CN1668763B - 作为心血管病的标志和治疗靶的il1rl-1 - Google Patents

Abstract

本发明涉及诊断和治疗心血管疾病的方法和组合物。更特别地，本发明涉及可以用于诊断和/或治疗心血管疾病的分离的分子，所述心血管疾病包括心脏肥大，心肌梗塞，中风，动脉硬化，和心力衰竭。

Description

作为心血管病的标志和治疗靶的IL1RL-1

发明领域

本发明涉及诊断和治疗心血管疾病的方法和组合物。更特别地，本发明涉及可用于治疗心血管疾病的分离的分子，所述心血管疾病包括心脏肥大，心肌梗塞，中风，动脉硬化，和心力衰竭。

发明背景

在发达国家中，尽管在心血管疾病的治疗上已经取得了很大进展，但是心血管疾病仍然是疾病和死亡的最常见的原因。因此，心血管疾病如心肌梗塞和中风的预防和治疗已经成为主要为公共健康服务的一个重要领域。目前已经认识到了几个心血管疾病发病的危险因素，并且已经在临床上广泛用于发现高危患者。这种筛选检查包括评估总的和HDL胆固醇水平。但是，许多明显是低度到中度危险的患者也会发生心血管疾病，而辨别这类患者的能力还非常有限。而且，累积数据表明在不同的患者人群中，对具有患心血管疾病危险的患者和已患有心血管疾病的患者进行的预防性和治疗性治疗的有益效果的程度也有所不同。然而，目前还缺乏用于确定某种治疗效果较好还是效果较差的诊断性检测数据。

发明简述

本发明提供了用于诊断和治疗心血管疾病的方法和组合物。更特别地，本发明识别了基因，当心脏细胞受到机械诱导而变形的时候该基因在细胞中受到正调控。基于这个发现，本发明的分子可用于治疗心血管(包括血管)疾病，包括心脏肥大，心肌梗塞，中风，动脉硬化，和心力衰竭。

除此之外，还提供了使用这些分子诊断任何上述心血管(血管)疾病的方法。

还进一步提供了用于制备治疗上述疾病的治疗剂的组合物。

因此本发明在几个方面包括了多肽，编码这些多肽的分离核酸，上述分子的功能性修饰物和变体，上述分子的有用片段，以及相关的治疗方法和诊断方法。

根据本发明的一个方面，提供了一种诊断由核酸分子的异常表达及其表达产物的异常(或上述分子的独特片段的异常)表征的疾病的方法。该方法包括使来自患者的生物样品与试剂接触，所述试剂特异地与所述核酸分子，其表达产物，或者其表达产物的片段结合，检测所结合试剂的量，由此确定所述核酸分子的表达或者其表达产物是否有异常，表达有异常即诊断为疾病，其中所述核酸分子为白介素1受体样1(IL1RL-1，也称为T1/ST2，ST2，和Fit-1，SEQ ID NO：1和2是可溶形式，SEQ ID NO：3和4是膜结合形式)。术语IL1RL-1，T1/ST2，ST2和Fit-1在本说明书中可以互换使用。在一些实施方案中，所述疾病是选自下组的心血管疾病：心肌梗塞，中风，动脉硬化，和心力衰竭。在一个实施方案中，所述疾病是心脏肥大。在另一个实施方案中，所述疾病是心力衰竭。在特定的实施方案中，生物样品包括生物活组织切片样品，以及生物流体例如血液/血清。

根据本发明的另一个方面，提供了确定患者的心血管疾病阶段(例如退化，发展或者发作)的方法，其中所述阶段由核酸分子的异常表达及其表达产物的异常(或上述分子的特定片段的异常)表征。所述方法包括监控患者样品的选自下组的参数：(i)IL1RL-1核酸分子(或其独特片段)，(ii)由IL1RL-1核酸编码的多肽，(iii)由该多肽衍生的肽(或其独特片段)，以及(iv)可选择性结合所述多肽或肽(或其独特片段)的抗体，这些参数可以确定患者的所述心血管疾病(例如退化，发展或者发作)所处的阶段。在一些实施方案中，所述样品是任何前述实施方案中所述的生物流体或是组织。在特定的实施方案中，监控的步骤包括使所述样品与一种选自下组的可检测到的试剂接触：(a)可在严谨条件下与(i)所述核酸分子选择性杂交的分离的核酸分子，(b)可选择性地与(ii)所述多肽，或者(iii)所述的肽结合的抗体，以及(c)可选择性地与(iv)的抗体结合的多肽或肽。所述抗体，多肽，肽，或核酸都可以用可检测到的标记例如放射性标记或酶进行标记。在另一个实施方案中，所述方法包括监控(检测)样品中的肽。在另一个实施方案中，对样品的监控持续一段时间。

根据本发明的一个方面，提供了一种试剂盒。所述试剂盒包括容器，其中含有可以选择性地与任何上述IL1RL-1分离核酸，或其表达产物结合的试剂，以及对照，用于与所述试剂与任意上述分离核酸或其表达产物的结合的测量值进行比较。在一些实施方案中，用于与测量值进行比较的对照具有预先确定的值。在特定的实施方案中，对照包括任意上述分离核酸的表达产物的表位。

根据本发明的一个方面，提供了一种治疗心血管疾病的方法。所述方法包括给需要这种治疗的患者施用有效量的可治疗心血管疾病的IL1RL-1分子。在特定的实施方案中，所述心血管疾病选自心肌梗塞，中风，动脉硬化，和心力衰竭。在一些实施方案中，所述方法进一步包括同时给予选自下组的制剂：抗炎制剂，抗血栓形成制剂，抗血小板制剂，纤维蛋白溶解剂，降脂剂，直接凝血酶抑制剂，糖蛋白IIb/IIIa受体抑制剂，能与细胞粘附分子结合并能抑制白细胞与这些分子接触的能力的制剂，钙通道阻断剂，β-肾上腺素受体阻断剂，环氧合酶-2抑制剂，或者血管紧张素系统抑制剂。

根据本发明的另一个方面，提供了一种治疗心脏肥大的方法。所述方法包括给需要这种治疗的患者施用有效量的可治疗患者的心脏肥大的制剂以增加IL1RL-1核酸分子或者其表达产物的表达。

根据本发明的另一个方面，提供了一种治疗患者以减少患者发生心血管疾病的危险性的方法。所述方法包括给IL1RL-1分子表达水平异常的患者施用有效量的能减少心血管疾病危险性，或者降低患者在未来发生心血管疾病的危险性的制剂，其中所述制剂是抗炎制剂，抗血栓形成制剂，抗血小板制剂，纤维蛋白溶解剂，降脂剂，直接凝血酶抑制剂，糖蛋白IIb/IIIa受体抑制剂，能与细胞粘附分子结合并能抑制白细胞与这些分子接触的能力的制剂，钙通道阻断剂，β-肾上腺素受体阻断剂，环氧合酶-2抑制剂，或者血管紧张素系统抑制剂。在特定的实施方案中，所述患者没有需要用所述制剂治疗的其它症状。

根据本发明的一个方面，提供了一种鉴定可用于治疗心血管疾病的候选试剂的方法。所述方法包括在不存在候选试剂的条件下测定心脏细胞或组织中IL1RL-1分子的表达，其中所述心脏细胞或组织中IL1RL-1分子的为第一种表达量，使所述心脏细胞或组织与候选试剂接触，测定所述IL1RL-1分子表达的检测量，其中在存在候选试剂的条件下表达的检测量与第一种表达量相比有所降低，表明该候选试剂可用于治疗心血管疾病。在重要的实施方案中，IL1RL-1分子是任一个SEQ ID NO：1-4所述的分子。在特定的实施方案中，所述心血管疾病选自心脏肥大(例如非适应性肥大)，心肌梗塞，中风，动脉硬化，和心力衰竭。

根据本发明的另一个方面，提供了一种药物组合物。所述药物组合物包括一种试剂，所述试剂包括制药有效量的可治疗心血管疾病的IL1RL-1分离核酸分子(SEQ ID NO：1或3)，或其表达产物(例如SEQ ID NO：2或4)，以及药学可接受的载体。在特定的实施方案中，所述心血管疾病选自心脏肥大，心肌梗塞，中风，动脉硬化，和心力衰竭。

根据本发明的再一方面，还提供了制备用于治疗心血管疾病的药物的方法。所述药物优选包括有效量的至少一种上述分子或组合物。

根据本发明的另一个方面，提供了固相核酸分子阵列。所述阵列基本由一组核酸分子，其表达产物，或其片段(核酸片段或者多肽分子片段)组成，其中至少一种IL1RL-1分子(包括其表达产物，或其片段)固定于固相底物之上。在一些实施方案中，固相阵列进一步包括至少一种对照核酸分子。

在特定的实施方案中，所述固相底物包括选自下组的物质：玻璃，硅，硅酸铝，硅酸硼，金属氧化物例如氧化铝和氧化镍，各种粘土，硝化纤维素，和尼龙。优选所述底物是玻璃。在一些实施方案中，所述核酸分子通过共价结合固定于固体底物之上。

根据本发明的另一个方面，提供了评价患者在用能减少心血管疾病危险性的试剂进行的治疗中获益的可能性的方法。在重要的实施方案中，所述试剂选自抗炎制剂，抗血栓形成制剂，抗血小板制剂，纤维蛋白溶解剂，降脂剂，直接凝血酶抑制剂，糖蛋白IIb/IIIa受体抑制剂，能与细胞粘附分子结合并能抑制白细胞与这些分子接触的能力的制剂，钙通道阻断剂，β-肾上腺素受体阻断剂，环氧合酶-2抑制剂，或者血管紧张素系统抑制剂。所述方法包括获得患者的IL1RL-1分子水平，将所述IL1RL-1分子水平与心血管疾病诊断特异性的预定值相比较。所述IL1RL-1分子水平与预定值的比较可以表明患者是否通过用所述试剂进行的治疗而获益。在特定的实施方案中，心血管疾病诊断特异性的预定值是多个预定标记物水平范围，所述的比较步骤包括确定所述患者的水平落在哪个预定标记物水平范围中。所述心血管疾病可以是选自心脏肥大，心肌梗塞，中风，动脉硬化，和心力衰竭中的疾病。

本发明的另一个方面提供了一种预测心血管疾病结果的方法。所述方法包括获得患者的IL1RL-1分子水平，将所述IL1RL-1分子水平与心血管疾病的预测结果特异性的预定值相比较。所述IL1RL-1分子水平与预定值的比较可以表明患者是会具有好的/正的结果还是会具有坏的/负的结果。在一些实施方案中高水平的IL1RL-1分子可能表示负的结果，而低水平可能表示正的结果。在特定的实施方案中，心血管疾病的预测结果特异性的预定值是多个预定标记物水平范围，所述的比较步骤包括确定所述患者的水平落在哪个预定标记物水平范围中。所述心血管疾病可以是选自心脏肥大，心肌梗塞，中风，动脉硬化，和心力衰竭中的疾病。

IL1RL-1分子的任何序列都可以用于本发明的任何方面和任何实施方案中。例如，除了如SEQ ID NO：1和3所述的核苷酸序列之外，还包括如SEQ ID NO：5和7所述的核苷酸序列。除了包括如SEQ ID NO：2和4所述的预测氨基酸序列之外，还包括如SEQ ID NO：6和8所述的预测氨基酸序列。

本发明的这些方面和其他方面将通过发明详述来进一步详细描述。

序列简述

SEQ ID NO：1是人IL1RL1(可溶的)cDNA的核苷酸序列。

SEQ ID NO：2是人IL1RL1(可溶的)cDNA(SEQ ID NO：1)的翻译产物的预测氨基酸序列。

SEQ ID NO：3是人IL1RL1(膜结合的)cDNA的核苷酸序列

SEQ ID NO：4是人IL1RL1(膜结合的)(SEQ ID NO：3)的翻译产物的预测氨基酸序列。

SEQ ID NO：5是鼠Fit-1S cDNA的核苷酸序列。

SEQ ID NO：6是鼠Fit-1S cDNA(SEQ ID NO：5)的翻译产物的预测氨基酸序列。

SEQ ID NO：7是鼠Fit-1M cDNA的核苷酸序列。

SEQ ID NO：8是鼠Fit-1M cDNA(SEQ ID NO：7)的翻译产物的预测氨基酸序列。

附图简述

图1是Northern Blot结果，显示了经过一段时间以后8％周期性机械应变对于培养的心肌细胞中Fit-1的表达的影响。

图2是Northern Blot结果，显示了经过一段时间以后，8％周期性机械应变，血管紧张素受体的阻断，血管紧张素II，IL-1b，和佛波酯对于培养的心肌细胞中IL1RL-1的表达的影响。

图3是Northern Blot结果，显示了经过一段时间以后，8％周期性机械应变，过氧化氢，和TIRON对于培养的心肌细胞中IL1RL-1的表达的影响。

图4是Northern Blot结果，显示了经过一段时间以后，在心肌细胞发生8％周期性机械应变的过程中，放线菌素D和环己亚胺对于IL1RL-1表达的诱导的影响。

图5是Northern Blot结果，显示了经过一段时间以后，8％周期性机械力单独，或与IL-1b一起，以及在没有机械应变的条件下的佛波酯，对于IL1RL-1的表达的影响。

图6是Northern Blot结果，显示了经过一段时间以后，8％周期性机械应变对于培养的心肌细胞中空泡型ATP酶的表达的影响。

图7显示了本发明的试剂盒的外形特征。

图8显示了心肌细胞中机械应变对T2/ST2的mRNA诱导的早期(左)和晚期(右)阶段。3小时达到最大诱导量，维持9小时，然后经15小时下降。顶部组为T1/ST2 RNA；底部组为溴化乙锭。无应变为没有机械应变。

图9显示了通过机械应变(8％)，白介素-1(10ng/ml)和佛波酯(PMA，200nM)在1小时和3小时对T1/ST2的mRNA的诱导。PMA＞机械应变＞IL-1。顶部组为T1/ST2 mRNA，底部组为溴化乙锭。

图10显示了T1/ST2可能是在心肌细胞中IL1/IL-受体信号传导中由NF-kB的激活诱导的一种基因。IL-1和机械应变在用对照腺病毒感染的条件下诱导T1/ST2 mRNA(左)。在被I B腺病毒感染的条件下(右)会降低NF-B DNA的结合活性，IL-1对T1/ST2的诱导被阻断。机械应变对T1/ST2的诱导被I B腺病毒感染部分阻断，表明机械应变还通过另一种途径诱导T1/ST2。顶部组为T1/ST2 mRNA，底部组为溴化乙锭。

图11显示了小鼠心肌梗塞后T1/ST2蛋白的表达，在梗塞后1天和3天进行免疫组化分析。40倍放大。

图12以图解方式显示了人患者心肌梗塞后体循环中的ST2蛋白水平；a.在心肌梗塞后1天与14天和90天相比ST2蛋白显著增加；b.线性回归分析证明了在心肌梗塞后1天循环ST2蛋白和肌酸激酶之间有显著的正相关关系(p＜0.001)。Log ST2＝0.454(log CK)-1.07；c.心肌梗塞后1天循环ST2蛋白水平和和射血分数的四分位值分析。较低的射血分数伴随着较高的ST2蛋白。

图13显示了在随访的30天内，ST2基准水平的升高表示较高的死亡率。(对数秩，p＝0.0009)。

发明详述

本发明涉及多个基因的发现，当心脏细胞受到机械诱导发生应变变形的时候所述基因在细胞中受到正调控。由于这个发现，本发明的分子可以用于治疗心血管疾病，包括心脏肥大，心肌梗塞，中风，动脉硬化，和/或心力衰竭。

除此之外，还提供了使用这些分子诊断任何上述心血管疾病的方法。

进一步，还提供了用于制备治疗上述疾病的治疗剂的组合物。

这里所述的“正调控”是指提高基因和/或它所编码的多肽的表达。“提高表达”是指提高本发明的任何一种核酸(IL1RL-1，SEQ ID NO：1，3)的复制、转录、和/或翻译(即达到可检测的水平)，这些过程的任何一种受到正调控都会导致该基因(核酸)编码的多肽的浓度/量的增加。相反地，这里所述的“负调控”或“降低表达”是指降低基因和/或它所编码的蛋白的表达。基因表达的正调控或负调控可以直接根据分别检测所述基因的mRNA水平，或所述基因编码的多肽的蛋白表达水平的升高或降低确定，检测可以用所属领域已知的任何适当的方法，例如分别用核酸杂交或抗体检测方法，并与对照相比较。

这里所说的“心脏细胞”是指心肌细胞。

这里所说的“分子”包括“核酸”和“多肽”两者。

这里所说的“表达”指核酸和/或多肽表达。

这里所说的“患者”指哺乳动物或非人的哺乳动物。在所有的实施方案中，人核酸，多肽，以及人患者都是优选的。用人分子和其它文献所述的鼠分子得到的结果预示着用其它同源序列也可以得到这样的结果。

通常，同源序列和等位基因与本发明的人序列具有至少80％的核苷酸相同性和/或至少85％的氨基酸相同性。进一步，同源序列和等位基因可以与人序列分别具有至少90％，95％，或甚至99％的核苷酸相同性和/或至少95％，98％，或者甚至99％的氨基酸相同性。同源性可以用NCBI(Bethesda，Maryland)提供的各种公开软件计算。实例包括Altschul SF等的启发式算法(JMol Biol，1990，215：403-410)，也称为BLAST。可以用公共软件(EMBL，Heidelberg，Germany)和商业软件(例如OxfordMolecular Group/Genetics Computer Group，Madison，WI，Accelrys，Inc.，San Diego，CA的Mac Vector序列分析软件)进行Pairwiseand ClustalW对准排列(BLOSUM30矩阵设置)。本发明还包括上述核酸的Watson-Crick互补序列。

在筛选相关基因，例如本文所述的序列的同源序列和等位基因的时候，可以在严谨条件下进行Southern blot，并使用探针。这里所说的术语“严谨条件”是指所属领域所熟悉的参数。对于核酸来说，严谨杂交条件通常是指条件为低离子强度，温度低于DNA杂交复合物的熔解温度(Tm)(通常是比杂交的Tm低3℃)。较高的严谨条件有助于使探针序列和靶之间具有更高的特异性。核酸杂交的严谨条件是所属领域熟知的，可以在描述此方法的文献中找到，例如，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，J.Sambrook，et al.，eds.，Second  Edition，Cold  Spring  HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，1989，或者Current Protocols in Molecular Biology，F.M.Ausubel，et al.，eds.，John Wiley&Sons，Inc.，New York。“高度严谨条件”的一个实例是65℃，6×SSC。高度严谨条件的另一个实例是在65℃杂交，杂交缓冲液由3.5×SSC，0.02％Ficoll，0.02％聚乙烯吡咯烷酮，0.02％牛血清清蛋白，2.5mM NaH₂PO₄[pH7]，0.5％SDS，2mMEDTA组成。(SSC是0.015M氯化钠/0.15M柠檬酸钠，pH7；SDS是十二烷基磺酸钠；EDTA是乙二胺四乙酸)。杂交后，将DNA转移膜上，在室温用2×SSC洗涤，然后用0.1×SSC/0.1×SDS洗涤直至温度达到68℃。在另一个例子中，可用甲酰胺杂交溶液代替杂交水溶液。这时严谨杂交条件可以是，例如50％甲酰胺溶液，42℃。还可以使用其他条件，试剂等，也可以达到类似的严谨程度。所属领域技术人员熟知这些条件，因此这里不再描述。应当认识到，所属领域技术人员能够控制条件使得可以清楚地鉴定本发明的IL1RL-1核酸的同源序列和等位基因。所属领域技术人员还熟知筛选细胞的方法，表达这些分子文库，然后从文库中分离出相关核酸分子并测序。

根据本发明给出的全长人和鼠cDNA的克隆，可以用标准菌落杂交技术从cDNA文库中分离出其它哺乳动物序列例如与相关人和鼠核酸相应的(小鼠，牛等的)cDNA，还可以用同源性搜索进行识别，例如用这里描述的任何算法或所属领域已知的算法在GenBank中搜索。例如GenBank序列号Y07519.1和D13695.1是小鼠IL1RL-1的同源序列，在本发明的各个方面都可以和本发明的同源鼠序列互换使用，而不背离本发明的精神。

相应这里所说的核酸，术语“分离的”意思是：(i)在体外通过例如聚合酶链式反应(PCR)扩增；(ii)通过克隆产生重组体；(iii)通过切割和凝胶分离进行纯化；或者(iv)通过例如化学合成进行合成。分离的核酸可以容易地通过所属领域熟知的重组DNA技术获得。因此，在其5’和3’端的限制性位点已知的，或者已公开了其聚合酶链式反应(PCR)的引物序列的载体中所含有的核苷酸序列被认为是分离的，但是以天然状态存在的或是存在于其天然宿主中的核酸序列则不是分离的。分离的核酸可以被纯化，但是不需要纯化。例如在克隆或表达载体内的分离的核酸是不纯的，因为在细胞内它可能只包含微量的物质。但是这样的核酸如本文所用的术语一样是分离的，因为它可以很容易用所属领域普通技术人员所公知的标准技术获得。

根据本发明，本发明的任何上述IL1RL-1核酸的表达，包括上述序列的独特片段，可以用不同的方法确定。这里所说的相关核酸的“独特片段”是指较大核酸的“特征片段”。例如，独特片段应足够长，以确保它的精确序列在人基因组中除上述定义的每一个核酸之外都不存在。所属领域普通技术人员仅用常规实验就可以确定一个片段在人基因组中是否是独特的。但是，独特片段不包括完全由本申请的申请日之前公开的核苷酸序列组成的片段。

