290 tat gac tgt Tyr Asp Cys 305 aga ctg aga Arg Leu Arg
Glu Ala Leu gtg gaa tgg Val Glu Trp aga aat cgg Arg Asn Arg 70 aaa gtg gaa Lys Val Glu 85 tcg att aag Ser Ile Lys 100 aac tgc aaa Asn Cys Lys gat aaa aat Asp Lys Asn aca gcg cct Thr Ala Pro 150 agg ttc agg Arg Phe Arg 165 gtt gat gaa Val Asp Glu 180 acc aat tac Thr Asn Tyr ggc ttc tet Gly Phe Ser gtg gaa gtg Val Glu Val 230 ttt ggc aca Phe Gly Thr 245 a r*n dw-, ana att Thr Arg Ile 260 cca aat aaa Pro Asn Lys agg ata act Arg Ile Thr gtg gee atg Val Ala Met 310 agg aaa caa Arg Lys Gin 325
Ile Val 40 Arg tat tat tca Tyr 55 Tyr Ser ate ttc gtc Ile Phe Val gac tet ggg Asp Ser Gly acc gga tet Thr Gly Ser 105 ate cct gat Ile Pro 120 Asp tcc aag ata Ser 135 Lys Ile gtt cag tgg Val Gin Trp gca cac atg Ala His Met ggt gac tac Gly Asp Tyr 185 att gtg act Ile Val 200 Thr aca ttt cca Thr 215 Phe Pro gaa ata gga Glu Ile Gly gee tet cag Ala Ser Gin nrra tet ttt 33“ Gly Ser Phe 265 agt tcc age Ser Ser 280 Ser ggt gtg acc Gly 295 Val Thr aac cat cac Asn His His cca agt aag Pro Ser Lys
Cys aat Asn 375 tca Ser 423 att Ile 90 471 ttg Leu 519 tac Tyr 567 aca Thr 615 ttt Phe 663 tcc Ser 170 711 aca Thr 759 gee Ala 807 gta Val 855 aaa Lys 903 ttc Phe 250 951 ggc Gly 999 aat Asn 1047 gac Asp 1095 gga Gly 1143 gag Glu 330 1191 tga caaaattggc tgaatttgct gcaaaccaca 1242 atcctttttc tcagaggact gtgtgttata gcttggtccc aggggattca tcatgatcgt 1302 gggatcagtt ggccagtttc ctcaaatgtg tttttcatgt tgagaaagct ccttaaatct 1362 ggtctgtcca gaatgtttct gtcttctaga aggactctct gtcattgtat ctttcctctc 1422 72 tctgtttccc cttgtccttg ttctcctcac gttctctcta ctcttcttcc cttatctctg agtcaccctt tgcacatgct acaagggaca taaccctact gtgtttctcc ctttgtgact tggatgacca acttgatccc attttaaaag acactctctt atgatactaa ccactgcctc ttttaacttc tttcaaatat caagagggtg catagtgata tgtggggcat ttattgggat gtacctattg gataccatca agctgtgtca tggttctgtt tgtcttcttt ggtttgtttt ctagagttcc acctggcttt gcctctcagg ccagccagga tgtttcttgt tttggtttca ataaagtaga gtttgattca taggtggcca ggtcttaggc atccacccct tataatgctg gtgttatgag atggtggagg tcatggcaca gtctcaccag gcacaacctt gagtcctcac cagatttctg agtattctct agttacattt ttctgtattt gttttgtttg tgtgtggttt gttgctattc aaatcaatgt atctgtactg cgtgtctgtt gttgttgaat gata <210>6 <211>336
<212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 6 ggtcctcccc atcccttcac cttccttcac ggctccttct cacctgttag tggcttcttc ttggtgttga tactgggttg gaagcagtaa cttgtaacag aaaacaactt acacattagg agtagagaaa acatgatatt tttaccctta aatggcaata caactaatgt aaaaacatta tggaagggag agagacactg actctaagct taagatattg attaaatgat tagggtgggg ctgcctgaag tggtagttgg gatttttttt aactatagag accattctgc tcttgaactc tcctgggatt aaagccatat gtcaccttac attttagagc ctctggcttg taagattttt gagttgtgac tcatagatgg gttttagtga ttacccaggg tgactgtgga ccacagcact ttctatagga aaagagaagc caagccccta tgctctcctc tgccaacagg accttttgtc gtatttgaac tatatttgtg ttatctgtaa tgtatcttcc agattatttt taattcacct cttcatcaac acagcctgtt aaataaaagt 1482 1542 1602 1662 1722 1782 1842 1902 1962 2022 2082 2142 2202 2262 2322 2382 2442 2502 2562 2586 73