独特片段可以用作Southern和Northern blot检测的探针，以识别核酸，或者可以用于扩增检测例如使用PCR进行的检测。如所属领域技术人员所知，优选使用大的探针如200，250，300个或更多个核苷酸用于特定用途如Southern和Northern blots，而优选使用较小的片段用作其它用途如PCR。独特片段也可以用于产生融合蛋白以生成抗体，或者结合多肽片段，或者生成免疫检测成分。同样地，独特片段可以用于产生非融合片段，例如IL1RL-1多肽，它可用于，例如抗体的制备，免疫检测或治疗。独特片段进一步可用作反义分子，以分别抑制上述核酸和多肽的表达。

所属领域技术人员应当认识到，独特片段的大小取决于它们在遗传密码上的保守性。因此，SEQ ID NO：1，和3及其互补序列的一些区域的独特片段较长，而其它序列的独特片段较短，一般是12到32个核苷酸长(例如12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31和32个碱基)或者更多，直至每个公开的序列的全长。如上所述，本发明公开了每个序列的每一个片段，从第一个核苷酸，第二个核苷酸等等开始，直至离末端8个核苷酸，以每个序列的第8位，第9位，第10位核苷酸等等之后的任一个结束，直至最后一个核苷酸，(该序列如上所述是独特的)。例如，事实上SEQ ID NO：1从第1个核苷酸到第1357个核苷酸区域，或者SEQ ID NO：3从第1个核苷酸到第2058个核苷酸区域的任何片段，或其具有20个或更多个核苷酸的互补序列都是独特的。所属领域技术人员熟知选择这种序列的方法，典型地是基于独特片段能将所感兴趣的序列选择性地与人基因组中的其它序列区分开。将片段序列与已知数据库中的序列相比较就足够了，虽然还可以在体外进行验证性的杂交和测序分析。

本发明的特定方面包括选择性地与编码多肽的核酸分子结合以降低该多肽活性的反义寡核苷酸。

这里所说的“反义分子”，“反义寡核苷酸”，和“反义”所描述的寡核苷酸是寡核糖核苷酸，寡脱氧核糖核苷酸，修饰的寡核糖核苷酸，或者修饰的寡脱氧核糖核苷酸，它们可在生理条件下与含有特定基因的DNA或该基因的转录mRNA杂交，从而抑制该基因的转录和/或抑制该mRNA的翻译。反义分子应能通过与靶基因或其转录产物杂交从而干扰靶基因的转录或翻译。所属领域技术人员应当认识到反义寡核苷酸的确切长度以及它与靶互补的程度取决于所选择的特定靶，包括靶的序列以及组成该序列的特定碱基。优选反义寡核苷酸的组成和排布使其能够在生理条件下选择性地与靶结合，即在生理条件下相对于靶细胞中的其它序列更多地是与靶序列结合。基于SEQ ID NO：1，和3，或等位基因或同源染色体和/或cDNA序列，所属领域技术人员可以很容易选择并合成可用于本发明的任何适当的反义分子。要达到足够的选择性和抑制能力，反义寡核苷酸应当包括至少10个，更优选地至少15个与靶互补的连续碱基，虽然在特定的条件下，长度为7个碱基的修饰寡核苷酸也可成功用于反义寡核苷酸(Wagner et al.，Nat.Med，1995，1(11)：1116-1118；Nat.Biotech.，1996，14：840-844)。最优选地，反义寡核苷酸含有20-30个碱基的互补序列。

虽然寡核苷酸可以是基因或mRNA转录物的任何区域的反义物，在优选的实施方案中，反义寡核苷酸相应于N末端或者5’上游位点，例如翻译起始，转录起始或者启动子位点。除此之外，反义寡核苷酸也可以靶定3’未翻译区域。在所属领域中，也可以靶定mRNA剪接位点，但是如果存在其它的mRNA剪接则不倾向于使用这种方式。除此之外，反义物优选靶定不影响mRNA二级结构的位点(参见，例如，Sainio et al.，Cell Mol.Neurobiol.14(5)：439-457，1994)和不与蛋白质结合的位点。最后，虽然SEQ IDNO：1和3，公开了cDNA序列，所属领域普通技术人员可以很容易获得上述序列的基因组DNA序列。因此，本发明还提供了与SEQ ID NO：1和3相应的基因组DNA互补的反义寡核苷酸。类似地，无需过度的实验就可以获得其等位基因或者同源的人cDNA和基因组DNA的反义物。

本发明的寡核苷酸可以包括RNAi分子。RNA干扰或者说“RNAi”包括使用双链RNA(dsRNA)阻断基因表达(参见，例如Sui，G，et al，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99：5515-5520，2002)。本发明的实施方案中使用的RNAi策略方法是所属领域普通技术人员公知的。

在一些实施方案中，本发明的反义寡核苷酸可以由“天然的”脱氧核糖核苷酸，核糖核苷酸，或其任意组合组成。也就是说一个天然核苷酸的5’端和另一个天然核苷酸的3’端可以通过核苷间的磷酸二酯键共价结合，如天然状态那样。这些寡核苷酸可以通过所属领域公知的方法，通过人工操作或者用自动合成仪制备。它们也可以通过载体重组产生。

但是，在优选的实施方案中，本发明的反义寡核苷酸还包括“修饰的”寡核苷酸。也就是说，所述寡核苷酸可以通过多种方式修饰，修饰的方式不妨碍它们与其靶杂交，但是可以增强它们的稳定性或者它们对目标的靶定，或者增强它们的治疗效果。

这里所说的术语“修饰的寡核苷酸”是指这样的寡核苷酸：(1)其中至少两个核苷酸通过合成的核苷间连接(即除一个核苷酸的5’端和另一个核苷酸的3’端之间的磷酸二酯键以外的连接)相连和/或(2)其中通常不与核酸相连的化学基团与该寡核苷酸共价连接。优选的核苷间连接是硫逐磷酸酯，膦酸烷基酯，二硫代磷酸酯，磷酸酯，硫逐磷酸烷基酯，氨基磷酸酯，氨基甲酸酯，碳酸盐，磷酸三酯，乙酰胺，羧甲基酯和肽。

术语“修饰的寡核苷酸”还包括具有共价修饰的碱基和/或糖的寡核苷酸。例如，修饰的寡核苷酸包括具有与除3’位置的羟基以外的以及除5’位置的磷酸基团以外的低分子量的有机基团共价连接的骨架糖。因此修饰的寡核苷酸可以含有2’-O-烷基化核糖基团。除此之外，修饰的寡核苷酸可以含有糖例如用阿拉伯糖代替核糖。因此本发明包括含有在生理条件下与编码SEQ ID NO：2和/或4的多肽的核酸互补并与之杂交的修饰的反义分子的药物制备物，以及药学可接收的载体。

反义寡核苷酸可以作为药物组合物的一部分给药。这样的药物组合物可以含有反义寡核苷酸和所属领域公知的标准生理学和/或药学可接收的载体的组合。所述组合物应当是无菌的，并且在适于给患者施用的单位重量或单位体积中含有治疗有效量的反义寡核苷酸。术语“药学可接收的”是指不会干扰活性成分的生物学活性的效果的非毒性物质。术语“生理学可接收的”是指与生物系统例如细胞，细胞培养物，组织，或生物体相容的非毒性物质。载体的特征取决于给药的方式。生理学和药学可接收的载体包括稀释剂，填充物，盐，缓冲液，稳定剂，增溶剂，以及所属领域熟知的其它物质。

本发明还包括编码由SEQ ID NO：1和/或3的核酸，片段及其变异体编码的蛋白质的表达载体，以及含有这些表达载体的宿主细胞。实际上，任何细胞，不论是原核的或真核的，只要能被异源DNA或RNA转化并能在培养基中生长或维持，都可以用于本发明。实例包括细菌细胞例如大肠杆菌，和哺乳动物细胞例如小鼠，仓鼠，猪，羊，灵长类动物等。细胞可以是多种组织类型，包括肥大细胞，成纤维细胞，卵母细胞和淋巴细胞，它们可以是初始细胞或细胞系。特定的例子包括CHO细胞和COS细胞。也可以使用不含细胞的转录系统代替细胞。

这里所说的“载体”可以是任何核酸，其中所需要的序列可以通过限制性切割和连接插入该核酸，以在不同的遗传环境中传递或者在宿主细胞中表达。载体通常是由DNA组成，虽然RNA载体也可以使用。载体包括但不限于质粒，噬菌粒和病毒基因组。克隆载体是能够在宿主细胞内复制，并且可由一种多种内切酶限制性位点表征的载体，其中该载体可以以确定的方式切割，并且所需的DNA序列可以连接到其中并使新的重组载体保留了其在宿主细胞中复制的能力。如果载体是质粒，当质粒在宿主细菌增加拷贝数的时候所需序列可以复制多次，或者在宿主通过有丝分裂繁殖之前在每个宿主中只复制一次。如果载体是噬菌体，可以在溶胞阶段主动复制，或者在溶源阶段被动复制。表达载体是所需的DNA序列可以通过限制性切割和连接插入其中并且与调控序列可操作地连接并通过RNA转录表达的载体。载体可以进一步包括一个或多个适用于识别已经被或没有被载体转化或转染的细胞的标记序列。标记包括，例如编码可以增加或减少对抗体或其它化合物的抗性或敏感性的的蛋白的基因，编码其活性可以用所属领域公知的标准检测方法检测的酶的基因(例如-半乳糖苷酶或碱性磷酸酶)，以及可见的能影响所转化或转染细胞，宿主，菌落或噬斑的表型的基因(例如绿色荧光蛋白)。优选的载体是能够自发复制并表达存在于DNA区段中并与之可操作地连接的结构基因产物的载体。

这里所说的编码序列和调控序列，当它们共价连接以使编码序列的表达或转录受到调控序列的影响或控制的时候称为“可操作地连接”。如果需要，编码序列可以翻译为功能蛋白。如果5’调控序列的启动子诱导导致了编码序列的转录，并且如果两个DNA序列之间的连接状态不会(1)导致出现移码突变，(2)干扰启动子区域指导编码序列的转录，或者(3)干扰相应RNA转录物翻译成蛋白质的能力，则两个DNA被称为可操作地连接。因此，如果启动子区域能够影响DNA序列的转录并使转录产物能够被翻译成所需的蛋白质或多肽，则启动子区域应当是可操作地与编码序列连接。

基因表达所需的调控序列的确切特征随种属或细胞类型的不同而不同，但是通常包括，转录和反义分别所必需的5’非转录和5’非翻译序列，例如TATA盒，帽子序列，CAAT序列，等等。这种5’非转录调控序列通常包括启动子区域，该启动子区域含有对可操作连接的基因进行转录控制的启动子序列。调控序列还可以含有所需的增强子序列或者上游活化子序列。本发明的载体可以任选地含有5’前导序列或信号序列。选择和设计合适的载体在所属领域普通技术人员的能力和判断力之内。

含有所有表达所必需元件的表达载体是商业可获得的，也是所属领域技术人员公知的。参见，例如，Sambrook et al.，MolecularCloning：A Laboratory Manual，Second Edition，Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989。可以通过向细胞中引入编码多肽或其片段或变体的异源DNA(RNA)构建基因工程细胞。该异源DNA(RNA)可操作地受到转录元件的控制，使其可以在宿主细胞中表达异源DNA。

哺乳动物细胞中优选的mRNA表达系统包括例如pcDNA3.1(可从Invitrogen，Carlsbad，CA获得)，其含有可选择的标记例如赋予G418抗性的基因(有助于选择稳定转染的细胞系)，以及人巨细胞病毒(CMV)增强子-启动子序列。除此之外，适于在灵长类或犬细胞系中表达的是pCEP4载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)，其含有Epstein Barr病毒(EBV)复制起点，有助于使质粒成为多拷贝染色体外元件。另一种优选的表达载体是腺病毒，在Stratford-Perricaudet的文献中有描述，其是E1和E3蛋白缺陷型(J.Clin.Invest.90：626-630，1992)。

本发明还包括所谓的表达试剂盒，使得技术人员可以制备所需的表达载体。这种表达试剂盒包括至少上述讨论的每一个编码序列的分离部分。也可以加入其它所需的组分，只要其中含有所需的上述序列。

还应当认识到本发明包括上述SEQ ID NO：1和/或3，含有cDNA序列的表达载体转染宿主细胞和细胞系，如原核细胞(例如大肠杆菌)，或真核细胞(例如CHO细胞，COS细胞，酵母表达系统和昆虫细胞中的重组杆状病毒表达)的用途。特别有用的是哺乳动物例如小鼠，仓鼠，猪，羊，灵长类动物等的细胞。它们可以是多种组织类型，包括灵长类细胞和细胞系。特定的例子包括树突状细胞，U293细胞，外周血白细胞，骨髓干细胞和胚胎干细胞。

本发明还提供了由上述核酸(SEQ ID NO：1和3)编码的分离的多肽(包括整个蛋白和部分蛋白)，还包括SEQ ID NO：2和/或4的多肽，以及它们的独特片段。这种多肽可单独使用或作为融合蛋白的一部分生成抗体，或者作为免疫检测的组分。可以从生物样品包括组织或细胞匀浆中分离多肽，也可以在多种原核和真核表达系统中重组表达多肽，其是通过构建适合于表达系统的表达载体，将表达载体引入表达系统，分离重组表达蛋白。短的多肽，包括抗原性肽(例如由细胞表面的MHC分子呈递以进行免疫识别的肽)也可以用已知的肽合成方法化学合成。

就这里所说的多肽而言，术语“分离的”表示以足够纯的形式从其天然环境中分离出来，以使它能够用于本发明的任何目的。因此分离的表示足够纯以用于(i)产生和/或分离抗体，(ii)作为检测试剂，(iii)测序，(iv)作为治疗剂等。

每一个上述多肽的独特片段都具有如上所述的与核酸相关的独特片段的特征。所属领域技术人员应当认识到，独特片段的大小取决于各种因素如该片段是否由若干个保守蛋白域组成。因此，多肽的某些区域应当必须具有比较长的片段才是独特的，而其它区域只需要短的片段，一般是在5到12个氨基酸之间(例如5，6，7，8，9，10，11和12个氨基酸或更多，包括每一个整数直至每个多肽的全长)就可以。

多肽的独特片段优选是那些能保留该多肽的独特功能的片段。独特片段所保留的多肽的功能包括与抗体的相互作用，与其它多肽或其片段的相互作用，与其它分子的相互作用等。一种很重要的活性就是作为识别该多肽的特征。所属领域技术人员熟知选择独特氨基酸序列的方法，通常是基于独特片段能够将所感兴趣的序列与非家族成员区分开。所需要做的就是将所述片段的序列与已知数据库中的序列比较。

本发明包括上述多肽的变体。这里所说的多肽的“变体”是其中含有一个或多个天然(例如“野生型”：具有选自SEQ ID NO：2和4的氨基酸序列的多肽)多肽的初级氨基酸序列的修饰。能够产生多肽变体的修饰通常是对编码该多肽的核酸进行的，可以包括缺失，点突变，截断，氨基酸取代以及插入氨基酸或非氨基酸分子，其目的是：(1)降低或消除多肽的活性；(2)增强多肽的一种性质，例如蛋白质在表达系统中的稳定性或者蛋白-配体连接的稳定性；(3)为蛋白提供一种新的活性或性质，例如插入抗原性表位或者插入可检测到的分子，或者(4)为多肽受体或其它分子提供同等的或更好的连接。可选择地，修饰可以是直接针对多肽的，例如切割，插入连接体分子，插入可检测到的分子，例如生物素，插入脂肪酸等。修饰也可以包括含有该多肽全部或部分氨基酸序列的融合蛋白。所属领域技术人员应当熟悉预测蛋白质序列发生改变对于蛋白质构象的影响，并可以根据已知方法“设计”一种变体多肽。这种方法的一个实例如Dahiyat and Mayoin Science 278：82-87，1997所述，其中蛋白是完全新设计的。所述方法可以应用于已知蛋白，仅改变该多肽序列的一部分。使用Dahiyat and Mayo所述的的计算方法，可以得到任何上述多肽的特异变体，并进行检测以确定所述变体是否具有所希望的构象。

变体可以包括进行特定修饰的改变了与其生理活性无关的多肽性质的多肽。例如半胱氨酸残基可以被取代或者被删除以防止产生不希望的二硫键。类似地，可以改变特定的氨基酸以通过在表达系统中消除蛋白酶的蛋白质水解作用增强多肽的表达(例如酵母表达系统中的二元氨基酸残基，其中存在KEX2蛋白酶活性)。

编码多肽的核苷酸的突变优选保留了编码序列的氨基酸阅读框，优选不在核酸中产生可能杂交形成二级结构，例如发卡或环的区域，这不利于表达变体多肽。

可以通过选择氨基酸取代，或者通过在编码多肽的核酸的选定位点进行任意突变产生突变。然后表达变体多肽并检测其一种或多种活性以确定哪种突变得到的变体多肽具有所希望的性质。可以对其中所述多肽的氨基酸序列处于沉默状态，但是却具有在特定宿主中进行翻译的优选密码子的变体(或者非变体多肽)进行进一步突变。核酸在例如大肠杆菌中翻译的优选密码子是所属领域普通技术人员所熟知的。还可以对基因的非编码序列或cDNA克隆进行其它突变以增强多肽的表达。

所述领域技术人员应当认识到，可以对任意上述多肽进行保守性氨基酸取代，以提供上述多肽的功能相同的变体，即这些变体保留了每个多肽的功能。这里所说的“保守性氨基酸取代”是指氨基酸取代不显著改变多肽的三级结构和/或活性。可以使用所属领域普通技术人员公知的改变多肽序列的方法制备变体，包括那些描述此方法的参考文献中所述的方法，例如MolecularCloning：A Laboratory Manual，J.Sambrook，et al.，eds.，SecondEdition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，1989，或者Current Protocols in Molecular Biology，F.M.Ausubel，et al.，eds.，John Wiley&Sons，Inc.，New York。氨基酸的保守性取代包括在下列各组内的氨基酸取代：(a)M，I，L，V；(b)F，Y，W；(c)K，R，H；(d)A，G；(e)S，T；(f)Q，N；和(g)E，D。

因此本发明包括多肽的功能相同的变体，即保留着天然(“野生型”)多肽的功能的多肽变体。产生每个多肽的功能等同性变体的多肽氨基酸序列的保守性氨基酸取代是通过改变编码所述多肽的核酸得到的。可以用所属领域普通技术人员所公知的多种方法进行这种取代。例如，根据Kunkel(Kunkel，Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.82：488-492，1985)所述的方法进行PCR定向突变，位点定向突变，或者化学合成编码多肽的基因以进行氨基酸取代。多肽的功能等同性变体的活性可以通过下述方法检测：将编码改变的多肽的基因克隆到细菌或哺乳动物表达载体中，将载体引入合适的宿主细胞中，表达改变的多肽，用本文所述的方法检测多肽功能。

本发明如本文所述具有多种用途，其中一些在本文其它部分描述。首先，本发明使得可以分离多肽。可以用所属领域技术人员熟知的多种方法得到分离的分子。所述多肽可以从天然能产生该多肽的细胞中通过层析方法或免疫识别纯化。可选择地，可将表达载体引入细胞以生产所述多肽。在另一种方法中，可以将mRNA转录物通过显微注射或其它方法引入细胞中，以生产所述的编码多肽。mRNA在不含细胞的提取物例如网织红细胞溶解产物系统中的翻译也可以用于生产多肽。所属领域技术人员还可以很容易地用已知的方法分离多肽。这些方法包括但不限于免疫层析，HPLC，排阻层析，离子交换层析和免疫亲和层析。

在特定的实施方案中，本发明还包括衍生自多肽的“显性抑制”多肽。显性抑制多肽是一种蛋白质的无活性的变体，通过与细胞体系的相互作用，取代活性蛋白与细胞体系的相互作用或者与活性蛋白竞争，由此减少了活性蛋白的作用。例如，与配体结合但在与配体结合的同时不传递信号的显性抑制受体可以减少配体表达的生物学作用。同样地，显性抑制无催化活性的激酶可以正常地与靶蛋白相互作用，但是不能磷酸化靶蛋白，这可以减少靶蛋白响应细胞信号时发生的磷酸化。类似地，显性抑制转录因子可以与基因控制区域的启动子位点结合但是不增加基因转录，这可以通过占据启动子结合位点而又不增加转录来减少正常转录作用。

在细胞中表达显性抑制多肽的最终结果是降低了活性蛋白的功能。所属领域普通技术人员可以评估蛋白质显性抑制变体潜在的功能，并且使用标准的突变技术产生一种或多种显性抑制变体多肽。参见，例如，美国专利序列号5,580,723和Sambrook etal.，Molecular Cloning.A Laboratory Manual，Second Edition，ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989。所属领域技术人员然后可以检测减少了选定的活性和/或保留了此活性的突变多肽群体。其它类似的生成和检测蛋白质的显性抑制变体的方法对于所属领域普通技术人员是显而易见的。

本发明的cDNA的分离使技术人员有可能诊断由任何上述cDNA的异常表达表征的疾病。这些方法包括确定每一个所识别的核酸，和/或由其生成的多肽的表达。在上述情况下，这种确定可以通过任何标准的核酸确定性检测，包括聚合酶链式反应，或者用标记的杂交探针来进行，如下文例示。在后者的情况下，可以通过标准的免疫检测，用例如与分泌蛋白结合的抗体进行确定。

本发明还包括分离的肽结合试剂，例如，该试剂可以是抗体或者抗体的片段(“结合多肽”)，具有能选择性地与本发明的任何多肽(例如SEQ ID NO：2或4)结合的能力。抗体包括多克隆和单克隆抗体，可以根据传统方法制备。

重要的是，如本领域熟知的，只有抗体的一小部分，抗原决定簇，与抗体与其表位的结合有关(参见，一般的，Clark，W.R.(1986)The Experimental Foundations of Modern ImmunologyWiley&Sons，Inc.，New York；Roitt，I.(1991)EssentialImmunology，7th Ed.，Blackwell Scientific Publications，Oxford)。pFc’和Fc区域，例如，是补体级联系统的效应物，但不涉及抗原结合。其pFc′区域被酶切了的，或者不含有pFc′区域的抗体称为F(ab’)₂片段，保留有完整抗体的抗原结合位点。类似地，其Fc区域被酶切了的，或者不含有Fc区域的抗体称为Fab片段，保留有完整抗体分子的一个抗原结合位点。进一步，Fab片段由共价结合的抗体轻链和抗体重链的Fd部分组成。Fd片段是抗体特异性的主要决定因素(一个单独的Fd片段可以和多达十个不同的轻链结合而不会改变其抗体特异性)，Fd片段在分离过程中保持了表位结合能力。

在抗体的抗原结合部分中，如所属领域所熟知的，具有可以和抗原的表位直接相互作用的互补决定区(CDR)，以及维持抗原决定簇的三级结构的框架区(FR)(参见，一般的，Clark，1986；Roitt，1991)。在IgG免疫球蛋白的重链Fd片段和轻链中，具有四个框架区域(FR1到FR4)，分别被三个互补决定区(CDR1至CDR3)分隔开。CDR，特别是CDR3区域，更特别的是重链CDR3，主要负责抗体的特异性。

所属领域已知哺乳动物抗体的非CDR区域可以被同种或异种抗体的类似区域取代，而还保持原始抗体的表位特异性。这清楚地由“人化的”抗体的研究和使用所证明，其中非人的CDR与人FR和/或Fc/pFc’区域共价结合，产生功能性抗体。参见，例如，美国专利序列号4,816,567；5,225,539；5,585,089；5,693,762和5,859,205。因此，例如，PCT国际公开号WO 92/04381教导了人化的鼠RSV抗体的生产和使用，其中鼠FR的至少一部分被来源于人的FR区域取代。这种抗体，包括完整抗体的具有抗原结合能力的片段，通常被称为“嵌合”抗体。

因此，如所属领域普通技术人员显然可知的，本发明还提供了F(ab′)₂，Fab，Fv和Fd片段；其中Fc和/或FR和/或CDR1和/或CDR2和/或轻链CDR3区域被同源的人或非人的序列取代的嵌合抗体；其中FR和/或CDR1和/或CDR2和/或轻链CDR3区域被同源的人或非人的序列取代的嵌合F(ab’)₂抗体；其中FR和/或CDR1和/或CDR2和/或轻链CDR3区域被同源的人或非人的序列取代的嵌合Fab抗体；以及其中FR和/或CDR1和/或CDR2区域被同源的人或非人的序列取代的嵌合Fd抗体。本发明还包括所谓的单链抗体。

因此，本发明涉及多种大小和类型的能特异地与本发明的多肽(例如SEQ ID NO：2，或4-其胞外部分)结合的多肽，以及多肽和其结合配偶体的复合体。这些多肽可以来自于抗体技术以外的来源。例如，可以由可方便地在溶液中，以固定化形式，作为细菌鞭毛肽展示文库或作为噬菌体展示文库制备的变性肽文库提供这种多肽结合试剂。也可以合成含有一个或多个氨基酸的肽的组合文库。进一步可以合成肽和非肽合成分子的文库。

本发明进一步提供了识别在细胞功能决定的多肽或多肽片段水平活化的试剂或可使试剂活化的前导化合物的有效方法。特别的，这种功能包括与其它多肽或片段的相互作用。通常，筛选方法包括检测干扰本发明的多肽的活性的化合物，虽然用此筛选方法也可以检测能增强活性的化合物。这种方法适于进行自动化的，高通量的化合物筛选。目标的指示包括由这些多肽调节的细胞过程，例如在发生机械应变的细胞中的过表达。

提供了多种候选(药学)试剂的检测方法，包括，体外标记蛋白配体结合检测，电泳迁移率改变检测，免疫检测，基于细胞的检测例如双杂交和三杂交筛选，表达检测等。转染的核酸可以编码，例如组合肽文库或者cDNA文库。这些检测所用的试剂，例如GAL4融合蛋白，是所属领域已知的。一种基于细胞的检测的实例包括用编码与GAL4DNA结合域融合的本发明的多肽的核酸和编码可操作地与基因表达调控区域，例如一种或多种GAL4结合位点连接的报道子基因的核酸转染细胞。当报道子融合蛋白与试剂结合时激活报道子基因的转录，由此使得报道子基因转录。然后通过报道子基因表达的变化检测能调节多肽介导的细胞功能的试剂。确定报道子基因表达的变化的方法是所属领域公知的。

该方法中所用的多肽片段，如果不是由转染的核酸产生的，则作为分离的多肽加入到检测混合物中。多肽优选是通过重组产生的，虽然也可以从生物提取物中分离这种多肽。重组产生的多肽包括含有本发明的蛋白质和另一种多肽的融合体的嵌合蛋白，所述多肽是例如能够提供或增强蛋白-蛋白结合，序列特异性核酸结合(例如GAL4)的，能增强本发明的多肽在检测条件下的稳定性的，或者能提供可检测分子如绿色荧光蛋白或Flag表位的多肽。

所述检测混合物由能与本发明的多肽相互作用的天然的胞内或胞外结合靶组成。虽然可以使用天然的多肽结合靶，但是通常优选使用多肽结合靶的一部分(例如多肽或核酸片段)或类似物(即在检测中可模仿天然结合靶的多肽结合性质的试剂)，只要所述部分或类似物在检测中可以提供可测量的与所述多肽片段的结合亲和力。

检测混合物还含有候选试剂，通常使多种检测混合物同时以不同的试剂浓度进行检测，以得到对各种浓度的不同反应。通常，其中一种浓度作为负对照，即试剂浓度为零或者试剂浓度在可检测到的限度以下。候选试剂包括多种化学类别，虽然通常都是有机化合物。优选地，候选试剂是小的有机化合物，即分子量高于大约50但低于大约2500，优选小于大约1000，更优选小于大约500。候选试剂含有与多肽和/或核酸的结构相互作用必需的功能性化学基团，包括至少一个胺，羰基，羟基或羧基，优选包括至少两个功能性化学基团，更优选包括三个功能性化学基团。候选试剂可以含有被一个或多个上述功能性基团取代的碳环或者杂环结构和/或芳香环或多环芳香结构。候选试剂还可以是生物分子例如肽，多糖，脂肪酸，甾醇，类异戊二烯，嘌呤，嘧啶，上述物质的衍生物或结构类似物，及其组合等。如果所述试剂是核酸，那么该试剂典型地是DNA或RNA分子，虽然这里也包括修饰的核酸。

候选试剂可以来自于多种来源，包括合成或天然化合物文库。例如，可以用多种方法随机合成和定向合成多种有机化合物和生物分子，包括随机寡核苷酸表达，合成有机组合文库，随机肽的噬菌体展示文库等。可选择地，细菌，真菌，植物和动物提取物形式的天然化合物文库是可获得的或者是容易生成的。除此之外，天然的和合成的文库和化合物可以通过传统的化学，物理和生物化学方法进行修饰。进一步，可以使用已知的(药学的)试剂进行定向的或随机的化学修饰，例如酰化，烷基化，酯化，酰胺化等，以产生所述试剂的结构类似物。

混合物中可以含有其它试剂。这些试剂包括盐，中性蛋白(例如清蛋白)，去垢剂等，这些物质有利于最优化蛋白质-蛋白质和/或蛋白质-核酸结合。这种试剂也可以减少反应组分之间的非特异性或背景相互作用。也可以使用其它可以提高检测效率的试剂例如蛋白酶抑制剂，核酸酶抑制剂，抗微生物试剂等。

上述检测物质的混合物在下述条件下培育：在所述条件下如果不存在候选试剂，所选择的本发明的多肽特异地与细胞结合靶，其部分或其类似物结合。各组分加入的顺序，培育的温度，培育的时间，和检测的其它参数都是很容易确定的。试验仅仅涉及最优化检测参数，而不涉及检测的基本组分。培育温度典型地在4℃和40℃之间。培育时间优选尽量短，以便于进行快速的，高通量的筛选，典型地是在0.1到10小时之间。

在培育以后，可以使用任何使用者可用的方法检测在所述多肽和一个或多个结合靶之间是否存在特异性结合。对于不含细胞的结合类型的检测，经常用分离步骤将结合的组分与未结合的组分分离开。可以用各种方法进行分离。至少有一种组分在固体底物上固定化，未结合的组分可以很容易从其上分离。固体底物可以是各种不同的材料以及各种不同的形状，例如微量滴定盘，微球，检测条，树脂粒子等。底物优选使信噪比达到最大，并减少背景结合，同时易于分离并降低成本。

分离可以通过从容器中移去微球或检测条来进行，倾空或稀释容器如微量滴定盘的孔，清洗微球，粒子，用洗脱溶液或溶剂进行柱层析或过滤。分离步骤优选包括多次漂洗或清洗。例如，当固体底物是微量滴定盘的时候，其上的孔可以用洗脱溶液洗脱多次，洗脱溶液一般包括培育混合物中那些不参与特异性结合的组分，例如盐，缓冲液，去垢剂，非特异性蛋白等等。如果固体底物是磁珠，这些磁珠可以用洗脱液洗脱一次或多次，然后用磁铁分离。

可以用任意适宜的方法进行基于细胞的检测，例如双杂交或三杂交筛选。由多肽与靶分子相互作用的报道子基因转录检测得到的转录物通常直接或间接地编码可检测产物，例如半乳糖苷酶活性，荧光素酶活性等。对于不含细胞的结合检测，其中一种组分通常是可检测的标记，或与可检测的标记偶联。可以使用多种标记，例如那些可以直接检测的标记(例如放射性，荧光，光密度或电子密度等)或者间接检测的标记(例如表位标签如FLAG表位，酶标签如辣根过氧化物酶等。所述标记可以与多肽的结合配偶体结合，或者包含在结合配偶体的结构中。

可以使用多种方法检测标记，这取决于标记的性质和其它检测组分。例如，可以在标记连接在固相底物的时候或者从固相底物上分离以后对其进行检测。可以通过光密度或电子密度，放射性射线，非放射性能量转移等直接检测标记，或者通过抗体结合物，抗生物素蛋白链菌素-生物素等间接检测标记。检测标记的方法是本领域熟知的。

本发明提供了多肽特异性结合试剂，识别和制备这些试剂的方法，以及它们在诊断、治疗和药物开发中的用途。例如，多肽特异性的药学试剂可用于多种诊断和治疗应用中，特别是在疾病或疾病预后与多肽结合特性的改变有关的时候。新的多肽特异性结合试剂包括多肽特异性抗体，细胞表面受体，以及如双杂交筛选的检测所识别的其它天然胞内和胞外结合试剂，以及在对化学文库的筛选中识别的非天然的胞内和胞外的结合试剂。

通常，多肽与特定分子结合的特异性是由结合平衡常数决定的。能够选择性结合多肽的靶优选具有至少大约10⁷M^-1的结合平衡常数，更优选至少大约10⁸M^-1，最优选至少大约10⁹M^-1。多种基于细胞的和不含细胞的检测都可以用于证明多肽的特异性结合。基于细胞的检测包括单杂交，双杂交和三杂交筛选，检测，其中多肽介导的转录受到抑制或增强。不含细胞的检测包括蛋白质结合检测，免疫检测等。其它可用于筛选与本发明的多肽结合的试剂的检测包括荧光能量共振转移(FRET)，和电泳迁移率变动分析(EMSA)。

根据本发明的另一个方面，提供了一种诊断由核酸分子表达的异常，其表达产物的异常，或者表达产物的片段的异常表征的疾病的方法。所述方法包括使分离自患者的生物样品与能特异地与核酸分子，其表达产物，或其表达产物的片段结合的试剂接触，确定试剂与核酸分子或其表达产物之间的相互作用以确定该疾病，其中所述核酸分子是IL1RL-1核酸(SEQ ID NO：1)。在一些实施方案中，所述疾病是选自下组的心血管疾病：心肌梗塞，中风，动脉硬化，和心力衰竭。在一个实施方案中，所述疾病是心脏肥大。在另一个实施方案中，所述疾病是心肌梗塞。在一个实施方案中，所述疾病是心力衰竭。

如果所述分子是核酸分子，这种确定可以通过任何标准的核酸确定性检测进行，包括聚合酶链式反应，或者本文所例示的标记杂交探针检测。如果所述分子是核酸分子的表达产物，或者核酸分子表达产物的片段，可以使用，例如能与任何多肽表达产物结合的抗体通过任何标准免疫检测进行这种确定。

“表达异常”指任意上述IL1RL-1分子(核酸和/或多肽)与对照(即健康的或“正常的”患者中同一个分子的表达)相比表达减少(过少表达)或表达增加(过表达)。这里所说的“健康的患者”是指不具有将来发生心血管疾病的危险的患者(参见前面的讨论和Harrison′s Principles of Experimental Medicine，13thEdition，McGraw-Hill，Inc.，N.Y.-这里称为“Harrison′s”)。健康的患者另外也没有疾病的症状。换句话说，这种患者如果由医生检查，会被认为是健康的并且没有心血管疾病的症状，也没有发生心血管疾病的危险。

当所述疾病是选自下组的心血管疾病的时候：心脏肥大，心肌梗塞，中风，动脉硬化，和心力衰竭，任何上述分子与对照(例如健康的患者)相比表达的减少表示存在疾病，或者表示具有将来发生这种疾病的危险。

本发明还提供了可用于测量本发明的核酸，或者本发明的表达产物水平的新的试剂盒。

在一个实施方案中，试剂盒包括一个容器，其中含有一种可以选择性地与分离的IL1RL-1核酸，或其表达产物结合的试剂，以及一个对照，用于与所述试剂和任意上述分离核酸或其表达产物的结合的测量值比较。试剂盒通常包括下述主要成分：外壳，一种本发明的试剂，一种对照试剂，以及说明书。外壳可以是一种盒子样的结构，其中放有一个装有本发明的试剂的小瓶(或多个小瓶)，一个装有对照试剂的小瓶(或多个小瓶)，以及说明书。所属领域技术人员可以很容易地改变外壳以适应个人需要。在一些实施方案中，对照是一个预定值，用以与测量值比较。在特定的实施方案中，对照包括任意上述分离的核酸的表达产物的表位。

在核酸的检测中，可以包括用于扩增本发明的核酸分子的引物对。优选的试剂盒包括已知数量的核酸探针，表位(例如IL1RL-1表达产物)或抗表位的抗体，以及说明书或其它印刷材料。在特定的实施方案中，所述印刷材料可以表明发生基于检测结果的心血管疾病的危险性。试剂可以包装在容器中和/或以预定量涂覆在孔中，所述试剂盒可以包括标准物质例如标记的免疫试剂(例如标记的抗IgG抗体)等。一种试剂盒是组装好的聚苯乙烯微量滴定盘，其上涂覆有任意上述的本发明的蛋白，和一个含有标记的抗人IgG抗体的容器。滴定盘的孔与例如生物流体接触，洗涤，然后与抗IgG抗体接触。然后检测标记。本发明的试剂盒特征由数字11表示，如图7所示。试剂盒11由下述主要成分组成：外壳15，本发明的试剂17，对照试剂19，以及说明书21。外壳15是盒子样的结构，其中放有一个含有本发明的试剂17的小瓶(或多个小瓶)，一个装有对照试剂19的小瓶(或多个小瓶)，以及说明书21。所属领域技术人员可以很容易地改变外壳15以适应个人需要。

在优选的实施方案中，本发明提供了新的试剂盒或者对在本发明的基础上选择的预定值特异的并具有合适的灵敏度的检测试剂。因此优选的试剂盒与商业可获得的试剂盒不同，包括例如不同的临界值，在特定的临界值具有不同的灵敏度，以及说明书或印刷材料上标明检测结果的危险性。

本发明还包括评价患者用减少心血管疾病危险的试剂进行治疗时获益的可能性。在一些实施方案中，所述试剂选自下组：抗炎试剂，抗血栓形成试剂，抗血小板试剂，溶解血纤维蛋白的试剂，降脂试剂，直接凝血酶抑制剂，糖蛋白IIb/IIIa受体抑制剂，能与细胞粘附分子结合并能抑制白细胞与此分子粘附的能力，钙通道阻断剂，β-肾上腺素受体阻断剂，环氧合酶-2抑制剂，以及血管紧张素系统抑制剂。所述方法包括获得患者中IL1RL-1分子的水平，将IL1RL-1分子的水平与心血管疾病诊断特异的预定值相比较。IL1RL-1分子的水平与预定值的比较表示患者是否从所述试剂的治疗中获益。在特定的实施方案中，心血管疾病诊断特异的预定值是多个预定标记物水平范围，所述比较步骤包括确定所述患者的水平是否落在所述预定标记物水平范围内。所述心血管疾病可以是选自下组的疾病：心脏肥大，心肌梗塞，中风，动脉硬化，和心力衰竭。

预定值可以是多种形式。它可以是单个的临界值，例如中值或平均值。该值可以是基于比较组得到的，例如一个规定组的危险是另一个规定组的危险的两倍。它也可以是一个范围，例如，将检测人群平均(或者不平均地)分为各组，例如低危险组，中等危险组和高危险组，或者分为四组，最低组是具有最低危险性的患者，最高组是具有最高危险性的组。

预定值可以是基于所选定的特定人群的。例如，显然是健康的人群(没有可检测到的疾病，并且没有心血管疾病的历史)与吸烟的人群与曾经患过心血管疾病的人群相比，其系统炎症标记物具有不同的“正常”范围。相应的，所选的预定值可以考虑患者所属的类别。所属领域普通技术人员只需要常规试验就可以选择合适的范围和类别。

如上所述的，本发明提供了评价患者用减少将来患心血管疾病的危险的试剂进行治疗时获益的可能性。此方法对于患者的治疗以及新的治疗方法的临床开发具有重要的启发。医师为患者的治疗选择治疗方法是基于所期望的对患者的净益处。净益处来自于危险对益处的比率。本发明使得可以选择更有可能通过干扰方法获益的患者，从而帮助医师选择治疗方案。这可以包括使用具有较高危险性的药物，但提高了获得所期望的益处的可能性。同样地，临床研究希望能为临床试验选择获得净益处的可能性较高的人群。本发明可以帮助临床研究者选择这样的患者。临床研究者现在也可以使用本发明确定临床试验的选择标准。

本发明还包括治疗心血管疾病的方法。在一些实施方案中，所述方法包括给需要治疗的患者施用有效量的可治疗心血管疾病的IL1RL-1分子。在特定的实施方案中，所述方法包括给需要治疗的患者施用一种能调节任意上述IL1RL-1分子表达的试剂。“能调节表达的试剂”包括有效量的可治疗心血管疾病的这里所说的任何IL1RL-1分子，能增加这些分子的表达的试剂，以及能减少任何上述IL1RL-1分子表达的试剂。

这里所说的对于核酸或多肽来说“能减少表达的试剂”是所属领域所公知的，指反义核酸，能结合由所述核酸编码的多肽的抗体，以及其它能降低这种分子表达的试剂。根据本发明，任何可以减少分子表达的试剂(如本文所述的，降低其活性)都可以使用。

在特定的实施方案中，所述分子是核酸(反义)。在一些实施方案中，所述核酸可操作地与能指导所述核酸分子在心肌细胞中表达的基因表达序列连接。“基因表达序列”是任何调控核苷酸序列，例如启动子序列或启动子和增强子的组合，可以促进与之可操作相连的核酸有效地转录和翻译。基因表达序列可以是，例如哺乳动物或病毒启动子，例如组成型或可诱导的启动子。组成型哺乳动物启动子包括但不限于下述基因的启动子：次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPTR)，腺苷脱氨酶，丙酮酸激酶，-肌动蛋白启动子和其它组成型启动子。能在真核细胞中起作用的病毒启动子包括，例如猿病毒，乳头瘤病毒，腺病毒，人免疫缺陷病毒(HIV)，劳氏肉瘤病毒，巨细胞病毒的启动子，莫洛尼氏白血病毒和其它逆转录病毒的长末端重复序列(LTR)，以及单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子。其它组成型启动子是所属领域普通技术人员公知的。可用于本发明的基因表达序列的启动子还包括可诱导的启动子。可诱导的启动子在存在诱导试剂的条件下被激活。例如，亲金属蛋白启动子在存在某些金属离子的条件下可被激活并提高转录和翻译。其它可诱导的启动子是所属领域普通技术人员所公知的。

通常，基因表达序列必须包括分别与转录和翻译起始相关的5’端非转录和5’端非翻译序列，例如TATA盒，帽子序列，CAAT序列等等。特别地，5’端非转录序列应包括启动子区域，该启动子区域包括对与其可操作连接的抗原核酸进行转录调控的启动子序列。根据需要，基因表达序列任选地包括增强子序列或者上游活化子序列。

优选地，任何本发明的IL1RL-1核酸分子与能使核酸分子在细胞如心肌细胞和/或血管内皮细胞(包括平滑肌细胞)中表达的基因表达序列相连。更优选地，基因表达序列使得所述核酸分子可在心肌细胞中表达，而使所述分子不会在选自神经细胞，成纤维细胞，以及造血细胞的细胞中表达。能使得所述核酸分子在心肌细胞中表达的序列能够在这种细胞类型中选择性地被激活，从而导致所述核酸分子在此细胞中表达。心脏肌球蛋白重链基因启动子，例如，可以用于在心肌细胞中表达本发明的任何上述核酸分子。所属领域普通技术人员可以容易地识别能在心肌细胞中表达核酸分子的备选启动子。