Met Ile Gly Lys Trp Arg Met Gly Leu Trp Ala Leu Ala Ile Leu Thr 1 5 10 15 Vai Pro Met Tyr Phe Ile Vai Thr Glu Gly Arg Lys Thr Ser Trp Gly 20 25 30 Leu Glu Asn Glu Ala Leu Ile Vai Arg Cys Pro Gin Arg Gly Gly Ala 35 40 45 Ile Asn Pro Vai Glu Trp Tyr Tyr Ser Asn Thr Asn Glu Arg Ile Pro 50 55 60 Thr Gin Lys Arg Asn Arg Ile Phe Vai Ser Arg Asp Arg Leu Lys Phe 65 70 75 80 Leu Pro Ala Lys vai Glu Asp Ser Gly Ile Tyr Thr Cys Vai Ile Arg 85 90 95 Ser Pro Glu Ser Ile Lys Thr Gly Ser Leu Asn Vai Thr Ile Tyr Lys 100 105 110 Arg Pro Pro Asn Cys Lys Ile Pro Asp Tyr Met Met Tyr Ser Thr Vai 115 120 125 Asp Gly Ser Asp Lys Asn Ser Lys Ile Thr Cys Pro Thr Ile Ala Leu 130 135 140 Tyr Asn Trp Thr Ala Pro Vai Gin Trp Phe Lys Asn Cys Lys Ala Leu 145 150 155 160 Gin Gly Pro Arg Phe Arg Ala His Met Ser Tyr Leu Phe Ile Asp Lys 165 170 175 Vai Ser His vai Asp Glu Gly Asp Tyr Thr Cys Arg Phe Thr His Thr 180 185 190 Glu Asn Gly Thr Asn Tyr Ile Vai Thr Ala Thr Arg Ser Phe Thr Vai 195 200 205 Glu Glu Lys Gly Phe Ser Thr Phe Pro Vai Ile Thr Asn Pro Pro His 210 215 220 Asn Tyr Thr Vai Glu Vai Glu Ile Gly Lys Thr Ala Asn Ile Ala Cys 225 230 235 240 Ser Ala Cys Phe Gly Thr Ala Ser Gin Phe Vai Ala vai Leu Trp Gin 245 250 255 Ile Asn Lys Thr Arg Ile Gly Ser Phe Gly Lys Ala Arg Ile Gin Glu 260 265 270 Glu Lys Gly Pro Asn Lys Ser Ser Ser Asn Gly Met Ile Cys Leu Thr 275 280 285 Ser Leu Leu Arg Ile Thr Gly Vai Thr Asp Lys Asp Phe Ser Leu Lys 290 295 300 Tyr Asp Cys Vai Ala Met Asn His His Gly Vai Ile Arg His Pro Vai 305 310 315 320 Arg Leu Arg Arg Lys Gin Pro Ser Lys Glu Cys Leu Ser Gin Ile Ala 325 330 335
<210>7 <211>2 06 5 <212> ADN <213> Rattus norvegicus <220>
<221> CDS
<222> (275)..(1975) <223> Fit-1M 74 <400> 7 aggagaaaag actgggatat gctagcttgc tagctccagc aagcggcggt atgcgcggtc €0 tttaaaatag acagacatag aggctttggg ggagaggaag aagtgcctgg gatgaagaag 120 agatgcacct acccggcagg ggtgaaatcc caagctacac tgatttctct tttggaccct 180 acatcagaca gcacacatca accgcctagt ggactcaccg ttaccttcct gtgccattgc 240 catcggagag atctcggcca tcaatcacta gcac atg att ggc aaa tgg aga atg 295
Met Ile Gly Lys Trp Arg Met 1 5 ggg ctt tgg gct ttg gca att ctg aca gtt ccc atg tat ttc ata gtg 343 Gly Leu Trp Ala Leu Ala Ile Leu Thr Val Pro Met Tyr Phe Ile Val 10 15 20 aca gag ggc aga aaa aca tcc tgg ggt cta gaa aac gag gct tta att 391 Thr Glu Gly Arg Lys Thr Ser Trp Gly Leu Glu Asn Glu Ala Leu Ile 25 30 35 gtc aga tgc ccc caa aga gga ggt gcg att aac cct gtg gaa tgg tat 439 vai Arg Cys Pro Gin Arg Gly Gly Ala Ile Asn Pro Val Glu Trp Tyr 40 45 50 55 tat tca aat aca aat gaa aga att cct act caa aag aga aat cgg ate 487 Tyr Ser Asn Thr Asn Glu Arg Ile Pro Thr Gin Lys Arg Asn Arg Ile 60 65 70 ttc gtc tca aga gat cgt ctg aag ttt cta cca gee aaa gtg gaa gac 535 Phe Vai Ser Arg Asp Arg Leu Lys Phe Leu Pro Ala Lys Val Glu Asp 75 SQ 85 tct ggg att tat acg tgt gtt ate aga age cct gaa tcg att aag acc 583 Ser Gly Ile Tyr Thr Cys Val ile Arg Ser Pro Glu Ser Ile Lys Thr 90 95 100 gga tct ttg aat gtc acc ata tat aaa aga cca cca aac tgc aaa ate 631 Gly Ser Leu Asn Vai Thr Ile Tyr Lys Arg Pro Pro Asn Cys Lys Ile 105 110 115 cct gat tac atg atg tac tcg aca gta gat gga tca gat aaa aat tcc 679 Pro Asp Tyr Met Met Tyr Ser Thr Val Asp Gly ser ASp Lys Asn Ser 120 125 130 135 aag ata aca tgt cca aca att gee ttg tat aat tgg aca gcg cct gtt 727 Lys Ile Thr Cys Pro Thr Ile Ala Leu Tyr Asn Trp Thr Ala Pro Val 140 145 150 cag tgg ttt aag aac tgc aaa gct ctc caa ggg cca agg ttc agg gca 775 Gin Trp Phe Lys Asn Cys Lys Ala Leu Gin Gly Pro Arg Phe Arg Ala 155 160 165 cac atg tcc tat ttg ttc att gac aaa gtg agt cat gtt gat gaa ggt 823 His Met Ser Tyr Leu Phe Ile Asp Lys Val Ser His val Asp Glu Gly 170 175 180 gac tac aca tgt cga ttc act cac acg gag aac gga acc aat tac att 871 Asp Tyr Thr Cys Arg. Phe Thr His Thr Glu Asn Gly Thr Asn Tyr Ile 185 190 195 75 gtg act gee acc aga tea ttc aca gtt gaa gaa aaa ggc ttc tct aca 919 Vai Thr Ala Thr Arg Ser Phe Thr Val Glu Glu Lys Gly Phe Ser Thr 200 205 210 215 tct cca gta att aca aac cct cca cac aac tac aca gtg gaa gtg gaa 967 Phe Pro val Ile Thr Asn Pro Pro His Asn Tyr Thr Val Glu Val Glu 220 225 230 ata gga aaa aca gea aac att gee tgc tea gct tgc ttt ggc aca gee 1015 Ile Gly Lys Thr Ala Asn Ile Ala Cys Ser Ala Cys Phe Gly Thr Ala 235 240 245 tct cag ttc gtt gct gtc ctg tgg cag att aac aaa a cg aga att gga 1063 Ser Gin Phe Val Ala Val Leu Trp Gin He Asn Lys Thr Arg Ile Gly 250 255 260 tct ttt gg<= aaa gea aga att caa gaa gag aaa ggc cca aat aaa agt 1111 Ser Phe Gly Lys Ala Arg Ile Gin Glu Glu Lys Gly Pro Asn Lys Ser 265 270 275 tcc age aat ggc atg att tgc tta acc tea ctg tta agg ata act ggt 1159 Ser Ser Asn Gly Met Ile Cys Leu Thr Ser Leu Leu Arg Ile Thr Gly 280 285 290 295 gtg acc gac aag gac ttc tcc ctg aaa tat gac tgt gtg gee atg aac 1207 Vai Thr Asp Lys Asp Phe Ser Leu Lys Tyr Asp Cys Val Ala Met Asn 300 305 310 cat cac gga gtg ata agg cac ccc gta aga ctg aga agg aaa caa cca 1255 His His Gly val Ile Arg His Pro Val Arg Leu Arg Arg Lys Gin Pro 315 320 325 att gac cac