当核酸序列和基因表达序列共价连接以使所述核酸编码序列的转录和/或反义受到所述基因表达序列的影响或控制的时候，被称为是“可操作地连接”。如果需要，所述核酸序列可以翻译成功能性蛋白质，如果5’端基因表达序列的启动子的诱导能导致所述核酸序列的转录，如果两个DNA序列之间的连接的性质没有(1)导致出现移码突变，(2)妨碍启动子区域指导抗原序列转录的能力，和/或(3)妨碍相应的RNA转录以翻译成为蛋白质的能力，那么这两个DNA序列被认为是可操作地连接。因此，如果基因表达序列可以使所述核酸序列转录，并使转录产物可以翻译成所需的蛋白质或多肽，那么基因表达序列就是可操作地与核酸序列相连。

本发明的抗原核酸可以单独或者与载体一起递送到本发明的优选细胞类型中。从广义来说，“载体”可以是任何媒介物，它能够促进(1)分子递送到靶细胞和/或(2)靶细胞吸收所述分子。优选地，使用载体将所述分子运输到靶细胞中会比不使用载体的降解程度更低。可选择地，“靶配体”可以与载体相连接以选择性地将载体递送到在其表面表达靶配体的同源受体的细胞上。以这种方式，所述载体(含有核酸或蛋白质)可以被选择性地递送到例如心肌中的心肌细胞中。靶定的方法包括结合体，例如美国专利5,391,723 to Priest所述的。另一个公知的靶定载体的例子是脂质体。脂质体可以从Gibco BRL(Life TechnologiesInc.，Rockville，MD)获得。有数种已公开的方法可以用于制备靶定脂质体。优选地，本发明的分子被靶定递送到心肌细胞，和/或血管内皮细胞中。

通常，可用于本发明的载体包括但不限于质粒，噬菌粒，病毒，其它来源于病毒或细菌并且能够插入或结合本发明的核酸序列的载体，以及其它能与本发明的核酸序列相连的核酸片段(例如增强子，启动子)。病毒载体是优选的载体形式，包括但不限于来自下列病毒的核酸序列：腺病毒；腺病毒相关病毒；逆转录病毒，例如莫洛尼氏鼠白血病毒；Harvey小鼠肉瘤病毒，鼠乳房肿瘤病毒；劳式肉瘤病毒；SV40类型病毒；多瘤病毒；爱波斯坦-巴尔病毒；乳头瘤病毒；疱疹病毒；牛痘病毒；脊髓灰质炎病毒；和RNA病毒如逆转录病毒。还可以使用本文未指出但是所属领域公知的其它载体。

用于某些应用的特别优选的病毒是腺相关病毒，一种双链DNA病毒。腺相关病毒可以感染许多类型和种属的细胞，可以改造成复制缺陷型的，即能指导合成所需蛋白质，但不能制造感染颗粒。它进一步还具有其它优点：例如热稳定性和脂溶剂稳定性；在不同谱系的细胞，包括造血细胞中具有较高的转导率；并且没有重复感染抑制因而能够进行多重转导。据说腺相关病毒可以以位点特异的方式整合到人细胞DNA中，因而可以减少插入突变的可能性和插入基因表达的可变性。除此之外，野生型腺相关病毒感染在组织培养基中在没有选择压力的条件下可传代超过100代，表明腺相关病毒的基因组整合是一种相对稳定的事件。腺相关病毒还可以在染色体外发挥作用。

通常，其它优选的病毒载体是基于不引起细胞病变的真核细胞病毒，其中非必需的基因被感兴趣的基因取代。不引起细胞病变的病毒包括逆转录病毒，其生命周期包括基因组病毒RNA逆转录为DNA，然后前病毒整合到宿主细胞DNA中。腺病毒和逆转录病毒已证明可用于人基因疗法。通常，逆转录病毒是复制缺陷型的。这样经过基因改造的逆转录表达载体可以用于基因在体内的高效转导。产生复制缺陷型逆转录病毒的标准操作方法(包括在质粒中引入外源遗传物质，用质粒对包装细胞系进行转染，用包装细胞系产生重组逆转录病毒，从组织培养基中收集病毒颗粒，用病毒颗粒感染靶细胞)在Kriegler，M.，“Gene Transfer andExpression，A Laboratory Manual，”W.H.Freeman C.O.，NewYork(1990)和Murry，E.J.Ed.“Methods in Molecular Biology，”vol.7，Humana Press，Inc.，Cliffton，New Jersey(1991)中有描述。

另一种优选的逆转录病毒载体是来自莫洛尼氏鼠白血病毒的载体，如Nabel，E.G，et al.，Science，1990，249：1285-1288中所述。据报道这些载体可有效将基因递送到所有三层动脉血管壁中，包括中膜。其它优选的载体在Flugelman，et al.，Circulation，1992，85：1110-1117中公开。其它可用于递送本发明的分子的载体在美国专利序列号5,674,722，申请人为Mulligan等中有描述。

除了上述载体，可以用其它递送方法将本发明的分子递送到细胞例如心肌细胞和/或血管内皮细胞中，并能够促进其吸收。

本发明的一种优选的递送方法是胶体分散系。胶体分散系包括基于脂类的系统，包括水包油的乳剂，胶粒，混合胶粒，和脂质体。本发明的一种优选的胶体系统是脂质体。脂质体是人造膜载体，可用于在体内或体外作为递送载体。它表现为大的单层囊泡(LUV)，尺寸为0.2-4.0pm，能够包裹大的大分子。RNA，DNA和完整的病毒颗粒可以包入水相内部，以生物活性形式递送到细胞中(Fraley，et al.，Trends Biochem.Sci.，1981，6：77)。脂质体要成为有效的基因转移载体，应当具有下述一个或多个特征：(1)能高效封装所感兴趣的基因，同时保持其生物活性；(2)与非靶细胞相比优选和主要结合靶细胞；(3)将载体的水相成分高效递送到靶细胞的细胞质中；以及(4)准确而有效地表达遗传信息。

脂质体可以通过与特定的配体，例如单克隆抗体，糖，糖脂类，或蛋白偶联，从而靶定特定的组织。可用于将脂质体靶定到血管壁的配体包括但不限于日本血凝病毒的病毒外壳蛋白。除此之外，所述载体可以与核靶定多肽偶连，可将所述核酸定向到宿主细胞的核。

脂质体是商业可获得的，可从Gibco BRL获得，例如LIPOFECTIN^TM和LIPOFECTACE^TM，是由阳离子酸例如N-[1-(2，3二油酰基氧)-丙基]-N，N，N-三甲基氯化铵(DOTMA)和二甲基双十八烷基溴化铵(DDAB)形成的。制备脂质体的方法是所属领域所熟知的，在许多出版物中都有描述。在Gregoriadis，G.in Trends in Biotechnology，V.3，p.235-241(1985)中对脂质体也有综述。用于大分子，包括核酸的细胞内递送的新的脂质体在PCT国际申请号PCT/US96/07572(公开号WO96/40060，发明名称为“Intracellular Delivery of Macromolecules”)也进行了描述。

在一个优选的实施方案中，优选的载体是适合于对哺乳动物受体进行植入的生物相容的微粒或者植入物。可用于本方法的生物溶蚀的植入物在PCT国际申请号CT/US/03307(公开号W095/24929，发明名称为“Polymeric Gene Delivery System”，优先权为1994年3月15日申请的美国专利申请序列号213,668)中有描述。PCT/US95/03307描述了一种包含由适当的启动子控制的外源基因的生物相容的，优选是生物可降解的聚合体基质。聚合体基质可用于在患者中持续释放外源基因。根据本发明，这里所述的核酸被封装并分散在PCT/US95/03307公开的生物相容的，优选生物可降解的聚合物基质中。聚合物基质优选是微粒的形式，例如微球(其中核酸分散在固体聚合物基质中)或者微胶囊(其中核酸储存在聚合物外壳的中心)。用于包含本发明的核酸的其它形式的聚合体基质包括薄膜，涂层，凝胶，植入物，和支架。聚合体基质装置的尺寸和组成应使得基质在其所植入的组织中可方便地释放。聚合体基质装置的尺寸是根据要使用的递送方法进一步选择的，典型地是注射到组织中，或者通过喷雾剂将悬浮颗粒送入鼻腔和/或肺部。聚合体基质的组分的选择应使之具有良好的降解速度，并且由具有生物附着性的物质组成，当此装置施用到血管表面的时候进一步增加了其转移效率。还应选择基质的组成使其不被降解，而是在较长的一段时间内通过扩散释放。

非生物降解的和生物降解的聚合物基质都可以用于向患者递送本发明的核酸。优选使用生物可降解的基质。这种聚合物可以是天然的或是合成的聚合物。优选使用合成的聚合物。聚合物的选择取决于所希望的释放时间，通常是数小时至一年或更长。典型地，一段时间内的释放可以是在几个小时之间，三至十二个月是最希望的。聚合物可选择地是水凝胶的形式，可以吸收达其自身90％重量的水，而且，进一步可选择地与多价离子或其它化合物交联。

通常，本发明的核酸可以用生物溶蚀的植入物通过扩散的方式，或者更优选地，通过聚合物基质的降解而被递送。可以用于形成生物可降解的递送系统的合成聚合物包括：聚酰胺，聚碳酸酯，聚亚烷，聚亚烷二醇，聚亚烷氧，聚亚烷对苯二甲酸酯，聚乙烯醇，聚乙烯醚，聚乙烯酯，聚卤乙烯，聚乙交酯，聚硅氧烷，聚氨酯及其共聚物，烷基纤维素，羟烷基纤维素，纤维素醚，纤维素酯，硝化纤维素，丙烯酸和甲基丙烯酸酯的聚合物，甲基纤维素，乙基纤维素，羟丙基纤维素，羟基-丙基甲基纤维素，羟丁基甲基纤维素，醋酸纤维素，丙酸纤维素，醋酸丁酯纤维素，醋酸邻苯二甲酯纤维素，羧乙基纤维素，三醋酸纤维素，硫酸钠盐纤维素，聚(甲基丙烯酸甲酯)，聚(甲基丙烯酸乙酯)，聚(甲基丙烯酸丁酯)，聚(甲基丙烯酸异丁酯)，聚(甲基丙烯酸己酯)，聚(甲基丙烯酸异癸酯)，聚(甲基丙烯酸月桂酯)，聚(甲基丙烯酸苯酯)，聚(丙烯酸甲酯)，聚(丙烯酸异丙酯)，聚(丙烯酸异丁酯)，聚(丙烯酸十八酯)，聚乙烯，聚丙烯，聚(乙二醇)，聚(氧化乙烯)，聚(对苯二甲酸乙烯酯)，聚(乙烯醇)，聚乙酸乙烯酯，聚氯乙稀，聚苯乙烯和聚乙烯吡咯烷酮。

非生物可降解的聚合物包括乙烯基醋酸乙烯酯，聚(甲基)丙烯酸，聚酰胺，及其共聚物和混合物。

生物可降解的聚合物包括合成聚合物例如乳酸和羟基乙酸的聚合物，聚酐，聚(邻位)酯，聚氨酯，聚(丁酸)，聚(戊酸)，和聚(丙交酯-共己内酯)，和天然聚合物例如藻酸盐和其它多糖包括右旋糖苷和纤维素，胶原，其化学衍生物(化学基团的取代，插入，例如烷基，烯基，羟基化作用，氧化作用，和其它所属领域技术人员按常规进行的修饰)，清蛋白和其它亲水蛋白，玉米蛋白和其它醇溶谷蛋白和疏水蛋白，及其共聚物和混合物。通常，这些物质可以通过酶水解或在体内暴露于水中通过表面侵蚀或主体侵蚀降解。

所特别感兴趣的生物附着性的聚合物包括生物溶蚀的水凝胶，如H.S.Sawhney，C.P.Pathak and J.A.Hubell inMacromolecules，1993，26，581-587所述，在此也包括此文献中给出的教导，聚透明质酸，酪蛋白，明胶，明胶蛋白，聚酐，聚丙烯酸，藻酸盐，壳聚糖，聚(甲基丙烯酸甲酯)，聚(甲基丙烯酸乙酯)，聚(甲基丙烯酸丁酯)，聚(甲基丙烯酸异丁酯)，聚(甲基丙烯酸己酯)，聚(甲基丙烯酸异癸酯)，聚(甲基丙烯酸月桂酯)，聚(甲基丙烯酸苯酯)，聚(丙烯酸甲酯)，聚(丙烯酸异丙酯)，聚(丙烯酸异丁酯)，和聚(丙烯酸十八烷酯)。因此本发明提供了一种作为药物使用的本发明的上述分子的组合物，制备所述药物的方法和使所述药物在体内持续释放的方法。

压缩试剂也可以与本发明的载体组合使用。这里所说的“压缩试剂”是指能中和核酸的负电荷因而能够使核酸压缩成微粒的试剂，例如组蛋白。核酸的压缩使靶细胞更容易吸收核酸。压缩剂可以单独使用，例如以一种更有效被细胞吸收的方式递送本发明的分离核酸，或者更优选地，与一种或多种上述载体一起使用。

其它可促进靶细胞吸收本发明的核酸的组分包括磷酸钙和其它胞内运输的化学调节剂，显微注射组分，电穿孔和同源重组组分(例如用于将核酸整合到靶细胞染色体的预先选定的部位)。

根据本发明，术语细胞对核酸的“吸收的促进”根据所述分子的性质具有下述含义。对于分离的核酸，它的含义是描述核酸穿过细胞膜进入到细胞核中，其中基于“核酸转基因”可以利用细胞体系产生所述核酸编码的功能性多肽。根据“核酸转基因”它的含义是描述本发明的所有含有或不含相关载体的核酸。对于多肽，它的含义是描述多肽穿过细胞膜进入到细胞质中，如果需要，使用细胞质体系在功能上修饰所述多肽(例如使之成为活性形式)。

可以使用各种技术将本发明的核酸引入到细胞中，这取决于所述核酸是在体外还是体内引入到宿主中。这种技术包括核酸-CaPO₄沉淀转染，与DEAE相关的核酸转染，用含有所感兴趣的核酸的逆转录病毒转染，脂质体介导的转染等。为特定的用途，优选将所述核酸靶定到特定细胞。在这些情况中，用于将本发明的核酸递送到细胞中去的载体(例如脂质体，逆转录病毒，或其它病毒)可以具有与之相连的靶定分子。例如，可将一种分子例如靶细胞表面膜蛋白特异性的抗体或靶细胞上的受体的配体与所述核酸递送载体相连或包含在其中。例如，当使用脂质体递送本发明的核酸的时候，和有关胞吞作用的表面膜蛋白相连的蛋白可以包含在脂质体中，以进行靶定和/或促进吸收。这种蛋白包括特定细胞类型的衣壳蛋白或其片段，在细胞循环中行使内在化作用的蛋白的抗体，靶定细胞内位点并能延长细胞半衰期的蛋白等。聚合物递送系统也可成功用于将核酸递送到细胞中，如所属领域技术人员所述。这种系统甚至可以口服递送核酸。

本发明还提供了血管和心血管疾病的诊断和治疗方法。所述疾病包括心肌梗塞，中风，动脉硬化，心力衰竭，和心脏肥大。

本发明的方法可用于任何上述疾病的急性和预防性治疗。这里所说的急性治疗是指对具有特定疾病的患者的治疗。预防性治疗是指对于具有患所述疾病的危险，但是目前并没有患病也没有经历过所述疾病的症状的患者。

从最广义来讲，术语“治疗”同时指急性和预防性治疗。如果需要治疗的患者曾经患过某种疾病(或者正患有某种特定的疾病)，那么疾病的治疗指改善，减少或消除所述疾病或由此疾病引起的一个或多个症状。在一些优选的实施方案中，疾病的治疗指改善，减少或消除某种具体的症状或与所述疾病相关的具体症状。如果需要治疗的患者具有患某种疾病的危险，那么患者的治疗指减小患者患所述疾病的危险性。

中风(这里也指缺血性中风和/或脑血管缺血)通常被认为是工业世界中第三大死亡原因，排在缺血性心脏病和癌症之后。中风在美国每年引起300,000人死亡，是入院治疗和长期残疾的主要原因。相应地，中风的社会经济影响和它给社会所带来的负担实际上是不可估量的。

“中风”被世界卫生组织定义为症状持续至少24小时的脑部功能的病灶处或全部的紊乱所表现出来的快速发展的症状。中风还包括除了血管问题以外的没有明显原因的死亡。

中风典型地是由通往脑部的或大脑内部的血管的阻塞引起的。全部阻塞的时候，脑循环的滞留在数秒内引起神经电活动的停止。在能量状态衰退和离子达到动态平衡后几分钟内，即发生高能量磷酸盐的消耗，膜离子泵失效，释放细胞钾，释放氯化钠和水，膜去极化。如果阻塞持续超过五到十分钟，会导致不可逆的损伤。如果是不完全的局部缺血，则结果很难估计，很大程度上取决于残留的灌注和可以获得的氧。在脑血管形成血栓后很少发生完全的缺血。通常在缺血部位都有一些残留的灌注，这取决于旁系血流和局部灌注压力。

脑血管可以通过自动调整补偿平均动脉血压，使之维持在90到60mmHg。这种现象涉及下游抗性血管的扩张。在自动调整的较低水平(大约60mmHg)之下的时候，血管扩张不充分，脑血管血流下降。然而大脑具有灌注储备可以补偿脑血管血流量的下落。存在这种储备是因为在正常条件下血液输运的氧中只有35％被取用。因此，氧取用量增加导致血氧量和血二氧化碳量正常。当末梢血压下降到大约30mmHg以下，这两种补偿机制(自动调整和灌注储备)也不足以防止氧气输送的不足。

当血流下降到缺血极限23ml/100g/分钟的时候，会发生组织缺氧症状。严重的缺氧可能是致命的。中等程度的缺血会导致“半阴影”。在神经学上，半阴影指脑组织的一个区域具有中等程度的缺血，神经功能瘫痪，而这种现象通过恢复足够的灌注可以逆转。半阴影形成的区域具有旁系灌注组织，围绕着一个严重缺血的内核，其中该内核发生梗塞。换句话说，半阴影是是能够挽救的组织区域，基本处于生和死之间。

虽然缺血事件可以发生在血管系统的任何部位，颈动脉分枝和颈动脉是最经常发生脑血管血栓性阻塞的部位，由此导致脑部缺血。由于血管狭窄或者血栓造成的血流减少症状与中等脑动脉疾病引起的症状类似。流过眼部的动脉血管经常受到影响形成一时性黑蒙或暂时性单眼失明。严重的两边颈动脉狭窄会导致脑半球灌注不足。这表现为在严重缺血的半球同侧发生剧烈头痛。血流阻塞或减少会导致前交通动脉末梢的一个大脑前动脉缺血，这会造成另一侧的腿具有运动或大脑皮层感觉症状，偶尔在近侧的胳膊上也具有这些症状。其它大脑前动脉的阻塞或低灌注的表现包括步态失调，有时由于中线两旁的额叶的损伤造成小便失禁。语言障碍表现为自发性语言减少，伴随产生精神活动衰退。

大多数缺血性中风都包括中部脑动脉的部分或所有区域，这大多数是由于心脏或颅外颈动脉栓塞造成的。栓塞可能使中部脑动脉的主干发生堵塞，但是更常见的是使上支或下支发生末梢堵塞。上支的堵塞能引起脸部和胳膊上最大程度的无力和感觉丧失。后部脑动脉穿透部分末梢的堵塞能引起对侧视力完全丧失。主要的后部脑动脉的缺血可能导致阅读上的(阅读障碍)和计算上的(计算障碍)困难。后部脑动脉附近的堵塞可能引起渗入到calamic结构和边缘结构的分支血管的阻塞。临床的症状就是半球感觉失调，可能会慢慢变成有缺陷的一边的难以控制的疼痛(脑丘疼痛)。

患有中风的患者是通过症状和/或物理检查诊断的，所述物理检查包括介入性或非介入性的诊断工具例如CT和MR成像。本发明的方法可用于治疗中风患者的各种临床症状。患有中风的患者可能具有一种或多种下述症状：麻痹，虚弱，感觉和/或视觉下降，无感觉，麻刺感，失语症(例如不能说话或发音含糊，不能阅读说书写)，失认症(即不能识别或确定感觉刺激)，失去记忆，协调困难，嗜睡，困倦或无意识，不能控制膀胱和肠，以及认知下降(例如痴呆，注意广度有限，不能集中精力)。使用医学成像技术能够识别出患有中风的患者，以及患有脑梗塞或脑溢血的患者。

本发明的一个重要的实施方案就是治疗患有异常严重危险的缺血性中风的患者。如本文所述的，患有异常严重危险的缺血性中风的患者是根据传统的医学实践确定的(见先前的描述)；这样的患者在传统的医学实践中也可以认为是具有中风的危险因素，或者更大的发生脑血管事件的危险。这种患者包括，例如进行任选的血管手术的患者。典型地，和心脏病相关的危险因素与和中风相关的危险因素相同。主要的危险因素包括高血压，高胆固醇血，和吸烟。心房纤维性颤动或心肌梗塞也是重要的危险因素。除此之外，根据本发明，IL1RL-1核酸分子，或其表达产物的表达水平的改变，也是重要的危险因素。

这里所说的，患有异常严重危险的缺血性中风的患者还包括进行具有栓塞危险的，降低血压的或者减少通往脑部血流的手术或诊断程序，例如颈动脉内膜切除术，脑血管造影术，神经外科手术，其中血管被压缩或被封闭，心导管插入术，血管成形术，包括气球血管成形术，冠状旁路手术，或者类似的程序。患有异常严重危险的缺血性中风的患者还包括具有任何一种能导致脑部血流减少的心脏疾病，例如心房纤维性颤动，心室心动过速，扩张性心肌病以及其它需要进行抗凝血治疗的心脏疾病。患有异常严重危险的缺血性中风的患者包括具有下述疾病的患者，包括动脉病或脑脉管炎，例如由狼疮，血管的先天性疾病引起的疾病，例如CADASIL综合症，或者偏头痛，特别是持续时间较长的事件。