caa age acc tac tac ata gtt gee gga tgt agt tta ttg 1303 Ile Asp His Gin Ser Thr Tyr Tyr Ile Val Ala Gly Cys Ser Leu Leu 330 335 340 cta atg ttt ate aat gtc ttg gtg ata gtc tta aaa gtg ttc tgg act 1351 Leu Met Phe Ile Asn Val Leu Val Ile Val Leu Lys Val Phe Trp Ile 345 350 355 gag gtt gct ctg ttc tgg aga gat ata atg gea cct tac aaa acc cag 1399 Glu vai Ala Leu Phe Trp Arg Asp Ile Met Ala Pro Tyr Lys Thr Gin 360 365 370 375 aat gat gga aag ctc tat gat gct tac ate att tac cct cgg gtc tcc 1447 Asn Asp Gly Lys Leu Tyr Asp Ala Tyr Ile Ile Tyr Pro Arg Val Phe 380 385 390 cgg ggc age gea gea ggg acc ggc tct gtg gag tac ttt gtt cac tac 1495 Arg Gly Ser Ala Ala Gly Thr Gly Ser val Glu Tyr Phe Val His Tyr 395 400 405 act ctg ccc gac gtt ctc gaa aat aaa tgt ggc tac aag ttg tgc act 1543 Thr Leu Pro Asp Val Leu Glu Asn Lys Cys Gly Tyr Lys Leu Cys Ile 410 415 420 tac ggg aga gac ctg ctg cct ggg caa gat gcg gee act gtg gtg gaa 1591 Tyr Gly Arg Asp Leu Leu Pro Gly Gin Asp Ala Ala Thr Val Val Glu 425 430 435 age agt ate cag aat agt aga cgg caa gtg ttt gtc ctg gee cct cac 1639 Ser Ser Ile Gin Asn Ser Arg Arg Gin Val Phe val Leu Ala Pro His 440 445 450 4 55 atg atg cac age aaa gag ttt gee tat 9*9 cag gag ate gee ctg cac 1687 Met Met His Ser Lys Glu Phe Ala Tyr Glu Gin Glu Ile Ala Leu His 460 465 470 age gee ctc ate cag aac aac tcc aag gtg att ctg att gaa atg gag 1735 Ser Ala Leu Ile Gin Asn Asn Ser Lys val Ile Leu Ile Glu Met Glu 475 480 485 cct atg 991 gag gea age cga ctg cag ctt ggg gat ctg caa gat tct 1783 Pro Met Gly Glu Ala Ser Arg Leu Gin Leu Gly Asp Leu Gin Asp ser 490 495 500 ctc cag cat ctt gtg aaa atg cag ggg acc ate aag tgg agg gaa gac 1831 Leu Gin His Leu Val Lys Met Gin Gly Thr Ile Lys Trp Arg Glu Asp 505 510 515 cac gtg gee gac aaa cag tct cta age tcc aaa ttc tgg aag cat gtg 1879 His Vai Ala Asp Lys Gin Ser Leu Ser Ser Lys Phe Trp Lys HiS Val 76 520 525 530 aga tac caa atg cca gtc ccg aaa aga cec ccc
Arg Tyr Gin Met Pro Vai Pro Lys Arg Pro Pro 540 545 gcc gct ccg ttg age ggc aag gtg tgc ttg gac
Ala Ala Pro Leu Ser Gly Lys Vai Cys Leu Asp 555 560 gtcgtggact tgcctactca gagctgggga atcccagcag gtgaagactt gaaatgccaa gggtggggcc
<210>8 <211>56 6 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 8 535 aag atg gea tet gtt 1927 Lys Met Ala Ser 550 vai ctg Leu aaa Lys cac His 565 ttt Phe tga 1975 taggccccag aagtgaaggt 2035 2065 77