中风的治疗可以是针对患过中风的患者，也可以是一种预防性治疗。短期预防性治疗是针对受到具有栓塞危险的，降低血压的或者减少通往脑部血流的手术或诊断程序的患者的，以减少这些程序引起的缺血性事件造成的伤害。长期或持续性的预防性治疗是针对具有能导致流向脑部的血流减少的心脏疾病，或者能直接影响脑部脉管系统的疾病的患者。如果进行的是预防性治疗，那么治疗是针对上述的具有异常严重危险的缺血性中风的患者。如果患者患过中风，那么治疗可以包括急性治疗。中风患者的急性治疗意味着在疾病的症状发作之时，或者在发作之时的48小时之内，优选在24小时之内，更优选地是在12小时之内，更优选地是在6小时之内，更优选地是在疾病症状发作之时的3小时之内。

高胆固醇血和/或高甘油三酯患者定义的标准是所属领域公知的(参见，例如“Harrison′s”)。高胆固醇血患者和高甘油三酯患者与过早的冠状心脏病升高的发生率有关。高胆固醇血患者的LDL水平＞160mg/dL或者＞130mg/dL，具有选自下组的至少两个危险因素：男性性别，家族过早冠状心脏病史，吸烟(每天超过10支)，高血压，低HDL(＜35mg/dL)，糖尿病，高胰岛素血症，腹部肥胖，高脂蛋白，以及个人的脑血管疾病史或闭合性外周血管疾病。高甘油三酯患者的甘油三酯(TG)水平＞250mg/dL。因此，高血脂患者定义为其胆固醇和甘油三酯水平等于或超过同时为高胆固醇血和高甘油三酯患者设定的上述极限。

“心肌梗塞”是由于心脏组织的不充分的灌注造成的坏死。心肌梗塞通常是由于曾经因动脉硬化症变得狭窄的冠状动脉的血栓性闭塞造成的冠状血流突然减少引起的。通常，当动脉粥样硬化斑裂开，断裂，或溃烂时则发生梗塞，形成附壁血栓，导致冠状动脉闭塞。

患者心肌梗塞的诊断决定了是否需要用本发明的方法治疗患者。许多种本领域公知的实验室试验在例如Harrison′s中有描述。通常，这些试验被分为四类：(1)组织坏死和炎症的非特异性指标，(2)心电图，(3)血清酶变化(例如肌氨酸磷酸激酶水平)，和(4)心脏成像。所属领域普通技术人员可以很容易使用上述检测确定患者是否具有心肌梗塞危险，是否患有心肌梗塞，或者是否曾经患过心肌梗塞。除此之外，根据本发明，IL1RL-1核酸分子，或其表达产物的表达水平的增加也是重要的危险因素。确定患病的患者因此能够从本发明的治疗方法中获益。

根据本发明，所述方法包括给患有心肌梗塞的患者施用有效量的能治疗患者的心血管疾病的任何上述IL1RL-1分子。“患有心肌梗塞”是指患者具有发病的危险，正在患病，或者曾经患过心肌梗塞。用所述分子立即进行治疗可以通过在梗塞发生之前或之后抑制心肌细胞(受到梗塞影响最大的细胞)的细胞凋亡性细胞死亡而使患者受益。“立即”是指给药发生在心肌梗塞之前(如果诊断的及时)，或48小时之内，虽然在发作之后14天进行给药对患者也是有用的。

本发明的另一个重要的实施方案是动脉硬化导致的缺血性损伤的治疗。动脉硬化是一个用于描述动脉壁变厚变硬的术语。它被认为在美国和大部分西方化社会中是大部分死亡的原因。动脉粥样硬化是动脉硬化的一种类型，是大部分冠状动脉疾病，主动脉瘤和下肢动脉疾病(包括外周血管动脉病)的原因，也可以导致脑血管疾病。动脉粥样硬化在美国是死亡的最主要的原因。

正常的动脉典型地在其内侧具有线纹，只有一层内皮细胞，内膜。内膜覆盖着中膜，其中只含有一种细胞类型，平滑肌细胞。动脉的最外层是外膜。随着年龄变化，外膜厚度不断增加，部分是由于中膜中的平滑肌细胞的迁移和增殖。各种外伤事件或介入也会导致内膜厚度类似地增加，例如当气球扩张术引起血管壁的损伤的时候。本发明与治疗动脉硬化病引起的缺血性损伤有关。这里所说的动脉硬化病是指传统的动脉粥样硬化，加重的动脉粥样硬化，动脉粥样硬化损伤，以及任何其它由不希望的内皮和/或血管平滑肌细胞的增殖表征的动脉硬化疾病，包括糖尿病的血管并发症。

本发明的另一个重要的实施方案是心力衰竭的治疗。心力衰竭是具有共同的心脏泵送损伤特性的各种疾病的临床症状，表征为心脏不能泵送出组织代谢所需要的血液，或者仅仅是由于充注压力升高而造成的这种情况。

本发明的另一个重要的实施方案是心脏肥大的治疗。这种疾病典型地表征为左心室肥大，通常是非扩张的心室，并且没有明显的前述原因。目前诊断的方法包括心电图和超声心动图。但是许多患者都是无症状的，可能是患有已知疾病的患者的亲属。不幸的是，这种疾病第一表现可能就是突然的死亡，通常是在儿童和青年中，通常是在身体活动之后。

减少心血管疾病的危险或者治疗心血管疾病的试剂包括选自下组的试剂：抗炎性制剂，抗血栓形成制剂，抗血小板制剂，纤维蛋白溶解剂，降脂剂，直接凝血酶抑制剂，糖蛋白IIb/IIIa受体抑制剂，能结合细胞粘附分子并能抑制白细胞粘附到这些分子上的能力的试剂(例如抗细胞粘附分子抗体)，钙通道阻断剂，β-肾上腺素受体阻断剂，环氧合酶-2抑制剂，血管紧张素系统抑制剂，和/或其组合。一种优选的试剂是阿斯匹林。

本发明的治疗剂的给药的方式和剂量随要治疗的疾病的特定阶段，要治疗的患者的年龄和身体状况，治疗的持续时间，同时所进行的治疗的种类(如果有的话)，给药的特定方式，以及健康从业人员知识和实践范围内的类似因素的不同而不同。

这里所说的本发明的试剂是以能治疗任何上述心血管疾病的有效量给药的。通常，有效量是能在患者的所希望的组织中引起有益变化的任何量。优选地，有效量是指足以在特定疾病中引起有利的表型变化，例如减轻，缓和或消除症状或整个疾病的量。

通常，有效量是药物制剂单独或与其它药物一起能够产生所需反应的量。这可能包括暂时性减缓所述疾病的发展，更优选的是，其包括永久性地使所述疾病停止发展，或者延迟所述疾病的发作或者预防所述疾病的发生。这可以通过常规方法进行监测。通常，活性化合物的剂量是从大约每天0.01mg/kg至每天1000mg/kg。预期剂量范围从50-500mg/kg是适当的，优选口服并且每天一次或几次服药。

当然，剂量应当取决于要治疗的特定疾病，疾病的严重程度，患者参数包括年龄，身体条件，体形大小和体重，治疗的持续时间，同时进行的其它治疗的种类(如果有的话)，给药的特定方式，以及健康从业人员知识和实践范围内的类似因素。特定形式的给药可以使用较低的剂量，例如静脉内给药。在这种情况下，初始剂量的使用在患者中引起的反应是不够的，可以使用达到患者耐受极限的更高的量(或者通过不同的更局部的递送方式达到更高的剂量)。每天多倍剂量可以使化合物达到合适的全身水平。优选通常使用最大剂量，也就是根据合理的医学判断确定的最高安全剂量。所属领域技术人员应当了解，患者可以出于医学原因，生理原因或任何其它原因持续使用较低剂量或者可耐受的剂量。

任选地，本发明的试剂可以和药学可接收的载体组合形成药学制剂。这里所说的术语“药学可接收的载体”是指适用于给人施用的一种或多种相容的固体或液体填充物，稀释剂或胶囊封装物质。术语“载体”表示有机或无机成分，其是天然的或合成的，与活性成分相结合以帮助使用。药物组合物中的组分也是能与本发明的分子共混和的，它们的互相混和不产生能破坏所需药物疗效的相互作用。在一些方面，所述药物制剂含有有效量的可治疗疾病的本发明的试剂。

药物制剂可以含有合适的缓冲溶液，包括乙酸盐，柠檬酸盐，硼酸盐或磷酸盐。所述药物组合物还可以含有，可选择地，合适的防腐剂，例如苯扎氯铵；氯代丁醇；对羟基苯甲酸酯和硫柳汞。

可以使用各种给药方式。特定方式的选择取决于所选择的特定药物，要治疗的疾病的严重程度以及治疗有效所需要的剂量。一般来讲，本发明的方法可以用任何医学可接收方式进行，医学可接收的方式是指任何能使活性化合物达到有效的水平而不引起临床不可接受的副作用。这种给药方式包括口服，直肠内，局部，鼻腔内，真皮内，穿过皮肤的或肠胃外方式。术语“肠胃外”包括皮下，静脉内，肌肉内，或灌注。静脉内或肌肉内方式不是特别适用于长期治疗和预防。例如，对患有偏头痛的患者的急性治疗的药物组合物可以以多种方式配制，并可使用多种给药方式，包括片剂，胶囊，粉末，栓剂，注射和鼻腔喷雾。

药物制剂可以方便地以任何单位剂量形式使用，可以用制药领域公知的任何方法制备。所有的方法都包括将活性试剂与一种或多种辅助成分构成的载体结合的步骤。通常，所述组合物是通过将活性化合物与液体载体，粒状固体载体，或者两者均匀紧密地结合在一起制备的，如果需要的话，可将产品加工成形。

适合于口服给药的组合物可以以不连续的方式使用，例如胶囊，片剂，锭剂，其中每种都含有预定剂量的活性化合物。其它组合物包括在水溶液中的悬液或非水溶液例如浆液，酏剂或乳剂。

适合于肠胃外给药的组合物可以包括本发明的试剂的无菌水性制剂，其优选是与受体的血液等渗的。这种水性制剂可以根据已知的方法用合适的分散剂或湿润剂和悬浮剂配制。无菌注射制剂也可以是无菌注射溶液或在无毒性的肠胃外可接收的稀释剂或溶剂中的悬液，例如1，3-丁二醇溶液。可以使用的可接收的载体或溶剂是水，Ringer溶液，和等渗氯化钠溶液。除此之外，也可以使用无菌的混和油作为溶剂或悬浮介质。为此目的可以使用任何温和的混和油，包括合成的单或二甘油酯。除此之外，脂肪酸例如油酸也可以用于制备注射用药剂。适合于口服，皮下，静脉内，肌肉内等给药方式的配制品在Remington′sPharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.，Easton，PA中有描述。

其它递送系统包括定时释放，延时释放或者持续释放的递送系统。这种系统可以避免本发明的试剂的重复给药，为患者和医师提供了方便。所属领域普通技术人员公知并可获得许多释放递送系统。其中包括基于聚合物的系统例如聚(丙交酯-乙交酯)，共聚草酸盐，聚己酸内酯，聚酰胺酯，聚原酸酯，聚羟基丁酸，和聚酐。含有药物的上述聚合物的微胶囊在，例如美国专利序列号5,075,109中有描述。递送系统还包括非聚合物系统，包括：含有甾醇例如胆固醇，胆固醇酯和脂肪酸或中性脂例如单，双和三甘油酯的脂类；水凝胶释放系统；sylastic系统；基于肽的系统；蜡质外壳；用传统粘合剂和赋形剂制备的压缩片剂；部分融合的植入物等。特定的例子包括但不限于：(a)腐蚀系统，其中本发明的试剂被置于如美国专利序列号4,452,775；4,675,189；和5,736,152所述的基质中；以及(b)扩散系统，其中活性成分以受控速度从如美国专利序列号3,854,480；5,133,974；和5,407,686所述的聚合物中渗透出来。除此之外，也可以使用基于泵的硬件递送系统，其中一些适合于植入。

使用长期持续释放的植入物可能是合乎需要的。这里所说的长期释放是指所构建和放置的植入物能够释放治疗水平的活性成分达至少30天，优选的是60天。长期持续释放的植入物是所属领域普通技术人员所公知的，包括上述的一些释放系统。特定的例子包括但不限于长期持续释放的植入物，如美国专利序列号4,748,024，和加拿大专利序列号1330939中所述。

本发明还包括本发明的IL1RL-1分子(核酸和多肽，和/或其片段)之外的其它试剂的给药，在一些实施方案中是共同给药，这些试剂在以有效量给药的时候可以与本发明的分子协作，具有附加作用和/或发生协同作用，以：(i)调节心脏细胞的抗凋亡活性，以及(ii)治疗其中涉及本发明的分子的心脏细胞抗凋亡活性的任何疾病。除本发明的分子之外的试剂包括抗炎性制剂，抗血栓形成制剂，抗凝血剂，抗血小板制剂，纤维蛋白溶解剂，降脂剂，直接凝血酶抑制剂，糖蛋白IIb/IIIa受体抑制剂，能与细胞粘附分子结合并能抑制白细胞的与此分子粘附能力的试剂，钙通道阻断剂，β-肾上腺素受体阻断剂，环氧合酶-2抑制剂，血管紧张素系统抑制剂，抗-高血压药，和/或其组合。

“抗炎性”制剂包括烯氯苯乙酸；阿氯米松二丙酸盐；丙缩阿尔孕酮；α淀粉酶；戊缩去炎松；安西非特；氨基苯酰基苯乙酸钠；盐酸氨普立糖；阿那白滞素；阿尼罗酸；阿尼扎芬；炎爽痛；巴柳氮二钠；苯吲酸；苯恶洛芬；盐酸苄达明；菠萝蛋白酶；溴哌莫；布地缩松；卡洛芬；芴丙酸；噌戊唑酮；克利洛芬；丙酸氯氟美松；丁酸氯氟美松酮；氯吡酸；丙酸氯硫卡松；Cormethasone Acetate；去氧可的松；地夫可特；地奈德；去羟米松；地塞米松二丙酸盐；环氟拉嗪；二氯苯胺苯乙酸钠；双醋酸二氟松；二氟米酮钠；二氟苯水杨酸；醋丁二氟龙；地弗他酮；二甲亚砜；羟西缩松；恩甲羟松；恩莫单抗；依诺利康钠；甲嘧啶唑；依托度酸；依托非那酯；联苯乙酸；非那莫；联苯丁酮酸；芬氯酸；苯克洛酸；芬多沙；Fenpipalone；双苯噻酸；夫拉扎酮；氟恶米松；氟灭酸；Flumizole；醋酸去氟肤轻松；氟胺烟酸；氟胺烟酸甲葡胺；氟考丁酯；醋酸氟甲龙；氟喹宗；氟联苯丙酸；氟瑞托芬；氟替卡松丙酸酯；呋喃洛芬；制吐剂；氯氟松；丙酯乌倍他索；醋酸卤泼尼松；对异丁基苯乙酸；布洛芬；布洛芬铝；Ibuprofen Piconol；伊洛达普；茚甲新；茚甲新钠；吲哚洛芬；双甲氧苯吲哚；吲四唑；醋酸异氟泼尼松；异肟；伊索昔康；酮丙酸；盐酸洛非咪唑；氯诺昔康；氯替泼诺；甲氯芬那酸钠；甲氯灭酸；甲氯松二丁酸盐；甲灭酸；美沙拉嗪；美西拉宗；甲基去氢氢化可的松；莫尼氟酯；萘丁美酮；甲氧萘丙酸；甲氧萘丙酸钠；萘普索；尼马宗；奥沙拉嗪钠；肝蛋白；奥帕诺辛；恶丙嗪；羟保泰松；盐酸瑞尼托林；戊聚糖聚硫酸钠；Phenbutazone SodiumGlycerate；吡非尼酮；吡氧噻嗪；吡氧噻嗪肉桂酸盐；吡氧噻嗪；环吡酮胺；吡丙芬；泼那扎特；普立非酮；普罗度酸；普罗喹宗；普罗沙唑；普罗沙唑柠檬酸盐；利美索龙；氯马扎利；柳胆来司；沙那西定；双水杨酯；Salycilates；血根氯铵；司克拉宗；丝美辛；舒多昔康；舒林酸；舒洛芬；他美辛；他尼氟酯；他洛沙酯；特丁非隆；替尼达普；替尼达普钠；替诺昔康；替昔康；Tesimide；Tetrydamine；硫平酸；氢可的松特戊酸盐；甲苯酰吡酸；甲苯酰吡酸钠；三氯氟松；三氟米酯；齐多美辛；糖皮质激素；和佐美酸钠。一种优选的抗炎性制剂是阿斯匹林。

“抗血栓形成”和/或“溶解血纤维蛋白”制剂包括血纤维蛋白溶酶原(通过与前激肽释放酶，激肽原，因子XII，XIIIa，血纤维蛋白溶酶原激活剂前体，以及组织血纤维蛋白溶酶原激活剂[TPA]的相互作用作用于血纤维蛋白溶酶)，链激酶；尿激酶；甲氧苯基化纤维蛋白溶酶-链激酶激活剂复合物；前尿激酶；(Pro-UK)；rTPA(阿替普酶或溶栓活性酶；“r”表示重组)；rPro-UK；Abbokinase；阿尼普酶；Sreptase AnagrelideHydrochloride；比伐卢定；达肝素钠；达那肝素钠；盐酸达唑氧苯；硫酸依非加群；依诺肝素钠；伊非曲班；伊非曲班钠；亭扎肝素钠；瑞替普酶；三苯格雷；丙酮苄羟香豆素；和右旋糖苷。

“抗血小板”制剂包括Clopridogrel；苯磺唑酮；阿斯匹林；双嘧哌胺醇；安妥明；氨基甲酸吡啶；PGE；胰高血糖素；抗血清素药物；咖啡因；茶碱己酮可可碱；噻氯匹定；和阿那格雷。

“降脂”剂包括吉非罗齐；cholystyramine；考来替泼；烟酸，普罗布考洛伐他汀，氟伐他汀，辛伐他汀，阿伐他汀，普伐他汀，和cirivastatin。

“直接凝血酶抑制剂”包括水蛭素，水蛭原，水蛭肽，agatroban，PPACK，以及凝血酶类似物。

“糖蛋白IIb/IIIa受体抑制剂”同时包括抗体和非抗体，包括但不限于ReoPro(阿昔单抗)，拉米非班，和替罗非班。

“钙通道阻断剂”是在化学性质不同类的化合物，在对各种疾病包括几种心血管疾病的控制中具有重要的治疗价值，所述的心血管疾病例如高血压，绞痛，和心律不齐(Fleckenstein，Cir.Res.v.52，(suppl.1)，p.13-16(1983)；Fleckenstein，Experimental Factsand Therapeutic Prospects，John Wiley，New York(1983)；McCall，D.，Curr Pract Cardiol，v.10，p.1-11(1985))。钙通道阻断剂是一种不同种类的药物组，可以通过调节细胞钙通道防止或减慢钙进入细胞(Remington，The Science and Practice of Pharmacy，Nineteenth Edition，Mack Publishing Company，Eaton，PA，p.963(1995))。根据本发明得可用得大多数目前可获得得钙通道阻断剂属于药物的三种主要类别，二氢吡啶，例如硝苯吡啶，苯基烷基胺，例如戊脉安，以及苯并噻吖庚因，例如硫氮酮。根据本发明其它可用的钙通道阻断剂包括但不限于，氨利酮，阿姆罗赫，苄环烷，非洛地平，苯乙二苯丙胺，氟苯桂嗪，伊拉地平，硝苯苄胺啶，印楝素酸，perhexilene，戈洛帕米，噻帕米和噻帕米类似物(例如1993RO-11-2933)，苯妥英，巴比妥酸盐，和肽强啡肽，

-蜗牛毒素，和-蜘蛛毒素，及其类似物和/或其药学可接收的盐。

“β-肾上腺素受体阻断试剂”是一类能对抗心绞痛，高血压，和心律不齐中儿茶酚胺的心血管作用的药物。β-肾上腺素受体阻断剂包括但不限于，氨酰心安，醋丁酰心安，烯丙心安，百部碱，倍他索洛尔，丁下腈心安，山羊豆苷，噻利洛尔，hedroxalol，茚诺洛尔，柳胺苄心定，左布诺洛尔，甲吲哚心安，methypranol，metindol，甲氧乙心安，metrizoranolol，烯丙氧心安，吲哚洛尔，普萘洛尔，醋氨心安，醋氨心安，sotalolnadolol，甲硫心安，tomalolol，噻吗心安，氯甲苯心安，喷布洛尔，三甲苯心安，2-(3-(1，1-二甲基乙基)-氨基-2-羟基丙氧基)-3-pyridenecarbonitrilHCI，1-丁基氨基-3-(2，5-二氯苯氧基)-2-丙醇，1-异丙胺基-3-(4-(2-环丙基甲氧基乙基)苯氧基)-2-丙醇，3-异丙胺基-1-(7-甲基茚满-4-基氧)-2-丁醇，2-(3-t-丁胺基-2-羟基-丙基硫)-4-(5-氨甲酰基-2-噻吩基)噻唑，7-(2-羟基-3-t-丁胺基丙氧基)苯酞。上述化合物可以使用其同分异构体混合物，或者分别使用其左旋形式或右旋形式。

环氧合酶-2(COX-2)是环氧合酶的一种近来才被识别的形式。“环氧合酶”是存在于大部分能从花生四烯酸产生各种前列腺素和凝血恶烷的组织中的酶复合物。非甾族，抗炎性药物发挥其大部分抗炎性，止痛和退热活性，并通过抑制环氧合酶(也称作前列腺素G/H合酶和/或前列腺素-内过氧化物合酶)。最初，只知道一种形式的环氧合酶，“组成型酶”或环氧合酶-1(COX-1)。它最初是在牛精囊中被发现的。

环氧合酶-2(COX-2)最初是从小鸡，鼠和人中被克隆，测序和鉴定的(参见，例如美国专利序列号5,543,297，1996年8月6日由Cromlish等发明，由Merck Frosst Canada，Inc.，Kirkland，CA申请，名称为：“Human cyclooxygenase-2 cDNA and assays forevaluating cyclooxygenase-2 activity”)。这种酶与COX-1不同。COX-2可快速和容易地被多种试剂诱导，所述试剂包括有丝分裂素，内毒素，激素，细胞因子和生长因子。由于前列腺素同时具有生理学和病理学功能，组成型酶，COX-1在很大程度上负责前列腺素的内源基底释放，因此具有重要的生理学功能例如维持胃肠的完整性和肾脏的血液流动。相反，诱导形式的COX-2主要负责前列腺素的病理性效果，作为对如炎性试剂，激素，生长因子和细胞因子的试剂的反应，可快速诱导该酶。因此，COX-2的选择性抑制剂对于传统的非甾族抗炎性药物具有类似的抗炎性，退热和止痛性质，除此之外还抑制激素诱导的子宫收缩，还具有潜在的抗癌效果，但副作用有所减轻。特别是，这种COX-2抑制剂可能具有降低的胃肠毒性，降低的对肾脏的副作用，减短的流血时间，在阿斯匹林过敏的哮喘患者中具有降低的诱发哮喘的可能性，因此根据本发明是有用的。

有多种选择性“COX-2抑制剂”都是所属领域已知的。包括但不限于美国专利序列号5,474,995“Phenyl heterocycles asCOX-2 inhibitors”；美国专利序列号5,521,213“Diaryl bicyclicheterocycles as inhibitors of cyclooxygenase-2”；美国专利序列号5,536,752“Phenyl heterocycles as COX-2 inhibitors”；美国专利序列号5,550,142“Phenyl heterocycles as COX-2 inhibitors”；美国专利序列号5,552,422“Aryl substituted 5，5 fused aromaticnitrogen compounds as anti-inflammatory agents”；美国专利序列号5,604,253“N-Benzylindol-3-yl propanoic acid derivatives ascyclooxygenase inhibitors”；美国专利序列号5,604,260“5-Methanesulfonamido-1-indanones as an inhibitor ofcyclooxygenase-2”；美国专利序列号5,639,780“N-Benzylindol-3-yl butanoic acid derivatives as cyclooxygenase inhibitors”；美国专利序列号5,677,318“Diphenyl-1，2-3-thiadiazoles asanti-inflammatory agents”；美国专利序列号5,691,374“Diaryl-5-oxygenated-2-(5H)-furanones as COX-2 inhibitors”；美国专利序列号5,698,584“3，4-Diaryl-2-hydroxy-2，5-dihydrofurans as prodrugs to COX-2 inhibitors”；美国专利序列号5,710,140“Phenyl heterocycles as COX-2 inhibitors”；美国专利序列号5,733,909“Diphenyl stilbenes as prodrugs to COX-2inhibitors”；美国专利序列号5,789,413“Alkylated styrenes asprodrugs to COX-2 inhibitors”；美国专利序列号5,817,700“Bisaryl cyclobutenes derivatives as cyclooxygenase inhibitors”；美国专利序列号5,849,943“Stilbene derivatives useful ascyclooxygenase-2 inhibitors”；美国专利序列号5,861,419“Substituted pyridines as selective cyclooxygenase-2 inhibitors”；美国专利序列号5,922,742“Pyridinyl-2-cyclopenten-1-ones asselective cyclooxygenase-2 inhibitors”；美国专利序列号5,925,631“Alkylated styrenes as prodrugs to COX-2 inhibitors”中所述的COX-2抑制剂；所有专利的专利权人均为Merck Frosst Canada，Inc.(Kirkland，CA or Merck&Co.，Inc.(Rahway，NJ)。美国专利序列号5,643,933，专利权人为G.D.Searle&Co.(Skokie，IL)，发明名称为：“Substituted sulfonylphenylheterocycles ascyclooxygenase-2 and 5-lipoxygenase inhibitors.”的专利也描述了其它的COX-2抑制剂。

许多上述的COX-2抑制剂都是选择性COX-2抑制剂的前体药物，通过在体内转化为活性的和选择性的COX-2抑制剂来发挥作用。由上述COX-2抑制剂前体药物形成的活性的和选择性的COX-2抑制剂在1995年1月5日公开的WO 95/00501，1995年7月13日公开的WO 95/18799和1995年12月12日公开的美国专利序列号5,474,995中有详细描述。根据发明名称为“Humancyclooxygenase-2 cDNA and assays for evaluatingcyclooxygenase-2 activity”的美国专利序列号5,543,297的教导，所属领域普通技术人员应当能够确定一种试剂是否是选择性COX-2抑制剂或COX-2抑制剂的前体，因此也是本发明的一部分。

“血管紧张素系统抑制剂”是一种能干扰血管紧张素II的功能，合成或分解代谢的试剂。这类试剂包括但不限于血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂，血管紧张素II拮抗剂，血管紧张素II受体拮抗剂，能激活血管紧张素II的分解代谢的试剂，以及可以防止血管紧张素I的合成从而最终防止血管紧张素II的合成。肾素-血管紧张素系统涉及血液动力学和水和电解质平衡的调节。能降低血液容积，肾灌注压力，或血浆中Na⁺浓度的因素可以激活该系统，而能增加这些参数的因素则能够抑制其功能。

血管紧张素I和血管紧张素II是通过酶促的肾素-血管紧张素途径合成的。当酶肾素作用于血管紧张素原，一种血浆中的假球蛋白，以产生十肽血管紧张素I的时候则启动了合成过程。血管紧张素I被血管紧张素转换酶(ACE)转换为血管紧张素II(血管紧张素-[1-8]八肽)。后者是一种活性升压剂，是在各种哺乳动物例如人中引起几种形式的高血压的试剂。

血管紧张素(肾素-血管紧张素)系统是能干扰血管紧张素原或血管紧张素I到血管紧张素II的产生，或能干扰血管紧张素II的活性的化合物。这些化合物是所属领域普通技术人员公知的，包括能抑制血管紧张素II的最终产生过程中涉及的酶的化合物，包括肾素和ACE。还包括能干扰血管紧张素在产生之后的活性的化合物。这类化合物的例子包括抗体(例如肾素抗体)，氨基酸及其类似物(包括与大分子结合的氨基酸)，肽(包括血管紧张素和血管紧张素I的肽类似物)。前肾素相关类似物等。那些最有效的和有益的肾素-血管紧张素系统抑制剂是肾素抑制剂，ACE抑制剂，和血管紧张素II拮抗剂。在本发明的一个优选的实施方案中，肾素-血管紧张素系统抑制剂是肾素抑制剂，ACE抑制剂，和血管紧张素II拮抗剂。

“血管紧张素II拮抗剂”是能够通过与血管紧张素II的受体结合来干扰血管紧张素II的活性的化合物。血管紧张素II拮抗剂是公知的，包括肽化合物和非肽化合物。大部分血管紧张素II拮抗剂都是经过轻微修饰的同源物，其中通过将第8位的苯基丙氨酸替换为其它氨基酸减弱其激动剂活性；通过其它能减缓体内退化的取代增强稳定性。

血管紧张素II拮抗剂的实例包括：肽类化合物(例如肌丙抗增压素，[(San¹)(Val⁵)(Ala⁸)]血管紧张素-(1-8)八肽以及相关的类似物)；N-取代的咪唑-2-酮(美国专利序列号5,087,634)；醋酸咪唑衍生物包括2-N-丁基-4-氯-1-(2-chlorobenzile)，咪唑-5-醋酸(参见Long et al.，J.Pharmacol.Exp.Ther.247(1)，1-7(1988))；4，5，6，7-四氢-1H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸及其类似的衍生物(美国专利序列号4,816,463)；N2-四唑-葡糖苷酸类似物(美国专利序列号5,085,992)；取代的吡咯，吡唑，和tryazoles(美国专利序列号5,081,127)；苯酚和杂环衍生物例如1，3-咪唑(美国专利序列号5,073,566)；咪唑并融合的7元杂环(美国专利序列号5,064,825)；肽(例如美国专利序列号4,772,684)；血管紧张素II的抗体(例如美国专利序列号4,302,386)；和芳烷基咪唑化合物例如二苯基-甲基取代的咪唑(例如EP号253,310，1988年1月20日)；ES8891(N-吗啉代乙酰基-(-1-萘基)-L-丙氨酰-(4，噻唑基)-L-丙氨酰(35，45)-4-氨基-3-羟基-5-环-hexapentanoyl-N-hexylamide，Sankyo Company，Ltd.，Tokyo，Japan)；SKF108566(E--2-[2-丁基-1-(羧苯基)甲基]1H-咪唑-5-基[methylane]-2-噻吩丙酸，Smith Kline Beecham Pharmaceuticals，PA)；洛沙坦(DUP753/MK954，DuPont Merck PharmaceuticalCompany)；Remikirin(R042-5892，F.Hoffman LaRoche AG)；A₂激动剂(Marion Merrill Dow)和特定的非肽杂环(G.D.Searle andCompany)。

“血管紧张素转换酶”(ACE)是一种能催化血管紧张素I转化为血管紧张素II的酶。ACE抑制剂包括能通过抑制ACE活性干扰肾素-血管紧张素系统从而减少或消除升压物质血管紧张素II的形成的氨基酸及其衍生物，肽，包括二肽和三肽，以及ACE抗体。ACE抑制剂在医学上已经被用于治疗高血压，充血性心力衰竭，心肌梗塞和肾病。已知可用作ACE抑制剂的化合物包括酰基巯基和巯基烷酰基脯氨酸例如卡托普利(美国专利序列号4,105,776)和佐芬普利(美国专利序列号4,316,906)，羧烷基二肽例如依那普利(美国专利序列号4,374,829)，赖诺普利(美国专利序列号4,374,829)，喹那普利(美国专利序列号4,344,949)，雷米普利(美国专利序列号4,587,258)，和培哚普利(美国专利序列号4,508,729)，羧烷基二肽类似物例如硅氨(美国专利序列号4,512,924)和贝那普利(美国专利序列号4,410,520)，磷酰基烷酰基脯氨酸例如福辛普利(美国专利序列号4,337,201)和trandolopril。

“肾素抑制剂”是能够干扰肾素活性的化合物。肾素抑制剂包括氨基酸及其衍生物，肽及其衍生物，以及肾素的抗体。美国专利中所给出的肾素抑制剂的实例如下：肽的脲衍生物(美国专利序列号5,116,835)；通过非肽键相连的氨基酸(美国专利序列号5,114,937)；二肽和三肽衍生物(美国专利序列号5,106,835)；氨基酸及其衍生物(美国专利序列号5,104,869和5,095,119)；二醇磺胺和亚磺酰(美国专利序列号5,098,924)；修饰的肽(美国专利序列号5,095,006)；肽酰-氨酰基氨基二醇氨基甲酸酯(美国专利序列号5,089,471)；pyrolimidazolones(美国专利序列号5,075,451)；含有氟和氯施德丁或statone的肽(美国专利序列号5,066,643)；肽酰氨基二醇(美国专利序列号5,063,208和4,845,079)；N-吗啉代衍生物(美国专利序列号5,055,466)；抑胃肽衍生物(美国专利序列号4,980,283)；N-杂环醇(美国专利序列号4,885,292)；肾素的单克隆抗体(美国专利序列号4,780,401)；和多种其它肽及其类似物(美国专利序列号5,071,837，5,064,965，5,063,207，5,036,054，5,036,053，5,034,512，和4,894,437)。

能与细胞粘附分子结合并能抑制白细胞与这种分子结合能力的试剂包括多肽试剂。这种多肽试剂包括根据传统方法制备的多克隆和单克隆抗体。这种抗体是所属领域已知的，包括抗-ICAM 1抗体和其它上述抗体。

抗凝血剂包括但不限于蛇毒去纤维酶；抗凝血剂柠檬酸盐右旋葡萄糖溶液；抗凝血剂柠檬酸盐磷酸盐右旋葡萄糖腺嘌呤溶液；抗凝血剂柠檬酸盐磷酸盐优选葡萄糖溶液；抗凝血剂肝素溶液；抗凝血剂柠檬酸钠溶液；阿地肝素钠；比伐卢定；溴茚二酮；达肝素钠；地西卢定；双香豆素；肝素钙；肝素钠；阿朴酸钠；甲磺酸萘夫西林；苯丙羟基香豆素；亭扎肝素钠；和丙酮苄羟香豆素钠。

肝素可以在中风发展的过程中稳定症状，但是由于其增加了脑或其它组织出血的可能性，抗凝血剂对于急性完全中风没有用(而且可能具有危险性)，并且对于高血压是禁忌的。虽然时间的选择还存在争议，但是抗凝血剂可用于预防复发性的心脏栓塞。凝血块溶解试剂，包括组织血纤维蛋白溶酶原激活剂和链激酶正在被评定是否可以作为急性中风的最早期治疗。最近发现尼莫地平可以提高缺血性中风的存活率和临床效果。

除了阿司匹林以外，噻氯匹定是另一种可有效用于中风治疗的抗血小板试剂。70％到99％的颈内动脉狭窄患者需要进行动脉内膜切除术。但是，大多数权威人士认为基底脊椎系统TIA的患者，因曾患过中风而具有明显缺陷的患者，或者正患有中风的患者不需要进行颈动脉内膜切除术。

HMG-CoA(3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A)还原酶是一种能催化胆固醇生物合成过程中的限速反应(HMG-CoA6M甲羟戊酸)的微粒体酶。HMG-CoA还原酶抑制剂可抑制HMG-CoA还原酶，最终能抑制胆固醇的合成。许多HMG-CoA还原酶抑制剂已被用于治疗高胆固醇血症患者。最近发现HMG-CoA还原酶抑制剂可有效治疗中风(Endres M，et al.，Proc Natl Acad Sci US A，1998，95：8880-5)。

可用于与本发明的试剂一同给药的HMG-CoA还原酶抑制剂包括但不限于辛伐他汀(美国专利序列号4,444,784)；洛伐他汀(美国专利序列号4,231,938)；普伐他汀钠(美国专利序列号4,346,227)；氟伐他汀(美国专利序列号4,739,073)；阿伐他汀(美国专利序列号5,273,995)；西立伐他汀，和如美国专利序列号5,622,985；美国专利序列号5,135,935；美国专利序列号5,356,896；美国专利序列号4,920,109；美国专利序列号5,286,895；美国专利序列号5,262,435；美国专利序列号5,260,332；美国专利序列号5,317,031；美国专利序列号5,283,256；美国专利序列号5,256,689；美国专利序列号5,182,298；美国专利序列号5,369,125；美国专利序列号5,302,604；美国专利序列号5,166,171；美国专利序列号5,202,327；美国专利序列号5,276,021；美国专利序列号5,196,440；美国专利序列号5,091,386；美国专利序列号5,091,378；美国专利序列号4,904,646；美国专利序列号5,385,932；美国专利序列号5,250,435；美国专利序列号5,132,312；美国专利序列号5,130,306；美国专利序列号5,116,870；美国专利序列号5,112,857；美国专利序列号5,102,911；美国专利序列号5,098,931；美国专利序列号5,081,136；美国专利序列号5,025,000；美国专利序列号5,021,453；美国专利序列号5,017,716；美国专利序列号5,001,144；美国专利序列号5,001,128；美国专利序列号4,997,837；美国专利序列号4,996,234；美国专利序列号4,994,494；美国专利序列号4,992,429；美国专利序列号4,970,231；美国专利序列号4,968,693；美国专利序列号4,963,538；美国专利序列号4,957,940；美国专利序列号4,950,675；美国专利序列号4,946,864；美国专利序列号4,946,860；美国专利序列号4,940,800；美国专利序列号4,940,727；美国专利序列号4,939,143；美国专利序列号4,929,620；美国专利序列号4,923,861；美国专利序列号4,906,657；美国专利序列号4,906,624；和美国专利序列号4,897,402中所述的其它试剂，在此引入这些专利所公开的内容作为参考。

一氧化氮(NO)是一种在心血管，神经和免疫系统具有多种生理学功能的信使分子(Griffith，TM et al.，JAm Coll Cardiol，1988，12：797-806)。它可以调节血管松弛，神经传递和病原体的抑制。NO是通过NO合酶由L-精氨酸的胍基氮产生的(Moncada，S and Higgs，EA，Eur J Clin Invest，1991，21：361-374)。能正调控内皮细胞一氧化氮合酶的试剂包括但不限于L-精氨酸，rho GTP酶功能抑制剂(参见国际申请WO 99/47153，在此引入其内容作为参考)，以及能破坏肌动蛋白细胞骨骼结构的试剂(参见国际申请WO 00/03746，在此引入其内容作为参考)。

这里所说的“一同给药”是指同时给予两种或更多种本发明的化合物(例如IL1RL-1核酸和/或多肽，以及一种已知对治疗例如心血管疾病有益的试剂，例如一种抗凝血剂)，在单一的组合物中作为混合物存在，或者是时间紧密地顺序加入以使得所述化合物可以起到附加作用或者协同作用，即在心血管疾病中减少心肌细胞死亡。

本发明还包括固相核酸分子阵列。所述阵列基本由一组核苷酸分子，其表达产物或其片段(核酸或多肽分子的片段)组成，所述组包括固定于固相上的一种IL1RL-1核酸分子和至少一种对照核酸。在优选的实施方案中，所述核苷酸组分子包括最大数目为100种的不同的核酸分子。在重要的实施方案中，所述核苷酸组包括最大数目为10种的不同的核酸分子。

根据本发明，可使用微阵列技术的标准杂交方法确定核酸表达的模式，并识别核酸表达。已知微阵列技术还可以称为：DNA芯片技术，基因芯片技术，以及固相核酸阵列技术，这都是所属领域普通技术人员熟知的，它是基于但不限于：获得所识别的核酸探针(例如本发明中所描述的分子例如IL1RL-1)在固定底物上的阵列，用报道分子(例如放射性，化学发光，或荧光标记例如荧光素，Cye3-dUTP或Cye5-dUTP)标记靶分子，使靶核酸与探针杂交，测定靶-探针的杂交。具有完全能与靶序列匹配的核酸序列的探针通常比不完全匹配的探针能检测到更强的报道分子信号。核酸微阵列技术中用到的许多组分和技术在NatureGenetics，Vol.21，Jan 1999中有描述，在此引入其全文作为参考。

根据本发明，微阵列底物包括但不限于玻璃，二氧化硅，硅酸铝，硼硅酸盐，金属氧化物例如氧化铝和氧化镍，各种粘土，硝化纤维，或尼龙。在所有的实施方案中优选使用玻璃底物。根据本发明探针选自核酸，所述核酸包括但不限于DNA，基因组DNA，cDNA，和寡核苷酸；可以是天然的或是合成的。寡核苷酸探针优选为20到25聚体的寡核苷酸，DNA/cDNA探针优选为500-5000碱基长，但是也可以用其它长度。合适的探针长度应当由所属领域技术人员根据本领域已知的程序来确定。在一个实施方案中，优选的探针是两个或多个如SEQ ID NO：1和/或3所示的核苷酸分子组。探针可以用所属领域普通技术人员已知的方法例如凝胶过滤或沉淀以除去杂质。

在一个实施方案中，微阵列底物可以被一种化合物包裹以促进探针在底物上的合成。这种化合物包括但不限于寡乙二醇。在另一个实施方案中，可在底物上使用偶联剂或偶联基团，以使第一个核苷酸或寡核苷酸共价连接到底物上。这种试剂或基团包括但不限于氨基，羟基，溴基和羧基。这些反应性基团优选通过烃基与底物连接，所述烃基例如亚烃基或亚苯基二价基，其中一价的位置由链连接占据而另一价与反应基团相连。这些烃基可以含有达十个碳原子，优选达六个碳原子。亚烃基通常优选在主链上含有两个到四个碳原子。这些过程以及其它的细节在例如美国专利序列号4,458,066中公开，在此引入其全文作为参考。

在一个实施方案中，探针是用如光控的化学合成，光化学去保护，或将核酸前体递送到底物上并最终生成探针的方法在底物上以预定的栅格模式直接合成的。

在另一个实施方案中，所述底物可以被一种化合物包裹以增强探针与底物的结合。这种化合物包括但不限于聚赖氨酸，氨基硅烷，氨基反应性硅烷(Nature Genetics，Vol.21，Jan 1999)或铬。在这个实施方案中，预合成的探针以精确的，预定的体积和栅格模式点样于底物上，使用计算机控制的机器人以接触印刷方式或非接触方式例如喷墨或压电方式将探针点样在底物。探针可共价连接在底物上，所使用的方法包括但不限于UV-射线和加热。

靶是选自下组的核酸，包括但不限于DNA，基因组DNA，cDNA，RNA，mRNA，可以是天然的或是合成的。在所有实施方案中，来自怀疑患有或正患有心血管疾病的患者的核酸分子是优选的。在本发明的特定实施方案中，可在底物上连接一种或多种对照核酸分子。优选地，对照核酸分子应可以判断下述因素，包括但不限于：核酸质量和结合特性；试剂质量和效率；杂交的成功，分析的阈值和成功。对照核酸可以包括但不限于基因例如持家基因的表达产物或其片段。