Met Ile Gly Lys Trp Arg Met Gly Leu Trp Ala Leu Ala Ile Leu Thr 1 5 10 15 Vai Pro Met Tyr Phe Ile Vai Thr Glu Gly Arg Lys Thr Ser Trp Gly 20 25 30 Leu Glu Asn Glu Ala Leu Ile Vai Arg Cys Pro Gin Arg Gly Gly Ala 35 40 45 Ile Asn Pro Vai Glu Trp Tyr Tyr Ser Asn Thr Asn Glu Arg Ile Pro 50 55 60 Thr Gin Lys Arg Asn Arg Ile Phe Vai Ser Arg Asp Arg Leu Lys Phe 65 70 75 80 Leu Pro Ala Lys Vai Glu Asp Ser Gly Ile Tyr Thr Cys Vai Ile Arg 85 90 95 Ser Pro Glu Ser Ile Lys Thr Gly Ser Leu Asn Vai Thr Ile Tyr Lys 100 105 110 Arg Pro Pro Asn Cys Lys Ile Pro Asp Tyr Met Met Tyr Ser Thr Vai 115 120 125 Asp Gly Ser Asp Lys Asn Ser Lys Ile Thr Cys Pro Thr Ile Ala Leu 130 135 140 Tyr Asn Trp Thr Ala Pro Vai Gin Trp Phe Lys Asn Cys Lys Ala Leu 145 150 155 160 Gin Gly Pro Arg Phe Arg Ala His Met Ser Tyr Leu Phe ile Asp Lys 165 170 175 Vai Ser His Vai Asp Glu Gly Asp Tyr Thr Cys Arg Phe Thr His Thr ISO 185 190 Glu Asn Gly Thr Asn Tyr Ile Vai Thr Ala Thr Arg Ser Phe Thr Vai 195 200 205 Glu Glu Lys Gly Phe ser Thr Phe Pro Vai Ile Thr Asn Pro Pro His 210 215 220 Asn Tyr Thr Vai Glu Vai Glu Ile Gly Lys Thr Ala Asn Ile Ala Cys 225 230 235 240 Ser Ala cys Phe Gly Thr Ala Ser Gin Phe Vai Ala Vai Leu Trp Gin 245 250 255 Ile Asn Lys Thr Arg Ile Gly Ser Phe Gly Lys Ala Arg lie Gin Glu 260 265 270 Glu Lys Gly Pro Asn Lys Ser Ser Ser Asn Gly Met Ile Cys Leu Thr 275 280 285 Ser Leu Leu Arg Ile Thr Gly Vai Thr Asp Lys Asp Phe Ser Leu Lys 290 295 300 Tyr Asp Cys Vai Ala Met Asn His His Gly Vai Ile Arg His Pro Vai 305 310 315 320 Arg Leu Arg Arg Lys Gin Pro Ile Asp His Gin Ser Thr Tyr Tyr Ile 325 330 335 Vai Ala Gly Cys Ser Leu Leu Leu Met Phe Ile Asn Vai Leu Vai Ile 340 345 350 Vai Leu Lys Vai Phe Trp Ile Glu Vai Ala Leu Phe Trp Arg Asp Ile 355 360 365 78
Met Ala 370 Pro Tyr lie 385 Ile Tyr Pro val Glu Tyr Phe Cys Gly Tyr Lys 420 ASp Ala Ala 435 Thr Val Phe 450 Val Leu Glu 465 Gin Glu Ile Val Ile Leu Ile Leu Gly Asp Leu 500 Thr Ile Lys 515 Trp Ser Lys 530 Phe Trp Pro 545 Pro Lys Met Leu Asp Leu Lys
Lys Thr Gin 375 Asn Arg Val 390 Phe Arg Val 405 His Tyr Thr Leu Cys Ile Tyr Val Val Glu Ser 440 Ala Pro His 455 Met Ala Leu 470 His Ser Glu 485 Met Glu Pro Gin Asp Ser Leu Arg Glu Asp His 520 Lys His val 535 Arg Ala His 565 Ser 550 Phe Val Ala
Asp Gly Lys Leu 380 Gly Ser Ala 395 Ala Leu Pro 410 Asp val Gly 425 Arg Asp Leu Ser Ile Gin Asn Met His Ser Lys 460 Ala Leu Ile 475 Gin Met Gly 490 Glu Ala Gin 50S His Leu Val Val Ala Asp Lys Tyr Gin Met Pro 540 Ala Pro Leu 555 Ser
Tyr Asp Ala Tyr Gly Thr Gly Ser 400 Leu Glu Asn 415 Lys Leu Pro 430 Gly Gin Ser 445 Arg Arg Gin Glu Phe Ala Tyr Asn Asn Ser Lys 480 Ser Arg Leu 495 Gin Lys Met 510 Gin Gly Gin 525 ser Leu Ser Val Pro Lys Arg Gly Lys Val Cys 560 79
DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO
Esta lista de documentos referidos pelo autor da presente solicitação de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.
Documentos de patente referidos na descrição • US 4816567 A [0054] • US 5225539 A [0054] • US 5585089 A [0054] • US 5693762 A [0054] • US 5859205 A [0054] • WO 9204381 A [0054] • US 60379173 B [0125]
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Claims (10)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Um método in vitro de predição do risco de mortalidade e/ou nova ou agravamento de insuficiência cardíaca congestiva (ICC) para um indivíduo com uma patologia cardiovascular seleccionada do grupo que consiste em ICC e enfarte do miocárdio (EM), sendo que o método compreende: obter um nível de proteína IL1RL-1 solúvel numa amostra biológica que compreende soro do indivíduo; e comparar o dito nível de proteína IL1RL-1 solúvel com um valor predeterminado específico para a patologia cardiovascular; em que um nível elevado de proteína IL1RL-1 solúvel em comparação com o valor predeterminado é indicativo de um risco aumentado de mortalidade dentro de 30 dias e/ou nova ou agravamento de ICC dentro de 30 dias, e a proteína IL1RL-1 solúvel é um produto de expressão de uma sequência de ácido nucleico como é representado na SEQ ID NO. 1. 2. 0 método de acordo com a reivindicação 1, em que o nível de proteína IL1RL-1 solúvel é determinado dentro de 12 horas de um episódio de desconforto isquémico ou 1, 3, 12 ou 24 horas depois disso. 3. 0 método de acordo com a reivindicação 2, em que o nível de proteína IL1RL-1 solúvel é determinado dentro de 6 horas de um episódio de desconforto isquémico ou 1, 3, 12, ou 24 horas depois disso. 4. 0 método de acordo com a reivindicação 1 que compreende as etapas de: (a) colocar em contacto uma amostra biológica que compreende soro de um indivíduo com um anticorpo ou fragmento de ligação a antigénio do mesmo que se liga especificamente a proteína IL1RL-1 solúvel; e 2 (b) medir a quantidade de anticorpo ligado e determinar a partir disso se o nível da dita proteína IL1RL-1 solúvel é elevado em comparação com o nível predeterminado. 5. 0 método de acordo com a reivindicação 4, em que o anticorpo ou fragmento de ligação a antigénio do mesmo é marcado com um marcador detectável. 6. 0 método de acordo com a reivindicação 1 ou 4, que compreende ainda medir pelo menos um outro biomarcador. 7. 0 método de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3 e 6, em que o valor predeterminado específico para a patologia cardiovascular é uma pluralidade de intervalos de valores predeterminados e a dita etapa de comparação compreende determinar em qual dos ditos intervalos de valores predeterminados o dito nível do indivíduo está. 8. 0 método de acordo com a reivindicação 1, em que o indivíduo recebeu ou está a receber tratamento para uma patologia cardiovascular.