要选择一组心血管疾病标记，优选对例如由基因表达的微阵列分析产生的表达数据进行分析以确定不同类别的患者(每个类别的患者都患有不同的心血管疾病)中的哪个基因是显著差异表达的。基因表达的有效性可以用Permax计算机软件确定，也可以使用任何能区别表达的显著性差异的标准统计软件包。Permax对大量数据阵列进行置换2-样品t-检验。对于所观测的高维向量，Permax软件对每一个特征进行t-统计，用最大和最小总特征的置换分布评估其显著性。其主要用途是用于确定所述特征(基因)在两组(例如对照的健康患者和具有特定心血管疾病的患者)之间是否具有最大差异，用t-统计的值测量“最大差异”，以及它们的显著性程度。

心血管疾病核酸分子的表达也可以用蛋白检测方法判断，以例如通过分别判断SEQ ID NO：1和/或3编码的多肽的表达确定SEQ ID NO：2和/或4的表达。优选的特定的和定量的检测蛋白质的方法包括但不限于：基于质谱的方法例如表面增强激光解吸电离(SELDI；例如Ciphergen ProteinChip系统)，基于非质谱的方法，和基于免疫组织化学的方法例如二维凝胶电泳。

SELDI方法可以用所属领域普通技术人员公知的步骤进行，使微量的肿瘤蛋白质蒸发产生单个蛋白的“指纹”，从而可以在一个样品中同时检测多个蛋白质的丰度。优选基于SELDI的检测可以用于表征心血管疾病以及该疾病的各个阶段。这种检测优选包括但不限于下述实例。由RNA微阵列发现的基因产物可以通过SELDI蛋白质盘的特异性捕获进行选择性地检测(例如选择性SELDI)。由蛋白质筛选(例如二维凝胶电泳)发现的基因产物可以通过“全蛋白SELDI”解析，并将其最优化以可以见到SEQ ID NO：1和/或3中的所感兴趣的特定标记。由SELDI对SEQID NO：1和/或3中的多个标记进行检测得到的肿瘤分类预测模型可以用于SELDI策略。

用任何上述微阵列方法确定心血管疾病核酸的表达可以用所属领域普通技术人员公知的常规方法实施，由蛋白质检测方法确定的表达可能与用作为心血管疾病患者选择治疗策略的预测方法的标记物的预定水平相关。

通过下述实施例本发明应当可以被更充分地理解。但是这些实施例仅仅是举例说明本发明的实施方案，而并非限制本发明的范围。

实施例

实施例1

实验方法：材料与方法

机械力装置

在心肌细胞上加载机械负载的实验通常是在没有心动周期对照的情况下拉伸细胞，这种方法不能区分收缩相对于松弛的机械负载的差别。在本研究中，我们设计并构建了一种独特的实验系统，可以精确地控制培养的心肌细胞中的机械应变和电步进，以特别研究心动周期是如何调节心肌细胞的机械转导的，并识别这种调节中涉及到的基因。

步进应变装置。使用一种具有多个台板的仪器实施机械刺激，所述台板与硅酮弹性体膜的底部接触，向所述膜施加一个空间上各项同性的双轴应变(Schaffer JL，et al.，J Orthop Res，1993，12：709-719；以及1999年7月16日申请的美国临时专利申请，发明名称为AN APPARATUS FOR STUDYINGMYOCARDIAL MECHANICAL OVERLOAD HYPERTROPHYAND USES THREFOR，申请人为Richard T.Lee，承接律师备案记录号为100038.130，快递邮件号为EL110243781US)。六个单独的78mm的膜可以同时拉伸，并通过用步进电机控制每一个台板的替换实现不同程度的应变。测量的格林应变在1-14％之间，并应精确到～±0.25％(Cheng GC，et al.，Circ Res，1997，80：28-36；Brown TD，J Biomechanics，2000，33：3-14)。在此研究中，使用8％的双轴应变。

要控制机械应变相对于细胞周期的定时，计算机用电步进每个皿盘，并控制：机械应变和电脉冲之间的相位，电脉冲的持续时间，电脉冲的电压。除此之外，电脉冲具有交替的极性，以将电化学效应例如电极的pH梯度减至最小。每个皿盘上的两个输出每一个都连接到一组单独的电极上。所述皿盘步进的同时具有大约每皿盘500ohm的阻力。

正的和负的电源电压是由两个电源提供的(6545A，HewlettPackard Company，Palo Alto，CA)。控制电路被分为两部分：高电压电路和低电压或数字信号电路。高电压电路是一个基于输入信号转换输出的门电路。低电压电路接收两个来自计算机的控制信号，接收来自可变电阻器的脉冲宽度，这可以一起控制正的和负的电压门。低电压电路允许电压脉冲在0-120V DC振幅之间，持续2-37ms。用光连续检测脉冲，电路的定时和校准通过示波器进行。

每个皿盘的电极都是在皿盘内表面底部的两个弧形的AgCl₂线电极，正好在可变形的膜上方。电极是预先制备的，用乙醇灭菌，在每次实验之前放置到皿盘中，以将银可能具有的毒性减至最小。用这种方法在24小时的实验中没有观察到细胞死亡或脱离。每个弧形都是120度；我们用二维有限元分析以评估这种结构的势场的均一性。这些计算评测的{均方根}的势场的空间变化＝29％。因此，此系统可提供高度均一的双轴机械应变，并且电压场相对变化较小。

机械刺激方法。我们只是分别在第三个心动周期通过电刺激以在“心脏收缩阶段”施加应变，在松弛阶段的三分之一心动周期施加应变以在“心脏舒张阶段”施加应变。此研究中所使用的条件是：(1)对照；(2)应变，没有步进；(3)步进，没有应变；(4)在心脏收缩阶段施加应变；以及(5)在心脏舒张阶段施加应变。

来自1日龄的Sprague-Dawley鼠的新生鼠心肌细胞(NRVM)根据前述方法分离(Springhorn JP，and Claycomb WC.，Biochem J，1989；258：73-78；Arstall MA，et al.，JMol Cell Cardiol，1998，30：1019-25)。NRVM置于具有薄膜涂层的皿中，密度为2,000,000个细胞/皿，细胞是在含有7％FCS的DMEM中，培育24小时。细胞汇合大约为85-90％。然后用10ml Hank平衡盐溶液(HBSS，138mM NaCl，5.3mM KCl，4.0mM NaHCO₃，1.3mM Cal₂，0.5mM MgCl₂，0.4mM MgSO₄，0.4mM KH₂PO₄，0.3mM Na₂HPO₄，5.6mM葡萄糖；Life Technologies，Inc.，Rockville，MD)洗涤两次使NRVM静止，并且与26ml含有0.2％FCS的DMEM培育48-72小时。

在这些细胞培养条件中，细胞拍打为40-60次/分钟。以这个速度，当以70次/分钟步进的时候我们观察到微乎其微的竞争。我们进行试捕获实验；每个皿上在九个部位进行点样。所有位点的捕获效率都是类似的，60V或更高时达到最大捕获，脉冲宽度为10ms。因此选择电压为70V，脉冲为10ms，速度为1.2Hz(70次/分钟)。在此条件下我们没有观察到部分细胞的脱离。

转录模式。DNA微阵列实验用鼠的初生心肌细胞进行，在纤连蛋白覆盖的膜上用不含血清的培养基培养48小时。仅仅在细胞收缩的30分钟时间内有8％的细胞变形，继续在没有应变也没有步进的条件下培养6小时后制备RNA。这个时间点的选择是基于从前的研究证明了在这个时间段内可以诱导基因肌腱蛋白(心肌细胞的正对照)。用Affymatrix GeneChip RGU34A(Affymetrix，Inc.，Santa Clara，CA)进行DNA微阵列杂交实验。用Affymatrix软件分析数据。

Northern分析。差异表达的基因的cDNA克隆根据GenBank序列用PCR获得。每个克隆均分别从5’端和3’端测序，保证序列完全等同。DNA微阵列中的正组分通过至少三个独立实验，使用三个不同的NRVM来源进行Northern blot杂交分析以证实。总RNA用硫氰酸胍和苯酚氯仿方法提取(Chomcyznski，et al.，Anal.Biochem.，1987，162：156-159)。Northern blotting是将15gRNA加样到1.0％琼脂糖-甲醛凝胶(2.0mol/l)上，转移到尼龙膜(Amersham Pharmacia Biotech AB，Piscataway，NJ)，用UVStratalinker(Stratagene，Inc.，La Jolla，CA)进行UV交联。每个探针都与ExpressHyb溶液(Clontech Labs.，Inc.，Palo Alto，CA)在68℃杂交1小时。膜用2×SSC，0.05％SDS溶液在室温洗脱30到40分钟，洗脱三次，用0.1×SSC，0.1％SDS溶液在50℃持续振荡40分钟。将膜在-80℃暴露于胶片上，扫描射线照片，用Optimas 5.0软件(Optimas Co./Media Cybernetics，SilverSprings，MD)进行分析。根据膜上的溴化乙啶染色的28S核糖体亚基对密度进行归一化。

结果。图1显示了在培养基中的新生心肌细胞中8％周期性机械应变诱导IL1RL-1mRNA表达的过程(早期，左，晚期，右)。最大诱导量是在3小时，并且持续15小时。

图2显示了8％机械应变，血管紧张素受体阻塞(ARB，CP-19116，100nM)，血管紧张素II(Ang II，50nM)，白介素-1β(IL-1β，10ng/ml)，和佛波酯(PMA，200nM)在培养的新生鼠心肌细胞中诱导IL 1RL-1mRNA表达3小时的效果。应变对IL1RL-1mRNA表达的诱导没有被血管紧张素受体阻塞阻断；进一步，用血管紧张素II进行处理没有诱导IL1RL-1mRNA表达。当不存在机械应变时，IL-1β和PMA处理与IL1RL-1mRNA表达的诱导有关。

图3显示了8％机械应变，过氧化氢(H₂O₂，100μM)和抗氧化剂，TIRON(10mM)诱导IL1RL-1mRNA表达的效果。与机械诱导的肌腱蛋白-C基因的mRNA表达不同，其中肌腱蛋白-C基因在没有机械应变的条件下被H₂O₂诱导并且被TIRON阻断，而H₂O₂在没有应变的条件下不能诱导IL1RL-1并且阻断应变对IL1RL-1的诱导。在没有应变的条件下，TIRON轻微减少了IL1RL-1的mRNA表达。

图4显示了放线菌素D(5μg/ml，左)和环己亚胺(10μg/ml，右)对于8％机械应变诱导IL1RL-1mRNA表达的影响。放线菌素D和环己亚胺是在机械应变发生期间加入的。放线菌素D在2小时和4小时的时候阻断IL1RL-1mRNA表达的诱导，这表示应变对IL1RL-1的诱导是导致IL1RL-1转录的增加。蛋白质合成抑制剂，环己亚胺阻断了应变对IL1RL-1mRNA表达的诱导，表示IL1RL-1mRNA表达的诱导需要新的蛋白质合成。

图5显示了8％机械应变单独或与白介素-1β(IL-1β，10ng/ml)，以及佛波酯(PMA，100ng/ml)一起，在没有应变的条件下对培养的新生心肌细胞中IL1RL-1mRNA表达的作用。Both IL-1β和机械应变单独均能诱导IL1RL-1mRNA表达，但是在存在IL-1β的条件下机械应变对IL1RL-1的诱导并没有进一步增加，这表明机械应变和IL-1β在对IL1RL-1的诱导上并没有协同作用或附加作用。最强烈诱导IL1RL-1表达的是PMA。对IL1RL-1mRNA表达的诱导能力按次序排列是PMA＞应变＞IL-1β。

图6显示了暴露于8％应变下0，1，3，6，9小时的新生鼠心肌细胞。用Rneasy试剂盒提取总RNA。将5μg总RNA在1％琼脂糖-甲醛凝胶上分离并转移至尼龙膜上。用UV光交联以后，使膜与V-ATP酶B亚基特异的³²P-标记的探针杂交。然后在-80℃用增光屏将膜暴露于x射线胶片下3小时。

实施例2

介绍：

细胞因子和心脏损伤。应力激活的细胞因子参与多种形式的心脏损伤和病理生理状况，最具代表性的是肿瘤坏死因子-α，白介素-1和白介素-6。这些分子在正常的心脏中并不表达，但是在缺血和多次灌注或者血液动力超负荷的时候可以迅速地被诱导，这表明它们在心肌对应力，损伤或生长刺激的初始反应中具有重要作用(Mann DL，Cytokine and Growth Factor Reviews.1996；7：341-354；St.John SuttonMG，et al.Circulation.2000；101：2981-2988)。但是，细胞因子也在病理性心肌状况包括预后不良的缺血性心脏病和心力衰竭下稳定表达(Pulkki KJ，et al..Annals ofMedicine.1997；29：339-343；Kubota T，et al Proc Natl Acad Sci.1998；95：6930-6935；Aukrust P，et al.Am J Cardiol 1999；83：376-382；MacGowan GA，et al.Am J Cardiol 1997；79：1128-1132；Roig E，et al.Am J Cardiol 1998；688-690；Tsutamoto T，et al.JAmColl Cardiol 1998；31：391-398；Prabhu SD，et al.Circulation.2000；101：2103-2109；Murray DR，et al..Annu Rev Immunol.2000；18：451-494)。

在多种不同系统中，白介素-1通过白介素-1受体进行信号传导，是炎性细胞因子信号传导的早期事件。(Trehu EG.，ClinCancer Res.1996；8：1341-51)。在心脏损伤中，在受到白介素-1，肿瘤坏死因子-α，或脂多糖刺激以后心肌细胞产生白介素-6，在缺血心肌的多次灌注期间在缺血后淋巴腺中也发现白介素-6(Gwechenberger M，et al.Circulation 1999；99：546-551)。最近发现在心脏疾病中在白介素-1信号传导以后表达抵抗抗炎性细胞因子。白介素-4和白介素-10可以抑制肿瘤坏死因子-α的合成，并可增加可溶性肿瘤坏死因子受体的释放，该受体是肿瘤坏死因子的配体(Joyce DA.，1994；Eur.J.Immunol.11：2699-705)。白介素-10在心力衰竭的患者中有所增加(Yamaoka M，et al.JpnCirc J.1999；63：951-956)，在患有扩张性心肌炎的患者中当肿瘤坏死因子-α的血清水平增加时白介素-10的血清水平也增加(Ohtsuka T，et al.J Am Coll Cardiol.2001；37：412-417)。

T1/ST2(IL1RL-1)：一种新的机械诱导受体。我们发现了一种新的心脏中的应力激活的信号传导途径：调控一种白介素-1家族成员基因，T1/ST2的诱导。目前对任何细胞类型中的T1/ST2的诱导，信号传导和功能还几乎一无所知，在研究的不同领域中T1/ST2似乎具有两种不相关的功能。一种是生长调控，另一种是免疫调节。补偿性的过度生长和免疫/炎性调节均与心血管疾病的病理生理学有关。

生长。首次发现T1/ST2基因是由于在血清刺激休眠的鼠3T3成纤维细胞之后它的诱导作用，这表明T1/ST2基因参与生长调控(Tominaga S.，FEBSLetters 1989；258：301-304)。后来发现该基因具有较长的转录物，由与全长白介素-1受体同源的跨膜区域和胞质区域组成(Yanagisawa K，et al.FEBS Letters.1993；318：83-87)。

免疫。T1/ST2在适应性免疫系统中在T辅助细胞-2上表达，而不在T辅助细胞-1上表达，所述系统可产生白介素-4，白介素-5和白介素-10(Yanagisawa KI，et al.J Biochem.1997；121：95-103；Coyle AJ，et al.J Exp Med.1999；190：895-902)。T辅助细胞-2介导对感染的有益反应，但是对变态反应和哮喘的发展是有害的。在T辅助细胞-2上T1/ST2的表达和白介素-4的产生之间具有强相关性(Coyle AJ，et al.J Exp Med.1999；190：895-902)。T1/ST2在分化以及T辅助细胞-2而不是T辅助细胞-1的激活中具有重要作用(O′Neill LAJ，et al.Immunology Today.2000；21：206-209)。

T1/ST2信号传导的抑制减弱了肺中T辅助细胞2-介导的嗜曙红细胞炎性反应的诱导，抑制T辅助细胞-2分泌细胞因子，而不改变T辅助细胞-1分泌干扰素γ(Coyle AJ，et al.J Exp Med.1999；190：895-902)。这些研究表明T1/ST2的表达可以改变细胞因子的组成，以利于白介素-4，白介素-5和白介素-10的表达。进来发现白介素-10在一些心脏损伤中具有抗炎性效果(OhtsukaT，et al.J Am Coll Cardiol.2001；37：412-417)。同样地，T1/ST2不表达会导致偏向干扰素的表达，这对于心肌损伤是有害的。

生长反应和免疫功能中均涉及到T1/ST2，这两者都与细胞因子在针对缺血/多次灌注的炎性反应中的功能的临床识别有关，说明T1/ST2的激活是一种生长-或是应力-激活的信号传导途径，有助于心肌生长和重建。

无T1/ST2小鼠的表型。(Townsend MJ，et al.J Exp Med.2000；191：1069-1075)。无T1/ST2小鼠中T1/ST2的缺乏在没有免疫问题的时候并不损害其基本的免疫功能。但是，无T1/ST2的小鼠产生IL-4，IL-5，和IL-10的能力受到破坏，但是产生IFN-γ(一种Th1细胞因子)的能力没有被破坏，同时在肺中在嗜曙红细胞渗透期间产生T辅助细胞-2炎性反应(一种Th2反应)的能力也受到破坏。

我们已经开始研究心肌细胞中T1/ST2的诱导，以及它在肌细胞信号传导途径中存活/死亡信号传导中的作用。下面所述的初步研究表明T1/ST2在心肌细胞中在对白介素-1和机械应变的反应中受到诱导，白介素-1对T1/ST2的诱导依赖于NF-κB的激活。T1/ST2 mRNA在成人血管平滑肌细胞中在对白介素-1的反应中也受到诱导。T1/ST2蛋白在体内在小鼠心脏中在心肌缺血早期即表达，在具有不稳定斑点的人患者的大动脉组织中也是这样。

结果：

体外研究。下述研究表明机械应变和白介素-1对T1/ST2的诱导可能是通过NF-B的激活实现的。T1/ST2的两种转录产物(也就是IL1RL-1S-可溶的-和IL1RL-1M-膜结合的)在心肌细胞中都能被应变诱导，虽然可溶形式的异构体的转录产物更多一些。T1/ST2 mRNA在培养的新生心肌细胞中可被机械应变诱导(图8)。

T1/ST2 mRNA在培养的新生心肌细胞中可被机械应变诱导。新生的鼠心肌细胞通过胶原蛋白酶消化提取，放置在覆盖着纤连蛋白的硅酮薄膜容器上，密度为3,500,000个细胞，13ml培养液/个容器，如文献所述(Yamamoto K，et al.J Biol Chem.1999；274：21840-21846)。这种方法产生＞95％的肌细胞培养物。用能提供均一的双轴周期性应变的装置实施机械变形，方法如文献所述(Yamamoto K，et al.J Biol Chem.1999；274：21840-21846)。提取RNA(Qiagen)，并用鼠T1/ST2特异性的³²p-标记的600bp的PCR片段作为探针进行Northern blotting。最大诱导量是在3小时并且持续9小时，经15小时衰减。

白介素-1β和机械应变每个都能在心肌细胞中诱导T1/ST2RNA(图9)。图9显示的是白介素-1和应变对T1/ST2的诱导。我们还发现当存在白介素-1β的时候机械应变对T1/ST2的诱导没有进一步增加，说明白介素-1β不会使肌细胞对机械应变对T1/ST2的诱导作用(或者反之亦然)更为敏感。该研究中包含了1小时的时间点，应变的诱导在3小时达到饱和，因此掩盖了白介素1的附加作用。右边的两条线是佛波酯(PMA)在1小时和3小时的效果。对T1/ST2 mRNA表达的诱导的次序是PMA＞应变＞白介素1β。由于白介素1β是通过NF-κB进行信号转导，PMA是通过PKC进行信号转导，这些结果说明NF-κB和PKC活化均参与T1/ST2的诱导。

T1/ST2在心肌细胞中可以通过白介素-1/白介素-1受体信号传导成为NF-κB的靶基因(图10)。根据我们以前所报道的(Yamamoto K，et al.J Biol Chem.1999；274：21840-21846)，心肌细胞的机械应变能够激活NF-B。为了研究NF-κB在白介素-1β和应变对T1/ST2RNA的诱导中的作用，我们过表达了IκBα，它可以降低NF-κB DNA的结合活性。培养的心肌细胞被过表达IκBα的腺病毒载体或具有β-半乳糖苷酶的对照载体转染，然后用8％周期性机械应变或白介素-1(10ng/ml)处理4小时。用³²P-标记的IL1RL-1cDNA探针进行Northern blotting分析RNA。与用β-半乳糖苷酶对照载体处理的细胞中的T1/ST2诱导相比，IκBα的异常表达阻断了白介素-1β对T1/ST2-1 mRNA的诱导，部分阻断了应变对T1/ST2 mRNA表达的诱导。这些结果表明T1/ST2通过白介素-1/白介素-1受体信号传导成为早期的NF-κB靶基因。相反的，除了NF-kB活化以外的途径也可能与机械应变对T1/ST2 RNA的诱导有关。T1/ST2 mRNA在成人血管平滑肌细胞中也可以被白介素-1诱导，但是不被PMA或肿瘤坏死因子(TNF)诱导。

除了上述结果以外，我们还发现T1/ST2是在NF-κB被白介素-1激活之后被诱导，NF-κB与心肌细胞的存活有关。进一步的体外实验证实T1/ST2激活与细胞生长和存活有关。

体内研究。

材料与方法

小鼠的实验性心肌梗塞。小鼠的实验程序得到了哈佛医学院常设动物委员会的支持。如前所述，通过对小鼠进行冠状动脉结扎产生实验型心肌梗塞(13)。收集进行冠状动脉结扎后1天和2天的心脏，将心脏用Z-Fix(Anatech LTD)灌流固定。然后将心脏在4℃固定浸在Z-Fix中过夜。在分级乙醇溶液中脱水后，将心脏放置在Histo-Clear(National Diagnostics)中并用石蜡包埋。将5μm的组织段去石蜡，再水化，用3％过氧化氢培育，用水漂洗然后再用磷酸盐缓冲液漂洗。将组织段封闭，在1∶50抗小鼠ST2初级抗体(Morwell Diagnostics)和1∶100抗-大鼠HRP结合刺激抗体(Vector Laboratories)中培育。玻片用苏木精和伊红进行对比染色。

ST2的患者研究和ELISA

HEART研究。康复和早期后负荷减少疗法(HEART)研究是一种随机的，双盲的，用安慰剂做对照的实验，共对来自美国和加拿大的36个中心的352名具有急性心肌梗塞(MI)的患者进行了实验。在21岁以上并且在24小时内经历过MI的男性和女性都是合乎实验条件的。实验包含和不包含的标准以及细节如文献所述(Pfeffer M.A.，et al.，Circulation，1997，95：2643-2651；Greaves S.C.，et al.，Am.J.Cardiol，1997，80：442-448；Solomon S.D.，et al.，Ann.Intern.Med.，2001，134：451-458；Aikawa Y.，et al.，Am.Heart J，2001，141：234-242)。在HEART实验中需要从69名随机选取的患者中依次采集发生心肌梗塞后1，14和90天的血液样品。用如文献所述的双层单克隆抗体夹心ELISA(KuroiwaK.，et al.，Hybridoma，2000，19：151-159)检测可溶性T1/ST2。这种检测是商业可获得的(MBL International，Watertown，MA)。

PRAISE研究。预期随机Amlodipine存活实验(PRAISE)研究是在具有冠状动脉疾病造成的心力衰竭的患者中进行的一种预期性的对Amlodipine的大规模研究。实验的结果是Amlodipine对于严重的心力衰竭没有有益效果。在治疗之前研究开始的时候采集血液样品，然后在研究过程中采集两次或更多。用上述方法检测可溶性T1/ST2。目前对于心力衰竭的血液检测的关键因素之一是脑利尿钠肽(BNP)。我们检查心力衰竭的患者中T1/ST2水平是否发生改变，并且检查在这些患者中T1ST2水平是否与BNP水平相关。

统计学分析。每个体外实验最少进行三次。其值为平均值±SEM。用单因素ANOVA或重复测量的ANOVA，以及合适的posthoc Bonferroni多重比较分析方法分析数据。由于非正常的数据分布，对血清值的对数转换值进行线性回归分析。P值＜0.05被认为是具有统计学意义。

结果：

小鼠心肌梗塞期间的T1/ST2体内表达。为了评价损伤心肌中的T1/ST2表达，通过进行冠状动脉结扎使小鼠发生实验性心肌梗塞。图11显示了用心肌梗塞后1和3天小鼠心脏的免疫组织化学分析得到的T1/ST2的蛋白表达。观察心肌梗塞后(MI后)1天在左心室的所有区域，正常区域，梗塞区域和边缘区域的正染色结果，但是不观察心肌梗塞后3天的染色结果。在1天和3天的假手术对照中没有观察到T1/ST2着色。这些结果表明T1/ST2蛋白在梗塞后的重建过程的早期阶段中，在第3天所观察到的巨噬细胞转移到梗塞和边缘区域之前，在对急性损伤的反应的时候表达。用于这些研究的单克隆抗体不区分T1/ST2的可溶形式和膜结合形式。

在心肌梗塞后一天，在患者的系统循环中发现可溶性T1/ST2增加。由于可溶性T1/ST2在心肌细胞中被高度诱导，T1/ST2蛋白在发生实验性心肌梗塞之后在小鼠心肌中高度表达，我们猜测在心肌梗塞之后在患者的系统循环中可溶性T1/ST2有所增加。

方法和结果：用双层单克隆抗体夹心ELISA检测，我们对HEART研究中的69个参与者在心肌梗塞当天(1天)，梗塞后14天和90天检测了其血样。如图12a所示，与14天(平均值±SEM，0.98±0.06ng/ml；范围，0.25到3.42ng/ml)和90天(平均值±SEM，0.79±0.07ng/ml；范围，0.02到3.53ng/ml；14天与90天相比，P＝NS)相比，系统T1/ST2蛋白在心肌梗塞后一天(平均值±SEM，3.8±0.4ng/ml，p＜0.001；范围，0.32到17.42ng/ml)显著增加。90天的平均值与公开的健康对照的平均值相似(Kuroiwa K.，et al.，Hybridoma，2000，19：151-159)。系统T1/ST2蛋白水平与肌酸激酶水平的峰值正相关(r＝0.41，p＜0.001)，如图12b所示。高的系统ST2蛋白水平还与心肌梗塞后一天时的低射血分数有关，如图12c中四分位值分析所示(p＝0.03)。

结论：这些结果表明在心肌梗塞的临床表现中，心肌损伤程度与可溶性T1/ST2的合成和其向系统循环中的分泌之间存在律动调节。

可溶性T1/ST2在患有严重慢性心力衰竭的患者的系统循环中有所增加。此研究检验了关于在患有严重慢性心力衰竭的患者血清中可溶性T1/ST2与在心力衰竭中有所增加的BNP，ProANP和降肾上腺素，神经激素有关的猜想。

方法和结果：使用预期随机Amlodipine存活评估2研究(PRAISE-2)心力衰竭试验的神经激素亚组研究(纽约心脏协会功能分类III或IV，终点：死亡率或移植)中的血清样品，临床变量和神经激素水平。PRAISE-2研究是一种多中心的，随机的，双盲的，平行组的，用安慰剂做对照的研究，可以评价amlodipine10mg/天对于具有非缺血性原因的充血性心力衰竭患者存活的效果。该试验由来自美国和加拿大的240个场所的患者组成。神经激素亚组研究由来自参与主要研究的26个中心的181名患者组成。主要的PRAISE-2和神经激素亚组研究得到了参与机构的机构审查委员会的支持。如果患者年龄至少为18岁，具有非缺血性原因的心力衰竭，并且症状是发生在休息的时候或最平缓的运动时(纽约心脏协会功能分类III或IV)，并且左心室射血分数低于30％，那么该患者合乎条件。所有的患者都使用ACE抑制剂和地高辛治疗至少3个月。具有近期或远期绞痛史的患者被排除在外。

T1/ST2，神经激素的检测，氧化性胁迫的测量。测量基准血样和2周时的血样(表1)。用双层单克隆抗体夹心ELISA方法检测可溶性T1/ST2(Medical&Biological Laboratories Co.，Ltd.，Nagoya，Japan)，根据制造商的手册进行操作。简单地说，血样或标准样品在涂覆有抗人T1/ST2抗体的微孔中培育。进行洗脱后，向微孔中加入结合过氧化物酶的抗人T1/ST2抗体并培育。再次洗脱后，加入过氧化物酶底物，测量450nm处的光密度。循环的儿茶酚胺(降肾上腺素，肾上腺素，多巴胺)，血管紧张素II，利尿钠肽(前-心房利尿钠肽(Pro-ANP)，脑利尿钠肽(BNP))和氧化性胁迫的指标(丙醛，肾上腺黄素)的测量如文献所述(Dhalla KS，et al.，Mol Cell Biochem，1989；87：85-92；Moe GW，et al.，Am Heart J，2000；139：587-95)。对在实验登记时获取的162名患者的样品以及在实验登记后2周获取的相同患者中的135名患者的样品进行T1/ST2血清检测。基准T1/ST2水平与基准BNP水平(r＝0.3511，p＜0.0001)，基准ProANP水平(r＝0.3598，p＜0.0001)和基准降肾上腺素水平(r＝0.3854，p＜0.0001)相关(表2)。T1/ST2的变化(2周时的T1/ST2水平减去实验登记时的T1/ST2水平)是重要的死亡率或移植的单变量预测因素(p＝0.048)，基准BNP(p＜0.0001)和基准ProANP(p＜0.0001)也是一样(表3)。在包括BNP和ProANP的多变量模型中，T1/ST2的变化独立于BNP和ProANP，也是死亡率或移植的重要的独立预测因素(表4)。

表1基准特征

表2.ST2与临床变量和神经激素相关：斯皮尔曼相关分析

R，斯皮尔曼相关系数；N，样品数量。基准，实验登记时的值；^*变化，2周时的数值减去实验登记时的数值。

表3.死亡率和移植的单变量预测因素(终点)

基准，实验登记时的值；^*变化，2周时的数值减去实验登记时的数值。

表4.死亡率和移植的单变量预测因素(终点)：ST2的预测值

基准，实验登记时的值；^*变化，2周时的数值减去实验登记时的数值。

实施例3

方法

研究人群。心肌梗塞的血栓溶解(TIMI)14试验是一项随机的，开放标记，剂量定量的研究，在1997年3月和1998年7月之间进行，研究患有ST区段升高的MI的患者的组合多次灌注治疗。特别地，这项研究是一项血管造影试验，比较了4种不同的溶解血栓组合：阿昔单抗单独，阿替普酶单独，阿昔单抗和剂量减少的阿替普酶一起，以及阿昔单抗和剂量减少的链激酶一起(Antman EM et al.，Circulation，1999；99：2720-32；Antman EM etal.，Eur Heart J，2000；21：1944-53)。ENTIRE-TIMI 23试验是一项开放标记的，剂量定量的，多中心的研究，在2000年2月和2001年9月之间进行，以评价依诺肝素作为附加抗凝血酶治疗进行不同形式的药理学多次灌注的效果，其中多次灌注包括全剂量的替奈替普酶和半剂量的替奈替普酶加上阿昔单抗(Antman EMet al.，Circulation.2002；105：1642-9)。在这两项研究中，如果患者在6小时(ENTIRE)内或12小时(TIMI 14)内至少发生30分钟符合条件的缺血性不适事件，并且在2次连续的心前区的心电图线之间至少具有0.1mV的ST区段升高，那么该患者是合乎条件的。两项试验的排除标准包括增加的出血危险性，几种肾功能不足，以及心原性休克。

实验室分析。收集基准时的，TIMI 14登记后1，3，12和24小时后的血清样品，并进行分析。来自ENTIRE实验的血清样品只获取其基准值。在样品收集后60分钟之内分离血清，-20℃或更低温度贮存，直至运往TIMI Biomarker Core Lab(Boston，MA)，到达后将样品在-70℃贮存。用双层单克隆抗体夹心ELISA方法(Medical&Biological Laboratories Co.，Ltd.，Nagoya，Japan)检测可溶性ST2。血清样品或标准样品在涂覆有抗人ST2抗体的微孔中培育。进行洗脱后，向微孔中加入结合过氧化物酶的抗人ST2抗体并培育。再次洗脱后，加入过氧化物酶底物，测量450nm处的光密度。用文献所述方法(Morrow DA et al.，JAm Coll Cardiol.1998；31：1460-5；Morrow DA et al.，Clin Chem.2000；46：453-460)测量高敏感的C-反应性蛋白(hs-CRP，Dade-Behring Inc，Deerfield，IL)，肌酸激酶MB同工酶(CK-MB)，B-类型的利尿钠肽(SHIONORIA BNP，Shionogi，Osaka，Japan)，和心脏肌钙蛋白I(ACS：180，Bayer Diagnostics，Tarrytown，NY)。如果条件允许，在最初的24小时内在3小时，以6到8小时的间隔在原位检测肌酸激酶同工酶水平。由于样品的可获得性，对来自ENTIRE-TIMI 23的样品，而不对来自TIMI 14的样品检测BNP水平。

统计分析。将患者依据其在进行研究登记之时的ST2血清水平将其分为四组。ST2水平用平均值和25^th-75^th百分点表示。用连续变量的Kruskal-Wallis检测和分类变量的χ2检测分析基准临床特征和ST2四分位值之间的相关性。用非参数(斯皮尔曼)的相关系数来研究ST2和其它连续基准变量之间的相关性。为评价ST2与临床结果之间的相关性，比较达到研究终点的患者的ST2和那些没有使用Wilcoxon秩和检验的患者的ST2。ST2和结果之间相关性的多变量分析是用对数回归分析的，包括ST升高的心肌梗塞(STEMI)的死亡率的已知预测因素的条件(Morrow，DAet al.，Circulation 2000；Oct 24；102(17)：2031-7)。除非特别指出，所有的结果都是综合了TIMI 14和ENTIRE-TIMI 23研究人群的结果。

结果

基准ST2和临床变量。大部分基准临床特征，包括性别，年龄，体重，以及冠状动脉疾病的程度都与基准ST2水平无关(表5)。在研究人群中几乎没有患者曾经患有心力衰竭或者显示心力衰竭的临床症状。有趣的是，心率与ST2水平(p＜0.0001)正相关，并且心脏血液收缩压和ST2有适度的相关性(p＝0.05)，这和关于ST2是由心肌细胞在收到生物力学胁迫的时候分泌的推测相吻合。生物标志化合物心脏肌钙蛋白I，BNP，和CRP都能够在发生心肌梗塞之后预测结果(de Lemos JA et al.，N Engl JMed 2001；345：1014-21；Antman EM et al，N Engl J Med 1996；335：1342-9；Morrow DA et al.，J Am Coll Cardiol 1998；31：1460-5)，四分位值分析表明它们与ST2相关，心脏肌钙蛋白I和CRP具有统计学意义。将这些生物标志化合物作为连续变量评价的时候，只观察到数量上较弱的相关性(表6)。

表5ST2四分位值的基准临床特征(ng/mL)

CP＝胸痛；HR＝心率；cTnI＝心脏肌钙蛋白I；BNP＝B类型的利尿钠肽；CRP＝C反应性蛋白；CAD＝冠状动脉疾病；EF＝射血分数

^*只检测了ENTIRE-TIMI 23人群；N＝448除了^**(N＝469)

表6.ST2和连续变量之间的相关性

CP＝胸痛；CKMB＝肌酸激酶的MB同工酶；cTnI＝心脏肌钙蛋白I；BNP＝B类型的利尿钠肽；CRP＝C反应性蛋白；CAD＝冠状动脉疾病；EF＝射血分数。

^*只检测了ENTIRE-TIMI 23人群；N＝448除了^**(N＝469)

ST2和临床结果。综合810名患者的结果，基准ST2与30天时的结果显著相关(表7)。特别是，实验登记后30天，在后来死亡的患者(p＝0.0001)，或者发生新的或更严重的CHF(p＝0.009)的患者的ST2水平显著较高。如果根据中值分为两部分，通过30天的随访(对数秩，p＝0.0009，图13)，较高的基准ST2水平预示着较高的死亡率。而且，在ST2的四分位值分析中，随着ST2水平的升高，无论是死亡率(p＝0.001)还是死亡或CHF的组合(p＝0.001)的危险性都是以分级的，逐渐的方式增加的。ST2和临床事件之间的相关性在两个单独的试验(TIMI 14和ENTIRE-TIMI 23)中都是类似的。

表7.基准ST-2浓度(ng/ml)和结果之间的相关性

MI＝心肌梗塞；CHF＝充血性心力衰竭

ST2血清水平的变化。用四分位值分析的基准ST2水平与随机化的时间显著相关(表5和表6)。预期ST2水平在冠状动脉闭塞以后的第一天会上升，然后经过14天回复正常(6)。在TIMI14的患者中，对228名患者进行连续测量血清ST2的分析表明其水平随时间上升，大部分患者在12小时达到ST2水平的峰值，虽然，有少数患者在过了这个时间点以后血清水平还继续上升。

多变量分析。在对已知的STEMI的临床预测因素包括年龄，心率，心脏收缩压，心急梗塞的部位，Killip分类，以及胸痛发作经历的时间进行控制以后，在30天时，上升的ST2水平仍然是死亡的独立预测因素(OR 1.77；95％CI 1.01-3.12，p＝0.047)。当在临床模型中加入BNP以后，这种相关性变得不再显著(评价仅限于ENTIRE)。还评价了ST2的预测能力，这在后来的时间点也得到确证(在TIMI 14中是3和12小时)；表明在ST2和死亡危险性之间有较强的相关性。

因此血清可溶性T1/ST2是一种严重心力衰竭的新的生物标志物，与神经激素激活类似。在具有严重慢性NYHA III-IV类心力衰竭的患者中，T1/ST2水平的变化是死亡率或移植终点的独立预测因素。

在此研究中，我们研究了对血清中的一种最近识别的白介素-1家族受体的检测在急性心肌梗塞中的可能作用。当细胞受到的生物力超负荷的时候，心肌细胞迅速分泌这种受体的可溶性形式；这表明该受体可能在心肌超负荷，例如心肌梗塞的时候具有某种功能。为了研究这个问题，我们检测了一组具有急性心肌梗塞的患者发病时的ST2水平。结果证明在这些患者发病时的ST2水平与住院和30天的死亡率相关。而且，多变量分析表明ST2水平独立地与对重要临床因素进行控制以后的结果相关。

因此，这些数据的意义是双重的。首先，这些数据揭示了与宿主防御和T细胞的分化有关的白介素受体家族(Sims JE.IL-1and IL-18 receptors，and their extended family.Curr Opin Immunol.2002；14：117-22)，可能与急性心肌梗塞的早期事件有关。这些数据暗示，该受体可能是改变心肌梗塞患者的预后的一种新的靶。第二，ST2代表了一种新的生物标志物，它为患有急性心肌梗塞的患者提供了预测信息；因此，我们从前工作的延伸证明了在具有非缺血的充血性心力衰竭，另一种心肌超负荷疾病的患者中，ST2和死亡率之间具有相关性(Weinberg EO，Shimpo M，Hurwitz S，Tominaga S，Rouleau JL，Lee RT.Identification of serumsoluble ST2 receptor as a novel heart failure biomarker.Circulation.2003；107：721-6)。

虽然并没有排除这种可能，但是ST2和心肌梗塞之后的结果之间的关系并不仅仅是反映了炎性标志物例如CRP的缓慢上升和心肌梗塞危险性之间的相关性。ST2，如BNP，可以由心肌细胞自身合成，没有明显的缺血性疾病的患者的数据表明，在不存在冠状动脉疾病的情况下，ST2可预测疾病的预后。进一步，初步资料表明患有稳定的冠状动脉疾病的门诊患者的ST2水平与CRP水平无关。我们的数据提供了ST2在稳固的临床模型(REFTIMI Risk Score)中进行危险评估的补充数据，ST2在ENTIRE-TIMI 23所限的小样本数据中没有为BNP提供额外的信息。也可能具有ST2与其它可获得的生物标志物协同的预测值。

虽然ST2可以由受力超负荷的心肌细胞分泌，但是许多细胞都可以分泌ST2。因此可能血清ST2的升高不完全是由急性心肌梗塞引起的。除了非缺血性的心力衰竭(Weinberg EO，Shimpo M，Hurwitz S，Tominaga S，Rouleau JL，Lee RT.Identification of serumsoluble ST2 receptor as a novel heart failure biomarker.Circulation.2003；107：721-6)，哮喘患者(Oshikawa K，Kuroiwa K，Tago K，Iwahana H，Yanagisawa K，Ohno S，Tominaga SI，Sugiyama Y.Elevated soluble ST2 protein levels in sera of patients with asthmawith an acute exacerbation.Am JRespir Crit Care Med.2001；164：277-81)或自体免疫疾病患者如全身性红斑狼疮患者(Kuroiwa K，Arai T，Okazaki H，Minota S，Tominaga S.Identification of humanST2 protein in the sera of patients with autoimmune diseases.Biochem Biophys Res Commun.2001；284：1104-8)也可以升高血清ST2水平。因此，在于急性心肌梗塞的初始诊断中所进行的ST2检测的有效性并不是很确定。

但是，ST2仍然是MI患者治疗的可能的靶。这些数据证明了基因技术如何能发现一种普通疾病中的新的可能的病理生理途径。ST2最初是通过对白介素-1家族的研究而发现的，但是它在心肌疾病中的作用最近才通过用DNA微阵列技术进行的基因组研究发现。DNA微阵列的研究可以识别可能的新的疾病途径，但这只是了解该途径作用的最初步骤。上述数据证明了ST2在急性心肌梗塞中的作用，ST2的水平可以预测结果。ST2在心肌梗塞中的功能的研究是有可能的。除此之外，可溶的和膜结合的ST2受体的配体的识别也有助于进一步了解膜结合的和可溶的受体分别的潜在功能。

上述结果表明在心脏病发作和/或心力衰竭期间分泌T1/ST2，它可以容易地被检测，由此证明了本发明所述的效用。

等效方案

所述领域技术人员应当认识到，或者应当确知，无需过度的实验就可以获得与本发明的特定实施方案等效的方案。这些等效方案也包括在下述的权利要求中。

这里公开的所有参考文献都引入其全文作为参考。

Claims (3)

1.特异性地与SEQ ID NO：2的多肽结合的试剂在制备预测患者心血管疾病结果的药物中的用途，其中所述心血管疾病选自：心肌梗塞和心力衰竭。

2.权利要求1的用途，其中所述与SEQ ID NO：2的多肽结合的试剂是抗体或其抗原结合片段。

3.权利要求2的用途，其中所述抗体或其抗原结合片段用可检测的标记进行标记。

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