9. Um método In vítro para predizer o risco de mortalidade e/ou nova ou agravamento de insuficiência cardíaca congestiva (ICC) para um indivíduo com uma patologia cardiovascular seleccionada do grupo que consiste em ICC e enfarte do miocárdio (EM), sendo que o método compreende: obter um primeiro nível de proteína IL1RL-1 solúvel numa amostra que compreende soro de um indivíduo; obter um segundo nível de proteína IL1RL-1 solúvel numa amostra subsequente que compreende soro do mesmo indivíduo; e comparar a mudança no nível da proteína IL1RL-1 com um valor predeterminado específico para a patologia cardiovascular, em que uma mudança no nível da proteína 3 IL1RL-1 que excede o valor predeterminado é indicativo de um risco aumentado de mortalidade dentro de 30 dias e/ou nova ou agravamento de ICC dentro de 30 dias.
10. O método de acordo com a reivindicação 9, em que o primeiro nível é obtido dentro de 24 horas de um EM.
11. O método de acordo com a reivindicação 8 ou 9, em que o segundo nível é obtido aproximadamente 2 semanas após o primeiro.
12. O método de acordo com a reivindicação 9, em que uma mudança no nível de proteína IL1 RL-1 solúvel que excede o valor predeterminado é indicativo de um risco aumentado de uma necessidade de transplante cardíaco. 13. 0 método de acordo com a reivindicação 9, que compreende ainda medir pelo menos um outro biomarcador no indivíduo. 14. 0 método de acordo com as reivindicações 6 ou 13, em que o outro biomarcador é uma catecolamina circulante, angiotensina II, creatinina, creatinina quinase MB isoenzima (CK-MB), proteína C reactiva (CRP), troponina, um péptido natriurético ou um índice de stress oxidativo.
15. O método de acordo com a reivindicação 1, 4, ou 9, que compreende ainda medir troponina e péptido natriurético cerebral (BNP) no indivíduo.
16. O método de acordo com a reivindicação 14 ou 15, em que a troponina é troponina cardíaca I. 4 17. 0 método de acordo com a reivindicação 14, em que a catecolamina circulante é norepinefrina, dopamina ou epinefrina. 18. 0 método de acordo com a reivindicação 14, em que o péptido natriurético é péptido natriurético cerebral (BNP) ou péptido natriurético pró-atrial (ProANP). 19. 0 método de acordo com a reivindicação 18, em que o péptido natriurético é péptido natriurético cerebral (BNP).
20. O método de acordo com a reivindicação 14, em que o índice de stress oxidativo é adrenolutina ou malondialdeído.
21. O método de acordo com a reivindicação 1, 4, ou 19, em que a amostra biológica é uma amostra de sangue ou de soro. 22. 0 método de acordo com a reivindicação 9, em que o indivíduo recebeu ou está a receber tratamento para uma patologia cardiovascular.
23. O método de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 22, em que a proteína IL1RL-1 solúvel tem uma sequência de SEQ ID NO.2.
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